專利名稱：用于棘球白素類藥物耐藥性的檢測法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及真菌的核酸檢測法。
背景技術(shù)：
真菌感染是重癥患者發(fā)病和死亡的重要原因，并且由于無法迅速 診斷和有效治療而加重感染后果。抗真菌藥物的普遍使用導(dǎo)致對天然 耐藥的真菌菌種的選擇效應(yīng)，并且敏感菌種也出現(xiàn)耐藥性。有效的抗 真菌藥物的種類很少，阻礙了真菌疾病的治療。近來，卡泊芬凈作為
第一個新型棘球白素(echinocandin)藥物應(yīng)用于臨床，這類藥物阻斷 —3)-D-葡聚糖合酶而定向作用于真菌細(xì)胞壁。隨著卡泊芬凈的使 用迅速增加，目前已有報道念珠菌(Ow^V/")的臨床分離群在體外的敏 感性降低，治療失敗與體外最低抑菌濃度值或MIC較高之間密切相 關(guān)。隨著患者使用卡泊芬凈增加，以及其他棘球白素類藥物包括 micafungin和阿尼芬凈上市銷售，預(yù)計(jì)MIC值提高的臨床分離群的數(shù) 目會越來越多。
本發(fā)明的一個方面是核酸檢測法，檢測與包括但不限于念珠菌 (Ow 的真菌中與棘球白素類藥物耐藥性相關(guān)的遺傳突變。
本發(fā)明的另 一 方面是進(jìn)行特定區(qū)域的指數(shù)式核酸擴(kuò)增的核酸檢 測法，該區(qū)域編碼FKS1蛋白，并優(yōu)選結(jié)合序列測定或使用標(biāo)記的等 位基因識別探針進(jìn)行檢測。
本發(fā)明的又 一 方面是引物和探針的寡聚核苷酸組和試劑的試劑 盒，用于進(jìn)行上述實(shí)驗(yàn)。
發(fā)明概述
棘球白素類為近年來上市銷售的新型主要用于抗真菌的藥物。真 菌細(xì)胞壁必須保持完整，結(jié)構(gòu)缺失甚至發(fā)生某些明顯改變，真菌就無法生存。細(xì)胞壁為層狀結(jié)構(gòu)的細(xì)胞外基質(zhì)，由外層的糖蛋白與內(nèi)層的 糖聚合物包括葡聚糖、殼多糖和半乳甘露聚糖組成。在腐生性真菌和 致病性真菌中，糖層主要包括卩(1—3)-葡聚糖和(1—3)-葡聚糖，但也 含有一些卩(l—6)-葡聚糖和殼多糖。真菌細(xì)胞壁釋放葡聚糖作為胞外
聚合物(exopolymers)進(jìn)入感染真菌患者的血液中，已知其激發(fā)廣泛的 先天免疫反應(yīng)。真菌細(xì)胞壁是一種動態(tài)結(jié)構(gòu)，在細(xì)胞壁的生物合成中 組成性聚合物不斷的進(jìn)行化學(xué)修飾和重排。例如Fkslp是生成卩(l-3) 葡聚糖的葡聚糖合酶復(fù)合物的推定催化亞基，已知其共定位 (co-localized)于皮質(zhì)肌動蛋白斑內(nèi)。其向細(xì)胞表面移動到達(dá)細(xì)胞壁結(jié) 構(gòu)重塑位點(diǎn)，具有固定Fkslp的細(xì)胞的細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和功能均有缺陷。 Fkslp是F《S/基因的產(chǎn)物。棘球白素類為通過N-連接到脂肪酰基側(cè) 鏈的環(huán)狀六肽，抑制負(fù)責(zé)大多數(shù)細(xì)胞壁生物聚合物生物合成的卩(1 — 3)-D-葡聚糖合酶。棘球白素類藥物、卡泊芬凈、micaflmgin和阿尼芬 凈為新型抗真菌化合物，作用于真菌細(xì)胞壁定向阻斷P-l,3-D-葡聚糖 合酶?？ú捶覂羰窃擃惖谝粋€被批準(zhǔn)的藥物，近來許多研究評價在治 療真菌感染中的安全性和耐受性，證明在臨床上或?qū)嶒?yàn)室中對大多數(shù) 患者沒有嚴(yán)重的藥物不良反應(yīng)。
這些藥物對念珠菌(Cam&ia)和曲霉菌04^ergz7/w spp)具有廣譜 抗真菌活性，與目前所用抗真菌藥物沒有交叉耐藥性，因而對耐受唑 類藥物的酵母菌和霉菌均有效。重要的是由于其特異性作用于細(xì)胞 壁，棘球白素類對酵母菌具有殺菌作用。它們對霉菌有效，但僅抑制 菌絲的生長錐。但是它們幾乎不抑制侵襲性接合菌亞綱 (Zygcwycetey) 、 #斤型隱3求菌(Cryptococcus neoformans)或嫌刀菌 spp)。然而其在臨床上非常有效的抑制曲霉菌(J^ wg///^ spp)。美國及其它國家已經(jīng)批準(zhǔn)卡泊芬凈用于治療許多嚴(yán)重的真菌感 染，包括頑固性或不耐受其它治療的曲霉病患者，食道念5朱菌病、念 珠菌血癥及其它念珠菌感染(包括腹內(nèi)膿胂、念珠菌性腹膜炎、胸膜間 隙感染)。卡泊芬凈也用于疑似真菌感染的持續(xù)發(fā)熱與中性白細(xì)胞減少患者的經(jīng)驗(yàn)治療。目前廣泛使用卡泊芬凈，與三唑類藥物如伏立康唑 聯(lián)用，主要用于抗酵母菌和霉菌的抗真菌治療。緊密相關(guān)的藥物
micaflmgin和阿尼芬凈的上市將近一步擴(kuò)大這類高效的新型藥物在 臨床上的使用范圍。
自從2002年批準(zhǔn)第一個棘球白素上市銷售以來，卡泊芬凈在臨 床上的使用越來越多，特別是在美國卡泊芬凈近來已擴(kuò)展使用到包括 食道念珠菌病、念珠菌血癥及其它念珠菌感染，以及經(jīng)—瞼治療上。已 經(jīng)描述了對卡泊芬凈的體外敏感性降低的念珠菌臨床分離群，并且注 意到在體內(nèi)治療失敗與體外卡泊芬凈MIC值提高有關(guān)，雖然尚未確定 最低抑菌濃度(MIC)與臨床療效的嚴(yán)格相關(guān)性。隨著患者使用卡泊芬 凈增加，以及micaflmgin(2005年6月)和阿尼芬凈上市銷售，預(yù)計(jì)MIC 值提高的臨床分離群的數(shù)目會越來越多，并且由于藥物敏感性降低導(dǎo) 致治療失敗的患者也會越來越多。
本發(fā)明包括核酸檢測法，用于檢測真菌例如酵母菌的念珠菌 (Ca"JWa)屬和霉菌的曲霉菌0^perp7/w)屬的突變，產(chǎn)生對棘球白素類 藥物包括卡泊芬凈、micafungin和阿尼芬凈的耐藥性。檢測適用于含 有或懷疑含有真菌的任何樣品，包括但不限于得自人的樣品，例如血、 尿或組織樣品。念珠菌(Ca"&^)種類包括白色念珠菌(C. "/6Zc^w)、 克柔念珠菌(C. fcrw"/)、高里念珠菌(C. gwz7/ermow/z7)、光滑念珠菌(C. g7aM ra)、熱帶念i朱菌(C. rropfcafc)及近平滑念J朱菌(C./ arapw7owX)。 曲霉菌G^perg/〃us)種類包括煙曲霉菌(A. /wm'gafw力、黃曲霉菌(A. yZam5)、黑曲霉菌(A. m'gw)、構(gòu)巢曲霉菌(A. m'甴/am)和土曲霉菌(A. te〃e附)。4企測靶標(biāo)為FKSlp蛋白家族中一個或優(yōu)選兩個保守區(qū)域?qū)?應(yīng)的核酸(DNA、 RNA)序列。對應(yīng)于CaFkslp中Phe641至Pro649的氨 基酸序列的區(qū)域，我們稱為第一區(qū)或HS1。本發(fā)明檢測的核酸靶序列 對應(yīng)于保守區(qū)域，但是可能對應(yīng)于每個保守區(qū)域的一個末端或兩個末 端上的一個、兩個或少數(shù)幾個，最多達(dá)5個的另外的氨基酸。對應(yīng)于 CaFkslp中Aspu57至Leu1364 的氨基酸序列的區(qū)域，我們稱為第二區(qū)或
6HS2。本發(fā)明檢測的核酸把序列與保守區(qū)域相對應(yīng)，但也可對應(yīng)于末
端上的其它的氨基酸，從CaFkslp的第1345位氨基酸到1^111364外延 超出的一個、兩個或多達(dá)5個氨基酸，例如從1345至1369位氨基酸。 使用實(shí)驗(yàn)室菌抹及臨床分離群，在那些區(qū)域內(nèi)，我們已經(jīng)鑒別出許多 產(chǎn)生棘球白素耐藥性的突變。在實(shí)驗(yàn)室菌^^中，我們^使用CAI4和M70 (參見實(shí)施例2)及我們制備的實(shí)驗(yàn)室突變體(本文指定為"NR"抹， 實(shí)施例NR2)。從實(shí)驗(yàn)室菌林和臨床分離群，我們鑒別出許多引起耐 藥性的單一氨基酸改變，包括F641L、 F641S、 S645P、 S645Y、 S645F、 D648Y、 P649H、 R1361H和R1361G,以及許多負(fù)責(zé)氨基酸改變的 SNPs。
本發(fā)明實(shí)驗(yàn)包括核酸序列的擴(kuò)增，這些核酸序列包括上述靶序 列，即核酸靶序列，也就是對應(yīng)于或編碼上述氨基酸序列的DNA或 RNA?？捎萌魏沃笖?shù)式擴(kuò)增方法，包括例如PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))(參 見美國專利第4，965，188號和已公開的申請WO 03/054233Al)、 LCR (連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))、NASBA基于核酸序列的擴(kuò)增)、SDA(鏈置換擴(kuò)增)、 3SR(自動維持序列擴(kuò)增)、TMA(轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增)和Q P復(fù)制酶介導(dǎo)的 擴(kuò)增，上述所有技術(shù)均為本領(lǐng)域所熟知。
可通過任何方法檢測擴(kuò)增的靶序列內(nèi)的突變，包括但不限于序列 測定方法和使用標(biāo)記的雜交探針;^測。序列測定方法包括例如傳統(tǒng)的 雙脫氧序列測定以及焦磷酸測序，二者均為本領(lǐng)域中已知的^f支術(shù)。利 用雜交探針檢測，可擴(kuò)增后檢測即終點(diǎn)檢測，或?qū)崟r檢測即在擴(kuò)增過 程中檢測。利用雜交探針實(shí)時檢測方法包括美國專利第5,487,972號 和美國專利第5,538,848號中所述的5'核酸酶檢測方法；利用在美國專 利第5,925,517號中所述的分子信標(biāo)(molecuiarbeacon)探針檢測；使用 FRET探針對檢測；使用在Li, Q.等(2002) "A New Class of Homogeneous Nucleic Acid Probes Based on Specific Displacement Hybridization(—種新型的基于特異性置換雜交的均相核S^罙針)"，Nuc. Acid Res,30:(2)c5中所述的雙鏈探針檢測；使用在Afonia等(2002)"Minor Groove Binder-Conjugated DNA Probes for Quantitative DNA Detection by Hybridization-Triggered Fluorescence(小溝結(jié)合劑纟泉合的 DNA探針，用于通過雜交激發(fā)的熒光定量檢測DNA)"Biotechniques 32: 946-9中所述的小溝結(jié)合(MGB)撰:針檢測。
本發(fā)明的探針檢測方法使用至少一種等位基因識別探針，也就是 說在檢測條件下，該探針與一個等位基因(例如野生型序列)雜交并產(chǎn) 生信號，而不與另一個等位基因(例如突變體等位基因)雜交。等位基 因識別探針通常具有相當(dāng)短的結(jié)合序列，典型的長度不超過25個核 苷酸，經(jīng)常比25個核苷酸少5-10個核苷酸。本發(fā)明的耐藥突變體檢 測可使用 一個或多個探針沖全測整個把序列。多探針(Multiple probes)也 可用于鑒別特定的突變，即 一個探針特異耙向于特定核苷酸位點(diǎn)產(chǎn)生 的或懷疑產(chǎn)生的 一個突變。多探針檢測可包括每個擴(kuò)增含有一種探針 的平行擴(kuò)增(parallel amplifications),也包括部分或全部復(fù)合式 (multiplexed)檢測，其中每個反應(yīng)器包括兩種或多種不同探針。
本發(fā)明的檢測試劑盒包括探針和擴(kuò)增引物。通常引物不作為指示 探針，但是并非不能具有這種作用。例如所謂的"蝎形"引物包括連 接的發(fā)夾或分子信標(biāo)、探針。Whitcombe等(1994) "Detection of PCR Products Using Self-Probing Amplicons and Fluorescence,"Cf吏用自身4笨 針擴(kuò)增子和熒光檢測PCR產(chǎn)物)Nat.Biotechnol. 117: 804-807。檢測試 劑盒優(yōu)選包括擴(kuò)增和檢測所需的所有試劑，至少包括需要的引物、探 針、聚合酶和dNTPs。檢測試劑盒可包括用于其它目的，例如對照組 寡聚核苷酸擴(kuò)增的引物和探針。試劑盒也可包括樣品制備試劑。
本發(fā)明也包括至少包括檢測所需的引物和探針在內(nèi)的寡聚核苷 酸組。在這個組中可任選包括對照組寡聚核苦酸。
本發(fā)明的一個或多個實(shí)施方案詳細(xì)描述于附錄的圖表及下述說 明書中。本發(fā)明的其它特征、目標(biāo)和優(yōu)點(diǎn)自說明書和圖表及權(quán)利要求 書是顯而易見的。
在本申請書中，使用了部分縮寫。GS是葡聚糖合酶的縮寫。
Fkslp是Fksl蛋白的縮寫，目前指負(fù)責(zé)(3(1-3)-葡聚糖生成的葡聚
糖合酶復(fù)合物的催化亞基。
為編碼Fkslp的基因。 CaFkslp為白色念珠菌的Fksl蛋白。 CaF《67為白色念珠菌的i^S7基因。
Ser645是氨基酸的常規(guī)命名方法，此例指絲氨酸及在蛋白質(zhì)中它 的位置。在CaFkslp中，絲氨酸是第645位氨基酸。
S645P指示一個突變，第一個字母指野生型蛋白質(zhì)中的氨基酸(此 例"S，，指絲氨酸)，接著是氨基酸位置(在此例中"645"指野生型的 Ser645),最后是指突變的氨基酸(此例中"P"指脯氨酸)。
T1933C指在第1933位核苷酸的基因突變，T突變?yōu)镃。在基因 C"i^S7，第1933位核苷酸存在于編碼CaFkslp的Ser645三聯(lián)體密碼 中，這種突變導(dǎo)致氨基酸改變。
SNP是"單核苷酸多態(tài)性"的縮寫。
附圖簡述


圖1A和1B顯示CaFK57的基因序列(GenBank檢索號D88815), 包括加下劃線的使對棘球白素敏感性降低的突變區(qū)域。
圖2顯示CaFkslp的氨基&1^列(GenBank檢索號BAA21535), 包括加下劃線的使對棘球白素敏感性降低的突變區(qū)域。
圖3顯示酉良酒酵母菌(5"acc/zaraw少ces cereWw》e)Fkslp的氨基酸序 列與白色念珠菌(Ow&^ a/^cam)Fkslp的氨基酸序列的序列比對。
圖4顯示實(shí)施例中利用的引物、探針和試探靶(probe targets)的序列。
圖5顯示雜合子樣品的實(shí)時PCR檢測熒光曲線圖。 圖6A-6D為純合子樣品的實(shí)時PCR檢測熒光曲線圖。 圖7顯示作為多重實(shí)時檢測的檢測結(jié)果的格式(format)。
9發(fā)明詳述
真菌的尸X57基因轉(zhuǎn)錄為相應(yīng)信使RNA(mRNA)，再翻譯為1,3-(3 -D-葡聚糖合酶(GS)亞基Fkslp。設(shè)計(jì)本發(fā)明實(shí)驗(yàn)檢測各種真菌中保 守的兩個短基因區(qū)域中的一個或兩個區(qū)域。已知念珠菌和一些曲霉菌 物種的氨基酸序列及其對應(yīng)的基因序列。
現(xiàn)有C"尸A:57的幾條序列。為了設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物和探針，我們使用 3條序列GenBank檢索號D88815、 F027295和CA2043。圖1A和圖 1B代表核苷酸序列D88815。圖2代表CaFkslp的氨基酸序列。本發(fā) 明實(shí)驗(yàn)靶序列包括的兩個短DNA序列在圖1A和圖1B中下面加有下 劃線。對于CaPKS7，那些序列指自T1921至T1947和自G4069至 G4092的核苷酸序列。圖2中相應(yīng)的CaFkslp的短核苷酸序列加有下 劃線。這些序列指自F(Phe)641至P649和自D1357至L1364的氨基 酸序列。
為了定位不同真菌產(chǎn)生的Fksl蛋白的氨基S殳序列，用常規(guī)序列 比對顯示定位。圖3說明白色念珠菌和釀酒酵母菌(S. cerev&ae)的序 列比對。線的上方是白色念珠菌的野生型CaFkslp蛋白從第641位氨 基酸(Phe^)到第649位氨基酸(Pro649)的一段序列。該段序列非常類似 于釀酒酵母菌Fkslp的從第639位氨基酸(Phe639)到第647位氨基酸 (Pro646)的氨基酸序列。線的下方是白色念珠菌的野生型CaFkslp蛋白 從第1357位氨基酸(ASp,357)到第1364位氨基酸(Leu!364)的一段序列。 該段序列非常類似于釀酒酵母菌Fkslp的從第1353位氨基酸(Asp^3) 到第1360位氨基酸(Leu,36o)的氨基酸序列。其他真菌種類的Fksl蛋白 可進(jìn)行類似的序列比對。
對每個物種相關(guān)氨基酸序列的描述有利于本領(lǐng)域技術(shù)人員確定 氨基酸序列相應(yīng)的基因序列。另外對于每個物種相關(guān)氨基酸序列定位 的描述有利于本領(lǐng)域技術(shù)人員定位其他物種對應(yīng)的氨基酸序列，從而 定位其相應(yīng)的基因序列；對于一個物種相關(guān)基因序列定位的描述有利 于本領(lǐng)域技術(shù)人員定位其他物種對應(yīng)的基因序列和相關(guān)氨基酸序列。因?yàn)槲覀冎饕褂冒咨钪榫涂巳崮钪榫?，本文的描述基于白色?br> 珠菌氨基酸序列和基因序列。白色念珠菌(OlF7^0的F《57基因序列 為GenBank檢索號D88815。白色念珠菌(C"FA:67)相應(yīng)的氨基酸序列 為GenBank檢索號BAA21535。其他物種的序列為煙曲霉菌U79728、 枸巢曲霉菌AACD01000061、光滑念珠菌CR380953、克柔念珠菌 DQO17894 、新型隱球菌AAEYO 1000070 、巴西副球孢子菌 CP"racoc"Wo/cifey 6ms77ims7》 AF148715 、 粗糙鏈孑包霉(臉wmypora craw") XM32715 6 、卡氏肺嚢蟲CP"ewwoc"他can'"〃) AF191096 、酉良酒 酵母菌U08459、解脂耶氏酵母(7arrovWa /*o/,'ca) CR382131 。
本發(fā)明實(shí)驗(yàn)涉及檢測圖2中加下劃線的兩個短氨基酸序列相應(yīng)的 核酸序列，優(yōu)選DNA序列。對于第一個加下劃線的序列，此第一條 靶序列包括DNA或RNA，其最少編碼Phe641至Pro649的序列(使用 CaFkslp作參照)，任選編碼在一端或兩端的1-5個優(yōu)選1個或2個附 加的氨基酸。對于第二個加下劃線的序列，此第二條靶序列包括DNA 或RNA，其最少編碼ASpB57至Leu,364的序列，任選編碼在一端或兩 端的1-5個優(yōu)選1個或2個附加的氨基酸。
本發(fā)明實(shí)驗(yàn)包括擴(kuò)增含有第一條靶序列的第一個核酸區(qū)域。優(yōu)選 本發(fā)明實(shí)驗(yàn)也包括擴(kuò)增含有第二條靶序列的第二個核酸區(qū)域。第 一 區(qū) 域和第二區(qū)域都可使用 一個二者均包括在內(nèi)的單引物對擴(kuò)增?；蛘呖?使用兩個引物對，第一對包括第一區(qū)，第二對包括第二區(qū)。特別是如 果序列測定用于檢測靶序列的突變，那么我們優(yōu)選使用較短的擴(kuò)增 子，因此使用兩個引物對。正如上述所示，本發(fā)明實(shí)驗(yàn)不局限于特定 的擴(kuò)增。雖然迄今為止如實(shí)施例所述，我們使用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR) 擴(kuò)增，但是也可使用其他技術(shù)。
靶序列中突變的檢測可通過序列測定完成。如實(shí)施例所述，我們 使用循環(huán)測序法，但是也可使用其他序列測定方法。靶序列中突變的 檢測也可利用雜交探針完成，該雜交探針在實(shí)驗(yàn)中識別野生型靶序列 和包括突變的序列。雜交探針可為DNA、 RNA或二者的組合。它們200680035097.3
可包括非天然(non-natural)的核香酸，例如2'0-曱基核糖核苦酸。可包 括非天然的核苷酸間鍵，例如磷硫酰鍵。它們可為PNA。本發(fā)明實(shí)驗(yàn) 適合的雜交探針包括與靶序列等位基因雜交產(chǎn)生可檢測信號的探針。 探針優(yōu)選經(jīng)熒光標(biāo)記并且產(chǎn)生可檢測熒光信號。使用雜交探針檢測可 為終點(diǎn)檢測(end-point detection),即擴(kuò)增完成后檢測。本發(fā)明探針測定 方法優(yōu)選均相測定(homogeneous assays),即測定時不需要分離結(jié)合的 探針和未結(jié)合的探針。更優(yōu)選的均相測定包括實(shí)時檢測，最優(yōu)選實(shí)時 熒光檢測，即在擴(kuò)增過程中多次檢測。對于實(shí)時擴(kuò)增檢測，我們優(yōu)選 雙重?zé)晒鈽?biāo)記的探針，最優(yōu)選用熒光團(tuán)標(biāo)記也用非熒光猝滅劑例如 4-(4'-二甲氨基-苯偶氮基)苯曱酸(DABCYL)標(biāo)記的探針。
實(shí)時檢測可采用任何適當(dāng)?shù)奶结樂椒?，包括采用結(jié)合DNA熒光 染料例如SYBR染料的雜交探針，雙鏈DNA存在則發(fā)出焚光。例如 SYBR綠色染料可用于檢測擴(kuò)增，等位基因識別焚光雜交探針可用于 檢測野生型靶序列的擴(kuò)增，探針熒光曲線的斜率指示純合性野生型 靶、突變體和野生型靶雜合體或純合性突變體耙的存在。另一種方法 為使用容許錯配探針(mismatch-tolerant probe)檢測擴(kuò)增的耙序列(野生 型或突變體)的一條鏈，并使用一個或多個等位基因特異性探針與另外 一條鏈雜交從而確定靶序列是否突變?；蛘呷鐚?shí)施例所證明，可以使 用多探針，野生型靶序列和特異性突變存在就發(fā)出信號。在第一條和 第二條靶序列中，我們已經(jīng)鑒定出幾種突變導(dǎo)致卡泊芬凈敏感性降 低。在第一條靶序列中為(使用Q^i^S/作參考)T1921C、 T1922C、 G1932T、 T1933C、 C1934A、 C1934T、 C1934G、 G1942T和C1946A。 在第二條靶序列中為(使用CaF尤S7作參考)C4081G和G4082A。
現(xiàn)有許多用于突變分析和SNP基因分型的分子方法。其中通過 自身報告分子信標(biāo)探針檢測的實(shí)時PCR是一種非常有效的方法。與線 性探針相比，由于其具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)，在分子內(nèi)雜交和分子間雜交達(dá)到
分子信標(biāo)探針能夠高度特異性且在寬廣的溫度范圍內(nèi)區(qū)分密切相關(guān)
12的靶序列。具有識別能力的分子信標(biāo)已經(jīng)成功用于分析導(dǎo)致抗生素耐 藥性的突變、等位基因分化、純合和雜合的snps，以及許多其他應(yīng) 用。
分子信標(biāo)探針的選擇性有利于分析導(dǎo)致卡泊芬凈敏感性降低的
c"f尤w等位基因。對于我們指定為"Hsr'序列的第一條靶序列的
檢測集中于第645個CoF尤W密碼子突變T1933C、C1934A和C1934T， 用白色念珠菌的臨床分離群已經(jīng)鑒別其降低對卡泊芬凈的敏感性。由 于在該區(qū)域內(nèi)存在SNP T1929A，設(shè)計(jì)用于^r測耙區(qū)域內(nèi)抗性等位基 因的等位基因特異性探針不太容易。為了適應(yīng)在很多臨床分離群中出 現(xiàn)的這種SNP,在相應(yīng)SNP位點(diǎn)使用擺動堿基設(shè)計(jì)探針。向探針中引 入擺動堿基減少了整個熒光發(fā)射輸出，因?yàn)樵诮o定條件下僅有半數(shù)探 針分子庫與互補(bǔ)的靶DNA特異性結(jié)合。由于無論在C"i^S7中有沒 有T1929ASNP，這些^l果針對全部白色念珠菌菌群均有活性，因此簡 并探針的多樣性較高帶來的益處遠(yuǎn)大于絕對熒光強(qiáng)度的損失。
合成了與1種野生型和3種突變體CaF尤S7等位基因相對應(yīng)的4 種簡并分子信標(biāo)，這4種探針都顯示出極好的識別性質(zhì)，對于多數(shù)靶 的匹配/錯配(match-to-mismatch)的信號比例接近100%。觀察到4種探 針僅與互補(bǔ)的DNA靶特異性雜交。唯一的例外是分子信標(biāo) CaFKSl-WT與含有T1922C等位基因模板少量的雜交。這種結(jié)果可 通過探針域內(nèi)錯配的側(cè)面定位(lateral location)解釋，也可通過熱力學(xué) 已知的相對穩(wěn)定DNA-DNA錯配的形成T <}錯配的能量學(xué)形成解釋。 在等位基因異質(zhì)結(jié)合(allele heterozygosity)情況下，與純合模板相比， 分子信標(biāo)探針(識別野生型和突變體序列)產(chǎn)生一半強(qiáng)度的熒光信號。
降低對卡泊芬凈敏感性的突變體才及少產(chǎn)生，發(fā)生頻率與每個活細(xì) 胞<10'8的突變頻率一致。耐藥性突變體的形成需要在含卡泊芬凈固 體培養(yǎng)基上長時間孵育(〉7天)，殘存細(xì)胞生長出現(xiàn)。在預(yù)先不接觸藥 物的白色念珠菌培養(yǎng)物中，我們尚未發(fā)現(xiàn)卡泊芬凈耐藥性細(xì)胞。通過 等位基因特異性分子信標(biāo)分析兩種不同菌林中85個(Eight-five)自發(fā)
13產(chǎn)生的敏感性降低的突變體。發(fā)現(xiàn)在菌林CAI4的35個分離群中的突 變與先前所述置換相同，影響編碼Ser645的密碼子。這些突變也包含 菌林M70的50種卡泊芬凈耐藥性衍生物中絕大多數(shù)。從6林得自 M70的自發(fā)突變體中檢測到3種新型突變，也就是T1922C、 G1932T 和C1934G，影響編碼Phe^、 Leu64a。 Ser645的密碼子。這些結(jié)果與 近來對于卡泊芬凈敏感性降低的白色念珠菌實(shí)驗(yàn)室和臨床菌抹的突 變分析結(jié)果一致。發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)的核苷酸置換位于CaFXW的第645 位密碼子。在QiFXS7其他位點(diǎn)中新發(fā)現(xiàn)的突變僅見于M70菌株的子 代，并且相對頻率不超過12%。
所有單獨(dú)應(yīng)用的分子信標(biāo)使得能夠?qū)θ?5種卡泊芬凈耐藥性 衍生物進(jìn)行基因分型。在79個菌株中已經(jīng)正確鑒別且DNA序列分析 確認(rèn)了分子信標(biāo)耙向的3種等位基因。在6個菌抹中也通過DNA序 列分析確認(rèn)了非分子信標(biāo)靶向的3種新型突變。在通用封閉管檢測 (universal closed tube assay)進(jìn)行的單獨(dú)反應(yīng)中使用所有4個分子信標(biāo)， 用于檢測Cai^W中第一條靶序列內(nèi)的卡泊芬凈耐藥性突變。在實(shí)驗(yàn) 中，F(xiàn)AM信號表示存在野生型CoFKS7等位基因，而HEX熒光表示 DNA樣品中存在T1933C、 C1934A或C1934T CaFA"6V突變的一種。 從產(chǎn)生FAM和HEX信號的雜合上述3種突變的白色念珠菌菌林中提 取DNA。如此可準(zhǔn)確檢測引起卡泊芬凈敏感性降低的白色念珠菌中 CaFi^7基因內(nèi)純合狀態(tài)與雜合狀態(tài)的已知突變。本實(shí)驗(yàn)也足以鑒別 可影響藥物敏感性的這一 區(qū)域內(nèi)的其他突變。
正如上面所述，突變將卡泊芬凈敏感性降低與C"FA:5V中短保守 區(qū)域聯(lián)系起來。最顯著的基因座(locus)是Ser645，并且包括在白色念珠 菌的實(shí)驗(yàn)室和臨床分離群中都發(fā)現(xiàn)的置換S645P、 S645Y、 S645F。這 些突變表現(xiàn)出能夠支配并賦予雜合狀態(tài)和純合狀態(tài)下的卡泊芬凈耐 藥性。靶向于這些突變的診斷用探針可提供一種迅速和準(zhǔn)確評價白色 念珠菌中卡泊芬凈耐受性的工具。
基于F尺57突變分析迅速診斷卡泊芬凈耐藥性，這種診斷必須能夠區(qū)分單個核苷酸不同的雜合的和純合的等位基因，能夠以多重形式 同時檢測這些等位基因。分子信標(biāo)技術(shù)是用于等位基因識別和多重檢 測的極好的技術(shù)。
通過超過50個卡泊芬凈敏感性降低的白色念珠菌的臨床和實(shí)驗(yàn)
室分離群的DNA序列分析，顯示出3種突變，即T1933C、 C1934A 和C1934T,分別導(dǎo)致氨基酸改變S645P、 S645Y和S645F。除了那些 核苷酸置換外，序列比對揭示在此區(qū)域有另外一個變異位點(diǎn)。在所有 已分析的白色念珠菌菌林中約有25%觀察到T1929A單一同義核苷酸 置換，在作為白色念珠菌基因組序列測定課題一部分的菌林SC5314 中也有報道。這種觀察是重要的，因?yàn)橛锌赡芨淖兏采w此區(qū)域的等位 基因特異性探針識別所需的探針-擴(kuò)增子雜交?；贑"尸^W序列分 析數(shù)據(jù)，我們設(shè)計(jì)了 4種對應(yīng)于1920位至1944位核苷酸的等位基因 特異性分子信標(biāo)探針。實(shí)施例中詳細(xì)描述了這個過程。 一種探針與卡 泊芬凈敏感性白色念珠菌菌抹中發(fā)現(xiàn)的野生型(WT) QlFKS7等位基 因互補(bǔ)，而其他3種探針與卡泊芬凈耐藥性分離群中發(fā)現(xiàn)的突變體 CoP^S7等位基因(C1934A、 C1934T、 T1933C)互補(bǔ)。所有信標(biāo)的6 個核芬酸長的莖部區(qū)域相同，為5'CGCGAG和CTCGCG3',用A/T 50:50的擺動石咸基合成在第1929位CaFA:S/ SNP相應(yīng)位點(diǎn)從而確保與 耙序列對應(yīng)。野生型分子信標(biāo)CaF尺57-WT用FAM在5'端標(biāo)記，而 其他3種突變體信標(biāo)用HEX在5'端標(biāo)記。所有分子信標(biāo)的3'末端用 DABCYL猝滅劑修飾。實(shí)施例3中描述了特異性引物和探針的設(shè)計(jì)。 實(shí)施例4中描述了探針識別的溫度窗(temperature window)。在溫度窗 中進(jìn)行檢測。
通過在含有4 jj g/ml (40倍MIC)卡泊芬凈的固體生長培養(yǎng)基上 直接選擇白色念珠菌菌林CAI4和M70的耐受卡泊芬凈的自發(fā)性突變 體。兩種菌林中耐受卡泊芬凈的自發(fā)性衍生物形成的頻率<10—8突變 體/活細(xì)胞。對于兩種菌抹，觀察到在含有卡泊芬凈的培養(yǎng)板上形成很 少的萎縮的緩慢生長的菌落。這些菌落劃線分離到含有相同濃度卡泊芬凈的新培養(yǎng)板上不再生長。孵育時間延長到10天以上后，少量小 的萎縮菌落產(chǎn)生光滑、快速生長的衍生物，再接種后在含有卡泊芬凈 培養(yǎng)基中能夠持續(xù)培養(yǎng)。每個培養(yǎng)板上只保存培養(yǎng)一個這種衍生物用
于進(jìn)一步分析。菌林CAI4和M70各自分離35個和50個卡泊芬凈壽文 感性降低的分離群。對于所有實(shí)驗(yàn)室得到的分離群，體外卡泊芬凈敏 感性測定顯示卡泊芬凈的MIC值提高到M6ng/ml。在實(shí)施例2中描 述了詳細(xì)的分離步驟。
初步測定CAI4和M70菌林的CoFKS7基因的序列(參見實(shí)施例 2)揭示在CAI4的OlPX57基因中存在T1929A SNP,而在M70中沒 有此突變。從CAI4和M70親代菌林及其卡泊芬凈耐藥性衍生物提取 染色體DNA，并且作為模板與CaF^S7分子信標(biāo)一起用于實(shí)時PCR 實(shí)驗(yàn)。圖4給出了多種野生型和突變體耙、使用的引物和分子信標(biāo)探 針的核苷酸序列。圖4中探針的探針區(qū)域和靶鏈的靶序列下加有下劃 線。探針和靶序列中與OlP^S7的HS1域的突變對應(yīng)的堿基為黑體字。 指示為W的堿基位置指示兩種在此位置僅是A或T的差別的簡并分 子信標(biāo)的等摩爾混合物。每種染色體DNA樣品分別與代表不同的降 低敏感性的等位基因的單分子信標(biāo)探針進(jìn)行4次獨(dú)立的PCR反應(yīng)。實(shí) 施例5中描述了實(shí)時PCR反應(yīng)。61。C的退火溫度適用于所有反應(yīng)，從 而極好的區(qū)分不同CaFKS7等位基因(參見實(shí)施例4)。從CAI4菌株的 所有35種卡泊芬凈耐藥性衍生物中均發(fā)現(xiàn)了突變體C"F^S7等位基 因。其中大多數(shù)(20個分離群)具有雜合突變wt/T1933C，其他15個突 變體含有純合突變T1933C、 C1934A或C1934T。在T1933C雜合中， 從分子信標(biāo)CaFKS l-WT和CaFKSl-T1933C產(chǎn)生兩種類似強(qiáng)度的信 號(圖5)。圖5為使用單分子信標(biāo)和DNA靶的4個獨(dú)立PCRs的結(jié)果。
~"~CaFKS1-T1933C信標(biāo)+具有雜合T腦C突變的CW等
位基因的DNA, *CaFKSl-WT信標(biāo)+具有純合T1933C
突變的Cai^XS7等位基因的DNA，* CaFKSl-T1933C信標(biāo)+
16具有雜合T1933C突變的CaFX5/等位基因的DNA
CaFKSl-WT信標(biāo)+具有雜合T1933C突變的CaFX^等位 基因的DNA。
圖6A-6D顯示通過4種分子信標(biāo)CaFKS1-WT(圖6A)、 CaFKSl-T1933C( 圖 6B) 、 CaFKSl-C1934A( 圖 6C) 和 CaFKSl-C1934T(圖6D)區(qū)分10種CaF^S7純合等位基因。每個圖概 括用有突變的單個DNA等位基因進(jìn)行的11次單獨(dú)的PCRs結(jié)果
野生型(無突變或SNP)， " T1933C,
務(wù)
C1934A , t C1934T 、 ^ T1929A SNP ,
~0~ T1933C+T1929A SNP, ""0C1934A+T1929A SNP， ~3551 ~ C1934T+T1929A SNP , ~ T1922C, ^
G1932T+C1934G, ~~空白(無DNA)。
具有純合C"FX57突變的DNA樣品產(chǎn)生對CaFKSl-WT無信號 的相應(yīng)突變體分子信標(biāo)的特殊反應(yīng)(圖6B-6D)。相反從僅與 CaFKSl-WT探針相互作用的CAI4親代菌抹提取的染色體DNA用突 變體信標(biāo)檢測不到焚光信號(圖6A)。
M70菌林的卡泊芬凈耐藥性衍生物的CaFKS7等位基因進(jìn)行基因 分型，揭示在50份樣品中有44份存在已知突變T1933C、 C1934A或 C1934T。對于CAI4突變體，大多數(shù)M70衍生物獲得雜合突變T1933C。 已經(jīng)發(fā)現(xiàn)敏感性降低的50個菌林中有25個含有T1933C置換位于一 個C"i^S7拷貝。在6個菌林中檢測到雜合突變C1934A和C1934T。 具有雜合突變T1933C、 C1934A或C1934T的DNA樣品進(jìn)行的所有 實(shí)時PCR產(chǎn)生兩種熒光信號， 一種來自CaFKSl-WT分子信標(biāo)，另一 種來自3種雜交體分子信標(biāo)CaFKSl-T1933C、 CaFKSl-C1934A或 CaFKSl-C1934T中的一種。在的第1933位和第1934位上的雜合突變外，在通過與相應(yīng)的突變體分子信標(biāo)CaFKSl-T1933C、 CaFKSl-C1934A或CaFKSl-C1934T特異性雜交鑒別的13種菌林中 也檢測到這些位點(diǎn)上有純合置換(圖6B-6D)。
在50種菌林中有6種菌抹的染色體DNA的PCR擴(kuò)增僅能通過 野生型分子信標(biāo)檢測，而突變體分子信標(biāo)(5種菌林)完全檢測不到，一 種菌林野生型和突變體分子信標(biāo)都檢測不到?？紤]到探針的這種等位 基因特異性，這些數(shù)據(jù)顯示模板序列以未知方式改變。
從所有卡泊芬凈耐藥性菌林CAI4和M70得到所有CaFK57的 DNA序列，用于確定實(shí)時PCR結(jié)果和解釋用6種M70 ^f汙生物無法區(qū) 分的情況。發(fā)現(xiàn)對于35種CAI4衍生物和44種M70衍生物來說，實(shí) 時PCR結(jié)果和序列測定結(jié)果100%相關(guān)。在實(shí)時PCR實(shí)^r中通過與 分子信標(biāo)CaFKSl-T1933C、 CaFKSl-C1934A或CaFKSl-C1934T雜 交檢測突變位點(diǎn)在CaF尤S7的1933位和1934位的所有雜合突變和純 合突變，用DNA序列測定加以確證。在5種M70衍生物的CaFKW 基因中發(fā)現(xiàn)存在新型純合突變T1922C，在實(shí)時PCR實(shí)驗(yàn)中沒有顯示 明確結(jié)果。另外DNA序列分析揭示出 一種M70卡泊芬凈耐藥性衍生 物的CaFXW基因中兩種新型純合突變G1932T和C1934G,在實(shí)時 PCR實(shí)驗(yàn)中這兩種突變不產(chǎn)生任何焚光反應(yīng)。經(jīng)序列測定揭示預(yù)期的 所有CAI4菌林的衍生物具有T1929A SNP，而M70菌林的衍生物沒 有T1929A SNP。
使用單CoP&S7分子信標(biāo)有可能進(jìn)行白色念珠菌C"F凡W基因中 3種已知突變的基因分型。我們進(jìn)一步研究所有4種簡并CaF尤S7分 子信標(biāo)組合應(yīng)用于多重實(shí)時PCR實(shí)驗(yàn)的可能性，適于同時評價給定 DNA樣品中的突變。參見實(shí)施例5。我們收集所有4種CaF尤S7分子 信標(biāo)，為區(qū)分野生型和突變體用不同的熒光標(biāo)記，向每個PCRs體系 加入聚集的探針混合物。得自野生型菌抹CAI4和M70的染色體DNA 以及這些菌林中代表12種不同CaFKW基因型的12種卡泊芬凈耐受 性衍生物的染色體DNA作為多重實(shí)時PCRs反應(yīng)的模板。除了退火溫度為6(TC外，多重實(shí)時PCR實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)條件與單獨(dú)使用單分子信標(biāo) 的實(shí)時PCR相同。野生型分子信標(biāo)CaFKSl-WT用FAM標(biāo)記，雜交 體分子信標(biāo)CaFKSl-T1933C、 CaFKSl-C1934A或CaFKSl-C1934T用 HEX標(biāo)記。使用這些探針，我們能夠通過熒光輸出的性質(zhì)鑒別卡泊芬 凈敏感性菌林和卡泊芬凈耐藥性菌抹。
圖7表明MX4000軟件處理C"F尺57突變體的多種實(shí)時PCR的 圖形輸出。當(dāng)觀察到FAM信號時，上面半圓形變亮，報告存在野生 型0 i^KS7 DNA。當(dāng)觀察到HEX信號時，下面半圓形變亮，報告 OlP尺S/DNA中存在3種所示突變體的任何一種。純合OlP凡S7等位 基因產(chǎn)生FAM信號或HEX信號，而雜合C"FXS/等位基因產(chǎn)生FAM 信號，也產(chǎn)生HEX信號。
壽文感性菌4朱CAI4和M70的DNA進(jìn)行多重實(shí)時PCR時^U見察到 FAM熒光。OzFX57內(nèi)具有純合突變T1933C、 C1934A或C1934T的 DNA進(jìn)行多重實(shí)時PCR僅報道HEX熒光(圖7)。當(dāng)分析CoFKS7基 因中已知具有雜合突變T1933C、 C1934A或C1934T的菌抹的DNA 時，檢測到相等強(qiáng)度的FAM和HEX信號(圖7)。用從CaF《57內(nèi)具 有兩種新型突變G1932T和C1934G的菌林提取的染色體DNA進(jìn)行多 重實(shí)時PCR，既不產(chǎn)生FAM熒光也不產(chǎn)生HEX熒光。在用從含有雜 合突變T1922C的菌抹提取的染色體DNA進(jìn)行反應(yīng)中觀察到微弱的 FAM信號。
我們也已經(jīng)設(shè)計(jì)出引物和探針用于稱為"HS2"的第二個靶區(qū)域 的，特異性用于一種突變體G4082A。在實(shí)施例6中已有報道。對突 變體C4081G或任何其他這類突變體的突變體探針，可以在設(shè)計(jì)包括 第二個靶區(qū)域的檢測中進(jìn)行類似設(shè)計(jì)，無論如上述實(shí)例中所述單獨(dú)或 聯(lián)合用于HS2，或HS1和HS2。
實(shí)施例1
已經(jīng)利用4種不同菌林成功進(jìn)行了 CW^W基因相關(guān)片段的核酸NR2、 NR3和NR4的基因組DNA擴(kuò)增C"i^S7(約450bp)片段?；?于C"F^SJ序歹'J(GenBank檢索號D88815)， PCR所用正義引物和反 義引物分別為 5'-GAAATCGGCATATGCTGTGTC-3'和 5'-AATGAACGACCAATGGAGAAG-3'。 PCR產(chǎn)物克隆進(jìn)入pCR2.1 (Invitrogen)并測定DNA序列。對于念珠菌臨床分離群，使用5'-CATTGCTGTGGCCACTTTAG-3' 和 5'-GGTCAAATCAGTGAAAACCG-3 '分別作為正向引物和反向引物 擴(kuò)增大部分OlFXS7 ORF(約2.6 kb)用于DNA序列分析。除了上述 Ca尸《W的第一個靶區(qū)域(與第1921位至第1947位編碼核苦酸一致) 以外，這個片段包括第4069位至第4092位的第二條靶核苷酸。純化 PCR產(chǎn)物，用熒光標(biāo)記(Pico Green,分子探針)定量，使用DTCS Quick Start Kit (Beckman Coulter)從5'和3'兩個方向測序。 實(shí)施例2
使用核酸擴(kuò)增和循環(huán)測序法的DNA序列分析可作為檢測技術(shù)單 用，也可作為對照評價基于探針的檢測。
用Q-Biogene FastDNA kit(Q-Biogene， Irvine, CA),自液體YPD 培養(yǎng)基中生長過夜的細(xì)胞提取白色念珠菌染色體DNA。在iCycler
thermocycler(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)上進(jìn)4亍PCR實(shí)馬全。寸吏 用引物CaFKSl-F1719和CaFKSl-R2212(圖4)擴(kuò)增命名為HS1的 OiFi^/區(qū)域。每個lOO-(il PCR反應(yīng)體系含有分別為0.25 的兩種 引物，2.5 U的iTaq DNA聚合酶(Bio-Rad Laboratories, Hercules， CA), 0.5mMdNTPs、 50mMKCl、 4mMMgCl2、 20 mM Tris-HCl, pH=8.4、 約50 ng的白色念珠菌染色體DNA。循環(huán)條件是1次循環(huán)，95°C 3 分鐘；35次循環(huán)，95°C 30秒，55°C 30秒，72°C 1分鐘；1次循環(huán)， 72°C 3分鐘。使用Montage PCR純化試劑盒(Millipore， Bedford, MA) 純化PCR產(chǎn)物。使用iCycler熱循環(huán)儀根據(jù)制造商建議使用CEQTM Dye Terminator Cycle Sequencing - Quick Start kit (Beckman Coulter, Fullerton, CA)得到并純化測序用PCR產(chǎn)物。引物CaFKSl-F1719或
20CaFKSl-R2212用于序列測定反應(yīng)。測序PCR的循環(huán)條件是1次循環(huán)， 95°C 3分鐘；30次循環(huán)，96°C 20秒，50°C 20秒，60°C 1分鐘。所 有DNA序列測定均在CEQ 8000 Genetic Analysis System (Beckman Coulter, Fullerton, CA)上完成。CEQTM 8000 Genetic Analysis System Software (Beckman Coulter, Fullerton, CA)用于控制硬件和分析序列測 定后結(jié)果。
白色念3朱菌菌抹CAI4購自ATCC(ATCC, Manassas, VA)。白色念 珠菌菌抹M70得自Merck培養(yǎng)物保藏中心(MRL, Rahway， NJ)。菌林 生長在酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖(YPD)培養(yǎng)基(l。/。酵母提取物、2% Bacto蛋白胨、2%葡萄糖)。為了菌林CAI4生長，YPD培養(yǎng)基中加入 25 mg/ml的尿嘧咬核普(Sigma- Aldrich, St. Louis， MO)。直接向YPD 加入卡泊芬凈(Merck， Rahway, NJ)至4 jig/ml。瓊脂平板孵育在30。C 下，液體培養(yǎng)物在30。C下培養(yǎng)在旋轉(zhuǎn)搖床(100轉(zhuǎn)/分鐘)上含有3 ml YPD的12 ml培養(yǎng)管中。在RPMI- 1640培養(yǎng)基(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)中采用液體微量肉湯稀釋檢測法(liquid microbroth dilution assay)評價對卡泊芬凈的敏感性，該實(shí)驗(yàn)在NCCLS資料M27-A2已有 概述。
經(jīng)100 ul ( 108個細(xì)胞)液體YPD培養(yǎng)物在含有4嗎/ml卡泊芬凈 的YPD培養(yǎng)板中培養(yǎng)18小時，分離出白色念^^菌菌抹CAI4和M70 的自發(fā)卡泊芬凈耐藥性突變體。連續(xù)稀釋的過夜培養(yǎng)物接種于未加抗 生素(無抗生素選擇壓力)的YPD培養(yǎng)jm中，從而精確測定起始菌 落計(jì)數(shù)。(抗生素)選擇培養(yǎng)板在30。C下孵育10-14天。從每一個選 擇培養(yǎng)板中再接種至少4個單獨(dú)的耐藥菌落于新的含有卡泊芬凈培養(yǎng) 板中，從而確定這種耐藥性表型。
實(shí)施例3
已報道GenBank檢索號為D88815、 AF027295和CA2043的三種 C^XS/ DNA序列用于FA:57分子信標(biāo)及《1物設(shè)計(jì)。本領(lǐng)域已知檢測 用引物和探針的設(shè)計(jì)。可得到許多有助于研究者的公開文獻(xiàn)。另外計(jì)
21算機(jī)軟件包可用來提高效率并減少需反復(fù)實(shí)驗(yàn)確定的調(diào)整(參見實(shí)施
例4)。我們^吏用這種軟件包。使用Beacon Designer 3.0軟件(PREMIER Biosoft， Palo Alto, CA)設(shè)計(jì)分子信標(biāo)和DNA引物(圖4)。預(yù)設(shè)的專欠件 參數(shù)適于構(gòu)建所有分子信標(biāo)和引物。用熒光團(tuán)5-羧基熒光素(FAM)和 6-羧基-2',4,4'，5',7,7'-六氯熒光素(HEX)在5'末端，用dabcyl在3'末端標(biāo) 記分子信標(biāo)。分子j言標(biāo)和引物均購自Biosearch Technologies (Biosearch Technologies, Novato, CA)。在全部溫度范圍，25 °C- 95。C內(nèi)測定 CaFKSl等位基因特異性分子信標(biāo)與單鏈靶寡聚核苷酸雜交的雜交性 質(zhì)(圖4)。用Stratagene MX4000多重定量PCR系統(tǒng)(Stratagene， La Jolla, CA)進(jìn)行分子信標(biāo)定向雜交。使用MX4000軟件，選擇"分子信標(biāo)解 鏈曲線"實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ奖O(jiān)測、分析數(shù)據(jù)。每個50 )il雜交反應(yīng)混合體系含 有1 x Stratagene Core PCR緩沖液、4 mM MgCl2、 100 pmol分離的耙 寡聚核苷酸和5 pmol分子信標(biāo)。實(shí)驗(yàn)溫度條件包含在95。C下加熱3 分鐘，然后用112秒冷卻到80°C，然后用30秒冷卻到25°C，溫度下 降梯度為0.5°C。在冷卻步驟終點(diǎn)測定每次單獨(dú)反應(yīng)發(fā)出的熒光。"分 子信標(biāo)解鏈曲線"實(shí)驗(yàn)最終數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為 "SYBR Green(解離曲線)" 實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ?。由MX4000軟件確定每個分子信標(biāo)-靶序列對的解鏈溫度 (Tm),作為與熒光輸出的一階導(dǎo)數(shù)-R' (T)的最大值相對應(yīng)的溫度點(diǎn)。 每個熱曲線實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。 實(shí)施例4
在兩個或多個等位基因間核酸雜交探針的識別能力具有溫度依 賴性，即如果探針在70。C識別與靶序列有1個核香酸不同的序列，在 40。C下探針可能與耙錯配，從而在如此低溫下無法識別。
我們把探針的等位基因識別能力看作探針設(shè)計(jì)和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的一 部分。測定分子信標(biāo)對代表野生型CaFi^S7和具有第1933位和第1934 位的卡泊芬凈耐藥性突變以及第1929位的SNP的不同Ca尸X57等位 基因的8個DNA寡聚核苷酸模板的雜交曲線(圖4)。圖4中這些寡聚 核普酸稱為"靶"，用于探針的解鏈曲線分析。在數(shù)個靶序列中，加下劃線的部分與一種探針互補(bǔ)配對，如圖所示，加入另外的末端重復(fù) 腺芬從而減少解鏈曲線分析期間二級結(jié)構(gòu)形成。首先用兩種DNA靶
評價其與每種分子信標(biāo)探針的雜交，此DNA把與探針域序列互補(bǔ)， 不同之處在于與第1929位SNP對應(yīng)的核苷酸石咸基。每種簡并的分子 信標(biāo)探針與這些DNA靶形成兩種類型的分子間雜交體。靶寡聚核苷 酸和具有互補(bǔ)序列的分子信標(biāo)亞群形成穩(wěn)定的雜交體。另一種在第 1929位具有單錯配(single mismatched)核苷酸的分子信標(biāo)探針亞群與 相同DNA靶形成較不穩(wěn)定的雜交體。結(jié)果，以焚光輸出的一階導(dǎo)數(shù) (-R' (T))表示的混合探針的解鏈曲線顯示兩個獨(dú)特的峰，分別對應(yīng)于較 穩(wěn)定和較不穩(wěn)定的分子信標(biāo)-靶雜交體的Tms。然后我們研究了每種分 子信標(biāo)與非互補(bǔ)DNA寡聚核苷酸(圖4)的雜交。盡管這種錯配雜交體 通常比互補(bǔ)的更不穩(wěn)定，但是分子信標(biāo)的簡并性對于這兩種雜交體亞 群能產(chǎn)生相同的趨勢。通過靶寡聚核苷酸與單錯配的信標(biāo)亞群形成較 穩(wěn)定的分子間雜交體，相反較不穩(wěn)定的雜交體包含寡聚核苷酸和雙錯 配(double mismatches)的信標(biāo)亞群。8個簡并分子信標(biāo)與靶寡聚核苦 酸對中的每一對得到的兩個TJ直中只考慮較高的Tm值，其對應(yīng)于單 錯配或沒有錯配的較穩(wěn)定的信標(biāo)-靶雜交體。這些OlFXS7分子信標(biāo)與 其互補(bǔ)DNA耙的Tm值相當(dāng)接近，溫度范圍降至62.7。C-64.0。C。相應(yīng) 的識別窗也占據(jù)類似的溫度范圍(thermal diapason)。通過改變單個信 標(biāo)的探針域序列的長度達(dá)到這種一致性。分子信標(biāo)CaFKSl-WT、 CaFKSl-T1933C、CaFKSl-C1934A和CaFKSl-C1934T相應(yīng)的具有24、 23、 25和25個核苷酸的探針域。 實(shí)施例5
用圖4所述的引物和探針證明了實(shí)施擴(kuò)增檢測法。本實(shí)驗(yàn)包括通 過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增DNA和利用分子信標(biāo)探針實(shí)時檢測。
關(guān)于使用各個單探針(圖4)的檢測步驟如下。在Stratagene Mx4000 多重定量PCR系統(tǒng)上使用"定量PCR(多標(biāo)準(zhǔn))(Multiple Standards)" 設(shè)置進(jìn)行實(shí)時PCR實(shí)驗(yàn)。Brilliant QPCR Core試劑盒(Stratagene, LaJolla, CA)中的試劑可用于所有反應(yīng)。每個5(HilPCR反應(yīng)體系含有l(wèi)x Stratagene Core PCR緩沖液、0.2 )iM分子信標(biāo)、分別為0.25 fiM的 HS1AN2和HS1SN2引物(圖4)， 2.5 U SureStart Taq DNA聚合酶 (Stratagene, La Jolla, CA)、 0.4 mM dNTPs、 4 mM MgCl2和約50 ng白 色念珠菌染色體DNA。在多重PCR實(shí)驗(yàn)中，這4種分子信標(biāo)(圖4) 各自的濃度為0.2nM。實(shí)時PCR溫度循環(huán)參數(shù)為1次循環(huán)95°C 10 分鐘；45次循環(huán)，95°C 30秒，61°C 30秒，72°C 30秒鐘。當(dāng)以多 重方式進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn)時使用6(TC的退火溫度。為了平衡不同分子信 標(biāo)產(chǎn)生的熒光信號強(qiáng)度，Mx4000系統(tǒng)的濾光器放大裝置(filter gain set) 更換為FAM-960 HEX-720。退火期間熒光強(qiáng)度測定3次。
Stratagene Mx4000系統(tǒng)在PCR擴(kuò)增期間產(chǎn)生的熒光信號4吏用 Mx4000軟件實(shí)時檢測。在每次運(yùn)行終點(diǎn)，將擴(kuò)增圖數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)變?yōu)閳D形 并保存為圖象文件，或?qū)С鲋罬icrosoft Office Excel并保存為表格文 件。在多重PCR反應(yīng)情況下，PCR擴(kuò)增的最終結(jié)果由"定量PCR(多 標(biāo)準(zhǔn))"實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ睫D(zhuǎn)變?yōu)?定量讀板"實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ健蝹€熒光團(tuán)(Rpost-Rpre) 發(fā)射熒光的總變化作為分析值。結(jié)果轉(zhuǎn)換為圖形或數(shù)字格式并保存為 圖象文件或表格文件。
除了溫度循環(huán)的退火溫度為6(TC而不是6rC外，我們利用上述 PCR擴(kuò)增進(jìn)行多重檢測。在相同反應(yīng)中使用多探針。
實(shí)施例6
已經(jīng)設(shè)計(jì)出引物和分子信標(biāo)，用于我們稱為HS2的第二條DNA 序列的PCR擴(kuò)增。這些引物具有下面的序列 CCATTTGGTTGTTACAATATTGC-3' CCAATGGAATGAAAGAAATGAAG-3'
為了區(qū)分棘球白素-耐藥突變體G4082A和野生型基因序列，設(shè)計(jì) 了用于一對等位基因識別分子探針的核苷酸序列。每個序列的一個末 端用熒光團(tuán)標(biāo)記，另一端用無萸光的猝滅劑例如DABCYL標(biāo)記。當(dāng) 然也可使用可區(qū)分的熒光團(tuán)使野生型探針只與野生型基因序列雜交而發(fā)出熒光，使突變體探針只與突變體序列雜交而發(fā)出熒光，在含有 這些探針中的一種的終點(diǎn)檢測和實(shí)時擴(kuò)增檢測中，或者在含有所有兩 種探針的多重檢測中都適用，無論含有或不含有第一條靶序列的引物 或探針。
分子信標(biāo)探針具有長度為24個核苷酸的單鏈環(huán)，兩側(cè)為形成6 個核苷酸莖區(qū)的互補(bǔ)的3'和5'臂序列(arm s叫uences)。兩探針的計(jì)算 Tm均為61.5°C。序列為
野生型探針
CGCGAGGATTGGATTAGACGTTATACTTTGCTCGCG 突變體探針
CGCGAGGATTGGATTAGACATTATACTTTGCTCGCG
互補(bǔ)臂序列加有下劃線，突變體中的單核苷酸突變標(biāo)為黑體。 本發(fā)明已經(jīng)描述了許多實(shí)施方案。然而應(yīng)理解在不偏離本發(fā)明精 神和范圍內(nèi)可作各種修改。例如可使用除PCR外的其他擴(kuò)增方法比如 NASBA,可使用除分子信標(biāo)探針外其他等位基因識別探針。相應(yīng)的其 他實(shí)施方案也在本發(fā)明范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1. 一種核酸檢測法，檢測對棘球白素類藥物敏感且含有對應(yīng)于1-3β-D-葡聚糖合酶亞基Fkslp的FKS1基因的真菌中對棘球白素類藥物的耐藥性，包括擴(kuò)增FKS1基因的第一條核酸靶序列，該序列與包括第641位至第649位氨基酸在內(nèi)的CaFkslp第636位至第654位氨基酸的至少一部分相對應(yīng)；以及檢測與所述擴(kuò)增的第一條靶序列內(nèi)野生型等位基因之間的任何差異。
2. 權(quán)利要求l的檢測法，其中真菌為念珠菌。
3. 權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的檢測法，能夠檢測選自CaFkslp中 F641L、 F641S、 S645P、 S645Y、 S645F、 D648Y和P649H的至少一 個氨基酸突變。
4. 權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的檢測法，其中擴(kuò)增步驟包括擴(kuò)增對應(yīng) 于l-3-f3-D-葡聚糖合酶亞基Fkslp的FKS1基因的第二條核酸靶序列， 該序列與包括第1357位至第1364位氨基酸在內(nèi)的CaFkslp第1345 位至1369位氨基酸序列的至少一部分相對應(yīng)；并且其中檢測步驟包 括檢測與所述擴(kuò)增的第二條靶序列內(nèi)野生型等位基因之間的任何差 異。
5. 權(quán)利要求4的檢測法，能夠檢測選自CaFkslp中R1361H和 R1361G的至少一個氨基酸改變。
6. 權(quán)利要求4或5的檢測法，其中第一個靶序列與第二個耙序列 的擴(kuò)增均在相同的反應(yīng)混合物中完成。
7. 權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的檢測法，其中檢測步驟包括序列測定。
8. 權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的檢測法，其中檢測步驟包括擴(kuò)增的第 一個靶序列和第二個耙序列與標(biāo)記的雜交探針接觸。
9. 權(quán)利要求8的檢測法，其中檢測為均相終點(diǎn)檢測或?qū)崟r檢觀'J。
10. —種權(quán)利要求9的實(shí)時檢測法。
11. 權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的檢測法，其中擴(kuò)增步驟包括選自PCR、 NASBA和TMA的擴(kuò)增方法。
12. —種包括用于擴(kuò)增所述第 一個靶序列的第 一對正向？ 1物和反 向引物的寡聚核苷酸組，其中正向引物和反向引物用于擴(kuò)增對應(yīng)于 l-3-P-D-葡聚糖合酶亞基Fkslp的i^XS7基因的第一條核酸靶序列，該 序列與包括第641位至第649位氨基酸在內(nèi)的CaFkslp第636位至654 位氨基酸序列的至少 一部分相對應(yīng)。
13. 權(quán)利要求12的寡聚核苷酸組，包括用于擴(kuò)增對應(yīng)于1-3-P-D-葡聚糖合酶亞基Fkslp的基因的第二條核酸靶序列的第二對正 向引物和反向引物，該序列與包括第1357位至第1364位氨基酸在內(nèi) 的CaFkslp第1345位至1369位氨基酸的至少一序列部分相對應(yīng)。
14. 權(quán)利要求12的寡聚核苷酸組，其中所述第一對正向引物和反 向引物也涵蓋與CaFkslp第1357位至第1364位氨基酸對應(yīng)的氨基酸。
15. 權(quán)利要求12-14中任一項(xiàng)的寡聚核苷酸組，進(jìn)一步包括標(biāo)記 的等位基因識別雜交探針，該探針選擇性的與選自Ca^XS7中 T1921C、 T1922C、 G1932T、 T1933C、 C1934A、 C1934T、 C1934G、 C1942T和C1946A的至少一個突變體雜交。
16. 權(quán)利要求13-15中任一項(xiàng)的寡聚核苦酸組，進(jìn)一步包括標(biāo)記 的等位基因識別雜交探針，該探針選擇性的與選自CoFXS/中C4081G 和G4082A的至少一個突變體雜交。
17. 權(quán)利要求12的寡聚核苦酸組，進(jìn)一步包含用于測定所述正向 引物和反向引物所限定的擴(kuò)增產(chǎn)物序列的測序引物。
18. —種試劑盒，用于執(zhí)行權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)的檢測法。
19. 權(quán)利要求18的試劑盒，包括權(quán)利要求12-17中任一項(xiàng)的寡聚 核香酸組。
20. 權(quán)利要求18或權(quán)利要求19的試劑盒，另外包括用于樣品制 備和DNA提耳又的試劑。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種分析真菌基因FKS1的兩個短部分的突變的核酸擴(kuò)增檢測法。這些靶序列中的突變顯示出與棘球白素類藥物的耐藥性的相關(guān)性。該檢測法可包括通過測序檢測或通過標(biāo)記的雜交探針檢測。還提供了進(jìn)行這種檢測的引物、探針和試劑盒。
文檔編號C12Q1/68GK101448953SQ200680035097
公開日2009年6月3日 申請日期2006年7月26日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月26日
發(fā)明者C·M·杜格拉斯, D·S·珀林, J·N·卡恩, R·凱利, S·A·帕倫特, S·帕克 申請人:新澤西醫(yī)學(xué)與牙科大學(xué);默克公司