專利名稱：：用于控制雜草的真菌分離株和生物控制組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物除草劑。更具體而言，本^發(fā)明涉及真菌生物除草劑和包括真菌生物除草劑的組合物，以及用于篩選真菌分離林以確定它們是否具有生物控制活性的方法。
背景技術(shù)：
：使用殺蟲(chóng)劑來(lái)殺死昆蟲(chóng)、雜草和其它病蟲(chóng)在農(nóng)業(yè)中是常見(jiàn)的。據(jù)估計(jì)加拿大農(nóng)民在殺蟲(chóng)劑上的花費(fèi)超過(guò)7億5千萬(wàn)美元，估計(jì)美國(guó)和歐洲可能比加拿大還要高出好幾倍。在加拿大草原上，種植小麥、大麥、蕓苔和亞麻的土地中有95%都用一種或多種殺蟲(chóng)劑處理過(guò)。然而，盡管使用了昂貴的殺蟲(chóng)劑，每*在加拿大雜草還是^1成約十億美元的作物損失。雜草對(duì)農(nóng)業(yè)作物是有害的，因?yàn)樗鼈兡軌蛟谕魑镏擦诌M(jìn)行的空間、陽(yáng)光和營(yíng)養(yǎng)竟?fàn)幹袆俪?。特別棘手的雜草包括加拿大薊(cirsiumarvense)和紫菀家族的其它成員如多年生苣苦菜(sonchusarvense)和蒲公英(taraxacumofficinale)。加拿大薊(cirsiumarvense[L.]Scop.)是農(nóng)作物中、牧草中和路邊的一種有侵略性的多年生雜草，并且在加拿大西部特別盛行，它們占據(jù)了全部田地的約50%。不同密度的加拿大薊可導(dǎo)致谷類、油料種子和豆類作物的作物產(chǎn)量損失約15-60%。在谷類作物中，每平方米6-20林加拿大薊的植林密度會(huì)導(dǎo)致谷類產(chǎn)量損失18-30%。1937年，加拿大薊被加拿大聯(lián)邦種子條例指定為有害雜草。盡管紫菀家族的雜草(例如加拿大薊和蒲公英)是通過(guò)開(kāi)花來(lái)繁殖的，但是因?yàn)樗鼈兊母凳謴V泛，使得它們難以被根除。所述根非常脆并JL^耕地的過(guò)程中很容易碎裂。這會(huì)導(dǎo)致受激芽抽莖更多。進(jìn)一步增加控制難度的是，所述才,片帶有足以在不利糾下長(zhǎng)期存活的養(yǎng)料儲(chǔ)備。農(nóng)作物中加拿大薊的控制目前是通#播種前、耕種中(in-crop)以及收獲后以足以抑制頂端生長(zhǎng)或殺死根的水平施加除草劑來(lái)實(shí)現(xiàn)的。例如，草甘膦可被用作殺死加拿大薊的播種前處理，或在，中^M于草甘膦耐受作物。二氯吡咬酸,皮用于耕種中控制以itSU相同的效果，4旦是其殘余活性在下一年中對(duì)一些作物有影響。其它的產(chǎn)品組合只能提供頂端生長(zhǎng)抑制，如瘞磺隆和M隆或精噁唑禾草靈(fenoxy-prop)和MCPA。其它的控制方法包括種植竟?fàn)幾魑锊⑶以绮シN，以便在加拿大薊出芽和土壤淺耕前^J'〗旺盛的作物生長(zhǎng)以減少根斷裂和新枝生長(zhǎng)?；蛘呃秘赘顏?lái)控制路邊、溝渠、岬角(headland)和柵欄線上的雜草。通常建議控制小塊地而非整塊田地以降低費(fèi)用。除上文討論的那些外，還有許多與加拿大薊的非化學(xué)控制相關(guān)的缺陷。首先，很少有作物能夠在與雜草如加拿大薊的竟?fàn)幹袆俪?，并且許多作物不能播種得足夠早，因而無(wú)法在作物與加拿大薊的竟?fàn)幹袨槠涮峁┚範(fàn)巸?yōu)勢(shì)。此外，早播種作物會(huì)4吏農(nóng)民感到不<更。土;裏淺#^刈割雜草以殺死雜草或防止雜草開(kāi)花也只是臨時(shí)的解決方案，并且最多是在控制如加拿大薊的雜草時(shí)勉強(qiáng)有效。還有許多與使用化學(xué)除草劑來(lái)控制雜草如加拿大薊相關(guān)的缺陷。除草劑價(jià)格昂貴，并且可能昂貴得使一些農(nóng)民不能使用。此外，如l艮民使用少于要求劑量的除草劑來(lái)殺死雜草，那么會(huì)增加一些雜草M出除草劑抗性的風(fēng)險(xiǎn)。由于#使用除草劑而導(dǎo)致除草劑抗性的風(fēng)險(xiǎn)也會(huì)增加。此外，除草劑并不適用于所有的作物以及所有的情況。例如，不存在有效的適用于如豌豆和扁豆的除草劑，而一些耕種中化學(xué)除草劑只能抑制雜草的頂端生長(zhǎng)而不會(huì)控制根生長(zhǎng)，這是通常用于如小麥、大麥和蕓莒的作物的短期策略。殘留的除草劑活性可能也會(huì)限制一些作物的作物輪作，且一些農(nóng)用除草劑的實(shí)施可能會(huì)增加雜草密度。也有關(guān)于除草劑對(duì)于消費(fèi)者和環(huán)境的短期和長(zhǎng)期安全性的憂慮。農(nóng)產(chǎn)品工業(yè)中的環(huán)境問(wèn)題，包括化學(xué)性害蟲(chóng)控制產(chǎn)品的替代品的開(kāi)發(fā)，已經(jīng)成為聯(lián)邦和省i^的首要問(wèn)題,，最終目的是減少化學(xué)農(nóng)藥的使用。與農(nóng)業(yè)收入、噴霧漂移和農(nóng)藥殘留相關(guān)的增加的經(jīng)濟(jì)、環(huán)境和社會(huì)成本，減少農(nóng)l和家庭應(yīng)用中雜草控制的引:關(guān)注的策略。'"、'、"'、草坪環(huán)境(如草地、公園和高爾夫球場(chǎng))中的闊葉雜草會(huì)破壞所需的視覺(jué)一致性(即難看)，由于雜草的聚叢和生長(zhǎng)習(xí)慣而在草皮維護(hù)中產(chǎn)生問(wèn)題，與草皮竟?fàn)幑庹?、營(yíng)養(yǎng)和水。當(dāng)對(duì)雜草的花粉或?qū)τ糜陔s草控制的化學(xué)試劑發(fā)生過(guò)敏反應(yīng)時(shí)，對(duì)人來(lái)說(shuō)雜草也是刺激性的。草坪草中重要的雜草屬于菊科(如蒲公英、苦荬菜)、石竹科(如繁縷)、萏草科和旋花科。通常，草畔中雜草的控制是在不同的時(shí)間(種植前、出芽前和出芽后)⑩口選擇性、非選擇性、系統(tǒng)性和接觸性除草劑。阻止在7>共場(chǎng)所(如7>園)和私人草地中使用化學(xué)除草劑的公眾壓力正在增加，例如最近在加拿大亞伯答的卡爾加里和新斯#的哈利法克斯已經(jīng)通過(guò)條例反對(duì)使用化學(xué)除草劑。在這些地區(qū)使用的化學(xué)除草劑會(huì)導(dǎo)致對(duì)A^中例如兒童、寵物和老年人的易感群的化學(xué)暴露增加。許多細(xì)菌和真菌都是雜草的天然病原體，人/f門認(rèn)為生物除草劑或由生物試劑而非化學(xué)試劑制成的除莠劑可以作為化學(xué)農(nóng)藥的替代品。例如，美國(guó)專利6，008，159公開(kāi)了佳月真菌核腔菌(戶7re/70/7力wa)控制一年生雜草。美國(guó)專利5，993,802和5,472，690教導(dǎo)了分別使用低溫?fù)?dān)子菌類真菌的分離抹獲真菌除草劑(至少包括雪腐鐮刀菌CPwwW咖/7/^//力和拂子茅刺盤(pán)孢W7"oWc力咖ca/a咖gmy".^s))來(lái)抑制力口拿大拂子草(6W邁a^ro"/'sc3加^/7ir/》的生長(zhǎng)。美國(guó)專利5，952，264和5，635，444教導(dǎo)了分別佳JU真菌中間旋孢腔菌(Coc///o6o7/1y//^e/vz/e力'w5)或選自彎孢霉屬(C"/ra/ar/a)的真菌來(lái)控制馬唐。美國(guó)專利5，747，029教導(dǎo)了用真菌祝3膝斑菌(#jroMec/ua7p^m/car/a)控制鐮刀豆草。美國(guó)專利5，698，491和W098/08389公開(kāi)了用真菌何金氏指霉("ac^W紅/aA/^i/w/i)控制莎草(W098/08389和US5,698,491)。美國(guó)專利4，606，751教導(dǎo)了用高梁生平臍蠕^^孢子(A》o/ar"sor^ico/aspores)控制阿拉伯高粱和類似的雜草。將所述孢子懸浮在水和表面活性劑的溶液中并且噴灑到所述雜草正在生長(zhǎng)的田地上。美國(guó)專利5，795，845公開(kāi)了包括反相乳液載體和微生物的生物除草組合物，所述微生物為弱的或非病原性細(xì)菌或真菌。所述組合物可纟皮用于控制藜、無(wú)羽薊、絨葉和草原櫻桃。美國(guó)專利4,636,386公開(kāi)了用于意大利薊控制的鏈格孢C4/^ra2i7a)分離抹。美國(guó)專利5，994，27公開(kāi)了包括生物除草劑的組合物，9所述生物除草劑為在闊葉雜草物種中引起葉片枯萎和腐爛以抑制它們生長(zhǎng)的小核盤(pán)菌C5WeiY〃"/a組'/7o力的分離林。所述生物除草劑可被用于控制闊葉雜草的生長(zhǎng)，如蒲公英、闊葉車前草、豕草、常青藤、蓼科苦荬菜(knotweedsowthistle)和白三葉草。Brebaum和Boland(1999，PlantDisease83:2000)乂>開(kāi)了甜菜莖點(diǎn)霉和草莖點(diǎn)零(戶力o鵬力er6ar咖)為蒲英(西洋蒲^>英(7amac咖c/y7c/加/e))的病原體，然而，沒(méi)有報(bào)導(dǎo)過(guò)佳JU這些物種時(shí)有雜草控制活性。沒(méi)有任何一篇經(jīng)證實(shí)的參考文獻(xiàn)公開(kāi)過(guò)來(lái)源于巨口莖點(diǎn)霉的真菌分離抹可作為適合用于控制加拿大薊、蒲公英或其它雜草物種的生物控制組合物。草植物例如加拿大薊、多年生苣苦菜、蒲公英、具柄向日葵、田旋花、金蕎麥、淡甘菊、豬M和繁縷。本領(lǐng)域中還需要包括生物控制試劑和生長(zhǎng)培養(yǎng)基的生物控制組合物，所述生長(zhǎng)培養(yǎng)基用于在采用所述生物控制組合物控制雜草時(shí)維持所述生物控制試劑的活性。本領(lǐng)域中還需要檢測(cè)可被用作適合的生物控制試劑的真菌分離抹的方法。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明涉及生物除草劑。更具體而言，本發(fā)明涉及真菌生物除草劑和包括真菌生物除草劑的組合物，以及用于篩選真菌分離抹以確定它們是否具有生物控制活性的方法。本發(fā)明的一個(gè)目的是提供用于雜草控制的改進(jìn)的真菌分離林和生物控制組合物。才艮據(jù)本發(fā)明，揭:供了一種控制一種或多種闊葉雜草的方法(A),包括將一種或多種巨口莖點(diǎn)霉分離林、其提取物、其接種肉湯或上述物質(zhì)的組合給予至所述一種或多種闊葉雜草或給予至所述雜草生長(zhǎng)的土壤，所述一種或多種巨口莖點(diǎn)霉分離林、^^取物或^^種肉湯具有雜草控制活性。本發(fā)明還涉U文所定義的方法，其中所述巨口莖點(diǎn)霉分離林來(lái)自加拿大薊("r"'咖sr7e/we)。本發(fā)明還涉及上文所定義的方法(A)，其中所述一種或多種闊葉雜草為選自菊科、石竹科、旋花科、車前草科和茜草科的一個(gè)科的一個(gè)種。優(yōu)選地，所述一種或多種闊葉雜草選自加拿大薊、多年生苣苦菜、蒲公英、淡甘菊、假豬殃殃(falsecleavers)、繁縷、金蕎麥、車前草、具柄向日葵和田旋花。本發(fā)明還涉及一種生物控制試劑，包括一種或多種巨口莖點(diǎn)霉分離林、其提取物、，種肉湯，或它們的組合，所述一種或多種巨口莖點(diǎn)霉分離抹或其提取物或其接種肉湯具有雜草控制活性、生長(zhǎng)增強(qiáng)活性或兩者兼具。所述一種或多種莖點(diǎn)霉分離M自a)85-24B(IDAC230201-1，保藏于2001年2月23日)，b)89-25A(IDAC110401-1,保藏于2001年4月11日)，c)94-26(IDAC230201-2,保藏于2001年2月23日)，d)94-44B(IDAC230201-3，保藏于2001年2月23日)，e)94-134(IDAC230201-4，保藏于2001年2月23日)，f)94-359A(薩110401-2,保藏于2001年4月11日)，g)95-54Al(薩230201-5,保藏于2001年2月23日)，h)95-268B(IDAC110401-3，保藏于2001年4月11日)，i)97-12B(IDAC230201-6，保藏于2001年2月23日)，j)97-15B2(IDAC110401-4，保藏于2001年4月11曰);以及它們的纟且合。本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種生物控制組合物，包括本發(fā)明的生物控制試劑以及用于維持所述一種或多種莖點(diǎn)霉分離抹活性的培養(yǎng)基。所述培養(yǎng)基優(yōu)選地選自瓊脂、pesta、泥炭粒(peatprill)、蛭石、粘土、淀粉、馬鈴薯葡萄糖肉湯、蔬菜汁肉湯、谷物和豆類。本發(fā)明涉及上述方法(A)，其中所述提取物選自滅活大麥接種物、巨口莖點(diǎn)霉分離林的氯仿提取物、巨口莖點(diǎn)霉分離株的甲醇提取物和巨口莖點(diǎn)霉分離林的乙酸乙酯提取物，且所述接種肉湯選自粗接種肉湯、過(guò)濾的接種肉湯或離心的^l^種肉湯。本發(fā)明還涉及一種在作物生長(zhǎng)過(guò)程中控制雜草生長(zhǎng)的方法(B),包括a)向土壤中加入有效量的包括一種或多種巨口莖點(diǎn)霉分離林、其提取物、其接種肉湯或上述物質(zhì)的組合的生物控制試劑，以產(chǎn)生處理過(guò)的土i襄，所述一種或多種巨口莖點(diǎn)霉分離林、其提取物或其接種肉湯具有雜草控制活性；b)在所皿理過(guò)的土壤中種植所述作物；和c)使所述作物生長(zhǎng)。根據(jù)本發(fā)明，還提供了一種在作物生長(zhǎng)過(guò)程中控制雜草生長(zhǎng)的方法(c),包括a)種植所i^作物，b)向種植了所述作物的土壤中加入有效量的包括一種或多種巨口莖點(diǎn)霉分離林、其提取物、其接種肉湯或上述物質(zhì)的組合的生物控制試劑，所述一種或多種巨口莖點(diǎn)霉分離林、其提取物或^種肉湯具有雜草控制活性；cM吏所述作物生長(zhǎng)。本發(fā)明還涉及一種在作物生長(zhǎng)過(guò)程中控制雜草生長(zhǎng)的方法(D)，包括a)向作物種子中加入有效量的包括一種或多種巨口莖點(diǎn)霉分離林、其提取物、其接種肉湯或上述物質(zhì)的組合的生物控制試劑，以產(chǎn)生處理過(guò)的作物種子，所述一種或多種巨口莖點(diǎn)霉分離祙、其提取物或其接種肉湯具有雜草控制活性；b)種植處理過(guò)的作物種子；和c)使所述作物生長(zhǎng)。本發(fā)明中還包括上文定義的方法(B、C或D)，其中所述處理過(guò)的作物種子為草種，包括家庭草碎草種和專業(yè)草畔草種、畜牧牧草或干草草種混^4勿，所述混合物包括一種或多種梯牧草、羊茅草、早熟禾、多年生黑麥草、無(wú)芒雀麥、蘆草、紅頂草和野茅的種子。本發(fā)明還提供了一種在已穩(wěn)定生長(zhǎng)的作物生長(zhǎng)過(guò)程中控制雜草生長(zhǎng)的方法(E)，包括a)向所述已穩(wěn)定生長(zhǎng)作物施加有效量的包括一種或多種巨口莖點(diǎn)霉分離林、其提取物、其接種肉湯或上述物質(zhì)的組合的生物控制試劑，所述一種或多種巨口莖點(diǎn)霉分離林、^^取物或^^種肉湯具有雜草控制活性，和bM吏所述作物生長(zhǎng)。本發(fā)明還包括了剛剛定義的方法(E)，其中所述已穩(wěn)定生長(zhǎng)作物為草，包括家庭草坪草和專業(yè)草坪草、畜牧牧草或干草草種混合物，所述混合物包括一種或多種梯牧草、羊茅草、早熟禾、多年生黑麥草、無(wú)芒雀麥、蘆草、紅頂草和野茅。本發(fā)明還提供了一種控制雜草生長(zhǎng)的方法(F)，包括給所述雜草生長(zhǎng)的土壤施加有效量的包括一種或多種巨口莖點(diǎn)霉分離林、其提取物、其接種肉湯或上述物質(zhì)的組合的生物控制試劑，所述一種或多種巨口莖點(diǎn)霉分離林、其提取物或其接種肉湯具有雜草控制活性。所述生物控制試劑優(yōu)選地為所述一種或多種巨口莖點(diǎn)霉分離林的提取物。本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種控制雜草生長(zhǎng)的方法(G),包括給所述雜草施力口有效量的包括一種或多種巨口莖點(diǎn)霉分離林、其提取物、其接種肉湯或上述物質(zhì)的組合的生物控制試劑，所述一種或多種巨口莖點(diǎn)霉分離林、其提取物或^4妄種肉湯具有雜草控制活性。本發(fā)明還提供了一種在草畔生長(zhǎng)過(guò)程中控制雜草生長(zhǎng)的方法(H)，所述方法包括a)向土壤中加入有效量的包括一種或多種巨口莖點(diǎn)霉分離林、其提取物、其接種肉湯或上述物質(zhì)的組合的生物控制試劑，以產(chǎn)生處理過(guò)的土i裏，所述一種或多種巨口莖點(diǎn)霉分離林、^^取物或^^種肉湯具有雜草控制活性，b)在所述處理過(guò)的土壤中種植草種，和c)用所述草種生長(zhǎng)所述草畔。本發(fā)明還提供了一種在草畔生長(zhǎng)過(guò)程中控制雜草生長(zhǎng)的方法(I),所述方法包括a)種植草種,b)向種植了所述草的土壤中加入有效量的包括一種或多種巨口莖點(diǎn)霉分離抹、其提取物、其接種肉湯或上述物質(zhì)的組合的生物控制試劑，所述一種或多種巨口莖點(diǎn)霉分離林、其提取物或其接種肉湯具有雜草控制活性；和c)用所述，草種生長(zhǎng)所ii草坪。本發(fā)明還提供了一種在草坪生長(zhǎng)過(guò)程中控制雜草生長(zhǎng)的方法(J),包括a)向草種中加入有效量的包括一種或多種巨口莖點(diǎn)霉分離林、其提取物、其接種肉湯或上述物質(zhì)的組合的生物控制試劑，以產(chǎn)生處理過(guò)的草種，所述一種或多種巨口莖點(diǎn)霉分離抹、^^取物或^4妄種肉湯具有雜草控制活性；b)種植所述處理過(guò)的草種；和c)用所述處理過(guò)的草種生長(zhǎng)所述草沖。本發(fā)明還提供了一種在已長(zhǎng)成草坪的草的生長(zhǎng)過(guò)程中控制雜草生長(zhǎng)的方法(K),所述方法包括a)給所述已長(zhǎng)成的草碎施加有效量的包括一種或多種巨口莖點(diǎn)霉分離抹、其提取物、其接種肉湯或上述物質(zhì)的組合的生物控制試劑，所述一種或多種巨口莖點(diǎn)霉分離林、^^取物或^^種肉湯具有雜草控制活性；和bM吏所it草坪生長(zhǎng)。本發(fā)明還提供了一種增強(qiáng)作物生長(zhǎng)的方法(L),所述方法包括a)向土壤中加入有效量的包括一種或多種巨口莖點(diǎn)霉分離抹、其提取物、^#種肉湯或上述物質(zhì)的組合的生物控制試劑，以產(chǎn)生處理過(guò)的土壤，所述一種或多種巨口莖點(diǎn)霉分離抹、^-R取物或^-^種肉湯具有雜草控制活性；b)在所i^t理過(guò)的土壤中種^i;斤述作物，和c)使所述作物生長(zhǎng)。本發(fā)明還^^供了一種增強(qiáng)作物生長(zhǎng)的方法(M),所述方法包括a)在土壤中種;ti;斤述作物；b)向種植了所述作物的土壤中加入有效量的包括一種或多種巨口莖點(diǎn)霉分離株、其提取物、其接種肉湯或上述物質(zhì)的組合的生物控制試劑，所述一種或多種巨口莖點(diǎn)霉分離株、其提取物或^^種肉湯具有雜草控制活性；和cM吏所ii作物生長(zhǎng)。本發(fā)明進(jìn)一步^^了一種增強(qiáng)已穩(wěn)定生長(zhǎng)作物生長(zhǎng)的方法(N),所述方法包括a)給所述已穩(wěn)定生長(zhǎng)作物施加有效量的包括一種或多種巨口莖點(diǎn)霉分離林、其提取物、其接種肉湯或上述物質(zhì)的組合的生物控制試劑，所述一種或多種巨口莖點(diǎn)霉分離林、^-^取物或其接種肉湯具有雜草控制活性；和bM吏所述作物生長(zhǎng)。本發(fā)明還包括上文定義的方法(L、M或N)，其中所述作物為草，包括家庭草jf草和專業(yè)草沖草、畜牧牧草或干草草種混合物，所述混合物包括一種或多種梯牧草、羊茅草、早熟禾、多年生黑麥草、無(wú)芒雀麥、蘆草、紅頂草和野茅。本發(fā)明還涉及一種增強(qiáng)作物生長(zhǎng)的方法(O),所述方法包括a)向作物種子中加入有效量的包括一種或多種巨口莖點(diǎn)霉分離林、其提取物、其接種肉湯或上述物質(zhì)的組合的生物控制試劑，以產(chǎn)生處理過(guò)的作物種子，所述一種或多種巨口莖點(diǎn)霉分離林、其提取物或M種肉湯具有雜草控制活性；b)種植所述處理過(guò)的草種；和cM吏所述作物生長(zhǎng)。本發(fā)明還包括上文定義的方法(O),其中所述處理過(guò)的作物種子為草種，包括家庭草呼草種和專業(yè)草坪草種、畜牧牧草或干草草種混合物，所述混合物包括一種或多種梯牧草、羊茅草、早熟禾、多年生黑麥草、無(wú)芒雀麥、蘆草、紅頂草和野茅種子。本發(fā)明的方法還涉及包括一種或多種巨口莖點(diǎn)霉分離林、其提取物、其接種肉湯或上述物質(zhì)的組合的生物控制組合物的用途，所述一種或多種巨口莖點(diǎn)霉分離林、其提取物或其接種肉湯具有雜草控制活性；所iii且合物中還包括用于維持所述一種或多種巨口莖點(diǎn)霉分離抹的存活率的培養(yǎng)基。本發(fā)明的方法優(yōu)選地被用于在多年生作物的生長(zhǎng)過(guò)程中控制雜草生長(zhǎng)。優(yōu)選地，所述多年生作物選自草皮、多年生禾草和冬谷。本發(fā)明還提供了上述方法的任一種，其中所述生物控制試劑或組合物是在雜草出芽前或出芽后被^口到所^i壤中的，優(yōu)選出芽前。本發(fā)明還提供了上述方法的任一種，其中所述生物控制試劑或組合物是通過(guò)撒、涂、敷、條播、帶播、撒播、噴灑、液體注射、灌或灌根等方式施用的。本發(fā)明還提供了上述方法的任一種，其中所述一種或多種巨口莖點(diǎn)霉分離抹來(lái)自加拿大薊。本發(fā)明還提供了上述方法的任一種，其中所述一種或多種巨口莖點(diǎn)霉分a)85-24B(IDAC230201-1，保藏于2001年2月23日)，b)89-25A(IDAC110401-1，保藏于2001年4月11曰),c)94—26(IDAC230201-2，<呆藏于2001年2月23日)，d)94-44B(IDAC230201-3，保藏于2001年2月23曰),e)94-134(IDAC230201-4，保藏于2001年2月23日)，f)94-359A(IDAC110401-2,保藏于2001年4月11日)，g)95-54A1(IDAC230201-5,保藏于2001年2月23曰),h)95-268B(IDAC110401-3,保藏于2001年4月11日)，i)97-12B(IDAC230201-6，保藏于2001年2月23日)，j)97-15B2(IDAC110401-4，保藏于2001年4月11日)；以及它們的纟且合。本發(fā)明包括含有一種或多種巨口莖點(diǎn)霉分離林和粘合劑的包被的作物種子。本發(fā)明還包括了含有從一種或多種巨口莖點(diǎn)霉分離林獲得的提取物和粘合劑的包被的作物種子。所述一種或多種巨口莖點(diǎn)霉分離林優(yōu)選ii^自a)85-24B(IDAC230201-1,保藏于2001年2月23曰),b)89-25A(IDAC110401—1，寸呆藏于2001年4月11日)，c)94—26(IDAC230201—2,寸呆藏于2001年2月23日)，d)94一44B(IDAC230201—3，保藏于2001年2月23日)，e)94-134(IDAC230201-4,保藏于2001年2月23日)，f)94-359A(IDAC110401-2,保藏于2001年4月11日)，g)95-54A1(IDAC230201-5，保藏于2001年2月23日)，h)95-268B(IDAC110401-3,保藏于2001年4月11日)，i)97-12B(IDAC230201-6,保藏于2001年2月23日)，j)97-15B2(IDAC110401-4，保藏于2001年4月11曰);以及它們的組合。本發(fā)明提供的所述包被的作物種子為草種，包括家庭草沖草種和專業(yè)草坪草種、畜牧牧草或干草草種混合物，所述混合物包括一種或多種梯牧草、羊茅草、早熟禾、多年生黑麥草、無(wú)芒雀麥、,草、紅頂草和野茅的種子。本發(fā)明還提供了用于檢測(cè)一種或多種具有雜草控制活性的巨口莖點(diǎn)霉分離抹的^針，所述^:針包括SEQIDNO:1。本發(fā)明還提供了一種使用本發(fā)明的探針檢測(cè)一種或多種具有雜草控制活性的巨口莖點(diǎn)霉分離林的方法(P)。所述方法優(yōu)i^包括在雜交^f牛下，將所述一種或多種巨口莖點(diǎn)霉分離林的核酸與本發(fā)明的探針混合，其中所述一種或多種巨口莖點(diǎn)霉分離林的核酸與探針的雜交說(shuō)明所述分離抹具有雜草控制活性。所述巨口莖點(diǎn)霉分離林的核酸優(yōu)選地為基因組DNA。本發(fā)明還提供了用于檢測(cè)一種或多種具有雜草控制活性的巨口莖點(diǎn)霉分離抹的引物對(duì)，所述引物對(duì)包括SEQIDN0:2和SEQIDNO:3。本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種使用本發(fā)明的引物對(duì)檢測(cè)一種或多種具有雜草控制活性的巨口莖點(diǎn)霉分離林的方法(Q)。所i^r法優(yōu)i^i也包括用本發(fā)明的引物對(duì)擴(kuò)增所述一種或多種巨口莖點(diǎn)霉分離林的核酸，其中擴(kuò)增的核酸片段的存在說(shuō)明所述分離林具有雜草控制活性。所述巨口莖點(diǎn)霉分離林的核酸優(yōu)選地為基因組DNA。本發(fā)明涉;SJi述方法(Q),其中使用聚合H^式反應(yīng)(PCR)來(lái)擴(kuò)增一種或多種巨口莖點(diǎn)霉分離林的基因組DNA,并JLit過(guò)電泳來(lái)分離所得的PCR產(chǎn)物，其中介于0.8和1.2kb之間的擴(kuò)增的DM片段的存在說(shuō)明所述分離林具有雜草控制活性。本發(fā)明還提供了一種使用隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA(RAPD)指紋篩選一種或多種巨口莖點(diǎn)霉分離林以確定所述一種或多種分離林是否具有雜草控制活性的方法(R),所述方法包括aM吏用選自SEQIDNO:4;SEQIDNO:5;SEQIDNO:6;SEQIDNO:7;及它們的組合的引物擴(kuò)增一種或多種已知具有雜草控制活性的巨口莖點(diǎn)霉分離抹的染色體DNA，以獲得所述分離抹的RAPD片段圖譜；b)在與(a)相同或^i^目同的務(wù)降下，擴(kuò)增所要篩選的一種或多種巨口莖點(diǎn)霉分離株的染色體DNA，以獲得所述分離林的RAPD片段圖譜；c)比較步驟(a)中獲得的RAPD片段圖諉與步驟(b)中獲得的RAPD片段圖譜，其中所述RAPD片段圖譜間的相似性說(shuō)明所述一種或多種所要篩選的巨口莖點(diǎn)霉分離林具有雜草控制活性。本發(fā)明還提供了一種利用擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(AFLP)篩選一種或多種巨口莖點(diǎn)霉分離林以確定所述一種或多種分離株是否具有雜草控制活性的方法(S)，所述方法包括a)使用限制性內(nèi)切酶AcoRI和胞el消化一種或多種已知具有雜草控制活性的巨口莖點(diǎn)霉分離林的染色體DM,以獲得多個(gè)DM片段；b)將雙^S核苷酸AccRI和胞el接頭連接到步驟(a)中獲得的DM片段的AcoRI和#sel位點(diǎn)上；(i)SEQIDNO:10和SEQIDNO:11;(ii)SEQIDNO:10和SEQIDNO:12;(iii)SEQIDNO:13和SEQIDNO:11;(iv)SEQIDNO:13和SEQIDNO:12;(v)SEQIDNO:14和SEQIDNO:11;(vi)SEQIDNO:14和SEQIDNO:12;以及它們的纟且合；以獲得一組已知分離林的擴(kuò)增DM片段；d)對(duì)所要篩選的一種或多種巨口莖點(diǎn)霉分離林重復(fù)步驟(a)至(c),以獲得所述分離林的一組擴(kuò)增DNA片段；e)比較獲自一種或多種已知具有雜草控制活性的巨口莖點(diǎn)霉分離抹的擴(kuò)增DNA片^i且與獲自一種或多種所要篩選的巨口莖點(diǎn)霉分離林的擴(kuò)增DNA片^i且，其中所述擴(kuò)增DM片段間的相似性說(shuō)明所述一種或多種所要篩選的巨口莖點(diǎn)霉分離抹具有雜草控制活性。本發(fā)明涉及上述篩選方法(P、Q、R或S)，其中步驟(a)中所述一種或多種已知具有雜草控制活性的巨口莖點(diǎn)霉分離員自a)85-24B(IDAC230201-1，保藏于2001年2月23日)，b)89-25A(IDAC110401-1，保藏于2001年4月11日)，c)94-26(IDAC230201-2，保藏于2001年2月23日)，d)94-44B(IDAC230201-3，保藏于2001年2月23日)，e)94-134(IDAC230201-4，保藏于2001年2月23曰),f)94-359A(IDAC110401-2，保藏于2001年4月11曰),g)95-54A1(IDAC230201-5，保藏于2001年2月23日)，h)95-268B(IDAC110401-3,保藏于2001年4月11日)，i)97-12B(IDAC230201—6，保藏于2001年2月23日)，j)97-15B2(IDAC110401-4,保藏于2001年4月11日)；或它們的組合。本發(fā)明提供了一種巨口莖點(diǎn)霉分離林，所述巨口莖點(diǎn)霉分離林的特征為具有圖21，泳道22、44-46和48-53中所公開(kāi)的擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(AFLP)，所述擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(AFLP)方法使用下述引物對(duì)(i)SEQIDNO:10和SEQIDNO:11;(ii)SEQIDNO:10和SEQIDNO:12;(iii)SEQIDNO:13和SEQIDNO:11;(iv)SEQIDNO:13和SEQIDNO:12;(v)SEQIDNO:14和SEQIDNO:11;(vi)SEQIDNO:14和SEQIDNO:12;以及它們的組合。本
發(fā)明內(nèi)容部分不一定描述了本發(fā)明的所有特征。下文中參考附圖的說(shuō)明將使得本發(fā)明的上述特征和其它特征更加顯而易見(jiàn)，其中圖1示出了不同量的85-24B的接種物懸M加拿大薊的作用。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為1—t泉，深《錄色葉片；2=輕度黃1錄色的葉片；3=葉片主要是黃色的，一些是黃鄉(xiāng)錄色的；4=葉片主^^_白色的，少M(fèi)黃鄉(xiāng)錄色的；5=^_抹完全是白色的；以及6—直抹死亡。圖2示出了真菌分離林94-44B、94-26、95-54A1和97-12B對(duì)多年生苣苦菜的才艮生長(zhǎng)率的作用。圖3示出了真菌分離林94-44B對(duì)多年生苣苦茱葉片生物量的作用。圖4示出了真菌分離林94-44B對(duì)多年生苣苦菜抽莖的作用。圖5示出了給多年生苣苦菜;^口真菌分離林94-44B、89-25A和97-12B后雜草死亡率的示意圖。圖6示出了加拿大的五種^:生物殺蟲(chóng)劑生態(tài)區(qū)(ecozone)(來(lái)源PestManagementRegulartoryAgency,2001)。圖7示出了來(lái)自三種具有生物除草活性的巨口莖點(diǎn)霉分離抹的基因組DM與所制備的探針(SEQIDNO:1)的DM印跡。泳道1:GeneRulerlkb分子量標(biāo)記。泳道2-4:分別為未切割的巨口莖點(diǎn)霉分離林85-24B、94-44B和95-54A1的DNA。泳道5-7:分別為用i^c/-iT/w/消^匕的巨口莖點(diǎn)霉分離林85-24B、94-44B和95-54Al的DNA。泳道8:100bp標(biāo)記。圖8示出了具有生物除草活性的巨口莖點(diǎn)霉分離林以及其它兩種不具有生物除草活性的莖點(diǎn)霉分離抹的染色體DNA與所述探針(SEQIDNO:1)的DM印跡。泳道1-15:100bp標(biāo)記、巨口莖點(diǎn)霉85-24B、巨口莖點(diǎn)霉89-25A2、巨口莖點(diǎn)霉94-26、巨口莖點(diǎn)霉94-44B、巨口莖點(diǎn)霉94-134、巨口莖點(diǎn)霉94-359A、巨口莖點(diǎn)霉95-54A1、巨口莖點(diǎn)霉95-268、巨口莖點(diǎn)霉97-12B、巨口莖點(diǎn)霉97-15B2、苜蓿莖點(diǎn)霉(戶./zed/ca^'//》94-335Al、草莖點(diǎn)霉CP.力er^3r鵬)AI、草莖點(diǎn)霉AIV和草莖點(diǎn)霉G5/2。圖9示出了所制備的探針SEQIDNO:1的DNA序列數(shù)據(jù)。圖IO示出了用于所述探針(SEQIDN0:1)的左側(cè)引物:SEQIDNO:2(》》和右側(cè)引物SEQIDNO:3(《<)的>^^序列位置。圖11示出了PCR引物對(duì)(SEQIDNO:2;SEQIDNO:3)對(duì)巨口莖點(diǎn)霉的特異性。泳道l:GeneRulerlkb分子量標(biāo)記；泳道2:水對(duì)照；泳道3-12:巨口莖點(diǎn)霉的生物控制分離抹85-24B、89-25A2、94-26、94-44B、94-134、94-359A、95-54A1、95-268B、97-12B和97-15B2;泳道13:丹尼莖點(diǎn)霉變種(戶.cfe7z/7/w7var.&/7/7/</2〕CBS135.96;泳道14-17:巨口莖點(diǎn)霉變種CP.鵬croi",o鵬var.邁acro"o鵬)分離林CBS154.83、CBS482.95、CBS488.94和CBS837.84;泳道18:巨口莖點(diǎn)霉變種CP.邁aoroWo邁avar.//7co/ora&)CBS389.84;泳道19-21:黑脛莖點(diǎn)霉CP.///卵邁Leroy)、Peace-3和P186-12;泳道22-24:草莖點(diǎn)霉AI、AIV和G5/2;泳道25-26:菊花莖點(diǎn)霉(尸.c力r7M"Me邁/c0/a)90-64和91-271;泳道27-30:甜菜莖點(diǎn)霉92-180-1、苜蓿莖點(diǎn)霉94-335A1、雜色莖點(diǎn)霉CP./7e6i//ow)92-74和楸子莖點(diǎn)霉CP./7咖oi"咖)91-177;泳道31-37:禾i走孢腔菌(Coc力7/o6o/mm"pw)2715、紫附5求菌(^/cocc咖/w;wrasce/^)98-SD85-18、尖孢鐮刀菌(尸z^a,/咖<^7咖)91-121B、青霉菌(尸e/7/c27/i咖sp.)02_10、腐霉菌(戶/Mi咖sp.)94-123-Bl、油菜菌核病菌GSWero〃"/a"7ero〃or咖)SS-321和薊殼針孢CS^^r/'ac/"/i)98-llB2;泳道38:/^/ye"r/;^￡57T1—6(+ve對(duì)照)。圖12示出了在溫室^f牛下，PCR引物對(duì)(SEQIDNO:2;SEQIDNO:3)對(duì)土壤中和植物組織中的巨口莖點(diǎn)霉94-44B靈欲變。以各種劑量給裝有田間土i裏的并說(shuō)種。泳道l:GeneRulerlkb分子量標(biāo)記、泳道2-8:從分別以0、4、8、16、31、64和125g接種物/1112的量接種的瓶中土壤中提取的DNA、泳道9-15:從分別以0、4、8、16、31、64和125g接種物/血2的量接種的瓶中植物根中提取的DNA。圖13示出了^JI菌林特異性引物SEQIDN0:2和SEQIDN0:3對(duì)巨口莖點(diǎn)霉的生物控制菌^Mi行PCR檢測(cè)。能夠被擴(kuò)增的分離林以下劃線源文為粗體)形式給出。圖13A示出了泳道1:低分子量標(biāo)記(Invitrogen);泳道2:空白；泳道3-29:SRC95-54A2、SRC97-15B2*、SRC94-359A、SRC94-134、SRC85-24B*、SRC95-268B、SRC95-54A1*、SRC89-25A2、SRC97-12B、SRC02-2A、SRC94-26、SRC94-26Avir、SRC94-44B、CBS154.83、CBS837.84、CBS488.94、CBS839.84、CBS482.95、CBS483.66、CBS560.70、CBS598.94、DAOM175135、DAOM175940t、DAOM175951、ICMP2325、ICMP2715、ICMP3173。*這三種SRC分離林不能擴(kuò)增，但是曾被預(yù)計(jì)是陽(yáng)性的。因此如圖13C所示對(duì)t種分離株4^進(jìn)行重新分析。卞分離抹DAOM175940是唯一的能產(chǎn)生陽(yáng)性^Ji的其它分離抹。圖13B示出了泳道30:低分子量標(biāo)記；泳道31-54:ICMP6603、ICMP6628、ICMP6803,ICMP6814，ICMP7033，ICMP10843,ICMP10963,ICMP11186，ICMP12948，IMI118020,IMI175661*,IMI299239，IMI336757，IMI336761,WAC7881，CCM-F322，CCM-F323，ATCC24524,ATCC46580，CBS112.36，CBS115.12，CBS185.25，CBS198.69、CBS297.36。*由于未知原因該分離林具有微弱的陽(yáng)性反應(yīng)，盡管曾預(yù)期它會(huì)產(chǎn)生陰性M。如圖13C所示對(duì)該分離^其任一側(cè)的分離^^行重新分析。圖13C示出了泳道1:LowMassLadder;泳道2-26:SRC95-54A2、SRC97-15B2*、SRC94-359A、SRC94-134、SRC85-24B、SRC95—268B、SRC95-54A1、SRC89-25A2、SRC97-12B、SRC02—2A、SRC94-26、SRC94-26A、SRC94-44B、SRC85-24B、SRC95-54Al、SRC94-26、SRC94-44B、SRC94-26Avir、DA匿75940、IMI118020、IMI175661、IMI299239、SRC85-24B、SRC95-54A1，泳道26,空白。*盡管曾被預(yù)期會(huì)產(chǎn)生陽(yáng)性反應(yīng)，但分離抹SRC97-15B2無(wú)法被擴(kuò)增。形態(tài)學(xué)檢查表明培養(yǎng)Ut到了污染，所以用存^t培養(yǎng)基復(fù)蘇SRC97-15B2并且如如圖13C所示對(duì)所提取的DNA進(jìn)行重新分析。在對(duì)DM濃度進(jìn)^i^整之后，其它先前失敗的SRC分離林產(chǎn)生了陽(yáng)性反應(yīng)。圖13D示出了泳道1:低襯量標(biāo)記；泳道2-23:MA1908B、PFC2705、CBS300.36、olrim779、PFC3313、olrim776、WAC7788、CBS297.36、CBS371.61、CBS529.66A、SRC97-15B2*、CBS529.66B、MA3312、MA1908R、CBS223.69、MI192267、PD68/1014A、DAOM179750、CBS109173、SRC03-1A8、IMI192268、PD68/1014B、CBS345.97;泳道25-30:對(duì)照、+veSRC94-44B、-veATCC24524、十veSRC95-54A2、-veATCC46580、+veSRC02-2A、-veCBS112.36。*在重新培養(yǎng)和重新提取后SRC97-15B2產(chǎn)生了陽(yáng)性反應(yīng)。其它之前沒(méi)有測(cè)試過(guò)的分離林包括巨口莖點(diǎn)霉型培養(yǎng)物SRC03-1A8、CBS223.69和CBS529.66(表5),以及其它幾種并不屬于表5中所示的巨口莖點(diǎn)霉群組的分離株。圖14示出了巨口莖點(diǎn)霉和其它幾種通過(guò)脈沖場(chǎng)皿電泳分離的莖點(diǎn)霉分離抹的電;^^型。:^道M:酉良酒酵母才示i己(Saccharomycescerevisiaemarker);泳道1-10:分別為巨口莖點(diǎn)霉分離林85-24B、89-25A2、94-26、94-44B、94-134、94-359A、95-54A1、95-268B、97-12B和97-15B2;泳道ll:苜蓿莖點(diǎn)霉94-335Al;泳道12-14:分別為草莖點(diǎn)霉分離林AI、AIV和G5/5/2。圖15示出了利用CHEF圖來(lái)揭示的幾種莖點(diǎn)霉分離林間的系^j^生關(guān)系。明顯存在兩種不同的亞類，其中存在有限的變化。生物控制分離林94-44B、85-24B、94-26、95-268B和95-54A1被分成亞類I(I型圖)，而分離林89-25A2、94-134、94-359A、97-12B和97-15B2屬于亞類2(II型圖)。翻用于Windows的Treecon⑧軟件計(jì)算進(jìn)4W巨離碰(置于圖的上部)和拔鄭(bootstrap)值(置于樹(shù)的節(jié)點(diǎn)上)。所有的主要聚類(cluster)都得到了拔靴復(fù)制(bootstrapreplication)的強(qiáng)有力支持。圖16示出了莖點(diǎn)霉分離林之間遺傳變異的隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DM(RAPD)分析。圖16A示出了使用寡核苷酸引物UBC308對(duì)莖點(diǎn)霉分離林之間遺傳變異進(jìn)行的RAPD分析。泳道1和31:GeneRulerlkbDNA分子量標(biāo)記(MBIFermentas);泳道2-ll:巨口莖點(diǎn)霉分離林85-24B、89-25A2、94-26、94-44B、94-134、94-359A、95-54A1、95-268B、97-12B和97-15B2;泳道12:丹尼莖點(diǎn)霉變種(戶-cfe/w&27var.^5/z/7/'w7)CBS135.96;泳道13-16:巨口莖點(diǎn)霉變種莖點(diǎn)霉分離林CBS154.83、CBS482.95、CBS488.94和CBS837.84;泳道17:巨口莖點(diǎn)霉變種CP.鵬cro"o鵬var./"co/ora^)CBS839.84;泳道18-20:黑脛莖點(diǎn)霉分離抹Leoy、Peace-3和P186-12;泳道21-23:草莖點(diǎn)霉分離林AI、AIV和G/5/2;泳道24-25:菊花莖點(diǎn)霉(戶.cAr^犯Me邁/coh)90-64和91-271;泳道26-29:甜菜莖點(diǎn)霉92-180-1、苜蓿莖點(diǎn)霉94-335Al、雜色莖點(diǎn)霉92-74和楸子莖點(diǎn)霉91-177;泳道30:空白。圖16B示出了^JI寡核普酸引物UBC356對(duì)莖點(diǎn)霉分離林之間遺傳變異進(jìn)行的MPD分析。泳道1和31，GeneRulerlkbDM分子量標(biāo)記(MBIFermentas);泳道2-11:巨口莖點(diǎn)霉分離林85-24B、89-25A2、94-26、94-44B、94-134、94-359A、95-54Al、95-268B、97-12B和97-15B2;泳道12:丹尼莖點(diǎn)霉變種(戶.de/z/7/w7var.de///57力CBS135.96;泳道13-16:巨口莖點(diǎn)霉變種莖點(diǎn)霉分離林CBS154.83、CBS482.95、CBS488.94和CBS837.84;泳道17:巨口莖點(diǎn)霉變種(？鵬cro〃o鵬var.//2co/ora^2)CBS839.84;泳道18-20:黑脛莖點(diǎn)霉分離抹Leoy、Peace-3和P186-12;泳道21-23:草莖點(diǎn)霉分離抹AI、AIV和G/5/2;泳道24-25:菊花莖點(diǎn)霉(？.c力r"a/^fe巡/co/a)90-64和91-271;泳道26-29:甜菜莖點(diǎn)霉92-180-1、苜蓿莖點(diǎn)霉94-335Al、雜色莖點(diǎn)霉92-74和楸子莖點(diǎn)霉91-177;泳道30:空白。圖16C示出了^JJ寡核苦酸引物UBC734對(duì)莖點(diǎn)霉分離林之間遺傳變異進(jìn)行的RAPD分析。泳道1和31:GeneRulerlkbDM分子量標(biāo)記(MBIFermentas);泳道2-11:巨口莖點(diǎn)霉分離林85-24B、89-25A2、94-26、94-44B、94-134、94-359A、95-54Al、95-268B、97-12B和97-15B2;泳道12:丹尼莖點(diǎn)霉變種(戶.cfe/w"http://var.de/z/7/i/力CBS135.96;泳道13-16:巨口莖點(diǎn)霉變種莖點(diǎn)霉分離林CBS154.83、CBS482.95、CBS488.94和CBS837.84;泳道17:巨口莖點(diǎn)霉變種(戶.鵬"o^o巡avar.//coAxra^)CBS839.84;泳道18-20:黑脛莖點(diǎn)霉分離抹Leoy、Peace-3和P186-12;泳道21-23:草莖點(diǎn)霉分離林AI、AIV和G/5/2;泳道24-25:菊花莖點(diǎn)霉(尸.c力r7i^/7^e邁/co/a)90-64和91-271;泳道26-29:甜菜莖點(diǎn)霉92-180-1、苜蓿莖點(diǎn)霉94-335Al、雜色莖點(diǎn)霉92-74和楸子莖點(diǎn)霉91-177;泳道30:空白。圖16D示出了^J^寡核普酸引物UBC736對(duì)莖點(diǎn)霉分離林之間遺傳變異進(jìn)行的MPD分析。泳道1和31:GeneRulerlkbDM分子量標(biāo)記(MBIFermentas);泳道2-11:巨口莖點(diǎn)霉分離林85-24B、89-25A2、94-26、94-44B、94-134、94-359A、95-54Al、95-268B、97-12B和97-15B2;泳道12:丹尼莖點(diǎn)霉變種(戶.fite"/7^27var.de/w/;//)CBS135.96;泳道13-16:巨口莖點(diǎn)霉變種莖點(diǎn)霉分離林CBS154.83、CBS482.95、CBS488.94和CBS837.84;泳道17:巨口莖點(diǎn)霉變種CP-鵬c了0"咖avar./"co/ora&)CBS839.84;泳道18-20:黑脛莖點(diǎn)霉分離抹Leoy、Peace-3和P186-12;泳道21-23:草莖點(diǎn)霉分離林AI、AIV和G/5/2;泳道24-25:菊花莖點(diǎn)霉CP.cAr"犯"郎/co/a)90-64和91-271;泳道26-29:甜菜莖點(diǎn)霉92-180-1、苜蓿莖點(diǎn)霉94-335Al、雜色莖點(diǎn)霉92-74和楸子莖點(diǎn)霉91-177;泳道30:空白?？谇o點(diǎn)霉生物控制分離林與其它莖點(diǎn)霉屬的18種參照分離抹間的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系。在所述生物控制分離林聚類中，將來(lái)自兩個(gè)不同的加拿大生態(tài)區(qū)的分離林隨機(jī)分散。將進(jìn)化距離尺度置于圖上部，并且將拔靱值置于樹(shù)的節(jié)點(diǎn)上。除樹(shù)底部的小組外，所述小組僅得到了59%的拔孰復(fù)制的支持，對(duì)于所有的主要聚類來(lái)說(shuō)，強(qiáng)有力的統(tǒng)計(jì)支持是顯而易見(jiàn)的。圖18示出了使用通用真菌引物ITS4和ITS5進(jìn)行的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)PCR擴(kuò)增。圖18A示出了泳道l:^f氐分子量標(biāo)^己；泳道2-30:ATCC24524、ATCC46580、CBS112.36、CBS115.12、CBS154.83、CBS185.25、CBS198.69、CBS297.36、CBS482.95、CBS483.66、CBS488.94、CBS560.70、CBS598.94、CBS837.84、CBS839.84、DAOM175135、DAOM175940、DAOM175951、CCM-F322、CCMF-323、ICMP2325、ICMP2715、ICMP3173*、ICMP6603、證6628、ICMP6803、ICMP6814、ICMP7033、ICMP10843。*ICMP3173無(wú)法擴(kuò)增，并且如圖18C所示進(jìn)行重新分析。圖18B示出了泳道31:低分子量標(biāo)記；泳道32-53:ICMP10963、ICMP11186、ICMP12948、IMI118020、IMI175661、IMI299239、IMI336757、皿336761、WAC7881、SRC85-24B、SRC89-25A2*、SRC94-26、SRC94-26AVIR、SRC94-44B、SRC94-134、SRC94-359A、SRC95-54A1、SRC95-54A2、SRC95-268B、SRC97-12B，、SRC97-15B2卞、SRC02-2A;泳道54:空白。卞發(fā)現(xiàn)SRC97-15B2的培養(yǎng)腿到了污染，所以用賴培養(yǎng)基將其復(fù)蘇并且如下文(圖18D)所示提取DNA以用于重新分析。圖18C示出了泳道1:低分子量標(biāo)記；泳道2-29:ICMP10963、ICMP11186、ICMP12948、IMI118020、IMI175661、IMI299239、IMI336757、IMI336761、WAC7881、SRC85-24B、SRC89-25A2*、SRC94-26、SRC94-26AVIR、SRC94—44B、SRC94-134、SRC94-359A、SRC95-54A1、SRC95-54A2、SRC95-268B、SRC97-12B、SRC97-15B2卞、SRC02-2A、ICMP3173*、SRC89—25A2*、證3173*、SRC89-25A2*、ICMP3173*、SRC89-25A2*;泳道30:空白。*所有在先前分析中失敗的重新擴(kuò)增的培養(yǎng)物均重現(xiàn)了陽(yáng)性反應(yīng)。在不同DM濃度下，在所述^R的右部，ICMP3173和SRC89-25A2似乎出現(xiàn)了倍增。在泳道26和27中可以看到較低DNA濃JU/法擴(kuò)增目的產(chǎn)物。用于分離林SRC97-15B2的DNA的來(lái)源與圖18B中概述的相同。圖18D示出了所述復(fù)蘇分離株的DNA。圖18D示出了泳道1:低襯量標(biāo)記;泳道2-24:MA1908B、PFC2705、CBS300.36、olrim779、PFC3313、olrim776、WAC7788、CBS297.36、CBS371.61、CBS529.66A、SRC97—15B2*、CBS529.66B、MA3312、MA1908R、CBS223.69、頂1192267、PD68/1014A、DA0M179750、CBS109173卞、SRC03-1A8、IMI192268、PD68/1014B、CBS345.97;泳道25:空白。*在重新培養(yǎng)和重新|^:^后，對(duì)SRC97-15B2的DNA進(jìn)行序列分析，得到了與來(lái)源與加拿大薊的其它分離糾目同的序列。所述分析中還包括一種2003年收集的新分離林SRC03-1A8，以及模式培養(yǎng)物CBS223.69與CBS529.66和幾種其它分離抹。圖19示出了用于各種巨口莖點(diǎn)霉分離抹的核糖體DNAITS序列。圖19A示出了表5中取自不同宿主和地理位置的巨口莖點(diǎn)霉分離林的ITS序列的序列比對(duì)。圖19B示出了具有雜草控制活性的巨口莖點(diǎn)霉的ITS序列的非限制性實(shí)例，在該實(shí)例中示出了分離抹SCR970-15B2的核苷酸序列(SEQIDNO:15)。圖20示出了表5中取自不同宿主和地理位置的巨口莖點(diǎn)霉分離林的核糖體DNAITS序列的相鄰合并樹(shù)。標(biāo)明了70或更高(1000次重復(fù)的百分紀(jì)的拔靴值，四舍五入到最接近的整數(shù)。枝長(zhǎng)與遺傳距離成正比，所述枝長(zhǎng)是由右上角的標(biāo)尺來(lái)標(biāo)明的。圖21示出了用引物組合E-AC和M-CA進(jìn)行的擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(AFLP)凝膠，所述凝膠示出了來(lái)自加拿大薊的分離林(泳道22,44-53)的獨(dú)特模式(uniquepatterns)。泳道1:10bp分子量標(biāo)記(Invitogen);泳道3-5:空白(從其它泳道滲出)。泳道6-53:ATCC24524、ATCC46580、CBS112.36、CBS115.12、CBS154.83、CBS185.25、CBS198.69、CBS297.36、CBS482.95、CBS483.66、CBS488.94、CBS560.70、CBS598.94、CBS837.84、CBS839.84、DAOM175135、DAOM175940*、DAOM175951、CCM-F322、CCMF-323、ICMP2325、ICMP2715、ICMP3173、ICMP6603.ICMP6628、證6803、ICMP6814、ICMP7033、ICMP10843、ICMP10963、ICMP11186、ICMP12948、IMI118020、IMI175661、IMI299239、IMI336757、IMI336761、WAC7881、SRC85-24B、SRC89—25A2、SRC94-26、SRC94-26AVIR、SRC94-44B、SRC94-134、SRC94-359A、SRC95-54A1、SRC95-54A2、SRC95-268B;泳道54:空白，泳道55:10bp分子量標(biāo)記；泳道56(未標(biāo)記)50bp分子量標(biāo)記。*注釋DAOM175940(泳道22)具有與其它來(lái)自加拿大薊的分離糾目同的遺傳指紋。皿圖像不包括在另一塊皿上被分開(kāi)的分離林WAC7788、IMI192267、IMI192268、CBS300.36、MA簡(jiǎn)B、CBS223.69、CBS345.97、CBS371.61、CBS529.66、MA3312、SRC97-12B、SRC97-15B2、SRC02-2A和SRC03-1A8。圖22示出了從不同宿主和地理位置收集的巨口莖點(diǎn)霉分離林的AFLP產(chǎn)物的UPGMA樹(shù)形圖。具有生物除草活性且收集自加拿大薊的分離林形成了由右側(cè)粗線框出的聚類。標(biāo)明了70或更高(1000次重復(fù)的百分紛的拔承維，四舍五入到最接近的整數(shù)。枝長(zhǎng)與遺傳距離成正比，所述枝長(zhǎng)是圖上部的標(biāo)尺來(lái)標(biāo)明的。具體實(shí)施方式本發(fā)明涉及生物除草劑。更具體而言，本發(fā)明涉及真菌生物除草劑和包括真菌生物除草劑的組合物，以及用于篩選真菌分離抹以確定它們是否具有生物控制活性的方法。下面描述優(yōu)選的實(shí)施方案。術(shù)語(yǔ)"防止雜草生長(zhǎng)"或"雜草控制活性"是指當(dāng)施加到雜草上或接近雜草時(shí)會(huì)干擾雜草的正常生長(zhǎng)和發(fā)育的一種或多種巨口莖點(diǎn)霉離物、其提取物、其接種肉湯或上述物質(zhì)的組合。雜草控制活性的實(shí)例包括但不限于根生長(zhǎng)的抑制、枝條生長(zhǎng)的抑制、抽莖的抑制、雜草生物量的降低或誘發(fā)失綠癥的能力，或降低雜草對(duì)水或營(yíng)養(yǎng)或其組合的竟?fàn)幜Γ駝t所述水、營(yíng)養(yǎng)可被作物植林所利用?；蛘?真菌分離林能夠通過(guò)殺死雜草來(lái)控制它們。優(yōu)選地，真菌分離M擇性控制雜草生長(zhǎng)，且對(duì)于所需要的作物的生長(zhǎng)沒(méi)有任何實(shí)質(zhì)影響，例如非目標(biāo)植物如重要農(nóng)業(yè)植物或者家庭或商業(yè)用草。控制雜草生長(zhǎng)或具有雜草控制活性的真菌分離林可#^征為具有約20%至iooy。的雜草控制指數(shù)(wci)(wci越高，真菌分離林約有效)。所述wci包括下文所定義的一年生WCI(WCIA)或多年生WCI(WCIP)。優(yōu)選地，真菌分離^M皮表征具有約50。/。至100。/。的WCI。更優(yōu)選地，所述真菌分離林具有約70°/。至100%的WCI。然而，應(yīng)該理解的是，具有低WCI的真菌分離林仍然可以有效地幫助控制雜草生長(zhǎng)并且為非目標(biāo)植物提供超過(guò)一種或多種雜草的竟?fàn)巸?yōu)勢(shì)。牝夕卜，需要使用一種或多種具有低wci的真菌分離株以確保非目標(biāo)植物不受到所述生物除草劑的影響。所述雜草控制指數(shù)^_使用用于評(píng)估一年生雜草的WCIA或用于評(píng)估多年生雜草的WCIP來(lái)確定的，如下所述WCIA-U(IO(KFFW)+(%M)+(%IOC)/300}X100%WCIP={(100-RW)+(100-FFW)+(%M)+(%IOC)/400}X100%其中M-為根的重量FFW-為新鮮葉片的重量M-為死亡率；和IOC-為失綠癥的發(fā)病率，這是利用評(píng)分為3-6的植物來(lái)確定的，其中1=健康，深綠色葉片；2=輕度黃綠色的葉片；3=葉片主要是黃色的，一些是黃綠色的；4=葉片主要是白色的，少M(fèi)黃綠色的；5=植林完全是白色的；以及6=植林死亡。"真菌分離林"或"生物控制試劑"是指生物學(xué)活性的巨口莖點(diǎn)霉分離林(也可稱為c,鵬cro^o鵬)或從巨口莖點(diǎn)霉獲取或分離的生物學(xué)活性片段或組分。真菌分離林的片段或組分是指菌絲體的片段或獲取自所述真菌的一種或多種孢子、分生孢子器、分生孢子、原膜孢子，或它們的組合。，真菌分離林可以獲取自所需雜草(包括但不限于加拿大薊)的葉和莖組織上的小褪i錄斑和壞死斑，并且如本文中所述或使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定雜草生長(zhǎng)控制活性。本發(fā)明的具有雜草控制活性的真菌分離林為巨口莖點(diǎn)霉菌抹。本發(fā)明所用的巨口莖點(diǎn)霉分離林的非限制性實(shí)例包括85-24B(IDAC230201-1，保藏于2001年2月23日)，89-25A(IDAC110401-1,保藏于2001年4月11日)，94-26(IDAC230201-2，保藏于2001年2月23日)，94-44B(IDAC230201-3,保藏于2001年2月23曰),94-134(IDAC230201-4,保藏于2001年2月23日)，94-359A(IDAC110401-2，保藏于2001年4月11日)，95-54A1(IDAC230201-5，保藏于2001年2月23曰),95-268B(IDAC110401—3,保藏于2001年4月11日)，97-12B(IDAC230201-6，保藏于2001年2月23日)，97-15B2(IDAC110401-4,保藏于2001年4月11日)，以及它們的組合。這些分離林源自加拿大薊("m'咖a/^e/^e)并且具有生物控制活性(參見(jiàn)實(shí)施例2)。因此，本發(fā)明規(guī)定本發(fā)明的巨口莖點(diǎn)霉源自加拿大薊(C/m'咖sire/z")。源自非加拿大薊來(lái)源的巨口莖點(diǎn)霉分離林也可能會(huì)具有生物控制活性,例如，源自兵豆"e/Lfcz7/2'加r/》的分離抹SRC02-2A(參iL45)具有雜草控制活性(參見(jiàn)實(shí)施例2)。因此，本發(fā)明進(jìn)一步提供巨口莖點(diǎn)霉分離林、其提取物或其接種肉湯可以獲取自其他植物來(lái)源，只要所述分離抹具有雜草控制活性即可。"提取物"是指當(dāng)接近或被施加到雜草上時(shí)能夠防止雜草生長(zhǎng)的粗制的或更純的狀態(tài)的水性或溶劑提取物，水性或溶劑提取物所述包括一種或多種獲取自真菌分離林的活性化^。"接種肉湯"是指獲取自一種或多種本文所限定的莖點(diǎn)霉分離林(參見(jiàn)實(shí)施例5)培養(yǎng)基的肉湯，包括一種或多種能夠控制雜草生長(zhǎng)的活性化合物?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的方法來(lái)濃縮所述接種肉湯，例如但不限于蒸發(fā)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)或冷凍干燥。"飽和，，是指土壤的最大保持能力，且被定義為在土壤上部中的土壤孔隙充滿水時(shí)出現(xiàn)飽和。"田間持7jc量"或"田間保濕量，，是指飽和后且自然排水J^4亭止后兩至三天，土壤中殘余水的百分?jǐn)?shù)。"永久萎蔫點(diǎn)"是指當(dāng)置于黑暗和潮濕氣氛中時(shí)，植物萎蔫且不能恢復(fù)膨脹度的土壤的關(guān)鍵性濕度點(diǎn)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，將所述巨口莖點(diǎn)霉分離林配制成包括一種或多種巨口莖點(diǎn)霉分離林、一種或多種獲取自巨口莖點(diǎn)霉分離抹的提取物、接種肉湯或上述物質(zhì)的組合的生物控制組合物。優(yōu)選地，將所述生物控制組合物加入到土壤中、加入到堆肥中、加入到泥炭型片劑中、加入到或被用于覆蓋栽培培養(yǎng)基(例如但不限于木片)、用于在存在凈給劑(例如但不限于甲基纖維素、淀粉、粘土、糖，或它們的組合)的情況下包被或處理植物種子或者被施加到柏:物上(例如但不限于噴或涂在植物上)，以控制雜草。此外，也可以使用液體注射來(lái)將一種或多種分離林例如孢子或菌絲體、獲取自真菌分離林的提取物、接種肉湯或上述物質(zhì)的組合施加到土壤中。液體注射可被用于長(zhǎng)期用途，例如但不限于草畔草管理。術(shù)語(yǔ)"生物控制組合物"是指在適合的培養(yǎng)基中包括一種或多種生物控制試劑的組合物。生物控制試劑由一種或多種上述巨口莖點(diǎn)霉分離抹、其接種肉湯、其4^取物或上述物質(zhì)的組合組成。例如，如果所述生物控制試劑包括巨口莖點(diǎn)霉分離林，那么所述適合的培養(yǎng)基包括用于在將所述生物控制組合物施加到土壤中之前和之后維持所述巨口莖點(diǎn)霉存活率的生長(zhǎng)培養(yǎng)基。如果巨口莖點(diǎn)霉分離林的提取物、一種或多種巨口莖點(diǎn)霉分離抹或上述物質(zhì)的組合被給予至雜草或土壤，那么所iiii合的培養(yǎng)基可以包括本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的穩(wěn)定劑、表面活性劑等。例如但不應(yīng)被認(rèn)為是以任何方式限制，培養(yǎng)基可以包括補(bǔ)力口的瓊脂、pesta、泥炭粒(peatprill)、蛭石、粘土、淀粉、馬鈴薯葡萄糖肉湯(PDB)、V8(蔬菜)汁肉湯、純或豆類的整粒或整粒的一部分，所述豆類包括小扁豆或鷹嘴豆，所述谷類例如小麥或大麥或者玉米或者其任何組合或變種，只要所述培養(yǎng)J^^f吏得巨口莖點(diǎn)霉分離林保^P存活率即可。Pesta^i旨由谷類和生物控制試劑制成的顆粒狀產(chǎn)物。所述方法^^將生物控制試劑封進(jìn)糊劑裝的被稱為pesta的產(chǎn)物中(Connicketal.，1991，通過(guò)引用的方式納^v^說(shuō)明書(shū))。在這類培養(yǎng)基中形成的細(xì)菌可能會(huì)具有延長(zhǎng)的貯存壽^P田間壽命(例如，Connicketal.，1996;Connicketal.，1998)。可能會(huì)在使用前被儲(chǔ)藏或^皮用于田間雜草控制前要經(jīng)過(guò)巨離運(yùn)輸?shù)漠a(chǎn)物需要上述特征。因此，包括本發(fā)明的巨口莖點(diǎn)霉分離林的生物控制組合物可以在適合的培養(yǎng)基例如但不限于pesta中配制。如果所iiit合的培養(yǎng)基為生長(zhǎng)培養(yǎng)基，那么所述生長(zhǎng)培養(yǎng)基可能會(huì)包括任何能使本發(fā)明的巨口莖點(diǎn)霉分離林生長(zhǎng)或保持活性的液體、半液體或固體培養(yǎng)基?？梢允褂胇^T本領(lǐng)域中已知的能夠支持所述真菌分離抹生長(zhǎng)的生長(zhǎng)培養(yǎng)基。適合的生長(zhǎng)培養(yǎng)基的實(shí)例包括，但不應(yīng)被認(rèn)為是以任何方式限制，馬鈴薯葡萄糖瓊脂、馬鈴薯葡萄糖肉湯、V8(蔬菜)汁肉湯等。優(yōu)選地所述生長(zhǎng)培養(yǎng)基為固,養(yǎng)基，例如但不限于谷物，例如谷物或豆類的整?；蛘５囊徊糠?，所述豆類包括小扁豆或鷹嘴豆，所述谷類例如小麥或大麥或者玉米(參見(jiàn)實(shí)施例3)。所述生長(zhǎng)培養(yǎng)基也應(yīng)容納有效量的巨口莖點(diǎn)霉分離林以使其被在施加到土壤中一段適合的時(shí)間后保持活性，例如但不限于，施加后最長(zhǎng)達(dá)約7天至18個(gè)月。優(yōu)選地，所ii分離^^^^約14天至12個(gè)月間##活性，且更優(yōu)選地在約14天至90天。對(duì)于土壤應(yīng)用，可以將孢子、菌絲體(在谷物上生長(zhǎng))或在谷物上生長(zhǎng)的孢子和菌絲體混M來(lái)并且施加到土壤上或與土》襄混合。此外，也可以使用液體注射來(lái)將一種或多種分離林例如孢子或菌絲體、獲取自真菌分離林的提取物、接種肉湯或上述物質(zhì)的組合施加到土壤中。在優(yōu)選的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的真菌分離林的典型施加量包括但不限于，0.001kg/m2至5kg/m2，使用49-840微米的粒子大小和60-100%的粒子活性。優(yōu)選^kife加量為0.1kg/m2至1.0kg/m2。然而，可以采用^f^會(huì)獲得雜草控制活性的施加量。當(dāng)使用固體培養(yǎng)基例如無(wú)殼大麥?zhǔn)┘右环N或多種巨口莖點(diǎn)霉分離林時(shí)，可以在;^口到土壤前研磨按照實(shí)施例3中所述制備的感染的大麥?？梢约言氯魏芜m合的顆粒大小，例如從約50jam至約lmm。優(yōu)選的用于施加的粒子活性為約60-100%。如表25(實(shí)施例3)中所示，對(duì)于較小的顆粒大小，較低的施加劑量(g/m2)將會(huì)實(shí)現(xiàn)類似的或更好的雜草控制活性。本發(fā)明也考慮到了可以使用多種巨口莖點(diǎn)霉分離抹來(lái)控制雜草。類似地，本發(fā)明的生物控制試劑或生物控制組合物可以包括多種巨口莖點(diǎn)霉分離抹?？梢允褂枚喾N能夠控制特定雜草的巨口莖點(diǎn)霉分離抹或者可以#^種能夠控制不同類型雜草的多種巨口莖點(diǎn)霉分離林混合并且按本文所^口以使用。優(yōu)選地，所述生物控制試劑或生物控制組合物具有宿主選擇性，即在一種或多種目標(biāo)雜草中可觀察到雜草控制活性，而在非目標(biāo)雜草中沒(méi)有觀察到雜草控制活性。非目標(biāo)植物的實(shí)例包括重要農(nóng)業(yè)植物或者家庭或商業(yè)用草(Gramineae)。雜草是指^f^不想要的植物。優(yōu)選地，雜草為闊葉(雙子葉植物)雜草，例如但不限于菊科、石竹科、蓼科、旋花科、車前草科和茜草科中的一員。更優(yōu)選地，雜草選自菊科(菊科)包括蒲公英[7^rawc咖oJ77c/朋/eL.]、牛眼菊雛菊[C力r7sa/^力e邁咖7ei/ca/^力azwfl7]、牛蒡?qū)伲琖口常見(jiàn)的牛蒡Urc〃咖邁/zzzAJ]、假升麻[例:ft口rrago^^o"c^6/z/s〗、[侈O口J^/zM/咖<y^n/fl7a_r/z/fl〗、豕草例如常見(jiàn)的豕草arfe邁/s27/oh'a]或大豕草[如6my/a^r//b//a]、淡甘菊[他"/car/a/ei"尸o^"M6rat.]、苦荬菜例如多年生苣苦菜[5b/c力ui1ar7e/^2'5"L.]和薊，J:i口力口拿大薊[C7rs/咖arFe/2^eL.(Scop.)];石竹科(石竹科)繁縷[5Ye/7aWa/Z7^/Za(L.)Vffl.];f^牛(f^牛)包括金蕎麥[戶o77go"咖co/7ra77J7/z/5"L.];旋花科(旋花科)包括田旋花[Co"7。/ratoL];車前草科(車前草科)包括車前草LP7s/7"go/a/ceo/a"];或茜草科(茜草科)包括^R豬皿[6^/2'咖""r/"邁]本發(fā)明的生物控制試劑、生物控制組合物或兩者都可凈Ai口入到已種植或可以種才直所述種子的土壤中。可以混合所述土i裹^f吏得一種或多種生物控制試劑接近雜草的根系或4Mf片。優(yōu)選地，當(dāng)存在雜草種子時(shí)，所述生物控制試劑也可以接近這些種子?；蛘撸景l(fā)明的生物控制試劑、生物控制組合物或兩者都可被直接加入到所述雜草中?？衫萌魏伪绢I(lǐng)域中已知的方法將本發(fā)明的生物控制試劑和生物控制組合物施加到土壤中，例如但不P艮于撒、涂、敷、條播、帶播、撒播(進(jìn)行或未進(jìn)行#^)、噴灑、液體注射、灌或灌根。所述生物控制試劑和生物控制組合物也可以在任何時(shí)間施加，例如但不限于土壤耕作過(guò)程中或之后。優(yōu)選地，所述生物控制試劑和生物控制組合物是在春季或初夏時(shí)施加的。將所述生物kg/m'至5kg/m'的量加入到土壤中。將約103至109cfu/mL的液體懸液以約1L/ii^至5L/m'的速率;^口。然而，可以;^M爿可能產(chǎn)生雜草控制活性的量。本發(fā)明范疇還包括可以配制獲取自一種或多種巨口莖點(diǎn)霉分離林的提取物并將其以液體形式或固體形式施加到土壤中或雜草上，包括用配制適當(dāng)?shù)奶崛∥锿炕蛉龈邏簻缇^(guò)的感染的大麥，所述液體如噴霧、注射液、浸液、涂、撒。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠根據(jù)所述提取物或固體中活性組分的濃度來(lái)確定適當(dāng)?shù)膭┝?。?yōu)選地，所述提取物來(lái)自4周后的比原始體積濃縮了100倍的肉湯粗產(chǎn)物，或者來(lái)自將所提取的菌絲體和曱,3:1比例混合而獲得的提取物。這類提取物^i口量的一個(gè)不應(yīng)被認(rèn)為是限制性的實(shí)例為從約0.1至約2.5L/m2，這取決于活性成分的濃度。然而，可以施加任何會(huì)產(chǎn)生雜草控制活性的量。可將本發(fā)明的包括一種或多種巨口莖點(diǎn)霉分離林、一種或多種獲取自真菌分離抹的提取物、接種肉湯或上述物質(zhì)的組合的生物控制試劑或生物控制組合物加入到或用于包^皮備選的栽培培養(yǎng)基例如堆肥中，或者可以將其加入到或用于包被備選的栽培培養(yǎng)基中，所述栽培培養(yǎng)基例如但不限于木片、landscapingcloth、蟲(chóng)至石等，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)這是顯而易見(jiàn)的。此子。包被種子可以包括使用*^劑，侈w口但不限;甲基纖維素,淀粉、粘土、糖或它們的組合。因此，根據(jù)本發(fā)明，提供了一種使用包括一種或多種巨口莖點(diǎn)霉分離抹的生物除草劑、生物控制試劑或生物控制組合物控制一系列雜草的方法，所述生物控制組合物包括一種或多種巨口莖點(diǎn)霉分離林、獲取自一種或多種巨口莖點(diǎn)霉分離林的^^物、接種肉湯或上述物質(zhì)的組合?？蒦皮用于控制雜草生長(zhǎng)的巨口莖點(diǎn)霉分離M其組合包括但不限于下表1中所列出的分離抹。表1.真菌分離林信息和所作用的目標(biāo)雜草真菌分離抹目標(biāo)雜草保藏信息95-陽(yáng)54A1加拿大薊、淡甘菊、假豬殃殃、繁縷、田旋花、蒲公英、車前草、具柄向曰葵薩230201--5*97--12B加拿大薊、蒲公英、淡甘菊、假豬M、多年生苣苦菜、繁縷薦230201--6*97--15B2加拿大薊、淡甘菊、假豬殃殃、繁縷、金蕎麥、具柄向曰葵賦l訓(xùn)l--4承*94--359A淡甘菊、加拿大薊、蒲公英IDACl薩l-89--25A加拿大薊、淡甘菊、蒲公英、具柄向曰葵IDAC110401-85--24B加拿大薊、蒲公英、淡甘菊、假豬M、具柄向日葵、繁縷、車前草、金蕎麥IDAC230201--1*94--26加拿大薊、蒲公英、淡甘菊、假豬M、多年生苣苦菜、繁縷、車前草、金蕎麥薦230201--2*94--44B加拿大薊、蒲公英、淡甘菊、假豬M、多年生苣苦菜、繁縷、金蕎麥、車前草、具柄向日葵匿230201-3*94--134加拿大薊、繁縷、金蕎麥、淡甘菊、車前草、假豬艦薩230201-—4*95--268B假豬殃殃、繁縷、金蕎麥、淡甘菊、加拿大薊、蒲公英薩110401-—3***2001年2月23日保藏于加拿大國(guó)家保^(IDAC)**2001年4月11日保藏于加拿大國(guó)家保^(IDAC)現(xiàn)在看表2(和參見(jiàn)實(shí)施例2的相關(guān)方案)，這里以加拿大薊新鮮葉片重量的減少、根重量的減少、失綠癥或死亡率為例示出了一系列真菌分離抹的雜草控制活性。表2.真菌分離^加拿大薊的新鮮葉片重量(FFW)、根重量(RW)、死亡率(M)和失綠癥發(fā)病率(IOC)的作用，以及雜草控制指數(shù)(WCIP)分離林%FFW*%RW*%M%IOCWCIP**對(duì)照100±4100±51±10085-24B22±625±457±786±67494-2623±726±672±783±67694-44B8±315±280±596±28894-13420±826±559±1174±97295-54A120±1023±879±882±87997-12B59±1353±1139±1161±114789-25A76±1363±1123±836±103094-359A69±1363±1018±943±133295-268B31±732±658±875±76897-15B217±417±481±889±685*對(duì)照的％**WCIP={[(100-RW)+(100-FFW)+(%M)+(%IOC]/400}X100%,根據(jù)表2可以注意到，與未接種的對(duì)照相比，幾種真菌菌抹例如但不限于85-24B94-26、94-44B、94—134、95-54A1、97-12B、95-268B和97-15B2能夠使加拿大薊的新鮮葉片重量降低約40%至92%，并且能夠抑制4艮重量達(dá)約47%至85%。這些真菌分離抹的特征為具有約47至88%的WCIP,它們能有皿防止雜草生長(zhǎng)，高達(dá)約80%的植物被所述處理殺死的這一觀察結(jié)果支持了這一點(diǎn)。真菌分離抹89-25A和94-359A也能有皿抑制新鮮葉片重量、根重量，WCIP為約30-32%。因此，本發(fā)明涉及一種用于控制加拿大薊的生物除草劑，所述生物除草劑包括真菌分離林85-24B、94-26、94-44B、94-134、95-54A1、97-12B、89-25A、94-359A、95-268B、97-15B2,或它們的組合?，F(xiàn)在看圖1，圖1中示出了含有85-24B的接種物懸tof加拿大薊的作用。圖1表明接種濃M高，對(duì)加拿大薊的損傷約大。約5g/0.01m'至約50g/0.01m2或更高的劑量能夠控制加拿大薊。通過(guò)將感染的大麥顆津i^加到土壤中也可以，見(jiàn)察到類4以的結(jié)果。不希望囿于理論，如下所述，本文所述的巨口莖點(diǎn)霉分離林具有通過(guò)影響包括植林生長(zhǎng)和發(fā)育在內(nèi)的過(guò)程例如光^ft用、影響根中貯存產(chǎn)物的積累、減少抽莖、減慢根生長(zhǎng)、誘發(fā)失綠癥(植物葉片變黃)來(lái)削弱加拿大薊或一系列其他多年生或一年生雜草的能力。本發(fā)明的幾種巨口莖點(diǎn)霉分離林的雜草控制活性的特征表明巨口莖點(diǎn)霉分離林的雜草控制活性可能會(huì)持續(xù)一個(gè)生長(zhǎng)季，這取決于將所述真菌分離林施加到土壤或植物中的時(shí)間。參照表22(實(shí)施例3),顯示^季和夏季;^口真菌分離株會(huì)在一個(gè)或多個(gè)生長(zhǎng)季中表現(xiàn)雜草控制活性。秋季施加不會(huì)產(chǎn)生可觀察到的雜草控制活性。此外，如表24(實(shí)施例3)中所示，雜草控制活性隨土壤水分含量升高而增加。也測(cè)試了許多巨口莖點(diǎn)霉分離林，以確定它們控制除加拿大薊以外的雜草的功效，所述雜草如包括5b/c力Mar「e/ye(多年生苣苦菜)、^fe/2.a/7^/s(具柄向曰葵)、7to"c咖o/"/7c//7a/e(蒲公英)、他"/car/aper/br"a(淡甘菊)的紫菀科成員和其它植物，包括繁縷05^//"/<2邊eWa)、野生燕麥、綠色狐4^和假豬^^:("a"/咖""r/咖)。使用實(shí)施例2中所述的接種物mat生物測(cè)定(inoculummatbioassay)，將真菌分離林85-24B、89-25A、94-26、94-359A、94-44B、94-134、95-54A1、95-268B、97-15B和97-12B^口到多年生苣苦菜上。如圖2所示，在溫室試驗(yàn)中，與未接種對(duì)照相比，真菌分離抹94-44B、94-26、95-54A1和97-12B會(huì)降低根的重量。使用實(shí)施例2的表IO中所示的大多數(shù)其它真菌分離林時(shí)也觀察到了類似的根重量的降低。此外，與對(duì)照相比，真菌分離林94-44B顯著地降低了葉片生物量(圖3)和抽莖(圖4)。如圖5和表10中所示，三種分離林(94-44B、89-25A和97-12B)增加了雜草的死亡率。因此，真菌分離林94-44B、89-25A、94-26、95-54A1和97-12B可被月于控制多年生苣苦菜(化力c力mawe/w/i)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用生物控制試劑或包括94-44B的生物控制組合物來(lái)控制多年生苣苦菜。這些真菌分離^Mt用于其它雜草(包括多年生和一年生雜草)時(shí)，觀察到了類似的結(jié)果，這是通過(guò)測(cè)定一系列雜草物種的WCIiM口以證明的，例如表3中所示(也參見(jiàn)實(shí)施例2)。表3.真菌分離M淡甘菊(SC)、假豬殃殃(FC)、具柄向日葵(SF)、繁縷(CH)、金蕎麥(WB)、田旋花(FB)、多年生苣苦菜(PST)、向日葵(DA)和加拿大薊(CT)的雜草控制指數(shù)(WCI)。分離抹SC*FC*SF*CH*WB*FB*PST**DA**CT**nd-未測(cè)定*WCIA(%)={[(100-FFW)+(%M)+(%IOC)]+300}x100%.**WCIP(%)={[(跳RW)+(100-FFW)+(%M)+(%IOC)]+400}x100o/o.因此，本發(fā)明也涉及一種用于任何易感雜草(一年生和多年生)控制的包括真菌分離林85-24B、94-26、94一44B、94-134、95-54A1、97-12B、89-25A、94-359A、95-268B、97-15B2，或它們的組合的生物除草劑。優(yōu)選地，所述雜草為闊葉雜草。更優(yōu)選地，所述闊葉雜草屬于菊科、石竹科、蓼科、車前草科、茜草科或旋花科，例如但不限于淡甘菊、假豬M、繁縷、金蕎麥、田旋花、多年生苣苦菜、蒲公英和加拿大薊。當(dāng)4吏用所^i接種物mat生物測(cè)定(inoculummatbioassay)(實(shí)施例2概述的方法)時(shí)，測(cè)試了許多真菌分離林的控制向日葵(Aeh'ai7"^)的能力。利用真菌分離林85-24B影響種子萌發(fā)，這會(huì)將向日葵種子的萌發(fā)降低約10%。五種真菌分離株(85-24B、94-44B、89-25A、95-54Al、97-15B2)降低了具柄向日葵的葉片生物量(參見(jiàn)表13，實(shí)施例2)。因此，真菌分離林85-24B、94-44B、89-25A、95-54Al、97-15B2可祐J^1于控制具柄向日葵。也已經(jīng)觀察到了上述生物控制試劑和包括本發(fā)明真菌分離林的生物控制組^4勿是特異性針對(duì)目標(biāo)#^的雜草植物的，例如紫苑(菊科)家族中的植物?？傮w而言，本發(fā)明的真菌分離林不能有效地控制草的生長(zhǎng)，例如野生燕麥和綠色狐尾草(分別參見(jiàn)表15和16)。然而，94-44B對(duì)于野生燕麥中具有雜草控制活性，且85-24B和95-359A在綠色狐尾草中具有雜草控制活性(參M21，實(shí)施例2中WCI的總結(jié))。由于本發(fā)明的真菌分離株即使在高接種量的條件下(明顯高于田間糾下的用量)也具有選擇性，所以可以證明在作物中分離林不^i秀發(fā)病害癥狀或無(wú)真乾7400085-24B793084769294-262748nd913994-44B826469999694-13482546598595-54A1985472598597-12B93439571589-25A711370nd1394-359A50183nd1795-268B72920978197-15B2917253655546822702850778774336827QN55135506451164249:4845dd1Gdddd3dd僅誘發(fā)可忽略的病害癥狀(參J^30A-30D,實(shí)施例4)。所測(cè)試的作物植物實(shí)例包括1)谷類和其它單子葉植物小麥-cvs.Katepwa，ACDomain,ACKarma,Biggar，Kyle大麥-cvs.Harrington,Silky燕麥-cvs.DerbyorWalden黍子-cvs.MincoorPrairieGold力口納利子(Canaryseed)-cv.Keet2)油料種子作物蕓苔-cvs.ACExcel,ACParkland芥末-cvs.Cutlas，Ochre亞麻-cv.Vimy向日葵-cvs.CargillSF270orIS7111纟x^-cv.Lethbridge3)豆類作物小扁豆-cvs.Laird，Eston紫花婉豆一cv.Express鷹嘴豆-cv.Sanford蠶豆一cv.CDCFatima4)飼料作物三葉草-黃色三葉草cv.Norgold,白色三葉草cvs.Polara和Sonja,常見(jiàn)的三葉草、紅色三葉草cvs.Altaswede或Florex烏^_^葉草-cv.Gree紫花苜蓿-cv.Bsavcr例如，不應(yīng)被認(rèn)為是以任何方式限制，94-44B適用于谷類作物，因?yàn)榧词乖诟呓臃N量下也沒(méi)有觀察到病害癥狀。然而，不希望在高接種量下對(duì)豆類作物使用94-44B,因?yàn)樵谶@些務(wù)降下豆類作物具有一些病害癥狀。如果^J^較孑緣種量的94-44B，則可以使豆類中的病害癥狀最小化，這樣該真菌分離抹就可^皮用于豆類作物。在接種量降低時(shí)，這些分離林仍舊具有雜草控制活性。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過(guò)調(diào)整劑量來(lái)優(yōu)化獲得雜草控制活性和防止非目標(biāo)作物、重要的農(nóng)業(yè)或商業(yè)作物中的病害癥狀之間的平衡。本發(fā)明也考慮到了使用本發(fā)明的一種或多種巨口莖點(diǎn)霉分離林的接種肉湯或提取物作為雜草控制試劑。如實(shí)施例5中所述，可以將獲取自本文所述的一種或多種巨口莖點(diǎn)霉并且重溶到適當(dāng)?shù)慕橘|(zhì)(例如但不限于水或甲醇)中的接種肉湯、水I"生或可溶性提取物施加到土壤中或植物葉子上，并且所述接種肉湯、水性或可溶性提取物具有雜草控制活性。還考慮到的是本發(fā)明的接種肉湯或提取物可與化學(xué)除草劑或真菌分離林包括非莖點(diǎn)霉分離林結(jié)^^吏用來(lái)作為雜草控制試劑。本發(fā)明也考慮到了使用一種或多種巨口莖點(diǎn)霉分離林、其提取物、其接種肉湯或上述物質(zhì)的組合來(lái)在如上所述的穩(wěn)定生長(zhǎng)中或已穩(wěn)定生長(zhǎng)作物的生長(zhǎng)中控制雜草生長(zhǎng)的方法，所述作物包括但不限于草，例如但不限于家庭草坪草和專業(yè)的草畔草；畜牧牧草或干草混合物，包括例如表23(實(shí)施例3)中所示的一種或多種梯牧草、羊茅草、早熟禾、多年生黑麥草、無(wú)芒雀麥、,草、紅頂草和野茅。本發(fā)明還考慮到了使用一種或多種巨口莖點(diǎn)霉分離林、其提取物、其接種肉湯或上述物質(zhì)的組合來(lái)增強(qiáng)如上所述的穩(wěn)定生長(zhǎng)中或已穩(wěn)定生長(zhǎng)作物的生長(zhǎng)(例如生物量)的方法，所述作物包括但不限于草，例如但不限于家庭草坪草和專業(yè)的草畔草；畜牧牧草或干草濕合物，包括例如表23(實(shí)施例3)、28和29(實(shí)施例3)中所示的一種或多種梯牧草、羊茅草、早熟禾、多年生黑麥草、無(wú)芒雀麥、蘆草、紅頂草和野茅。不希望囿于理論，生長(zhǎng)的增強(qiáng)可能是由于萌發(fā)率的增加。本發(fā)明也考慮到了使用一種或多種巨口莖點(diǎn)霉分離林、其提取物、其接種肉湯或上述物質(zhì)的組合來(lái)在如上所述的穩(wěn)定生長(zhǎng)中或已穩(wěn)定生長(zhǎng)作物的生長(zhǎng)中在雜草發(fā)芽之前或之后通過(guò)葉面噴灑控制雜草發(fā)育的方法。所述作物可以是例如上述作物之一，并且包括但不限于草，例如但不限于家庭草碎草和專業(yè)的草畔草；畜牧牧草或干草混合物，包括例如表29(實(shí)施例3)中所示的一種或多種梯牧草、羊茅草、早熟禾、多年生黑麥草、無(wú)芒雀麥、F草、紅頂草和野茅。與單獨(dú)使用分離擬目比，當(dāng)真菌分離林與本發(fā)明的接種肉湯或提取物結(jié)合使用時(shí)能以一種快速的方式產(chǎn)生雜草控制活性。不希望囿于理論，所述接種肉湯或提取物能夠以一種更快的方式發(fā)揮作用，是因?yàn)椴恍枰却稣婢蛛x林的生長(zhǎng)，并且能夠在生長(zhǎng)中的真菌分離林在產(chǎn)生明顯的雜草控制活性之前先提供一種雜草控制活性。本發(fā)明也考慮到了將真菌分離^Ml真菌分離林與一種或多種化學(xué)除草劑聯(lián)合使用。此外，本發(fā)明考慮到了這樣一種生物控制組合物，所述生物控制組合物包括本發(fā)明的一種或多種真菌分離抹與一種或多種化學(xué)除草劑，以及用于維持所述真菌分離株存活率的生長(zhǎng)培養(yǎng)基。本發(fā)明也考慮到了將真菌分離抹或真菌分離抹與一種或多種非莖點(diǎn)霉真菌菌^^^f吏用。此外，本發(fā)明考慮到了這樣一種生物控制組合物，所述生物控制組合物包括本發(fā)明的真菌分離株或多種非莖點(diǎn)霉真菌分離林與一種或多種化學(xué)除草劑，以及用于維持所述真菌分離林存活率的生長(zhǎng)培養(yǎng)基。本發(fā)明還考慮到了用于檢測(cè)一種或多種具有雜草控制活性的巨口莖點(diǎn)霉分離抹的探針。所述探針可以包括SEQIDN0:1(圖9)或其片段或者SEQIDN0:15(圖19B)或其片段。所述探針是通過(guò)用限制性內(nèi)切酶化力/消化已知具有雜草控制活性的本發(fā)明真菌分離抹的基因組DNA，以產(chǎn)生實(shí)施例6中所示的;Ut1-2kb長(zhǎng)的片M制備的。用質(zhì)粒；Wz/e"W/^iK7nStratagene)將所述片段克隆到丑co//DH5oc中。通過(guò)^JUDM印跡，發(fā)現(xiàn)分離林85-25B的一個(gè)片段可與94-44B、95-54Al和85-24B的基因組DM結(jié)合(參見(jiàn)圖7)。將所述片段作為DNA印跡探針，用于其它各種莖點(diǎn)霉分離抹的染色體DM的DM印跡，以確證所述分離林探針可被用^測(cè)具有雜草控制活性的分離林。所述各種莖點(diǎn)霉分離林為7種已經(jīng)被證明具有雜草控制活性的巨口莖點(diǎn)霉分離林(圖8)，外加一種苜蓿莖點(diǎn)霉分離林和三種草莖點(diǎn)霉分離林。質(zhì)粒DNA(含有所述探針的/^/wescr/;^￡570是利用QIAGENSpinMiniprep試劑盒來(lái)分離的。將所述探針Cfoc/-r;7/2/插入片衝測(cè)序，圖9中示出了所述^4十(SEQIDN0:1)的核苷酸序列。本發(fā)明也提供了一種使用本發(fā)明的探針檢測(cè)一種或多種具有雜草控制活性的巨口莖點(diǎn)霉分離林的方法。所述方法優(yōu)選地包括在雜交務(wù)降下將所述一種或多種巨口莖點(diǎn)霉分離林的核酸與本發(fā)明的探針混合，其中所述一種或多種巨口莖點(diǎn)霉分離抹的核酸與探針的雜交說(shuō)明所述分離林具有雜草控制活性。所述巨口莖點(diǎn)霉分離林的核酸優(yōu)選地為基因組DNA。可被用于這種測(cè)定的探針的非限制性實(shí)例包括SEQIDNO:1或其片段(圖9、IO)和SEQIDNO:15或其片段(圖19B)。本發(fā)明也考慮到了用于檢測(cè)一種或多種具有雜草控制活性的巨口莖點(diǎn)霉分離林的引物對(duì)，所述引物對(duì)可包括SEQIDNO:2和SEQIDNO:3(圖10)。然而，可以使用其它引物對(duì)來(lái)擴(kuò)增SEQIDN0:1的核苷酸序列的區(qū)域。優(yōu)選地，所述引物對(duì)的每條引物為約13至約50個(gè)核苷酸長(zhǎng)。此外，也可以使用包括例如但不限于圖19B的40-60位和450-470位核苷酸的備選引物對(duì)。可以基于圖19A中所示的ITS序列比^jU^擇額外的引物對(duì)，以便選擇只有具有雜草控制活性的分離株才有的ITS序列區(qū)域來(lái)作為PCR或其它區(qū)分核酸多態(tài)性的方法的引物。這類區(qū)域包括位于圖19A的41-59位、340-350位、370-390位或450-470位核苷酸中的那些區(qū)域。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)顯而易見(jiàn)的是，也可以使用其他引物對(duì)來(lái)擴(kuò)增SEQIDNO:1或SEQIDNO:15的核普斷列的區(qū)域。優(yōu)選地，所述引物對(duì)的每條引物為約13至50個(gè)核苷酸長(zhǎng)或其間的樹(shù)長(zhǎng)度?；谔结樞蛄?SEQIDNO:l)來(lái)設(shè)計(jì)所述引物對(duì)(SEQIDNO:2和SEQIDNO:3)。也可以基于SEQIDNO:1的核苷酸序列來(lái)設(shè)計(jì)其他的引物對(duì)。可以使用這些引物對(duì)的任一個(gè)來(lái)篩選一種或多種真菌分離林以確定所述分離林是否具有雜草控制活性，所述任一個(gè)引物對(duì)例如但不限于引物對(duì)A,包括(圖10的)541-561位核苷酸和1240-1260位核苷酸；引物對(duì)B,包括(圖10的)520-540位核苷酸和1320-1340位核苷酸，或圖10的1-1371位核苷酸之間的任何其它約13-30個(gè)核苷酸長(zhǎng)的引物對(duì)。例如，所述引物對(duì)可^JUilUt過(guò)實(shí)施例6中所示的聚合Sl^式^^(PCR)擴(kuò)增提取自真菌分離林的基因組DM?？梢酝ㄟ^(guò)電泳來(lái)分離所述PCR產(chǎn)物，^J^包括SEQIDNO:2和SEQIDNO:3的引物對(duì)擴(kuò)增出的下述長(zhǎng)度的DNA片段的存在表明所述分離林具有雜草控制活性，所述DM片段長(zhǎng)度在0.8kb和1.2kb之間，或者在約700至1,200減J^之間，或?yàn)槠溟g任意長(zhǎng)度，例如為853bp長(zhǎng)。圖13中示出了這類分析的實(shí)例?？梢允褂迷醋詧D19B(SEQIDNO:15)中所示的ITS核苷酸序列的引物對(duì)來(lái)進(jìn)行類似的擴(kuò)增。本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種^J^1源自SEQIDNO:l的引物對(duì)#測(cè)一種或多種具有雜草控制活性的巨口莖點(diǎn)霉分離抹的方法，所述引物對(duì)例如但不限于SEQIDNO:2和SEQIDNO:3所限定的引物對(duì)。也可以基于SEQIDNO:1的核苷,列來(lái)設(shè)計(jì)其他的引物對(duì)，例如但不限于引物對(duì)A，包括(圖10的)541-561位核苷酸和1240-1260位核苷酸；引物對(duì)B，包括(圖IO的)520-540位核苷酸和1320-1340位核苷酸，或圖10的1-1371位核苷酸之間的任4可其它約13-30個(gè)核苷酸長(zhǎng)的引物對(duì)。所述方法優(yōu)選地包括用本發(fā)明的引物對(duì)擴(kuò)增所述一種或多種巨口莖點(diǎn)霉分離林的核酸，其中擴(kuò)增的核酸片段的存在說(shuō)明所述分離抹具有雜草控制活性。所述巨口莖點(diǎn)霉分離抹的核酸優(yōu)選地為基因組DNA。本發(fā)明涉;Oi述方法，其中^J]包括SEQIDNO:2和SEQIDNO:3的引物對(duì)、通過(guò)聚合Sl^i^1(PCR)來(lái)擴(kuò)增一種或多種巨口莖點(diǎn)霉分離抹的基因組DNA，并且通過(guò)電泳來(lái)分離所得的PCR產(chǎn)物，其中擴(kuò)增出的下述長(zhǎng)度的DM片段的存在表明所述分離株具有雜草控制活性，所述DNA片段長(zhǎng)度在0.8kb和1.2kb之間，或者在約700至1,200^J^之間，或?yàn)槠溟g任意長(zhǎng)度，例如為853bp長(zhǎng)。實(shí)施例8中給出了一種^J]隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA(RAPD)指紋篩選一種或多種巨口莖點(diǎn)霉分離林的方法。在該實(shí)施例中，并非意在以任何方式進(jìn)行P艮制，表37中給出的引物對(duì)可,M于通過(guò)PCR擴(kuò)增許多不同莖點(diǎn)霉分離林的DNA。所述PCR產(chǎn)物可通過(guò)電泳來(lái)分辨。發(fā)現(xiàn)已知具有雜草控制活性的分離林的條帶形式與其它莖點(diǎn)霉分離林條帶形式明顯不同，因此RAPD指紋提供了一種用于篩選莖點(diǎn)霉分離林以確定它們是否具有雜草控制活性的有用工具。因此，本發(fā)明考慮到了一種^JI隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DM(RAPD)指紋篩選一種或多種巨口莖點(diǎn)霉分離林以確定所述一種或多種分離林是否具有雜草控制活性的方法，所述方法包括aMM選自SEQIDNO:4;SEQIDNO:5;SEQIDNO:6;SEQIDNO:7;及它們的組合的引物擴(kuò)增一種或多種已知具有雜草控制活性的巨口莖點(diǎn)霉分離抹的染色體DNA，以獲得已知分離林的RAPD片段圖譜；b)對(duì)所要篩選的一種或多種巨口莖點(diǎn)霉分離林的染色體DM重復(fù)步驟(a)，以獲得所要篩選的分離林的RAPD片段圖譜；c)比較步驟(a)中獲得的RAPD片段圖語(yǔ)與步驟(b)中獲得的RAPD片段圖鐠，其中所述RAPD片段圖譜間的相似性說(shuō)明所述一種或多種所要篩選的巨口莖點(diǎn)霉分離株具有雜草控制活性。實(shí)施例10中給出了一種利用擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(AFLP)篩選一種或多種巨口莖點(diǎn)霉分離林的方法。在該實(shí)施例中，并非意在以任何方式進(jìn)行限制，使用P艮制性內(nèi)切酶ib汰I和胞el消化巨口莖點(diǎn)霉分離林的染色體DM以獲得許多DM片段。^^I雙鏈寡核苷酸^汰I和接頭連接所述DNA片段的fcdll和胞el位點(diǎn)。然后使用表38中給出的引物對(duì)通過(guò)PCR擴(kuò)增所連接的片段。所述PCR產(chǎn)物可通過(guò)電泳來(lái)分離(參見(jiàn)圖21)。發(fā)現(xiàn)已知具有雜草控制活性的分離林的條帶形式與其它莖點(diǎn)霉分離抹條帶形式明顯不同，因此AFLP指故提供了一種用于篩選莖點(diǎn)霉分離林以確定它們是否具有雜草控制活性的有用工具。因此，本發(fā)明考慮到了一種利用擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(AFLP)篩選一種或多種巨口莖點(diǎn)霉分離抹以確定所述一種或多種分離林是否具有雜草控制活性的方法。例如，不應(yīng)被認(rèn)為是限制性的，所述方法包括a)佳月限制性內(nèi)切酶&oRI和^el消化一種或多種已知具有雜草控制活性的巨口莖點(diǎn)霉分離林的染色體DNA，以獲得DM許多片段；b)將雙^^t苷酸和vteel接頭連接到步驟(a)中獲得的DNA片段的fcoRI和胞el位點(diǎn)上；c)使用選自下ii^列的引物對(duì)擴(kuò)增步驟(b)中獲得的連接的DNA片段(i)SEQIDNO:10和SEQIDNO:11;(ii)SEQIDNO:10和SEQIDNO:12;(iii)SEQIDNO:13和SEQIDNO:11;(iv)SEQIDNO:13和SEQIDNO:12;(v)SEQIDNO:14和SEQIDNO:11;(vi)SEQIDNO:14和SEQIDNO:12;以及它們的組合；以獲得一組已知分離林的擴(kuò)增DNA片段；d)對(duì)所要篩選的一種或多種巨口莖點(diǎn)霉分離林重復(fù)步驟(a)至(c)，以獲得一組所述分離林的擴(kuò)增DNA片段；e)比較獲自一種或多種已知具有雜草控制活性的巨口莖點(diǎn)霉分離林的擴(kuò)增DNA片^i且與獲自一種或多種所要篩選的巨口莖點(diǎn)霉分離林的擴(kuò)增DNA片ie且，其中所述擴(kuò)增DNA片段間的相似性說(shuō)明所述一種或多種所要篩選的巨口莖點(diǎn)霉分離抹具有雜草控制活性。然而，可以如上所i^i^吏用其他限制性內(nèi)切i^引物對(duì)組合物來(lái)鑒定一種或多種具有雜草控制活性的巨口莖點(diǎn)霉分離林。參照?qǐng)D21，可以容易地鑒定一組包括DAOM175940、SRC85-24B、SRC89-25A2、SRC94-26、SRC94-44B、SRC94-134、SRC94-359A、SRC95-54A1、SRC95-54A2和SRC95-268B(對(duì)應(yīng)于泳道22、44-46、48-53)并JL也包^i亥艦上未顯示但具有類似帶型的分離林SRC97-12B、SRC97-15B、SRC02-2A和SRC03-1A8的分離林。這些分離林具有由圖21可以顯而易見(jiàn)的特異性條帶形式，而且這些分離林具有雜草控制活性。該分析可凈皮用來(lái)篩選、選擇或鑒定一種或多種具有雜草控制活性的巨口莖點(diǎn)霉分離抹。因此，本發(fā)明還提供了一種巨口莖點(diǎn)霉分離林，巨口莖點(diǎn)霉分離株的特征為具有如圖21,泳道22、44-46和48-53中所乂>開(kāi)的擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(AFLP),所述擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(AFLP)方法^J1下述引物對(duì)(i)SEQIDNO:10和SEQIDNO:11;(iOSEQIDNO:10和SEQIDNO:12;(iii)SEQIDN0:13和SEQIDNO:11;(iv)SEQIDNO:13和SEQIDNO:12;(v)SEQIDNO:14和SEQIDNO:11;(vi)SEQIDNO:14和SEQIDNO:12;以及它們的組合。本發(fā)明還涉及已經(jīng)使用上述方法鑒定過(guò)的具有雜草控制活性的巨口莖點(diǎn)霉分離林，所述方法包括RAPD、AFLP、PCR或^JflSEQIDNO:1的核苷餅列或其片段或者SEQIDN0:15的核苷酸序列或其片段的雜交。本發(fā)明將在下述實(shí)施例中進(jìn)一步加以說(shuō)明。實(shí)施例l:真菌分離株的分離、貯藏和生長(zhǎng)1.1真菌分離抹真菌分離林是從收集自田地、牧場(chǎng)和路邊的加拿大薊植抹的葉和莖組織的小褪錄斑和壞死斑上分離的。利用柯赫氏(Koch's)法則證實(shí)了來(lái)自所述植物組織的純化的真菌分離林會(huì)導(dǎo)致所述病害癥狀。表4.來(lái)自加拿大薊的真菌分離林的信息名稱地點(diǎn)習(xí)性宿主生長(zhǎng)階段原始癥狀85-24BErwood，SK94-26Chatham,ON9"4BMelfort,SK94-134St.Quentin,NB95-54A1Coldbrook,NS97-12BValleyview,AB89-25AItuna^SK94-359ARM157，SK95-268BRosthem,SK97-15B2Westlock^AB葉斑病、失綠祖失綠癥失綠癥失緣癥葉片壞死莖損傷葉斑病葉斑病、莖損傷葉斑病葉斑病、莖損傷、頂梢枯死大麥田田間作物牧場(chǎng)長(zhǎng)花花生苦苔，開(kāi)養(yǎng)抽抽t營(yíng)r長(zhǎng)花A籽花花開(kāi)養(yǎng)結(jié)開(kāi)開(kāi)營(yíng)錄田，？，記邊邊田場(chǎng)耕w未路路廢牧休，剛1.2真菌分離抹的分離將按照上文所iiH得的真菌分離株在5%的次氯酸鈉中表面滅菌2分鐘、在滅菌蒸餾水中漂洗并且在24。C下置于DifcoPDA板上(馬鈴薯葡萄糖瓊脂)3-7天，12小時(shí)光照。分別將所述組織上生長(zhǎng)的真菌轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基中并且使其生長(zhǎng)至成熟。利用柯赫氏法則和對(duì)所分離葉子的生物測(cè)定來(lái)篩選分離林的致病性。將從加拿大薊上新切下來(lái)的葉子表面滅菌并且置于玻璃有蓋培^jiil中的濕潤(rùn)Whatman#3濾紙上。將取自純化的真菌培養(yǎng)物的瓊脂片置于每片葉子的中央，將所述培一密封以防止水分流失，并且按上文所述進(jìn)行培養(yǎng)。觀察到了病害癥狀的t艮。將多份所述純化的致病培,^^下文所述的冷凍保存庫(kù)中。通錄-78。C下，^JJ10。/。脫月旨奶粉(w/v)和4(W甘油(v/v)的1:1混#冷凍保存孢子和菌絲體來(lái)貯藏純化的真菌培養(yǎng)物。荷蘭細(xì)菌保藏中心(CBS)鑒定了下述10種真菌培養(yǎng)物為戶力咖a邁acro"o鵬Montagne，并JL將它們4呆藏于IDAC,1呆藏4言息如下85-24B(IDAC230201-1，保藏于2001年2月23日)；89-25A(IDAC110401-1，保藏于2001年4月11日)；94-26(IDAC230201-2,<果藏于2001年2月23日)；94一44B(IDAC230201-3,寸呆藏于2001年2月23曰);94-134(IDAC230201-4,保藏于2001年2月23日)；94-359A(I直110401-2，保藏于2001年4月11曰);95-54Al(皿C230201-5,保藏于2001年2月23曰);95-268B(IDAC110401-3，保藏于2001年4月11日)；97-12B(IDAC230201—6，寸呆藏于2001年2月23日)；97-15B2(IDAC110401-4,保藏于2001年4月11日)。1.3培養(yǎng)并貯藏真菌分離林在室溫糾(20。C)下，用lxl()S個(gè)無(wú)性孢子/L接種含有l(wèi)"mL馬鈴薯葡萄糖肉湯(PDB)或V8⑧汁肉湯(Dhingra，0.D.，andSinclair,J.B.1995.BasicPlantPathologyMethods,SecondEdition,CRCPressInc.，BocaRaton,FL.)的燒瓶，并J^振蕩器(150rpm)上培養(yǎng)最少7-14天，但更優(yōu)選14-28天。然后，#^個(gè)燒瓶的內(nèi)容物真空過(guò)濾以分離孢子和菌絲體。測(cè)量無(wú)性孢子濃度和菌絲體的鮮重。真菌可在固體或液*養(yǎng)基上生長(zhǎng)。對(duì)于固*養(yǎng)基培養(yǎng)，所有的真菌分離#^在Difco馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA:根據(jù)生產(chǎn)商的指導(dǎo)進(jìn)行制備)上生長(zhǎng)，每升培養(yǎng)基添加3ml85%的乳酸。將取自冷凍保存物的真菌培養(yǎng)物樣品融化至室溫，并且通過(guò)將所述內(nèi)容物傾倒或移液到三個(gè)或更多個(gè)制備好的平板上;W所述內(nèi)，進(jìn)行無(wú)菌分布。使用無(wú)菌的玻璃涂布##接種物涂布在每個(gè)平板的表面上。將瓊脂平板在室溫下的實(shí)驗(yàn)臺(tái)上培養(yǎng)或者在23/18。C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一至兩周，12小時(shí)光照(20W的冷白熒光燈泡)。對(duì)于液*養(yǎng)，養(yǎng)，將125mlDifcoPDB置于500ml的錐形燒瓶中。用孢子懸液或瓊脂片接種所述燒瓶。對(duì)于孢子懸液，用無(wú)菌蒸餾7K覆蓋帶有生長(zhǎng)成熟的孢子(mature)的DifcoPDA平板，并且用無(wú)菌玻璃涂布棒輕輕移出所述孢子。將孢子懸液稀釋至lxl06孢子/ml的濃度，然后將lml稀釋的孢子溶^>入到每個(gè)液?jiǎn)T養(yǎng)基燒瓶中。為了使用瓊脂片接種所述液*養(yǎng)基，從成熟的DifcoPDA平^lJi取出直徑5-8mm的瓊脂片。在周圍的光照和溫度^f牛下，將接種過(guò)的燒^i化150rpm的臺(tái)式振蕩器上培養(yǎng)2周。將取自所述液*養(yǎng)物的菌絲體(10g)放入20mL5%的脫月旨奶粉:20%甘油的冷凍4絲溶液中并且勻漿。將樣品冷凍并iL^-18'C和-73匸下^#30天，并且與勻漿后立即制備的對(duì)照進(jìn)行比較。在l&藏30天后，通過(guò)將500L懸液涂布在1/2濃度的PDA平板上、培養(yǎng)4天并且評(píng)定菌絲體生長(zhǎng)和孢子產(chǎn)量以確定活性。作為實(shí)例，在-18。C或-73X:下保存了一個(gè)月之后，在PDB或V8⑧汁肉湯中生長(zhǎng)的真菌分離林85-24B的存活率沒(méi)有下降。實(shí)施例2:使用真菌分離林控制雜草的生長(zhǎng)2.1劑量對(duì)雜草控制的影響使真菌分離株在PDA和乳酸上生長(zhǎng)10至14天。將帶有真菌培養(yǎng)物的瓊脂平;^分別稱出50g(等于整個(gè)瓊脂平紛、10g、5g、2.5g和Og(對(duì)照)的劑量，然后用無(wú)菌蒸餾7JC浸軟并且使每個(gè)劑量的接種物懸液都到達(dá)50mL的g積。作為實(shí)例，測(cè)試了85-24B。將根切成適當(dāng)?shù)拈L(zhǎng)度，例如將加拿大薊的根切成10cm長(zhǎng)，稱重并JU文入10cn^的裝有土壤的罐中。將一份劑量的接種物懸液傾倒在根的表面上，縣上lcm的土壤，加水至飽和并JUt/J顯室中(白天20。C，夜晚15。C;光照16小時(shí))，同時(shí)進(jìn)行6個(gè)平行，。在2、4和6周時(shí)，就抽莖、失綠癥和死亡對(duì)植物進(jìn)4iSf分。6周時(shí)，收集才艮并且稱重。圖1中示出了^JU分離林85-24B的研究結(jié)果(評(píng)分等級(jí)為;彩錄色葉片；2-輕度黃綠色的葉片；3-葉片主要是黃色的，一些是黃綠色的；4-葉片主^^白色的，少IU:黃綠色的；5—復(fù)抹完全是白色的；6-才t抹死亡)。上述結(jié)果表明本發(fā)明的真菌分離林可以控制雜草生長(zhǎng)，且隨著給予根的^"種物量的增加，該作用更加顯著。^種物mat生物測(cè)定將根用流動(dòng)的自來(lái)水沖洗1小時(shí)以移除過(guò)量的土壤，并且將其切成10cm長(zhǎng)，并JH段根都至少帶有一個(gè)芽。記錄2-10cm長(zhǎng)的根的重量，一個(gè)重復(fù)中所用的所有，保持類似的根重量。將接種后兩周的瓊脂平板倒扣在根片上。對(duì)照為沒(méi)有接種真菌的瓊脂平板。用2-3cm的土壤〉V^物覆蓋所述瓊脂平板和根，并且將所述^it入20/15。C的使用自然光的溫室中。記錄根接種后2、4和6周時(shí)枝條或植林的總數(shù)、死亡的枝條或植林的數(shù)量、患有癥狀(即失綠癥、壞死、損傷)的枝條或植抹的總數(shù)。六周后，記錄葉片生物量和4艮重量。就幾個(gè)l^t對(duì)lt據(jù)i^f于^^斤i)根生長(zhǎng)的百分?jǐn)?shù)[處理的最終根重量/處理的起始根重量]+[對(duì)照的最終根重量/對(duì)照的起始根重量]xlOO);ii)葉片生物量；iii)以對(duì)照百分lfc4示的抽莖；iv)患有癥狀的枝條的百分?jǐn)?shù)。2.2本發(fā)明的真菌分離株與其它巨口莖點(diǎn)霉分離株的比較巨口莖點(diǎn)霉分離林獲取自世界上^M果藏中心，通#蒲公英上使用接種物mat生物測(cè)定(inoculummatbioassay)來(lái)比較它們和本發(fā)明分離林的雜草控制能力。表5中給出了所測(cè)試的分離林<image>imageseeoriginaldocumentpage0</image>表5:獲取自全世界范圍內(nèi)的保藏中心的不同的巨口莖點(diǎn)霉分離物分離抹a屬/種宿主的屬/種地理來(lái)源和分離日期加拿大生態(tài)區(qū)[]d<image>imageseeoriginaldocumentpage0</image>ICMP10843Levin,NewZealandICMP10963Stratford,NewZealandICMP11186Wam'咖5sp.Kimbolton，NewZealandICMP12948RubberNewZealandIMI118020TheNetherlandsMl75661UK1922677Hfta/msp.EthiopiaIMI192268EthiopiaIMI299239UKIMI336757TanzaniaIMI336761TanzaniaMA1BrocksurfaceVieonajAustriaMA3312rocksurfaceVieona^AustriaSRC85-24BSaskatchewan,Canada[3]SRC89-25A2Saskatchewan,Canada[3]SRC94-26Ontario,Canada[4SRC94-26AvirNotapplicable[-c]SRC94"44BSaskatchewan,Canada[3〗SRC94-134NewBrunswickjCanada[4]SRC94-359ASaskatchewan,Canada[3SRC95-54A1NovaScotia,Ganada[4JSRC95-54A2NovaScotia^Canada[4]SRC95-268BSaskatcliew旭，Canadaf3]SRC97-12BAlberta,C咖da[3SRC9745B2Alberta，Canada[3SRC02-2ASaskatchewan,Canada[3]SRC03-1A8Saskatchewan,Canada[3〗WAC7788AustraliaWAC7881Australia5ATCC,美國(guó)菌種保藏中心；CBS,荷蘭微生物菌種保藏中心；DAOM,加拿大真菌培養(yǎng)物保藏中心(CCFC);CCM,捷克微生物保藏所；ICMP,國(guó)際植物學(xué)微生物保藏中心；IMI,CABI生物科學(xué)遺傳資源中心(以前，國(guó)際真菌學(xué)研究所(IMI));WAC,澳大利亞西部農(nóng)業(yè)部門；MA分離物是由K-Sterflinger,UniversityofNaturalResourcesandAppliedLifeScience,Vienna,Austria所提供的。b未知c實(shí)驗(yàn)室中制成的無(wú)毒性分離物(不是從自然中分離的)。d'圖6中所示的加拿大生態(tài)區(qū)簡(jiǎn)19771977200680034970.7轉(zhuǎn)溢*被40/84mAP556005'959444445557723269999990,-990s9ds9^SOS^SON9ds990099表6中示出了巨口莖點(diǎn)霉分離^Mt蒲公英生^發(fā)育的作用。結(jié)果顯示了兩個(gè)試驗(yàn)中雜草減少的平均百分?jǐn)?shù)OO，每個(gè)試^ii行5次重復(fù)。未接種的瓊脂對(duì)照的雜草減少平均百分?jǐn)?shù)CO和平均值標(biāo)準(zhǔn)誤差為15.4%±3.7S.E.且未處理對(duì)照的雜草減少平均百分?jǐn)?shù)OO和平均值標(biāo)準(zhǔn)誤差為8.3%±1.6S.E.。表6:佳JU所述"^種物mat生物測(cè)定(inoculummatbioassay)得到的莖點(diǎn)霉分離抹的根接種對(duì)蒲公英病害;^的作用。雜草減少高于50%的分離林具有高度的生物除草活性(粗體)。分離林雜草減少的百分?jǐn)?shù)(％).標(biāo)準(zhǔn)誤差SRC94-44B99.SO.SSRC02-2A99.5o.sSRC95^268B95.Sl.SSRC94-13489.03.7SRC94-359A狄04.2SRC95-54A181.26.1SRC94-2676.17.7SRC97-12B71.7S.6SRC85"24B68.25.7SRC9S-54A266.713.0DAOM17594059.911.8SRC03-1A858.66.2SRC89-25A2S7.65.8CBS297-3636,510.1ICMP1096331.69.7CBS837.8428.27.0CBS483.6623.17.8CBS198.6923.06.5CBS223.6922.19.1CBS115.1221.45.83DAOM17975020.26,2CBS185.2519.77.1CBS482.9519.65.4CBS154.8319.56.2ICMP1118619.55.3IC旨317319.26.2IMI1麵019.04.3IMI19226818.06.1CBS839.8417.76.5CBS529.6617.19.0ICMP662816.54.3ICMP703316.47.9IMI17566116.16.7CBS560.7015.04.5IMI33676114.28.3CBS371.6113.85.5ICMP681412.55,2WAC778812.26.3ATCC2452411.85.5CCMF32311.75.2CCMF32210.34.2IMI2992399.93.2CBS598.949.82.9DAOM1759519.23.7ICMP68038.73.5CBS345,9718.64.5ATCC465808.53.4ICMP27158.52.5WAC78818.03.5ICMP23257.95.0CBS112-367.23.5MA33126.84.0IMI1922676.64.594-26Avir6.52.9CBS488.946.33.4IMI3367576.32.8ICMP66034.52.4ICMP129484.11.9DAOM1751353.12.3CBS300.3600SRC97-15B*未測(cè)試未測(cè)試*發(fā)現(xiàn)SRC97-15B培，被污染且沒(méi)有重新測(cè)試新鮮的培養(yǎng)物。有十三種分離林顯示了高于50。/。的雜草減少量(表6中用粗體表示)。多數(shù)培養(yǎng)物(48)幾乎沒(méi)有或沒(méi)有雜草控制活性，雜草減少量低于25°/(表6)。來(lái)自加拿大薊(。'rw'raar^e/we)的分離林，包括本發(fā)明的分離林，對(duì)蒲公英#現(xiàn)出雜草控制活性。來(lái)自兵豆(/郎sc^/""/》的分離林SRC02-2A"^現(xiàn)出對(duì)蒲公英有雜草控制活性(99.5。/。的雜草減少量)。分離林97-15B也具有雜草控制活性。2.3本發(fā)明的真菌分離M加拿大薊的生長(zhǎng)和發(fā)育的作用表7中示出了幾種本發(fā)明的真菌分離^Mt加拿大薊的生長(zhǎng)和發(fā)育的作用。表7:4吏用所述_接種物mat生物測(cè)定(inoculummatbioassay)測(cè)得的莖點(diǎn)霉分離抹的根接種對(duì)加拿大薊病害發(fā)展的作用。<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>順-根重；z從l-綠色、itJ:至6-白色、死亡的失綠癥增加的評(píng)分等級(jí)。y每個(gè)實(shí)驗(yàn)的欄不同的字母表示^JlDuncan多范圍^:驗(yàn)P〈0.05時(shí)的顯著性差異。表7中的結(jié)a明，當(dāng)被口到土壤中時(shí)，所述分離林具有有效的雜草控制活性，例如控制加拿大薊的生^發(fā)育。2.4用于加拿大薊對(duì)照的真菌菌抹的比較4吏用所述—^"種物mat生物測(cè)定(inoculummatbioassay)測(cè)試了一系列真菌分離抹的雜草控制活性，使用加拿大薊作為雜草。表8中示出了使用上述生物測(cè)定得到的幾種真菌分離林對(duì)加拿大薊的生長(zhǎng)或發(fā)育的作用的結(jié)果。表8:在六個(gè)溫室實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行的真菌分離#^1:理對(duì)照對(duì)加拿大薊的根重量降低、葉片生物量、死亡率和病害癥M現(xiàn)的比較。對(duì)照M~Z6脈25A糾效A97-15B2根重量(對(duì)照的wExpt100a*41b8"18b683b73a85aSlabntExpt2100a33cd8dUdntnt53be34cd28cd46cDtExpt3100a23b19b16bntnt37b83a77a23bntExpf4100a6b0b28b8b加ntnt17b〗4bExpt5100a30b24b26b32b16bntmnt42b20bExpt6100a13c12c46bntntat14c17c土100±525±415±226±S32±6葉片鮮重(g)Expt15Jab2.2c5.3ab0.5d4.7ab4.1b4.8ab2.4cnt4.1a1.4cde0.2e0,1emlit2.4be1.7cde0,8dc1.8cdntExpt33.0a1.1b0，4b0.1bnt0.9b3,2a2.8a0.6bntExpt411.8a0cOcOc4.4b0,2cntntDt2.3be1.4beExpt58."0.7b0.8b1.6b0.3bntntm3.5bExpt611.ia0.5c0.8c0.7c0,4c5.9bnttilm1.8c1.7c7.2±0,S1.0士D.21.3±0.40.6土0.32.〗士0.92,2±1.12.7士0,63.0±0.52,8±0.62.0±0.61.4±0.7死亡率(y)020be038cltt7ab8ab10ab27bentExpt25a40b95c100c加加39b50b45b27abnt￡豐30勒78c85cnt加39b50b45b27abntExpt4092be00c!OOc60b92bentntnt88c87beExpt5072d78d78d40be90dm64cd73dExpt62a84c82c90c77c55bentmt80c83c+均值±SEi±i57±772±780±539±1123±8病害癥狀(患有失綠癥的枝條的百分?jǐn)?shù))Expt1087b23a100bntnt33b32a20a70bntExpt2080be95c100cnt加70be50b63bntE豐3067b90be100cntnt80be25a10a85bentExpt40100c100c100c60b%cnt8"87cExpt50100c88be78be73be100cntnt加68b90beExpt6088c100c100c90c491>nt80c卯c0±0S6"83±696"74±9S2±B36±3075±7訴i6*對(duì)于每個(gè)實(shí)驗(yàn)，每行中的不同的字母表示使用Duncan多范圍檢驗(yàn)時(shí)所述分離#對(duì)照間存在顯著性差異，P<0.1。**nt:未測(cè)試。上迷結(jié)果表明一系列莖點(diǎn)霉分離抹對(duì)加拿大薊的根重量、葉片鮮重、失綠癥和死亡率有消極的影響，并且可被用來(lái)防止加拿大薊的生長(zhǎng)和發(fā)育。將上述結(jié)果平均(表9)。上述結(jié)^明一系列真菌分離抹具有雜草控制活性，表現(xiàn)在WCIP大于20。/u。表9:4吏用所述i^種物mat生物測(cè)定(inoculummatbioassay)對(duì)10種真菌菌^^制加拿大薊的作用進(jìn)行了比較。平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差是由3-6次"^r中所收集的數(shù)據(jù)計(jì)算得來(lái)的，每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)5次。處理對(duì)照的RW豐對(duì)照的FFWo/0死亡率％IOC%wen*%對(duì)照100±5100±41±10±0085-24B25±422±657±786±67494-2626±623±772±783±67615±28±380±596±28894-13426±520±859±1174±97295-54A123±820±1079±882±87997-12B53±1159±1339±1161±114789-25A63±1176±1323±836±103094-359A63±1069±1318±943±133295-268B32±631±758±875±76897-15B217±413±681±889土685RW-根重；FFW-葉片鮮重；IOC-失綠癥發(fā)病率；WCIP-多年生雜草控制指數(shù)(wcipy產(chǎn)([(ioo-根重)+(ioo-葉片鮮重)+(。/。死亡率)+(yn失綠癥發(fā)病率)]+贈(zèng)x畫(huà)。)2.5真菌菌抹對(duì)一系列植物的雜草控制活性的比較使用所述mat生物測(cè)定(matbioassay)檢測(cè)了一系列真菌分離;^W幾種一年生和多年生雜草以及其g物的雜草控制活性。所測(cè)試的檔L物為多年生苣苦菜表io蒲公英表ll淡甘菊表12具柄向日葵表13假豬^fe:(falsecleavers)表14野生燕麥表15綠色狐尾草表16繁縷表17金蕎麥表18田旋花表19車前草表20WCI的總結(jié)表21表10-21中，^Jfl了下述縮寫(xiě)RW-根重；FFW-葉片鮮重；IOC-失綠癥發(fā)病率；WCIP-多年生雜草控制指數(shù)(WCIP%={[(lOO-根重)+(lOO-葉片鮮重)+(%死亡率)+(%失綠癥發(fā)病率)]+400}xl00%。)WCIA-—年生雜草控制指數(shù)(^從%-{[(100-葉片鮮重)+(%死亡率)+(%失綠癥發(fā)病率)〗+300}x薦。)合并S.E.=分離#對(duì)照之間的平均合并標(biāo)準(zhǔn)誤差表10:真菌分離絲制多年生苣苦菜的比較。<table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table>表ll:真菌分離躲制蒲公英的比較。<table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table>表12:真菌分離林控制淡甘菊的比較。<table>tableseeoriginaldocumentpage53</column></row><table>表13:真菌分離林控制具柄向日葵的比較。<table>tableseeoriginaldocumentpage53</column></row><table>表14:真菌分離a制假豬M(falsecleavers)的比較。<table>tableseeoriginaldocumentpage54</column></row><table>表15:真菌分離^^制野生燕麥的比較。<table>tableseeoriginaldocumentpage54</column></row><table>表17:真菌分離,制繁縷的比較。<table>tableseeoriginaldocumentpage55</column></row><table>兩次試驗(yàn)的平均值表18:真菌分離躲制金蕎麥的比較。<table>tableseeoriginaldocumentpage55</column></row><table>表19:真菌分離#^制田旋花的比較。<table>tableseeoriginaldocumentpage55</column></row><table>表20:真菌分離;^Mt制車前草CP/a/7"^/a/ceo/a&)的比較。<table>tableseeoriginaldocumentpage56</column></row><table>一年生雜草控制指^t。/。-[(100-葉片鮮重)+(。/死亡率)+(°/。失綠癥發(fā)病率)]+300x100%。認(rèn)為高于25%的雜草控制指_可接受的。表21:真菌分離糾淡甘菊、假豬艦、野生燕麥、綠色狐尾草、繁縷、金蕎麥、田旋花、車前草、多年生苣苦菜、蒲公英和加拿大薊的雜草控制指數(shù)。認(rèn)為高于25。/。的雜草控制指數(shù)是可接受的。分離襪雜草控制指我％生物活性水平概逸SCFCWBFBPLPSTDA優(yōu)選的WC1:最優(yōu)選的WCi:75-娜無(wú)真菌4:>I[)3).1oatia85-24B797692ad咖卩，，74D入CTSC,CH,WB,PL2748ad9139od10024k7無(wú)CH，CT,PLM-44BS210W961100卩8卩9幼FC,PST、DASC，CH，WB，CT,PL8205985ad站B15FC,CH.CTSC,WB,PL98[71841S410013Sl79FC，F(xiàn)B,DASC,CH,CT，PL15ndnd346147CH，DAsc89-25A71。d13adnd154330無(wú)5018ad1713nd6J2sc無(wú)95-268B72921797SIndnd4568SC，CTFC,CH,WB97-i5B291724365S5od;67985FC，CH，WB，SFSC，CTnd-無(wú)l^居；na-不適用一年生雜草SC-淡甘菊、WO-野生燕麥、GF-綠色狐尾草、FCH艮豬皿、CHi縷、WB峻蕎麥、FB-田旋花、PL-車前草種子一年生雜草控制指數(shù)%=[(IOO-葉片鮮重)+(%死亡率)+(%失綠癥發(fā)病率)]+300x100%多年生雜草PST-多年生苣苦菜、DA-蒲公英、CT-加拿大薊多年生雜草控制指數(shù)%=[(1OO-才艮重)+(100-葉片鮮重)+(%死亡率)+(%失綠癥發(fā)病率))+400x100%上述結(jié)果綜^來(lái)證明了一系列巨口莖點(diǎn)霉分離#選擇性控制雜草生長(zhǎng)時(shí)有效。這些分離抹可有效地控制闊葉雜草的生長(zhǎng)，包括車前草科例如車前草，菊科例如淡甘菊、蒲公英、多年生苣苦菜、^f^豬M和加拿大薊，石竹科例如繁縷，f^例如田旋花，旋花科例如田旋花。巨口莖點(diǎn)霉不具有控制禾本科雜草的活性，例如野生燕麥和綠色狐尾草，并且因此可以被用于控制禾;Mf牛植物中的闊葉雜草。實(shí)施例3:雜草控制活性的表征尤^義老^^^^y定為了準(zhǔn)備用于真菌分離林接種的大麥，將無(wú)殼大麥例如但不限于將barlycv.CDCSilky^7^蒸餾7jc中。排出過(guò)量的水并蹤121'C下高壓滅菌45分鐘，共計(jì)三次。高壓滅菌并冷卻接種所述燒瓶。為了制備接種物懸液，將培養(yǎng)兩周的瓊脂培養(yǎng)^tl^A^有無(wú)菌蒸餾水的廣口瓶中，并JL^入抗生素儲(chǔ)液(鏈霉素和萬(wàn)古霉素)并將所述瓊脂抗生素混合物勻漿。用所述勻漿過(guò)的接種物懸液接種每個(gè)裝有無(wú)菌大麥顆粒的容器，并JLj^普通實(shí)驗(yàn)室條件下培養(yǎng)兩周。培R后，移出容器中的大麥并且將感染的顆粒在盤(pán)上鋪成一個(gè)薄層，在室溫IHt下干燥4天。用研磨機(jī)(即ArthurH.ThomasCo.)研磨所述干燥顆粒。所#碎的接種物在室溫下最長(zhǎng)可]^藏3個(gè)月或者可被冷藏更長(zhǎng)的儲(chǔ)存時(shí)間。對(duì)照是由以相同方式處理的未接種無(wú)菌顆粒組成的。將25片碎片(piece)》化PDAa,并記錄菌落生長(zhǎng)3^粒子的數(shù)目以及7天后類似于原始真菌分離林或污染物的菌目，從而確^J"碎的接種物的存活率。為了進(jìn)4亍所述生物測(cè)定，將他泉的根切成10cm長(zhǎng)的片段，確保每個(gè)根片段都至少含有一個(gè)芽。將沖i^的根片段稱重并JL^每^中;^^兩個(gè)。將磨碎的接種物均勻地噴灑在才^土i^面上，例如約5g(也可以使用其它劑量)，并用2-3cm的土壤^/^;覆蓋，將所述^i"溫室中。記錄根培養(yǎng)后2、4和6周時(shí)枝條的總數(shù)、死亡的枝條或植株的數(shù)量、患有癥狀(即失綠癥、壞死、損傷)的枝條或植抹的總數(shù)。還記錄了6周時(shí)收集的罐中剩余的漂洗過(guò)的根的鮮重以及葉片組織的鮮重。就幾個(gè)參數(shù)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析i)才艮生長(zhǎng)的百分?jǐn)?shù)(即[處理的最終才艮重量/處理的起始4艮重量]+[對(duì)照的最終根重量/對(duì)照的起始根重量]x100);ii)葉片生物量；HU以對(duì)照百分^示的抽莖；iv)患有癥狀的枝條的百分?jǐn)?shù)。3.1作用的持續(xù)時(shí)間為了確定單次;^口本發(fā)明的真菌分離^[^幾年中的效力，以lkg/m2的水平在生長(zhǎng)季中的三個(gè)不同時(shí)期絲(加拿大薊出苗時(shí))；中夏；和秋季將樣品真菌分離林(按上文所述制備的無(wú)殼大麥接種物)施加到土壤中。確定兩個(gè)生長(zhǎng)季中所述測(cè)試罐中剩余的加拿大薊的數(shù)量。表22中示出了該實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。表22:單次;口到土壤中的分離林85-MB對(duì)田地中加拿大薊出苗的作用。<table>tableseeoriginaldocumentpage58</column></row><table>這些數(shù)據(jù)表明單次施加的本發(fā)明的真菌分離抹可有效地在一個(gè)或多個(gè)生長(zhǎng)季中發(fā)揮雜草控制活性。如果所述接種物是在春季或夏季施加的，則雜草控制活性最大；如果是在秋季施加的，則雜草控制活性會(huì)降低。3.2草坪中的雜草控制活性為了確定在由種子長(zhǎng)成草地的過(guò)程中以及在已穩(wěn)定生長(zhǎng)的多年生草岬中單次;^口的本發(fā)明的真菌分離林的雜草控制效力，在春季中以250-1000g/m2的水平(多數(shù)粒子大小為50-480ja;參見(jiàn)下表25)將樣品真菌分離林(按上文所述制備的無(wú)殼大麥接種物)施加到土壤中。在建立草區(qū)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)前將4^種物、草種和雜草種稱重。以每1/4m25.7g(200lb/英畝)的量施加草圩草的"過(guò)量播種，，混合物。它含有40。/。的多年生黑麥(ManhaUanIE和Calypso11)、25%的草地早熟禾(QuantumLeap和Alene)、15%的羊茅、10%的匍旬紫羊茅、10。/。的粗莖早熟禾(化a/^>/a7/iL)。按照這個(gè)量，將10%的雜草混^^(5%蒲公英和5°/繁縷種子)計(jì)為每1/4m20.6g。按照所^^口劑量稱取接種分離抹。播種過(guò)的草區(qū)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)的準(zhǔn)備包M轉(zhuǎn)碎土，然后通*一片11112的膠合板上來(lái)壓實(shí)苗床。耙平不平整的區(qū)域并再次壓實(shí)。在所述壓實(shí)區(qū)的中央建立1/41112的實(shí)驗(yàn)點(diǎn)。將所述草種、雜草種和接種物撒在上面并M兩個(gè)方向上用手扭rf。然后將5cm長(zhǎng)的浮動(dòng)層^(rowcover)置于實(shí)驗(yàn)點(diǎn)上2周，在此期間，每天給實(shí)驗(yàn)點(diǎn)澆水，澆水量為'^^足以使表面保持濕潤(rùn)并且在萌發(fā)時(shí)不^f吏草種脫水。在已經(jīng)長(zhǎng)成的草畔中，將所述1/41112的實(shí)驗(yàn)點(diǎn)建立在草已經(jīng)生M過(guò)20年的區(qū)域中。將草種和接種物噴灑在表面上并JU/v兩個(gè)方向上用手耙平。每天給實(shí)驗(yàn)點(diǎn)澆水，持續(xù)兩周，澆水量為足以使表面保持濕潤(rùn)但不足以使接種物隨水流出。確定整個(gè)生長(zhǎng)季中，實(shí)驗(yàn)點(diǎn)中蒲公英和繁縷植抹的數(shù)量。測(cè)量生物量，計(jì)為以克為單位的草的鮮重。表23中示出了該實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。表23:單次施加到土壤中的85-24B對(duì)草畔中蒲公英和繁縷的平均出苗率的作用。<table>tableseeoriginaldocumentpage59</column></row><table>*由于實(shí)驗(yàn)點(diǎn)中用草喂,和兔子導(dǎo)致的較大變異上述結(jié)a明了在草地生長(zhǎng)過(guò)程中和已經(jīng)長(zhǎng)成的草地中蒲公英和繁縷的控制。它們也示出了可以4吏用85-24B來(lái)增強(qiáng)草的生長(zhǎng)。3.3土壤濕度和氣溫進(jìn)一步的研究檢驗(yàn)了土壤濕度和氣溫對(duì)幾種真菌分離抹的雜草控制活性的影響，使用無(wú)殼大麥作為接種物(參見(jiàn)上文)。這些實(shí)驗(yàn)中考慮了三種土壤濕度^f牛(飽和、田間持水量和永久萎蔫點(diǎn))以及20。C或3(TC的日溫。表24中示出了這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。表24:土壤濕度和氣溫對(duì)幾種本發(fā)明的真菌分離林(89-25A、94-:26.、94-359A和97-12B)的加拿大薊控制活性的影響。<table>tableseeoriginaldocumentpage60</column></row><table>z對(duì)于每種溫度狀況，小寫(xiě)字母表示對(duì)四種分離株求平均值后的土壤濕度^f牛的差異。上述結(jié)杲表明在任一溫度下使用較高的土壤濕度可獲得更好的雜草控制活性。3.4施加方法也檢驗(yàn)了用于施加所述真菌分離林的方法。這一研究考慮了施加無(wú)殼大麥接種物或液,種物所產(chǎn)生的雜草控制活性。對(duì)于無(wú)殼大麥，檢驗(yàn)了感染過(guò)的大麥的粒子大小和劑量響應(yīng)(表25)。對(duì)于液^^種物，枱二驗(yàn)了菌絲體勻漿(與兩種堆肥混合，奶牛或月娥和家禽堆肥)對(duì)雜草控制活性的作用(表26)。按照上文來(lái)使用高溫滅菌的大麥來(lái)制備真菌接種物。在周圍的實(shí)驗(yàn)室條件下培養(yǎng)接種過(guò)的無(wú)菌大麥顆粒兩周，干燥并用研磨機(jī)(即ArthurH.ThomasCo.)研磨。對(duì)照是由以相同方式處理的未接種無(wú)菌顆粒組成的。將25片碎片(piece)放在PDA板上，并記錄菌落生長(zhǎng)3天后粒子的數(shù)目以及7天后類似于原始真菌分離林或污染物的菌落的數(shù)目，從而確^碎的接種物的活性。為了進(jìn)行所述生物測(cè)定，##^的根切成10cm長(zhǎng)的片段，確保每個(gè)根片段都至少含有一個(gè)芽。沖、射艮片段并稱重，并JL^每M中;^X兩個(gè)。將磨碎的接種物均勻地噴灑在才詠土i^面上，例如約5g(也可以使用其它劑量)，并用2-3cm的土壤〉V^g^覆蓋，將所述^^^溫室中。記錄根培養(yǎng)6周后才艮重量的變化。表25示出了結(jié)果。表25:顆粒大小和施加量對(duì)85-24B降^>拿大薊根重量的效力的影響。<table>tableseeoriginaldocumentpage61</column></row><table>5840=用85-24B侵染的全部大麥種子具有100%的活性/豐立子；840-590-研磨并_1^1過(guò)20目而非30目篩的j曼染過(guò)的大麥種子具有75%的活性/粒子；590-49=研磨并且通過(guò)30目篩的侵染過(guò)的大麥種子具有75°/。的活性/粒子。y兩次微的平均值表25中示出的結(jié)a明一系列的大麥顆粒大小和;^口量可有效控制雜草生長(zhǎng)(通過(guò)減慢根生長(zhǎng)來(lái)表示)。使用較小的顆粒和較高的施加量時(shí)可觀察到增強(qiáng)的效力。按照上文所"液*養(yǎng)基中生長(zhǎng)所述真菌(參見(jiàn)真菌分離,養(yǎng)基，實(shí)施例1)。使用雙層紗布，利用重力將液體從菌絲體中排出。將菌絲體和水以大約1:3.2(v/v)的比例勻漿以達(dá)到約105至106cfu/mL。以約1:2(v/v)的比例將所迷勻漿物與堆肥糞便^^。將兩段雜草根，例如約10cm的加拿大薊根，放入其中3/4裝滿土壤混合物(3砂壤土l泥炭土l中品蛭石l洗篩過(guò)的9咖沙)并且壓實(shí)的罐中。將根片段稱重并iMi每，中^L^兩個(gè)。將處理過(guò)的堆肥(堆肥-勻漿物混合物)力tA罐中，然后在充分澆水前用額外的土壤混合物加以覆蓋。將^it7v溫室中，并且記錄2、4和6周時(shí)枝條/罐的總數(shù)、患有癥狀(即失綠癥、壞死、損傷)的枝條或植抹的總數(shù)。在6周時(shí)收集根、漂洗并記錄鮮重，也舉了葉片組織的鮮重。就幾個(gè)參數(shù)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析i)根生長(zhǎng)的百分?jǐn)?shù)(即[處理的最終根重量/處理的起始根重量]+[對(duì)照的最終根重量/對(duì)照的起始根重量]x100);ii)葉片生物量。表26中示出了結(jié)果。表26:使用85-24B的菌絲體勻漿物接種堆肥糞便對(duì)加拿大薊控制的作<table>tableseeoriginaldocumentpage62</column></row><table>上述結(jié)果證明了使用各種堆肥培養(yǎng)基制備為勻漿物的液體接種物可有效控制雜草生長(zhǎng)。丄敘麟i參縱按照上文所^液*養(yǎng)基中生長(zhǎng)所述真菌(參見(jiàn)真菌分離，養(yǎng)基，實(shí)施例1)。一種處理橫JU生長(zhǎng)了約4-8周的95-359A、94-44B和85-24B混合物，另一種處理使用生長(zhǎng)了2周的85-24B。將菌絲體和液*養(yǎng)基肉湯勻漿以達(dá)到約103至10WmL。對(duì)照是未接種的液^"養(yǎng)基。在100mL(等價(jià)于0.02m2)的無(wú)土栽培混合物中，將25粒蒲公英種子播種到6mm深處，并且將100mL勻漿物傾倒在土:tJi。計(jì)數(shù)包括5、7和14A^出苗的蒲公英幼苗的數(shù)量和患失綠癥的幼苗的數(shù)量。表27示出了結(jié)果。表27:以土壤浸液形式施加的真菌分離林的菌絲體勻漿物對(duì)蒲公英控制的作用。<table>tableseeoriginaldocumentpage62</column></row><table>上述結(jié)^明以約5L/ii^的速率，以土壤浸液的形式施加約103至104cfu/mL的真菌勻漿物以用于雜草控制，且使用培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)的接種物時(shí)所獲得雜草控制活性會(huì)更快更高。并預(yù)賴i參縱按照上文所述將分離林94-44B在液*養(yǎng)基中生長(zhǎng)4周(參見(jiàn)真菌分離抹的培養(yǎng)，實(shí)施例1)。將菌絲體和液，養(yǎng)基肉湯勻漿以iiSj約103至104cfu/mL。使用所述真菌勻漿物(lmL)和lmL2%的methocil(纖維素粘合劑)在玻璃有蓋培養(yǎng)孤中包被36個(gè)Katewpa小麥種子(138cfu/種子)或173個(gè)匍旬紅茅草種子(29cfu/種子)。將包被過(guò)的種子在層流《櫥中空氣干燥過(guò)夜。將所述小麥種子和20粒蒲公英種子放入4英寸的無(wú)土栽培培養(yǎng)基中并且充分澆水。記錄14天后患有失綠癥的蒲公英植林的百分?jǐn)?shù)以及小麥的鮮重生物量。參錄28.表28:用真菌分離林94-44B處理作物種子對(duì)蒲公英控制和作物生長(zhǎng)的作用。處理患失綠癥的蒲公英的百作物生物量(未處理對(duì)照的分?jǐn)?shù)％百分?jǐn)?shù)%)草種子-處理過(guò)6116草種子-未處理0100小麥種子-處理過(guò)23*122*小麥種子-未處理0100*與未處理對(duì)照相比，具有P<0.05的顯著性差異上述結(jié)果證明可通過(guò)使用本發(fā)明的真菌分離林處理作物的種子來(lái)控制蒲公英。也證明了一種劑量作用，即與使用較低cfu/種子的較小種子相比，使用較高cfu/種子的較大種子產(chǎn)生了更高的控制性。3.5出苗前后的葉片噴施按照上文所述將分離株94-44B在液*養(yǎng)基中生長(zhǎng)4周(參見(jiàn)真菌分離抹的培養(yǎng)，實(shí)施例1)。用尼龍濾布過(guò)濾所述液*養(yǎng)基，并且將所述液*養(yǎng)基肉湯和菌絲體部分^H絲。用0.45pm的乙酸纖維素濾紙過(guò)濾150ml的液，養(yǎng)基肉湯以制備過(guò)濾的培養(yǎng)基肉湯處理。向另一份150ml的液g養(yǎng)基肉湯中加入15。/n的菌絲體(w/v)，然后勻漿以制備被稱為過(guò)濾的培養(yǎng)基肉湯的含有106至1(^繁殖體/ml的處理液。繁殖體包括菌絲體片段和孢子。使用M噴霧器以480L/ha的速率將這兩種處理和7JC對(duì)照噴在6-4英寸的罐上。在每個(gè)罐的無(wú)土栽培培養(yǎng)基中播種0.11g栽培草種、過(guò)量播種混合物(OverseedingMixture)和20粒蒲公英種子。播種后1-2天，對(duì)罐噴灑作為出苗前葉片噴施。^番種兩周后，再次對(duì)罐噴灑作為出苗后葉片噴施。噴灑三周后，記錄下列數(shù)據(jù)，的蒲公英總量、，患失綠癥的蒲公英數(shù)量、，中以克為單位的草的鮮重、每罐中以克為單位的蒲公英的鮮重。(參iL429)。表29:出苗前后分離抹94-44B的液,養(yǎng)基肉湯噴施的作用。噴施噴藥處理鮮重(^K對(duì)照的百^^數(shù)8/。)<table>tableseeoriginaldocumentpage64</column></row><table>對(duì)于每個(gè)施加時(shí)間，每欄中小寫(xiě)字母的不同表示P〈0.05的顯著性差異。上述結(jié)果表明可通過(guò)植物出苗前后噴施本發(fā)明的真菌分離林來(lái)控制蒲公英，并且可通過(guò)出苗前噴施來(lái)改善草的生長(zhǎng)。實(shí)施例4:本發(fā)明的真菌分離^t重要農(nóng)業(yè)植物的作用4.1施加方法的影響A)接種物mat生物測(cè)定(inoculummatbioassay)測(cè)試了一系列重要農(nóng)業(yè)植物以確定本發(fā)明的真菌分離林的宿主特異性。利用實(shí)施例2中所示的接種物mat生物測(cè)定，將所述真菌分離#^加到油料種子、絲、、豆類和飼料作物中。檢驗(yàn)了這些真菌分離糾萌發(fā)、失綠癥、葉片鮮重和死亡率的作用。4.2用于宿主范圍測(cè)試的作物使用高接種物載量的接種物mat生物測(cè)定(inoculummatbioassay)(參見(jiàn)實(shí)施例2)測(cè)試了作物對(duì)真菌分離林的易感性。因此，結(jié)果示出了比在更天然的感染條件更敏感的反應(yīng)。作物和栽培種如下所示l)谷類和其它單子葉植物小麥-cvs.Katepwa,ACDomain,ACKarma,Biggar，Kyle大麥-cvs.Harrington,Silky燕麥-cvs.DerbyorWalden黍子_cvs.MincoorPrairieGold力口納利子(Canaryseed)-cv.Keet2)油料種子作物蕓苔-cvs.ACExcel,ACParkland芥末-cvs.Cutlas，Ochre亞麻-cv.Vimy向日葵-cvs.CargillSF270orIS7111cv.Lethbridge3)豆類作物小扁豆-cvs.Laird,Eston紫花豌豆-cv.Express鷹嘴豆-cv.Sanford蠶豆-cv.CDCFatima4)飼料作物三葉草-黃色三葉草cv.Norgold，白色三葉草cvs.Polara和Sonja,常見(jiàn)的三葉草、紅色三葉草cvs.Altaswede或Florex鳥(niǎo)足三葉草-cv.Cree紫花苜蓿-cv.Beaver表30A時(shí)萌發(fā)的作用)、表30B(對(duì)失綠癥的作用)、表30C(對(duì)葉片鮮重的作用)和表30D(對(duì)死亡率的作用)示出了上述實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。表30A:真菌分離物對(duì)重要農(nóng)作物萌發(fā)的作用。加號(hào)表示對(duì)一種或多種所要測(cè)試的栽培種的有害作用且字母表示所影響的栽培種的數(shù)量(a=l-，b=2',c=3;<table>tableseeoriginaldocumentpage66</column></row><table>十表示在P-O.05時(shí)使用AKOVA比較處理和對(duì)照，對(duì)每種作物的至少一個(gè)或多個(gè)所測(cè)試的栽培種有有害作用；-表示在P—.05時(shí)使用ANOVA比較處理和對(duì)照，對(duì)處理沒(méi)有有害響應(yīng)200680034970.7勢(shì)溫也被60/84:K<table>tableseeoriginaldocumentpage67</column></row><table>表30C:真菌分離物對(duì)重要農(nóng)作物葉片鮮重的作用。加號(hào)表示對(duì)一種或多種所要測(cè)試的栽培種的有害作用且字母表示所影響的栽培種的數(shù)量(a=l;b-2;c-3;d-4;e-5)<table>tableseeoriginaldocumentpage68</column></row><table>十表示在P,.05時(shí)使用AN0VA比較處理和對(duì)照，對(duì)每種作物的至少一個(gè)或多個(gè)所測(cè)試的栽培種有有害作用；-表示在P-O.05時(shí)^f吏用A卯VA比較處理和對(duì)照，對(duì)處理沒(méi)有有害響應(yīng)<table>tableseeoriginaldocumentpage69</column></row><table>表30A-D中示出的結(jié)a明重要農(nóng)業(yè)物種的許多植物品種不會(huì)受到以高接種量^r口的本發(fā)明的真菌分離林的影響，且這些分離抹可在存在作物的情況下被用作生物除草劑以控制雜草活性。如果需要的話，可以使用較低的接種量來(lái)使其對(duì)農(nóng)作物的影響最小化，所述較低的接種量可有效^現(xiàn)出雜草控制活性但不會(huì)對(duì)作物植林有害。嵐射絲辦為了確定單次施加本發(fā)明的真菌分離林對(duì)田中生長(zhǎng)的重要農(nóng)業(yè)作物的殘留作用，使用無(wú)殼大麥接種物以1kg/n^的水平在生長(zhǎng)季中的三個(gè)不同時(shí)期將樣品真菌分離#^口到土壤中以控制加拿大薊(參見(jiàn)實(shí)施例3，作用的持續(xù)時(shí)間)。在^i口生物除草劑后大約10-14個(gè)月，以70-80kg/ha的水平將Laird栽培種的小扁豆種子播種到處理過(guò)區(qū)域的和對(duì)照區(qū)域中。對(duì)每個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)出苗的小扁豆植林的數(shù)量和患有失綠癥的植抹的數(shù)量進(jìn)^i十?dāng)?shù)。表31中示出了該實(shí)驗(yàn)的結(jié)杲。表22中示出了對(duì)加拿大薊進(jìn)行的類似實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)。表31:殘留的^口到土壤中的真菌接種物85-24B對(duì)每個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)小扁豆的平均出苗率以及每個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)的患有失綠癥的小扁豆植抹的平均數(shù)量的影響。處理出苗率失綠癥對(duì)照38±12S.E.0施力口1999年6月46±11.51999年8月40±1301999年10月19±30.3上述結(jié)果表明當(dāng)在感染的天然條件下，在春季和夏季中以高田間施用量施加時(shí)，本發(fā)明的真菌分離^w重要農(nóng)業(yè)作物沒(méi)有有害的殘余活性。實(shí)施例5:植物毒素的制備4企驗(yàn)了熱滅活的真菌分離抹的雜草控制活性。如下文所述，將無(wú)殼大麥接種物熱滅活并M加到加拿大薊上，或者將所述熱滅活"^種物與4皮5%蒲公英種子污染的草種混合(表32和33)。結(jié)g明熱滅活的真菌分離株保留了雜草控制活性。因此，還檢驗(yàn)了本發(fā)明真菌分離林的過(guò)濾的接種肉湯或提取物對(duì)雜草生長(zhǎng)的作用(圖34)。5.1真菌制劑或由真菌制劑產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物的雜草控制按照上文所述制備無(wú)殼大麥顆粒接種物(實(shí)施例3)。將所述大麥接種物高溫滅菌并JU^。到加拿大薊所生長(zhǎng)的土壤中，或者將所述接種物與用51蒲公英種子污染的草種混合(參見(jiàn)上述實(shí)施例3)。作為對(duì)照，將常規(guī)的大麥顆津iil未侵染的大麥顆豐i^i口到土壤中。在溫室和田間條件下重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)。表32和表33中示出了所述實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。表32:熱滅活的真菌侵染的大麥顆津樹(shù)加拿大薊的作用。處理失綠癥根重量(對(duì)照的6/。)死亡率％,粉絲"-未處理的對(duì)照無(wú)100a0侵染的顆粒有9b70c高溫滅菌的顆津立有33b20ab未處理的對(duì)照無(wú)100a04曼染的顆粒有67ab30b高溫滅菌的顆粒有55ab17ab每欄中不同的字母表示偵月Duncan多范圍枱r驗(yàn)P〈0.05的顯著性差異。高溫滅菌樣品中的存活率為0%,侵染顆粒的真菌存活率為100%。這些實(shí)IHi明熱滅活真菌接種物具有雜草控制活性，也就是說(shuō)雜草控制活性不必需活的真菌接種物。上述結(jié)^明天然產(chǎn)物是由本發(fā)明的真菌分離林生成的。獲取了植物毒素成分的粗提物并且分析了其雜草控制活性。表33:熱滅活的真菌侵染的大麥顆粒(分離林85-24B)對(duì)草坪中蒲公英出苗的作用。處理每個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)的蒲公英的平均數(shù)量每個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)的草的生物量(鮮重g)無(wú)顆粒11750顆粒4857侵染的顆粒1969熱滅活的4曼染顆豐立1698LS緣05)1629田間測(cè)i錄八月中旬進(jìn)行并JL^計(jì)算生物量前持續(xù)4周。上述結(jié)果證明真菌制劑或由真菌制劑產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物可以控制草;也中的蒲公英，且所述代謝產(chǎn)物可以改4"草的生長(zhǎng)。5.2植物毒素的提取和生物測(cè)定在周圍的光照和溫度^^牛下，使真菌分離株在振蕩器上的液^養(yǎng)基中生長(zhǎng)4周。使用襯有Whatman#1濾紙和2-4層紗布的Buchner漏斗通過(guò)真空過(guò)濾來(lái)將培養(yǎng)基分離為肉湯部#菌絲體部分。使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(4(TC)或凍干機(jī)自所述肉湯部分(過(guò)濾的接種肉湯)。將菌絲體部分;^氯仿中3小時(shí)至過(guò)夜，然后用Whatman#1濾紙真空過(guò)濾以分離溶劑和菌絲體。將過(guò)濾的溶劑S走轉(zhuǎn)蒸干。對(duì)照為處理方式與所述肉湯部分相同的未接種的液，養(yǎng)基。將干燥的提取物貯藏在水箱內(nèi)的燒瓶中直至使用。為了進(jìn)行測(cè)試，首先將肉湯部分和菌絲體部分的干燥培養(yǎng)JJi:解到2-5ml的蒸餾水中，然后向每個(gè)燒瓶中加入等量的80°/。甲醇。對(duì)照處理為40%的曱醇。在氯仿提取步驟之后，還獲取了所述菌絲體部分的甲醇提取物和乙酸乙酯提取物，并且按下文所述檢驗(yàn)其雜草控制活性。使用生物測(cè)定來(lái)確定各部分的液滴中是否存在能在易感植物(在本實(shí)施例中，使用蠶豆作為測(cè)^物)或加拿大薊(雜草宿主)的葉片上導(dǎo)致與真菌所導(dǎo)致的失綠斜目似癥狀的植物毒素。將蠶豆種子訪t^土壤混合物中并且使其稀釋至每罐5林植抹，每個(gè)處理佳月2罐。將加拿大薊的才MtA土壤混^中并站3周后選擇有2-3個(gè)枝條的罐。將2滴10ji1的提取物液滴^6口到每抹蠶豆植株的2片葉子上和每^i口拿大薊枝條的3片葉子上；一滴滴在昆蟲(chóng)針?biāo)斐傻拇虃?，另一滴直接滴在葉子表面上。在10天中每天觀察植株的失鄉(xiāng)錄癥狀況。4吏用一種不同的生物測(cè)定來(lái)測(cè)定源自上述部分的植物毒素對(duì)蠶豆鮮重的影響。在該測(cè)定中，將蠶豆種子與1ml^^l物和lml2%的氯哇西林混合以包#^斤述種子，然后在空氣中干燥過(guò)夜。在每罐的土壤混合物中植入5粒種子。就10天后的萌發(fā)率和失綠癥以及4周后的葉片生物量(拜重)對(duì)植林評(píng)分。表34(氯仿提取物)和表35(氯仿、甲醇或乙酸乙酯提取物)中示出了這些溶劑提取物的雜草控制活性。表34中示出了通#;^口獲取自真菌分離林94-26的氯仿提取物的液滴10A^觀察到的患失綠癥的植林(蠶豆(FB)或加拿大薊(CT))的百分WMI定的雜草控制活性。表34:本發(fā)明真菌分離林的溶劑提取物的雜草控制活性。溶劑對(duì)照為40%甲醇或未"^種肉湯。<table>tableseeoriginaldocumentpage73</column></row><table>處理n-IO抹植抹還檢驗(yàn)了氯仿、甲醇或乙酸乙酯提取物的雜草控制活性。通過(guò)檢測(cè)蠶豆的出苗率、失綠癥和葉片鮮重來(lái)測(cè)定雜草控制活性，所述蠶豆的種子已經(jīng)經(jīng)過(guò)了各種94-26的提取物或未接種對(duì)照肉湯的處理。表35中示出了該實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。表35:本發(fā)明真菌分離林的各種提取物的雜草控制活性<table>tableseeoriginaldocumentpage73</column></row><table>n-15^Mi株；每欄中的不同字母表示使用LSD枱r驗(yàn)PO.05的顯著性差異表34和35中所示結(jié)果證明過(guò)濾的接種肉湯和獲取自本發(fā)明真菌分離林的溶劑提取物對(duì)于易感植物可以誘發(fā)病害癥狀、減'漫生長(zhǎng)并且具有雜草控制活性。因此，過(guò)濾的接種培養(yǎng)基、菌絲體^:取物或它們的組^^可凈皮用于控制雜草生長(zhǎng)。實(shí)施例6:用于檢測(cè)具有雜草控制活性的巨口莖點(diǎn)霉分離抹的PCR探針的開(kāi)發(fā)6.1質(zhì)粒DNA分離和DNA揮:針測(cè)序用^c/和r卯JP艮制性內(nèi)切酶消化分離林94-44B、95-54A1和85-24B的基因組DNA以產(chǎn)生幾個(gè)1-2kb長(zhǎng)的片段。使用質(zhì)粒/^/we"r/j^Z^iT(Stratagene)將所述片段克隆到丑co/ZDH5oc中。4，DM印跡，發(fā)現(xiàn)85-25B的一個(gè)片段可與94-44B、95-54A1和85-24B的基因組DNA結(jié)合(圖7)。使用該片段作為探針用于下述各種莖點(diǎn)霉分離林的染色體DM的DM印跡，所述各種莖點(diǎn)霉分離株為7種其它的已經(jīng)被證明具有雜草控制活性的巨口莖點(diǎn)霉分離抹(參見(jiàn)實(shí)施例2.2)、一種苜蓿莖點(diǎn)霉分離^三種草莖點(diǎn)霉分離林。圖8中示出了所述DNA印跡的結(jié)果。所述^4十可與所述10種巨口莖點(diǎn)霉分離林的8種雜交，但不會(huì)與所測(cè)試的其它莖點(diǎn)霉雜交(圖8)。使用QIAGENSpinMinipr印試劑盒分離質(zhì)粒DNA(含有所述探針的/^uescr/^^STO。在PlantBiotechnologyInstitute,NationalResearchCouncilCanada,Saskatoon測(cè)序所述探針C5^/-iT/7/Lr插入片勵(lì)。圖9中示出了所述^針的核苷酸序列(SEQIDNO:1)。6.2PCR引物設(shè)計(jì)和M基于SEQ.ID.NO:1設(shè)計(jì)了用于巨口莖點(diǎn)霉分離林的PCR檢測(cè)的引物對(duì)左側(cè)？1物ACAGCTTCGACAATGGCTCT[SEQ.ID.NO:2；右側(cè)引物ACA170GCGTAGTTCCCAACISEQ.ID.NO:3然而，根據(jù)需要可以使用其它的引物對(duì)。25jli1的PCR^Jl》V給物由14.7ju1的超純7jc、2.5y1的GeneAmp10xPCR緩沖液II、2.0p1的MgCl2(25niM)、2.0ji1的dNTP';-給物(MBIFermentas，各2mM)、1.25yl的絲引物(5pM)、0.3y1的AmpliTaqGold聚合酶(5U/fi1,Appliedbiosystems)和1.0p1的才莫板DM(IOng/jul)組成。所述PCR程序包括94'C下10分鐘的初始變性，然后是35個(gè)循環(huán)的94'C下2分鐘(變性)、6(TC下10分鐘(退幻和72'C下3分鐘(延伸)，然后是在72'C下10分鐘的最終延伸。所有的PCR^都是在用于PTCDMEngineSystem的AlphaUnitBlockAssembly,Research,Inc.,Waltham,Massachusetts)中進(jìn)行的。如圖10中所示，所述引物對(duì)產(chǎn)生了對(duì)應(yīng)于SEQ.ID.NO:1的449至1301位核苷酸的853個(gè)堿基的PCR產(chǎn)物。6.3用于測(cè)試引物對(duì)4十對(duì)巨口莖點(diǎn)霉的特異性的方法表36中列出了用于測(cè)試所述PCR引物特異性的真菌培,。真菌分離林是通過(guò)將菌絲片段和孢子懸液保持在脫月旨牛奶(10%v/v)與甘油(40%w/v)1:1的溶液中，然后j&藏于-8(rc下來(lái)^^的。通過(guò)將含有所述真菌的小瓶融化至室溫來(lái)復(fù)蘇分離株。將內(nèi)，無(wú)菌地涂布在直徑為15cm的含有Difco馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)或V-8⑧汁瓊脂的有蓋培^m的培養(yǎng)絲面上，絲培養(yǎng)基補(bǔ)加了3ml85%的乳酸。在室溫和自然光照射下，將所述平板培養(yǎng)l-2周。從下文所述的每種真菌分離抹中提取基因組DNA。表36:莖點(diǎn)霉物種的分離抹物種分離物起源的宿主85-24B89-25A2戶.W。CTWfO卿94-26尸.艦cro加;n。94-134戶."。c;-o加/n。94-359A戶.；nac廣o加卿95-54A1尸，mctcro加mfl95-2鄉(xiāng)尸./7WCrO加TO。97-12B戶.m。cw/o怖fl尸.macrosto附。var,i'rtco/oratoCBS839.84戶.柳cro加wflvar,柳c,or/o啦CBS54,S3尸.mamwtomflvar.ma(ro加moCBS站2,95￡arixMill/*.加cro加"flvar.macn加加。CBS4S8,94尸01^Krtosp，戶.m。crojto加。var.mfliroytomaCBS肌84Z3,var.de朋WCBS135.96Leroy丑mw,Cfl"a拜L.尸.//"gwwPeace-3Pl86-12B旭ric。呻wr戶.//"g。w戶.//"g。加Pl89-21AlWebberexF.H.Wigg,ATV戶.herfcfl;"MmG/5/2鄰W戶.cftr^anfAemico/ti91-271戶，e:ci^w。92-180-1戶.mWc。g&iy94-335Al尸.ne6u/osfl92-749卜17727159"121Bfem.c"/i-Mmsp.02-10iS^torf。Wr他SS-321Cirsiwm。rvcwse起源的位置8來(lái)源'Saskatchewan,Canada[3SaskatchewanCanada(3jOntario,CanadaSaskatchewanCaNewBrunswick^(Saskatchewan,CaNovaScotia*CaSaskatchewanCaAlberta，Canada[3AJberta，Canada〖3Monhein^GermanyBaam^NetherlandsBaantfNetherlandsMonheim,GermanyOntario,Canada[Saskatchewan^CaBritishColumbia*CaManitol)^Canada[3]Unloiown,AustraliaMtBarker,AustraliaOntario,Canada4]Ontario,Canada{4Ontario,Canada[4Ontario,Canada[4]Ontario'Canada4Manitoba^Canada[3〗Saskatchewan*Canada[3]Saskatchewan,Canada3〗Io叫USAOntaiio，Canada[Saskatchewan*CaOntario,Canada[Saskatchewan,CaNewBrunswiclt;CaSaskatchewan,<Saskatchewan,CaSRC/IDACSRC/IDACSRC/IDACSRC/IDACSRC/IDACSRC/IDACSRC/BDACSRC/IDACSRC/IDACSRC/IDACCBSCBSCBSCBSCBSCBSSRCSRCSRCSRCSRCG.BolandG.BolandG,BokndSRCSRCSBCSRCSRCSRCSRCSRCSRCSRCSRCSRCSRCa.括號(hào)中的數(shù)字是指加拿大的生態(tài)區(qū)。b,SRC-加拿大薩斯卡通農(nóng)業(yè)和農(nóng)產(chǎn)品研究中心，薩斯卡通，加拿大；IDAC《藏于加拿大國(guó)際保藏局，溫尼伯，加拿大；CBS-荷蘭細(xì)菌保藏中心，烏德勒支，荷蘭。6,4用于測(cè)試引物對(duì)針對(duì)巨口莖點(diǎn)霉的靈敏度的方法使巨口莖點(diǎn)霉接種物94-44B在無(wú)菌脫殼大麥顆粒上生長(zhǎng)，所述大麥顆粒^^jt松歉密封的250ml罐頭罐中。用10ml真菌接種物懸液接種所述顆粒，所述懸液是通過(guò)將培養(yǎng)了2周的培養(yǎng)M添加了3ml抗生素儲(chǔ)液(W鏈霉素和0.5%萬(wàn)古霉素)的300ml水中勻漿(將PolytronKi識(shí)aticaPt10-35i殳置在5-7)30秒來(lái)制成的。在普通實(shí)驗(yàn)室條件下將接種過(guò)的^養(yǎng)2周，然后在通風(fēng)的情況下在內(nèi)襯鋁箔的盤(pán)上干燥所述感染的顆粒。然后將顆粒研磨成49-840/Lim的粒子。在溫室條件下，使用所述研磨過(guò)的接種物將7種劑量(即0、4、8、16、31、63和125g/m2表面積)的真菌⑩口到10.5血2的罐中。為4吏所述真菌接種物特別是較^^種量的接種物能在所it4面上均勻分布，將所有的劑量處理與一定比例的未侵染的研磨大麥混合，使得施加到每^中的顆粒總量等于125g/m2的接種量。在，中播種20粒蒲公英種子和0.11g草坪草"過(guò)量播種〉、^^物，，(^^有40%多年生苣苦菜"0//咖/^^朋6Z.，cvs.Manhattanffl和Calypso11)、25傳地早熟禾(/toa;r"e/57'".，cvs.QuantumLeap和Alene)、15%羊茅CPe"wcar^ravar,c畫(huà)"f"sGaud,)、鄉(xiāng)匍匐紫羊茅(尸e"i/car"6raL.)和10。/。粗莖早熟禾(尸oa"/r/a/ZsL.))。施加接種物10天后，就失綠癥的百分比給蒲公英評(píng)分。3周后收集土壤以及草和蒲公英的根，并且取樣以進(jìn)行DNA提取。所述實(shí)騶3殳計(jì)為進(jìn)行4次重復(fù)的隨才幾完全區(qū)組。6.5用于從真菌培養(yǎng)物、植物和土:t裏中提:^基因組DNA的方法在PDA平板上生長(zhǎng)真菌培養(yǎng)物，并佳月QIAGENDNeasyPlantMini試劑盒進(jìn)行DM分離。^M^斤述培養(yǎng)基平板的潮-錄面上刮取約100mg菌絲體和孢子，并_0^盛有液氮的微量離心管中使用小塑料^#將其磨碎。按照生產(chǎn)商的說(shuō)明書(shū)(QIAGENInc.,Mississauga，Ontario)完成接下來(lái)的步驟。將植物仔細(xì)i緣土壤中移出以保持根的完整。所述植物樣品多數(shù)為草坪草，偶爾存在一些蒲公英。將所述植物ii^v^有水的燒杯中并且振蕩以移除附著的土壤，然后用自來(lái)水漂洗直至可以見(jiàn)到不含土壤顆粒的根。將所述樣品在自來(lái)水中再次振蕩30分鐘，然后用自來(lái)水漂洗。在用蒸餾水進(jìn)行最終漂M，將才MUkJi組織上切下來(lái)并且用紙巾吸千。4^基于Edwardsetal.(1991)厄c/.^/^y及es.19:1349的方案提Wi物DNA,RNA酶A處理之后為~氯仿萃取。選擇UUraClean加SoilDNA試劑盒(MOBIOLaboratories,Inc.,SolanaBeach,California)^jL壤樣品中提取DM。對(duì)于每個(gè)樣品，按照生產(chǎn)商的指導(dǎo)^J10.3g直徑小于lmm且不含明顯的植物碎片的細(xì)土壤粒子。6.6PCR引物的特異性和靈M測(cè)試的結(jié)果測(cè)試了15種巨口莖點(diǎn)霉分離抹、代表8種其它莖點(diǎn)霉的13種分離#來(lái)自7個(gè)其它屬的常見(jiàn)土壤真菌的7種分離林(表36)對(duì)所述PCR引物的特異性。所述引物對(duì)(SEQ.ID.NO:1;SEQ.ID.NO:2)對(duì)圖11中所示的全部10種具有雜草控制活性的巨口莖點(diǎn)霉分離是高度特異性的。這些分離林全部都分離自Ga斤e;Lye(加拿大薊)。為檢測(cè)到分離自其它宿主如￡ra/卵re,池7ade7/7力iAycwo/7a"'esL.，Zar/>ctec/VfwasMill.，尸o"7^'asp.和7y/〃c咖aes〃V咖L.的巨口莖點(diǎn)霉的其它分離株。類似地，利用所述引物未檢測(cè)到8種其他的莖點(diǎn)霉和7個(gè)其它屬的分離林。為了評(píng)估在檢測(cè)低濃度的分離林94-44B過(guò)程中所述PCR引物靈M如何，從溫室i緣中用不同劑量接種物(0-125g/m"處理過(guò)的罐中取出土壤和植物根的樣品。在^JI0g/tf的土壤樣品中^r測(cè)到所述生物控制分離林，但是如圖12中所示，在<^4g/m2-125g/m'接種物處理的土壤中檢測(cè)到了所述分離林。在植物根中，在劑量為8g/m2-125g/瓜2時(shí)檢測(cè)到了分離林94-44B,但是在劑量為4g/m2的最低劑量時(shí)未檢測(cè)到該分離抹(圖12)。^Mt物中取樣進(jìn)行DM提取前，在用高接種量處理過(guò)的蒲公英幼苗上^^到了幾種失綠癥癥狀。在劑量為0、4、8、16、31、63和125g/m2時(shí)，失綠癥百分?jǐn)?shù)分別為0、19、28、64、93、92和100%(LSD。,。產(chǎn)2.9)。6.7使用PCR引物對(duì)對(duì)來(lái)自世界保藏中心的巨口莖點(diǎn)霉進(jìn)行的引物特異性識(shí)別獲得了來(lái)自不同保藏中心的62種源自不同宿主和地理來(lái)源的巨口莖點(diǎn)霉分離林(表5)。在J]t^分離抹后tW分離^ii行復(fù)蘇，分離單孢子并在補(bǔ)加了85%乙酸(3ml/L)的馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PM;DifcoLaboratories,Detroit,Michigan,USA)上培養(yǎng)。在23±1。C和12小時(shí)光照下孵育培輛，所述光照由兩個(gè)置于平板上方30cm處的40W、120cm長(zhǎng)冷白色熒光管^^。真菌分離林是通過(guò)將菌絲片段和孢子懸液保持在脫脂牛奶(10%v/v)與甘油(40%w/v)1:1的溶液中，然后J3i藏于-80'C下來(lái)保存的。使每種分離抹的單孢培^7在PDA上生長(zhǎng)5-7天，^將菌絲體片轉(zhuǎn)移到250ml含有100ml馬鈴薯葡萄糖肉湯的錐形燒瓶中，并在23±1'C下在軌道振蕩器(150rpm)上培養(yǎng)7天。通過(guò)過(guò)濾收集菌絲體，凍千并在2mlWheaton-Tenbroek組織研磨器(FisherScientific,Ottawa,Ontario,Canada)中研磨，然后加入800jul裂解緩沖液("/。十二烷^^危酸鈉、10mMTris-HCl[pH8.0〗、0.5MNaCl和10mMEDTA)。然后按照Sambrook"".(1989)#o/ecu/arC/o"http://^.-^Za6orafor/ColdSpringHarbourPress,ColdSpringHarbour,NewYork的方法進(jìn)行基因組DNA提取。將DNA重懸于100juLTE緩沖液中(10mMTris-HCl[pH8.O]和1mMEDTA)，并且使用NanoDropND-l000(NanoDropTechnologies,Inc.,Rockland,Delaware)通過(guò)分光光度法來(lái)定量。通ii^入TE緩沖液將DNA調(diào)整至10ng/jaL并貯藏于-2(TC下直至^f吏用前。4吏用所述引物對(duì)(SEQ.ID.NO:2;SEQ.ID.NO:3)擴(kuò)增每種分離株的基因組腿。所述引物由InvitrogenLifeTechnologiesInc.(Burlington,Ontario,Canada)合成。PCR反應(yīng)是以25n1的總體積^i^行的，所述體積包括0.5)^L純化的基因組DM模板(10ng/|iL)、1.25jaL每種引物(0.5|jM)、2.0|iLdNTP〉、給物(dATP、dCTP、dGTP和dTTP[NewEnglandBiolabs，Ltd.，Pickering,Ontario,Canada]各2nM)、2.0"LMgCl2(25mM)、0.3juL7^醒聚合酶(5U/pL[PromegaCorporation,Madison,Wisconsin])和2.5|aL10xPCR反應(yīng)緩沖液(50mMTris-HCl[pH8.0]、100mMNaCl、0.1mMEDTA、1mMDTT、50%甘油和1%TritonX-100)。m步驟包括94。C下3鍵的初始變性，之后是35個(gè)循環(huán)的變性(94。C下60秒)、退火(60X:下60秒)和延伸(72。C下90秒)，以及72。C下10分鐘的最終延伸。6.8PCR產(chǎn)物的電泳和顯影PCR^Jl;^在用于PTCDMEngineSystems(MJResearchInc.，Waltham,Massachusetts)的AlphaUnitsTMBlockAssembly中進(jìn)行的。通it^2%的含有1xTris乙酸鹽-EDTA的瓊脂糖上進(jìn)行電泳來(lái)分離PCR產(chǎn)物。皿在100V下電泳3小時(shí)，然后在顯影前用1lag/mL的溴化乙錠染色15-20分鐘并在UV燈下拍照。重復(fù)所有的PCR擴(kuò)增以枱:lir再現(xiàn)性。對(duì)于14種已經(jīng)證明具有雜草控制活性的分離林的^-種來(lái)說(shuō)，圖13示出了使用所述引物對(duì)(SEQ.ID.NO:2;SEQ.ID.NO:3)的PCR擴(kuò)增可以擴(kuò)增出遷移率在0.8和1.2kb長(zhǎng)的標(biāo)記之間的單個(gè)DM片段(參見(jiàn)實(shí)施例2.2)。這14種分離抹包括本發(fā)明的所有分離林(薩斯卡通研究中心(SRC)保藏且用前綴SRC標(biāo)記)，還有同樣來(lái)源于薩斯卡通研究中心保藏的分離林SRC02-2A和SRC03-1A8，以及來(lái)源于加拿大農(nóng)業(yè)部菌種中心(也稱為加拿大真菌培養(yǎng)物保藏中心)的另一種分離抹DAOM175940(CCFC003534)。DAOM175940的收集獨(dú)立于所述SRC分離林，幾乎是在該計(jì)劃開(kāi)始前的20年(參見(jiàn)表5)。在實(shí)驗(yàn)室中制備而非從自然中分離的無(wú)致病性分離株SRC94-26Avir不會(huì)與源自加拿大薊的天然分離林一樣產(chǎn)生遷移率在0.8和1.2kb長(zhǎng)的標(biāo)記之間的單個(gè)DM片段。除對(duì)應(yīng)于分離祙IMI175661的泳道41中的另一種孩4:弱擴(kuò)增產(chǎn)物0卜(參見(jiàn)圖13B)，所述撰i:弱擴(kuò)增產(chǎn)物在重新擴(kuò)增時(shí)不能產(chǎn)生陽(yáng)性^JU圖13C,泳道22),使用所述引物對(duì)(SEQ.ID.NO:2;SEQ.ID.NO:3)的PCR擴(kuò)增不^^吏來(lái)源于任一其它巨口莖點(diǎn)霉分離林的基因組DM的產(chǎn)物被擴(kuò)增。為重新分析唯一可疑的分離林B1I175661,重新擴(kuò)增來(lái)自該分離林以及位于其任一側(cè)的分離林的DM(即圖13B的泳道40和42，分別為IMI118020和IMI299239K重新擴(kuò)增后兩種分離株是為了確認(rèn)圖13B泳道41中看到的產(chǎn)物不是源于任一側(cè)分離林，也不是由于在上樣過(guò)程中少量DNA的溢出或滲漏或者由于失誤。此外，由于泳道邊界有時(shí)難以區(qū)分，所以包括這兩種分離林以確保充分解決問(wèn)題。重新擴(kuò)增之后，這些分離林所產(chǎn)生的所有反應(yīng)均為陰性(圖13C，泳道21-23)。相反，在第一輪實(shí)驗(yàn)中有三種SRC分離株不能擴(kuò)增，盡管被預(yù)期會(huì)產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物(圖13A)。在調(diào)整了DM濃度后重新擴(kuò)增SRC97-15B2、SRC85-24B和SRC95-54A1(圖130。除SRC97-15B2外，4^獲得了陽(yáng)性^1。形態(tài)學(xué)^rl^表明SRC97-15B2的培養(yǎng)^dt受了污染，所以用貯藏培養(yǎng)物復(fù)蘇SRC97-15B2并提取DNA用于重新分析，^觀察到了陽(yáng)性M(圖13D,泳道12)。圖13D所示分析中包括了之前未測(cè)試的其它分離林SRC03-U8(參M5)、巨口莖點(diǎn)霉型培絲CBS223.69和CBS529.66,以及不屬于表5中所示的巨口莖點(diǎn)霉群組的莖點(diǎn)霉屬的幾種其它分離林。注意到無(wú)致病性的分離林SRC94-26Avir始終為陰性。上述結(jié)果證明由SEQIDNO:1所限定的探針可被用于區(qū)#識(shí)別具有雜草控制活性的真菌分離林。此外，SEQIDNO:1的片段也可以被用來(lái)鑒定具有雜草控制活性的真菌分離林。實(shí)施例7:巨口莖點(diǎn)霉的生物除草劑分離林的染色,型7.1脈沖場(chǎng)凝皎電泳法利用脈沖場(chǎng)凝膠電泳(PFGE)分析比較巨口莖點(diǎn)霉的生物除草劑分離林(包括本發(fā)明的分離林)以及苜蓿莖點(diǎn)霉的一種分離抹和草莖點(diǎn)霉的三種分離抹的染色體DM，。通站10%V8⑧汁瓊脂上傳代培養(yǎng)并iL^室溫(20-24*0和100-150mE/mVs的16小時(shí)光周期下培養(yǎng)來(lái)維持所述分離林的單孢子培養(yǎng)物。通過(guò)用0.05%的Tween80摩擦所ii^面并且用兩層神奇濾布(Miracloth)過(guò)濾所述孢子懸液來(lái)收集14天培養(yǎng)物的器孢子。按照Pl飄erandHowlett(1993);Cwr24:107-113所述制備染色儲(chǔ)入片段。按照進(jìn)行了少許改變的ChenandSeguin-Swartz(1999);/尸/a/,,W力o/21:361-367,在irC下使用0.5xTBE緩沖液在鉗位均勻電場(chǎng)電泳(CHEF)DRII系統(tǒng)(Bio-Rad，Mississauga,Out,Canada)上進(jìn)行電核型分析，如下所述初始切換時(shí)間為600秒且最終切換時(shí)間為600秒，在100V下進(jìn)行72小時(shí)；然后是初始400秒且最終400秒，在100V下進(jìn)行46小時(shí)。用0.1蹄/iiil的溴化乙錠溶液染色并拍照。將每種分離林的染色體DNA條帶記錄為存在("1")或不存在("O，，)。使用用于Windows的系統(tǒng)進(jìn)化軟件包TREEC0N⑧(1.3b版；VandePeerandDeWachter(1994)Cb邁/7u,a〃o刀a7^j^/c3〃o/sAAwc/e/zces,10:569-570)來(lái)^^斤^t據(jù)。按照NeiandLi(1979)尸roceed//7^7oTf力ejVa〃o加/^7ade早Jc/e/zce51/力ett7i7ediY"ey血er/ca，76:5269-5273進(jìn)行進(jìn)^J巨離預(yù)測(cè)。使用帶有算術(shù)平均值的^M口fet群集群法(UPGMA;Benz6criJP(1973)L'analysedesdonn6es.TomeI.Lataxonomie.Dunod(ed)，Paris,France)來(lái)推斷樹(shù)形布局?；簿揠x預(yù)測(cè)和樹(shù)形布局中包括拔靱分析^^系統(tǒng)進(jìn)化上引入置信區(qū)間(EfronandGong(1983)血37:36-48.;Felsenstein(1985)細(xì)/w〃叫39:783-791;Sworffordetal.(1996)HillisDM,MoritzC，MableBK,eds.MolecularSystematics.SinauerAssociates,Sunderland,USA.pp.407—514)。7.2PFGE分析的結(jié)果使用PFGE分析生成了圖14所示的27個(gè)多態(tài)染色體DNA條帶。苜蓿莖點(diǎn)霉和草莖點(diǎn)霉的染色體圖與巨口莖點(diǎn)霉的不同。巨口莖點(diǎn)霉的生物除草劑分離林分為兩類不同的染色體圖(I型和n型)。如圖15所示，所述I型包括分離林94-44B、85-24B、94-26、95-268B和95-54A1,另外五種分離林(94-134、94-359A、97-12B、97-15B2、89-25A2)屬于II型。實(shí)施例8:巨口莖點(diǎn)霉生物除草劑分離林的RAPD指紋8.1隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA法將來(lái)自生物除草劑分離抹(包括本發(fā)明的分離抹)的DNA的隨機(jī)擴(kuò)增結(jié)果與表36所示的其它莖點(diǎn)霉分離抹的結(jié)果進(jìn)行比較。所4狄的引物為購(gòu)自生物4支術(shù)實(shí)驗(yàn)室(UniversityofBritishColumbia(UBC)，Vancouver,BritishColumbia)的10個(gè)>^長(zhǎng)的寡核苷酸并錄表37中列出。表37:選來(lái)用于RAPD分析的10個(gè)^長(zhǎng)的寡核苷酸引物引物編號(hào)Tii]GC%SSEQ.ID.NO:UBC3085'AGCGGCTAXJG3'5UBC^UBC3565'GCGGCCCTCT3'80UBC5UBC7345'GGAGAGGGAG3'70UBC6UBC7365'GAGGGAGGAG3'70UBC7用25pi的^Jl^^物i^阡DM擴(kuò)增，均含有20ng的模板DNA、1個(gè)單位的AmpliTaqGold^L合酶(5U/ji1，AppliedBiosystems)、1/10體積(2.5jil)的GeneAmp10xPCR緩沖液II、2.0mMMgCl2、0.2引物和100^iM的每種dNTP(MBIFermentas)。所述PCR程序包括94'C下10分鐘的初始變性，然后是45個(gè)循環(huán)的94。C下1M(變性)、35。C下1分鐘(退火)和72'C下2分鐘(延伸)，然后是在72"C下10分鐘的最終延伸。所有的擴(kuò)增AJI都^^在用于PTCDNAEngineSystem的AlphaUnitBlockAssembly(MJResearch,Inc.)中進(jìn)行的。通過(guò)在1.5%的瓊脂糖^_11進(jìn)行電泳來(lái)分析所述擴(kuò)增產(chǎn)物。為了檢驗(yàn)擴(kuò)增子的再現(xiàn)性，重復(fù)進(jìn)行擴(kuò)增。兩種中帶型相同，說(shuō)明了再現(xiàn)性。#^種分離株的染色體DM條帶記錄為存在("1")或不存在("0")。佳月用于Windows的系統(tǒng)ii化軟件包TREEC0N(1.3b版；VandePeerandDeWachter(1994)C卿W"/咖/場(chǎng)7/c"/o/w2,/zMeS/0sc/e/2ces，10:569-570)來(lái)^^析lfc據(jù)。按照NeiandLi(1979)戶roceed/"^yo尸^"o/za7hflfe早o尸5We/7ce51Mett"ef/i"e^o尸血e,/ca，76:5269-5273進(jìn)行進(jìn)4M巨離預(yù)測(cè)。使用帶有算術(shù)平均值的^H樹(shù)群集群法法(UPGMA;Benz6criJP(1973)1/analysedesdonn6es.TomeI.Lataxonomie.Dunod(ed)，Paris,France)來(lái)推斷樹(shù)形布局。在距離預(yù)測(cè)和樹(shù)形布局中包括拔孰分析來(lái)在系統(tǒng)進(jìn)化上引入置信區(qū)間(EfronandGong(1983)血37:36-48.;Felsenstein(1985)fra/i/〃OA39:783—791;Sworffordetal.(1996)HillisDM,MoritzC，MableBK，eds.MolecularSystematics.SinauerAssociates,Sunderland,USA.pp.407—514)。8.2RAPD指紋的結(jié)果使用引物UBC308、UBC356、UBC734和UBC736的生物控制分離林的RAPD片段圖彼此類似，但與圖16A-D中所示的巨口莖點(diǎn)霉變種莖點(diǎn)霉、巨口莖點(diǎn)霉變種CP.鵬oray"邁arar.//co/ora^)和其它莖點(diǎn)霉物種的其它分離林的RAPD片段圖不同。本發(fā)明的4^10種生物控制分離抹密切相關(guān)并且被聚類到圖17中所示的標(biāo)記為"巨口莖點(diǎn)霉生物控制分離抹"的組中。該組中的分離^^有PI^呈度上彼此不同。例:W^I引物UBC356、UBC734和UBC736時(shí)，97-15B2的帶型與其它生物控制分離財(cái)少許不同。^^J引物UBC736時(shí)，分離林95-54A1也具有一條額外的條帶。本發(fā)明的生物控制分離^M皮歸為一類，并且與其它莖點(diǎn)霉分離*在基因上的不同。在所述生物控制分離林的聚類中，將源自兩個(gè)不同的加拿大生態(tài)區(qū)的分離林隨機(jī)M。將進(jìn)化距離^1置于圖上部，并且將自展值置于樹(shù)的節(jié)點(diǎn)上。除樹(shù)底部的小組外，所述小組僅得到了59%的拔孰復(fù)制的支持，對(duì)于所有的主要聚類來(lái)說(shuō)，顯然具有強(qiáng)有力的統(tǒng)計(jì)學(xué)支持。實(shí)施例9:巨口莖點(diǎn)霉的生物除草劑分離林的ITS測(cè)序位于所述小(18S)和大核糖體亞基(LSU)的核糖體DNA區(qū)域^^有兩種快速進(jìn)化序列，稱為內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)1和2。這些由高保守性5.8S核糖體RNA基因分隔的快速進(jìn)化序列能夠在物種水平上表現(xiàn)出差異。因?yàn)檫@些序列代表了序列數(shù)據(jù)庫(kù)的最大的組分并且可以m^易地^^通用引物來(lái)擴(kuò)增(Whitea人(1990)戶C戶ro^7co/s.'Jft//ctefo#e^fotfsa/wfJ/;p7ycaf/oi^，eds.Innis，M.A.，Gelfand，D.H"Sninsky，J.J.，White,T.J.AcademicPress,Inc.，NewYork;pp.315-322)，對(duì)該區(qū)域的序列分片斤可以掮:供用于物種鑒定和物種界限描繪的有用工具。此外，ITS測(cè)序可以提供用于在種群研究或基因多樣性分析前評(píng)估分離林親緣關(guān)系的有用工具。也可以鑒定所述ITS序列中只有具有雜草控制活性的巨口莖點(diǎn)霉分離株才有的區(qū)域，且可以使用這些區(qū)域通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(包括PCR或SNP分析)來(lái)測(cè)定具有雜草控制活性的分離抹。9.1真菌分離抹和DM提取上述實(shí)施例6.7中描述了所有關(guān)于真菌DM的保藏、復(fù)蘇、培養(yǎng)、貯藏和提取的細(xì)節(jié)。表5中列出了所用的分離林。9.2ITSPCR擴(kuò)增使用下述引物擴(kuò)增每個(gè)分離林的完整ITS區(qū)域(ITS1、5.8SrRM基因、ITS2):its4(tcctccgcttattgatatgc;seq.ID.no:8)its5(ggaagtaaaagtcgtaacaagg;seq.ID.no:9)所述引物是由Whitea厶(1990)戶CT戶ro^co^.'J^#e^o&e叔I皿is，M.A"Gelfand,D.H.，Sninsky，J.J"White,T.J.AcademicPress,Inc.,NewYork;pp.315-322設(shè)計(jì)并且由IntegratedDMTechnologies(Coralville，Iowa)合成的。PCR反應(yīng)是以25jLi1的總體積來(lái)進(jìn)行的，所述體積包括O.5pL純化的基因組DNA模板(lOng/jaL)、1.25jnL每種引物(O.5jaM)、2.0dNTP混絲(dATP、dCTP、dGTP和dTTP[NewEnglandBiolabs]各2mM)、1.5mLMgCl2(25mM)、0.3yL7^DNA聚合酶(5U/jiL[PromegaCorporation])和2.5juL10xPCR^Jl緩沖液(50mMTris-HCl[pH8.0]、100mMNaCl、0.1mMEDTA、1mMDTT、50%甘油和1%TritonX-IOO)。^步驟包括94。C下3分鐘的初始變性，之后是35個(gè)循環(huán)的變性(94C下60秒)、退火(65'C下60秒)和延伸(72。C下2^4中)，以及72。C下10分鐘的最終延伸。PCRAJl都是在用于PTCDMEngineSystem的AlphaUnitBlockAssembly(MJResearch,Inc.,Waltham,Massachusetts)中進(jìn)行的。在擴(kuò)增產(chǎn)物的純化和序列分析前，從每種分離抹中分離5^L樣品并且按上文所述通過(guò)電泳來(lái)顯影，以確認(rèn)成功發(fā)生了擴(kuò)增反應(yīng)。9.3產(chǎn)物純化和DM測(cè)序在電^^,用WizardPCRPr印sMAPurificationSystem(PromegaCorporation)純化ITS產(chǎn)物。所純化的PCR產(chǎn)物是由PlantBiotechnologyInstitute,Saskatoon,Saskatchewan,Canada測(cè)序的。PCR產(chǎn)物是在DMTechnologiesUnit,PlantBiotechnologyInstitute,NationalResearchCouncilofCanada,Saskatoon,SK,Canada用AB373(Lr/毛細(xì)管電泳MA序歹U分析儀(AppliedBiosystems，Streetsville，Ontario,Canada)來(lái)觀'J序的。9.4序列分析在接受序列數(shù)據(jù)之后，移除引物序列并比對(duì)正向和反向序列，按照所提供的電泳圖改正可見(jiàn)的錯(cuò)配并加以修整以包括完整的ITS區(qū)域(ITS1、5.8SrRM基因、ITS2)以^^斤述18S和大核糖體RM亞基的各10個(gè)^J^，保留這些序列來(lái)輔助所述比對(duì)。用BioEditSequenceAlignmentEditor(Hall(1999)NucleicAcidsSymposiumSeries,41:95—98)編4卑各個(gè)序列并且利用ClustalX(Thompsoneta1.(1997)NucleicAcidsResearch,24:4876-4882)來(lái)^^沖斤?；赟aitou&Nei(1987)#o/ec"/ar5/0/057a/2cfj5Vo/i/〃o",4:406-425的鄰接算法來(lái)制成系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)以證明分離抹間的關(guān)系。通過(guò)^^1000個(gè)重復(fù)的拔靴分析來(lái)評(píng)估用于所述組的統(tǒng)計(jì)學(xué)支持(Felsenstein(1985)Evolution,39:783—791)。用NJplot"來(lái)顯示最終的樹(shù)形圖(Perriere&Gouy(1996)Biochimie，78:364-369)。9.5結(jié)果如圖18A-D中所示,使用寡核苷酸引物ITS4和ITS5的PCR擴(kuò)增(White"a/.(1990)戶rofocokJC"油a/2"卯7/c"/o叫eds.Innis，M.A.，Gelfand,D-H"Srdnsky，J.J"White,T-J.AcademicPress,Inc.,NewYork;pp.315-322)會(huì)擴(kuò)增出遷移率在400和600bp長(zhǎng)的標(biāo)記之間等距離分布的M究中所測(cè)序的每種分離株的單個(gè)DM片段。盡管在第一輪實(shí)驗(yàn)過(guò)程中某些個(gè)別的分離林不能擴(kuò)增，如圖18A和18B中所示，使用不同DM濃度的重新擴(kuò)增以及使用SRC97-15B2的情況(如實(shí)施例6.8中所示由儲(chǔ)液復(fù)蘇)解決了這些問(wèn)題，并且擴(kuò)增了所iW組中每種分離林的DNA以產(chǎn)生所期望的約500bp的片段大小。在進(jìn)行序列分析并^移除末端引物序列之后，除分離林IMI336757外(它是由于在370-377位的8個(gè)堿基的缺失所產(chǎn)生的516bp長(zhǎng)的序列)，由每種分離#增的ITS區(qū)域的長(zhǎng)度均在521-524個(gè)核苷酸之間。這一序列長(zhǎng)度包括整個(gè)ITS區(qū)域(ITSl、5.8S、ITS2)、18S核糖體DNA亞基的43bp和大核糖體DNA亞基的39bp。所述ITS區(qū)域^5U^越439-442個(gè)堿基，其中ITS1為125-128個(gè)絲、5.8S區(qū)域?yàn)?60個(gè)錄(它是完4M呆守的)且ITS2為154個(gè)堿基。通常，主要分離林之間的種內(nèi)序列差異極小。然而，源自加拿大薊(""/咖s/re/we)和加拿大來(lái)源的物種常常顯示出與本研究中的其它分離林不同的多樣性，通常在差異位置包含獨(dú)特的核苷酸。所測(cè)序的524bp中，已證明具有生物控制活性的包括加拿大薊分離抹的分離林(實(shí)施例2.2)在整個(gè)序列的20個(gè)位置處是獨(dú)特的，其中12個(gè)存在于更加穩(wěn)定的ITS1區(qū)域中。在這一區(qū)域中，所有多樣性的情況是加拿大薊分離林所共有的(SRC分離株包括本發(fā)明的分離^^DAOM175940)，JLil些情況中幾乎由一半發(fā)生于來(lái)自兵豆的分離林DAOM175135,但;O口拿大來(lái)源的分離林也具有所述獨(dú)特的核苷酸。盡管其它分離林偶然也會(huì)具有常見(jiàn)的從更常見(jiàn)狀態(tài)衍生的多樣性，但是47種非加拿大薊分離林中平均僅有2.9種在這些位置具有相同的核苷酸。十四種轉(zhuǎn)換、四種顛換和兩種插入(indel)突變體導(dǎo)致了所觀察到的與加拿大薊分離糾目同的變異，這等于所述擴(kuò)增區(qū)域的約3.82%。圖19A示出了莖點(diǎn)霉分離抹ITS序列的多序列比對(duì)，所述比對(duì)提供了序列組成的直)C4征。圖19B中示出了具有雜草控制活性的巨口莖點(diǎn)霉分離林ITS序列的非限制性實(shí)例(SEQIDNO:15)。才艮據(jù)圖19A中所示的信息可以得到其它具有雜草控制活性的分離抹序列。為研究分離抹間的關(guān)系，才艮據(jù)Saitou&Nei(1987)#o/ecw7ar》ioA^7a刀dfra/"〃o"，4:406-425的鄰接算法制成了系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。通過(guò)使用1000種隨才幾排列的拔靴分析來(lái)評(píng)估所述組的置信值(Felsenstein(1985)Evolution,39:783-791)。圖20中所示的ITS系統(tǒng)進(jìn)4W表明存在兩個(gè)主要的類。組I包括來(lái)自世界保藏中心的分離抹，收集自許多宿主并且?guī)缀跖懦思幽么笠酝獾牡攸c(diǎn)。菌林DAOM175135是唯一的例外，它分離自Alberta，Canada的兵豆。該組中分離林不具有生物除草活性。組n含有已經(jīng)證明具有生物控制活性的分離抹(實(shí)施例2.2)并且為l(W的拔靱復(fù)制所支持。這些分離抹(包括本發(fā)明的分離林)中的大多數(shù)分離自加拿大薊。如分支長(zhǎng)度的缺失所示出的那樣，各組中的許多菌林的整個(gè)ITS序列是相同的。觀察到的加拿大薊分離抹的長(zhǎng)分支長(zhǎng)度(組n)，說(shuō)明自從該組從一個(gè)共同祖先分化出來(lái)以后已經(jīng)經(jīng)過(guò)了相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間。觀察到的分離林SRC94-25Avir(在實(shí)驗(yàn)室中制備而非從自然中分離的)毒性的喪失也似乎是受ITS區(qū)域中的趨異性所影響的，使其偏離了具有生物除草劑表型的分離抹。實(shí)施例10:巨口莖點(diǎn)霉生物除草分離抹的AFLP指紋由Vos"a/.(1995)We"arc力，23:4407-4414開(kāi)發(fā)的擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(AFLP)技術(shù)是一種用于采集真菌基因組指紋的強(qiáng)大工具。使用兩種P艮制性內(nèi)切酶(在最初的方案中是ScoRI和胞el)消化DNA,并且將雙鏈寡核苷酸接頭連接到限制性位點(diǎn)上。與所述接頭和限制性位點(diǎn)互補(bǔ)的PCR引物可以擴(kuò)增由所述接頭側(cè)接的片段。^JI含有2個(gè)或3個(gè)^JJ4伸的PCR引物將這些片段的一個(gè)子集選擇性擴(kuò)增到所述限制性片段中。只有那些與所述引物序列完美匹配片段可以被PCR擴(kuò)增。在用變性聚丙烯分離^，DNA指紋通常含有50至100個(gè)限制性片段。AFLP具有高度的可再現(xiàn)性、4睹易應(yīng)用、僅需要少量的基因組DM并且每塊^MJ1具有高7JC平的多態(tài)性。10.1真菌分離^DM提取上述實(shí)施例6.7中描述了所有關(guān)于真菌DM的保藏、復(fù)蘇、培養(yǎng)、貯藏和提取的細(xì)節(jié)。表5中列出了所用的分離林。10.2擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(AFLP)AFLP方案是根據(jù)Invitrogen所提供的那些方案變化而來(lái)的。佳月3.6個(gè)單位的fcoRI和3.5個(gè)單位的；toel(NewEnglandBiolabs,Pickering,Ontario,Canada)和7jliL的5xP艮制性消化反應(yīng)液，以35的最^L積雙酶切250ng基因組DM樣品。將消化物在37。C下孵育2小時(shí)，然后在70°C下孵育15分鐘。然后將接頭連接到所述P艮制性片段上用作隨后PCR擴(kuò)增的啟動(dòng)位點(diǎn)。為進(jìn)^i亥連接反應(yīng)，將35jiL的接頭/連接;^^直接加入到已經(jīng)完成的限制性消化反應(yīng)中。所述連接^jS;^^/含有2jimo1的&汰I-接頭；20jnmol的#"1-接頭；1.4個(gè)單位的T4DM連接酶(Invitrogen,Burlington,Ontario,Canada);0.4mMATP;10mMTris-HCl,pH8.0;10mMMgAC;以及50mMKAC。將連接反應(yīng)在室溫下(20-25。C)孵育2小時(shí)，然后用1xTE-0.1緩沖液(IOmMTris-HCl[pH8.0],0.1mMEDTA)稀釋10倍。使用所述帶有連接接頭的限制性片段作為^t板進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)。所述化oRI和胞el引物都與它們各自的接頭完全互補(bǔ)且不含選擇'I"械基。所述51laLPCR混合物含有5L模板DM(連接產(chǎn)物)；2個(gè)單位的7"DM聚合酶(NewEnglandBiolabs);200mMTris-HCl、15nMMgCl2、500mMKCl和40jiL預(yù)擴(kuò)增引物》V^^(每種dNTP0.23mM、^^fcoRI和凇el引物750jag/L和無(wú)菌tK)。使用下述M進(jìn)行PCR:94。C30秒、56°C60秒和72°C60秒，進(jìn)行20個(gè)循環(huán)。所有的預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)均在MJResearchPTCDNAEngineSystemsthermalcycler(MJResearch,Waltham，Massachusetts)ii^f亍。用lxTE—0.l緩沖液將所述預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋50倍。使用21種引物組合和三種巨口莖點(diǎn)霉分離抹^ii行初步篩選。引物組合包括fc汰I+AC、AG、AT、TA、TC、TG或TT，與#化1+CA、CT或Gi^f亍組合。除含有TG的引物組合外，所有都產(chǎn)生了擴(kuò)增產(chǎn)物。使用15種引物組合來(lái)采集所有分離抹的指紋。選擇六種引物組合(ib汰I+AC、AG與胞el+CA的TC和CT進(jìn)行組合)用于分析(表38)。在每種引物對(duì)中，所述fcoR1j物是帶有放射性y—33P_ATP末端標(biāo)記的。所ii^端標(biāo)記M》V給物包括27.8mg/LEcoRI引物、0.2個(gè)單位的T4激酶(Invitrogen)和0.10jaL的5x激酶緩沖液，共計(jì)0.5nL。將所it^端標(biāo)記反應(yīng)在37X:下孵育1小時(shí)，然后在7(TC下孵育10^4中。表38:用于AFLP的引物組合的引物配對(duì)和序列引物配對(duì)序列SEQ.邁.NO:■EcoRI+AC和+CA5'-GACTGCGTACCAATTCAC-3'+105'-GATGAGTCCTGAGTAACA-3,11￡coRI+AC和Afcel+CT5'-GACTGCGTACCAATTCAC-3'+105'-GATGAGTCCTGAGTAACT-3'12￡coRI+AG和Msel+CA5'-GACTGCGTACCAATTCAG-3'+135'-GATGAGTCCTGAGTAACA-3，U￡c。RI+AG和Msel+CT5'-GACTGCGTACCAATTCAG"3'+135'-GATGAGTCCTGAGTAACT-3'12￡coRI+TC和Msel+CA5'-GACTGCGTACCAATTCTC-3'+!45'-GATGAGTCCTGAGTAACA-3'11icoRI+TC和Msel+CT5'-GACTGCGTACCAATTCTC-3,+145'-GATGAGTCCTGAGTAACT-3'12選擇性引物以粗體示出為進(jìn)行選擇性擴(kuò)增，#^有6.7mg/L引物(帶有"CA或-CT延伸)和每個(gè)反應(yīng)267pmol的每種dNTP/、2個(gè)單位的DNA聚合酶(NewEnglandBiolabs)、2jliL的10xPCR緩沖液(200mMTris-HCl，pH8.0;15mMMgCl2;500mMKC1)、無(wú)菌水和15yL作為模板的1:50預(yù)擴(kuò)增混合物的選擇性擴(kuò)增混合物與末端標(biāo)記的fcoRI引物混^^結(jié)合。在MJResearchPTCDMEngineSystems熱循環(huán)^義(MJResearch)上進(jìn)行PCR反應(yīng)，采用下述^:1個(gè)循環(huán)的94。C下30秒、65。C下30秒和72。C下60秒；在接下來(lái)的12個(gè)循環(huán)中，每個(gè)循環(huán)將退火溫度降^氐0.7°C;以及最終23個(gè)循環(huán)的94。C下30秒、56。C下30秒和72。C下60秒。10.3AFLP產(chǎn)物的電泳和顯影在BioRad測(cè)序凝膠系統(tǒng)(38cmx50cmx0.4cm)上用5%的變性聚丙烯酰胺^M對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳。在90W功率下在1xTBE中進(jìn)行皿電泳2.5小時(shí)，用Whatraann3固色鐠紙進(jìn)行干法印跡，并且配有BioRadHydrotech真空泵的BioRad585皿干燥器上干燥2小時(shí)，然后再-80'C下暴露于KodakBiomax(location)35cmx43cmX-射線膠片5-7天。^J^KodakX0MAT膠片顯像劑對(duì)膠片進(jìn)行顯像。10.4數(shù)據(jù)分析通過(guò)由下至上橫向讀^I^利用相鄰泳道的兩兩比^L分析PCR產(chǎn)物。僅記錄100至400bp的明亮清楚的條帶，*泳道中存在的單一的優(yōu)勢(shì)條帶使得可以對(duì)非相鄰泳道PCR產(chǎn)物進(jìn)行比對(duì)。將多態(tài)性DM片段作為單個(gè)基因座處理，它是根據(jù)所用引物以;sj斤擴(kuò)增的信息性DNA片段的長(zhǎng)度來(lái)命名的。在假設(shè)每個(gè)片段均代表一個(gè)唯一的雙等位(存在或缺少片段)基因座的情況下，記錄所有的擴(kuò)增子。將六種引物組合(表38)所得的數(shù)據(jù)結(jié)^來(lái)以產(chǎn)生一個(gè)多基因座數(shù)據(jù)集。認(rèn)為具有相同DM指故和多基因位點(diǎn)單倍型的分離林是相同克隆的單個(gè)成員。^f吏用TREEC0Nvl.3b;(VandePeer&DeWachter(1994)Cbfl^WaO'o/w/場(chǎng)7/c"/咖^"/oi^/e，s,10:569-570)分析數(shù)據(jù)。按照NeiandLi(1979)Proceef//""ofMe#a〃o/<2_/y4cacte巡7iSWe/ceyo/f力ett/^/Aa^yo/^er/ca，76:5269-5273和由使用算術(shù)平均值的^M口權(quán)對(duì)群集群法(UPGMA;Sneath&Sokal(1973)NumericalTaxonomy.W.H.Freeman,SanFrancisco)所制成的樹(shù)形圖,建距離矩陣。由^JI1000種排列的^L執(zhí)分析提供了所iii且的置信值(Felsenstein(1985)Evolution,39:783-791)。10.5結(jié)果六種引物組合(表38)對(duì)巨口莖點(diǎn)霉基因組DM進(jìn)行了AFLP分析，在除去100-400bp區(qū)域以外的條帶并且將所用引物組組合成一個(gè)多基因座數(shù)據(jù)集之后哦，產(chǎn)生了697條多態(tài)性條帶。由于分離林的多樣性，所有分離林中均不存在單一的條帶，圖21證實(shí)了引物群組中指紋的復(fù)雜性。在進(jìn)行聚類分析前就能明顯看出存在兩種不同的指紋，且許多分離抹屬于這兩組之一。第一組包括來(lái)自許多保藏中心(包括ATCC、CBS、ICMP、DA0M和MI)的大量分離抹。這一組#^易識(shí)別，包括對(duì)應(yīng)于泳道6、8、10-20、23-26、28、31、33、35-36、38-40的分離株ATCC24524、CBS112.36、CBS154.83、CBS185.25、CBS198.69、CBS297.36、CBS482.95、CBS483.66、CBS488.94、CBS560.70、CBS598.94、CBS837.84、CBS839.84、DA0M175951、CCM-F322、CCMF-323、ICMP2325、ICMP3173、ICMP6603.ICMP6628、ICMP6803、ICMP7033、ICMP10963、ICMP11186、BO118020、IMI175661和IMI299239,也包括未在該皿上示出的MA1908B、CBS223.69、CBS345.97、CBS371.61、CBS529.66和MA3312。第二組包括對(duì)應(yīng)于泳逸22、44-46、48-53的DA0M175940、SRC85-24B、SRC89-25A2、SRC94-26、SRC94—44B、SRC94-134、SRC94-359A、SRC95-54A1、SRC95-54A2和SRC95-268B,也包括^M^該^MJi示出但具有類似條帶圖形的SRC97-12B、SRC97-15B、SRC02-2A和SRC03-1A8。這些分離林具有雜草控制活性。因此，該分析可被用來(lái)篩選或選擇具有雜草控制活性的巨口莖點(diǎn)霉分離林。圖21中不屬于任何一組的其余的分離^5具有獨(dú)特的DNA指紋和獨(dú)特的基因型。這一大范圍的基目型表明所述M界的保藏群組中存在相當(dāng)大的多樣性。這些分離株包括對(duì)》于泳道7、9、21、27、32、34和41-43的ATCC46580、CBS115.12、DAOM175135、ICMP2715、ICMP6814、ICMP10843、ICMP12948、IMI336757、IMI336761和WAC7881，也包括未在該皿上示出的WAC7788、IMI192267、IMI192268和CBS300.36。分離株SRC94-26Avir(泳道47)具有與其它SRC分離株完全不同的指統(tǒng)，并且與獲取自加拿大薊的具有除草劑活性的其它分離糾目比，似乎與非除草劑巨口莖點(diǎn)霉分離林更加相似。所述UPMGA聚類分析產(chǎn)生了圖22中所示的樹(shù)形圖。幾乎每種分離,占據(jù)了一個(gè)單獨(dú)的分支。值辱注意的例外是那些包括朝向樹(shù)底部的單源聚類的加拿大薊分離林。這一聚類將到了100%的拔孰復(fù)制的支持，包含將SRC分離抹分成兩個(gè)小組的分支，所述小細(xì)對(duì)應(yīng)于7.2部分所述的染色體核型分組。分離林MOM175940和SRCQ3-U8對(duì)應(yīng)于那些之前通過(guò)染色絲型分析鑒定為組I的分離林(SRC85-24B、SRC94-26、SRC94-44B、SRC95-54A1、SRC95-54A2、SRC95-268B)，余下的包括^離株SRC02-2A的分離林(并非原始染色*型分析研究的一部分)被分在一類并且對(duì)應(yīng)于之前^皮鑒定為組n染色體核型的分離抹(SRC89-25A2、SRC94-134、SRC94-359A、SRC97-12B、SRC97-15B2)。這些聚類分別得到了91°/。和82%的拔孰復(fù)制的支持。包含分離林的這一獨(dú)特子集的分支被^v所述樹(shù)形圖中，表明該分離林組中的多樣性不高于整個(gè)群組中的多樣性，所述分離抹具有生物除草劑活性、因其與所述生物控制特異性引物的反應(yīng)而被鑒定、具有獨(dú)特的ITS序列和獨(dú)特的AFLP指紋。除了與所，組的其它分離抹具有基因上的不同"卜，這些分離^基因上也更類似與^9f究中的任何其它分離林。它們具有范圍非常窄的多樣性并且具有幾乎相同的基因型。所述數(shù)據(jù)表明這些分離林可能會(huì)在其各自的宿主加拿大薊上凈tt因隔離和/或在加拿大^t^理隔離。通itil些特征看將生物控制分離林識(shí)別為一個(gè)具有獨(dú)特特征的獨(dú)特子集。值得注意的是，參考了所有涉a拿大薊分離林的參考文獻(xiàn)，除了分離抹96-24Avir。這一分離林是在實(shí)驗(yàn)室中利用菌絲尖端轉(zhuǎn)移制備的，并且不具有除草劑特征。基于引物的鑒定、ITS序列分析和AFLP指紋分析均表明該分離林與具有獨(dú)特的抗闊葉雜草的生物除草劑活性特征的其它SRC分離抹和DAOM175940不同。所有引文通過(guò)引用的方式納4文。已經(jīng)參照一種或多種實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了描述。然而，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的是，在本申請(qǐng)權(quán)利要求所限定的本發(fā)明的范圍內(nèi)，可對(duì)本發(fā)明進(jìn)4ti午多變化和修改。權(quán)利要求1.一種控制一種或多種闊葉雜草的方法，包括將一種或多種巨口莖點(diǎn)霉(Phomamacrostoma)分離株、其提取物、其接種肉湯或上述物質(zhì)的組合給予所述一種或多種闊葉雜草或所述雜草生長(zhǎng)的土壤，所述一種或多種巨口莖點(diǎn)霉分離株、其提取物或其接種肉湯具有雜草控制活性。2.權(quán)利要求1的方法，其中所述巨口莖點(diǎn)霉分離林來(lái)自加拿大薊(",s/咖3r7e/510)。3.權(quán)利要求l的方法，其中所述一種或多種闊葉雜草為選自菊科、石竹科、旋花科、車前草科和茜草科的科的種。4.權(quán)利要求l的方法，其中所述一種或多種闊葉雜草選自加拿大薊、多年生苣苦菜、蒲公英、淡甘菊、假豬殃殃(falsecleavers)、繁縷、金蕎麥、田旋花、車前草和具柄向日葵。5.權(quán)利要求l的方法，所述方法用于在多年生作物的生長(zhǎng)過(guò)程中控制雜草生長(zhǎng)。6.權(quán)利要求5的方法，其中所述多年生作物選自草皮、多年生禾草和冬谷。7.權(quán)利要求1的方法,所述方法用于在成坪草的生長(zhǎng)過(guò)程中控制雜草生長(zhǎng)。8.—種生物控制試劑，包括一種或多種巨口莖點(diǎn)霉分離抹、其提取物、其接種肉湯或上述物質(zhì)的組合，所述生物控制試劑具有雜草控制活性、生長(zhǎng)增強(qiáng)活性或上述活性的組合，其中所迷一種或多種莖點(diǎn)霉分離林選自a.85-24B(IDAC230201-1，保藏于2001年2月23日)，b.89-25A(IDAC110401-1,保藏于2001年4月11日)，c.94-26(IDAC230201-2，保藏于2001年2月23日)，d.94-44B(IDAC230201-3,保藏于2001年2月23日)，e.94-134(IDAC230201-4，保藏于2001年2月23曰),f.94-359A(IDAC110401-2，4呆藏于2001年4月11日)，g.95-54Al(IDAC230201-5,保藏于2001年2月23日)，h.95-268B(IDAC110401-3,保藏于2001年4月11日)，i.97-12B(IDAC230201-6,j呆藏于2001年2月23日)，j.97-15B2(IDAC110401-4,4呆藏于2001年4月11日)；以及它們的纟且合。9.一種生物控制組合物，包括權(quán)利要求8的生物控制試劑以及用于維持所述一種或多種莖點(diǎn)霉分離林存活率的培養(yǎng)基。10.—種控制雜草生長(zhǎng)的方法，包括向所述雜草或向所述雜草生長(zhǎng)的土壤施加有效量的權(quán)利要求8的生物控制試劑。11.一種控制雜草生長(zhǎng)的方法，包括向所述雜草或向所述雜草生長(zhǎng)的土壤施加有效量的權(quán)利要求9的生物控制組合物。12.—種包^皮的作物種子，包括一種或多種巨口莖點(diǎn)霉分離抹或從一種或多種巨口莖點(diǎn)霉獲得的提取物，以及粘合劑，所述一種或多種巨口莖點(diǎn)霉分離林或其^R取物具有雜草控制活性。13.權(quán)利要求12的包被的作物種子，其中所述一種或多種巨口莖點(diǎn)霉分離抹選自a)85-24B(IDAC230201-1,保藏于2001年2月23日)，b)89-25A(IDAC110401-1，保藏于2001年4月11日)，c)94-26(IDAC230201-2,保藏于2001年2月23日)，d)94-44B(IDAC230201-3，保藏于2001年2月23日)，e)94-134(IDAC230201-4，保藏于2001年2月23日)，f)94-359A(IDAC110401-2，保藏于2001年4月11日)，g)95-54A1(IDAC230201-5,保藏于2001年2月23日)，h)95-268B(IDAC110401-3,保藏于2001年4月11日)，i)97-12B(IDAC230201-6,保藏于2001年2月23日)，j)97-15B2(IDAC110401-4，保藏于2001年4月11日)；以及它們的纟且合。14.權(quán)力要求12的包被的作物種子，其中所述作物種子為草種。15.—種用于檢測(cè)一種或多種具有雜草控制活性的巨口莖點(diǎn)霉分離林的探針，所述探針包括SEQIDNO:1。16.—種檢測(cè)一種或多種具有雜草控制活性的巨口莖點(diǎn)霉分離林的方法，所述方法使用權(quán)利要求15的探針。17.權(quán)利要求16的方法，包括在雜交條件下將所述來(lái)自一種或多種巨口莖點(diǎn)霉分離林的核酸與權(quán)利要求15的探針混合，其中來(lái)自分離林的核酸與探針的雜交說(shuō)明所述分離林具有雜草控制活性。18.—種用于檢測(cè)一種或多種具有雜草控制活性的巨口莖點(diǎn)霉分離林的引物對(duì)，所述引物對(duì)包括SEQIDN0:2和SEQIDNO:3。19.一種檢測(cè)一種或多種具有雜草控制活性的巨口莖點(diǎn)霉分離林的方法，所述方法4吏用權(quán)利要求18的引物對(duì)。20.權(quán)利要求19的方法，包括用權(quán)利要求18的引物對(duì)擴(kuò)增所述一種或多種巨口莖點(diǎn)霉分離株的核酸，其中存在擴(kuò)增的核酸片段說(shuō)明所述分離抹具有雜草控制活性。21.權(quán)利要求20的方法，其中使用聚合HM式^Jl(PCR)來(lái)擴(kuò)增一種或多種巨口莖點(diǎn)霉分離抹的基因組DM，并且通過(guò)電泳來(lái)分離所得的PCR產(chǎn)物，其中存在介于0.8和1.2kb之間的擴(kuò)增的DNA片段說(shuō)明所述分離林具有雜草控制活性。22.—種使用隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DM(RAPD)指紋篩選一種或多種巨口莖點(diǎn)霉分離林以確定所述一種或多種分離抹是否具有雜草控制活性的方法，所述方法包括a)使用選自SEQIDNO:4;SEQIDNO:5;SEQIDNO:6;SEQIDNO:7;或它們的組合的引物擴(kuò)增一種或多種已知具有雜草控制活性的巨口莖點(diǎn)霉分離林的染色體DNA,以獲得已知分離抹的RAPD片段圖謙；b)對(duì)所要篩選的一種或多種巨口莖點(diǎn)霉分離林重復(fù)步驟(a)，以獲得所要篩選的分離抹的RAPD片段圖諉；c)比較步驟(a)中獲得的RAPD片段圖譜與步驟(b)中獲得的RAPD片段圖語(yǔ)，其中所述RAPD片段圖鐠間的相似性說(shuō)明所述一種或多種所要篩選的巨口莖點(diǎn)霉分離抹具有雜草控制活性。23.權(quán)利要求22的方法，其中步驟(a)中所述一種或多種已知具有雜草控制活性的巨口莖點(diǎn)霉分離林選自a)85-24B(IDAC230201—1，保藏于2001年2月23日)，b)89-25A(IDAC110401-1,保藏于2001年4月11日)，c)94-26(IDAC230201-2,保藏于2001年2月23日)，d)94-44B(IDAC230201-3，保藏于2001年2月23日)，e)94-134(IDAC230201-4,保藏于2001年2月23日)，f)94-359A(IDAC110401-2,保藏于2001年4月11曰),g)95-54A1(IMC230201-5,保藏于2001年2月23曰),h)95-268B(IDAC110401-3，保藏于2001年4月11日)，i)97-12B(IDAC230201-6，保藏于2001年2月23日)，j)97-15B2(IDAC110401—4,j呆藏于2001年4月11曰);或它們的組合。24.—種擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(AFLP)篩選一種或多種巨口莖點(diǎn)霉分離抹以確定所述一種或多種分離株是否具有雜草控制活性的方法，所述方法包括a)使用限制性內(nèi)切酶fcda和船el消化一種或多種已知具有雜草控制活性的巨口莖點(diǎn)霉分離抹的染色體DNA,以獲得多個(gè)DM片段；b)將雙鏈寡核苷酸fcoRI和胞el接頭連接到步驟(a)中獲得的DM片段的fcoRI和胞el位點(diǎn)上；c)使用選自下ii^列的引物對(duì)擴(kuò)增步驟(b)中獲得的連接的DNA片段(i)SEQIDN0:1Q和SEQIDNO:11;(ii)SEQIDNO:10和SEQIDNO:12;(iii)SEQIDNO:13和SEQIDNO:11;(iv)SEQIDNO:13和SEQIDNO:12;(v)SEQIDNO:14和SEQIDNO:11;(vi)SEQIDNO:14和SEQIDNO:12;以及它們的組合；以獲得一組已知分離林的擴(kuò)增DM片段；d)對(duì)所要篩選的一種或多種巨口莖點(diǎn)霉分離抹重復(fù)步驟(a)至(c)，以獲得一組所要篩選的分離林的擴(kuò)增DNA片段；e)比較獲自一種或多種已知具有雜草控制活性的巨口莖點(diǎn)霉分離林的擴(kuò)增DNA片段組與獲自一種或多種所要篩選的巨口莖點(diǎn)霉分離林的擴(kuò)增DNA片段組，其中所述擴(kuò)增DNA片段間的相似性說(shuō)明所述一種或多種所要篩選的巨口莖點(diǎn)霉分離抹具有雜草控制活性。25.權(quán)利要求24的方法，其中步驟(a)中所述一種或多種已知具有雜草控制活性的巨口莖點(diǎn)霉分離林選自a)85-24B(IDAC230201-1，保藏于2001年2月23日)，b)89-25A(IDAC110401-1，保藏于2001年4月11日)，c)94-26(IDAC230201-2，寸呆藏于2001年2月23日)，d)94-44B(IDAC230201-3,保藏于2001年2月23曰),e)94-134(IDAC230201-4,保藏于2001年2月23日)，f)94-359A(IDAC110401-2，{呆藏于2001年4月11日)，g)95-54Al(IDAC230201-5，保藏于2001年2月23日)，h)95-268B(IDAC110401-3，j呆藏于2001年4月11日)，i)97-12B(IDAC230201-6,保藏于2001年2月23日)，j)97-15B2(IDAC110401-4,保藏于2001年4月11日)；或它們的組合。26.—種巨口莖點(diǎn)霉分離株，其特征為具有如圖21,泳道22、44-46和48-53中所公開(kāi)的擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(AFLP)，所述擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(AFLP)方法使用下述引物對(duì)(i)SEQIDN0:1Q和SEQIDNO:11;(ii)SEQIDNO:10和SEQIDNO:12;(iii)SEQIDNO:13和SEQIDNO:11;(iv)SEQIDNO:13和SEQIDNO:12;(v)SEQIDNO:14和SEQIDNO:11;(vi)SEQIDNO:14和SEQIDNO:12;以及它們的纟且合。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了巨口莖點(diǎn)霉的真菌分離株或從其獲得的提取物，用于控制闊葉雜草，包括加拿大薊、多年生苣苦菜、蒲公英、淡甘菊、假豬殃殃(falsecleavers)、繁縷、金蕎麥和田旋花。本發(fā)明還公開(kāi)了生物控制組合物，包括與真菌分離株配制在一起的生長(zhǎng)培養(yǎng)基，當(dāng)將所述生物控制組合物施加至土壤時(shí)，所述生長(zhǎng)培養(yǎng)基可用于維持所述真菌分離株的存活率。本發(fā)明還公開(kāi)了用于檢測(cè)具有生物控制活性的巨口莖點(diǎn)霉分離株的新探針和引物對(duì)序列。本發(fā)明還公開(kāi)了篩選真菌分離株以確定它們是否具有生物控制活性的方法。文檔編號(hào)C12P19/34GK101282651SQ200680034970公開(kāi)日2008年10月8日申請(qǐng)日期2006年7月25日優(yōu)先權(quán)日2005年7月25日發(fā)明者J·德比,K·貝利申請(qǐng)人:由加拿大農(nóng)業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品部長(zhǎng)代表的加拿大女王陛下