專利名稱：：用于增加細(xì)胞培養(yǎng)物的壽命和蛋白收率的改良方法和組合物的制作方法用于增加細(xì)胞培養(yǎng)物的壽命和蛋白收率的改良方法和組合物發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明的多個(gè)實(shí)施方案涉及增加細(xì)胞系的壽命和/或蛋白收率的方法和組合物。在具體的實(shí)施方案中，所述細(xì)胞系可為生產(chǎn)抗體或抗體片段的雜交瘤細(xì)胞系。在更具體的實(shí)施方案中，所述方法可包括用一種或多種基因(例如編碼E6、E7和/或Bcl-2或相關(guān)蛋白的基因)轉(zhuǎn)染細(xì)胞系。這些蛋白不限于其天然序列，而是可包括一個(gè)或多個(gè)置換的氨基酸，例如具有T69E、S70E和S87E點(diǎn)突變的Bcl-2。其它實(shí)施方案涉及能夠在無(wú)血清培養(yǎng)基中生長(zhǎng)和生產(chǎn)蛋白的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系?？赏ㄟ^(guò)用表達(dá)異源蛋白的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染這些細(xì)胞系而將這些細(xì)胞系用于蛋白生產(chǎn)方法，所述異源蛋白例如為抗體、雙特異性抗體、多價(jià)抗體或多特異性抗體或其片段。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述細(xì)胞系可在無(wú)血清培養(yǎng)基中被轉(zhuǎn)染，由于避免了必須使轉(zhuǎn)染細(xì)胞系適應(yīng)無(wú)血清生長(zhǎng)和蛋白生產(chǎn)，因而提供了可觀的時(shí)間節(jié)省。發(fā)明背景多生物技術(shù)產(chǎn)品的基礎(chǔ)，包括由這些細(xì)胞將蛋白產(chǎn)物加工到支持介質(zhì)中，由此支持介質(zhì)分離這些產(chǎn)物，并進(jìn)一步加工，然后臨床使用。培養(yǎng)物中生長(zhǎng)的細(xì)胞隨時(shí)間變化的蛋白生產(chǎn)量取決于眾多因素，例如細(xì)胞密度、細(xì)胞周期、蛋白的細(xì)胞生物合成速率、用于支持細(xì)胞存活率和生長(zhǎng)的培養(yǎng)基條件狀況以及培養(yǎng)物中的細(xì)胞壽命(即它們需要多長(zhǎng)時(shí)間死于程序性細(xì)胞死亡或凋亡)。已開發(fā)了各種改善培養(yǎng)物中的細(xì)胞存活率和壽命的方法，以及通過(guò)例如控制營(yíng)養(yǎng)、細(xì)胞密度、氧和二氧化碳含量、乳酸脫氫酶、pH、摩爾滲透壓濃度、分解代謝產(chǎn)物等增加所需蛋白的生產(chǎn)率的方法。例如，增加細(xì)胞密度可使該過(guò)程更高產(chǎn)，但也能降低培養(yǎng)物中的細(xì)胞壽命。因此，可能期望在達(dá)到最大密度時(shí)降低培養(yǎng)物中這些細(xì)胞的增殖速率，以便將細(xì)胞群盡可能長(zhǎng)時(shí)間地保持在其最高產(chǎn)狀態(tài)。這導(dǎo)致增加或延長(zhǎng)了處于其生產(chǎn)高峰的生物反應(yīng)器周期，加工目標(biāo)蛋白產(chǎn)物的時(shí)間段更長(zhǎng)，并且這導(dǎo)致生物反應(yīng)器周期收率的更高。已尋求許多不同的方法來(lái)增加生物反應(yīng)器周期時(shí)間，例如調(diào)節(jié)支持細(xì)胞增殖的培養(yǎng)基、加入某些生長(zhǎng)促進(jìn)因子以及抑制細(xì)胞增殖而不影響蛋白合成。一個(gè)具體方法的目的就在于通過(guò)使用影響細(xì)胞周期靶的基因或反義寡核苷酸控制細(xì)胞周期來(lái)增加培養(yǎng)細(xì)胞的壽命，從而通過(guò)用阻止細(xì)胞周期發(fā)展和誘導(dǎo)所謂的假衰老狀態(tài)的載體來(lái)轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)化或感染而將細(xì)胞誘導(dǎo)至假衰老階段，所述假衰老狀態(tài)阻斷進(jìn)一步的細(xì)胞分裂，并擴(kuò)大培養(yǎng)物中所述細(xì)胞的蛋白合成能力；換句話說(shuō)，假衰老狀態(tài)可通過(guò)用表達(dá)細(xì)胞周期抑制劑的載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞來(lái)誘導(dǎo)(Bucciarelli等，美國(guó)專利申請(qǐng)2002/0160450Al;WO02/16590A2)。后一種方法通過(guò)抑制細(xì)胞復(fù)制設(shè)法迫使細(xì)胞進(jìn)入可具有延長(zhǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)物壽命(如Goldstein和Singal，ExpCellRes88，359-64,1974;Brenner等，Oncogene17:199-205，1998所述)并可抗凋亡(Chang等，ProcNatlAcadSciUSA97,4291-6，2000;Javeland等，Oncogene19,61-8，2000)的狀態(tài)。另一個(gè)方法涉及建立在用腺病毒El基因轉(zhuǎn)染后無(wú)限增殖的原代二倍體人細(xì)胞或其衍生物。新細(xì)胞系(其中一種是表達(dá)功能性Ad5EIA和EIB基因產(chǎn)物的PER.C6(ECACC保藏號(hào)96022940))可生產(chǎn)重組腺病毒以及設(shè)計(jì)用于基因治療和疫苗以及用于生產(chǎn)重組治療性蛋白(例如人生長(zhǎng)因子和人抗體(Vogels等，WO02/40665A2))的其它病毒(例如流感病毒、單純皰滲病毒、輪狀病毒、麻滲病毒)。其它方法集中于應(yīng)用胱天蛋白酶抑制劑來(lái)防止或延遲細(xì)胞凋亡。參見例如美國(guó)專利第6,586,206號(hào)。還有一些方法嘗試使用凋亡抑制劑如Bcl-2家族成員預(yù)防或延遲細(xì)胞凋亡。參見Arden等，BioprocessingJournal,3:23-28(2004)。這些方法已產(chǎn)生不可預(yù)知的結(jié)果。例如，在一項(xiàng)研究中，Bcl-2表達(dá)增加了細(xì)胞存活率，但并不增加蛋白產(chǎn)量。(參見Tey等，Biotechnol.Bioeng.68:31-43，2000)。另一個(gè)實(shí)例公開了Bcl-2蛋白的過(guò)表達(dá)延遲了CHO細(xì)胞凋亡，但Bcl-xL增加蛋白產(chǎn)量，而Bcl-2降低蛋白產(chǎn)量(參見WO03/083093)。又一個(gè)實(shí)例公開了使用Bcl-2蛋白表達(dá)來(lái)延長(zhǎng)培養(yǎng)物中的Sp2/0-Ag14(ATCC#CRL-1581，后文稱為Sp2/0)細(xì)胞存活的實(shí)驗(yàn)。但是，表達(dá)Bcl-2的克隆的細(xì)胞密度比其親本培養(yǎng)物的細(xì)胞密度低20-50%，這引起對(duì)其在生物醫(yī)藥工業(yè)中的實(shí)際應(yīng)用的顧慮(參見WO03/040374;U.S.6,964,199)。因此，顯然，本領(lǐng)域需要高水平表達(dá)重組蛋白的改良宿主細(xì)胞，以及在宿主細(xì)胞中可靠地增加重組蛋白生產(chǎn)(尤其是抗體和抗體片段、多特異性抗體、片段和單鏈構(gòu)建物、肽、酶、生長(zhǎng)因子、激素、白介素、干擾素和疫苗的生產(chǎn))的方法。還需要預(yù)適應(yīng)在無(wú)血清或血清耗竭培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的細(xì)胞系，這些細(xì)胞系可在無(wú)血清條件下用表達(dá)載體轉(zhuǎn)染并用于蛋白生產(chǎn)，在無(wú)血清生長(zhǎng)和蛋白生產(chǎn)前無(wú)需經(jīng)歷長(zhǎng)適應(yīng)期。發(fā)明概述因此，本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)是通過(guò)將抑制衰老或促進(jìn)細(xì)胞存活的物質(zhì)(例如抗凋亡劑)導(dǎo)入細(xì)胞中提供改良的宿主細(xì)胞，增加細(xì)胞培養(yǎng)物的壽命和/或重組蛋白產(chǎn)量的方法。這類物質(zhì)的使用優(yōu)先增加培養(yǎng)物中用于生產(chǎn)所需重組蛋白的細(xì)胞的壽命和存活率，伴隨地增加培養(yǎng)物中這些細(xì)胞的生產(chǎn)率，由此增加所需蛋白的最佳收率。優(yōu)選地，用于本發(fā)明方法的凋亡抑制劑包括但不限于Bcl-2及其家族成員?；蛘撸赏ㄟ^(guò)將下調(diào)胞內(nèi)促凋亡蛋白(例如p53和Rb)水平的物質(zhì)或上調(diào)胞內(nèi)抗凋亡蛋白(例如Bcl-2)的物質(zhì)導(dǎo)入細(xì)胞中改善細(xì)胞克隆的壽命和重組蛋白收率。優(yōu)選地，用于本發(fā)明方法的調(diào)節(jié)劑包括但不限于人乳頭瘤病毒16型(HPV-16)癌蛋白E6和E7、抗凋亡蛋白Bcl-2及其組合。另外，如本文所述的胱天蛋白酶抑制劑也可能有助于阻滯或減緩凋亡，由此增加細(xì)胞存活和增加培養(yǎng)物中所述細(xì)胞的重組蛋白產(chǎn)量?？稍谶@些培養(yǎng)物中用于增強(qiáng)重組蛋白生產(chǎn)的其它類別的抗凋亡劑包括細(xì)胞因子I型超家族的某些成員，例如促紅細(xì)胞生成素(EPO)。EPO作為該類別的一種原型分子，是多種細(xì)胞類型(不僅僅是紅細(xì)胞)凋亡的主要調(diào)節(jié)物，因此例如在內(nèi)皮細(xì)胞、心肌細(xì)胞、腎臟、皮膚和神經(jīng)元的管狀上皮細(xì)胞中具有更通用的細(xì)胞保護(hù)功能[參考P.Ghezzi和M.Brines,CellDeathandDifferentiation11(增刊1)，s37-s44,2004年7月的綜述]。[OOIO]在多個(gè)實(shí)施方案中，已用一種或多種調(diào)節(jié)劑如HPV-16、E6、E7和/或Bcl-2轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系可對(duì)在無(wú)血清培養(yǎng)基中生長(zhǎng)進(jìn)行預(yù)適應(yīng)。這類經(jīng)預(yù)適應(yīng)的細(xì)胞系包括但不限于Sp/ESF細(xì)胞系(參見以下實(shí)施例)，它們能夠在無(wú)血清條件下用一種或多種表達(dá)載體進(jìn)行進(jìn)一步的轉(zhuǎn)化，由此允許在無(wú)血清條件下表達(dá)和生產(chǎn)蛋白，而無(wú)需適應(yīng)無(wú)血清生長(zhǎng)所需的大量時(shí)間。這種意想不到的結(jié)果使得可以在無(wú)血清或低血清條件下生產(chǎn)蛋白，提供了顯著的培養(yǎng)基成本節(jié)約。同時(shí)，在無(wú)血清條件下的轉(zhuǎn)染和蛋白生產(chǎn)節(jié)約了無(wú)血清適應(yīng)所需的大量時(shí)間，而該時(shí)間在使用標(biāo)準(zhǔn)哺乳動(dòng)物細(xì)胞系時(shí)是必需的，這些標(biāo)準(zhǔn)哺乳動(dòng)物細(xì)胞系只有在富血清條件下才是可轉(zhuǎn)染的，需要額外的6-12個(gè)月來(lái)適應(yīng)無(wú)血清蛋白生產(chǎn)。本發(fā)明還講授了摻入新的因素組合的細(xì)胞培養(yǎng)方法，所述因素包括但不限于轉(zhuǎn)染載體、篩選和選擇具有所需特性的細(xì)胞克隆、細(xì)胞培養(yǎng)基、生長(zhǎng)條件、生物反應(yīng)器配置和細(xì)胞類型，以建立其中細(xì)胞培養(yǎng)物的壽命被增加和/或變得最佳以及所需重組蛋白收率增加的細(xì)胞培養(yǎng)條件。這些細(xì)胞培養(yǎng)方法包括懸浮、灌注和補(bǔ)料-分批生產(chǎn)方法。參見Tey等，J.BiotechnoL79:147-159(2000);Zhang等，J.Chem.Technol.BiotechnoL79:171-181(2004);Zhou等，Biotechnol.Bioeng.55:783-792(1997)。除非另有定義，否則本文使用的所有技術(shù)和科技術(shù)語(yǔ)都具有其平常的和普通的含義。另外，本文提及的所有專利和其它參考文獻(xiàn)的內(nèi)容都通過(guò)引用整體結(jié)合到本文中。附圖簡(jiǎn)述圖1顯示了用環(huán)己酰亞胺處理(+CHX)或未處理(-CHX)的Sp2/0和Sp-E26細(xì)胞的目視圖象。圖2顯示了對(duì)CHX處理更有抗性的HPVE6/E7轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的篩選結(jié)果。篩選了總共55個(gè)克??；在第一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，篩選31個(gè)克隆(上圖)；在第二個(gè)實(shí)驗(yàn)中，篩選24個(gè)克隆(下圖)。將各個(gè)克隆的健康細(xì)胞分為兩等份。一份用CHX處理2小時(shí)，另一份不處理。然后通過(guò)MTT測(cè)定來(lái)檢測(cè)這兩種培養(yǎng)物中的存活細(xì)胞，對(duì)經(jīng)處理的存活細(xì)胞群(CHX+)對(duì)未處理的存活細(xì)胞群(CHX_)的比率作圖。如上圖所示，CHX處理導(dǎo)致Sp2/0細(xì)胞的存活率下降30%,而Sp-E26細(xì)胞僅下降6%。所篩選的31個(gè)克隆中有7個(gè)(以*表示)表現(xiàn)得顯著好于Sp2/0(存活率下降<20%)，但不如Sp-E26。對(duì)于在第二個(gè)實(shí)驗(yàn)中篩選的24個(gè)克隆(下圖)，CHX處理導(dǎo)致Sp2/0細(xì)胞的存活率下降約50%,Sp-E26存活率下降<20%。所篩選的24個(gè)克隆中有10個(gè)(以*或**表示)表現(xiàn)得顯著好于Sp2/0(<30%下降)，它們中的6個(gè)(以**表示)相當(dāng)于或好于Sp-E26(<20%)。E28和E36是兩個(gè)額外的對(duì)照克隆，表現(xiàn)得好于Sp2/0，^f旦不如Sp-E26。圖3顯示了Guava微管連接蛋白V測(cè)定的斑點(diǎn)印跡。早期凋亡細(xì)胞的百分率(微管連接蛋白V-陽(yáng)性和7-AAD-陰性)示于右下象限。圖4顯示了CHX處理的Sp2/0中的DNA片段化。相比之下，Sp-E26細(xì)胞抗所述處理。圖5顯示了Sp2/0和Sp-E26細(xì)胞在T-培養(yǎng)瓶中的生長(zhǎng)譜。將健康細(xì)胞(〉95%存活率)以200,000個(gè)/ml的初始細(xì)胞密度接種在T-培養(yǎng)并瓦中。每日使用GuavaViaCount試劑(Guavatechnologies,Inc.)和PCA設(shè)備(GuavaTechnologies,Inc.)計(jì)數(shù)存活細(xì)胞和死細(xì)胞。還監(jiān)測(cè)NH/和乳酸鹽的累積。和Sp-E26細(xì)胞的生長(zhǎng)譜。將健康細(xì)胞(>95%存活率)以250,000個(gè)/ml的初始細(xì)胞密度接種在生物反應(yīng)器中。每日通過(guò)錐蟲藍(lán)和顯微鏡計(jì)數(shù)細(xì)胞。圖7顯示了用Bcl-2(100)抗體(SantaCmzBiotech.)染色并用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光顯現(xiàn)來(lái)篩選克隆之Bcl-2-EEE表達(dá)的代表性免疫印跡。圖8顯示了使用GuavaExpress的流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果的圖。固定細(xì)胞，并透化，然后用綴合了藻紅蛋白的抗Bcl-2抗體(SantaCruzBiotechnology,Inc.)染色。對(duì)比幾個(gè)亞克隆。圖9顯示了使用GuavaExpress的流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果的圖。固定細(xì)胞，并透化，然后用綴合了藻紅蛋白的抗Bcl-2抗體(SantaCruzBiotechnology,Inc.)染色。將Sp2/0、Raji和Daudi細(xì)月包與Bel-2-EEE克隆進(jìn)行對(duì)比。圖10顯示了665.B4.1Cl、Sp2/0、Raji、Daudi、Sp-EEE(87-29克隆)和Sp-EEE(7-16克隆)細(xì)胞裂解物的免疫印跡分析的結(jié)果。(A)用人Bcl-2特異性抗體(SantaCruzBiotechnology,Inc)染色的印跡。(B)用識(shí)別小鼠和人Bcl-2的抗Bcl-2抗體(SantaCruzBiotechnology,Inc)染色的印跡。圖11顯示了與在補(bǔ)加10%胎牛血清的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的Sp2/0細(xì)胞相比Sp-EEE克隆的生長(zhǎng)曲線(A)和存活率(B)。圖12顯示了與在補(bǔ)加1%胎牛血清的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的Sp2/0細(xì)胞相比Sp-EEE克隆的生長(zhǎng)曲線(A)和存活率(B)。圖13顯示了與在無(wú)血清培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的Sp2/0細(xì)胞相比Sp-EEE克隆的生長(zhǎng)曲線(A)和存活率(B)。圖14顯示了氨甲蝶呤對(duì)Sp-EEE(87-29克隆)細(xì)胞的殺傷曲線。圖15顯示了與在有或沒有1mg/mlzeocin的情況下生長(zhǎng)的Sp-EEE克隆相比，使用GuavaExpress的流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果圖。固定細(xì)胞，并透化，然后用綴合了藻紅蛋白的抗Bcl-2抗體(SantaCruzBiotechnology,Inc.)染色。圖16顯示了用于轉(zhuǎn)染Sp2/0細(xì)胞從而獲得665.2B9克隆的pdHL2載體的圖譜，其具有人源化抗體序列以及SV40啟動(dòng)子和增強(qiáng)子序列。圖17顯示了摻入了Bcl-2基因的DNA質(zhì)粒的圖語(yǔ)，用于轉(zhuǎn)染克隆665.2B9。圖18和圖19顯示了Bcl-2轉(zhuǎn)染克隆665.2B9糾、Bcl-2陰性克隆和未轉(zhuǎn)染對(duì)照的生長(zhǎng)語(yǔ)。將健康細(xì)胞(〉95。/。存活率)以400,000個(gè)/ml的初始細(xì)胞密度接種在24-孔板中。每日使用GuavaViaCount試劑和PCA設(shè)備計(jì)數(shù)存活細(xì)胞和死細(xì)胞。圖20和圖21顯示了Bcl-2轉(zhuǎn)染克隆665.2B9弁4和Bcl-2陰性克隆于不同MTX濃度的生長(zhǎng)譜。將健康細(xì)胞(〉95%存活率)以100,000個(gè)/ml的初始細(xì)胞密度接種在T-培養(yǎng)瓶中。每日使用GuavaViaCount試劑和PCA設(shè)備計(jì)數(shù)存活細(xì)胞密度和存活率。圖22顯示了克隆665.2B9#4于漸增的MTX濃度下表達(dá)的人Bcl-2水平和克隆#13表達(dá)的人Bcl-2水平，該水平通過(guò)蛋白質(zhì)印跡分析來(lái)纟企測(cè)。圖23和圖24分別顯示了在有或沒有攙入L-谷氨酰胺和葡萄4t的情況下在0.6和1fJvlMTX中培養(yǎng)的克隆665.2B9#4和在0.3MTX中培養(yǎng)的Bel-2-陰性克隆#13的細(xì)胞存活率和存活細(xì)胞密度的分布型。將健康細(xì)胞(>95%存活率)以200,000個(gè)/ml的初始細(xì)胞密度接種在轉(zhuǎn)瓶中。在第2天和第4天(箭頭指示)，將含葡萄糖和L-谷氨酰胺的營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充溶液加入"攙入"培養(yǎng)物中。每日使用GuavaViaCount試劑和PCA設(shè)備計(jì)數(shù)存活細(xì)胞和死細(xì)胞。圖25顯示了在5天培養(yǎng)當(dāng)中已適應(yīng)的Sp/EEE亞克隆在無(wú)血清培養(yǎng)基中的存活率。圖26圖示了在5天培養(yǎng)當(dāng)中無(wú)血清Sp/EEE亞克隆的存活細(xì)胞密度。發(fā)明詳述本文使用的"a"或"an"可指一個(gè)或一個(gè)以上的項(xiàng)目。本文使用的術(shù)語(yǔ)"和"與"或"可用于指合取或析取。即，兩個(gè)術(shù)語(yǔ)都應(yīng)被理解為等同于"和/或"，另有說(shuō)明的除外。本文使用的術(shù)語(yǔ)"約，，指加或減10%。即，"約100"指介于90和110之間的數(shù)字。本文描述的抗體指全長(zhǎng)(即天然的或通過(guò)正常免疫球蛋白基因片段重組過(guò)程形成的)免疫球蛋白分子(例如IgG抗體)或免疫球蛋白分子的免疫活性(即特異性結(jié)合)部分或類似物，如抗體片段。抗體片段是抗體的一部分，例如F(ab)2、F(ab，)2、Fab、Fv、sFv等。抗體片段與完整抗體所識(shí)別的相同抗原結(jié)合，與結(jié)構(gòu)無(wú)關(guān)。術(shù)語(yǔ)"抗體片段"還包括任何合成的或遺傳工程的蛋白，其通過(guò)結(jié)合特定抗原形成復(fù)合物起類似于抗體的作用。例如，抗體片段包括由可變區(qū)組成的分離片段，例如由重鏈和輕鏈的可變區(qū)組成的"Fv"片段、其中輕鏈和重鏈可變區(qū)通過(guò)肽接頭連接的重組單鏈多肽分子("scFv蛋白")以及由模擬高變區(qū)的氨基酸殘基組成的最小識(shí)別單位(CDR)。本文使用的術(shù)語(yǔ)抗體融合蛋白指重組生產(chǎn)的抗原結(jié)合分子，其中兩個(gè)或多個(gè)具有相同或不同特異性的相同或不同scFv或抗體片段相連接。融合蛋白的價(jià)數(shù)表示融合蛋白對(duì)單個(gè)抗原或表位具有多少個(gè)結(jié)合臂或位點(diǎn)；即單價(jià)、二價(jià)、三價(jià)或多價(jià)。抗體融合蛋白的多價(jià)指其在結(jié)合抗原時(shí)可利用多種相互作用，因此增加與抗原結(jié)合的親合力。特異性表示抗體融合蛋白能夠結(jié)合多少種抗原或表位；即單特異性、雙特異性、三特異性、多特異性。使用這些定義，天然抗體如IgG是二價(jià)的，因?yàn)槠渚哂袃蓚€(gè)結(jié)合臂，但是其是單特異性的，因?yàn)槠浣Y(jié)合一種表位。單特異性多價(jià)融合蛋白對(duì)一種表位具有不止一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，但僅結(jié)合一種這樣的表位，例如雙抗體具有兩個(gè)與同一抗原反應(yīng)的結(jié)合位點(diǎn)。融合蛋白可包含單個(gè)抗體組分、不同抗體組分的多價(jià)或多特異性組合或多拷貝的相同抗體組分。融合蛋白可另外包含抗體或抗體片段和治療劑。適于這類融合蛋白的治療劑的實(shí)例包括免疫調(diào)節(jié)劑("抗體-免疫調(diào)節(jié)劑融合蛋白，，)和毒素("抗體-毒素融合蛋白")。一種優(yōu)選的毒素包括核糖核酸酶(RNA酶)，優(yōu)選為重組RNA酶。細(xì)胞系本發(fā)明的各個(gè)實(shí)施方案涉及改良的組合物，包括宿主細(xì)胞系，并涉及在這些細(xì)胞系中增強(qiáng)重組蛋白生產(chǎn)的方法。業(yè)已建立了組成型表達(dá)一種或多種抗凋亡基因并可用編碼目標(biāo)蛋白或肽的表達(dá)構(gòu)建物轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系，其中抗凋亡基因的表達(dá)延長(zhǎng)了培養(yǎng)物中轉(zhuǎn)染細(xì)胞的存活，并提供了增強(qiáng)的目標(biāo)蛋白或肽的收率。具體的實(shí)施方案涉及Sp2/0骨髓瘤細(xì)胞系的衍生物，該衍生物提供了稱為Sp-E26、Sp-EEE和Sp-ESF的新細(xì)胞系，它們?cè)诜峙囵B(yǎng)中顯示出增強(qiáng)的存活。Sp-E26組成型地表達(dá)HPV-16的E6和E7蛋白。Sp-EEE和Sp-ESF組成型地表達(dá)稱為Bcl-2-EEE的Bcl-2突變體。另外，重組蛋白的生產(chǎn)，尤其是重組抗體和抗體片段的生產(chǎn)，可在用目標(biāo)重組蛋白的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染Sp-E26、Sp-EEE或Sp-ESF時(shí)得以改善。E6/E7或Bcl-2-EEE蛋白延遲了宿主細(xì)胞中的凋亡誘導(dǎo)，允許宿主細(xì)胞中增強(qiáng)的重組蛋白生產(chǎn)。還可通過(guò)將一種或多種胱天蛋白酶抑制劑(例如胱天蛋白酶1和/或3抑制劑)(BinYang等，NephronExperimentalNephrology2004;96:e39-e51)和/或一種或多種細(xì)胞因子I型超家族成員(例如促紅細(xì)胞生成素(EPO))加入到細(xì)胞的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中來(lái)加強(qiáng)蛋白生產(chǎn)。泛胱天蛋白酶(pan-caspase)抑制劑在這方面特別有效。此外，Sp-EEE細(xì)胞系可預(yù)適應(yīng)在無(wú)血清或低血清條件下生長(zhǎng)和蛋白生產(chǎn)，產(chǎn)生無(wú)血清預(yù)適應(yīng)細(xì)胞系，例如Sp-ESF。Sp-ESF和相似的細(xì)胞系可用一種或多種編碼目標(biāo)蛋白(例如抗體、抗體片段、雙特異性抗體等)的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染。將無(wú)血清條件用于轉(zhuǎn)染在可用于轉(zhuǎn)染和蛋白生產(chǎn)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系中是獨(dú)一無(wú)二的，節(jié)省了適應(yīng)無(wú)血清生長(zhǎng)所需的大量時(shí)間。重組蛋白(例如抗體或抗體片段)的生產(chǎn)可通過(guò)共表達(dá)凋亡抑制劑(例如Bc1-2)在宿主細(xì)胞中被顯著增強(qiáng)。具體地說(shuō)，蛋白生產(chǎn)在骨髓瘤細(xì)胞系如Sp2/0中被顯著增強(qiáng)，所述骨髓瘤細(xì)胞系用編碼抗體或抗體片段的表達(dá)載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，并用編碼凋亡抑制劑如Bcl-2的表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染。增加的抗體生產(chǎn)還可由E6/E7基因轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞獲得。還可通過(guò)將一種或多種胱天蛋白酶抑制劑加入細(xì)胞的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中來(lái)加強(qiáng)重組蛋白生產(chǎn)。泛胱天蛋白酶抑制劑在這方面特別有效。另夕卜，可通過(guò)將EPO或另一種抗凋亡細(xì)胞因子補(bǔ)加入細(xì)胞培養(yǎng)物的培養(yǎng)基中來(lái)增強(qiáng)重組蛋白生產(chǎn)。生理性或程序性細(xì)胞死亡稱為凋亡(Kerr等，BrJCancer.,26:239-257,1972),是正確的組織發(fā)育和維持所必需的，由在進(jìn)化中一直保守的固有遺傳程序控制(Ellis等，AnnuRevCellBiol,7,663-698,1991)。因此，當(dāng)細(xì)胞在人工環(huán)境如離體Oxv/vo)培養(yǎng)物中生長(zhǎng)時(shí)，此遺傳天賦導(dǎo)致有限的壽命。因此，這些細(xì)胞培養(yǎng)物對(duì)用于藥物和工業(yè)的蛋白生產(chǎn)以及研究的可用性，取決于維持這些培養(yǎng)物在它們按照凋亡^l4'J死亡之前的延長(zhǎng)壽命或周期。已發(fā)現(xiàn)了通過(guò)區(qū)分細(xì)胞周期與凋亡作用、獨(dú)立地作用于細(xì)胞增殖和細(xì)胞死亡事件的方法和物質(zhì)。Bcl-2是一種眾所周知的凋亡胞內(nèi)調(diào)節(jié)劑(Vaux等，Nature335,440-2,1988),為原癌基因，已發(fā)現(xiàn)其具有與其對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)入的抑制性影響在遺傳上不同的抗凋亡作用(Huang等，EMBOJ16,4628-38，1997)。Bcl-2的兩種同源物BcI-Xl和Bcl-w也延長(zhǎng)細(xì)胞存活，但Bcl-2家族的其它成員如Bax和Bak是促凋亡的(Oltvai等，Cell74，609-19,1993;Chittenden等，Nature374,733-6,1995;Farrow等，Nature374，731-3，1995;Kiefer等，Nature374,736-9，1995)。其它抗凋亡基因包括Bd-6和Mcl-l。因此，Bcl-2及其家族的某些成員表現(xiàn)出抗凋亡的保護(hù)作用，它們可用于增加培養(yǎng)物中用于生產(chǎn)蛋白的某些宿主細(xì)胞壽命，由此提高所產(chǎn)生和分離的蛋白量的方法?？沟蛲鯞cl-2家族成員(如Bcl-2、BCl-x。Bcl-w或這些蛋白的突變體)的過(guò)表達(dá)抑制凋亡，導(dǎo)致細(xì)胞密度增加和培養(yǎng)物存活更長(zhǎng)。因此，抗凋亡Bcl-2家族基因的轉(zhuǎn)染通過(guò)干擾細(xì)胞周期自身避免了延長(zhǎng)細(xì)胞培養(yǎng)的必要性，其他人已提出了這一點(diǎn)(同前)。同樣，用Bcl-2基因轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞導(dǎo)致Bcl-2在這些細(xì)胞中過(guò)表達(dá)，導(dǎo)致拮抗凋亡并增加這些細(xì)胞的壽命，伴隨著重組蛋白生產(chǎn)和分離的增加。還已經(jīng)觀察到在去除細(xì)胞因子時(shí)，白介素-6(IL-6)-依賴性鼠骨髓瘤細(xì)胞死亡，似乎它們經(jīng)歷了凋亡。還發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞中的IL-6-受體在延長(zhǎng)凋亡方面可由Bcl-2或Bcl-xt調(diào)節(jié)(Schwarz等，CancerRes55:2262-5，1995)。已有報(bào)道，具有3點(diǎn)突變(T69E、S70E和S87E)的突變型Bcl-2表現(xiàn)出顯著高于野生型或單點(diǎn)突變體的抗凋亡活性(Deng等，PNAS(101)153-158,2004)。因此，多個(gè)實(shí)施方案涉及構(gòu)建Bcl-2-EEE三重突變體的表達(dá)載體，然后使用該表達(dá)載體轉(zhuǎn)染Sp2/0細(xì)胞，以建立顯示出壽命和重組蛋白生產(chǎn)改善的Sp-EEE克隆和亞克隆。其它物質(zhì)，例如致癌性病毒，也可以對(duì)抗凋亡，作為其激發(fā)細(xì)胞無(wú)限增殖化的一部分，并最終完成惡性轉(zhuǎn)化，例如高風(fēng)險(xiǎn)型HPV癌蛋白E6和E7(Finzer等，CancerLett188,15-24，2002)。例如，病毒E6蛋白有效阻斷對(duì)紫外線的表皮凋亡反應(yīng)(Storey,TrendsMolMed8，417-21，2002)。還已經(jīng)由間接的證據(jù)表明，人乳頭瘤病毒可在鱗狀細(xì)胞(但不是基底細(xì)胞)癌中引起凋亡減弱(Jackson等，BrJCancer87,319-23,2002)。但是，不是所有的乳頭瘤病毒癌蛋白都具有抗凋亡作用。例如，其它研究已報(bào)告了牛物種的乳頭瘤病毒E6蛋白使細(xì)胞對(duì)凋亡敏化(Liu等，Virology295，230-7，2002),這與表明HPV-16E7基因保護(hù)星型細(xì)胞抗某些刺激物誘導(dǎo)的凋亡的其它研究(Lee等，YonseiMedJ42，471-9，2001)相反。通過(guò)使用E6結(jié)合肽適體，獲得HPVE6癌蛋白在HPV陽(yáng)性肺瘤細(xì)胞中具有抗凋亡活性的直接實(shí)驗(yàn)證據(jù)(Butz等，ProcNatlAcadSciUSA97，6693-7，2000)。但是，其它HPV癌蛋白可具有相反的作用。E2蛋白在沒有其它HPV蛋白的情況下誘導(dǎo)凋亡(Webster等，JBiolChem275,87-94，2000)。已知E6和E7兩種蛋白的持續(xù)表達(dá)是子宮頸癌細(xì)胞的最佳增殖所需要的，這兩種病毒蛋白對(duì)細(xì)胞存活表現(xiàn)出截然不同的作用(DeFilippis等，JVirol77，1551-63，2003)。歸于HPV-16E6的主要胞內(nèi)靶是p53。E6與p53和細(xì)胞遍在蛋白連接酶形成三重復(fù)合物E6AP，導(dǎo)致p53通過(guò)蛋白酶體途徑遍在蛋白化和降解以及p53失活。另一方面，HPV-16E7蛋白與肺瘤阻抑蛋白R(shí)b相互作用并^f吏其去穩(wěn)定化。而且，據(jù)報(bào)道，參與凋亡和細(xì)胞周期途徑的各種其它胞內(nèi)蛋白的水平受E6和E7轉(zhuǎn)化調(diào)節(jié)，這些蛋白例如為Bcl-2、Bcl-xL、p73、MDM2、p21、細(xì)胞周期蛋白和cdc、cdk蛋白等。這些蛋白表達(dá)的改變將大大地影響細(xì)胞的生理特性。本發(fā)明人因此假設(shè)，以HPV-16E6和E7轉(zhuǎn)染培養(yǎng)物中的細(xì)胞應(yīng)有效產(chǎn)生遺傳修飾型克隆，這些克隆抗衰老培養(yǎng)條件誘導(dǎo)的凋亡，并因此延長(zhǎng)了細(xì)胞培養(yǎng)物的壽命。還假定將HPV-16癌蛋白E7或E6中的任一種單獨(dú)導(dǎo)入細(xì)胞中可能足以產(chǎn)生對(duì)衰老培養(yǎng)條件誘導(dǎo)的凋亡抗性改善的遺傳修飾型克隆。當(dāng)細(xì)胞是生產(chǎn)重組蛋白的克隆時(shí)，生理特性的改善又會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)檎w蛋白生產(chǎn)率提高。產(chǎn)生表達(dá)病毒性抗凋亡基因的新宿主細(xì)胞可產(chǎn)生組成型表達(dá)病毒性抗凋亡基因(例如HPV-16E6和E7蛋白)的宿主細(xì)胞，例如骨髓瘤宿主細(xì)胞。這些宿主細(xì)胞可用編碼目標(biāo)重組蛋白的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染，抗凋亡基因的共表達(dá)導(dǎo)致重組蛋白的產(chǎn)量顯著增加。宿主細(xì)胞基本上可為適于重組蛋白生產(chǎn)、可用病毒性抗凋亡基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的任意宿主細(xì)胞。對(duì)于許多重組蛋白來(lái)說(shuō)，諸如CHO和COS細(xì)胞的宿主細(xì)胞是有利的，而對(duì)于其它蛋白如抗體來(lái)說(shuō)，諸如骨髓瘤細(xì)胞和CHO細(xì)胞的宿主細(xì)胞是通常的選擇。有用的宿主細(xì)胞系的其它實(shí)例為VERO和HeLa細(xì)胞、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞系、W138、BHK、C0S-7、293、HepG2、3T3、NSO、NS1、RIN和MDCK細(xì)胞系。使用的細(xì)胞系可得自商業(yè)來(lái)源，例如C0S-1(例如ATCCCRL1650)、C0S-7(例如ATCCCRL-1651)、HEK293、BHK21(例如ATCCCRL-IO)、P3X3Ag8.653(ATCCCRL-1580)、CHO(例如ATCCCRL1610)和BSC-1(例如ATCCCRL-26)細(xì)胞系?？赏ㄟ^(guò)導(dǎo)致基因組成型表達(dá)或誘導(dǎo)型表達(dá)的任意合適方法，即允許將基因穩(wěn)定整合入宿主細(xì)胞染色體中并同時(shí)允許基因表達(dá)的任意方法，將病毒(例如E6/E78)和/或真核基因?qū)胨拗骷?xì)胞中。用目標(biāo)基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的方法在本領(lǐng)域眾所周知。特別有利的方法是^f吏用編碼病毒性抗凋亡基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。適宜的載體包括LSXN載體(Miller等，Biotechniques7,980-90,1989)。但是，可使用本領(lǐng)域已知的任意替代方法，例如電穿孔或細(xì)胞融合。有利的是，用于轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞的載體含允許選擇含該載體的細(xì)胞的選擇標(biāo)記。適宜的選擇標(biāo)記，例如賦予所轉(zhuǎn)染細(xì)胞抗生素抗性的酶，在本領(lǐng)域眾所周知。在轉(zhuǎn)染后，將細(xì)胞保持在含該選擇劑如抗生素的培養(yǎng)基中，并根據(jù)所述標(biāo)記的抗性進(jìn)行篩選?？墒褂贸Ｒ?guī)方法通過(guò)有限稀釋選擇和克隆細(xì)胞。可通過(guò)用誘導(dǎo)凋亡的物質(zhì)如環(huán)己酰亞胺(CHX)4兆戰(zhàn)細(xì)胞來(lái)檢驗(yàn)病毒抗凋亡基因增加細(xì)胞存活率的能力。不表達(dá)病毒性抗凋亡基因的細(xì)胞傾向于表現(xiàn)出顯著的凋亡發(fā)生，而表達(dá)所述基因的細(xì)胞表現(xiàn)出凋亡活性急劇降低。檢測(cè)凋亡的方法在本領(lǐng)域眾所周知，包括例如細(xì)胞表面FITC-膜聯(lián)蛋白V結(jié)合測(cè)定、DNA斷裂成梯測(cè)定和TUNEL測(cè)定。在選擇表達(dá)病毒抗凋亡基因的適宜細(xì)胞時(shí)，可用編碼選定的重組蛋白的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞。表達(dá)載體可為適于瞬時(shí)表達(dá)的載體，或者有利地可為含真核復(fù)制起點(diǎn)的游離型載體，或者可為允許表達(dá)盒穩(wěn)定整合以及隨后基因擴(kuò)增的可擴(kuò)增載體。適宜的載體在本領(lǐng)域眾所周知，包括例如pdHL2載體，該載體特別適于生產(chǎn)抗體和抗體片段。在使用可擴(kuò)增表達(dá)盒時(shí)，其有利地含選擇標(biāo)記，該選擇標(biāo)記與在逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中使用的選擇標(biāo)記不同，使得可以選擇轉(zhuǎn)染細(xì)胞?？稍僖淮瓮ㄟ^(guò)有限稀釋選擇適宜的轉(zhuǎn)染細(xì)胞并進(jìn)行克隆。在選擇適宜的克隆時(shí)，可將細(xì)胞置于適宜的培養(yǎng)基中并培養(yǎng)，以生產(chǎn)期望的目標(biāo)蛋白。所述培養(yǎng)基可包含血清，或優(yōu)選地可為無(wú)血清的。另外，還可以通過(guò)將一種或多種胱天蛋白酶抑制劑(例如胱天蛋白酶1或3)加入培養(yǎng)基中來(lái)增加細(xì)胞壽命和蛋白產(chǎn)量。優(yōu)選地，胱天蛋白酶抑制劑起抑制胱天蛋白酶3、胱天蛋白酶9和/或胱天蛋白酶12中的一種或多種的作用。有利地，使用透過(guò)細(xì)胞的胱天蛋白酶抑制劑，泛胱天蛋白酶抑制劑特別有利。適宜的抑制劑如Z-VAD-fmk和Ac-DEVD-cho(SEQIDNO:7)在本領(lǐng)域眾所周知?；蛘撸蛇M(jìn)一步轉(zhuǎn)染細(xì)胞系，以表達(dá)胱天蛋白酶抑制劑，例如Aven或XIAP，以通過(guò)影響凋亡增強(qiáng)其生長(zhǎng)特性。就此而言，細(xì)胞因子I型超家族的某些成員，如EPO,也可以通過(guò)具有抗凋亡作用和細(xì)胞保護(hù)作用增加細(xì)胞存活。上述方法產(chǎn)生的細(xì)胞系可用于以基本任意的期望基因轉(zhuǎn)染。但是，技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，所建立的組成型表達(dá)預(yù)期蛋白(尤其是重組蛋白)的細(xì)胞系隨后可用編碼病毒抗凋亡基因或Bcl-2家族抗凋亡基因的適宜載體轉(zhuǎn)染。參見以下的實(shí)施例2。目標(biāo)蛋白基本上可為能以可檢測(cè)量在宿主細(xì)胞中生產(chǎn)的任意蛋白。實(shí)例包括傳統(tǒng)的IgG型抗體、Fab'、Fab、F(ab')2或F(ab)2片段、scFv、雙抗體、IgG-scFv或Fab-scFv融合抗體、IgG-或Fab-肽毒素融合蛋白或疫苗[例如包括但不限于甲、乙或丙型肝炎；HIV、流感病毒、呼吸道合胞體病毒、乳頭瘤病毒、皰疹病毒、漢坦病毒、埃博拉病毒、輪狀病毒、巨細(xì)胞病毒、利什曼原蟲RNA病毒、SARS、瘧疾、結(jié)核(分枝桿菌)、炭疽、天花、兔熱病和www.vaccines.org中歹'J出的其它疫苗，它們整體在此引入作為參考]。本文描述的宿主細(xì)胞特別適于在如實(shí)施例1和2中所述的骨髓瘤細(xì)胞系中高效生產(chǎn)抗體和抗體片段，以及生產(chǎn)重組生長(zhǎng)因子(例如EPO、G-CSF、GM-CSF、EGF、VEGF、血小板生成素)、激素、白介素(例如IL-1至IL-31)、干擾素(例^口a、卩、y禾口復(fù)合干才尤素(consensusinterferon)和酶。這些方法可應(yīng)用于眾多用于生產(chǎn)重組蛋白的細(xì)胞系，包括其它骨髓瘤細(xì)胞系，例如鼠NSO或大鼠YB2/0;表皮細(xì)胞系，例如CHO和HEK293;間充質(zhì)細(xì)胞系，例如成纖維細(xì)胞系COS-l或COS-7;和神經(jīng)元細(xì)胞，例如^L網(wǎng)膜細(xì)胞，以及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞。在表達(dá)凋亡抑制劑的細(xì)胞中的重組抗體表達(dá)先前的工作已描述了在生產(chǎn)嵌合抗體的重組CHO細(xì)胞中共表達(dá)Bcl-2(—種天然凋亡抑制劑)的作用。(參見Tey等，Biotechnol.Bioeng.68:31-43(2000))。盡管觀察到細(xì)胞培養(yǎng)物壽命增加，但與無(wú)Bcl-2表達(dá)的等同細(xì)胞相比，抗體生產(chǎn)并未增加。但是，本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)，當(dāng)骨髓瘤細(xì)胞也表達(dá)Bcl-2時(shí)，該細(xì)胞的重組抗體產(chǎn)量顯著增力口。有利地，用編碼抗體或抗體片段的表達(dá)盒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染骨髓瘤細(xì)胞系。適宜的表達(dá)盒包含一個(gè)或多個(gè)控制抗體重鏈和輕鏈(就scFv而言為單鏈)表達(dá)的啟動(dòng)子連同如上所述的選擇標(biāo)記。特別有用的載體是含選擇標(biāo)記基因的pdHL2，其含有效連接(operativelylinked)至編碼選擇標(biāo)記酶的DNA序列的啟動(dòng)子；具有有效連接至編碼目標(biāo)蛋白的DNA序列的啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄單元；和在選擇標(biāo)記基因和轉(zhuǎn)錄單元之間的增強(qiáng)子元件，與沒有該第一個(gè)增強(qiáng)子的情況下選擇標(biāo)記基因和第一個(gè)轉(zhuǎn)錄單元這二者的轉(zhuǎn)錄相比，該增強(qiáng)子元件刺激選擇標(biāo)記基因和第一個(gè)轉(zhuǎn)錄單元這二者的轉(zhuǎn)錄。該載體還包含封閉元件，其由處于第一個(gè)增強(qiáng)子和選^^標(biāo)記基因之間的啟動(dòng)子組成，該元件潛在地可用于選擇性削弱選擇標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)錄刺激。可將Vh和Vt序列連接入pdHL2中，pdHL2是含人輕鏈恒定區(qū)、重鏈恒定區(qū)和可擴(kuò)增dhfr基因的序列(這些序列每個(gè)均由單獨(dú)的啟動(dòng)子控制)的可擴(kuò)增載體。參見Leung等，TumorTargeting2:184,(1996)和Losman等，Cancer80:2660-2667，(1997)。該載體可通過(guò)例如電穿孔轉(zhuǎn)染入細(xì)胞中?？赏ㄟ^(guò)將0.1pM或適宜濃度的氨甲蝶呤(MTX)加入到培養(yǎng)基中進(jìn)行選擇。擴(kuò)增可用一直到3^M或更高的漸增濃度的MTX以分步方式進(jìn)行。因此，可使用本領(lǐng)域眾所周知的方法獲得并表征用表達(dá)盒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染并組成型表達(dá)目標(biāo)抗體的細(xì)胞。另參見以下的實(shí)施例4。在選擇和克隆后，則可用編碼抗凋亡基因如Bcl-2的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染表達(dá)抗體的細(xì)胞系。例如，使用適宜的方法，例如電穿孔，將含融合至SV40啟動(dòng)子的Bcl-2基因的載體pZeoSV(Invitrogen，Carlsbad,Calif.)轉(zhuǎn)染入細(xì)胞中，必要時(shí)可進(jìn)行選擇和基因擴(kuò)增?；蛘?，適宜的宿主細(xì)胞可用凋亡抑制劑如突變型Bcl-2基因轉(zhuǎn)染，然后適應(yīng)在無(wú)血清培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，之后優(yōu)選在無(wú)血清培養(yǎng)基中用編碼期望的目標(biāo)蛋白的表達(dá)載體進(jìn)一步轉(zhuǎn)染?？扇缟鲜褂盟@細(xì)胞系進(jìn)行抗體生產(chǎn)，并與不表達(dá)凋亡抑制劑的細(xì)胞中的生產(chǎn)相比較。以下給出了闡述本發(fā)明的代表性實(shí)例。實(shí)施例l描述了將HPV-16E6/E7摻入Sp2/0細(xì)胞中產(chǎn)生改良的細(xì)胞克隆Sp-E26，其顯示出凋亡降低/延遲的特征。實(shí)施例2描述了一種通過(guò)單獨(dú)地過(guò)表達(dá)HPV-16E7元件改良宿主細(xì)胞系的方法。實(shí)施例3描述了使用Sp-E26作為宿主開發(fā)生產(chǎn)重組抗體的轉(zhuǎn)染體。實(shí)施例4描述了對(duì)共表達(dá)E6/E7元件的產(chǎn)抗體細(xì)胞系觀察到的增強(qiáng)的單克隆抗體生產(chǎn)。實(shí)施例5描述了改良型Sp2/0細(xì)胞系(稱為Sp-EEE)的產(chǎn)生和表征，該細(xì)胞系組成型表達(dá)具有3個(gè)點(diǎn)突變的突變型Bcl-2(Bcl-2-EEE)，導(dǎo)致壽命提升。實(shí)施例6描述了表達(dá)Bcl-2的產(chǎn)抗體細(xì)胞系的改良生長(zhǎng)特性。實(shí)施例7描述了對(duì)實(shí)施例6的Bcl-2表達(dá)細(xì)胞系觀察到的增強(qiáng)的單克隆抗體生產(chǎn)。實(shí)施例8描述了通過(guò)在細(xì)胞中導(dǎo)入Bcl-2表達(dá)改良生產(chǎn)低水平重組蛋白的細(xì)胞克隆的方法。實(shí)施例9描述了通過(guò)在細(xì)胞中導(dǎo)入Bcl-2表達(dá)改良Sp-E26的方法。實(shí)施例10描述了使用Sp-EEE作為宿主開發(fā)生產(chǎn)重組抗體的轉(zhuǎn)染體。實(shí)施例11描述了使用補(bǔ)料-分批反應(yīng)器模式和補(bǔ)料流程優(yōu)化得率。實(shí)施例12描述了能夠在無(wú)血清培養(yǎng)基中生長(zhǎng)以及轉(zhuǎn)染的Sp-EEE亞克隆的產(chǎn)生。盡管本文利用以一種或多種編碼本領(lǐng)域已知的抑制劑的基因轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系闡述了優(yōu)選實(shí)施方案，但技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到，在替代性實(shí)施方案中，可在要求保護(hù)的方法和組合物的范圍內(nèi)，在這些基因的編碼和/或非編碼序列中實(shí)施各種置換、缺失或插入，只要所編碼蛋白表現(xiàn)出與天然蛋白相同的生理功能(抗凋亡)。在某些實(shí)施方案中，所編碼蛋白可表現(xiàn)出與天然(野生型)蛋白80%或以上的序列同一性，更優(yōu)選85%或以上、更優(yōu)選90%或以上、更優(yōu)選95%或以上、更優(yōu)選98%或以上、更優(yōu)選99%或以上、最優(yōu)選99.5%或以上的序列同一性?？贵w多種實(shí)施方案可涉及由目標(biāo)轉(zhuǎn)染細(xì)胞系表達(dá)的抗體和/或抗體片段。術(shù)語(yǔ)"抗體"在本文用于指具有抗原結(jié)合區(qū)的任意抗體樣分子，并包括抗體片革殳，例如Fab'、Fab、F(ab，)2、單結(jié)構(gòu)域抗體(DAB)、Fv、scFv(單鏈Fv)等。制備和使用各種基于抗體的構(gòu)建物和片段的技術(shù)在本領(lǐng)域眾所周知。制備和表征抗體的方法在本領(lǐng)域也是眾所周知的(參見例^口HarloweandLane,1988，爿加^0<^'^:爿丄a6orafto/jA/"wwa/,ColdSpringHarborLaboratory),所使用的抗體還可以由各種各樣的已知來(lái)源經(jīng)商業(yè)渠道獲得。例如，各種各樣的分泌抗體的骨髓瘤細(xì)胞系可得自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC,Manassas,VA)?？垢鞣N疾病靶標(biāo)(包括但不限于腫瘤相關(guān)抗原)的大量抗體已保藏于ATCC，可用于要求保護(hù)的方法和組合物。(參見例如美國(guó)專利第7,060,802、7,056,509、7,049,060、7,045,132、7,041,803、7,041,802、7,041,293、7,038,018、7，037，498、7,012,133、7,001,598、6,998,468、6，994，976、6,994，852、6,989,241、6,974,863、6,965,018、6,964,854、6,962,981、6,962,813、6,956,107、6,951,924、6,949,244、6,946,129、6，943，020、6,939,547、6,921,645、6,921,645、6,921,533、6,919,433、6,919,078、6,916,475、6,905,681、6,899,879、6,893,625、6,887,468、6,887,466、6,884,594、6,881,405、6,878,812、6,875,580、6,872,568、6,867,006、6,864,062、6,861,511、6,861,227、6,861,226、6,838,282、6,835,549、6,835,370、6,824,780、6,824,778、6,812,206、6,793,924、8，783，758、6，770，450、6,767,711、6,764,681、6,764,679、6,743,898、6,733,981、6,730,307、6,720,15、6,716,966、6,709,653、6,693,176、6,692,908、6,689,607、6,689,362、6,689,355、6,682,737、6,682,736、6,682,734、6,673,344、6,652,852、6,635,482、6,630,144、6,610,833、6，610，294、6,605,441、6,605，279、6,596,852、6,592,868、6，576,745、6，572;856、6，566，076、6,562,618、6,545,130、6,544,749、6,534,058、6,528,625、6,528,269、6,521,227、6,518,404、6,511,665、6,491,915、6,488,930、6,482,598、6,482,408、6,479,247、6,468,531、6,468,529、6,465,173、6,461,823、6,458,356、6,455,044、6,455,040、6,451,310、6,444,206、6,441,143、6,432,404、6,432,402、6,419,928、6,413,726、6,406,694、6,403,770、6,403,091、6,395,274、6,383,759、6,383,484、6,376,654、6,372,215、6,359,126、6,355,481、6,355,444、6,355,245、6,355,244、6,346,246、6,344,198、6,340,571、6,340,459號(hào),每個(gè)專利有關(guān)分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞系和所述抗體或其片段的相關(guān)靶抗原的ATCC保藏號(hào)的內(nèi)容均在此引入作為參考)。這些僅僅是示例性的，多種其它分泌抗體的雜交瘤是本領(lǐng)域已知的。技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到，通過(guò)簡(jiǎn)單檢索ATCC、PubMed和/或USPTO數(shù)據(jù)庫(kù)中抗選定疾病相關(guān)目標(biāo)靶的抗體，可獲得抗幾乎任意疾病相關(guān)抗原的分泌抗體的雜交瘤。可使用本領(lǐng)域眾所周知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，將所克隆抗體的抗原結(jié)合域擴(kuò)增、切下、連接到表達(dá)載體中、轉(zhuǎn)化入已適應(yīng)的表達(dá)載體中以及用于蛋白生產(chǎn)。所要求保護(hù)的方法和/或組合物的某些實(shí)施方案可涉及抗體片段。生產(chǎn)抗體片段的示例性方法公開于美國(guó)專利第4,036,945號(hào)；美國(guó)專利第4,331,647號(hào)；Nisonoff等，1960，Arch.Biochem.Biophys.，89:230;Porter,1959，Biochem.J.,73:119;Edelman等，1967，METHODSINENZYMOLOGY,422頁(yè)(AcademicPress)以及Coligan等(編輯)，1991，CURRENTPROTOCOLSINIMMUNOLOGY,CJohnWiley&Sons)。還可以使用其它形成抗體片段的方法，例如分離重鏈以形成單價(jià)重鏈片段、進(jìn)一步切割片段或其它酶解、化學(xué)或遺傳技術(shù)，只要所述片段結(jié)合完整抗體所識(shí)別的抗原即可。例如，F(xiàn)v片段包含結(jié)合的Vh和Vt鏈。該結(jié)合可為非共價(jià)的，如在Inbar等，1972,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA,69:2659中所述?；蛘撸勺冩溈赏ㄟ^(guò)分子間二石危4建連接，或通過(guò)化學(xué)物質(zhì)如戊二醛交聯(lián)。參見Sandhu,1992，Crit.Rev.Biotech"12:437。優(yōu)選地，F(xiàn)v片段包含通過(guò)肽接頭連接的Vh和Vt鏈。這些單鏈抗原結(jié)合蛋白(sFv)通過(guò)構(gòu)建結(jié)構(gòu)基因而制備，所述結(jié)構(gòu)基因含編碼Vh和Vi結(jié)構(gòu)域的DNA序列，所述Vh和VJ吉構(gòu)域通過(guò)寡核苷酸接頭序列連接。將結(jié)構(gòu)基因插入表達(dá)載體中，隨后將表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞中。重組宿主細(xì)胞合成其中連接肽橋接兩個(gè)V結(jié)構(gòu)域的多肽單鏈。用于生產(chǎn)sFv的方法在本領(lǐng)域眾所周知。參見Whitlow等，1991,Methods:ACompaniontoMethodsinEnzymology2:97;Bird等，1988,Science,242:423;美國(guó)專利第4,946,778號(hào);Pack等,1993，Bio/Technology，11:1271,和Sandhu,1992，Crit.Rev.Biotech.，12:437。另一種形式的抗體片段是編碼單個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的肽。CDR肽("最小識(shí)別單位，，)可通過(guò)構(gòu)建編碼目標(biāo)抗體CDR的基因獲得。這些基因例如通過(guò)使用聚合,反應(yīng)由產(chǎn)抗體的細(xì)胞的RNA合成可變區(qū)而制備。參見Larrick等，1991，Methods:ACompaniontoMethodsinEnzymology2:106;Ritter等(編輯)，1995,MONOCLONALANTIBODIES:PRODUCTION,ENGINEERINGANDCLINICALAPPLICATION,166-179頁(yè)(CambridgeUniversityPress);Birch等，(編輯)，1995,MONOCLONALANTIBODIES:PRINCIPLESANDAPPLICATIONS,137-185頁(yè)(Wiley-Liss,Inc.)。在分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞系可公開獲得時(shí)，可獲得編碼抗原結(jié)合特異性的CDR序列，將其摻入到嵌合或人源化抗體中，并使用。嵌合^傳^7乂源化拔傳嵌合抗體是一種重組蛋白，其中人抗體的可變區(qū)已被例如小鼠抗體的可變區(qū)(包括小鼠抗體的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR))替代。嵌合抗體在施用給受試者時(shí)表現(xiàn)出降低的免疫原性和增加的穩(wěn)定性。構(gòu)建嵌合抗體的方法在本領(lǐng)域眾所周知(例如Leung等，1994,Hybridoma13:469)?？赏ㄟ^(guò)將小鼠CDR由小鼠免疫球蛋白的重鏈和輕鏈可變鏈轉(zhuǎn)移到人抗體的對(duì)應(yīng)可變區(qū)中，使嵌合單克隆抗體人源化。嵌合單克隆抗體中的小鼠構(gòu)架區(qū)(FR)也用人FR序列替代。為保留人源化單克隆抗體的穩(wěn)定性和抗原特異性，一個(gè)或多個(gè)人FR殘基可用小鼠的對(duì)應(yīng)殘基替代。人源化單克隆抗體可用于受試者的治療性治療。還可通過(guò)選定的CDR序列修飾增加人源化抗體對(duì)耙的親合性(WO0029584Al)。生產(chǎn)人源化單克隆抗體的技術(shù)在本領(lǐng)域眾所周知。(參見例如Jones等，1986，Nature,321:522;Riechmann等，Nature,1988,332:323;Verhoeyen等，1988，Science,239:1534;Carter等，1992,Pro"Nat'lAcad.Sci.USA,89:4285;Sandhu,Crit.Rev.Biotech"1992，12:437;Tempest等，1991,Biotechnology9:266;Singer等，J.Immunol.,1993,150:2844)。其它實(shí)施方案可涉及非人靈長(zhǎng)類抗體。用于在狒狒中產(chǎn)生治療上有用的抗體的通用技術(shù)可見于例如Goldenberg等，WO91/11465(1991)以及Losman等，Int.J.Cancer46:310(1990)。乂戎糸使用組合方法或用人免疫球蛋白基因座轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)全人抗體的方法是本領(lǐng)域已知的(例如Mancini等，2004,TVewM/cra&.o/.27:315-28;Conrad和Scheller，2005，Ow^.if/g/z77zrawg/7戸fSc匿".8:117-26;Brekke禾口Loset,2003,C群.O—.尸/zawaco/.3:544-50;這些文獻(xiàn)每個(gè)均在此引入作為參考)。預(yù)期這些全人抗體表現(xiàn)出甚至比嵌合抗體或人源化抗體更少的副作用，并如基本內(nèi)源的人抗體一樣在體內(nèi)起作用。在某些實(shí)施方案中，要求保護(hù)的方法和步驟可使用通過(guò)這些技術(shù)產(chǎn)生的人抗體。在一個(gè)替代方法中，可使用噬菌體展示技術(shù)產(chǎn)生人抗體(例如Dantas-Barbosa等，2005,Mo/,4:126-40,該文獻(xiàn)在此引入作為參考)。人抗體可由正常人或表現(xiàn)出特定病癥如癌癥的人產(chǎn)生(Dantas-Barbosa等，2005)。由患病個(gè)體構(gòu)建人抗體的優(yōu)勢(shì)在于，循環(huán)抗體庫(kù)可偏向于抗疾病相關(guān)抗原的抗體。在該方法的一個(gè)非限制性實(shí)例中，Dantas-Barbosa等(2005)由骨肉瘤患者構(gòu)建了人Fab抗體片段的噬菌體展示文庫(kù)。一般來(lái)說(shuō)，由循環(huán)血淋巴細(xì)胞獲得總RNA(同前)。由p、y和K鏈抗體庫(kù)克隆重組Fab，并插入到噬菌體展示文庫(kù)中(同前)。將RNA轉(zhuǎn)變?yōu)閏DNA,并使用針對(duì)重鏈和輕鏈免疫球蛋白序列的特異性引物制備FabcDNA文庫(kù)(Marks等，1991,JMo/.艦222:581-97，該文獻(xiàn)在此引入作為參考)。按照Andris-Widhopf等(2000，載于P/zageD&;7/a;;Z^60rato7M<3wwa/，Barbas等(編輯)，第1版,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY9.1至9.22頁(yè)，該文獻(xiàn)在此引入作為參考)進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建。用限制性內(nèi)切核酸酶消化最終的Fab片段，并插入到噬菌體基因組中，以制備噬菌體展示文庫(kù)。這些文庫(kù)可通過(guò)本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)噬菌體展示方法篩選。技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，該技術(shù)僅是示例性的，通過(guò)噬菌體展示制備和篩選人抗體或抗體片段的任何已知方法都可使用。在另一個(gè)替代方法中，可使用標(biāo)準(zhǔn)免疫方案，用已經(jīng)過(guò)遺傳工程以生產(chǎn)人抗體的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，產(chǎn)生基本抗任意免疫原性靶的抗體。這類系統(tǒng)的一個(gè)非限制性實(shí)例是得自Abgenix(Fremont,CA)的XenoMouse(例如Green等，1999,//國(guó)wwo/.MeAoA231:11-23,該文獻(xiàn)在此引入作為參考)。在XenoMouse⑧和類似的動(dòng)物中，小鼠抗體基因已被失活，由功能性人抗體基因替代，而小鼠免疫系統(tǒng)的余下部分保持完整。用含人IgH和IgK基因座部分的種系配置(germline-configured)的YAC(酵母人工染色體)轉(zhuǎn)化XenoMouse,所述基因座部分含大部分可變區(qū)序列連同輔助基因和調(diào)節(jié)序列。人可變區(qū)庫(kù)可用于獲得產(chǎn)抗體的B細(xì)胞，所述B細(xì)胞可通過(guò)已知技術(shù)被加工為雜交瘤。經(jīng)過(guò)靶抗原免疫的XenoMouse⑧將通過(guò)正常的免疫應(yīng)答產(chǎn)生人抗體，所述抗體可通過(guò)以上論述的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)收集和/或生產(chǎn)。可得到多種XenoMouse⑧品系，其中每種都能夠生產(chǎn)不同種類的抗體。這些人抗體可通過(guò)化學(xué)交聯(lián)或其它已知方法偶聯(lián)至其它分子。業(yè)已表明，轉(zhuǎn)基因生產(chǎn)的人抗體具有治療潛力，同時(shí)保留正常人抗體的藥代動(dòng)力學(xué)特性(Green等，1999)。技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，要求保護(hù)的組合物和方法并不限于使用XenoMouse系統(tǒng)，而是可利用已經(jīng)過(guò)遺傳工程以生產(chǎn)人抗體的任意轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。實(shí)施例實(shí)施例1.通過(guò)穩(wěn)定表達(dá)HPV-16E6和E7基因產(chǎn)生抗凋亡的細(xì)胞克隆戎C/漢^理^敘應(yīng)乂發(fā)^遂舉用含HPV-16E6和E7基因之表達(dá)盒的LXSN逆轉(zhuǎn)錄病毒載體以10:1的MOI(感染復(fù)數(shù))轉(zhuǎn)導(dǎo)Sp2/0細(xì)胞。復(fù)蘇24小時(shí)后，在G418(1000iug/ml)中達(dá)10天選擇經(jīng)感染的細(xì)胞。通過(guò)有限稀釋(0.5個(gè)細(xì)胞/孔)將G418-抗性細(xì)胞在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上克隆。篩選抗環(huán)己酰亞胺(CHX)(—種有效的凋亡誘導(dǎo)劑)處理的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染體。簡(jiǎn)單地講，將健康細(xì)胞(存活率〉95%，圖1C和D)在含25嗎/mlCHX的培養(yǎng)基中溫育，在顯微鏡下檢查細(xì)胞形態(tài)。盡管50。/。以上的親代Sp2/0細(xì)胞在溫育2-3小時(shí)后經(jīng)歷形態(tài)改變并變成片段化的(圖1A)，但幾個(gè)E6/E7轉(zhuǎn)染克隆顯示出較低程度的形態(tài)改變，表明抗凋亡。最好的克隆稱為Sp-E26,在處理4小時(shí)時(shí)未表現(xiàn)出明顯形態(tài)改變(圖1B)。為避免冗長(zhǎng)的目視檢查，使用MTT測(cè)定評(píng)價(jià)存活細(xì)胞群的改變。在健康細(xì)胞于正常培養(yǎng)條件下與CHX或不與CHX溫育2-3小時(shí)后，向各孔加入MTT染料。在又溫育2小時(shí)后，通過(guò)加入含SDS和HC1的裂解緩沖液溶解細(xì)胞。于37。C過(guò)夜溫育平板，使用ELISA讀板器于590nm進(jìn)行OD讀數(shù)。如圖2所示，當(dāng)用CHX處理Sp2/0細(xì)胞時(shí)，存活細(xì)胞群顯著減少。相比之下，在相同處理?xiàng)l件(CHX濃度和時(shí)間長(zhǎng)度)下，Sp-E26細(xì)胞更好地耐受CHX處理。采用此方法，可篩選大量克隆，并選擇用于進(jìn)一步的分析(圖2)。S/-認(rèn)順源亡脊/4通過(guò)膜聯(lián)蛋白V染色和DNA片段化測(cè)定，評(píng)價(jià)Sp-E26和親代Sp2/0細(xì)胞中CHX-誘導(dǎo)的凋亡。在含25嗎/mlCHX的培養(yǎng)基中溫育后，收獲細(xì)胞，并用Guava微管連接蛋白試劑染色(等同于膜聯(lián)蛋白V染色)，在Guava個(gè)人細(xì)胞分析系統(tǒng)(GuavaPersonalAnalysissystem,GuavaTechnologies,Inc.)中分析。圖3表明，盡管超過(guò)30%的Sp2/0細(xì)胞在接觸CHX處理約1.5小時(shí)時(shí)變成膜聯(lián)蛋白V陽(yáng)性的，指示凋亡，但Sp-E26保持健康，沒有顯示出早期凋亡細(xì)胞增加。可通過(guò)分析胞內(nèi)寡核小體DNA片段(一種凋亡標(biāo)志)的形成揭示出CHX誘導(dǎo)凋亡。由經(jīng)CHX-處理和未處理的Sp-E26和Sp2/0細(xì)胞中提取細(xì)胞DNA，并進(jìn)行DNA斷裂成梯測(cè)定。在用CHX處理的Sp2/0細(xì)胞中，檢測(cè)到廣泛的DNA片段化(圖4)，相比之下，在相同的處理?xiàng)l件下，Sp-E26的基因組DNA仍是完整的，表明未出現(xiàn)DNA片段化(圖4)。勿/g哞/7/T五6一￡7差^^存^/#兆為證實(shí)E6和E7基因穩(wěn)定存在于Sp-E26細(xì)胞的基因組中，設(shè)計(jì)對(duì)E6和E7基因特異性的寡核苷酸引物，并用于PCR反應(yīng)，該P(yáng)CR反應(yīng)用由Sp-E26提取的基因組DNA作為模板，產(chǎn)生約700bp的DNA片段?？寺CR產(chǎn)物，通過(guò)DNA測(cè)序證實(shí)為E6和E7基因。在親代Sp2/0細(xì)胞中未4企測(cè)到E6和E7基因。在T-培養(yǎng)瓶(圖5)和3L-分批處理生物反應(yīng)器(圖6)中評(píng)價(jià)Sp-E26的生長(zhǎng)特性。在分批培養(yǎng)物中Sp-E26顯示出超越親代Sp2/0細(xì)胞的改良生長(zhǎng)特性，達(dá)到更高的最大細(xì)胞密度和更長(zhǎng)的存活時(shí)間。實(shí)施例2.通過(guò)穩(wěn)定過(guò)表達(dá)HPV16E7基因產(chǎn)生抗凋亡的細(xì)胞克隆通過(guò)使用引物對(duì)E6-N8+(ATGTTTCAGGACCCACAGGAGCGA;SEQIDNO:8)和E7-C8-(TTATGGTTTCTGAGAACAGATGGG;SEQIDNO:9)的PCR和DNA測(cè)序，分析整合入克隆Sp-E26基因組中的多順反子HPV16E6和E7基因的結(jié)構(gòu)。因?yàn)橐顴6-N8+和E7-C8—的序列分別匹配E6的N-末端8個(gè)氨基酸的編碼序列和E7的C-末端8個(gè)密碼子的互補(bǔ)序列，所以預(yù)期全長(zhǎng)E6和E7的擴(kuò)增子為約850bp。但是，用E6-N8+和E7-C8-擴(kuò)增由Sp-E26細(xì)胞制備的基因組DNA,產(chǎn)生僅約700bp的PCR片段。對(duì)700bpPCR產(chǎn)物的DNA測(cè)序揭示，E6基因缺失了一個(gè)182個(gè)多核苷酸片段。缺陷型E6基因可能因剪接產(chǎn)生，編碼具有N-末端43個(gè)氨基酸殘基的截短型E6肽。鑒于E6產(chǎn)生的主要生理活性是其下調(diào)p53表達(dá)的能力，故截短型E6蛋白可能不是全功能的，因?yàn)榘l(fā)現(xiàn)Sp-E26中的p53表達(dá)水平比Sp2/0中的p53表達(dá)水平更穩(wěn)定。因此，為評(píng)價(jià)單獨(dú)的HPV-16E7基因克隆是否足以具有抗凋亡作用和改善Sp2/0細(xì)胞的生長(zhǎng)特性，如下用HPV-16E7進(jìn)行Sp2/0細(xì)胞的轉(zhuǎn)染(i)通過(guò)RT-PCR由Sp-E26細(xì)胞克隆編碼E7的DNA序列。導(dǎo)入適當(dāng)?shù)南拗莆稽c(diǎn)，以利于將該基因連接入哺乳動(dòng)物表達(dá)載體pRc/CMV(Invitrogen)中。該載體中稱為E7pRc的病毒基因的轉(zhuǎn)錄由CMV啟動(dòng)子-增強(qiáng)子序列引導(dǎo)。該載體還包含賦予新霉素抗性的基因，該基因由SV40啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄。(ii)用含HPV-16E7基因表達(dá)盒的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染Sp2/0細(xì)胞。簡(jiǎn)單地講，用Scal使5iugE7pRc線性化，并通過(guò)電穿孔轉(zhuǎn)染入細(xì)胞中。(iii)在復(fù)蘇24小時(shí)后，在G418(1000嗎/ml)中達(dá)10天選擇轉(zhuǎn)染的細(xì)月包。(iv)然后通過(guò)有限稀釋(0.5個(gè)細(xì)胞/孔)將G418-抗性細(xì)胞在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中克隆。選擇并篩選抗環(huán)己酰亞胺(CHX)(—種有效的凋亡誘導(dǎo)劑)處理的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染體。(v)將健康細(xì)胞(存活率〉95。/。)在正常培養(yǎng)條件下于含25pg/mlCHX或沒有CHX的培養(yǎng)基中溫育3-4小時(shí)，接著將MTT染料加入各孔。在又溫育2小時(shí)后，通過(guò)加入含SDS和HC1的裂解緩沖液溶解細(xì)月包。于37°C過(guò)夜溫育板，使用ELISA讀板器于590nm進(jìn)行OD讀取。選擇顯示抗CHX處理的細(xì)胞克隆并擴(kuò)增，用于進(jìn)一步的分析。(vi)通過(guò)膜聯(lián)蛋白V染色和DNA片段化測(cè)定，評(píng)價(jià)E7轉(zhuǎn)染細(xì)胞的抗凋亡特性。在膜聯(lián)蛋白V測(cè)定中，在含25ng/mlCHX的培養(yǎng)基中溫育后，收獲細(xì)胞，用Guava微管連接蛋白試劑(等同于膜聯(lián)蛋白V染色)染色，并用Guava個(gè)人細(xì)胞分析系統(tǒng)(GuavaTechnologies,Inc.)分析。在DNA片段化測(cè)定中，由經(jīng)CHX處理和未處理的E7-轉(zhuǎn)染體和Sp2/0細(xì)胞提取細(xì)胞DNA,并用瓊脂糖凝膠電泳分析。(vii)通過(guò)DNA印跡(基因組水平)、RNA印跡(mRNA水平)和免疫印跡(蛋白質(zhì)水平)分析，評(píng)價(jià)E7-轉(zhuǎn)染體中所述病毒癌基因的表達(dá)。通過(guò)免疫印跡分析，^r查參與凋亡過(guò)程并受E7蛋白影響的胞內(nèi)蛋白的表達(dá)。(viii)在T-培養(yǎng)瓶和3L-分批處理生物反應(yīng)器中評(píng)價(jià)選定E7-轉(zhuǎn)染體的生長(zhǎng)特性。在分批培養(yǎng)中顯示出超越親代Sp2/0細(xì)胞的改良生長(zhǎng)特性(即達(dá)到更高的最大細(xì)胞密度和更長(zhǎng)的存活時(shí)間)的轉(zhuǎn)染體被看作是較好的宿主細(xì)胞。實(shí)施例3.hLL2IgG在Sp-E26中的高水平表達(dá)在該實(shí)施例中，Sp-E26用作宿主，以獲得產(chǎn)hLL2(—種開發(fā)用于治療NHL和自身免疫病患者的人源化抗CD22抗體)的細(xì)胞克隆。先前已通過(guò)使用Sp2/0細(xì)胞作為宿主得到產(chǎn)hLL2的克隆87-2-C9(Losman等，Cancer80,2660-2666,1997)，在該案例中，在轉(zhuǎn)染后僅鑒別出一個(gè)陽(yáng)性克隆(頻率約2.5x10—7)，最大生產(chǎn)率(Pmax)為1.4mg/L，所述最大生產(chǎn)率定義為擴(kuò)增前在T-培養(yǎng)瓶的條件終末培養(yǎng)基中僅產(chǎn)hLL2的克隆的抗體濃度。用相同的hLL2pdHL2載體并通過(guò)使用與Losman等(Cancer80,2660-2666,1997)所述相似的方法轉(zhuǎn)染Sp-E26細(xì)胞，產(chǎn)生了超過(guò)200個(gè)穩(wěn)定產(chǎn)hLL2的克隆，頻率>10—4。評(píng)價(jià)了12個(gè)隨機(jī)選擇的克隆的Pmax，發(fā)現(xiàn)介于13-170mg/L之間，平均值為50mg/L?？赏ㄟ^(guò)用MTX進(jìn)行基因擴(kuò)增進(jìn)一步增強(qiáng)這些克隆的生產(chǎn)率。該實(shí)施例表明，使用Sp-E26作為開發(fā)生產(chǎn)重組蛋白的細(xì)胞克隆的宿主優(yōu)于其親代Sp2/0細(xì)胞。實(shí)施例4.通過(guò)穩(wěn)定表達(dá)HPV16E6和E7基因改良產(chǎn)抗體的細(xì)胞系607-3u-8細(xì)胞最初通過(guò)轉(zhuǎn)染由Sp2/0產(chǎn)生，以產(chǎn)生人源化單克隆抗體。通過(guò)基因擴(kuò)增(用MTX)開發(fā)了該克隆，并經(jīng)亞克隆，以將最大(抗體)生產(chǎn)率增強(qiáng)高達(dá)150mg/L，其在去掉(weanedoff)培養(yǎng)基中的血清補(bǔ)加物后降低至約100mg/L。為獲得在無(wú)血清條件下的更高抗體生產(chǎn)率，將HPV-16的E6/E7基因?qū)?07-3u-8中，并如下評(píng)價(jià)E6/E7對(duì)抗體生產(chǎn)率的作用。用含HPV-16E6和E7基因表達(dá)盒的LXSN逆轉(zhuǎn)錄病毒載體以10:1的MOI轉(zhuǎn)導(dǎo)保持在補(bǔ)加10%FBS和3|iiMMTX的HSFM中的607-3u-8細(xì)胞。在復(fù)蘇24小時(shí)后，在G418(400|iig/ml)中達(dá)10天選擇穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。通過(guò)有限稀釋(0.5個(gè)細(xì)胞/孔)將G418-抗性細(xì)胞在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中亞克隆。獲得稱為607E1C12的存活克隆以進(jìn)行評(píng)價(jià)。還選擇了未用E6/E7轉(zhuǎn)染的607-3u-8的兩個(gè)亞克隆，稱為607-3u-8-7G7和607-3u-8-2D10。測(cè)定這3個(gè)克隆的Pmax，沒有顯著差異(表1)。這些結(jié)果提示，將E6/E7基因?qū)爰?xì)胞中不改變細(xì)胞產(chǎn)抗體的能力。接著，使607E1C12、607-3u-8-7G7和607-3u-8-2D10適應(yīng)在無(wú)血清培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，并測(cè)定這些克隆的生產(chǎn)率。所有細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)基中都生長(zhǎng)良好?？寺?07E1C12的最終抗體生產(chǎn)率保持在150mg/L，而兩個(gè)無(wú)E6/E7的克隆顯著下降少。另外，607E1C12在冷凍(用于冷凍保存)和融解循環(huán)后的生產(chǎn)率穩(wěn)定(表1)。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>a通過(guò)由終末培養(yǎng)物上清液進(jìn)行IgG蛋白純化而測(cè)定。"~b括號(hào)中的數(shù)字指示樣本量。e細(xì)胞已被冷凍用于冷凍保存。實(shí)施例5.組成型表達(dá)突變Bcl-2的遺傳改良型Sp2/0細(xì)胞系的產(chǎn)生和表征證據(jù)表明,具有3個(gè)點(diǎn)突變(T69E、S70E和S87E)的突變體Bcl-2表現(xiàn)出顯著高于野生型或單點(diǎn)突變體的抗凋亡活性(Deng等，PNAS101:153-158,2004)。因此，構(gòu)建用于該三重突變體(稱為Bcl-2-EEE)的表達(dá)載體，并用于轉(zhuǎn)染Sp2/0細(xì)胞，以便增加存活率和生產(chǎn)率，尤其是在生物反應(yīng)器中。分離克隆，并評(píng)價(jià)其Bel-2-EEE表達(dá)水平、生長(zhǎng)和凋亡特性。Bcl-2-EEE的核酸序列如SEQIDNO.3所示；Bcl-2-EEE蛋白的對(duì)應(yīng)氨基酸序列如SEQIDNO.4所示?；谌薆cl-2的氨基酸殘基64-101的編碼序列設(shè)計(jì)116bp的合成DNA雙鏈體。殘基69、70和87的密碼子全部改變?yōu)楣劝彼岬拿艽a子(E)。完整序列格外地富含GC,具有眾多聚G和聚C串(polyCmn)。對(duì)幾個(gè)密碼子進(jìn)行保守改變，以打破G和C串，降低整體GC含量。合成了兩種80-聚體寡核苦酸，它們組合在一起覆蓋116bp的序列，在它們的3'末端具有22bp的重疊(參見SEQIDNO.5和6)。使所述寡核苦酸退火，通過(guò)用Taq聚合酶進(jìn)行引物延伸產(chǎn)生雙鏈DNA。使用PCR引物Bcl-2-EEEPCRLeft(TATATGGACCCGGTCGCCAGAGAAG;SEQIDNO:10)和Bcl-2-EEEPCRRight(TTAATCGCCGGCCTGGCGGAGGGTC;SEQIDNO:ll)擴(kuò)增雙鏈體。然后將126bp的擴(kuò)增體克隆入pGemTPCR克隆載體中。用Tthl和NgoMI限制性內(nèi)切核酸酶消化Bcl-2-EEE-pGemT構(gòu)建物，凝膠分離105bp的片段，并與經(jīng)Tthl和NgoMI消化的hBcl-2-pucl9載體(ATCC79804)連接，產(chǎn)生hBcl-2(EEE)-puc19。證實(shí)了該構(gòu)建物的序列。用EcoRI由hBcl-2(EEE)-puc19切下948bp的插入片,殳，并與經(jīng)EcoRI消化并用堿性磷酸酶處理的pZeoSV2+載體連接。獲得的構(gòu)建物為hBcl-2(EEE)-pZeoSV2+。然后按照用于Sp2/0細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)方法，用60嗎hBcl-2(EEE)-pZeoSV2+通過(guò)電穿孔轉(zhuǎn)染Sp2/0細(xì)胞(5.6x106)。將細(xì)胞鋪板入6塊96孔板中，在無(wú)選擇壓力的情況下溫育48小時(shí)。2天后，向培養(yǎng)基加入訓(xùn)jig/mlzeocin。將40個(gè)孔的細(xì)胞擴(kuò)增至24孔板，通過(guò)采用抗hBcl-2和抗(3肌動(dòng)蛋白的蛋白質(zhì)印跡來(lái)分析。40個(gè)當(dāng)中除5個(gè)以外全部顯示出中至高水平的Bcl-2-EEE表達(dá)。圖7顯示了4個(gè)凝膠之一的結(jié)果。先前用野生型Bcl-2轉(zhuǎn)染的來(lái)源于Sp2/0的hMN14細(xì)胞系(克隆664.B4)用作陽(yáng)性對(duì)照(+)。如Deng等所證實(shí)，Bcl-2-EEE在SDS-PAGE中的遷移稍微慢于野生型Bcl-2。選擇3個(gè)強(qiáng)陽(yáng)性孔(#7、#25和#87)，用于進(jìn)一步評(píng)價(jià)和亞克隆。有限稀釋鋪板導(dǎo)致每塊96孔板少于20個(gè)陽(yáng)性孔，表明各個(gè)孔中的細(xì)胞實(shí)際上被克隆的可能性非常高(>99%)。起初，使用抗hBcl-2-PE通過(guò)GuavaExpress分析來(lái)自3個(gè)原始孔的23個(gè)亞克隆(圖8)。結(jié)果證實(shí)，原始孔含混合的細(xì)胞克隆。釘孔產(chǎn)生的克隆具有最強(qiáng)的信號(hào)，#25孔具有最低的信號(hào)。擴(kuò)增克隆7-12、7-16、87-2和87-10用于進(jìn)一步的分析。隨后，類似地分析某些初始較慢生長(zhǎng)的亞克隆，一個(gè)克隆87-29產(chǎn)生的信號(hào)比任意其它克隆高20%,擴(kuò)增該克隆用于進(jìn)一步的分析。將兩個(gè)高表達(dá)SP-EEE克隆(87-29和7-16)與未轉(zhuǎn)染的Sp2/0、Raji和Daudi細(xì)胞相對(duì)比(圖9)。Sp-EEE克隆表達(dá)約為Raji和Daudi細(xì)胞的20倍高，已知Raji和Daudi細(xì)胞均以估計(jì)正常的細(xì)胞水平表達(dá)Bcl-2。Sp2/0細(xì)胞為陰性。這一點(diǎn)由抗Bcl-2免疫印跡進(jìn)一步得到證實(shí)(圖10)。即便用高蛋白負(fù)載(50K細(xì)胞)和長(zhǎng)曝光X-射線膠片以人Bcl-2特異性抗體在Sp2/0細(xì)胞中也未檢測(cè)到Bcl-2。用識(shí)別小鼠、大鼠和人Bcl-2的抗Bcl-2單克隆抗體(C-2，SantaCruzBiotech)進(jìn)行免疫印跡分析，由未轉(zhuǎn)染的Sp2/0細(xì)胞未檢測(cè)到任何Bcl-2，即便用高蛋白負(fù)載(100K細(xì)胞)和長(zhǎng)曝光時(shí)間也是如此(圖IOB)。即便在Sp2/0細(xì)胞中有任何Bcl-2表達(dá)，其表達(dá)水平也比克隆87-29中的Bcl-2-EEE低超過(guò)2個(gè)數(shù)量級(jí)。[OIOO]比較5個(gè)Sp-EEE亞克隆和Sp2/0細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。3個(gè)Sp-EEE亞克隆表現(xiàn)出超越Sp2/0細(xì)胞的明顯優(yōu)勢(shì)。這3個(gè)克隆(7-12、7-16和87-29)還表達(dá)最高水平的Bcl-2隱EEE。由于7-12和7-16來(lái)自同一原始孔，并具有幾乎相同的特性(Bcl-2-EEE水平和生長(zhǎng)曲線)，所以它們可能源于同一初始克隆。最好的兩個(gè)SP-EEE亞克隆7-16和87-29用于進(jìn)一步的評(píng)價(jià)。將克隆接種在補(bǔ)加10%、1%或0。/。血清(未斷血清(withoutweaning))的培養(yǎng)基中，監(jiān)測(cè)細(xì)胞密度和存活率。在10。/。血清中，87-29生長(zhǎng)至高密度，與Sp2/0細(xì)胞相比存活增加超過(guò)4天(圖11)。在1%血清中，所有細(xì)胞都生長(zhǎng)至在10%血清中所獲密度的約35-40%，Bcl-2-EEE轉(zhuǎn)染體具有相似的超越Sp2/0的存活優(yōu)勢(shì)(圖12)。當(dāng)直接轉(zhuǎn)移入無(wú)血清培養(yǎng)基中時(shí)，Sp2/0細(xì)胞僅生長(zhǎng)至600K細(xì)胞/ml，而87-29細(xì)胞生長(zhǎng)至2倍高的密度(圖13)。在每個(gè)血清濃度，87-29細(xì)胞都比Sp2/0細(xì)胞多存活4-6天。測(cè)定87-29的氨甲蝶呤(MTX)敏感性(圖14)。數(shù)據(jù)提示，0.04pM的最低MTX濃度足以進(jìn)行MTX抗性克隆的初始選擇。因此，用于Sp2/0細(xì)胞的相同選擇和擴(kuò)增方案可用于SP-EEE細(xì)胞。Bcl-2是一種促存活/抗凋亡蛋白。已有幾個(gè)小組證明，失去柔性環(huán)結(jié)構(gòu)域(FLD)的Bcl-2缺失突變體具有增強(qiáng)的抑制凋亡的能力(Figueroa等,2001,BiotechnologyandBioengineering,73，211-222;Chang等，1997,EMBOJ.,16，968-977)。更近一些，已表明在Bcl-2的FLD中模擬磷酸化的1-3個(gè)S/T殘基向谷氨酸的突變，顯著增強(qiáng)其抗凋亡能力(Deng等2004,PNAS，101,153-158)。三重突變體(T69E、S70E和S87E)提供了最顯著的存活增強(qiáng)。在此，使用相似的Bcl-2三重突變構(gòu)建物(Bcl-2-EEE)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Sp2/0細(xì)胞。所有前述實(shí)驗(yàn)都表明，Bcl-2-EEE的表達(dá)降低了Sp2/0細(xì)胞中的凋亡速率。該作用很大程度上是劑量依賴性的，因?yàn)榫哂休^高表達(dá)水平的克隆比那些具有較低水平的克隆存活得更長(zhǎng)。與未轉(zhuǎn)染的Sp2/0細(xì)胞相比,最好的克隆87-29生長(zhǎng)至高15-20%的細(xì)胞密度，并多存活4-6天?？寺?87-29)中的Bcl-2-EEE水平是Daudi或Raji細(xì)胞中的正常水平的約20倍。在未轉(zhuǎn)染的Sp2/0細(xì)胞中未檢測(cè)到Bcl-2表達(dá)。如在實(shí)施例6中所述，用表達(dá)野生型Bcl-2用的相似構(gòu)建物轉(zhuǎn)染表達(dá)hMN-14的Sp2/0細(xì)胞，并分離出具有優(yōu)良生長(zhǎng)特性和增強(qiáng)的生產(chǎn)率的克隆。當(dāng)用MTX進(jìn)一步擴(kuò)增該克隆(664.B4)時(shí)，Bcl-2水平顯著增加。最后，對(duì)擴(kuò)增的(3MTX)細(xì)胞系進(jìn)行亞克隆，1個(gè)克隆(664.B4.1C1)的Bcl-2水平是664.B4的2倍。該特定亞克隆具有優(yōu)越的生產(chǎn)率和生長(zhǎng)特性。87-29中的Bcl-2-EEE水平是所擴(kuò)增的664.B4.1C1中的Bcl-2水平的約2倍。87-29細(xì)胞具有的生長(zhǎng)速率與Sp2/0細(xì)胞的生長(zhǎng)速率相當(dāng)，可明顯地再繼續(xù)生長(zhǎng)1天，所達(dá)到的最大密度比Sp2/0高15-20%。對(duì)表達(dá)E6/E7的Sp-E26細(xì)胞系觀察到相似的特性。表達(dá)Bcl-2-EEE的87-29克隆提供了比親代Sp2/0細(xì)胞多4-6天的存活，優(yōu)于Sp-E26克隆，Sp-E26克隆僅多存活1天。由87-29克隆代表的Sp-EEE細(xì)胞系可用作抗凋亡宿主，用于在用含重組蛋白基因的適宜載體轉(zhuǎn)染時(shí)表達(dá)該重組蛋白。為了使該細(xì)胞系可用，必須在轉(zhuǎn)染和擴(kuò)增后以及在延長(zhǎng)的培養(yǎng)當(dāng)中保持其Bcl-2-EEE表達(dá)和存活優(yōu)勢(shì)。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的Bcl-2-EEE基因不大可能會(huì)在隨后的轉(zhuǎn)染當(dāng)中失去，因此存活特性應(yīng)不會(huì)減小。MTX擴(kuò)增甚至有可能通過(guò)增加Bcl-2蛋白表達(dá)改善生產(chǎn)克隆的存活。實(shí)際上，用野生型Bcl-2轉(zhuǎn)染的hMN-14664.B4細(xì)胞系就是這種情況。在擴(kuò)增和亞克隆后，Bcl-2水平增加幾倍，細(xì)胞存活顯著改善。最終的Sp/EEE克隆(#87-29)具有與親代Sp2/0細(xì)胞相當(dāng)?shù)纳L(zhǎng)速率。但是，與Sp2/0相比，Sp/EEE87-29細(xì)胞再繼續(xù)生長(zhǎng)1天，達(dá)到高15-20%的最大密度,表現(xiàn)出多4-6天的存活。此外，Sp/EEE細(xì)胞系與Sp2/0細(xì)胞相比相當(dāng)程度地更耐受血清除盡。實(shí)施例6.通過(guò)穩(wěn)定表達(dá)人Bcl-2基因改善穩(wěn)定期分批培養(yǎng)物中產(chǎn)抗體細(xì)胞的存活#染順贏絲_/^細(xì)胞克隆665.2B9最初通過(guò)轉(zhuǎn)染由Sp2/0產(chǎn)生，以生產(chǎn)人源化單克隆抗-CEA抗體(Qu等，未公開的結(jié)果)。使用稱為hMN14pdHL2的載體轉(zhuǎn)染Sp2/0細(xì)胞，獲得細(xì)胞克隆665.2B9。pdHL2載體首先由Gillies等描述，具有可擴(kuò)增的鼠dhfr基因，該基因使得可以通過(guò)氨曱蝶呤處理進(jìn)行隨后的選擇和擴(kuò)增(Gillies等，J.Immunol.Methods125:191(1989))。一般來(lái)說(shuō)，pdHL2載體提供了IgG重鏈和輕鏈基因這二者的表達(dá)，所述IgG重鏈和輕鏈基因獨(dú)立地受控于兩個(gè)金屬硫蛋白啟動(dòng)子和IgH增強(qiáng)子。hMN14pdHL2載體的圖譜示于圖16。SEQIDNO.1顯示了所述載體的序列；SEQIDNO.2顯示了定義為增強(qiáng)子序列的72bp序列；啟動(dòng)子序列對(duì)應(yīng)于hMN14pdHL2的核苷酸2908-2979。Sp2/0細(xì)胞一^L可通過(guò)用線性化pdHL2載體(如在本實(shí)例中使用的hMN14pdHL2載體)電穿孔轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)可通過(guò)將細(xì)胞與含0.05-0.1|iMMTX的培養(yǎng)基溫育進(jìn)行選擇。通過(guò)逐步增加MTX濃度至5)LiM實(shí)現(xiàn)所插入抗體序列的擴(kuò)增。用逐步增加至0.3|LiM的MTX對(duì)克隆進(jìn)行基因擴(kuò)增，此時(shí)抗體的最大生產(chǎn)率(Pmax)增加至約100mg/L。為改善細(xì)胞生長(zhǎng)特性，用含人Bcl-2基因的質(zhì)粒表達(dá)載體(圖17)通過(guò)電穿孔轉(zhuǎn)染665.2B9細(xì)胞。使用EcoRI位點(diǎn)由購(gòu)自ATCC的pB4質(zhì)粒(pB4，目錄號(hào)#79804)切下Bcl-2基因，并使用相同的限制酶插入哺乳動(dòng)物表達(dá)載體pZeoSV(+)的MCS中。因?yàn)閦eocin抗性基因是所述載體的一部分，所以將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞置于含50-300嗎/mLzeocin的培養(yǎng)基中。由含300mg/mlzeocin的培養(yǎng)基中選擇穩(wěn)定克隆，并通過(guò)以0.5個(gè)細(xì)胞/100|uL/孔的密度鋪板在96孔板中于無(wú)zeocin的培養(yǎng)基中亞克隆。此后使用無(wú)zeocin的培養(yǎng)基。通過(guò)在顯微鏡下目視檢查證實(shí)各孔中克隆的形成情況。擴(kuò)增僅具有1個(gè)細(xì)胞簇的孔中的細(xì)胞。每塊96孔板都產(chǎn)生約30個(gè)克隆，由這些克隆隨機(jī)選擇約14個(gè)克隆用于進(jìn)一步的研究。通過(guò)每日細(xì)胞計(jì)數(shù)以及采用ViaCount試劑和GuavaPCA進(jìn)行存活率檢查評(píng)價(jià)這些克隆的生長(zhǎng)特征。由在24孔板中評(píng)價(jià)的14個(gè)克隆(圖18、19)鑒別出1個(gè)顯示出改善的生長(zhǎng)特征(較高的細(xì)胞密度和延長(zhǎng)的細(xì)胞存活)的Bcl-2-轉(zhuǎn)染克隆，稱為665.2B9糾(或克隆弁4)。相比于親代665.2B9克隆，克隆#4生長(zhǎng)至更高細(xì)胞密度(約1.7倍)，在T-培養(yǎng)瓶中多存活4-6天(圖20、21)，并且由于生長(zhǎng)更好，根據(jù)ELISA滴定和A蛋白柱純化的測(cè)定，克隆#4的P皿增加至約170mg/L。為i正實(shí)665.2B9#4的改良生長(zhǎng)特性因Bcl-2的轉(zhuǎn)染而產(chǎn)生，使用GuavaExpress試劑和GuavaPCA設(shè)備檢測(cè)人Bcl-2蛋白的胞內(nèi)水平。簡(jiǎn)單地講，將置于1.5ml離心管中的4><105個(gè)細(xì)胞以1500rpm離心5分鐘，用lxPBS清洗3次。小心地吸出上清液。向細(xì)胞沉淀加入SantaCruzBiotechnology(SCB),Inc.的固定溶液(10x，60pL)(目錄號(hào)弁sc-3622)達(dá)15分鐘，在水上溫育。于4。C用4xlmLPBS去除固定溶液，每次離心如所述進(jìn)行。在渦旋的同時(shí)于-20。C滴加透化緩沖液(0.5mL)(SCB目錄號(hào)弁sc-3623)，接著在冰上進(jìn)行15分鐘的溫育。然后離心細(xì)胞，并用0.5mLFCM清洗緩沖液(SCB目錄號(hào)弁sc-3624)清洗2次。將最終的細(xì)胞沉淀重懸浮在100FCM清洗緩沖液中，并用10pL綴合至PE的抗Bcl-2小鼠單克隆抗體(得自SCB)染色Bcl-2胞內(nèi)蛋白。于室溫在黑暗中進(jìn)行1小時(shí)的溫育。之后用0.5mLFCM清洗緩沖液進(jìn)行兩次清洗。用0.4mLFCM清洗緩沖液重懸浮最終的細(xì)胞沉淀，并用GuavaPC分析細(xì)胞。將各個(gè)克隆的平均熒光強(qiáng)度值(MFI)與采用綴合PE的非特異性同種型小鼠IgGl染色的對(duì)照比較。結(jié)果歸納于表2，證實(shí)與親代細(xì)胞系相比克隆665.2B9#4表達(dá)更高水平的Bcl-2蛋白。顯示出與親代665.2B9相似的生長(zhǎng)譜的zeocin抗性克隆(#13)對(duì)Bcl-2染色是陰性的，證實(shí)Bcl-2表達(dá)是生長(zhǎng)改良所必需的。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>[Q114]采用GuavaExpress分析，發(fā)現(xiàn)用MTX擴(kuò)增克隆665.2B9糾，對(duì)應(yīng)于Bcl-2水平的熒光染色強(qiáng)度升高，提示Bcl-2與dhfr基因共擴(kuò)增。為比較所擴(kuò)增細(xì)胞的胞內(nèi)Bcl-2水平，使用抗人Bcl-2抗體對(duì)克隆665.2B9#4(Bcl-2陽(yáng)性)和克隆#13(Bcl-2陰性)的細(xì)胞裂解物進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析。密度計(jì)評(píng)價(jià)表明，在1.0^MMTX中生長(zhǎng)的克隆665.2B9糾的Bcl-2信號(hào)是0.6MTX中的細(xì)胞的2倍?？寺?13的裂解物未表現(xiàn)出存在Bcl-2蛋白(圖22)。實(shí)施例7.在分批培養(yǎng)條件下克隆665.2B9#4的改良的抗體生產(chǎn)通過(guò)監(jiān)測(cè)接近終末期的細(xì)胞培養(yǎng)物中的營(yíng)養(yǎng)物消耗，發(fā)現(xiàn)葡萄糖和L-谷氨酰胺是首先被消耗的組分。進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以確定補(bǔ)加這些限制性營(yíng)養(yǎng)物是否會(huì)改善最終的抗體收率。啟動(dòng)兩類培養(yǎng)攙入補(bǔ)料分批培養(yǎng)一其中這些限制性組分在它們消耗時(shí)補(bǔ)加；和未補(bǔ)料分批培養(yǎng)一無(wú)營(yíng)養(yǎng)物補(bǔ)加。測(cè)試在含0.6和1pMMTX的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的Bcl-2-陽(yáng)性克隆665.2B9#4和在0.3pMMTX中生長(zhǎng)的Bcl-2-陰性克隆#13。圖23和24顯示了兩種培養(yǎng)類型中的細(xì)胞存活率和細(xì)胞密度的情況，直至它們達(dá)到終末期。蛋白收率以mg/L表示，如在表3中所示。該實(shí)驗(yàn)的結(jié)果提示，對(duì)于所有培養(yǎng)物來(lái)說(shuō)，營(yíng)養(yǎng)物攙入均將所生產(chǎn)抗體的總收率提升至約2倍。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>通過(guò)A蛋白柱純化測(cè)定。兩次純化的平均值。實(shí)施例8.將Bcl-2基因?qū)肷a(chǎn)低水平重組蛋白的細(xì)胞系中細(xì)胞克隆482.2C4A最初通過(guò)轉(zhuǎn)染由Sp2/0產(chǎn)生，以生產(chǎn)IgG(抗-CEA)和兩個(gè)scFv(抗-DTPA)形式的雙特異性抗體(Leung等，J.Nuc.Med.41:270P,2000;Hayes等，Proc.Am.Asso.Cancer.Res.43:969,2002),它們每個(gè)都共價(jià)連接至IgG重鏈的C-末端。對(duì)該克隆進(jìn)行基因擴(kuò)增，得到約20mg/L的最終生產(chǎn)率。為改善生長(zhǎng)特性和最終改善抗體生產(chǎn)率，如實(shí)施例6所述用含人Bcl-2基因的質(zhì)粒表達(dá)載體通過(guò)電穿孔轉(zhuǎn)染482.2C4A細(xì)胞。3周后在含750嗎/mlZeocin的培養(yǎng)基中選擇轉(zhuǎn)染體。用25pg/mlCHX處理Zeocin-抗性細(xì)月包5小時(shí)，以去除凋亡敏感細(xì)胞。用新鮮培養(yǎng)基清洗經(jīng)處理的細(xì)胞兩次，以去除CHX，并重懸浮在新鮮生長(zhǎng)培養(yǎng)基中。在復(fù)蘇24小時(shí)后，將存活的細(xì)胞通過(guò)有限稀釋在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中克隆(0.5個(gè)細(xì)胞/孔)?？寺≡?周內(nèi)出現(xiàn)在孔中，根據(jù)其抗體生產(chǎn)情況、對(duì)CHX誘導(dǎo)的凋亡的抗性以及生長(zhǎng)譜進(jìn)行篩選。選擇那些在所有方面都表現(xiàn)得比親代482.2C4A好的克隆，并進(jìn)一步表征。與親代482.2C4A細(xì)胞相比，預(yù)期最好的表現(xiàn)者在逆境條件下生長(zhǎng)時(shí)更強(qiáng)壯，抗衰老培養(yǎng)條件誘導(dǎo)的凋亡，具有更高的最大抗體生產(chǎn)率(約150%或更好)。實(shí)施例9.將Bcl-2基因?qū)隨p-E26中進(jìn)一步改善細(xì)胞生長(zhǎng)特性如在實(shí)施例5中所述用含人Bcl-2-EEE基因的質(zhì)粒表達(dá)載體通過(guò)電穿孔轉(zhuǎn)染Sp-E26細(xì)胞。3周后在含500嗎/mlZeocin的培養(yǎng)基中選擇轉(zhuǎn)染體。用25pg/mlCHX處理Zeocin抗性細(xì)胞5小時(shí)，以去除凋亡敏感細(xì)胞。用新鮮培養(yǎng)基清洗經(jīng)處理的細(xì)胞兩次，以去除CHX,并懸浮在新鮮培養(yǎng)基中。在復(fù)蘇24小時(shí)后，通過(guò)有限稀釋將存活細(xì)胞在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中克隆(0.5個(gè)細(xì)胞/孔)?？寺≡?周內(nèi)出現(xiàn)在孔中，根據(jù)其對(duì)CHX誘導(dǎo)的凋亡的抗性以及生長(zhǎng)譜進(jìn)行篩選。選擇那些在所有方面都表現(xiàn)得比親代Sp-E26以及Sp-EEE好的克隆，并進(jìn)一步表征。與親代Sp-E26和Sp/EEE細(xì)胞相比，預(yù)期含HPV-16E6/E7和Bcl-2-EEE的最佳表現(xiàn)者在逆境條件下生長(zhǎng)時(shí)更強(qiáng)壯，抗衰老培養(yǎng)條件誘導(dǎo)的凋亡；因此，其是用于重組蛋白生產(chǎn)的較好宿主細(xì)胞。實(shí)施例10.Sp-EEE細(xì)胞系的改善的重組蛋白生產(chǎn)在開發(fā)用于生產(chǎn)重組蛋白的存活增強(qiáng)的細(xì)胞系時(shí)，有兩條途徑可以采納。如在實(shí)施例6中所述，一個(gè)方法已完成得相當(dāng)成功，該方法包括用促凋亡基因如Bcl-2穩(wěn)定轉(zhuǎn)染已有的生產(chǎn)細(xì)胞系。但是，該方法需要額外的轉(zhuǎn)染、選擇和克隆步驟，由此將細(xì)胞系開發(fā)過(guò)程延長(zhǎng)至少兩個(gè)月和可能長(zhǎng)得多的時(shí)間。此外，篩選"最佳，，克隆是相當(dāng)復(fù)雜的，因?yàn)樾枰獮槊總€(gè)克隆確定許多參數(shù)，包括生長(zhǎng)/存活、Bcl-2表達(dá)水平和生產(chǎn)率。因此，僅可評(píng)價(jià)少量克隆。具有最高生產(chǎn)率的克隆很有可能不具有優(yōu)良的存活率，反之亦然。本文使用的一種替代的策略是開發(fā)具有優(yōu)良的生長(zhǎng)和存活特性的親代細(xì)胞系，該細(xì)胞系隨后用生產(chǎn)目標(biāo)蛋白用的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染。相比于Sp2/0細(xì)胞，Sp-EEE細(xì)胞再繼續(xù)生長(zhǎng)1天，達(dá)到的最大密度高15-20%，在培養(yǎng)物中多存活4-6天。細(xì)胞在隨后用生產(chǎn)重組蛋白用的基因轉(zhuǎn)染時(shí)保持其增強(qiáng)的生長(zhǎng)和存活特性，所述重組蛋白例如為IgG、抗體片段和融合蛋白、生長(zhǎng)因子(例如G-CSF、GM-CFS、EPO、EGF、VEGF)、細(xì)胞因子(例如白介素家族成員(IL-1-IL-31)或干擾素家族成員(例如a、(3或y干擾素))、寡核苷酸、肽、激素、酶或疫苗(例如曱、乙或丙型肝炎，以及上述的其它疫苗)。使用含一種或多種重組蛋白(例如IgG)表達(dá)盒的DNA載體(例如pdHL2)通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法如電穿孔轉(zhuǎn)染Sp-EEE細(xì)胞。將轉(zhuǎn)染體鋪板在96孔板中，通過(guò)既有技術(shù)如ELISA或Biacore分析克隆的蛋白生產(chǎn)情況。在幾個(gè)月內(nèi)使生產(chǎn)性克隆經(jīng)受培養(yǎng)基中增加濃度的MTX，以擴(kuò)增基因拷貝數(shù)。因?yàn)楸磉_(dá)Bcl-2-EEE的克隆與在Bcl-2陰性Sp2/0細(xì)胞中產(chǎn)生的克隆相比生長(zhǎng)至約高20%的細(xì)胞密度，并多存活至少4天，所以前者在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)瓶或轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)中將多產(chǎn)生至少20%的重組蛋白。在懸浮、灌注或補(bǔ)料-分批生物反應(yīng)器培養(yǎng)物中實(shí)現(xiàn)甚至更大的增加。實(shí)施例11.在生物反應(yīng)器中Bcl-2轉(zhuǎn)染克隆665,B4.1C1的改善的抗體生產(chǎn)將實(shí)施例6的665.2B9#4和親代克隆665.2B9兩者在無(wú)血清培養(yǎng)基中斷血清。通過(guò)在T-培養(yǎng)瓶中連續(xù)傳代培養(yǎng)幾個(gè)月使細(xì)胞適應(yīng)含3(_iMMTX的雜交瘤無(wú)血清培養(yǎng)基(HSFM)(ImmunomedicsPN10070)的定制配制物。經(jīng)適應(yīng)的細(xì)胞由T-培養(yǎng)瓶放大至轉(zhuǎn)瓶，用于建庫(kù)。使用由45%條件培養(yǎng)基(在指數(shù)生長(zhǎng)期的培養(yǎng)物離心后作為上清液收集的培養(yǎng)基)、10%DMSO和45%HSFM組成的無(wú)FBS的冷凍保護(hù)溶液，在各l-mL的小瓶中為每個(gè)細(xì)胞系建立具有l(wèi)xl(f個(gè)活細(xì)胞的主細(xì)胞庫(kù)(MCB)。MCB細(xì)胞系分別稱為665.2B9.1E4(無(wú)Bcl-2基因)和6M.B4.1C1(有BclJ基因)。在分批培養(yǎng)條件下比較這兩個(gè)克隆的生長(zhǎng)特性和抗體產(chǎn)量。使用以上由MCN擴(kuò)增的細(xì)胞在3-L實(shí)驗(yàn)室規(guī);漠的生物反應(yīng)器中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。3-L生物反應(yīng)器系統(tǒng)是按比例縮小的2500-LcGMP生物反應(yīng)器系統(tǒng)的模型。因此，評(píng)價(jià)結(jié)果將支持這些細(xì)胞系用于大規(guī)模商品化生產(chǎn)的適合性。使用與在建立MCB中所用相同的生長(zhǎng)HSFM(ImmunomedicsPN10070)維持細(xì)胞系，并制備接種物。在3-L補(bǔ)料-分批生物反應(yīng)器工藝中使用基礎(chǔ)HSFM(—種基于生長(zhǎng)HSFM具有定制改良的定制配制物(ImmunomedicsPN10194))。兩種培養(yǎng)基均含胰島素和轉(zhuǎn)鐵蛋白作為僅有的微量蛋白。將額外的0.1。/。PluronicF68摻入到配制物中，以保護(hù)細(xì)胞免遭攪拌和通氣引起的剪切。該培養(yǎng)基還含3jiMMTX。連續(xù)補(bǔ)料溶液和脈沖補(bǔ)料溶液的具體特性示于以下的表4和5:表4<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>表5<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>在具有2L工作體積的3LBellco旋動(dòng)瓶(spinner-flask)生物反應(yīng)器系統(tǒng)(Bellcoglasses,Vineland,N丄)中進(jìn)行補(bǔ)料-分批實(shí)驗(yàn)。監(jiān)測(cè)生物反應(yīng)器的溫度、pH和溶解氧(DO)，并通過(guò)單回路控制器控制。通過(guò)加熱毯將反應(yīng)器溫度控制于37°C。通過(guò)加入C02或6%Na2C03將培養(yǎng)物pH控制于7.3。通過(guò)圓柱形燒結(jié)噴頭以10ml/分鐘進(jìn)行通氣。通過(guò)將02間歇噴入培養(yǎng)基中將DO控制在40。/。空氣飽和度以上。在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中使用50約60rpm的恒定攪拌速率。融解MCB的冷凍小瓶，并在T-培養(yǎng)瓶中復(fù)蘇約1-2周。然后將細(xì)胞由T-培養(yǎng)瓶擴(kuò)增至轉(zhuǎn)瓶，然后接種入生物反應(yīng)器中。細(xì)胞在5%C02氣氛中于37。C培養(yǎng)，并在整個(gè)擴(kuò)增過(guò)程中保持在指數(shù)生長(zhǎng)期。在接種前，經(jīng)泵將1.2L基礎(chǔ)HSFM無(wú)菌轉(zhuǎn)移入生物反應(yīng)器中。以空氣飽和培養(yǎng)基，以校準(zhǔn)溶解氧(DO)探頭。另取培養(yǎng)基樣品，以校準(zhǔn)pH探頭。一校準(zhǔn)好pH探頭和DO探頭，就將兩個(gè)控制器設(shè)定于AUTO模式。一旦系統(tǒng)達(dá)到pH(7.3)和溫度(37。C)設(shè)定點(diǎn)，就將計(jì)算量的接種物由轉(zhuǎn)瓶經(jīng)泵轉(zhuǎn)移入生物反應(yīng)器中。接種后的存活細(xì)胞密度(VCD)約為2xl()S個(gè)存活細(xì)胞/ml。補(bǔ)料策略如下。在培養(yǎng)過(guò)程中，將濃縮的營(yíng)養(yǎng)物溶液補(bǔ)料入生物反應(yīng)器中，給細(xì)胞提供必需的和非過(guò)量的營(yíng)養(yǎng)物。濃縮的營(yíng)養(yǎng)物溶液經(jīng)連續(xù)補(bǔ)料和脈沖補(bǔ)料遞送至培養(yǎng)基。使用蠕動(dòng)泵(Watson-Marlow101U/R)將連續(xù)補(bǔ)料溶液經(jīng)泵連續(xù)轉(zhuǎn)移入反應(yīng)器中。脈沖補(bǔ)料溶液一天一次脈沖補(bǔ)料入培養(yǎng)物中。開發(fā)了兩種補(bǔ)料-分批補(bǔ)料策略，并應(yīng)用于兩種細(xì)胞系。工藝#1在培養(yǎng)過(guò)程中不補(bǔ)料重組胰島素。工藝#2基于工藝#1設(shè)計(jì)，具有改良的亞油酸和脂質(zhì)補(bǔ)料策略和額外的胰島素補(bǔ)料。下表歸納了用于兩種細(xì)胞系的兩種工藝的補(bǔ)料。<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>表7用于細(xì)胞系665.2B9.1E4的工藝#2連續(xù)補(bǔ)料連續(xù)補(bǔ)料速率(ml/天)天數(shù)預(yù)期的存活細(xì)胞葡萄糖和ImmuC2ImmuC5密度(纟田胞/mL)谷氨酰胺第2天0.40.7E66000第3天上午1.0~1.7E60600第3天下午1.01~2.5E60900第4天上午2.51~3.5E60900第4天下午2.51~4.5E601500第5天上午4.51~6.5E60090第5天下午4.517.5E600120第6天7.51~12E600120第7天如果〈13E600120如果〉13.1E600150第8天如果〈10E60090如果為10.1~13E600120如果〉13.1E600150脈沖補(bǔ)料脈沖補(bǔ)料(mL)天數(shù)TCSoyPlusLA/CD脂質(zhì)TECImmuBME/胰島素(120g/L)(1.5mg/ml)(500X)溶液VitaminEDTA(4mg/ml)480048246442200005665ui^tt,1456700第第第第第第表8<table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table>表9<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>在培養(yǎng)過(guò)程中，定時(shí)取生物反應(yīng)器樣品進(jìn)行離線分析。在用0.4%錐蟲藍(lán)染料染色后，使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器通過(guò)顯微鏡計(jì)數(shù)檢測(cè)活細(xì)胞密度(VCD)和細(xì)胞存活率。使用NovaBioprofile200檢測(cè)葡萄糖、乳糖、谷氨酰胺和氨濃度。使用A蛋白親和層析柱(AppliedBiosystems,P/N2-1001-00)通過(guò)HPLC測(cè)定抗體濃度。通過(guò)將所產(chǎn)生的累積抗體除以培養(yǎng)物中總存活細(xì)胞的時(shí)間積分計(jì)算單位抗體生產(chǎn)率一-i,其中fKCDFi^通過(guò)下述梯形法則逼近2借助于工藝#1，665.2B9.1E4細(xì)胞生長(zhǎng)，在第6天時(shí)獲得lxl()7個(gè)存活細(xì)胞/ml的最大VCD和86。/。的存活率。在6天后，VCD和V。/?？焖傧陆?，在第8天收集培養(yǎng)物。工藝#2幫助培養(yǎng)物達(dá)到1.2x107個(gè)存活細(xì)胞/ml的更高VCD,并維持多1天。與665.2B9.1E4細(xì)胞相比，665.B4.1C1細(xì)胞在兩種工藝中均表現(xiàn)出好得多的生長(zhǎng)。在工藝#1中，其VCD在第7天時(shí)達(dá)到2xl07個(gè)存活細(xì)胞/ml和97%存活率。培養(yǎng)物在其開始衰敗前還將此VCD和V。/。多保持2天。在第11天收集培養(yǎng)物。在工藝#2中，665.B4.1C1細(xì)月包顯示出與工藝#1相似的生長(zhǎng)譜。更具體地il,細(xì)胞達(dá)到2.3x107個(gè)存活細(xì)胞/ml的最高VCD,存活率稍微緩慢地下降，在第11天進(jìn)行收集。此觀察結(jié)果與665.2B9.1E4細(xì)胞系稍微不同，665,2B9,1E4細(xì)胞系在工藝#2中表現(xiàn)出生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)。比較兩種細(xì)胞系在工藝#1和#2中的抗體收率。665.2B9.1E4細(xì)胞在工藝#1中的最終收率是0.42g/L，在工藝#2中的最終收率是0.55g/L。相比之下，665.B4.1C1細(xì)胞在兩種工藝中都得到更高的最終收率1.5g/L。計(jì)算每日的單位抗體生產(chǎn)率(基于每個(gè)細(xì)胞)，對(duì)于兩種工藝，在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中665.2B9.1E4細(xì)胞都具有約15pg/細(xì)胞/天的平均每日Q[MAb]。在工藝#2中以最高VCD再生長(zhǎng)1天產(chǎn)生更高的最終抗體濃度。665.B4.1C1細(xì)胞在兩種工藝中都顯示出相似的每日單位抗體生產(chǎn)率分布型，工藝#1獲得稍高一些的生產(chǎn)率。每日Q[M,保持在約20-25pg/細(xì)胞/天之間，直至第9天。此后，生產(chǎn)率下降。與665.2B9.1E4細(xì)胞系的15pg/細(xì)胞/天相比，665.B4.1C1細(xì)胞系表現(xiàn)出約25pg/細(xì)胞/天的更高單位抗體生產(chǎn)率。組合其較好的生長(zhǎng)，與665.2B9.1E4細(xì)胞系達(dá)到的0.55g/L相比，665.B4.1C1細(xì)胞系使最終抗體收率增至3倍，達(dá)1.5g/L。這些結(jié)果證實(shí)了將Bcl-2基因摻入宿主細(xì)胞系中的利益在模擬重組蛋白(在本實(shí)例中為臨床應(yīng)用的抗體)的大規(guī)模商品化制備的生物反應(yīng)器中增強(qiáng)其在無(wú)血清培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)和抗體收率。實(shí)施例12.Sp/ESF無(wú)血清預(yù)適應(yīng)細(xì)胞系的開發(fā)以下概述了用于細(xì)胞轉(zhuǎn)化和蛋白生產(chǎn)的標(biāo)準(zhǔn)方法。將Sp2/0細(xì)胞或Sp2/0衍生細(xì)胞系保持在10%FBS中，通過(guò)用含目標(biāo)基因的表達(dá)載體經(jīng)電穿孔轉(zhuǎn)染。在將轉(zhuǎn)染細(xì)胞系保持在補(bǔ)加10。/。FBS的培養(yǎng)基中的同時(shí)，嘗試通過(guò)逐步增加培養(yǎng)基中的氨曱蝶呤(MTX)來(lái)擴(kuò)增表達(dá)。該擴(kuò)增方法似乎僅偶爾起作用，通常采用具有較低初始生產(chǎn)率的細(xì)胞系，一般需要4-8個(gè)月。一完成MTX擴(kuò)增，就在3-6個(gè)月的時(shí)間段內(nèi)使克隆逐漸適應(yīng)在無(wú)血清培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，這通常導(dǎo)致生產(chǎn)率損失達(dá)50%。因?yàn)镾p/EEE細(xì)胞系表現(xiàn)出增強(qiáng)的生長(zhǎng)和存活特性以及對(duì)血清除盡的優(yōu)良耐受，所以決定研究開發(fā)預(yù)適應(yīng)在無(wú)血清培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的Sp/EEE細(xì)胞系和使用該細(xì)胞系進(jìn)行轉(zhuǎn)染、克隆和擴(kuò)增的可行性。以下描述了Sp/ESF(Sp/EEE無(wú)血清)細(xì)胞系的開發(fā)。通過(guò)用C-AD2-Fab-h679-pdHL2表達(dá)載體轉(zhuǎn)染，證實(shí)了生產(chǎn)克隆蛋白如抗體或片段的可行性。這>在無(wú)羞，培#差尹_^長(zhǎng)和亞乂^在2個(gè)月的時(shí)間段內(nèi)使Sp/EEE細(xì)胞適應(yīng)在無(wú)血清培養(yǎng)基(SFM)中生長(zhǎng)。在嘗試確定于無(wú)FBS的SFM中轉(zhuǎn)染是否可行時(shí)，將已適應(yīng)無(wú)血清的Sp/EEE細(xì)胞以有限稀釋鋪板，以確定它們是否能由低密度復(fù)蘇。將細(xì)胞以5個(gè)細(xì)胞/孔的濃度鋪板在96孔板的第一行中，并順著板以2倍稀釋。由有限稀釋產(chǎn)生總共7個(gè)克隆。這些結(jié)果表明，細(xì)胞在轉(zhuǎn)染必需的條件下可存活。使用這7個(gè)亞克隆中的4個(gè)進(jìn)行生長(zhǎng)曲線實(shí)驗(yàn)，以選擇具有最有利的生長(zhǎng)特性的克隆。將這4個(gè)克隆(#1、3、4和5)以及親代克隆以3xl()S個(gè)細(xì)胞/ml的密度分傳到T25培養(yǎng)瓶的6ml培養(yǎng)基中。監(jiān)測(cè)細(xì)胞存活率(圖25)和密度(圖26),直至達(dá)到0存活率。在所述亞克隆中，#3比任意其它亞克隆或親代細(xì)胞系都多存活24小時(shí)。另外，亞克隆#3和#1達(dá)到比其它克隆高的最大細(xì)胞密度(3.2-3.3xl()e個(gè)/mL，圖26)。這提示亞克隆#3可能更適于經(jīng)歷成功的轉(zhuǎn)染。因此，給予亞克隆約新名稱Sp/ESF,用于隨后的轉(zhuǎn)染。^M7WZ^脊襲&/，勿應(yīng)基于以上數(shù)據(jù)，按照用于Sp2/0細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)方法，用30嗎的h679-AD2-pdHL2通過(guò)電穿孔轉(zhuǎn)染Sp/ESF細(xì)胞(亞克隆#3)。在48小時(shí)后，用0.1|iMMTX選擇細(xì)胞。作為對(duì)照，還在相同條件下用h679-AD2-pdHL2通過(guò)電穿孔轉(zhuǎn)染在10%FBS中的Sp/EEE細(xì)胞對(duì)照。在10天后，準(zhǔn)備平板，以便使用BSA-IMP-260包被的平板經(jīng)ELISA進(jìn)行篩選。對(duì)于兩個(gè)轉(zhuǎn)染，400個(gè)孔中約130個(gè)含陽(yáng)性克隆。將來(lái)自具有40個(gè)最高OD讀數(shù)的孔的陽(yáng)性Sp/ESF細(xì)胞轉(zhuǎn)移至24-孔板，并將MTX增加至0.2pMMTX。在24-孔板中的細(xì)胞達(dá)到終末期后，通過(guò)使用HSG傳感芯片的BIACORE分析進(jìn)行進(jìn)一步的篩選。所篩選的克隆中有4個(gè)克隆的生產(chǎn)率〉50mg/L。最高生產(chǎn)克隆(h679-AD2-SF弁T6)的初始生產(chǎn)率為82mg/L。這些初始生產(chǎn)率結(jié)果非常類似于由先前使用在10%FBS中的Sp/EEE細(xì)胞的該構(gòu)建物轉(zhuǎn)染獲得的那些結(jié)果。放大選擇h679-AD2-SF#T6克隆用于MTX放大(amplification)。在2周后，將MTX濃度由0.2pM增加至0.4^M。在增加僅2倍MTX后就已經(jīng)可以觀察到一些生產(chǎn)率的放大。表100.1nMMTX82mg/L0.2|uMMTX93mg/L0.4nMMTX103mg/L結(jié)論以上給出的Sp/ESF的數(shù)據(jù)表明，轉(zhuǎn)染、通過(guò)有限稀釋克隆和MTX力欠大全部可在無(wú)血清條件下在不足1個(gè)月內(nèi)完成。這由h679-Fab-AD2-pdHL2表達(dá)載體的轉(zhuǎn)染得到證實(shí)，產(chǎn)生非常高的初始生產(chǎn)率82mg/L,其可在兩周內(nèi)擴(kuò)大至103mg/L。預(yù)期較長(zhǎng)時(shí)間的MTX接觸可進(jìn)一步放大。最佳克隆(T6)的初始生產(chǎn)率為82mg/L，超過(guò)了來(lái)自在10%FBS中進(jìn)行的親代Sp/EEE細(xì)胞系最初轉(zhuǎn)染的最佳克隆h679-AD2-pdHL2(5D8)的初始生產(chǎn)率，后者的初始生產(chǎn)率為約50mg/L。還業(yè)已用EPO-DDD2-pdHL2轉(zhuǎn)染Sp/ESF細(xì)胞，用于生產(chǎn)促紅細(xì)胞生成素。表11比較了Sp/ESF的關(guān)鍵參數(shù)和現(xiàn)有PER.C6細(xì)胞系(Jones等,載于Biotechnol.Prog.2003,19:163-168)的那些參數(shù)，如表11所示，Sp/ESP在許多類別當(dāng)中都優(yōu)于PER,C6。表ll<table>tableseeoriginaldocumentpage53</column></row><table>按照本文公開內(nèi)容，可制備和執(zhí)行本文公開并要求保護(hù)的所有組合物和/或方法和或裝置，而無(wú)需過(guò)度不當(dāng)實(shí)驗(yàn)。盡管已就優(yōu)選實(shí)施方案描述了本發(fā)明的組合物和方法，但對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，可對(duì)所述組合物和/或方法和/或裝置以及在本文描述的步驟或步驟次序中應(yīng)用各種變化，而不偏離本發(fā)明的概念、精神和范圍。更具體地說(shuō)，顯然，化學(xué)和生理均相關(guān)的某些物質(zhì)可替代本文描述的物質(zhì)，而且會(huì)達(dá)到相同或相似的結(jié)果。對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員都是顯而易見的所有這些相似的替代和修改，被認(rèn)為屬于由隨附權(quán)利要求定義的本發(fā)明的精神、范圍和概念。權(quán)利要求1.哺乳動(dòng)物細(xì)胞系，所述細(xì)胞系已用凋亡抑制劑轉(zhuǎn)染，并適應(yīng)在無(wú)血清培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，所述細(xì)胞系可在無(wú)血清條件下用一種或多種表達(dá)載體轉(zhuǎn)染。2.權(quán)利要求1的細(xì)胞系，其中所述凋亡抑制劑包含編碼具有T69E、S70E和S87E突變的Bcl-2的基因。3.權(quán)利要求1的細(xì)胞系，其中所述表達(dá)載體編碼抗體、人源化抗體、嵌合抗體、人抗體、雙特異性抗體、多特異性抗體、多價(jià)抗體或其片段。4.權(quán)利要求1的細(xì)胞系，其中所述用凋亡抑制劑轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系表現(xiàn)出的生長(zhǎng)所達(dá)到的密度，等于或大于未轉(zhuǎn)染細(xì)胞系表現(xiàn)出的密度。5.權(quán)利要求4的細(xì)胞系，其中所述用凋亡抑制劑轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系表現(xiàn)出的生長(zhǎng)所達(dá)到的密度，比未轉(zhuǎn)染細(xì)胞系表現(xiàn)出的密度大至少10%。6.權(quán)利要求4的細(xì)胞系，其中所述用凋亡抑制劑轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系表現(xiàn)出的生長(zhǎng)所達(dá)到的密度，比未轉(zhuǎn)染細(xì)胞系表現(xiàn)出的密度大至少20%。7.權(quán)利要求1的細(xì)胞系，其中用凋亡抑制劑轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系的蛋白產(chǎn)量大于親本細(xì)胞系的蛋白產(chǎn)量。8.權(quán)利要求7的細(xì)胞系，其中用凋亡抑制劑轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系的蛋白產(chǎn)量是用親本細(xì)胞系觀察到的蛋白產(chǎn)量的2倍。9.權(quán)利要求1的細(xì)胞系，所述細(xì)胞系進(jìn)一步用一種或多種表達(dá)載體轉(zhuǎn)染。10.權(quán)利要求9的細(xì)胞系，其中所述一種或多種表達(dá)載體是染色體整合型的。11.權(quán)利要求1的細(xì)胞系，其中所述細(xì)胞系是選自Sp2/0、Sp2/0衍生物、NSO或YB2/0的骨髓瘤細(xì)胞系。12.權(quán)利要求1的細(xì)胞系，其中所述細(xì)胞系選自CHO、HEK293、COS-l、COS-7、HepG2、BHK21、P3X3Ag8.653和BSC-1。13.權(quán)利要求1的細(xì)胞系，其中所述凋亡抑制劑選自E6、E7、Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w、Bcl-EEE、Bhrfl、KS-Bcl-2、E1B-19K、Bcl-6和Mcl-l。14.一種蛋白，所述蛋白由權(quán)利要求9的細(xì)胞系生產(chǎn)。15.權(quán)利要求14的蛋白，其中所述蛋白是抗體、人源化抗體、嵌合抗體、人抗體、雙特異性抗體、多特異性抗體、多價(jià)抗體或其片段。16.權(quán)利要求14的蛋白，其中所述蛋白是生長(zhǎng)因子、激素、白介素、干擾素或酶。17.權(quán)利要求16的蛋白，其中所述蛋白選自EPO、G-CSF、GM-CSF、EGF、VEGF、血小板生成素、IL-1至IL-31、干擾素-a、干擾素-(3和干擾素-Y。18.蛋白生產(chǎn)方法，所述方法包括a)獲得用凋亡抑制劑轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系，所述細(xì)胞系適應(yīng)在無(wú)血清培養(yǎng)基中生長(zhǎng)；b)在無(wú)血清條件下用一種或多種表達(dá)載體轉(zhuǎn)染所述細(xì)胞系；和c)通過(guò)在無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述細(xì)胞系，由所述一種或多種表達(dá)載體生產(chǎn)一種或多種蛋白。19.權(quán)利要求18的方法，其中所述凋亡抑制劑包含編碼具有T69E、S70E和S87E突變的Bcl-2的基因。20.權(quán)利要求18的方法，其中所述表達(dá)載體編碼抗體、人源化抗體、嵌合抗體、人抗體、雙特異性抗體、多特異性抗體、多價(jià)抗體或其片段。21.權(quán)利要求18的方法，其中所述用凋亡抑制劑轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系表現(xiàn)出的生長(zhǎng)所達(dá)到的密度，等于或大于未轉(zhuǎn)染細(xì)胞系表現(xiàn)出的密度。22.權(quán)利要求21的方法，其中所述用凋亡抑制劑轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系表現(xiàn)出的生長(zhǎng)所達(dá)到的密度，比未轉(zhuǎn)染細(xì)胞系表現(xiàn)出的密度大至少10%。23.權(quán)利要求22的方法，其中所述用凋亡抑制劑轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系表現(xiàn)出的生長(zhǎng)所達(dá)到的密度，比未轉(zhuǎn)染細(xì)胞系表現(xiàn)出的密度大至少20%。24.權(quán)利要求18的方法，其中用凋亡抑制劑轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系的蛋白產(chǎn)量大于親本細(xì)胞系的蛋白產(chǎn)量。25.權(quán)利要求18的方法，其中所述細(xì)胞系是骨髓瘤細(xì)胞系。26.權(quán)利要求25的方法，其中所述骨髓瘤細(xì)胞系是Sp2/0或其衍生物、鼠NSO或大鼠YB2/0細(xì)胞系。27.權(quán)利要求18的方法，其中所述細(xì)胞系選自CHO、HEK293、COS-l、COS畫7、HepG2、BHK21、P3X3Ag8.653和BSC-1。28.權(quán)利要求18的方法，其中所述凋亡抑制劑選自E6、E7、Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w、Bcl-EEE、Bhrfl、KS-Bcl畫2、E1B-19K、Bcl-6和Mcl-l。29.權(quán)利要求18的方法，所述方法還包括在含至少一種胱天蛋白酶抑制劑的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述細(xì)胞系。30.權(quán)利要求29的方法，其中所述胱天蛋白酶抑制劑選自胱天蛋白酶-1、胱天蛋白酶-3、胱天蛋白酶-9、胱天蛋白酶-12和泛胱天蛋白酶抑制劑。31.權(quán)利要求18的方法，所述方法還包括在含促紅細(xì)胞生成素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述細(xì)胞系。32.權(quán)利要求30的方法，其中所述胱天蛋白酶抑制劑選自Z陽(yáng)VAD-fmk、Ac-DEVD-cho(SEQIDNO:7)、Aven和XIAP。33.權(quán)利要求18的方法，所述方法導(dǎo)致細(xì)胞培養(yǎng)物的壽命增加至少4天。34.權(quán)利要求18的方法，所述方法導(dǎo)致細(xì)胞培養(yǎng)物的壽命增加至少6天。全文摘要公開了用于增加細(xì)胞培養(yǎng)物的壽命并允許增加蛋白產(chǎn)量的組合物和方法，所述蛋白優(yōu)選為重組蛋白，例如為抗體、肽、酶、生長(zhǎng)因子、白介素、干擾素、激素和疫苗。用凋亡抑制性基因或載體(例如三重突變型Bcl-2基因)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞可在培養(yǎng)物中存活更長(zhǎng)時(shí)間，導(dǎo)致蛋白生物合成的狀態(tài)延長(zhǎng)和收率擴(kuò)大。這類轉(zhuǎn)染的細(xì)胞表現(xiàn)出的最大細(xì)胞密度等于或超過(guò)親代細(xì)胞系達(dá)到的最大密度。還可使轉(zhuǎn)染的細(xì)胞預(yù)適應(yīng)在無(wú)血清培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)，大大降低了在無(wú)血清培養(yǎng)基中獲得蛋白生產(chǎn)所需要的時(shí)間。在某些方法中，經(jīng)預(yù)適應(yīng)的細(xì)胞可在無(wú)血清條件下轉(zhuǎn)化后用于蛋白生產(chǎn)。該方法優(yōu)選涉及真核細(xì)胞，更優(yōu)選涉及哺乳動(dòng)物細(xì)胞。文檔編號(hào)C12N5/00GK101273121SQ200680035226公開日2008年9月24日申請(qǐng)日期2006年7月14日優(yōu)先權(quán)日2005年7月25日發(fā)明者C·H·張,D·M·戈登伯格,E·A·羅西,J·-D·楊,Z·屈,黛安·諾德斯特龍申請(qǐng)人:免疫醫(yī)療公司