專利名稱：：產(chǎn)生l-氨基酸的細(xì)菌和用于產(chǎn)生l-氨基酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及使用微生物產(chǎn)生L-氨基酸的方法，更具體地，涉及用于產(chǎn)生L-氨基酸例如L-賴氨酸、L-蘇氨酸和L-谷氨酸等的方法。L-賴氨酸和L-蘇氨酸通常用作動(dòng)物飼料添加劑、保健食品成分、氨基酸浸劑(infUsion)等，且L-谷氨酸通常用作調(diào)味品。因此，這些是工業(yè)上有用的L-氨基酸。
背景技術(shù)：
：在工業(yè)上采用發(fā)酵方法，使用短桿菌屬(&evAa"ehwm)、棒桿菌屬(Coo^e6a"en^m)或埃希氏菌屬(^c/zen'c/n'a)等的微生物生產(chǎn)L-氨基酸(EP0857784、0999267、1170358、JP11-192088A、WO00/53726、WO96/17930、WO03/04674)。野生型微生物、所述菌抹的人工突變體和以通過重組DNA技術(shù)而將L-氨基酸生物合成酶的活性增強(qiáng)的方式修飾的微生物通常用于L-氨基酸的產(chǎn)生。用于增強(qiáng)各種菌林產(chǎn)生L-氨基酸的能力的已知方法包括，修飾L-氨基酸的攝取(uptake)或輸出(export)。例如，為了修飾攝取，通過缺失或減少細(xì)胞中的L-氨基酸攝取來增強(qiáng)產(chǎn)生L-氨基酸的能力。例如，一種方法是通過缺失gluABCD操縱子或該操縱子的一部分等來缺失或減少L-谷氨酸的攝取(EP1038970)。用于修飾L-氨基酸輸出的方法之一是缺失或減少L-氨基酸生物合成中間物的輸出，而另一種方法是加強(qiáng)L-氨基酸的輸出。對(duì)于前者，如果目標(biāo)氨基酸是L-谷氨酸，已知方法是通過突變或破壞a-酮戊二酸通透酶基因，來減少L-谷氨酸生物合成中的中間物a-酮戊二酸的輸出(W001/005959)。為了缺失或減少L-氨基酸生物合成中間物的輸出，已經(jīng)報(bào)道了過量表達(dá)L-氨基酸輸出的方法，例如，使用將L-賴氨酸或L-精氨酸輸出基因(LysE)(JournalofMolecularMicrobiologyBiotechnology(JMolMicrobiolBiotechnol)1999Nov;l(2):327-36)的表達(dá)增強(qiáng)的棒桿菌屬微生物的細(xì)菌菌抹來產(chǎn)生L-賴氨酸(W097/23597)或L-精氨酸。另外，報(bào)道了使用埃希氏菌屬的細(xì)菌產(chǎn)生L-氨基酸的方法，在所述細(xì)菌中表達(dá)rhtA、B和C基因(US6，303,348)或yfiK、yahN基因等(EP1013765)。除了如上所述修飾L-氨基酸生物合成途徑和修飾L-氨基酸的攝取和輸出，改進(jìn)產(chǎn)生L-氨基酸能力的方法的其它實(shí)例是修飾攝取糖的能力。例如，磷酸烯醇丙酮酸糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(在下文中也稱作PTS:磷酸轉(zhuǎn)移酶)是公知的攝耳4唐的轉(zhuǎn)運(yùn)體。另外，將PTS歸類為非底物依賴性共有系統(tǒng)(commonsystem)EI(由ptsl編碼)、HPr(由ptsH編碼)，或底物特異性組分EII。葡萄糖特異性EII由ptsG和crr編碼，其中crr基因與ptsH和ptsl—起是操縱子的一部分。用于產(chǎn)生L-氨基酸的一種已知方法使用將ptsG基因增強(qiáng)的埃希氏菌屬(W003/04670),而另一種方法使用將ptsH、ptsl和crr基因增強(qiáng)的埃希氏菌屬(WO03飾74)。除了上述的葡萄糖PTS，已知manXYZ基因編碼甘露糖特異性磷酸轉(zhuǎn)移酶(PTS)(MolecularMicrobiology(MolecularMicrobiology)199827(2),369-380)，但是尚未報(bào)道將編碼甘露糖PTS的基因用于L-氨基酸的產(chǎn)生。發(fā)明概述本發(fā)明的目的是提供能夠有效產(chǎn)生L-氨基酸的細(xì)菌菌抹，并且提供使用所述細(xì)菌菌抹產(chǎn)生L-氨基酸的方法。為了解決上述問題，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)使用經(jīng)修飾而增加甘露糖PTS活性的屬于腸桿菌科(family五"ferak^/en'aceae)的微生物能夠有效地產(chǎn)生L-氨基酸。即，本發(fā)明如下本發(fā)明的目的是提供產(chǎn)生L-氨基酸的方法，所述方法包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)腸桿菌科的微生物，所述微生物具有產(chǎn)生L-氨基酸的能力并且經(jīng)》務(wù)飾以使甘露糖PTS活性增強(qiáng)；和從所述培養(yǎng)基或微生物中收集L-氨基酸。本發(fā)明的目的是提供上述方法，其中通過增加編碼甘露糖PTS的manXYZ基因的拷貝數(shù)，或修飾所述基因的表達(dá)調(diào)節(jié)序列，或它們的組合對(duì)所述微生物進(jìn)行修飾以增強(qiáng)該基因的表達(dá)。本發(fā)明的目的是提供上述方法，其中所述manXYZ基因編碼選自下組的蛋白質(zhì)(A)選自下組的蛋白質(zhì)SEQIDNos.2、3、4的氨基酸序列，和它們的組合，(B)選自下組的蛋白質(zhì)SEQIDNos.2、3、4的氨基S臾序列和它們的組合，其中所述蛋白質(zhì)包含一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失、插入、添加或倒位并且具有甘露糖PTS活性。本發(fā)明的目的是提供上述方法，其中所述manXYZ基因是選自下組的DNA:(a)包含SEQIDNo.1的核苷酸號(hào)72至2767的核苷S殳序列的DNA,(b)在嚴(yán)緊條件下與SEQIDNo.1中核苷酸號(hào)72至2767的核芬酸序列的互補(bǔ)序列，或與能夠從所述核苷酸序列制備的探針雜交的DNA,并且所述DNA編碼具有甘露糖PTS活性的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的目的是提供上述方法，其中所述微生物是埃希氏菌屬或泛菌屬(尸flwtoefl)的纟田菌。本發(fā)明的目的是提供上述方法，其中所述L-氨基酸選自下組L-賴氨酸、L-蘇氨酸、L-谷氨酸和它們的組合。附圖簡(jiǎn)述圖1顯示質(zhì)粒pMW118-attL-Tc-attR的構(gòu)建。圖2顯示質(zhì)粒pMWl18-attL-Cm-attR的構(gòu)建。圖3顯示質(zhì)粒pMW-intxis-ts的構(gòu)建。優(yōu)選實(shí)施方式詳述在下文中，將對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)i兌明。<1>本發(fā)明的微生物本發(fā)明的微生物是腸桿菌科的微生物，其具有產(chǎn)生L-氨基酸的能力，并且經(jīng)修飾以增強(qiáng)甘露糖PTS活性。短語(yǔ)"產(chǎn)生L-氨基酸的能力，，的意思是當(dāng)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明的微生物時(shí)，在培養(yǎng)基或所述微生物的細(xì)胞中產(chǎn)生和引起L-氨基酸積累的能力。本發(fā)明的微生物可具有產(chǎn)生多種L-氨基酸的能力。所述微生物天然地具有產(chǎn)生L-氨基酸的能力，或可通過誘變或重組DNA技術(shù)進(jìn)行修飾以賦予產(chǎn)生L-氨基酸的能力，例如下文所述的那些。L-氨基酸的類型無具體限制。L-氨基酸的實(shí)例包括堿性L-氨基酸例如L-賴氨酸、L-鳥氨酸、L-精氨酸、L-組氨酸和L-瓜氨酸(L-citrulline);脂肪族L-氨基酸例如L-異亮氨酸、L-丙氨酸、L-纈氨酸、L-亮氨酸和L-甘氨酸；羥基L-氨基酸例如L-蘇氨酸和L-絲氨酸；環(huán)狀L-氨基酸例如L-脯氨酸；芳族L-氨基酸例如L-苯丙氨酸、L-酪氨酸和L-色氨酸；含硫L-氨基酸例如L-半胱氨酸、L-胱氨酸和L-曱硫氨酸；和酸性L-氨基酸例如L-谷氨酸、L-天冬氨酸；酸性L-氨基酸的酰胺例如L-谷氨酰胺、L-天冬酰胺等。本發(fā)明的微生物可具有產(chǎn)生兩種或更多種氨基酸的能力。<1-1>賦予產(chǎn)生L-氨基酸的能力以下實(shí)例包括對(duì)賦予產(chǎn)生L-氨基酸能力的方法的描述，以及能夠用于本發(fā)明的被賦予產(chǎn)生L-氨基酸能力的微生物的實(shí)例。本發(fā)明的微生物不限于這些，只要它們具有產(chǎn)生L-氨基酸的能力，則可以是任何微生物。對(duì)用于本發(fā)明的微生物無具體限制，只要其屬于腸桿菌科，例如埃希氏菌屬、腸桿菌屬(五"feraZ^cfer)、泛菌屬、克雷伯氏菌屬(X/eZwW/a)、沙雷氏菌屬(&rra"a)、歐文氏菌屬(五nWm'a)、沙門氏菌屬(Sa/wo"e〃aO、摩根氏菌屬(Morg朋e^)等，并且其具有產(chǎn)生L-氨基酸的能力。具體地，可以使用屬于如NCBI(NationalCenterforBiotechnologyInformation)數(shù)據(jù)庫(kù)中分類的腸桿菌牙牛的^f壬4可《斂生物(http:〃www.genome.ad.jp/dbget-bin/get—htextOrganisms+-e+L+A+-s+F+-f+F+A2—A#L2)。作為能夠被修飾的腸桿菌科的親本菌株，特別期望使用屬于埃希氏菌屬、腸桿菌屬或泛菌屬的細(xì)菌。對(duì)于用來獲得本發(fā)明的細(xì)菌的埃希氏菌屬細(xì)菌的親本菌株不進(jìn)行具體限制，但可以使用Neidhardt等所列的菌抹(Neidhardt，F(xiàn)，C.etal.,^c/^Wc/z/aco//and5b/wo"e〃a7>p/n>nwn'wm，AmericanSocietyforMicrobiology,Washington,D.C.,1029表1)。一個(gè)實(shí)例是大腸桿菌。大腸桿菌的具體實(shí)例是大腸桿菌W3110(ATCC27325)、大腸桿菌MG1655(ATCC47076)等，其是源自K12的野生型菌4朱的原型(prototype)。這些可以從例如美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection(地址P.O.Box1549Manassas,VA20108,USA))獲得。它們可以通過使用給予每個(gè)菌抹的登錄號(hào)來獲得(參見http:/www.atcc.org)。所述登錄號(hào)對(duì)應(yīng)于每個(gè)細(xì)菌菌林，并且列于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄。腸桿菌屬細(xì)菌的實(shí)例包括成團(tuán)腸桿菌(五"feraZ)acferagg/omerara)和產(chǎn)氣腸桿菌(￡wtero6a"eraerage"e力。泛菌屬纟田菌的實(shí)例是尸a"toe"&。在近幾年中，基于16SrRNA核苷酸序列分析，有時(shí)將成團(tuán)腸桿菌重分類為成團(tuán)泛菌agg/omeraw)、Pa"toeaa"a"ato和斯氏泛菌toeaWevrar"/)。對(duì)于本發(fā)明，可以使用歸類在腸桿菌科中的任何細(xì)菌，無論屬于腸桿菌屬或泛菌屬。菌抹尸朋toeaAJ13355(FERMBP匿6614)、AJ13356(FERMBP-6615)、AJ13601(FERMBP-7207)或它們的任何衍生物可用于通過基因工程方法培育amwato。在分離時(shí)，將這些菌抹鑒定并且保藏為成團(tuán)腸桿菌。如上所述，通過使用16SrRNA核普酸序列的分析，已將這些細(xì)菌重分類為尸awto^za"a"afe。對(duì)于本發(fā)明，可以4吏用屬于腸桿菌屬或泛菌屬的任何細(xì)菌，只要所述細(xì)菌歸類于腸桿菌科中。下文將描述用于將產(chǎn)生L-氨基酸的能力賦予屬于腸桿菌科的微生物的方法。為了賦予產(chǎn)生L-氨基酸的能力，可以獲得營(yíng)養(yǎng)缺陷突變體、類似物抗性菌抹或代謝調(diào)節(jié)突變體，或可以產(chǎn)生將L-氨基酸生物合成酶的表達(dá)增強(qiáng)的重組菌抹。也可使用在棒狀桿菌型細(xì)菌(coryneformbacteria)或埃希氏菌屬細(xì)菌的培育中常規(guī)使用的方法(參見"AminoAcidFermentation",GakkaiShuppanCenter(Ltd.),1stEdition,publishedMay30，1986，pp.77-100)。在本文中，在產(chǎn)生L-氨基酸的細(xì)菌的培育中，可賦予一種或多種性質(zhì)，例如營(yíng)養(yǎng)缺陷突變、類似物抗性或代謝調(diào)節(jié)突變。也可使用將一種或多種L-氨基酸生物合成酶的表達(dá)的增強(qiáng)。另外，可以將賦予性質(zhì)與增強(qiáng)生物合成酶的活性組合進(jìn)行，所述性質(zhì)例如營(yíng)養(yǎng)缺陷突變、類似物抗性或代謝調(diào)節(jié)突變。具有產(chǎn)生L-氨基酸的能力的營(yíng)養(yǎng)缺陷突變體菌抹、L-氨基酸類似物抗性菌抹或代謝調(diào)節(jié)突變體菌抹可如下獲得對(duì)親本或野生型菌抹施以常規(guī)突變處理，例如用X-射線或UV照射處理，或用誘變劑例如N-甲基-N，-硝基-N-亞竭基胍等處理；其后選擇顯示營(yíng)養(yǎng)缺陷突變、類似物抗性或代謝調(diào)節(jié)突變并且還具有產(chǎn)生L-氨基酸的能力的那些菌抹。L-賴氨酸類似物抗性菌抹或代謝調(diào)節(jié)突變體的實(shí)例包括但不限于，大腸桿菌AJl1442菌株(FERMBP-1543、NRRLB-12185、JP56-18596A和美國(guó)專利No.4,346,170)、大腸桿菌VL611菌株(EP1016710A)等。也可以使用大腸桿菌WC196菌林(WO96/17930)作為產(chǎn)生L-賴氨酸的細(xì)菌。通過將AEC(S-(2-氨基乙基)-半胱氨酸)抗性賦予源自大腸桿菌K-12的W3110菌抹來培育WC196菌抹。將這種菌抹命名為大腸桿菌AJ13069,并且在1994年12月6曰以登錄號(hào)FERMP-14690保藏在工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所(theNationalInstituteofBioscienceandHuman-TechnologyoftheAgencyofIndustrialScienceandTechnology)(目前為，3蟲立4亍J支法人產(chǎn)業(yè)^支術(shù)纟宗合研究所特許《效生物保藏中心(InternationalPatentOrganismDepositary,NationalInstituteofAdvancedIndustrialScienceandTechnology);Chuo6,1-1,Higashil-chome，Tsukuba-shi,Ibaraki-ken305-8566，Japan),并且才艮據(jù)布達(dá)佩斯條約(BudapestTreaty)在1995年9月29日轉(zhuǎn)為國(guó)際保藏，并給予登錄號(hào)FERMBP-5252。也可通過增加L-賴氨酸生物合成酶活性來構(gòu)建產(chǎn)生L-賴氨酸的細(xì)菌。編碼L-賴氨酸生物合成酶的基因的實(shí)例是二氫吡啶二羧酸合酶基因(dapA)(EP0733710B)、天冬氨酸激酶基因(lysC)(EP0733710、US5,932，453)、二氫吡咬二羧酸還原酶基因(dapB)、二氨基庚二酸脫羧酶基因(lysA)、二氨基庚二酸脫氬酶基因(ddh)(WO96/40934)、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因(ppc)(JP60-87788A)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶基因(aspC)(JP6-102028A)、二氨基庚二酸差向異構(gòu)酶基因(dapF)(WO00/56858)、天冬氨酸半醛脫氫酶基因(asd)(WO00/61723)和二氨基庚二酸途徑酶的其它基因；以及高烏頭酸水合酶基因(JP2000-157276)和氨基己二酸途徑酶的其它基因。這些基因的縮寫在各自名稱之后的括號(hào)內(nèi)給出。此外，已知野生型二氫吡啶二羧酸合酶(DDPS)和天冬氨酸激酶(AK)受到L-賴氨酸反饋抑制的阻抑；因此，當(dāng)使用dapA和lysC時(shí)，優(yōu)選分別使用編碼對(duì)L-賴氨S交反饋抑制有抗性的二氬吡啶二羧酸合酶和天冬氨酸激酶的突變基因(EP0733710、US5，932，453)。編碼對(duì)L-賴氨酸反饋抑制有抗性的突變二氫吡啶二羧酸合酶的DNA的實(shí)例包括編碼具有以下氨基酸序列的DDPS的DNA,在所述氨基酸序列中用酪氨酸取代第118位的組氨酸殘基(US.5,661,012和6,040,160)。另外'編碼對(duì)L-賴氨酸反饋抑制有抗性的突變AK的DNA的實(shí)例包括編碼具有以下氨基酸序列的AK的DNA，在所述氨基酸序列中用異亮氨酸取代352_蘇氨酸殘基(U.S.5,661,012和6,040,160)。這些突變DNA能夠通過使用PCR的定點(diǎn)誘變等獲得。以下是通過將編碼L-賴氨酸生物合成酶的基因引入宿主中來賦予產(chǎn)生L-賴氨酸的能力的實(shí)例。即，通過將編碼L-賴氨酸生物合成基因的基因片段與在用于產(chǎn)生L-賴氨酸的宿主微生物中發(fā)揮功能的載體連接來制備重組DNA，所述載體優(yōu)選是多拷貝型載體，并且使用這種重組DNA來轉(zhuǎn)化所述宿主。通過所述轉(zhuǎn)化，在宿主細(xì)胞中編碼L-賴氨酸生物合成酶的基因的拷貝數(shù)增加，使表達(dá)增強(qiáng)并且從而增加酶活性。不具體指定編碼L-賴氨酸生物合成酶的基因，只要它們能夠在宿主微生物中表達(dá)。實(shí)例包括源自大腸桿菌的基因，和源自棒狀桿菌型細(xì)菌的基因。由于大腸沖干菌和谷氨酸才奉桿菌(Coo^e6ocfen'wmg/wtom/cww)的全基因組序列已經(jīng)確定，所以能夠基于這些基因的核苷酸序列合成引物，并且使用PCR方法獲得這些基因，在所述PCR方法中將微生物(例如大腸桿菌K12)的染色體DNA等用作模板。為了克隆這些基因，可以使用在腸桿菌科中自主復(fù)制的質(zhì)粒。實(shí)例包括pBR322、pTWV228(TakaraBioInc.)、pMW119(NipponGeneCo.,Ltd.)、pUC19、pSTV29(TakaraBioInc.)、RSF1010(Genevol.75(2),pp.271-288，1989)等。此外，也可使用噬菌體DNA的載體。為了將靶基因連接至上述載體，將載體用限制酶消化，所述限制酶與含有靶基因的DNA片段的末端匹S己。通常用連接酶例如T4DNA連接酶進(jìn)行連接。耙基因可分別存在于不同的載體上，或存在于相同的載體上?？梢允褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法來消化和連接DNA,以及制備染色體DNA、進(jìn)行PCR、制備質(zhì)粒DNA、轉(zhuǎn)化、確定用作引物的寡核苷酸等。這些方法在Sambrook，J.，andRussell,D.W.MolecularCloningALaboratoryManual/ThirdEdition.NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress(2001)等中描述?？梢允褂眠_(dá)到充分轉(zhuǎn)化效率的任何方法將如上所述制備的重組DNA引入微生物。實(shí)例包括電穿孔(CanadianJournalofMicrobiology,43,197(1997))。使用電穿孔制備的質(zhì)粒的實(shí)例是pCABD2,所述質(zhì)粒含有dapA、dapB和LysC基因(WO01/53459)。也可通過將靶基因的多拷貝引入微生物的染色體DNA來實(shí)現(xiàn)增強(qiáng)編碼L-賴氨酸生物合成酶的基因的表達(dá)?？赏ㄟ^使用以多拷貝存在于所述染色體DNA上的序列作為同源重組中的靶來將靶基因的多拷貝引入微生物的染色體DNA中。對(duì)這種以使用同源重組的基因取代為基礎(chǔ)位點(diǎn)特異性地引入突變已有描述。已經(jīng)描述使用線性DNA或含有溫度敏感復(fù)制起點(diǎn)的質(zhì)粒的方法(美國(guó)專利6,303,383和5,616,480)。可以使用存在于可轉(zhuǎn)座元件末端的反向重復(fù)序列和重復(fù)DNA作為以多拷貝存在于染色體DNA上的序列。可將L-賴氨酸生物合成基因與天然存在于染色體上的基因串聯(lián)(intandem)連接，或可將其引入染色體上的非必需區(qū)或引入如果缺失將使L-賴氨酸產(chǎn)率得到改進(jìn)的基因區(qū)。此外，如US5,595，889中披露，還可將靶基因定位于轉(zhuǎn)座子上，其后轉(zhuǎn)移所述轉(zhuǎn)座子以將多拷貝引入染色體DNA。用任一方法，將轉(zhuǎn)化體中輩巴基因的拷貝數(shù)增加，從而使L-賴氨酸生物合成的酶活性增加。除了上述基因擴(kuò)增外，可通過用較強(qiáng)的表達(dá)調(diào)節(jié)序列取代靶基因的表達(dá)調(diào)節(jié)序列(如啟動(dòng)子等)來實(shí)現(xiàn)L-賴氨酸生物合成酶活性的增加(參見JP1-215280A)。例如，lac啟動(dòng)子、trp啟動(dòng)子、trc啟動(dòng)子、tac啟動(dòng)子、入嗟菌體PR啟動(dòng)子、PL啟動(dòng)子和tet啟動(dòng)子都是公知的強(qiáng)啟動(dòng)子。^^用這些啟動(dòng)子取代使靶基因的表達(dá)增加，由此增強(qiáng)酶活性。強(qiáng)啟動(dòng)子的實(shí)例和用于評(píng)估啟動(dòng)子強(qiáng)度的方法的實(shí)例在Goldstein等的文章等中描述(Prokaryoticpromotersinbiotechnology.Biotechnol.Annu.Rev.,1995,1,105-128)。成酶活性的增加，所述元件例如操縱基因或阻抑物(repressor)(Hamiltonetal,;JBacteriol.1989Sep;171(9):4617-22)。如WO00/18935中披露，能夠在靶基因啟動(dòng)子的-35、-10區(qū)中引入幾個(gè)堿基的取代以將其修飾和增強(qiáng)。另外，已知在核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)和起始密碼子之間的間隔區(qū)中，特別在起始密碼子的緊鄰上游序列中取代幾個(gè)核苷酸，對(duì)mRNA翻譯效率具有強(qiáng)烈的影響。能夠通過啟動(dòng)子探針載體和基因分析軟件(例如GENETYX)等確定靶基因啟動(dòng)子的表達(dá)調(diào)節(jié)區(qū)等。例如，能夠以與上述使用溫度敏感質(zhì)粒的基因取代相同的方式進(jìn)行表達(dá)調(diào)節(jié)序列的取代。也可使用Red-驅(qū)動(dòng)整合方法(Red-drivenintegrationmethod)(WO2005/010175)。此外，在本發(fā)明的產(chǎn)生L-賴氨酸的細(xì)菌中，可將下述酶的活性減少或缺失催化從L-賴氨酸生物合成途徑分支的L-賴氨酸之外的化合物產(chǎn)生的酶，或?qū)-賴氨酸的產(chǎn)生具有負(fù)效應(yīng)的酶。這些酶包括高絲氨酸脫氬酶(thrA)、賴氨酸脫羧酶(cadA、lysC)和蘋果酸酶(sfcA、b2463)。在WO95/23864、WO96/17930、WO2005/010175等中提供所述酶活性減少或缺陷的菌抹。為了在細(xì)胞中減少或缺失所述酶活性，可使用常規(guī)和已知的方法，對(duì)編碼上述酶的基因進(jìn)行誘變。這可以通過如下方法實(shí)現(xiàn)例如，4吏用遺傳重組來缺失在染色體上編碼酶的基因，或修飾啟動(dòng)子或Shine-Dalgamo(SD)序列等表達(dá)調(diào)節(jié)序列。這也可通過如下方法實(shí)現(xiàn)在染色體上編碼酶的區(qū)中引入氨基酸取代(錯(cuò)義突變)或終止密碼子(無義突變)，引入添加或缺失1-2個(gè)堿基的移碼突變，或缺失基因的部分或完整區(qū)(JournalofBiologicalChemistry272:8611-8617(1997);JournalofAntimicrobialChemotherapy20046,793-796;BiotechnolProg1999,15,58-64;J.BiologicalChemistryvol272NO.13pp8611-8617)。同樣，可通過如下方法將酶活性減少或缺失構(gòu)建缺失編碼區(qū)的編碼突變酶的基因，其后通過同源重組等用這種基因取代染色體上的野生型基因，或?qū)⑥D(zhuǎn)座子或IS元件引入所述基因?？梢允褂靡韵路椒ㄍㄟ^遺傳重組來引入使上述酶活性減少或缺失的突變。將含有靶基因的分離的DNA突變，以使所得突變基因不產(chǎn)生正常發(fā)揮功能的酶。隨后，使用含有所述基因的DNA，將這種突變基因轉(zhuǎn)化至屬于腸桿菌科的微生物中，并且產(chǎn)生突變型基因與染色體上基因的重組。對(duì)于使用這種同源重組的基因取代，存在使用線性DNA的方法，例如稱為"Red-驅(qū)動(dòng)整合，，的方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2000,vol.97，No.12,pp.6640-6645),或?qū)ed-驅(qū)動(dòng)整合方法與人噬菌體切除系統(tǒng)(入phageexcisivesystem)組合的方法(J.Bacteriol.2002Sep;184(18):5200-3，InteractionsbetweenintegraseandexcisionaseinthephageXexcisivenucleoproteincomplex.ChoEH,GumportRI,GardnerJF)(參見WO2005/010175)等；還存在使用含有溫度敏感復(fù)制起點(diǎn)的質(zhì)粒的方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2000,vol.97,No.12,pp.6640-6645、美國(guó)專利No.6,303,383或5,616,480)。這種如上所述使用同源重組通過基因取代位點(diǎn)特異性地引入突變也可使用在宿主中不具有復(fù)制能力的質(zhì)粒進(jìn)行。上述用于增加L-賴氨酸生物合成中涉及的酶活性的方法和用于減少酶活性的方法同樣可以用來培育其它產(chǎn)生L-氨基酸的細(xì)菌。以下將說明用來培育其它L-氨基酸細(xì)菌的方法。作為本發(fā)明中使用的產(chǎn)生L-谷氨酸的細(xì)菌，存在例如屬于腸桿菌科的微生物，所述微生物經(jīng)修飾而將編碼L-谷氨酸生物合成中涉及的酶的基因的表達(dá)增加。L-谷氨酸生物合成中涉及的酶包括谷氨酸脫氫酶(gdh)、谷氨酰胺合成酶(gltAB)、谷氨酸合酶(glnA)、異檸檬酸脫氫酶(icd)、烏頭酸水合酶(acn)、檸檬酸合酶(gltA)、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(ppc)、丙酮酸羧化酶(pycA)、丙酮酸脫氫酶(pdhA)、丙酮酸激酶(pykA)、磷酸烯醇丙酮酸合酶(pps)、烯醇化酶(eno)、磷酸葡萄糖變位酶(pgm)、磷酸甘油酸激酶(pgk)、甘油醛-3-磷酸脫急酶(gpd)、丙糖磷酸異構(gòu)酶(tpi)、果糖二磷酸醛縮酶(fba)、磷酸果糖激酶(pfk)、葡糖磷酸異構(gòu)酶(gpi)等。在這些酶之中，檸檬酸合酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、谷氨酸脫氫酶和它們的組合是優(yōu)選的，并且使用全部三種是更優(yōu)選的。使用上述方法修飾而將檸檬酸合酶基因、磷酸烯醇丙酮酸脫羧酶基因和/或谷氨酸脫氳酶基因的表達(dá)增強(qiáng)的屬于腸桿菌科的微生物的實(shí)例在美國(guó)專利Nos.6,197,559和6,331,419、EP0999282、WO2006/051660中提供。此外，還可以使用經(jīng)修飾而將6-磷酸葡糖酸脫水酶或2-酮-3-脫氧-6-磷酸葡糖酸醛縮酶中任一的活性增加或?qū)⒍叩幕钚远荚黾拥膶儆谀c桿菌科的微生物(EP1352966B)?？梢允褂玫木哂挟a(chǎn)生L-谷氨酸能力的腸桿菌科微生物包括下述細(xì)菌，在所述細(xì)菌中，將催化L-谷氨酸之外化合物的產(chǎn)生的酶活性減少或降低，而所述化合物的產(chǎn)生從L-谷氨酸的生物合成途徑分支。催化從L-谷氨酸生物合成途徑分支的除L-谷氨酸之外的化合物產(chǎn)生的酶的實(shí)例是2-酮戊二酸脫氫酶(sucA)、異檸檬酸裂合酶(aceA)、乙酰羥酸合酶(ilvG)、乙酰乳酸合酶(ivN)、甲酸乙酰轉(zhuǎn)移酶(pflB)、乳酸脫氫酶(ldh)、谷氨酸脫羧酶(gadA)和1-吡咯啉脫氬酶(l-pyrrolinedehydrogenase)(putA)等。在這些之中，特別優(yōu)選減少或缺失2-酮戊二酸脫氫酶的活性。用于在屬于腸桿菌科的微生物中缺失或減少2-酮戊二酸脫氫酶活性的方法在美國(guó)專利5，573,945、美國(guó)專利No.6,197,559和美國(guó)專利No.6,331,419中描述。將2-酮戊二酸脫氫酶活性缺失或減少的屬于腸桿菌科的微生物的實(shí)例包括以下AJfl3601(FERMBP畫7之0"植生克雷伯氏菌(A7eZm'e〃ap/a""co/a)AJ13410菌^朱(FERMBP-6617)大腸桿菌AJ12949(FERMBP-4881)等等。AJ12949菌抹是將a-酮戊二酸脫氫酶活性減少的細(xì)菌菌抹，并且在1993年12月28日以登錄號(hào)FERMP-14039保藏在工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所(目前為，獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許微生物保藏中心(Chuo6,l陽(yáng)l，Higashil-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken305-8566，Japan),并且根據(jù)布達(dá)佩斯條約在1994年11月11日轉(zhuǎn)為國(guó)際保藏，并給予登錄號(hào)FERMBP-4881。本發(fā)明中優(yōu)選使用的產(chǎn)生L-色氨酸的細(xì)菌是以下一種或多種酶的活性增強(qiáng)的細(xì)菌即鄰氨基苯甲酸合酶(trpE)、磷酸甘油酸脫氫酶(serA)或色氨酸合酶(trpAB)。由于鄰氨基苯曱酸合酶和磷酸甘油酸脫氫酶均受到L-色氨酸和L-絲氨酸的反饋抑制，能夠通過保留(retain)脫敏的突變酶來增加這些酶的活性(US5，618，716、US6,180,373)。例如，通過將鄰氨基苯曱酸合酶基因(trpE)和/或磷酸甘油酸脫氫酶基因(serA)突變以防止反饋抑制，再將所述突變基因引入屬于腸桿菌科的微生物，從而可獲得具有脫敏的酶的細(xì)菌。這種細(xì)菌的具體實(shí)例是大腸桿菌SV164,所述細(xì)菌保留脫敏的鄰氨基笨曱酸合酶，并且用具有突變的serA的質(zhì)粒pGH5轉(zhuǎn)化所述細(xì)菌，所述突變的serA編碼脫敏的磷酸甘油酸脫氫酶(W094/08301)。用含有色氨酸操縱子的重組DNA轉(zhuǎn)化的細(xì)菌也是優(yōu)選的產(chǎn)生L-色氨酸的細(xì)菌。具體實(shí)例是用含有編碼脫敏鄰氨基苯曱酸合酶的基因的色氨酸操縱子(trpAB)4爭(zhēng)4匕的大腸4于菌(JapanesePatentApplicationPublicationNo.JP57-71397、JapanesePatentApplicationPublicationNo.JP62-244382、美國(guó)專利No.4,371,614)。另外，在色氨酸操縱子中，能夠通過增加編碼色氨酸合酶的基因(trpBA)的表達(dá)來增強(qiáng)產(chǎn)生L-色氨酸的能力。色氨酸合酶含有分別由trpA和trpB編碼的a和卩亞基(W02005/103275)。產(chǎn)生L-色氨酸的細(xì)菌的實(shí)例是生長(zhǎng)需要L-苯丙氨酸和L-酪氨酸的大腸桿菌AGX17(pGX44)[NRRLB-12263],和保留包含色氨酸搡縱子的質(zhì)粒pGX50的AGX6(pGX50)aroP[NRRLB-12264](參見美國(guó)專利No.4,371,614)。缺乏色氨酸操縱子抑制子(trpR)的菌抹和具有突變trpT的菌抹也是理想的產(chǎn)生L-色氨酸的細(xì)菌(美國(guó)專利No.4,371,614WO2005/056776)。其它優(yōu)選的產(chǎn)生L-色氨酸的細(xì)菌是結(jié)構(gòu)性表達(dá)蘋杲酸合酶(aceB)、異檸檬酸裂合酶(aceA)和異檸檬酸脫氫酶/磷酸酶(icl)操縱子(ace操縱子)的細(xì)菌，或?qū)⑺霾倏v子的表達(dá)增強(qiáng)的細(xì)菌(W02005/103275)。L-色氨酸、L-苯丙氨酸和L-酪氨酸均為芳族氨基酸，并且共享生物合成系統(tǒng)。編碼芳族氨基酸生物合成酶的基因的實(shí)例包括脫氧阿拉伯-庚酮糖酸磷酉吏合酶(deoxyarabino-heptulosonatephosphatesynthase)(aroG)、3-M^氯套寧酉臾合酶(aroB)、莽草酸脫水酶、莽草酸激酶(aroL)、5-烯醇丙酮酰莽草酸[-]3-磷酉菱合酶(5-enolpymvylshikimate[-]3-phosphatesynthase)(aroA)詳口分支酉吏合酶(choris憩tesynthase)(aroC)(EuropeanPatentApplicationPublicationNo.763127)。因此，通過將編碼這些酶的基因多重拷貝(multi-copy)至質(zhì)粒或基因組上，能夠改進(jìn)產(chǎn)生芳族氨基酸的能力。已知這些基因由酪氨酸抑制子(tyrR)調(diào)控，所以也可通過缺失tyrR基因來增加芳族氨基酸的生物合成酶活性(EP763127)。產(chǎn)生L-蘇氨酸的細(xì)菌優(yōu)選是屬于腸桿菌科的微生物，其中已將所述L-蘇氨酸生物合成酶增強(qiáng)。編碼L-蘇氨酸生物合成酶的基因的實(shí)例包括天冬氨酸激酶m基因(lysC)、天冬氨酸半醛脫氬酶基因(asd)、編碼thr操縱子的天冬氨酸激酶I基因(thrA)、高絲氨酸激酶基因(thrB)和蘇氨酸合酶基因(thrC)。這些基因的縮寫在它們的名稱之后的括號(hào)內(nèi)給出。可引入這些基因中的兩種以上?？蓪-蘇氨酸生物合成基因引入已將蘇氨酸降解阻抑的埃希氏菌屬的細(xì)菌。已將蘇氨酸降解阻抑的埃希氏菌屬的細(xì)菌實(shí)例包括將蘇氨酸脫氫酶活性缺失的TDH6菌抹(JapanesePatentApplicationPublicationNo.2001-346578)等等。某些L-蘇氨酸生物合成酶的活性受產(chǎn)生的L-蘇氨酸抑制。因此，為了構(gòu)建產(chǎn)生L-蘇氨酸的細(xì)菌，優(yōu)選對(duì)L-蘇氨酸生物合成酶進(jìn)行修飾以使所述酶不受到L-蘇氨酸的反饋抑制。上述thrA、thrB和thrC基因組成蘇氨酸操縱子，所述操縱子以弱化子(attenuator)結(jié)構(gòu)的形式存在。蘇氨酸操縱子的表達(dá)受到培養(yǎng)中存在的異亮氨酸和蘇氨酸的抑制，并且使表達(dá)減弱?？赏ㄟ^去除弱化區(qū)中的前導(dǎo)序列或弱化子來實(shí)現(xiàn)對(duì)蘇氨酸操縱子的這種修飾(WO0206993;BiotechnologyLettersVol.24,No.21,November2002;WO2005/049808)?？蓪⑽挥谔K氨酸操縱子上的天然啟動(dòng)子用非天然啟動(dòng)子取代(WO98/04715)?；蛘?，可構(gòu)建蘇氨酸操縱子而使蘇氨酸生物合成中涉及的基因的表達(dá)受到人噬菌體阻抑物和啟動(dòng)子的調(diào)控(EP0593792)。同樣，為了防止L-蘇氨酸的反饋抑制，也可通過選擇a-氨基-(3-羥基戊酸(AHV)抗性的細(xì)菌菌抹來獲得對(duì)埃希氏菌屬細(xì)菌的修飾(JP45026708B)。優(yōu)選經(jīng)修飾以防止L-蘇氨酸的反饋抑制的蘇氨酸操縱子在宿主中具有增加的拷貝數(shù)或連接至強(qiáng)啟動(dòng)子。除了使用質(zhì)粒擴(kuò)增所述基因的拷貝數(shù)，還可通過使用轉(zhuǎn)座子、Mu噬菌體等將蘇氨酸操縱子引入染色體上來增加基因的拷貝數(shù)。對(duì)于天冬氨酸激酶III基因(lysC)，期望的是使用經(jīng)修飾以防止這種L-賴氨酸的反饋抑制的基因。能夠使用在美國(guó)專利No.5,932,453中描述的方法獲得經(jīng)修飾以防止反饋抑制的lysC基因。除了L-蘇氨酸生物合成酶，期望的是將糖酵解系統(tǒng)、TCA循環(huán)和呼吸鏈中涉及的基因、調(diào)控基因表達(dá)的基因和誘導(dǎo)糖攝取的基因增強(qiáng)。在L-蘇氨酸產(chǎn)生中有效的這些基因的實(shí)例包括轉(zhuǎn)氫酶基因(pntAB)(EP733712)、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因(ppc)(WO95/06114)、磷酸烯醇丙酮酸合酶基因(pps)(EP877090)、棒狀桿菌型細(xì)菌或芽孢桿菌屬(Bacillus)細(xì)菌中的丙酮酸羧化酶基因(W099/18228、EP1092776)。還優(yōu)選增強(qiáng)賦予對(duì)L-蘇氨酸的抗性的基因和賦予對(duì)L-高絲氨酸的抗性的基因的表達(dá)，或賦予宿主L-蘇氨酸抗性和L-高絲氨酸抗性。這些基因的實(shí)例是rhtA基因(ResMicrobiol.2003Mar;154(2):123-35)、rhtB基因(EP0994190)、rhtC基因(EP10I3765)和yfiK、yeaS基因(EP1016710)。對(duì)于賦予宿主L-蘇氨酸抗性，參考EuropeanPatentApplicationPublicationNo.0994190、WO卯/04636。產(chǎn)生L-蘇氨酸的細(xì)菌另外的實(shí)例是大腸桿菌VKPMB-3996菌抹(美國(guó)專利No.5,175,107)。這種VKPMB-3996菌抹在1987年11月19日以登錄號(hào)VKPMB-3996保藏在俄羅斯國(guó)立工業(yè)微生物保藏中心(theRussianNationalCollectionofIndustrialMicroorganisms)(VKPM),GNIIGenetika。此夕卜，VKPMB-3996菌抹保留質(zhì)粒pVIC40(WO90/04636),所述質(zhì)粒pVIC40通過將蘇氨酸生物合成基因(蘇氨酸操縱子thrABC)插入包含鏈霉素抗性標(biāo)記的廣宿主(wide-host)載體質(zhì)粒pAY32中而獲得(Chistorerdov，A.Y.,Tsygankov，Y.D.,Plasmid,1986，16,161-167)。在這種pVIC40中，已將L-蘇氨酸對(duì)蘇氨酸操縱子中thrA編碼的天冬氨酸激酶I-高絲氨酸脫氫酶I的反饋抑制脫敏。進(jìn)一步的實(shí)例是大腸桿菌B-5318菌抹(參見EuropeanPatentNo.0593792)。B-5318菌抹在19卯年5月3日以登錄號(hào)VKPMB-5318保藏在俄羅斯國(guó)立工業(yè)微生物保藏中心(VKPM),GNIIGenetika(Russia,117545Moscow,1DorozhnyProezd,1)。這種VKPMB-5318菌抹是異亮氨酸非營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株，并且保留重組質(zhì)粒DNA,將所述重組質(zhì)粒DNA構(gòu)建成使蘇氨酸生物合成中涉及的基因，即，將弱化子區(qū)和天然轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)缺失的蘇氨S吏操縱子置于X噬菌體溫度敏感CI阻抑物、PR啟動(dòng)子和X噬菌體的Cro蛋白N末端的下游，并且蘇氨酸生物合成中涉及的所述基因的表達(dá)由所述X噬菌體阻抑物和啟動(dòng)子調(diào)控。在本發(fā)明中使用的優(yōu)選的L-組氨酸的實(shí)例包括大腸桿菌FERMP-5038和5(M8菌抹，其含有的載體中并入了L-組氨酸生物合成中涉及的基因信息(JP5^0(b099A);引入了氨基酸輸出基因Rht的細(xì)菌菌抹(EP1016710);對(duì)磺胺胍(sulfaguanidine)、D，L-l,2,4-三唑-3-丙氨酸和鏈霉素具有抗性的大腸桿菌80菌抹(VKPMB-7270,RussianPatentPublicationNo.2119536)等?？墒褂帽磉_(dá)L-組氨酸生物合成途徑酶的編碼基因的微生物來產(chǎn)生L-組氨酸。L-組氨酸生物合成酶的實(shí)例是ATP磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(hisG)、磷酸核糖AMP環(huán)化水解酶(hisl)、磷酸核糖-ATP焦磷酸水解酶(his正)、磷酸核糖亞胺曱基-5-氨基咪哇氨曱酰核苦酸異構(gòu)酶(phosphoribosylformimino陽(yáng)5-aminoimidazolecarboxamideribotideisomerase)(hisA)、酰胺轉(zhuǎn)移酶(hisH)、磷酸組氨醇氨基轉(zhuǎn)移酶基因(hisC)、組氨醇磷酸酶基因(hisB)和組氨醇脫氫酶基因(hisD)等。優(yōu)選的本發(fā)明產(chǎn)生L-半胱氨酸的細(xì)菌是將胱硫醚P-裂合酶活性減少的細(xì)菌(JP2003-169668)，和保留絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶的埃希氏菌屬細(xì)菌，所述絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶具有減少的L-半胱氨S吏反饋抑制(JP11-155571)。優(yōu)選的本發(fā)明產(chǎn)生L-脯氨酸的細(xì)菌包括大腸桿菌702(VKPMB-8011),其對(duì)3，4-脫羥基脯氨酸和氮雜環(huán)丁烷-2-羧酸(azetidineJ-carboxylate)有抗性，和702ilvA(VKPMB-8012菌抹)，其缺乏ilvA并且源自702(JP2002-300874A)。產(chǎn)生L-苯丙氨酸的細(xì)菌的實(shí)例包括具有tyrA、tyrR缺陷的AJ12739(tyrA::Tn10，tyrR)(VKPMB-8197),和具有擴(kuò)增的編碼苯丙氨酸輸出蛋白的基因例如yddG和yedA的菌抹。產(chǎn)生L-精氨酸的細(xì)菌的實(shí)例包括對(duì)a-曱基甲硫氨酸、p-氟苯丙氨酸、D-精氨酸、精氨酸氧肟酸、S-(2-氨乙基)-半胱氨酸、a-曱基絲氨酸(a-methyleserine)、(3-2-漆吩丙氨酸或磺胺胍等有抗性的大腸桿菌突變菌才朱(JP56-106598)。大腸桿菌237菌抹是產(chǎn)生L-精氨酸的細(xì)菌，所述細(xì)菌具有對(duì)L-精氨酸的反饋抑制有抗性的突變體并且保留高活性的N-乙酰谷氨酸合酶，并且其也是優(yōu)選的產(chǎn)生L-精氨酸的菌株(EP1170361B)。所述編號(hào)為VKPMB-7925的菌抹在2000年4月10日保藏在俄羅斯國(guó)立工業(yè)微生物保藏中心(VKPM)，GNIIGenetika,并且根據(jù)布達(dá)佩斯條約在2001年5月18日轉(zhuǎn)為國(guó)際保藏。也可以使用大腸桿菌382菌抹，其是237菌抹的衍生物并且是產(chǎn)生L-精氨酸的細(xì)菌，所述細(xì)菌具有改進(jìn)的乙酸同化能力(US6,841,365)。編號(hào)為VKPMB刁^6的大腸桿菌382菌林在2000年4月10日保藏在俄羅斯國(guó)立工業(yè)微生物保藏中心(VKPM)。同樣，作為具有產(chǎn)生L-精氨酸能力的微生物，可以使用具有改進(jìn)的基因表達(dá)的微生物，所述基因編碼L-精氨酸生物合成中涉及的酶。L-精氨酸生物合成酶的實(shí)例包括N-乙酰谷氨酸合酶(argA)、N-乙酰-谷氨酰-磷酸還原酶(argC)、鳥氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶(argJ)、N-乙酰谷氨酸激酶(argB)、乙酰鳥氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(argD)、乙酰鳥氨酸脫乙酰酶(argE)、鳥氨酸氨曱酰轉(zhuǎn)移酶(argF)、精氨琥珀酸合酶(argG)、精氨琥珀酸裂合酶(argH)和氨曱酰磷S吏合酶(carAB),和它們的組合。在每種酶名稱之后，在圓括號(hào)內(nèi)提供編碼該酶的基因的名稱。期望的是使用N-乙酰谷氨酸合酶基因(argA)的突變，其中通過取代對(duì)應(yīng)于野生型中位置15-19的氨基酸序列將L-精氨酸反饋抑制去除(EPEP1170361)?？梢允褂玫漠a(chǎn)生L-亮氨酸的細(xì)菌包括大腸桿菌屬的細(xì)菌，在所述細(xì)菌中將由ilvE基因編碼的支鏈氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶失活，并且將由tyrB基因編碼的芳族氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶的活性增強(qiáng)(EP1375655A);大腸桿菌H-9068菌抹(ATCC21530)，所述菌抹對(duì)4-氮亮氨酸或5，5,5-三氟亮氨酸有抗性；大腸桿菌H-9070菌4朱(FERMBP-4704);大腸桿菌H-9072菌4朱(FERMBP-4706)(美國(guó)專利No.5,744,331);大腸桿菌菌抹，在所述菌林中將L-亮氨酸對(duì)異丙基蘋果酸合酶的反饋抑制脫敏(EuropeanPatentNo.1067191);大腸桿菌AJ11478菌抹，所述菌抹對(duì)P-2噻吩丙氨酸和P-羥亮氨酸有抗性(美國(guó)專利No.5,763,231),等等。產(chǎn)生L-異亮氨酸的細(xì)菌包括6-二曱基氨基嘌呤抗性的大腸桿菌突變菌抹(JP5-304969A)、L-異亮氨酸氧肟酸抗性的大腸桿菌突變菌抹(JP5-130882A)、碌d戈異亮氨酸抗性的(thiaisoleucine-resistant)大腸片干菌突變菌林(JP5-130882A)、DL-乙硫氨酸抗性的大腸桿菌突變菌抹(JP5-13088SA)和精氨酸氧肟酸抗性的突變菌抹(JP5-130882A)，所述全部菌抹均具有產(chǎn)生L-異亮氨酸的能力。埃希氏菌屬的重組細(xì)菌的實(shí)例是以下細(xì)菌菌抹，在所述菌抹中將編碼L-異亮氨酸生物合成酶蘇氨酸脫氨基酶或乙酰羥酸合酶的基因的表達(dá)增加(JP2-458A、JP2-429歸、JP8-47397A)，等等。用于衍生本發(fā)明產(chǎn)生L-纈氨酸的細(xì)菌的親本菌株的實(shí)例包括但不限于，經(jīng)修飾而過量表達(dá)ilvGMEDA操縱子的菌林(美國(guó)專利No.5,998,178)。期望的是將ilvGMEDA操縱子中弱化所需的區(qū)去除，從而使所述操縱子的表達(dá)不被L-纈氨酸弱化。此外，期望地將操縱子中的ilvA基因破壞，以使蘇氨酸脫氨基酶活性減少。用于衍生本發(fā)明產(chǎn)生L-纈氨酸的細(xì)菌的親本菌株的實(shí)例包括在氨基-?；鵷-RNA合成酶中具有突變的突變體(美國(guó)專利No.5,658,766)。例如，可以使用大腸桿菌VL1970,其在編碼異亮氨酸t(yī)RNA合成酶的ileS基因中具有突變。大腸桿菌VL1970已經(jīng)在1988年6月24日以登錄號(hào)VKPMB-4411保藏在俄羅斯國(guó)立工業(yè)樣吏生物保藏中心(VKPM)(Russia,117545Moscow,1DorozhnyProezd，1)。此外，生長(zhǎng)需要硫辛酸(lipoicacid)和/或缺乏H+-ATP酶的突變體也可用作親本菌抹(W096/06926)。在本發(fā)明中使用的產(chǎn)生L-氨基酸的細(xì)菌中，除編碼天然生物合成酶的基因之外，可將糖攝取、糖代謝(糖酵解系統(tǒng))和能量代謝中涉及的基因增強(qiáng)。糖代謝中涉及的基因的實(shí)例是編碼糖酵解酶或攝取糖的蛋白的基因，例如編碼葡糖-6-磷酸異構(gòu)酶的基因(pgi;WO01/02542)、磷酸烯醇丙酮酸合酶基因(pps)、磷酸葡糖變位酶基因(pgm;WO03/04598)、果糖二磷酸醛縮酶基因(fba;WO03/04664)、丙酮酸激酶基因(pykF;WO03/008609)、轉(zhuǎn)醛醇酶(transaldolase)基因(ta舊；WO03/008611)、延胡索酸酶基因(fom;WO01/02545)、磷酸烯醇丙酮酸合酶基因(pps;EP877090)、非-PTS蔗糖攝取系統(tǒng)基因(csc;EP149911)和蔗糖同化基因(scrAB操縱子；WO90/04636)。能量代謝中涉及的基因的實(shí)例包括轉(zhuǎn)氫酶基因(pntAB;美國(guó)專利No.5，830,716)和細(xì)胞色素bo型氧化酶基因(cyoABCD;EP1070376)。<1-2>用于增加甘露糖PTS的活性的方法能夠通過修飾如上所述具有產(chǎn)生L-氨基酸的能力并且屬于腸桿菌科的微生物，以增加甘露糖PTS的酶活性從而獲得本發(fā)明的微生物。然而，可以在增加甘露糖PTS的酶活性的修飾之后賦予產(chǎn)生L-氨基酸的能力。本發(fā)明中的甘露糖PTS的意思是將糖攝取至細(xì)胞質(zhì)中，而同時(shí)將磷酸烯醇丙酮酸(在下文中，稱作PEP)中的磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移至糖的活性。用于本文中時(shí)，糖的意思是甘露糖，但也可是葡萄糖、果糖或氨基糖。(MolecularMicrobiology(1998)27(2)，369-380)。能夠通過使用Chen等的方法(Biochemistry199837:8714-8723)體外測(cè)量磷酸化活性(EC2.7丄69)來確認(rèn)甘露糖PTS的酶活性的增加。也能夠通過與所述野生型或未經(jīng)修飾的菌抹比較mRNA的量來確認(rèn)編碼甘露糖PTS的基因表達(dá)與親本菌抹例如野生型菌抹或未經(jīng)修飾的菌林相比得到增強(qiáng)。Northern雜交和RT-PCR也可用來確認(rèn)表達(dá)(MolecularCloning(ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor(USA)，2001))。只要酶活性與野生或未經(jīng)修飾的菌抹相比增加，則對(duì)酶活性的增加程度不進(jìn)行限制，但是期望的是，例如是野生型或未經(jīng)修飾的菌抹的1.5或更多倍，優(yōu)選2或更多倍，或更優(yōu)選3或更多倍。如果靶蛋白量相對(duì)于未經(jīng)修飾的或野生型菌林增加，則能夠確認(rèn)酶活性的增加。這能夠通過例如使用抗體的Western印跡來4企測(cè)(MolecularCloning(ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdspringHarbor(USA)，2001》。能夠通過修飾編碼甘露糖PTS的manX、manY和manZ基因的表達(dá)實(shí)現(xiàn)甘露糖PTS的酶活性的增加(稍后描述)。這可以是通過修飾表達(dá)調(diào)節(jié)區(qū)(包括啟動(dòng)子f務(wù)飾M吏內(nèi)源manX、manY和manZ基因的表達(dá)增力口；或這可以是通過引入含有manX、manY和manZ基因的質(zhì)粒，通過擴(kuò)增染色體上的manX、manY和manZ基因來增加拷貝數(shù)等，使外源manX、manY和manZ基因的表達(dá)增加。manX、manY和manZ形成操縱子結(jié)構(gòu)(在下文中，稱作"manXYZ操縱子，，)；并且能夠通過修飾manXYZ操縱子的表達(dá)調(diào)節(jié)序列以將其用更強(qiáng)的表達(dá)調(diào)節(jié)序列取代，和增加manXYZ操縱子的拷貝數(shù)，更有效地實(shí)現(xiàn)甘露糖PTS的酶活性的增加。已經(jīng)測(cè)定大腸桿菌的全基因組序列(Science277:1453-1462(1997)),并且各基因的功能和Genbank登錄號(hào)如下表1<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>本發(fā)明的manX、manY和manZ基因是埃希氏菌屬細(xì)菌的manX、manY和manZ基因和它們的同源物。例如，大腸桿菌的manX基因編碼具有SEQIDNo.2的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，manY基因編碼具有SEQIDNo.3的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，而manZ基因編碼具有SEQIDNo.4的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。源自大腸桿菌MG1655的manX、Y、Z基因在SEQIDNo.1中的編碼區(qū)和Genbank登錄號(hào)示于表1。manX、manY和manZ基因的同源物是源自其它微生物的，與埃希氏菌屬細(xì)菌的manX、manY和manZ基因在結(jié)構(gòu)上具有高相似性的，當(dāng)引入宿主時(shí)改進(jìn)產(chǎn)生L-氨基酸的能力并且顯示甘露糖PTS活性的基因。manX、manY和manZ同源物的實(shí)例是在Genbank登記的沙門氏菌屬、志賀氏菌屬(幼&eZ/a)和耶爾森氏菌屬(^M/mh)的manX、manY和manZ基因。另夕卜，基于與以上實(shí)例中提供的基因的同源性，可以從以下細(xì)菌中克隆這些manX、Y、Z基因棒狀斥干菌型細(xì)菌，例如谷氨酸才奉#干菌、乳發(fā)酵短一干菌(Bwv/Z^"eWwm/acto/er,"e"fwm)等；假單胞菌屬的細(xì)菌CP化wfifomo"a》，例如銅綠假單胞菌(尸化z^cwow(3i1"erw^ww")等；分4支4干菌屬(綺cc^acfen'wm)的纟田菌，例3口結(jié)斗亥分枝桿菌(ik(yco6acten'Mmw6ercw/ow》等；和芽孢桿菌屬的細(xì)菌。如圖表1中所示，容許不同的基因名，只要它們與埃希氏菌屬細(xì)菌的manXYZ高度同源。例如，可以4吏用合成的寡核普酸SEQIDNos.5和6來克隆編碼甘露糖PTS的基因。本發(fā)明中使用的編碼甘露糖PTS的基因不限于野生型基因，只要編碼的甘露糖PTS蛋白的功能(即，甘露糖PTS活性)不受損，它們也可以是編碼蛋白質(zhì)的突變體或人工修飾的產(chǎn)物，所述蛋白質(zhì)包含在SEQIDNo.2、3和4的氨基酸序列中的一個(gè)或多個(gè)位置含有一個(gè)或幾個(gè)氨基酸取代、缺失、插入、添加等的序列。在本文中，術(shù)語(yǔ)"幾個(gè)，，隨蛋白質(zhì)立體結(jié)構(gòu)中氨基酸殘基的位置和類型而變化；具體地，幾個(gè)的意思是1-20,優(yōu)選地1-10，并且更優(yōu)選地l-5。以上一個(gè)或幾個(gè)氨基酸的取代、缺失、插入或添加是保持甘露糖PTS活性的保守突變。保守突變是在該突變中，如果取代位置是芳族氨基酸，則取代在Phe、Trp、Tyr之間相互發(fā)生；如果取代位置是疏水氨基酸，則在Leu、Ile、Val之間；如果是極性氨基酸，則在Gln、Asn之間；如果是堿性氨基酸，則在Lys、Arg、His之間；如果是酸性氨基酸，則在Asp、Glu之間；并且如果是具有羥基的氨基酸，則在Ser、Thr之間。常規(guī)的保守突變是保守取代。優(yōu)選的保守取代還包括用Ser或Thr取代Ala;用Gln、His或Lys取代Arg;用Glu、Gln、Lys、His或Asp取代Asn;用Asn、Glu或Gin取代Asp;用Ser或Ala取代Cys;用Asn、Glu、Lys、His、Asp或Arg取代Gin;用Gly、Asn、Gln、Lys或Asp取代Glu;用Pro取代Gly;用Asn、Lys、Gln、Arg或Tyr取代His;用Leu、Met、Val或Phe取代Ile;用Ile、Met、Val或Phe取代Leu;用Asn、Glu、Gln、His或Arg取Lys;用Ile、Leu、Val或Phe取代Met;用Trp、Tyr、Met、Ile或Leu取代Phe;用Thr或Ala取代Ser;用Ser或Ala取代Thr;用Phe或Tyr取代Trp;用His、Phe或Tip取代Tyr;和用Met、Ile或Leu取代Val。上述氨基酸的耳又代、缺失、插入、添加或倒位等包括由于保留甘露糖PTS編碼基因的微生物的種間差異或個(gè)體差異而天然存在的突變(突變體或變體)。能夠通過如下方法獲得這些基因使用例如位點(diǎn)特異性突變方法來修飾SEQIDNo.1中顯示的核苷酸序列，從而使編碼的蛋白質(zhì)中位點(diǎn)特異性的氨基酸殘基包含取代、缺失、插入或添加。此外，編碼甘露糖PTS的基因編碼與SEQNo.2、3和4的氨基酸序列具有80%或以上，優(yōu)選90%或以上，更優(yōu)選95%或以上，甚至更優(yōu)選97%或以上的同源性的蛋白質(zhì)。由于基因的簡(jiǎn)并密碼性質(zhì)隨引入所述基因的宿主而變化，用宿主更容易使用的密碼子取代的基因是期望的。同樣，只要編碼甘露糖PTS的基因具有(carry)甘露糖PTS的功能，可以將所述基因的N末端或C末端延伸或去除。例如，延伸或去除的長(zhǎng)度可以是50或更少，優(yōu)選20或更少，更優(yōu)選10或更少，并且甚至更優(yōu)選5或更少的氨基酸殘基。更具體地，可以^f吏用編碼以下蛋白質(zhì)的基因，所述蛋白質(zhì)具有乂人N末端延伸或去除50-5個(gè)氨基酸的SEQIDNo.2,3和4，和/或從C末端延伸或去除50-5個(gè)氨基酸的SEQIDNo.2,3和4。同樣，能夠通過以下常規(guī)突變處理獲得基因的變體。突變處理方法之一是使用羥胺等，將具有如SEQIDNo.1的核苷酸序列號(hào)72至2767中所示核苷酸序列的基因進(jìn)行體外突變另一種方法使用紫外線或突變處理中通常使用的突變劑例如N-曱基-N，-硝基-N-亞硝基胍(NTG)或曱磺酸乙酯(EthylMethylSulfonate)(EMS)來處理具有所述基因的微生物，例如，埃希氏菌屬的細(xì)菌。這些基因是否編碼具有甘露糖PTS活性的蛋白質(zhì)能夠通過如下方法確認(rèn)例如在適當(dāng)?shù)募?xì)胞中表達(dá)這些基因，并且研究攝取甘露糖的能力是否增加，或采用Chen等的方法研究體外磷酸化活性(Biochemistry1998編碼甘露糖PTS的基因還可以是在嚴(yán)緊條件下與SEQIDNo.l中編號(hào)72至2767的核苷酸序列的互補(bǔ)核苷酸序列或與從這些序列制備的探針雜交的DNA。在本文中，術(shù)語(yǔ)"嚴(yán)緊條件"指形成所謂的特異性雜合體(hybrid),并且不形成非特異性雜合體的條件。盡管難以以數(shù)字清楚地表述這些條件，但是可將這些條件例舉為如下條件在該條件下高度同源的DNA片段，例如，具有不少于80%、90%或95%同源性的DNA相互雜交，并且具有低于以上同源性的DNA不相互雜交?；蛘?，嚴(yán)緊條件的示例是常規(guī)Southern雜交洗滌條件中的條件，所述條件為在相應(yīng)于60°C、IxSSC、0.1°/。SDS,優(yōu)選0.1xSSC、0.1%SDS，并且更優(yōu)選68。C、O.lxSSC、0.1%SDS的溫度和鹽濃度，洗滌一次或優(yōu)選2-3次。含有SEQIDNo.l中編號(hào)72至2767的核苷S吏序列或部分該序列的DNA也可用作探針。這種探針可以使用PCR制備，其中將含有SEQIDNo.l的核苷酸序列的DNA片段用作模板，并且將基于SEQIDNo.l的核苷酸序列制備的寡核苷酸用作引物。例如，當(dāng)使用大約300bp長(zhǎng)的DNA片段作為探針時(shí)，雜交洗滌條件是50。C、2xSSC和0.1。/。SDS。能夠通過使用例如增加細(xì)胞中上述甘露糖PTS編碼基因拷貝數(shù)的遺傳重組技術(shù)來進(jìn)行增強(qiáng)甘露糖PTS編碼基因表達(dá)的修飾。例如，將含有甘露糖PTS編碼基因的DNA片段與在宿主微生物中發(fā)揮功能的載體(優(yōu)選多拷貝型載體)連接，以制備重組DNA，其后將所述重組DNA引入該微生物以將其轉(zhuǎn)化。當(dāng)使用大腸桿菌的manX、Y、Z基因時(shí)，能夠使用PCR(PCR:聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng);參見White,丁.J.etal"TrendsGenet.5，185(1989))來獲得它們,在所述PCR中大腸桿菌的染色體DNA是模板，并且基于SEQIDNo.1的核苷酸序列制備引物，例如，SEQIDNos.5和6中所示的引物。使用基于甘露糖PTS蛋白的序列信息制備引物的PCR，或使用基于上述序列信息制備探針的雜交方法，也可從那些微生物中已知的manX、Y和Z基因或其它種樣么生物中的manX、Y和Z基因，或從那些微生物的染色體DNA或染色體DNA文庫(kù)獲得屬于腸桿菌科的其它微生物的甘露糖PTS編碼基因。另夕卜，可從DNA供體微生物制備染色體DNA。例如，可以使用Saito和Miura的方法等(參見H.SaitoandK.Miura,Biochem.Biophys.Acta,72,619(1963),SeibutsuKogakuJikkensho[BioengineeringExperiments],editedbyTheSocietyofBiotechnology,Japan,pp.97-98，BaifUkan，1992)。其后，通過將通過PCR方法擴(kuò)增的甘露糖PTS編碼基因與能夠在宿主微生物的細(xì)胞中發(fā)揮功能的載體DNA連接來制備重組DNA。能夠在宿主微生物的細(xì)胞中發(fā)揮功能的載體是在所述宿主微生物的細(xì)胞中可自主復(fù)制的載體。在大腸桿菌的細(xì)胞中可自主復(fù)制的載體的實(shí)例包括pUC19、pUC18、pHSG299、pHSG399、pHSG398、pACYC184(pHSG和pACYC可從TakaraBioInc.獲得)、RSF1010、pBR322、pMW219(pMW可從NipponGeneCo"Ltd.獲得)、pSTV29(可從TakaraBioInc.獲得)等?？蓪⑷缟纤鲋苽涞闹亟MDNA依照迄今已經(jīng)報(bào)導(dǎo)的任何轉(zhuǎn)化方法引入微生物。例如，一種方法是通過用氯化鈣處理受體細(xì)菌來增加DNA的透過性，如關(guān)于大腸桿菌K-12所才艮導(dǎo)的(Mandel,M.andHiga，A.,J.Mol.Biol.，53,159(1970))。另一種方法是在從處于生長(zhǎng)期的細(xì)胞制備感受態(tài)細(xì)胞之后引入DNA，如關(guān)于枯草芽孢桿菌CSoc〖〃wsM6"fe)所才艮導(dǎo)的(Duncan,CH.，Wilson,G.A.andYoung,F.E.，Gene,1,153(1977))。同樣，另一種方法是當(dāng)已知宿主微生物與枯草芽孢桿菌、放線菌類(actinomycete)和酵母有關(guān)時(shí)，將其變?yōu)槟軌蛉菀椎財(cái)z取重組DNA的原生質(zhì)體或原生質(zhì)球狀態(tài)，隨后將所述重組DNA引入i亥DNA受體纟田菌中(Chang,S.andChoen,S.N.，Molec.Gen.Genet.,168，111(1979);Bibb,M.J.,Ward,J.M.andHopwood，O.A"Nature,274,398(1978);Hi騰n,A.,Hicks,J.B.andFink,GR.,Pro"Natl.Acad.Sci.USA,751929(1978))。也可使用電脈沖方法轉(zhuǎn)化棒狀桿菌型細(xì)菌組(comyneformgroupofbacteria)(Sugimoto,etal.,JapanesePatentApplicationPublicationNo,Hei2-207791)。能夠通過將如上所述的甘露糖PTS編碼基因的多拷貝引入微生物的染色體DNA中來增加甘露糖PTS編碼基因的拷貝數(shù)。使用以多拷貝存在于所述染色體DNA上的序列作為靶，通過同源重組將編碼甘露糖PTS的基因的多拷貝引入微生物的染色體DNA?？梢允褂么嬖谟诳赊D(zhuǎn)座元件末端的反向重復(fù)序列和重復(fù)DNA作為所述以多拷貝存在于染色體DNA上的序列。同樣，可以將這些基因與存在于染色體上的manXYZ操縱子串聯(lián)連接，或可以將這些基因通過在染色體上的非必需基因上的復(fù)制(duplication)來并入?？梢允褂脺囟让舾休d體或整合載體來引入這些基因。manX、manY和manZ形成操縱子結(jié)構(gòu)(在下文中，稱作"manXYZ操縱子")，若將manXYZ操縱子的拷貝數(shù)增加則更加有效。如JP2-109985A中所披露，可以將甘露糖PTS編碼基因并入轉(zhuǎn)座子，再將所述轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)移以將多拷貝并入染色體DNA。能夠通過使用甘露糖PTS編碼基因的一部分作為探針進(jìn)行Southern雜交來確認(rèn)所述基因是否已經(jīng)轉(zhuǎn)移至染色體上。除了上述的增加基因的拷貝數(shù)，還可通過使用WOOO/18935中描述的方法來增強(qiáng)甘露糖PTS編碼基因的表達(dá)，例如將染色體DNA或質(zhì)粒上的manXYZ搡縱子啟動(dòng)子等表達(dá)調(diào)節(jié)序列用更強(qiáng)的取代，使-35、-10區(qū)接近共有序列，擴(kuò)增能夠增強(qiáng)manXYZ操縱子表達(dá)的調(diào)節(jié)基因，和缺失或減弱將會(huì)減少manXYZ操縱子表達(dá)的調(diào)節(jié)基因。例如，lac啟動(dòng)子、trp啟動(dòng)子、trc啟動(dòng)子、tac啟動(dòng)子、araBA啟動(dòng)子、人噬菌體PR啟動(dòng)子、PL啟動(dòng)子、tet啟動(dòng)子、T7啟動(dòng)子、q>10啟動(dòng)子等是公知的強(qiáng)啟動(dòng)子。還可將堿基取代等引入manXYZ操縱子的啟動(dòng)子區(qū)和SD區(qū)以實(shí)現(xiàn)更強(qiáng)的啟動(dòng)子強(qiáng)度。用于評(píng)估啟動(dòng)子強(qiáng)度的方法的實(shí)例和強(qiáng)啟動(dòng)子的實(shí)例在Godstein等的文章(Prokaryoticpromotersinbiotechnology.Biotechnol.Annu.Rev.，1995,1，105-128)等中描述。另外，已知在核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)和起始密碼子之間的間隔區(qū)中取代幾個(gè)核苷酸，特別在起始密碼子的緊鄰上游的序列中取代幾個(gè)核苦酸，對(duì)mRNA翻譯效率具有強(qiáng)烈影響。可對(duì)這些進(jìn)行修飾。可通過啟動(dòng)子搜索載體(promotersearchvector)和基因分析軟件如GENETYX等確定manXYZ操縱子的啟動(dòng)子等表達(dá)調(diào)節(jié)區(qū)。能夠通過取代或修飾這些啟動(dòng)子來增強(qiáng)甘露糖PTS編碼基因的表達(dá)。能夠例如使用溫度敏感質(zhì)?；騌ed-驅(qū)動(dòng)整為了增加甘露糖PTS蛋白的活性，也可以將增加甘露糖PTS活性的突變引入manX、Y、Z基因。增加manX、Y、Z基因編碼蛋白質(zhì)的活性的突變實(shí)例包括增加manXYZ操縱子轉(zhuǎn)錄量的啟動(dòng)子序列的突變，和增加甘露糖PTS比活性的所述基因編碼區(qū)內(nèi)的突變。<2>產(chǎn)生L-氨基酸的方法本發(fā)明的用于產(chǎn)生L-氨基酸的方法包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明的微生物，在所述培養(yǎng)基或微生物中產(chǎn)生和積累L-氨基酸，和從所述培養(yǎng)基或微生物中收集L-氨基酸。在使用微生物的L-氨基酸的發(fā)酵和產(chǎn)生中通常使用的培養(yǎng)基可用于本發(fā)明。即，可以使用含有碳源、氮源、非有機(jī)離子和所需的其它有機(jī)組分的普通培養(yǎng)基。碳源包括糖，例如葡萄糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、果糖、淀粉水解物等；醇，例如甘油、山梨糖醇(solbitol)等；有機(jī)酸，例如延胡索酸、檸檬酸、琥珀酸等。在這些中，優(yōu)選使用葡萄糖作為碳源。氮源包括無機(jī)銨鹽，例如硫酸銨、氯化銨、磷酸銨等；有機(jī)氮，例如大豆水解產(chǎn)物等；氨氣；氨水等。期望的是有機(jī)微量營(yíng)養(yǎng)物源含有適當(dāng)量的營(yíng)養(yǎng)缺陷物質(zhì)(auxotrophicsubstance),例如維生素B1、L-高絲氨酸等，或酵母提取物等。除這些之外，根據(jù)需要，可以添加小量的磷酸鉀、硫酸鎂、鐵離子、錳離子等。本發(fā)明中使用的培養(yǎng)基可以是天然的或合成的培養(yǎng)基，只要其含有碳源、氮源、無機(jī)離子和需要的其它有機(jī)微量營(yíng)養(yǎng)物。建議將培養(yǎng)在需氧條件下，在24°C-37°C的培養(yǎng)溫度進(jìn)行1-7天，培養(yǎng)期間的pH為5-9?？梢允褂脽o機(jī)或有機(jī)酸或堿物質(zhì)和氨氣等來調(diào)節(jié)pH。使用常規(guī)離子交換樹脂方法、沉淀方法和其它已知方法的組合可從發(fā)酵液中收集L-氨基酸。如果L-氨基酸積累在微生物的細(xì)胞內(nèi)，可通過超聲等將細(xì)胞破碎，隨后通過離心分離去除以獲得上清，使用離子交換樹脂方法等可從所述上清中收集L-氨基酸。還可使用適合于以沉淀產(chǎn)生L-谷氨酸的液體培養(yǎng)基，并且進(jìn)行培養(yǎng)，在培養(yǎng)的同時(shí)將L-谷氨酸產(chǎn)生在培養(yǎng)基中。用于產(chǎn)生L-谷氨酸的條件包括，例如，pH為5.0-4.0,優(yōu)選pH為4.5-4.0,更優(yōu)選pH為4.3-4.0，并且甚至更優(yōu)選pH為4.0。在培養(yǎng)完成之后，可以使用任何已知的回收方法從培養(yǎng)液中收集L-谷氨酸。例如，可以在將細(xì)胞從培養(yǎng)液中去除之后使用濃縮結(jié)晶法收集L-谷氨酸，或通過離子交換層析等收集L-谷氨酸。當(dāng)在產(chǎn)生L-谷氨酸的條件下進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，也可通過離心分離、過濾等收集沉淀在培養(yǎng)液中的L-谷氨酸。在這種情況下，可以將溶解在培養(yǎng)液中的L-谷氨酸結(jié)晶之后再分離。此外，可通過以下分離方法制備以本發(fā)明產(chǎn)生的發(fā)酵液為基礎(chǔ)的動(dòng)物飼料添加劑?？梢允褂肔-氨基酸分離方法例如離心、過濾、傾析、絮凝或這些的組合來去除或減少生物質(zhì)?？梢允褂靡阎椒ɡ缧D(zhuǎn)蒸發(fā)器、薄層蒸發(fā)器、反滲透或納米過濾(FR8613346B、US4,997,754、EP410005B,JP1073646B)來濃縮由本發(fā)明獲得的培養(yǎng)液。隨后使用冷凍干燥、噴霧干燥、噴霧制粒(spraygranulation)的方法，或產(chǎn)生作為動(dòng)物飼料添加劑使用的優(yōu)選為自由流動(dòng)、細(xì)碎的粉末的任何其它方法處理濃縮的培養(yǎng)液。通過使用合適的壓實(shí)或制粒方法，可將這種自由流動(dòng)的細(xì)碎粉末轉(zhuǎn)變成粗粒的、流動(dòng)非常自由的、穩(wěn)定并且基本上無塵的產(chǎn)品?？偠灾?，以這種方法將多于90%的水去除，以使動(dòng)物祠料添加劑中的水濃度按重量計(jì)少于10%，優(yōu)選少于5%。所述飼料添加劑中的蛋白質(zhì)含量按重量計(jì)可少于10%，優(yōu)選少于5%，并且L-蘇氨酸的濃度可多于50%,優(yōu)選多于85%,更優(yōu)選多于95%(US5，431，933、JP1214636B、US4，956，471、US4,777,051、US4946654、US5,840358、US6,238，714、US2005/0025878)。上述分離步驟不必一定進(jìn)行，而是可以按照在技術(shù)上有利的方式組合。實(shí)施例參考實(shí)施例參考實(shí)施例l:構(gòu)建產(chǎn)生L-賴氨酸的細(xì)菌<1-1〉構(gòu)建破壞了編碼賴氨酸脫羧酶的cadA和ldcC基因的菌抹首先，構(gòu)建不產(chǎn)生賴氨酸脫羧酶的菌林。使用WOWO2005/010175中描述的Red-驅(qū)動(dòng)整合方法和X噬菌體切除系統(tǒng)(J.Bacteriol.2002S印；184(18):5200-3.InteractionsbetweenintegraseandexcisionaseinthephageXexcisivenucle叩roteincomplex.ChoEH,GumportRI，GardnerJF)來構(gòu)建將賴氨酸脫羧酶基因破壞的菌抹。賴氨酸脫羧酶由cadA基因(Genbank登錄號(hào)NP—418555.SEQIDNo.42)和1dcC基因(Genbank登錄號(hào)NP—414728.SEQIDNo.44)編碼(W096/17930)。將WC196菌抹用作親本菌株。將WC196菌抹命名為大腸桿菌AJ13069,并且在1994年12月6日以登錄號(hào)FERMP-14690保藏在工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所(目前為，獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許微生物保藏中心；Chuo6，1-1,Higashi1-chome,Tsukuba-shi,Ibaraki-ken305-8566,Japan)),并且根據(jù)布達(dá)佩斯條約在1995年9月29日轉(zhuǎn)為國(guó)際保藏，并給予登錄號(hào)FERMBP-5252。<吏用最初由Datsenko和Wanner開發(fā)的稱為"Red-驅(qū)動(dòng)整合，，的方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2000，vol.97，No.12,pp.6640隱6645)和X喧菌體切除系統(tǒng)(J.Bacteriol.2002Sep;184(18):5200-3)，將編碼賴氨酸脫羧酶的cadA和ldcC基因缺失。根據(jù)"Red-驅(qū)動(dòng)整合"方法，通過使用以源自靶基因的5，末端和抗生素抗性基因的3，末端的合成寡核苷酸引物獲得的PCR產(chǎn)物，可以在單一的步驟中構(gòu)建基因破壞的菌抹。另外，通過人噬菌體切除，可將整合入染色體中的抗生素抗性基因從菌抹中去除。(l)破壞cadA基因?qū)⑾挛拿枋龅膒MW118-attL-Cm-attR質(zhì)粒用作PCR才莫板。通過將X噬菌體的attL和attR附著位點(diǎn)和抗生素抗性基因cat基因以attL-cat-attR的順序插入pMW118(TakaraBioInc.)來獲得pMWl18-attL-Cm-attR(參見WO2005/010175)。attL序列示于SEQIDNo.11,而attR序列示于SEQIDNo.12。使用SEQIDNos.46和47中所示合成寡核苷酸作為引物進(jìn)行PCR，其中相應(yīng)于attL和attR兩個(gè)末端的序列位于所述引物的3'端，并且相應(yīng)于靶基因cadA基因的一部分的序列位于所述引物的5，端。用瓊脂糖凝膠純化擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物，其后通過電穿孔引入含有質(zhì)粒pKD46的大腸桿菌WC196菌抹，所述質(zhì)粒具有溫度敏感復(fù)制能力。質(zhì)粒pKD46(Proc.Natl,Acad.Sci.USA,2000,vol.97，No.12,pp.6640-6645)包含？i噬菌體DNA片段(2154堿基)，并且其包含編碼XRed同源重組系統(tǒng)中Red重組酶的基因(y、(3和exo)，所述基因受阿拉伯糖誘導(dǎo)的ParaB啟動(dòng)子調(diào)控(GenBank/EMBLAccessionNo.J02459,31088th—33241st)。如下制備用于電穿孔的感受態(tài)細(xì)胞。將在含有100mg/L氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中在30°C培養(yǎng)過夜的大腸桿菌WC196菌抹在含有氨芐青霉素(20mg/L)和L-阿拉伯糖(lmM)的5mLSOB培養(yǎng)基中稀釋100倍(MolecularCloning:LabManual2ndedition,Sambrook,J"etal.,ColdSpringHarborLaboratoryPress(1989))。將稀釋產(chǎn)物在30。C培養(yǎng)直到OD600增長(zhǎng)至大約0.6,之后將其濃縮100倍并用10。/。甘油洗滌三次準(zhǔn)備電穿孔。使用70pl感受態(tài)細(xì)胞和大約100ngPCR產(chǎn)物進(jìn)行電穿孔。添加1mLSOC培養(yǎng)基(MolecularCloning:LabManual2ndedition,Sambrook，J"etal"ColdSpringHarborLaboratoryPress(1989))并且在37。C培養(yǎng)2.5小時(shí)，其后在含有Cm(氯霉素)(25mg/L)的L-瓊脂平板培養(yǎng)基上在37°C培養(yǎng)，并且選才奪Cm抗性的重組體。接下來，為了去除pKD46質(zhì)粒，將細(xì)胞在含有Cm的L-瓊脂培養(yǎng)基上在42。C傳代培養(yǎng)兩次，檢測(cè)所得菌落的氨千青霉素抗性，并且獲得了無pKD46的氨千青霉素敏感性菌林。使用PCR確認(rèn)通過氯霉素抗性基因鑒定的突變體中cadA基因的缺失。將cadA缺陷型菌才朱命名為WC196AcadA::att-cat。其后，為了去除引入cadA基因中的att-cat基因，使用在下文描述的輔助質(zhì)粒pMW-intxis-ts。pMW-intxis-ts含有編碼X噬菌體整合酶(Int)的基因(SEQIDNo.13)和編碼切除酶(Xis)的基因(SEQIDNo.15),并且具有溫度壽丈感復(fù)制能力。通過引入pMW-intxis-ts，識(shí)別染色體上的attL(SEQIDNo.11)和attR(SEQIDNo.12),引起重組，并且將attL和attR之間的基因切除，只將attL或attR序列保留在染色體上。使用常規(guī)方法制備如上所述獲得的WC196AcadA::att-cat菌抹的感受態(tài)細(xì)胞，并且用輔助質(zhì)粒pMW-intxis-ts轉(zhuǎn)化，在含有50mg/L氨芐青霉素的L-瓊脂平板培養(yǎng)基上在30°C培養(yǎng)，由此選擇氨芐青霉素抗性菌抹。其后，為了去除pMW-intxis-ts質(zhì)粒，將轉(zhuǎn)化體在L-瓊脂培養(yǎng)基上在42°C傳代培養(yǎng)，檢測(cè)所得菌落的氨芐青霉素抗性和氯霉素抗性，并且獲得了將att-cat和pMW-intxis-ts去除的氯霉素和氨芐青霉素敏感性菌抹。將這種菌抹命名為WC196AcadA。(2)在WC196AcadA菌抹中缺失ldcC基因按照上文描述的技術(shù)，使用具有SEQIDNos.48和49的序列的引物作為ldcC破壞引物將WC196AcadA菌抹中的ldcC基因缺失。由此產(chǎn)生將cadA和ldcC兩者都石皮壞的WC196AcadAAldcC。(3)制備PCR模板和輔助質(zhì)粒如下制備PCR模板pMWU8-attL-Cm-attR和輔助質(zhì)粒pMW-intxis-ts。(3-1)pMWl18-attL-Cm-attR基于pMW118-attL-Cm-attR構(gòu)建pMW118-attL-Tc-attR。制備以下四種DNA片段1)含有attL的BglII-EcoRIDNA片段(120bp)(SEQIDNo.11),其通過PCR擴(kuò)增相應(yīng)于大腸桿菌W3350菌抹(含有X原噬菌體的ATCC31278)染色體的序列而獲得，使用寡核苷酸PI和P2(SEQIDNos.17&18)作為引物(這些引物額外地含有BglII和EcoRI內(nèi)切核酸酶的識(shí)別位點(diǎn))，2)含有attR的PstI-HindIIIDNA片段(182bp)(SEQIDNo.12),其通過PCR擴(kuò)增相應(yīng)于大腸桿菌W3350菌抹(含有X原噬菌體)染色體的序列而獲得，使用寡核苷酸P3和P4(SEQIDNos.19&20)作為引物(這些引物額外地含有Pstl和HindIII內(nèi)切核酸酶的識(shí)別位點(diǎn))，3)pMW118陽(yáng)ter一rrnB的BglII-HindIII大片革殳(3916bp):所述pMWl18-ter—rrnB通過連接以下三個(gè)片段獲得i)含有來自PMW118的AatII-EcoRIpol片段的大片段(2359bp)，通過如下獲得用EcoRI限制性內(nèi)切核酸酶消化pMW118，將其用DNA聚合酶I的幻enow片段處理，其后用AatII限制性內(nèi)切核酸酶消化所述片段，ii)含有氨千青霉素抗性的(ApR)bla基因的pUC19的AatII-BglII小片段(1194bp),通過如下獲得PCR擴(kuò)增相應(yīng)于pUC19質(zhì)粒的序列，使用寡核苷酸P5和P6(SEQIDNos.21&22)作為引物(這些引物額外地含有AatII和BglII內(nèi)切核酸酶的識(shí)別位點(diǎn))，iii)含有轉(zhuǎn)錄終止子ter—rrnB的小BglII-PstIpol片段(363bp)，通過如下獲得PCR擴(kuò)增相應(yīng)于大腸桿菌MG1655菌抹的染色體的區(qū)域，使用寡核苷酸P7和P8(SEQIDNos.23&24)作為引物(這些引物額外地含有BglII和Pstl內(nèi)切核酸酶的識(shí)別位點(diǎn))，4)含有四環(huán)素抗性基因和轉(zhuǎn)錄終止子ter一thrL的pML-Tc-ter一thrL的小EcoRI畫PstI片段(138Sbp)(SEQIDNo.29)。如下獲得pML-Tc-ter一thrL。將pML-MSC(MolBiol(Mosk).2005Sep-Oct;39(5):823-31;Biotechnologiya(Russian)No.5:3-20.))用Xbal和BamHI限制性內(nèi)切核酸酶消化，并且將它的大片段(3342bp)與含有終止子ter—thrL的Xbal-BamHI片段(68bp)連接。所述Xbal-BamHI片段(68bp)相應(yīng)于大腸桿菌MG1655的染色體，并且通過PCR擴(kuò)增獲得，使用寡核苷酸P9和P10(SEQIDNos.25&26)作為引物(這些引物額外地含有Xbal和BamHI內(nèi)切核酸酶的識(shí)別位點(diǎn))。將連接反應(yīng)產(chǎn)物命名為質(zhì)粒pML-ter一thrL。將pML-ter—thrL用Kpnl和Xbal限制性內(nèi)切核酸酶消化，用DNA聚合酶I的Klenow片段處理，其后與含有四環(huán)素抗性基因的pBR322的小EcoRI-Van91I片段(1317bp)連接(將用EcoRI和Van91I限制性內(nèi)切核酸酶消化的pBR322用DNA聚合酶I的Klenow片段處理)。將這種連接的產(chǎn)物命名為質(zhì)4立pML-Tc-ter—thrL。其后，通過連接大BamHI-XbaI片段(4413bp)、PA2啟動(dòng)子(T7喧菌體的原始啟動(dòng)子)、氯霉素抗性的(CmR)cat基因、含有轉(zhuǎn)錄終止子terthrL的人工BglII-XbaIDNA片段(1162bp)和attR構(gòu)建了pMW118-attL-Cm-attR。如下獲得所述人工DNA片段(SEQIDNo.30)。將pML-MSC(MolBiol(Mosk).2005Sep-Oct;39(5):823-31;Biotechnologiya(Russian)No.5:3-20.))用Kpnl和Xbal限制性內(nèi)切核酸酶消化，并且與含有PA2啟動(dòng)子(T7噬菌體的早期啟動(dòng)子)的小Kpnl-Xbal片段(120bp)連接。Kpnl-Xbal片段用PCR通過擴(kuò)增相應(yīng)于T7噬菌體DNA的區(qū)域來獲得，使用寡核苷酸Pll和P12(SEQIDNos.27&28)作為引物(這些引物額外地含有KpnI和XbaI內(nèi)切核酸酶的識(shí)別位點(diǎn))。將所述連接的產(chǎn)物命名為質(zhì)粒pML-PA2-MCS。將Xbal位點(diǎn)從pML-PA2-MCS去除。將產(chǎn)物命名為質(zhì)粒pML-PA2陽(yáng)MCS(Xbal-)。將含有PA2啟動(dòng)子(T7噬菌體的原始啟動(dòng)子)和氯霉素抗性的(CmR)cat基因的pML-PA2-MCS(Xbal-)的小BglII-HindIII片段(928bp)與含有轉(zhuǎn)錄終止子ter—thrL和attR的pMW118-attL-Tc-attR的小Hindlll-Hindlll片段(234bp)連接。使用寡核苷酸P9和P4(SEQIDNos.25&20)作為引物(這些引物含有HindIII和XbaI內(nèi)切核酸酶的識(shí)別位點(diǎn))，通過所述連接混合物的PCR擴(kuò)增來獲得目標(biāo)人工DNA片段(1156bp)。(3-2)pMW-intxis-ts首先，基于X噬菌體DNA(Fermentas)作為模板擴(kuò)增了兩個(gè)DNA片段。第一片段由X噬菌體DNA基因組中的nt37168-38046區(qū)(SEQIDNo.39)組成，并且含有cl阻抑物、Prm和Pr啟動(dòng)子，以及cro基因的前導(dǎo)序列。此片段使用寡核苷酸Pl，和P2，(SEQIDNos.31&32)作為引物通過擴(kuò)增獲得。第二片段由X噬菌體DNA基因組中的nt2780I-29100區(qū)(SEQIDNo.40)組成，其含有來自X噬菌體DNA的xis-int基因。此片段使用寡核苷酸P3，和P4，(SEQIDNos.33&34)作為引物通過？01獲得。全部所述引物含有適當(dāng)?shù)膬?nèi)切核酸酶識(shí)別位點(diǎn)。第一PCR擴(kuò)增片段含有cl阻抑物，將所述片段用Clal限制性內(nèi)切核酸酶消化，其后用EcoRI限制性內(nèi)切核酸酶消化。將第二PCR片段用EcoRI和PstI內(nèi)切核酸酶消化。將質(zhì)粒pMWPlaclacI陽(yáng)ts用BglII內(nèi)切核酸酶消化，用DNA聚合酶I的Klenow片^R處理，其后用Pstl限制性內(nèi)切核酸酶消化。從瓊脂糖凝膠中洗脫pMWPlaclacI-ts的載體片段，并且與切割的PCR擴(kuò)增片段連接。質(zhì)粒pM曹ladacI-ts是pMWPlaclacI的衍生物，含有以下部分1)人工Bgin-HindIIIDNA片段，其含有PlacUV5啟動(dòng)子和在噬菌體T7基因10的RBS調(diào)控下的lacl基因；2)含有氨千青霉素抗性的(ApR)基因的AatII-BglII片段，其通過PCR擴(kuò)增相應(yīng)于pUC19質(zhì)粒的區(qū)域來獲得，使用寡核苷酸P5，和P6，(SEQIDNos.35&36)作為引物(這些引物含有AatII和BglII內(nèi)切核酸酶的識(shí)別位點(diǎn))；3)AatII-HindIII片段，其含有重組質(zhì)粒pMW118-ter_rrnB的AatII-PvuI片段。如下構(gòu)建所述質(zhì)粒pMWl18-ter一rrnB。使用含有適當(dāng)?shù)膬?nèi)切核酸酶識(shí)別位點(diǎn)的寡核苷酸P7，和P8，(SEQIDNos.37&38)作為引物，通過PCR擴(kuò)增相應(yīng)于大腸桿菌MG1655菌林的染色體的區(qū)域來獲得含有終止子ter一rrnB的PstI-HindIII片段。在連接之前，將pMW118和ter—rrnB片段(SEQIDNo.41的互補(bǔ)鏈)分別用Pvul或Pstl消化，用DNA聚合酶I的Klenow片段處理以將末端平端化，其后用AatII或HindIII內(nèi)切核酸酶消化。在pMWPlaclacI-ts突變體的構(gòu)建中，將質(zhì)粒pMWPlaclacI的AatII-EcoRV片段用含有pSC101復(fù)制子的par、ori和r印Ats基因的質(zhì)粒pMAN997的AatII-EcoRV片段取代(AppliedandEnvironmentalMicrobiology,June2005,p.3228-32)。實(shí)施例1:構(gòu)建用于增加甘露糖PTS活性的質(zhì)粒<1-1>構(gòu)建用于manXYZ過量表達(dá)的質(zhì)粒已經(jīng)測(cè)定大腸桿菌染色體(大腸桿菌K-12菌株)的全基因組序列(Science,277,1453-1474(1997))?；趍anXYZ基因的核苷酸序歹'J(Genbank登錄號(hào)NP416331、416332、416333),使用具有Sse83S71位點(diǎn)的SEQIDNo.5的合成寡核苷酸作為5'引物，和具有Xbal位點(diǎn)的SEQIDNo.6的合成寡核苷酸作為3'引物，使用大腸桿菌MG1655菌林的染色體DNA作為模板進(jìn)行PCR,并且獲得了含有manXYZ基因的基因片段。將純化的PCR產(chǎn)物與已經(jīng)用Sse8387I(TakaraShuzo)和Xbal(NipponGeneCo.,Ltd.)消化的載體pMW219連接，以構(gòu)建用于manXYZ過量表達(dá)的質(zhì)粒pM-manXYZ。這種質(zhì)粒受lac啟動(dòng)子的調(diào)控，并且將manXYZ基因置于所述lac啟動(dòng)子的下游。將pM-manXYZ用Sse83871和EcoRI消化，收集和純化manXYZ基因片段，并且連接至已經(jīng)用Sse83871和EcoRI消化的載體pSTV29(TakamShuzo)。以這種方法，構(gòu)建了用于過量表達(dá)的質(zhì)粒pS-manXYZ。<1-2>構(gòu)建用于ptsG過量表達(dá)的質(zhì)粒按照與上文所述manXYZ基因的相同方式，構(gòu)建了用于表達(dá)ptsG(SEQIDNo.50)基因的質(zhì)粒。使用含有HindIII位點(diǎn)的SEQIDNo.7的合成寡核苦酸作為5'引物，和含有Xbal位點(diǎn)的SEQIDNo.8的合成寡核芬酸作為3'引物，用大腸桿菌MG1655菌抹的染色體DNA作為模板進(jìn)行PCR，并且將其用限制性內(nèi)切核酸酶HindIII和XbaI處理，由此獲得了含有ptsG的基因片段。將純化的PCR產(chǎn)物與已經(jīng)用HindIII和Xbal消化的載體pMW219連接，以構(gòu)建用于擴(kuò)增ptsG的質(zhì)粒pM-ptsG。這種質(zhì)i)(i受lac啟動(dòng)子的調(diào)控，并且將ptsG基因置于所述lac啟動(dòng)子的下游。按照與manXYZ相同的方式，將ptsG基因片段從pM-ptsG中切除，并且連接至載體pSTV29。構(gòu)建了用于ptsG過量表達(dá)的質(zhì)粒pS-ptsG。實(shí)施例2:構(gòu)建過量表達(dá)manXYZ基因的菌抹和評(píng)估所述菌抹的L-賴氨酸產(chǎn)生作為產(chǎn)生L-賴氨酸的大腸桿菌菌林，將WC196AldcCAcadA(pCABD2)菌抹用作親本菌抹，將含有dapA、dapB和lysC基因的產(chǎn)生Lys的質(zhì)粒pCABD2(WO01/53459)引入?yún)⒖紝?shí)施例1中的WC196AldcCAcadA菌抹。用實(shí)施例1中構(gòu)建的manXYZ-擴(kuò)增質(zhì)粒pM-manXYZ和ptsG-擴(kuò)增質(zhì)粒pM-ptsG,和對(duì)照質(zhì)粒pMW219轉(zhuǎn)化WC196AldcCAcadA(pCABD2)菌抹，獲得了卡那霉素抗性菌抹。在確認(rèn)已將指定的質(zhì)粒引入后，將引入了manXYZ過量表達(dá)質(zhì)粒pM-manXYZ的菌才朱命名為WC196AldcCAcadA(pCABD2，pM-manXYZ)菌抹；將引入了ptsG過量表達(dá)質(zhì)粒pM-ptsG的菌抹命名為WC196AldcCAcadA(pCABD2，pM-ptsG)菌抹；并且將引入了對(duì)照質(zhì)粒pMW219的菌林命名為WC196AldcCAcadA(pCABD2，pMW219)菌林。將如上所述構(gòu)建的菌抹在含有25mg/L卡那霉素的L培養(yǎng)基中在37°C培養(yǎng)至最終成為OD600=0.6。其后，將40%甘油溶液以與培養(yǎng)液相等的量添加至所述培養(yǎng)物并攪動(dòng)，再吸取適量并且貯藏在-80。C。將其稱為甘油原種(glycerolstock)。在將這些菌抹的甘油原種融化之后，將各IOO^L均勻地鋪在含有25mg/L卡那霉素的L平板上，并且將其在37。C培養(yǎng)24小時(shí)。將平板上大約l/8的細(xì)胞接種至500mLSakaguchi搖瓶中包含的具有25mg/L卡那霉素的20mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，并且使用往復(fù)搖動(dòng)培養(yǎng)裝置在37。C培養(yǎng)24小時(shí)。培養(yǎng)之后，使用Biotech-analyzerAS210(SakuraSeiki)測(cè)量培養(yǎng)基中積累的L-賴氨酸的量。在第24小時(shí)存在的L-賴氨酸和OD示于表2。如表2所示，與未用manXYZ基因轉(zhuǎn)化的WC196AldcCAcadA(pCABD2，pMW219)菌抹相比，WC196AldcCAcadA(pCABD2,pM-manXYZ)菌抹中積累了大量的L-賴氨酸。在產(chǎn)生賴氨酸的量上的改進(jìn)還在與用ptsG基因轉(zhuǎn)化的WC196AldcCAcadA(pCABD2，pM-ptsG)菌抹的比較中得到確認(rèn)。這樣的數(shù)據(jù)顯示在L-賴氨酸的產(chǎn)生中manXYZ基因的過量表達(dá)比ptsG的過量表達(dá)更有效。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>培養(yǎng)期24小時(shí)用于L-賴氨酸產(chǎn)生的培養(yǎng)基:葡萄糖40g/L硫酸銨24g/L磷酸二氫鉀1.0g/L硫酸鎂7-水合物1.0g/L硫酸亞鐵今7-水合物0.01g/L硫酸錳4*7-水合物0.01g/L酵母提取物2.0g/L碳酸鉤30g/L用KOH調(diào)節(jié)至pH7.0,并且在115。C滅菌10分鐘。將葡萄糖和MgS04.7H20單獨(dú)滅菌。實(shí)施例3:manXYZ過量表達(dá)對(duì)產(chǎn)生L-谷氨酸的埃希氏菌屬細(xì)菌菌林的多響將產(chǎn)生L-谷氨酸的大腸桿菌菌抹AJ12949菌抹用作親本菌抹。AJ12949菌抹具有減少的a-酮戊二酸脫氫酶活性，并且在1993年12月28日以登錄號(hào)FERMP-14039保藏在工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所(目前為，獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許微生物保藏中心；Chuo6，1-，Higashil-chome,Tsukuba-shi,Ibaraki-ken305-8566,Japan),并且才艮據(jù)布達(dá)佩斯條約在1994年11月11日轉(zhuǎn)為國(guó)際保藏，并給予登錄號(hào)FERMBP-4881。用實(shí)施例1中構(gòu)建的manXYZ過量表達(dá)質(zhì)粒pS-manXYZ,和對(duì)照質(zhì)粒pSTV29轉(zhuǎn)化AJ12949菌抹，由此獲得氯霉素抗性菌抹。在確認(rèn)已將指定的質(zhì)粒引入之后，將引入了manXYZ過量表達(dá)質(zhì)粒pS-manXYZ的菌抹命名為AJ12949(pS-manXYZ);并且將引入了對(duì)照質(zhì)粒pSTV29的菌才朱命名為AJ12949(pSTV29)。將AJ12949(pS-manXYZ)菌抹和AJ12949(pSTV29)菌抹在含有20mg/L氯霉素的L培養(yǎng)基中在37。C培養(yǎng)直至達(dá)到OD600=0.6。此后，將40%甘油溶液以等于培養(yǎng)液的量添加至所述培養(yǎng)物并攪動(dòng)，再吸取適量以獲得甘油原種并且貯藏在-80°C。在將這些菌株的甘油原種融化之后，將各100pL均勻地鋪在含有20mg/L氯霉素的L平板中，并將其在37。C培養(yǎng)24小時(shí)。將獲得的平板上大約1/8的細(xì)胞接種至500mLSakaguchi搖瓶中包含的具有20mg/L氯霉素的20mL下述發(fā)酵培養(yǎng)基中，并且使用往復(fù)搖動(dòng)培養(yǎng)裝置在37。C培養(yǎng)40小時(shí)。培養(yǎng)之后，使用Biotech-analyzerAS210(SakuraSeiki)測(cè)量培養(yǎng)基中積累的L-谷氨酸的量。在第40小時(shí)的OD和已經(jīng)積累的L-谷氨酸示于表3。如表3中所示，與未用manXYZ基因轉(zhuǎn)化的AJ12949(pSTV29)菌抹相比，在AJU949CpS-manXYZ)菌抹中積累了大量的L-谷氨酸。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>培養(yǎng)期40小時(shí)用于L-谷氨酸產(chǎn)生的培養(yǎng)基葡萄糖40g/L硫酸銨磷酸二氬鉀硫酸鎂7-水合物硫酸亞鐵4.7-水合物硫酸錳4*7-水合物酵母提取物碳酸鉤20g/L1.0g/L1.0g/L0.01g/L0.01g/L2.0g/L30g/L用KOH調(diào)節(jié)至pH7.0，并且在115。C滅菌IO分鐘。將葡萄糖和MgS04.7H20單獨(dú)滅菌。另外，在培養(yǎng)物溫度降至60。C或更低后，添加已用DISMIC-25cs0.2mm濾器(ADVANTEC)滅菌的鹽酸硫胺素溶液，以獲得0.01g/L的終濃度。實(shí)施例4:甘露糖PTS過量表達(dá)對(duì)產(chǎn)生L-蘇氨酸的埃希氏菌屬細(xì)菌菌抹的影響作為用于產(chǎn)生L-蘇氨酸的manXYZ過量表達(dá)的親本菌抹，可使用B-5318菌才朱。將B-5318菌林在1990年5月3日以登錄號(hào)VKPMB-5318保藏在俄羅斯國(guó)立工業(yè)微生物保藏中心(VKPM)，GNIIGenetika(Russia,117545Moscow,1DorozhnyProezd,1)。從B-5318構(gòu)建manXYZ過量表達(dá)的菌抹，所述構(gòu)建可使用實(shí)施例1中描述的質(zhì)粒進(jìn)行。用實(shí)施例1中使用的manXYZ過量表達(dá)質(zhì)粒pS-manXYZ和對(duì)照質(zhì)粒pSTV29轉(zhuǎn)化B-5318菌抹，并且獲得了氯霉素抗性菌抹。在確認(rèn)了已將指定的質(zhì)粒引入后，將含有manXYZ過量表達(dá)質(zhì)粒manXYZ的菌抹命名為B-5318(pS-manXYZ);并且將含有對(duì)照質(zhì)粒pSTV29的菌抹命名為B-5318(pSTV29)。將B-5318(pS-manXYZ)菌抹和B-5318(pSTV29)菌抹在含有20mg/L氯霉素的L培養(yǎng)基中在37。C培養(yǎng)至OD600=0.6。此后，將等體積的40%甘油溶液添加至所述培養(yǎng)物并攪動(dòng)，再吸取適量以獲得甘油原種并且貯藏在-80。C。在將這些菌抹的甘油原種融化之后，將各100iaL均勻地鋪在含有20mg/L氯霉素的L平板中，并且將其在37°C培養(yǎng)24小時(shí)。將獲得的平板上大約1/8的細(xì)胞接種至500mLSakaguchi搖瓶中具有20mg/L氯霉素的20mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，并且使用往復(fù)搖動(dòng)培養(yǎng)裝置在37。C培養(yǎng)40小時(shí)。培養(yǎng)之后，使用高效液相層析測(cè)量培養(yǎng)基中積累的L-蘇氨酸的量。在第40小時(shí)存在的L-蘇氨酸和OD示于表4。如該表中所示，與未用manXYZ基因轉(zhuǎn)化的B-5318(pSTV29)菌株相比，在B-5318(pS-manXYZ)菌林中積累了大量的L-蘇氨酸。表4細(xì)菌菌才朱OD600L-蘇氨酸(g/L)B-5318(pSTV29)11.76.1B-5318(pS-manXYZ)15.67.4用于L-蘇氨酸的產(chǎn)生的培養(yǎng)基葡萄糖60g/L石克酸銨16g/L碌,酸二氫鉀0.7g/L硫酸鎂7-水合物1.0g/L硫酸亞鐵7-水合物0.01g/L硫酸錳7-水合物0.01g/L酵母提取物0.5g/L鹽酸好u胺素0.2mg/LL-異亮氨酸0.05g/L碳酸4丐30g/L用KOH調(diào)節(jié)至pH7.0,在115。C滅菌IO分鐘。將葡萄糖和MgS04.7H20單獨(dú)滅菌。通過在180。C千燥加熱3小時(shí)將氫氧化鉀滅菌。在培養(yǎng)物溫度降低至60。C或更低之后，添加已用DISMIC-"cs0.2mm濾器(ADVANTEC)滅菌的鹽酸硫胺素溶液以獲得0.2mg/L的終濃度。實(shí)施例5:甘露糖PTS的增強(qiáng)對(duì)產(chǎn)生L-谷氨酸的泛菌屬細(xì)菌菌抹的影響作為甘露糖PTS擴(kuò)增的產(chǎn)生L-谷氨酸的菌抹的親本菌抹，可使用Pa"to^a"朋afeAJ13601菌林。所述AJ13601菌抹在1999年8月18曰以登錄號(hào)FERMP-17516保藏在通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所(NationalInstituteofBioscienceandHumanTechnology,AgencyofIndustrialScienceandTechnology,MinistryofEconomy,TradeandIndustry)(1-3，Higashil-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken305-8566),并且根據(jù)布達(dá)佩斯條約在2000年7月6日轉(zhuǎn)為國(guó)際保藏，并獲得登錄號(hào)FERMBP-7207。使用實(shí)施例1中描述的質(zhì)粒能夠從產(chǎn)生L-谷氨酸的細(xì)菌構(gòu)建manXYZ過量表達(dá)的菌抹。在L-谷氨酸產(chǎn)生培養(yǎng)基中培養(yǎng)甘露糖PTS過量表達(dá)的菌抹，其后使用往復(fù)搖動(dòng)培養(yǎng)設(shè)備進(jìn)行培養(yǎng)。在培養(yǎng)之后，使用Biotech-analyzerAS210(SakuraSeiki)測(cè)量培養(yǎng)基中積累的L-谷氨酸的量以確認(rèn)L-谷氨酸的積累是否增加。通過這種方法，能夠獲得具有改進(jìn)的產(chǎn)生L-谷氨酸能力的甘露糖PTS過量表達(dá)的菌抹。權(quán)利要求1.用于產(chǎn)生L-氨基酸的方法，其包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)腸桿菌科的微生物，所述微生物具有產(chǎn)生L-氨基酸的能力，并且經(jīng)修飾而將甘露糖PTS活性增強(qiáng)；和從所述培養(yǎng)基或微生物中收集L-氨基酸。2.才艮據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中通過增加編碼甘露糖PTS的manXYZ基因的拷貝數(shù)，或修飾所述基因的表達(dá)調(diào)節(jié)序列，或它們的組合，來《奮飾所述微生物以增強(qiáng)該基因的表達(dá)。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中所述manXYZ基因編碼選自下組的蛋白質(zhì)(A)選自下組SEQIDNos.2、3、4的氨基酸序列，和它們的組合，(B)選自下組的蛋白質(zhì)SEQIDNos.2、3和4的氨基酸序列，所述蛋白質(zhì)包含一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失、插入、添加或倒位并且具有甘露糖PTS活性。4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的方法，其中所述manXYZ基因是選自下組的DNA:(a)包含SEQIDNo.1中核苷酸號(hào)72至2767的核苷酸序列的DNA,(b)在嚴(yán)緊條件下，與SEQIDNO.1中核苷酸號(hào)72至的核苷酸序列的互補(bǔ)序列或能夠從所述核苷酸序列制備的探針雜交的DNA，并且所述DNA編碼具有甘露糖PTS活性的蛋白質(zhì)。5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的方法，其中所述微生物是埃希氏菌屬或泛菌屬的細(xì)菌。6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的方法，其中所述L-氨基酸選自下組L-賴氨酸、L-蘇氨酸、L-谷氨酸和它們的組合。全文摘要提供用于產(chǎn)生L-氨基酸的方法，所述方法包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)具有產(chǎn)生L-氨基酸的能力并且經(jīng)修飾而將甘露糖PTS活性增強(qiáng)的腸桿菌科的微生物，在所述培養(yǎng)基或細(xì)胞中積累L-氨基酸，和從所述培養(yǎng)基或細(xì)胞中收集L-氨基酸。文檔編號(hào)C12P13/04GK101273139SQ20068003587公開日2008年9月24日申請(qǐng)日期2006年9月25日優(yōu)先權(quán)日2005年9月27日發(fā)明者城永佑志,植田拓嗣申請(qǐng)人:味之素株式會(huì)社