專利名稱：Fas結(jié)合抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及識(shí)別人脂肪酸合酶(hFAS)的單克隆抗體(MAb)。還提供了包含所述 MAb的組合物、衍生物和試劑盒以及在各種應(yīng)用中使用所述MAb的方法。
背景技術(shù)：
在乳腺癌患者腫瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的預(yù)后分子經(jīng)鑒定為脂肪酸合酶(FAS)。參見(jiàn) Kuhajda等人(1994) "Fatty acid synthesis: a potential selective target for antineoplastic therapy." Proc Natl Acad Sci USA.， 91(14):6379-83。 FAS是一種約270kDa的多肽， 腫瘤的脂肪酸合酶能以丙二酸單酰CoA依賴方式氧化NADPH，合成的脂肪酸含有 乙酰CoA、丙二酸單酰CoA來(lái)源的80%棕櫚酸酯、10%肉豆蔻酸酯和10%硬脂酸酉旨， 氧化NADPH的比活性是每分鐘每毫克可氧化624納摩NADPH。對(duì)脂肪酸合酶表達(dá) 升高腫瘤細(xì)胞系的研究證明隨著脂肪酸合酶增加伴有全部細(xì)胞的內(nèi)源性脂肪酸合成 增加。FAS還被鑒定為是細(xì)胞淺藍(lán)菌素介導(dǎo)的?；视秃铣梢种频囊种谱饔冒尹c(diǎn)。 隨后，認(rèn)識(shí)到為FAS在酶介導(dǎo)的脂肪酸重頭合成中起著關(guān)鍵作用。已證明FAS表達(dá) 與除乳腺癌以外的人惡性腫瘤，包括結(jié)直腸癌和前列腺癌的癌發(fā)生有關(guān)。參見(jiàn)例如， Shurbaji等人(1996) "Immunohistochemical detection of a fatty acid synthase(OA-519) as a predictor of progression of prostate cancer(用免疫組化方法檢測(cè)脂肪酸合酶作為前 列腺癌的預(yù)后因素V' Hum Pathol. 27(9):917-21，此文中，通過(guò)免疫組織化學(xué)方法采 用親合純化的FAS抗體來(lái)檢測(cè)原發(fā)性前列腺癌。
已鑒定到兩種結(jié)合FAS的原型單克隆抗體(MAb),將它們用于酶聯(lián)免疫吸附試 驗(yàn)(ELISA)來(lái)定量測(cè)定FAS。參見(jiàn)Wang等，"A new model ELISA， based on two monoclonal antibodies, for quantification of fatty acid synthase(—禾中依據(jù)雙單抗，定量 測(cè)定脂肪酸合酶的新型ELISA方法)."(2002) J Immunoassay Immunochem. 23(3):279-92。將鑒定為M6的MAb用作ELISA中的捕捉抗體，而標(biāo)記鑒定為M3的MAb用作檢測(cè)抗體。Wang等人("用于定量測(cè)定脂肪酸合酶的雙位 點(diǎn)ELISA法."Clin Chim Acta. 304(1-2):107-15， (2002))提出，可認(rèn)為依據(jù)這兩種 MAb聯(lián)合ELISA方法是對(duì)以前依據(jù)多克隆-單克隆聯(lián)合的ELISA試驗(yàn)的一種改進(jìn)。
Innocenzi等人("Fatty acid synthase expression in meianoma(黑色素并中月旨肪酸合 酶的表達(dá))."J Cutan Pathol. 30(l):23-8， (2003))也描述了采用M6抗體的實(shí)驗(yàn)。Krontiras 等人("Fatty acid synthase expression is increased in neoplastic lesions of the oral tongue(口舌腫瘤病損中脂肪酸合酶表達(dá)升高)."Head Neck 2跳325-9， (1999))描述 了用馬里蘭州巴爾的摩市查克特公司(ChekTec)的抗體，將M3和M6用作抗-OA-519 抗體。Pizer等人("Increased fatty acid synthase as a therapeutic target in androgen-inde pendent prostate cancer progression(升高的脂肪酸合酶可作為治療雄激素非依賴性前 列腺癌發(fā)展的靶標(biāo))."Prostate 47(2): 102-10 (2001))采用下面將要討論的美國(guó)專利 5,759,791和其涉及的美國(guó)專利5,864,011中所述的抗體。
本文中對(duì)文獻(xiàn)的上述討論和引用并不是承認(rèn)其中任何一項(xiàng)是現(xiàn)有技術(shù)。所有對(duì) 日期的陳述或?qū)ξ墨I(xiàn)內(nèi)容的描述均依據(jù)申請(qǐng)人所能得到的信息，不構(gòu)成任何對(duì)日期 或文獻(xiàn)內(nèi)容正確性的承認(rèn)。
發(fā)明簡(jiǎn)述
本發(fā)明提供了能識(shí)別人脂肪酸合酶(hFAS)的表位，從而能夠結(jié)合hFAS多肽的抗 體，包括其片段。本發(fā)明的實(shí)施方式包括能以先前未知的不同程度結(jié)合全長(zhǎng)特定hFAS 多肽的抗體。其它實(shí)施方式包括能結(jié)合一種或多種hFAS多肽但排斥其它hFAS多肽 的抗體。本發(fā)明還提供組合物和制品，制造設(shè)備、裝置和器材，和包含本文所述抗 體的方法。本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方式包括所述抗體的改良形式或衍生形式，包括作 為非限制性例子的雜交抗體、改性抗體、嵌合抗體、偶聯(lián)抗體、單鏈抗體和人源化 抗體。其它改良形式包括本發(fā)明抗體的各部分，包括能結(jié)合hFAS多肽的Fab、 Fab'、 F(ab')2和Fv片段。
因此在第一方面，本發(fā)明提供結(jié)合hFAS多肽的抗體，包括其片段，它們不同 于先前已知的FAS結(jié)合抗體。在一些實(shí)施方式中，所述抗體是單克隆抗體，即含有 均質(zhì)性抗體群的抗體組合物或制品，而不論該抗體群的來(lái)源或制造或制備該抗體群 的方法。在其它實(shí)施方式中，所述抗體是單克隆抗體的混合物，因而混合物中的抗 體群是異質(zhì)性的。
本發(fā)明的單克隆抗體具有獨(dú)特的結(jié)合特征，其結(jié)合特異性與先前已知的hFAS 結(jié)合抗體如M3和M6單克隆抗體，以及美國(guó)專利5，759，791中所述的由雜交瘤細(xì)胞0A-519-M1或HPR-2產(chǎn)生的以ATCC登錄號(hào)10853存放的抗-Hpr單克隆抗體不同。 盡管已觀察到抗-Hpr抗體與FAS有交叉反應(yīng)，但本發(fā)明只涉及在一些實(shí)施方式中不 與Hpr交叉反應(yīng)的抗-hFAS抗體。
不想受理論的束縛和為了增進(jìn)對(duì)本發(fā)明的理解，認(rèn)為結(jié)構(gòu)上本發(fā)明的抗體與先 前已知的hFAS結(jié)合抗體不同，在于參與結(jié)合hFAS多肽的CDR(互補(bǔ)決定區(qū))中至少 有一個(gè)不同。該觀點(diǎn)部分依據(jù)已充分證明的其各組件的結(jié)構(gòu)排列，包括抗體結(jié)構(gòu)中 V^和Vh高変區(qū)所含的CDR不同。當(dāng)然本發(fā)明的抗體與已知的hFAS結(jié)合抗體不同， 還可以有1個(gè)以上的CDR不同和/或一個(gè)或多個(gè)CDR內(nèi)1個(gè)以上氨基酸位點(diǎn)的不同。 這些差異使本發(fā)明抗體具有能結(jié)合與先前已知抗FAS抗體不同的表位的特征。
因此，本發(fā)明提供的hFAS結(jié)合抗體的CDR與先前的FAS結(jié)合抗體如M3或 M6抗體的CDR不同。本發(fā)明的CDR可以分離自該抗體正常所見(jiàn)的CDR?？赏ㄟ^(guò) 蛋白水解切割使CDR與該抗體分離，或測(cè)序和分離編碼抗體CDR(或CDR部分)的 核酸序列。作為非限制性例子，可將此CDR或者包含此CDR的多肽與另一多肽重 組連接形成融合蛋白，或用其取代另一抗體的CDR形成嵌合抗體(或其片段)?？捎?技術(shù)人員已知的方法，包括將編碼CDR的核酸序列摻入編碼融合蛋白或嵌合抗體的 更長(zhǎng)序列中的重組DNA技術(shù)，來(lái)實(shí)現(xiàn)這類(lèi)形式的CDR及其應(yīng)用。
本發(fā)明抗體所提供的不同結(jié)合特異性對(duì)其應(yīng)用有利和具有其優(yōu)點(diǎn)。在一些實(shí)施 方式中，只對(duì)hFAS多肽具有較高特異性而對(duì)非hFAS多肽交叉反應(yīng)較低的抗體可更 有利地用于抗體所要結(jié)合的hFAS多肽處于高度復(fù)雜的環(huán)境的方法中。這類(lèi)環(huán)境的非 限制性例子包括i)使含有許多其它非hFAS抗原的樣品與抗體接觸進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡 (或免疫印跡)時(shí)ii)使存在許多其它非hFAS抗原的樣品與抗體結(jié)合進(jìn)行免疫組織化學(xué) (IHC)時(shí)。在其它實(shí)施方式中，對(duì)全長(zhǎng)hFAS多肽具有相對(duì)較高特異性，而不會(huì)與較 短hFAS片段發(fā)生較低交叉反應(yīng)的抗體可有利地用來(lái)檢測(cè)全長(zhǎng)分子?；蛘?，能識(shí)別較 短hFAS片段或者也能識(shí)別全長(zhǎng)或其它片段的抗體也可有利地用于檢測(cè)一些樣品(包 括一些病人而非其它病人的生物樣品)中可能存在的hFAS蛋白水解片段。
另外的實(shí)施方式中，所述抗體可對(duì)變性或固定形式的hFAS多肽具有特異性。 一個(gè)非限制性例子是對(duì)用去污劑變性的全長(zhǎng)hFAS或其蛋白水解片段具有特異性的 抗體，可用于例如SDS凝膠電泳后的蛋白質(zhì)印染。另一個(gè)非限制性例子是對(duì)所用試 劑例如但不限于福爾馬林、甲醛、低聚甲醛、戊二醛和/或醇固定的全長(zhǎng)hFAS或 其蛋白水解片段具有特異性的抗體，例如可用于IHC的細(xì)胞或組織的固定樣品，包 括用福爾馬林固定和石蠟包埋(FFPE)的樣品。在第二方面，提供了包含本發(fā)明抗體的組合物和制品。所述組合物或制品可以 是較為粗制形式的那些組合物或制品，如含有本發(fā)明抗體和用于產(chǎn)生該抗體的細(xì)胞
和細(xì)胞組分，以及含有能結(jié)合一種或多種hFAS多肽的抗體混合物的那些組合物或制
品。在其它實(shí)施方式中，所述組合物或制品可以是用于本文所述試劑盒或方法中的 那些組合物或制品。其它實(shí)施方式中，所述組合物或制品是那些可將本發(fā)明抗體應(yīng) 用或包被器材的那些組合物或制品，如用來(lái)將該抗體固定在固體相上的抗體溶液。
當(dāng)然，固定形式的本發(fā)明抗體也是本文所提供的一方面內(nèi)容。非限制性例子包 括結(jié)合于例如多孔、微孔(各孔平均直徑小于約1微米)或大孔(各孔平均直徑大于約
IO微米)材料等固相的抗體，如結(jié)合于膜、纖維素、硝酸纖維素或玻璃纖維；例如由 瓊脂糖或聚丙烯酰胺或乳膠制成的小珠；或例如由聚苯乙烯制成的平皿、板或孔表 面的抗體。
另一方面，本發(fā)明提供了包括使用本發(fā)明抗體或抗體組合的方法。如上所述， 將抗體用于蛋白質(zhì)印跡或IHC的方法認(rèn)為是本發(fā)明的一部分。其它方法包括本領(lǐng)域 已知的那些方法，如酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)和放射免疫試驗(yàn)(RIA)。然而，更概括 地說(shuō)本發(fā)明還考慮了在任何情況下檢測(cè)hFAS多肽的方法。所有這類(lèi)方法具有一個(gè)共 同特點(diǎn)或機(jī)制，即或基于i)用本發(fā)明的抗體來(lái)檢測(cè)hFAS多本身或ii)檢測(cè)本發(fā)明抗體 與hFAS多肽的復(fù)合物。這兩種類(lèi)型的檢測(cè)都可最終解決是否存在hFAS多肽的問(wèn)題。 而且，因?yàn)椴捎昧吮景l(fā)明抗體來(lái)檢測(cè)，所述方法都可視作針對(duì)hFAS的免疫試驗(yàn)。
可進(jìn)行直接或間接(以及定量或定性)檢測(cè)來(lái)表明是否存在hFAS多肽或其水平。 或者，可用該檢測(cè)來(lái)確定不存在hFAS多肽。在本發(fā)明方法中，本發(fā)明抗體會(huì)在結(jié)合 hFAS多肽的免疫反應(yīng)條件下形成復(fù)合物?；蛘?，本發(fā)明方法可以只簡(jiǎn)單地涉及檢測(cè) 在任何條件下抗體與hFAS多肽，形成的復(fù)合物。非限制性例子是檢測(cè)在體內(nèi)器官或 細(xì)胞中形成復(fù)合物的方法。
在一些實(shí)施方式中，檢測(cè)生物學(xué)樣品，如病人或個(gè)體的液體或含細(xì)胞樣品中是 否存在hFAS。所述樣品可以是懷疑含有一種或多種hFAS多肽的樣品，此時(shí)可利用 本發(fā)明的方法初步表明其是否存在，或者此樣品可以是先前已用本發(fā)明方法或另一 種方法測(cè)定含有一種或多種hFAS多肽的樣品，此時(shí)可用本發(fā)明方法作為基礎(chǔ)來(lái)確認(rèn) 或否定先前的測(cè)定。
本發(fā)明還能檢測(cè)含有hFAS多肽的復(fù)合物，作為工具來(lái)診斷疾病如癌癥的存在。 根據(jù)hFAS的存在或其水平與疾病的相關(guān)性，該方法還可利用所述檢測(cè)來(lái)監(jiān)測(cè)病人的 疾病病程或復(fù)發(fā)。 一些實(shí)施方式中，所述疾病是乳腺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、卵巢癌、肺癌、皮膚癌(黑色素瘤)、口腔粘膜癌或鱗狀組織癌、生殖-泌尿道癌、胃腸道
癌或任何其它表達(dá)FAS的惡性腫瘤如肉瘤或淋巴瘤/白血病。檢測(cè)hFAS多肽還可作 為患者臨床護(hù)理或醫(yī)療處理的一部分。在一些實(shí)施方式中，根據(jù)患者樣品中hFAS多 肽的存在或其水平，該方法可利用所述檢測(cè)來(lái)確定是否要給予患者FAS抑制劑。其 它實(shí)施方式中，根據(jù)對(duì)樣品中hFAS多肽存在或其水平的診斷，可直接作出治療疾病 (包括但不限于上述那些疾病)的決定，給予FAS抑制劑或其它藥物來(lái)治療疾病緩解 癥狀。非限制性靶向FAS的化療例子包括美國(guó)專利5,759,837和US 2002/0173447 Al 中所述的那些。
在其它實(shí)施方式中，根據(jù)樣品中存在hFAS多肽或其水平可作出預(yù)防可能患上 疾病的決定，給予FAS抑制劑或其它藥物來(lái)預(yù)防疾病發(fā)生或者當(dāng)疾病發(fā)生時(shí)減輕其 嚴(yán)重性或程度。因此，本發(fā)明的此方面涉及根據(jù)疾病發(fā)生或發(fā)展時(shí)抑制FAS介導(dǎo)的 脂肪酸合成的化療預(yù)防疾病領(lǐng)域。
其它臨床方法包括全部或部分采用FAS結(jié)合抗體作為治療劑的那些方法。這類(lèi) 方法包括給予這種抗體，或其FAS結(jié)合片段。在一些實(shí)施方式中，所述抗體或其片 段，能抑制或減弱需要這類(lèi)抑制患者中FAS的活性。在其它實(shí)施方式中，將所述抗 體或其片段與另一種藥物聯(lián)結(jié)或偶聯(lián)形成能抑制或減弱FAS活性的偶聯(lián)物。另外實(shí) 施方式中所述另一種藥物是能拮抗細(xì)胞表達(dá)FAS活性的毒性藥物。所述抗體或其片 段可作為治療劑直接給予，作為本發(fā)明組合物的一部分給予，作為偶聯(lián)或融合多肽 的一部分給予，或者作為能在細(xì)胞或患者體內(nèi)表達(dá)所述抗體(或片段或融合多肽)的核 酸構(gòu)建物給予。
另外的臨床方法包括本文所述根據(jù)檢測(cè)hFAS多肽為患者提供醫(yī)療護(hù)理所包括 的那些方法。在一些實(shí)施方式中，所述方法涉及根據(jù)對(duì)存在hFAS多肽或其水平的測(cè) 定提供診斷服務(wù)，包括或不包括對(duì)檢測(cè)到多肽是否具有(診斷)意義的醫(yī)學(xué)解釋。在其 它實(shí)施方式中，本發(fā)明方法提供診斷服務(wù)之前，先要確定服務(wù)需求。在另外實(shí)施方 式中，所述方法包括監(jiān)視服務(wù)的性能以及對(duì)服務(wù)性能的要求或接受賠償。
其它實(shí)施方式和特征一部分將在后面的描述中提到， 一部分本領(lǐng)域技術(shù)人員可 通過(guò)閱讀本說(shuō)明書(shū)而了解或通過(guò)實(shí)施本發(fā)明而掌握。利用本發(fā)明所述的手段、組合 和方法可實(shí)現(xiàn)和了解本發(fā)明的特征和優(yōu)點(diǎn)。
定義
本文所采用的單位、前綴和符號(hào)一般以它們的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)單位制(SI)所接受的形式 表示。數(shù)值的范圍包括確定其范圍的數(shù)值。本文所提供的標(biāo)題并非是對(duì)參閱本說(shuō)明書(shū)全文所獲得的本發(fā)明各方面內(nèi)容或?qū)嵤┓绞降南拗啤Ｒ虼?，通過(guò)參閱本說(shuō)明書(shū)全 文可以更全面明確以下術(shù)語(yǔ)的定義。
術(shù)語(yǔ)"人脂肪酸合酶"或"hFAS"指先前在美國(guó)專利5,759,791和它所依據(jù)的 專利申請(qǐng)中鑒定為癌相關(guān)抗原的多肽。所述抗原在本領(lǐng)域中也稱為OA-519，國(guó)際生 化和分子生物學(xué)聯(lián)合會(huì)命名委員會(huì)(Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology, NC-IUBMB)將其定義為脂肪酸合酶 (E.C.2.3.1.85),如www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/所述。所述術(shù)語(yǔ)不是通過(guò)氨基 酸序列而是以本發(fā)明抗體識(shí)別的hFAS或其片段而言的特定人脂肪酸合酶。所述術(shù)語(yǔ) 也指hFAS蛋白質(zhì)或肽，包括留在胞內(nèi)的以及胞外環(huán)境和體液中見(jiàn)到的游離于細(xì)胞形 式的全長(zhǎng)序列和片段。 一些情況下，全長(zhǎng)hFAS片段(僅)指全長(zhǎng)hFAS。本文所用術(shù) 語(yǔ)"多肽"、"肽"和"蛋白質(zhì)"指氨基酸殘基的聚合物。這些術(shù)語(yǔ)還包括含有保守 性氨基酸取代的聚合物，該聚合物整體上保留了其功能，如可被本發(fā)明抗-hFAS抗體 所識(shí)別。
本文用的術(shù)語(yǔ)"抗體"指能與特定抗原發(fā)生免疫反應(yīng)的免疫球蛋白分子及其片 段。術(shù)語(yǔ)"抗體"指多個(gè)這類(lèi)分子的集合，不限于一種類(lèi)型抗體的均質(zhì)群體。術(shù)語(yǔ) "抗體"還包括基因工程改造形式的抗體如嵌合抗體(如，人源化鼠抗體)、異質(zhì)偶聯(lián) 抗體(如，雙特異性抗體)和重組單鏈Fv片段(scFv)及二硫鍵穩(wěn)定化的(dsFv)Fv片段(參 見(jiàn)，例如美國(guó)專利5,747,654)。術(shù)語(yǔ)"抗體"還包括抗體的抗原結(jié)合形式(如，F(xiàn)ab'、 F(ab')2、Fab、Fv和rlgG。還參見(jiàn)《皮爾斯商品目錄和手冊(cè)(Pierce Catalog和Handbook)》， 1994-1995(皮爾斯化學(xué)公司(Pierce Chemical Co.),羅克福徳市，Ill.)。術(shù)語(yǔ)"抗-hFAS" 指產(chǎn)生的抗hFAS抗體。
人源化抗體指在含人抗體序列的分子中還含有一個(gè)或多個(gè)非人源CDR的抗體 或其免疫活性片段。所述非人源CDR可以是任何來(lái)源，包括但不限于小鼠、大鼠、 家兔或其它哺乳動(dòng)物抗體。人源化抗體或其片段中存在的人源部分，當(dāng)給予人患者 時(shí)不太可能引起免疫應(yīng)答。人源化抗體或其片段可包含占抗體或其片段總長(zhǎng)約50% 或更多、約55%或更多、約60%或更多、約65%或更多、約70。/?；蚋?、約75%或 更多、約80%或更多、約85%或更多、約90%或更多或約95%或更多的人源抗體序 列。
可用已知方法，如用hFAS多肽免疫能產(chǎn)生抗體的動(dòng)物，來(lái)產(chǎn)生本文所述能與 hFAS免疫反應(yīng)的抗體?？捎帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員熟知的各種技術(shù)獲得單克隆抗體。制備 這類(lèi)單克隆抗體技術(shù)的描述可參見(jiàn)如，加利弗尼亞州洛杉磯市的蘭格醫(yī)學(xué)出版社(Lange Medical Publications)出版的Stites，等人(編)的《臨床免疫學(xué)基礎(chǔ)(BASIC and CLINICAL IMMUNOLOGY)(第4版)》及其參考文獻(xiàn)；Harlow和Lane,同上；Goding， 《單克隆原理和操作(MONOCLONAL: PRINCIPLES和PRACTICE)(第2版)，學(xué) 術(shù)出版社(Academic Press),肯塔基州紐約市(1986); Kohler禾n Milstein， Nature 256:495497(1975);和尤其是(Chowdhury， P.S.，等人Mol.Immunol.34:9 (1997))中所 述的產(chǎn)生單克隆抗體的非限制性方法。制備單克隆抗體的方法包括用編碼所需免疫 原(此時(shí)是hFAS多肽)的核酸序列免疫動(dòng)物。該技術(shù)與蛋白質(zhì)免疫方法相比至少有兩 個(gè)優(yōu)點(diǎn)不需要純化蛋白質(zhì)；和提高了翻譯后正確修飾免疫原的幾率。
免疫球蛋白分子通常含有兩類(lèi)多肽鏈重鏈和輕鏈。分子中重鏈和輕鏈各有兩 條，因而每個(gè)分子都有兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。每條鏈均包含恒定區(qū)和可變區(qū)。每條輕鏈的 可變區(qū)和每條重鏈的可變區(qū)的"骨架"區(qū)被3個(gè)超變區(qū)，也稱為互補(bǔ)決定區(qū)或CDR 隔開(kāi)。參見(jiàn)《影響免疫的蛋白質(zhì)序列(SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST)》，Kabat， E.等人，美國(guó)健康和人類(lèi)服務(wù)部 (U.S. Department ofHealth和Human Services), (1987);以其全文納入本文作參考。 不同輕鏈或重鏈的骨架區(qū)序列在種內(nèi)相對(duì)保守。 一條輕鏈和一條重鏈的骨架區(qū)聯(lián)合 形成了三維空間位置的CDR，使它們能與抗原表位相互作用和結(jié)合。CDR通常指 CDR1、 CDR2和CDR3，從每條鏈的N末端開(kāi)始依次編號(hào)。
本文所用短語(yǔ)"單鏈Fv"或"scFv"指?jìng)鹘y(tǒng)雙鏈抗體的重鏈和輕鏈連接形成的 具有一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的一條鏈抗體。通常，接頭肽位于兩條鏈之間使之正確折疊和定 位可變區(qū)而產(chǎn)生活性結(jié)合位點(diǎn)。術(shù)語(yǔ)"接頭肽"指抗體結(jié)合片段(如，F(xiàn)v片段)內(nèi)的 多肽鏈，其作用是將重鏈可變區(qū)直接連接于輕鏈可變區(qū)上。
更一般來(lái)講，"接頭"是用于將抗體連接于另一分子的分子。接頭與抗體和另一 分子二者均形成共價(jià)鍵連接。合適的接頭是技術(shù)人員所熟知，包括但不限于直鏈 或支鏈碳鏈接頭、雜環(huán)碳鏈接頭或肽接頭。當(dāng)抗體和另一分子都是多肽時(shí)，接頭可 通過(guò)它們的側(cè)鏈基團(tuán)與組成氨基酸相連接(如，通過(guò)二硫鍵與半胱氨酸連接)。或者， 接頭可連接末端氨基酸的a碳氨基和羧基。
術(shù)語(yǔ)"接觸"指置于直接的物理上相關(guān)處，例如將本發(fā)明抗體與hFAS多肽放 置在一起可導(dǎo)致這兩種組分形成復(fù)合物。
本文所用短語(yǔ)"測(cè)定是否存在"hFAS多肽或含有hFAS多肽的復(fù)合物指定性評(píng) 估樣品或其它材料中是否存在hFAS。也可認(rèn)為此術(shù)語(yǔ)指檢測(cè)存在的hFAS多肽是否 高于特定水平，例如但不限于水平高于背景噪聲或參比細(xì)胞或樣品(包括正常人的細(xì)胞或樣品)的水平。本文采用的"測(cè)定"或"檢測(cè)"hFAS多肽的水平指評(píng)估此多肽 含量的定量或半定量水平。這種評(píng)估不需要絕對(duì)精確而可以是近似值。
術(shù)語(yǔ)"偶聯(lián)"、"鍵連"、"連接"及其變化形式指兩個(gè)分子通過(guò)形成至少一個(gè)共 價(jià)鍵而物理連接。 一些情況下，這些術(shù)語(yǔ)指使兩條多肽結(jié)合成一條毗連的多肽分子。 在本發(fā)明內(nèi)容中，此術(shù)語(yǔ)還指使抗體分子連接于固相支持物或其它固相材料，包括
固相材料表面以及另一個(gè)分子?？衫没瘜W(xué)成鍵反應(yīng)來(lái)形成共價(jià)鍵。術(shù)語(yǔ)"支持物" 指常規(guī)支持物如小珠、微粒、蘸棒(dipstick)、纖維、濾膜、膜片和硅垸或硅酸鹽支持 物如載玻片。本發(fā)明的偶聯(lián)抗體包括但不限于連到標(biāo)記物的抗體，和連接毒素或 其它所需分子包括另一種多肽的抗體，因而所述抗體可作為靶向分子將毒素或其它
分子引到所需的表達(dá)FAS的靶點(diǎn)處。或者，所述靶點(diǎn)是細(xì)胞，如患病細(xì)胞。
術(shù)語(yǔ)"標(biāo)記物"指能夠被檢測(cè)(直接或間接地)到從而表明存在"該被標(biāo)記的"分 子的組分。因此，可以借助這種標(biāo)記物來(lái)檢測(cè)本發(fā)明的標(biāo)記抗體。這種檢測(cè)可以是 定量或定性檢測(cè)。合適的標(biāo)記物包括結(jié)合對(duì)(如生物素-親和素或生物素-鏈球菌親和 素結(jié)合對(duì)中的生物素)的一員、放射性同位素、核苷酸生色團(tuán)、酶(如，辣根過(guò)氧化物
酶、堿性磷酸酶和常用于ELISA的其它酶)、底物、熒光分子(如，異硫氰酸熒光黃、 德克薩斯紅、羅丹明、綠色熒光蛋白等)、化學(xué)發(fā)光分子、磁性微?；虼胖?、生物發(fā) 光分子、產(chǎn)熱標(biāo)記物如膠體金等。因此，標(biāo)記物可以是任何可用分光光譜、光化學(xué) 生物化學(xué)、免疫化學(xué)、電學(xué)、光學(xué)或化學(xué)方法直接或間接檢測(cè)到的組分。在一些實(shí) 施方式中，標(biāo)記物可以肉眼檢測(cè)。
檢測(cè)這類(lèi)標(biāo)記物的方法是為技術(shù)人員知道的。例如，可用照相膠片或閃爍計(jì)數(shù) 器檢測(cè)放射性標(biāo)記物，可用光電探測(cè)器檢測(cè)發(fā)射光來(lái)檢測(cè)熒光標(biāo)記。通?？赏ㄟ^(guò)提 供酶和底物，并檢測(cè)酶對(duì)底物作用所產(chǎn)生的反應(yīng)產(chǎn)物來(lái)檢測(cè)酶標(biāo)記物，和簡(jiǎn)單地肉 眼觀察有色標(biāo)記物來(lái)檢測(cè)比色標(biāo)記物。
術(shù)語(yǔ)"FAS抑制劑"包括目前已知或?qū)?lái)開(kāi)發(fā)的可作為脂肪酸合酶活性抑制劑 的任何化合物和分子。非限制性例子可參見(jiàn)美國(guó)專利5,759,837，以其全文納入本文 作參考。其它非限制性例子包括硫羥酸霉菌素(thiolactomycin)(非限制性描述參見(jiàn)WO 04/005277和PCT/US03/021700)和WO 2004/006835 A2(PCT/US03/020960)中所述的 那些。如下所述，抗體或其免疫活性片段也可以是FAS抑制劑。
附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明


圖1是過(guò)度表達(dá)hFAS的MCF-7人乳腺癌細(xì)胞裂解液的免疫印跡。1-3泳道顯 示證明家兔多克隆抗-FAS(泳道l)和泳道2顯示抗-人單克隆FAS、 M6克隆；泳道3顯示M3克隆對(duì)250kDa的FAS的反應(yīng)活性。34-6E7和347C3也與250kDa的FAS
和134kDa的FAS片段強(qiáng)烈反應(yīng)。未標(biāo)記的泳道內(nèi)含與其它單克隆抗體的反應(yīng)。
圖2是用于表位作圖的圖1中抗體對(duì)人FAS的胰蛋白酶消化裂解液的免疫印跡。 圖3是抗體對(duì)MCF-7細(xì)胞裂解液的免疫印跡。還顯示了采用M6抗體的檢測(cè)結(jié)
果(Wang等人J Immunoassay Immunochem.同上)。圖上其它部分采用了同樣的M6抗體。
圖4是不同組抗體對(duì)MCF-7細(xì)胞裂解液的免疫印跡。還顯示了采用M6抗體的
檢測(cè)結(jié)果。
圖5是用于表位作圖的圖3中抗體對(duì)從ZR-75-l人乳腺癌細(xì)胞純化的人FAS胰 蛋白酶消化裂解液的免疫印跡。
圖6是用于表位作圖的圖4中抗體對(duì)從ZR-75-l人乳腺癌細(xì)胞純化的人FAS胰 蛋白酶消化裂解液的免疫印跡。還顯示了采用多克隆抗體和M6的檢測(cè)結(jié)果。
圖7是另一組抗體對(duì)mCF-7細(xì)胞裂解液的免疫印跡。還顯示了采用M6抗體的 檢測(cè)結(jié)果。
圖8是用于表位作圖的圖7中抗體對(duì)從ZR-75-l人乳腺癌細(xì)胞純化的人FAS胰 蛋白酶消化裂解液的免疫印跡。
發(fā)明詳述
本發(fā)明提供了結(jié)合hFAS多肽的抗體。FAS是一種在多種人類(lèi)細(xì)胞以及癌細(xì)胞 中表達(dá)的蛋白質(zhì)。所述抗體具有與先前已知的抗-hFAS抗體不同的結(jié)合特異性。本發(fā) 明部分依據(jù)制備約超過(guò)120種克隆的單克隆抗體分析，發(fā)現(xiàn)有許多抗體與先前已知 的抗hFAS的單克隆抗體不同。對(duì)保存的約70種克隆進(jìn)行了復(fù)蘇。已用一些克隆在 動(dòng)物中生產(chǎn)腹水來(lái)產(chǎn)生抗體。本發(fā)明涉及結(jié)合hFAS但與先前已知的稱為M3或M6， 或者以ATCC登錄號(hào)10853保藏的單克隆抗體不同的單克隆抗體。
抗體結(jié)合hFAS的能力包括在免疫反應(yīng)條件下選擇性或特異性結(jié)合hFAS的一個(gè) 或多個(gè)決定簇的能力。本發(fā)明的抗體是能夠選擇性或特異性結(jié)合其它分子上不存在 的hFAS決定簇的那些抗體，例如可用hFAS在樣品中找到作為非限制性例子的Hpr。 術(shù)語(yǔ)"選擇性結(jié)合"指抗體的整體或一部分優(yōu)先結(jié)合hFAS多肽上存在的表位，而不 結(jié)合其它多肽的表位。當(dāng)然，也知道抗體與非靶分子之間可發(fā)生某種程度的非特異 性相互作用。然而，選擇性結(jié)合由于通過(guò)對(duì)hFAS的特異性識(shí)別而介導(dǎo)仍然可以區(qū)別。
盡管選擇性或特異性結(jié)合抗體也會(huì)結(jié)合其它抗原，但它們的親和力可能較低。 然而，特異性結(jié)合導(dǎo)致的抗體與其相關(guān)抗原之間的結(jié)合比抗體與非相關(guān)抗原之間的結(jié)合強(qiáng)得多。特異性結(jié)合常能導(dǎo)致與相關(guān)抗原結(jié)合的抗體數(shù)量(每單位時(shí)間)比與非相 關(guān)抗原結(jié)合的抗體數(shù)高約2倍以上、約5倍以上、約10倍以上或約100以上。存在
非相關(guān)蛋白質(zhì)時(shí)，與相關(guān)蛋白質(zhì)特異性結(jié)合需要所選擇的抗體對(duì)特定抗原具有特異 性。各類(lèi)免疫試驗(yàn)都適合選擇對(duì)特定蛋白質(zhì)有特異免疫反應(yīng)性的抗體。例如，常規(guī)
采用固相ELISA免疫試驗(yàn)來(lái)選擇對(duì)蛋白質(zhì)有特異免疫反應(yīng)性的單克隆抗體。參見(jiàn) Harlow和Lane，《抗體，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(ANTIBOD正S， A LABORATORY MANUAL)》， 冷泉港出版社(Cold Spring Harbor Publications),紐約(1988)中描述的可用于測(cè)定特異 免疫反應(yīng)性的免疫試驗(yàn)形式和條件。
可用標(biāo)準(zhǔn)的抗體-抗原試驗(yàn)，例如，競(jìng)爭(zhēng)性試驗(yàn)、飽和試驗(yàn)或標(biāo)準(zhǔn)的免疫試驗(yàn)如 ELISA或RIA來(lái)檢測(cè)或測(cè)定本發(fā)明抗體的結(jié)合親和力?？捎眠@類(lèi)試驗(yàn)來(lái)測(cè)定抗體的 解離常數(shù)。短語(yǔ)"解離常數(shù)"指抗體對(duì)抗原的親和力。如果抗體的解寓常數(shù)(Kd二1/K， 其中K是親和力常數(shù))〈lpM，優(yōu)選〈100nM和最優(yōu)選〈0.1nM時(shí)，認(rèn)為抗體與抗原 之間為特異性結(jié)合?？贵w分子的Kd通常狡小。KD = [Ab-Ag]/[Ab][Ag]，其中[Ab] 是抗體平衡時(shí)的濃度，[Ag]是抗原平衡時(shí)的濃度和[Ab-Ag]是抗原-抗體復(fù)合物平衡時(shí) 的濃度。通常，抗原與抗體之間的結(jié)合相互作用包括可逆的非共價(jià)鍵結(jié)合，例如靜 電吸引力、范德瓦耳斯力和氫鍵。測(cè)定結(jié)合特異性的方法可用于對(duì)相關(guān)抗原具有特 異性的一條重鏈和/或輕鏈、CDR、融合蛋白或重鏈和/或輕鏈的片段，如果它們單獨(dú) 和組合結(jié)合抗原時(shí)。
術(shù)語(yǔ)"免疫反應(yīng)條件"指使抗體與其相關(guān)表位結(jié)合可檢測(cè)的程度高于和/或基本 上不與所有其它表位結(jié)合的條件。免疫反應(yīng)條件取決于抗體結(jié)合反應(yīng)的類(lèi)型，通常
是用于免疫試驗(yàn)方法中的那些條件或體內(nèi)所遭遇的那些條件。參見(jiàn)Harlow和Lane, 同上，所描述的免疫試驗(yàn)形式和條件。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明方法中所采用的 免疫反應(yīng)條件是"生理?xiàng)l件"，包括通?；畹牟溉閯?dòng)物體內(nèi)或哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的參考 條件(如，溫度、同滲容摩和pH)。盡管知道有些器官處于極端條件下，但正常的體 內(nèi)和胞內(nèi)環(huán)境仍處于pH7附近(即，pH6.0-pH8.0，更典型是pH6.5-7.5)，含有水作為 主要溶劑和處于高于0"C和低于5(TC的溫度下。同滲容摩的范圍能支持細(xì)胞活力和 增殖。
本發(fā)明大多數(shù)抗體保留有結(jié)合約250 kD的hFAS多肽和/或約134kD的hFAS蛋
白水解產(chǎn)物的能力。然而，在一些實(shí)施方式中，所述抗體可以更高或更低的親和力 結(jié)合這兩種hFAS多肽?；蛘?，所述抗體結(jié)合這兩種多肽之一的特異性比結(jié)合與hFAS 多肽一同存在或與其它hFAS多肽有關(guān)的其它抗原更高或更低。比較不同抗體的特異性的一種手段是對(duì)同組多肽或抗原抗不同抗體的情況進(jìn)行免疫印跡。所述多肽或抗
原組可以是表達(dá)hFAS的細(xì)胞的多肽或抗體，或這種細(xì)胞的裂解液。這類(lèi)細(xì)胞的非限 制性例子包括表達(dá)hFAS的原代細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞系?？赡艿募?xì)胞包括作為非限制性 例子的乳腺癌細(xì)胞、結(jié)直腸癌細(xì)胞和前列腺癌細(xì)胞，而細(xì)胞系包括作為非限制性例 子的MCF-7和ZR-75-l?；蛘撸龆嚯幕蚩乖M可以是含有hFAS多肽的部分蛋白 水解樣品。所述蛋白水解手段可以是自然發(fā)生的或通過(guò)采用具體的蛋白水解劑如胰 蛋白酶、糜蛋白酶、內(nèi)蛋白酶Lys-C或Glu-C、化學(xué)裂解劑如溴化氰和BNPS-糞臭素， 或本領(lǐng)域任何其它合適手段。這類(lèi)組通常先由部分純化或純化的hFAS多肽樣品開(kāi)始 著手。非限制性例子包括含有未采用重組DNA技術(shù)，而由表達(dá)hFAS多肽的細(xì)胞純 化得到的全長(zhǎng)hFAS的樣品，如由ZR-75-l細(xì)胞純化得到的hFAS多肽?；蛘撸?樣品可以含有利用重組DNA技術(shù)表達(dá)的hFAS多肽。
尤其令人感興趣的是相對(duì)于其它與hFAS多肽同時(shí)存在或與其它hFAS多肽有關(guān) 的抗原能特異性結(jié)合一種或多種特定hFAS多肽的本發(fā)明抗體。 一些實(shí)施方式中，所 述抗體以相比本領(lǐng)域已知的M3抗體更高的親和力或更低的親和力結(jié)合全長(zhǎng)和/或 250kDh形式的FAS。
本發(fā)明還提供了具有與本領(lǐng)域已知的M3抗體相似但不相同的特異性的抗體。 提供了非限制性例子，包括不結(jié)合胰蛋白酶水解的hFAS多肽組中的約70kD的hFAS 多肽片段和/或結(jié)合約50kD的hFAS多肽片段的hFAS結(jié)合抗體。
在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了具有與本領(lǐng)域已知的M6抗體相似但不相同 的特異性的抗體。提供了非限制性例子，包括不結(jié)合MCF-7細(xì)胞胞溶產(chǎn)物中的約 60kD的多肽和/或結(jié)合約40kD的多肽的hFAS結(jié)合抗體。
其它M6類(lèi)抗體包括不結(jié)合a)用胰蛋白酶水解人ZR-75-l乳腺癌細(xì)胞的裂解液 中的約45kD、約34kD、約16kD、約37kD、約28kD或約7kD多肽；或
b)結(jié)合用胰蛋白酶水解人ZR-75-l乳腺癌細(xì)胞的裂解液中的約115kD、約90kD、 約50kD、約85kD、約78kD、約50kD、約40kD或約17kD多肽的那些抗體。
其它M6類(lèi)抗體包括a)不結(jié)合人MCF-7乳腺癌細(xì)胞裂解液中的約125 kD、約 32kD或約9kD多肽；或
b)結(jié)合用胰蛋白酶水解人ZR-75-l乳腺癌細(xì)胞的裂解液中的約85kD、約50kD、 約43kD或約24kD多肽的那些抗體。
本發(fā)明其它實(shí)施方式中，公開(kāi)和具體考慮將以下具體的單克隆抗體用于本發(fā)明 的組合物和方法中所述抗體是34-6E7，它于2006年8月17日作為雜交瘤克隆34-6E7-2G10-15保藏于ATCC，指定登錄號(hào)為_(kāi)，或是63-2D8，它于2006年
8月17日作為雜交瘤克隆63-2D8-2E2-lD2保藏于ATCC,指定登錄號(hào)為_(kāi)，
或是63-4G4，它于2006年8月17日作為雜交瘤克隆34-63-4G4-B3-2F3保藏于ATCC，
指定登錄號(hào)為_(kāi)，63-3C10，它于2006年8月17日作為雜交瘤克隆63-3C10-2B8
保藏于ATCC，指定登錄號(hào)為_(kāi)，或者是34-7C3，它于_J乍為雜交瘤
克隆_保藏于ATCC，指定登錄號(hào)為_(kāi)。所述34-6E7-2G10-15、
63-2D8-2E2-lD2、 63-4G4-B3-2F3和63-3C10-2B8雜交瘤全是小鼠脾臟來(lái)源的小鼠雜 交瘤細(xì)胞系。可以將它們?cè)诤?7.6%胎牛血清、lmM丙酮酸鈉、2mML-谷胺酰胺 和100個(gè)單位/mL的青霉素-鏈霉素的ImDm中進(jìn)行培養(yǎng)。所產(chǎn)生的抗體全是IgG，亞 型。當(dāng)然通過(guò)技術(shù)人員已知的方法還可以制備其它亞型的抗體。
本發(fā)明的一些實(shí)施方式中可以將CDR與這些單克隆抗體分離。其它實(shí)施方式包 括對(duì)一種或多種CDR或其編碼核酸進(jìn)行重組產(chǎn)生融合蛋白或嵌合抗體，用于本發(fā)明 實(shí)踐中。
當(dāng)然，上述hFAS多肽片段還可以用于產(chǎn)生本發(fā)明的其它抗體，包括與本文所 述那些抗體具有相同的hFAS反應(yīng)性的抗體。作為非限制性例子的胰蛋白酶水解產(chǎn)物 中的約50kD形式的hFAS多肽片段；MCF-7細(xì)胞裂解液中的約40kD的多肽；用胰 蛋白酶水解人ZR-75-l乳腺癌細(xì)胞的裂解液中的約115kD、約90kD、約50kD、約 85kD、約78kD、約50kD、約40kD或約17kD多肽；和/或用胰蛋白酶水解人ZR-75-l 乳腺癌細(xì)胞的裂解液中的約85 kD、約50kD、約43kD或約24kD多肽可以用技術(shù)人 員已知的方法分離，和用作產(chǎn)生本發(fā)明其它抗體的抗原。當(dāng)然，可以采用技術(shù)人員 已知的常規(guī)方法來(lái)簡(jiǎn)單篩選所述抗體的如本文所述的hFAS結(jié)合反應(yīng)性和特異性。
本發(fā)明的抗-hFAS抗體可以來(lái)自任何非人來(lái)源，包括作為非限制性例子的小鼠、 大鼠、山羊、綿羊和兔。所述抗體可用作免疫試驗(yàn)中的一抗，與對(duì)所述一抗的恒定 區(qū)有特異性的二抗結(jié)合。在一些實(shí)施方式中，所述一抗可以不標(biāo)記以便可以對(duì)二抗 進(jìn)行檢測(cè)標(biāo)記。所述抗體還可以是任何類(lèi)型，包括IgG、 IgM、 IgD、 IgA和IgE。它 們還可以是IgG或IgA的亞類(lèi)。
本發(fā)明的所述抗體和其片段還可以抑制FAS活性，因此可用作FAS抑制劑。這 類(lèi)抗體和片段可用來(lái)檢測(cè)FAS的存在和抑制其活性，而不需要再進(jìn)入其它FAS抑制 劑。或者，本發(fā)明FAS抑制性抗體或抗體片段可以與另一種FAS抑制劑聯(lián)用，如用 于抑制FAS活性的組合物中，或者單獨(dú)或聯(lián)合使用到對(duì)象作為抑制FAS活性的方法 的一部分。為了不受理論所局限和提供來(lái)增進(jìn)對(duì)本發(fā)明的理解，本發(fā)明的FAS抑制性抗體或抗體片段可以通過(guò)結(jié)合所有或部分FAS結(jié)合位點(diǎn)和/或調(diào)控區(qū)起作用。在其
它實(shí)施方式中，可以施用與另一種試劑相連或偶聯(lián)的抗體或其FAS結(jié)合部，從而所 述抗體(或其部分)能將另一種試劑靶向FAS活性處。所述另一種試劑可以是抗具有 FAS活性的所述細(xì)胞的FAS抑制劑和/或毒性劑。
另外的實(shí)施方式中，所述抗體或其部分可以通過(guò)編碼所述抗體或其部分的核酸 序列，單獨(dú)或作為融合多肽的一部分遞送到FAS活性部位。因此，所述核酸序列是 操作性連接調(diào)控元件的編碼序列，從而該元件能指導(dǎo)所述序列表達(dá)成mRNA和/或蛋 白質(zhì)以形成表達(dá)構(gòu)建物?？梢匀缤ㄟ^(guò)直接遞送到所需位點(diǎn)，然后被該位點(diǎn)處的細(xì)胞 所攝入而直接使用這類(lèi)構(gòu)建構(gòu)物，或者可以作為載體構(gòu)建物的部分。本發(fā)明的載體 構(gòu)建物包括在合適條件下，如在允許的細(xì)胞內(nèi)，能夠自我復(fù)制的那些載體。非限制 性的例子包括病毒載體和質(zhì)粒分子，包括那些保持游離狀態(tài)的載體。技術(shù)人員已經(jīng) 知道了多種調(diào)控元件和載體，可以容易地選擇將它們用于本發(fā)明實(shí)踐中。
可以對(duì)本發(fā)明抗體進(jìn)行修飾或?qū)⑵溆糜谘苌渌贵w。非限制性例子包括漢唷 所有或部分本發(fā)明抗體的hFAS結(jié)合官能度的雜交抗體、改變的抗體、嵌合抗體、偶 聯(lián)抗體、單鏈抗體和人源化抗體。本發(fā)明的其它實(shí)施方式包括結(jié)合hFAS多肽的本發(fā) 明抗體的部分，包括Fab、 Fab'、 F(ab')2和Fv片段。
本發(fā)明包括重組抗-hFAS抗體如scFv或二硫鍵穩(wěn)定化的Fv抗體。Fv抗體通常 約25kDa，其每條重鏈和輕鏈均包含完整的具有3個(gè)CDR的抗原-結(jié)合位點(diǎn)。如果非 連續(xù)表達(dá)VH和VL鏈時(shí)，F(xiàn)v-抗體各鏈通常會(huì)通過(guò)非共價(jià)作用結(jié)合到一起。然而，這 些鏈經(jīng)稀釋后會(huì)傾向于分離，因此，研究了一些方法通過(guò)戊二醛、分子內(nèi)二硫鍵或 肽接頭使各鏈交聯(lián)。所述抗體可以是單鏈Fv(scFv)。 scFv抗體的VH和VL區(qū)包含折 疊成與雙鏈抗體中找到的類(lèi)似的抗原結(jié)合位點(diǎn)的單鏈。 一旦折疊，非共價(jià)作用能位 穩(wěn)定所述單鏈抗體。在更優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述scFv是重組產(chǎn)生的。
盡管一些抗體實(shí)施方式的Vh和Vl區(qū)可以直接結(jié)合到一起，技術(shù)人員懂得所述 各區(qū)可以被由一個(gè)或多個(gè)氨基酸所組成的肽接頭隔開(kāi)。肽接頭和它們的應(yīng)用為本領(lǐng) 域所熟知。參見(jiàn)例如，Huston等，Proc. Nat，lAcad. Sci. USA 8:5879 (1988); Bird 等，Science 242:4236 (1988); Glockshuber等，Biochemistry 29:1362 (1990);美國(guó)專 利號(hào)4，946，778、美國(guó)專利號(hào)5,132,405和Stemmer等，Biotechniques 14:256-265 (1993)， 均以其全文納入本文作參考。通常所述肽接頭除了連接各區(qū)或在它們之間保持一些 最小距離外沒(méi)有特殊的生物學(xué)活性。然而，所述肽接頭的組成氨基酸可以選擇影響 一些分子特性，如折疊、凈電荷或疏水性。單鏈Fv(scFv)抗體任選包含長(zhǎng)度不超過(guò)50個(gè)氨基酸，通常不超過(guò)40個(gè)氨基酸，優(yōu)選不超過(guò)30個(gè)氨基酸和更優(yōu)選不超過(guò)20 氨基酸的肽接頭。在一些實(shí)施方式中，所述肽接頭是堿基序列的多聯(lián)體。
本發(fā)明提供了本文所述hFAS結(jié)合抗體的一個(gè)或多個(gè)CDR。 CDR可以單獨(dú)分 離，或者與相同抗體輕鏈或重鏈中存在的其它CDR中的一個(gè)或所有聯(lián)合。在一些實(shí) 施方式中，通過(guò)測(cè)序進(jìn)行分離和/或分離編碼抗體CDR(或CDR部分)的核酸序列。作 為非限制性例子，這類(lèi)核酸序列可以重組連接到編碼另一多肽的序列上形成融合蛋 白，或者被用于替換另一抗體的CDR編碼序列形成嵌合抗體(或其片段)。含有本發(fā) 明CDR的嵌合抗體可以相同方式用作本發(fā)明的抗體。
可以如本文所述共價(jià)或非共價(jià)地標(biāo)記本發(fā)明的抗體。為了用于一些免疫試驗(yàn)中， 常常標(biāo)記抗體以便檢測(cè)到它和如此檢測(cè)到結(jié)合到抗體上的hFAS多肽。在一些實(shí)施方 式中，所述標(biāo)記物可以簡(jiǎn)單地是大顆粒，包括作為非限制性例子的有色玻璃或塑料(如 聚苯乙烯、聚丙烯、膠乳等)珠，當(dāng)它們大量聚集到局部空間時(shí)可以被檢測(cè)到，包括 在一些示例性免疫試驗(yàn)中用肉眼檢測(cè)。
可以采用技術(shù)人員已知的許多方法將標(biāo)記物或其它可檢測(cè)部分連接到本發(fā)明抗 體上。將分子連接到抗體上的方法根據(jù)待連接分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)可以變化。多肽通常 含有各種能與抗體上合適的官能團(tuán)反應(yīng)的官能官?；蛘?，所述抗體衍生為露出或連 接上其它反應(yīng)性官能團(tuán)。所述衍生可以包括接上任何接頭分子，如獲自皮爾斯化學(xué) 公司的Rockfordlll的那些接頭。或者，所述抗體與特異性結(jié)合和標(biāo)記hFAS多肽和
抗體幵鄉(xiāng)成的結(jié)合復(fù)合物的標(biāo)記試齊ij'聯(lián)用d在一些實(shí)施方式中，所述標(biāo)記試齊U自身可
以是包含所述復(fù)合物即，抗-hFAS抗體的一部分?；蛘?，所述標(biāo)記試劑可以是第三方 部分，如特異性結(jié)合所述復(fù)合物的另一種抗體(被標(biāo)記或固定的二抗)。本發(fā)明的非限 制性例子包括使用特異性結(jié)合抗-hFAS抗體恒定區(qū)的那種二抗。
在一些競(jìng)爭(zhēng)性免疫試驗(yàn)的情況下，將本發(fā)明的未標(biāo)記抗體與標(biāo)記形式的另一種 抗-hFAS抗體聯(lián)用。然后使這兩種抗體接觸樣品中的hFAS來(lái)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合。在任選的非 競(jìng)爭(zhēng)性方式中，所述未標(biāo)記抗-hFAS抗體與標(biāo)記抗體聯(lián)用形成含有兩種抗體和結(jié)合的 hFAS多肽的"夾心"復(fù)合物。然后通過(guò)檢測(cè)該"夾心"復(fù)合物來(lái)檢測(cè)hFAS的存在， 或確定其含量。
其它特異性結(jié)合免疫球蛋白恒定區(qū)的蛋白質(zhì)，如蛋白質(zhì)A或蛋白質(zhì)G也可以用 作標(biāo)記試劑。這些蛋白質(zhì)在鏈球菌細(xì)胞壁組分中可以找到，并對(duì)各類(lèi)物種的免疫球 蛋白恒定區(qū)表現(xiàn)出強(qiáng)烈的非免疫原性反應(yīng)( 一 般參見(jiàn)，Krorwal等， J. Immunol. 111:1401-1406 (1973);和Akerstrom等，J. Immunol, 135:2589-2542(1985))。當(dāng)然，所述蛋白質(zhì)A或蛋白質(zhì)G自身可以被如本文所述進(jìn)行可檢測(cè)標(biāo)記，
包括通過(guò)接到或固定到為本發(fā)明抗體所提供的固相上。
可以根據(jù)本發(fā)明抗體的不同結(jié)合特異性進(jìn)行選擇以滿足需要檢測(cè)hFAS多肽的 具體情況的需要。作為非限制性例子，可以選擇對(duì)全長(zhǎng)hFAS具有較高特異性或親和 力的抗體，將其用于需要對(duì)全長(zhǎng)hFAS進(jìn)行檢測(cè)的情形下?；蛘?，對(duì)特定的hFAS片 段具有較高特異性或親和力的抗體可用于優(yōu)選檢測(cè)該片段的情況下。
本發(fā)明還提供了表達(dá)本發(fā)明抗體的細(xì)胞系。所述細(xì)胞系可以是雜交瘤細(xì)胞系， 包括如上所述進(jìn)行保藏的那些細(xì)胞系。
本發(fā)明的組合物
含有本發(fā)明抗體的組合物和制備物包括含有所述抗體以及所述抗體所結(jié)合的固 相材料的溶液。
在 一些實(shí)施方式中，所述抗體與將所述抗體用于ELISA或RIA的組分或器材相聯(lián)。 非限制性例子包固定于用于這些試驗(yàn)中的固相的表面的抗體。另一任選實(shí)施方式中， 所述抗體連接或偶聯(lián)到可以被電化學(xué)刺激的標(biāo)記物上，然后根據(jù)發(fā)射光進(jìn)行檢測(cè)。 這類(lèi)試驗(yàn)方法的非限制性例子是電化發(fā)光(ECL)技術(shù)，其中本發(fā)明的抗體或抗體片段 連到釕螯合物上，從而，當(dāng)采用已知方法使釕在電極表面氧化/還原時(shí)可以檢測(cè)到它。
在其它實(shí)施方式中，通過(guò)采用免疫層析試驗(yàn)將所述抗體與檢測(cè)hFAS多肽的器 材或條帶相連，如基于作為分析物的含有hFAS多肽的溶液的橫向流動(dòng)?？梢赃M(jìn)行稱 為"夾心"或競(jìng)爭(zhēng)性試驗(yàn)的這些試驗(yàn)。這類(lèi)器材或條帶的其它例子是那些設(shè)計(jì)來(lái)進(jìn) 行歸巢試驗(yàn)(home testing)或快點(diǎn)護(hù)理試驗(yàn)(rapid point of care testing)的器材或條帶。另 外的例子包括設(shè)計(jì)來(lái)對(duì)同時(shí)分析單個(gè)樣品中的多個(gè)分析物的那些器材或條帶。
本發(fā)明的未標(biāo)記抗體可以固定于這類(lèi)器材或條帶的"檢測(cè)"或"捕獲"區(qū)，捕 獲溶液中流過(guò)的hFAS多肽。在一些實(shí)施方式中，被捕獲(或固定)的hFAS多肽可以 結(jié)合標(biāo)記形式的本發(fā)明的抗-hFAS抗體，從而在"檢測(cè)"或"捕獲"區(qū)捕獲(或固定) 多肽和抗體復(fù)合物。所述標(biāo)記抗體可以與器材或條帶的另一區(qū)域相連或干固其上， 從而所述抗體可以在溶液到達(dá)"檢測(cè)"或"捕獲"區(qū)先前就與所述溶液接觸。所述 接觸會(huì)使標(biāo)記抗體溶解于溶液中并隨溶液一起移動(dòng)，同時(shí)如果溶液中存在hFAS多肽 時(shí)，還能與所述標(biāo)記抗體形成復(fù)合物。
所述溶液優(yōu)選是對(duì)象，如人類(lèi)的生物流體樣品?？捎糜诒景l(fā)明實(shí)踐中的生物流 體的范圍包括可以可檢測(cè)地存在hFAS的任何流體。非限制性例子包括對(duì)象的身體分 泌物，如唾液、淚液、粘液、鼻涕和陰道分泌物以及其它體液，如血液、血清、血漿、含精子的精液、不含精子的精液、積液、腹水、腦脊液、乳汁、子宮來(lái)源的液 體和尿液以及糞便或糞便的液體提取物中的任何液體組分。這類(lèi)液體的稀釋液也可 以用作本發(fā)明實(shí)踐中的樣品。 本發(fā)明的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的抗體還可以用于檢測(cè)或測(cè)量hFAS的方法中。盡管本發(fā)明方法的細(xì)節(jié)
可以隨采用的具體形式而變化，檢測(cè)或測(cè)量樣品中hFAS多肽的方法通常包括在免疫 反應(yīng)性條件下用與所述抗體特異性反應(yīng)的抗體接觸所述樣品。由于可以采用許多熟 知免疫結(jié)合試驗(yàn)(參見(jiàn)例如，美國(guó)專利號(hào)4,366,241; 4，376,110; 4,517,288和4,837,168) 中的任何一種檢測(cè)和/或定量抗體，因此所述抗體可以標(biāo)記或未標(biāo)記。
可以用本發(fā)明抗體進(jìn)行實(shí)踐的常規(guī)免疫試驗(yàn)的綜述，還可以參見(jiàn)《細(xì)胞生物學(xué) 方法(METHODS IN CELL BIOLOGY)》，第37巻，Asai編學(xué)術(shù)出版公司(Academic Press, Inc)紐約(1993);《基礎(chǔ)和臨床免疫學(xué)第7版(BASIC AND CLINICAL IMMUNOLOGY 7TH EDITION)》，Stites和Terr編(1991)。免疫結(jié)合試驗(yàn)(或免疫試驗(yàn)) 通常采用配體(如本文所述的hFAS多肽)特異性地結(jié)合和/或固定抗體。在這類(lèi)試驗(yàn) 中，每次加入試劑后均需要培養(yǎng)和/或洗滌步驟。培養(yǎng)步驟可以在約5秒-數(shù)小時(shí)之間 變化，優(yōu)選從約5分鐘-24小時(shí)。然而，培養(yǎng)時(shí)間將取決于試驗(yàn)形式、抗體、溶液體 積、濃度等。盡管可以在溫度范圍如10-4(TC下進(jìn)行所述試驗(yàn)，但通常在室溫下進(jìn)行。
本發(fā)明提供的其它基于抗體的試驗(yàn)方法包括基于免疫-擴(kuò)散、免疫電穿孔、免疫 組織病理學(xué)、免疫組織化學(xué)和組織病理學(xué)的那些方法。所述方法可以包括將測(cè)熱法、 化學(xué)發(fā)光法、電化學(xué)發(fā)光法或熒光技術(shù)與本發(fā)明的抗體或抗體片段聯(lián)用。其它方法 是采用如美國(guó)專利5,759,791所提供的競(jìng)爭(zhēng)性試驗(yàn)。
任選可以在存在如技術(shù)人員所知的能降低非特異性結(jié)合反應(yīng)的試劑下檢測(cè)或測(cè) 量hFAS。因此本發(fā)明提供了包括使用能降低非特異性結(jié)合的試劑的方法。降低非特 異性結(jié)合的方法的非限制性例子包括使用例如但不限于運(yùn)載體蛋白(像，牛血清白蛋 白)的緩沖液添加劑、加入去污劑和調(diào)節(jié)離子強(qiáng)度。
檢測(cè)樣品中存在hFAS多肽可用于診斷患有疾病，如癌癥。在其它實(shí)施方式中， 所述疾病可以是酒精性肝炎或脂肪肝，它們均可以通過(guò)肝細(xì)胞如肝臟活檢或含有本 文所述液體的血清中中存在高于正常水平的FAS被任選檢測(cè)?？梢酝ㄟ^(guò)利用任何FAS 結(jié)合抗體，包括本發(fā)明所述的那些抗體和技術(shù)人員先前已知的那些抗體，檢測(cè)酒精 性肝炎或脂肪肝。
所述檢測(cè)可以作為疾病結(jié)局，包括患與hFAS表達(dá)水平增加有關(guān)疾病的對(duì)象的述檢測(cè)還可以用于方法中，根據(jù)hFAS的存在或水平與疾病 的關(guān)聯(lián)監(jiān)控對(duì)象疾病的病程或復(fù)發(fā)。非限制性例子包括癌癥轉(zhuǎn)移的可能性、腫瘤等 級(jí)和疾病的臨床分期。
其它實(shí)施方式中，采用所述檢測(cè)根據(jù)患者樣品中存在的hFAS或其水平，和臨 床醫(yī)生或其它健康護(hù)理人員的技術(shù)或經(jīng)驗(yàn)，來(lái)確定是否要對(duì)患者施用FAS抑制劑。 所述確定可以用于治療根據(jù)樣品中存在hFAS多肽或其水平診斷出的疾病，從而施用 FAS抑制劑或其它試劑來(lái)治療可以緩解疾病?？梢哉J(rèn)為施用FAS抑制劑或其它治療 試劑是靶向FAS以治療疾病和/或其癥狀的化療手段。
另外的實(shí)施方式中，所述確定可用于預(yù)防根據(jù)患者樣品中存在的hFAS或其水 平和技術(shù)醫(yī)生的經(jīng)驗(yàn)指出可能患的疾病?；趯?duì)hFAS進(jìn)行檢測(cè)而可能或可靠地確定 病狀，接著施用FAS抑制劑或其它試劑來(lái)預(yù)防疾病發(fā)生，或者如果發(fā)生時(shí)，則減輕 其嚴(yán)重性或程度。因此本發(fā)明包括基于抑制脂肪酸合成酶而化學(xué)預(yù)防疾病領(lǐng)域中的 實(shí)施方式。
本發(fā)明的其它方法包括通過(guò)施用本文所述的抗體、抗體片段、含有軛合物的抗 體或含有融合多肽的抗體來(lái)抑制FAS活性或靶定表達(dá)FAS或其存在的位點(diǎn)來(lái)治療對(duì) 象。非限制性例子包括直接將本發(fā)明抗體施用對(duì)象，如注射進(jìn)對(duì)象身體的含細(xì)胞部 位使抗體被攝取?；蛘撸梢允┯镁幋a本發(fā)明抗體的核酸分子或結(jié)構(gòu)，如直接注射 進(jìn)對(duì)象身體的含細(xì)胞部位使細(xì)胞攝取核酸，接著表達(dá)抗體。所述對(duì)象可以是人類(lèi)， 本發(fā)明提供的類(lèi)似方法包括施用本文所述抗體片段、含有軛合物的抗體或含有融合 多肽的抗體。
醫(yī)療應(yīng)用
本發(fā)明還提供了在為患者提供醫(yī)療中作為一種組分檢測(cè)或測(cè)量hFAS多肽。非 限制性例子包括提供診斷服務(wù)結(jié)合提供醫(yī)療治療。因此，本發(fā)明包括對(duì)患者進(jìn)行醫(yī) 療的方法，所述方法包括檢測(cè)患者樣品中hFAS的存在或其表達(dá)。對(duì)患者進(jìn)行醫(yī)療時(shí) 的方法可以包括本文所公開(kāi)的任何方法。所述方法任選包括對(duì)hFAS的檢測(cè)或測(cè)量結(jié) 果進(jìn)行解釋。所述檢測(cè)或測(cè)量可以用于本文所述本發(fā)明的任何方法或?qū)嵤┓绞街小?br> 作為一個(gè)非限制性例子，可以在確定需要估計(jì)hFAS，如醫(yī)生、護(hù)士或其它醫(yī)療 提供者或在他們指導(dǎo)下工作的那些人作出決定之后，進(jìn)行所述檢測(cè)或測(cè)量。所述決 定還可以由健康保險(xiǎn)或維護(hù)組織的職員作出，以檢測(cè)或測(cè)量行為為基礎(chǔ)要求為此行 為作出補(bǔ)償或付款。
另一個(gè)非限制性實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了要求或接受要求將所述方法用于醫(yī)療護(hù)理患者或本文所述的其它方法中的方法?？梢杂舍t(yī)生、護(hù)士或其它健康護(hù)理人 員，或那些在他們的指導(dǎo)下工作的人員作出所述要求，而可以由執(zhí)行所述方法的任 何人員直接或間接地接受要求。本發(fā)明還提供了對(duì)本文所述所述檢測(cè)或測(cè)量hFAS付 款或補(bǔ)償?shù)牟襟E。補(bǔ)償或付款的步驟中的方法可以包括作出如下指示l)等待付款或
尚未收到付款或付款已過(guò)期，2)收到付款，3)付款不足或不充分，或者4)費(fèi)用將由另 一個(gè)付款人，如在進(jìn)行了本發(fā)明所述的hFAS檢測(cè)或測(cè)量方法之后在數(shù)據(jù)庫(kù)或其它計(jì) 算機(jī)可讀介質(zhì)中的付款人以書(shū)面或電子方式支付。所述數(shù)據(jù)庫(kù)可以是任何形式，包 括電子形式，如作為非限制性例子的計(jì)算機(jī)執(zhí)行數(shù)據(jù)庫(kù)。所作出的指示可以是書(shū)面 代碼或電子(或計(jì)算機(jī)可讀)形式的形式，或包括這些形式。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式 中，所述代碼可以包括解釋為免疫組織化學(xué)的88342。當(dāng)涉及"另一個(gè)付款人"時(shí)， 可以要求先前付款發(fā)票或清單所發(fā)送或傳達(dá)的原付款人以外的人或?qū)嶓w進(jìn)行付款。
或者，所述方法可以包括收到為患者醫(yī)療護(hù)理中檢測(cè)或測(cè)量hFAS方法的技術(shù) 行為或?qū)ζ浣Y(jié)果進(jìn)行的解釋的付款。當(dāng)然，本發(fā)明還包括另一人或一方收到付款或 被指示接受付款的實(shí)施方式。所述收據(jù)可以來(lái)自任何實(shí)體，包括作為非限制性例子 的保險(xiǎn)公司、健康維護(hù)組織、政府(健康)機(jī)構(gòu)、患者或患者的家庭成員。所述付款可 以是全部或部分。在患者付款的情況下，所述付款可以是稱為合作付寬的部分付款 形式。
在又一實(shí)施方式中，所述方法可以包括將在醫(yī)療護(hù)理中對(duì)患者進(jìn)行hFAS檢測(cè) 或測(cè)量方法行為的發(fā)票或其它付款請(qǐng)求轉(zhuǎn)寄或轉(zhuǎn)寄給保險(xiǎn)公司、健康維護(hù)組織、政 府健康機(jī)構(gòu)或患者。可以通過(guò)郵件、電子、電話、當(dāng)面或傳真作出所述請(qǐng)求。在另 外的實(shí)施方式中，方法可以包括收到同意為在醫(yī)療護(hù)理中對(duì)患者進(jìn)行的hFAS檢測(cè)或 測(cè)量方法的行為付款或拒絕為此付款的指示。這種指示可以來(lái)自對(duì)其作出付款請(qǐng)求 的任何一人或任何一方。非限制性例子包括保險(xiǎn)公司、健康維護(hù)組織或政府(健康) 機(jī)構(gòu)，像作為非限制性例子的麥迪克公司(Medicare)或麥迪凱徳公司(Medicaid)。所述 指示可以通過(guò)郵件、電子、電話、當(dāng)面或傳真作出。
另一個(gè)實(shí)施方式是包括發(fā)送為醫(yī)療護(hù)理中對(duì)患者進(jìn)行hFAS檢測(cè)或測(cè)量方法行 為的補(bǔ)償?shù)恼?qǐng)求。這類(lèi)請(qǐng)求可以通過(guò)郵件、電子、電話、當(dāng)面或通過(guò)傳真作出。所 述請(qǐng)求可以是對(duì)保險(xiǎn)公司、健康維護(hù)組織、聯(lián)邦(健康)機(jī)構(gòu)或所述方法所運(yùn)用的患者 作出。
另外的方法包括在表格上或數(shù)據(jù)庫(kù)中指出需要為醫(yī)療護(hù)理中對(duì)患者進(jìn)行的 hFAS檢測(cè)或測(cè)量方法行為作出補(bǔ)償或付款?；蛘撸龇椒梢院?jiǎn)單地包括指出所述方法行為。所述數(shù)據(jù)庫(kù)可以是任何電子表格形式，如包括作為非限制性例子的計(jì) 算機(jī)執(zhí)行數(shù)據(jù)庫(kù)。所述指示可以是任何代碼或其它書(shū)面或數(shù)據(jù)庫(kù)中的指示的形式。 在對(duì)患者進(jìn)行醫(yī)療護(hù)理的上述方法中，所述方法可以包括或者對(duì)健康護(hù)理機(jī)構(gòu)、健 康護(hù)理提供者、醫(yī)生、護(hù)士或?yàn)榇斯ぷ鞯娜藛T報(bào)告方法結(jié)果。所述報(bào)告還可以直接 或間接地傳遞給患者。所述包括可以通過(guò)郵件、電子、電話、當(dāng)面或傳真作出。 藥物組合物和給藥
還提供了含有本發(fā)明抗體、抗體片段、含抗體偶聯(lián)物或含抗體融合多肽的藥物 組合物。這類(lèi)藥物制備物和制劑可用于本文所述的方法中。非限制性例子包括本發(fā)
明檢測(cè)FAS的診斷方法和本發(fā)明的如本文所述檢測(cè)到FAS后即施用治療量的FAS抑 制劑的治療方法。任選非限制性實(shí)施方式包括施用毒素偶聯(lián)抗體或抗體片段，或者 施用直接抑制FAS活性的抗體或抗體片段。還提供了含有本發(fā)明抗體或抗體片段， 并與另一種FAS抑制劑組合的組合物。在許多實(shí)施方式中，本發(fā)明組合物和制劑可 以體內(nèi)或體外用于人對(duì)象。當(dāng)然，組合物和制劑可以包含藥學(xué)上可接受的稀釋劑、 賦形劑、鹽和/或(蛋白質(zhì))穩(wěn)定劑。在治療和診斷應(yīng)用時(shí)，可以將本發(fā)明的抗體或抗 體片段配制成不同的給藥模式，包括全身或局部給藥。技術(shù)人員已知的普通技術(shù)和 制劑參見(jiàn)《雷明頓藥物科學(xué)和實(shí)踐(Remington: The Science and Practice of Pharmacy(第20版))》Lippincott、 Williams和Wilkins(2000)。
本發(fā)明抗體或抗體片段的用量范圍很大。精確量取決于給藥途徑、施用抗體或 其片段的形式、待治療對(duì)象(取決于各因素，如對(duì)象體重)和技術(shù)人員如醫(yī)生的偏愛(ài)和 經(jīng)驗(yàn)。
藥學(xué)上可接受的稀釋劑和賦形劑是生理可耐受的和可相容的。非限制性例子包 括水、鹽水、右旋糖、甘油等和其組合。另外，如果需要，組合物或制劑中還可以 含有輔助物質(zhì)，如濕潤(rùn)劑或乳化劑，或pH緩沖劑。
藥學(xué)上可接受的鹽為技術(shù)人員已知。非限制性例子包括，但不限于醋酸鹽、
苯磺酸鹽(benzenesulfonate)、苯磺酸鹽(besylate)、苯甲酸鹽、碳酸氫鹽、酒石酸氫鹽、 溴化物、乙二胺四乙酸鈣、carnsylate，碳酸鹽、檸檬酸鹽、乙二胺四乙酸鹽、乙二 磺酸鹽、estolate、乙磺酸鹽、延胡索酸鹽、紅霉素(gluceptate)、葡萄糖酸銻鈉、谷氨 酸鹽、乙醇酰阿散酸鹽、liexylresorcinate、 hydrabamine、氫溴酸鹽、鹽酸鹽、羥萘酸 鹽、碘鹽、羥乙基磺酸鹽、乳酸鹽、乳糖醛酸鹽、蘋(píng)果酸鹽、馬來(lái)酸鹽、扁桃酸鹽、 甲磺酸鹽、粘酸鹽、萘磺酸鹽、硝酸鹽、撲酸鹽(雙羥萘酸鹽)、泛酸鹽、磷酸鹽/ 二磷酸鹽、聚半乳糖醛酸鹽、水楊酸鹽、硬脂酸鹽、次醋酸鹽、琥珀酸鹽、硫酸鹽、鞣酸鹽、酒石酸鹽或8-氯茶堿(teoclate)。其它可接受的鹽和試劑可以在例如上面引用 的《雷明頓》中找到。
可以制備胃腸道外遞送，包括肌肉內(nèi)、皮下、髓內(nèi)注射以及膜內(nèi)、直接心室內(nèi)、 靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、鼻內(nèi)或眼內(nèi)注射的組合物和制劑。還提供了透皮施用制備物。一 非限制性例子可見(jiàn)于局部應(yīng)用到對(duì)象表面上或附近的黑色素瘤。
本發(fā)明提供了直接遞送組合物。非限制性例子包括直接注射到腫瘤部位內(nèi)，如 進(jìn)入腫瘤本身或進(jìn)入特定組織，如肝。作為另外的非限制性例子，可以在切除術(shù)后 遞送到肝組織部位。因此，本發(fā)明實(shí)踐中可以采用局部遞送。
可以將本發(fā)明抗體或抗體片段在例如生理可相容的緩沖液如漢克斯溶液(Hank's solution)、林格溶液(Ringer's solution)或生理鹽水緩沖液中制成水溶液。在一些實(shí)施 方式中，包含適用于待滲透屏障的滲透劑。這類(lèi)滲透劑為技術(shù)人員已知。藥學(xué)上可 接受的運(yùn)載體也可以以適于全身施用的劑量用于本發(fā)明實(shí)踐的組合物或制劑中。組 合物或制劑還可以是懸液形式或適于在注射前溶解于或懸浮于液體中的固體形式。
用于本發(fā)明的藥物組合物包括存在能實(shí)現(xiàn)它目的的有效量的抗體或其片段的那 些組合物。還提供了含有本發(fā)明的編碼抗體、抗體片段或含抗體融合多肽的核酸分 子的組合物。這類(lèi)組合物可以根據(jù)核酸的性質(zhì)配制，例如但不限于它是否是待施 用的分子本身或包裝病毒載體形式中的分子。
可以配制胃腸道外遞送，包括肌肉內(nèi)、皮下、髓內(nèi)注射以及膜內(nèi)、直接心室內(nèi)、 靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、鼻內(nèi)或眼內(nèi)注射的所述組合物。還提供了透皮施用，如施用到患 者表面上的黑色素瘤的制備物。
還提供了本發(fā)明核酸的局部或直接遞送。非限制性例子包括直接注射進(jìn)腫瘤部 位，如進(jìn)入腫瘤本身，或進(jìn)入特定組織如肝臟，從而注射部位處或附近的細(xì)胞可以 攝取這類(lèi)核酸。攝取后，將表達(dá)能夠表達(dá)編碼抗體或抗體相關(guān)多肽的核酸，在細(xì)胞 中產(chǎn)生抗體或抗體相關(guān)多肽。作為另外的非限制性例子，可以將能夠在肝臟細(xì)胞中 表達(dá)抗體或抗體相關(guān)多肽的核酸遞送到行切除術(shù)后的肝組織部位，在該部位表達(dá) hFAS結(jié)合活性。
本發(fā)明的試劑盒
本發(fā)明提供了在本文所述生物樣品中檢測(cè)hFAS或其免疫反應(yīng)性片段(即，"hFAS 蛋白質(zhì)"全體)的試劑盒。生物樣品還包括組織切片，如為了組織學(xué)目的而獲得的新 鮮的、冷凍的或固定的切片。通常，試劑盒含有本發(fā)明的抗-hFAS抗體或?qū)FAS多 肽上存在的表位有免疫反應(yīng)性的抗體制備物。在一些實(shí)施方式中，所述抗-hFAS抗體是抗體片段。
本發(fā)明試劑盒還可以含有公開(kāi)或描述本發(fā)明試劑盒或抗體在本文所述本發(fā)明方 法中的應(yīng)用的指導(dǎo)材料。為了所設(shè)計(jì)的試劑盒的具體應(yīng)用，試劑盒還可以含有其它 組分。因此，例如，試劑盒可以另外含有檢測(cè)標(biāo)記物(如，酶標(biāo)記物的酶底物、檢測(cè)
熒光標(biāo)記物的過(guò)濾系統(tǒng)、適當(dāng)?shù)牡诙?biāo)記物如羊抗-小鼠-HRP等)的工具。試劑盒可
以另外含有緩沖液和其它可用于本發(fā)明方法中的試劑。非限制性例子包括減少非特 異性結(jié)合的試劑，如運(yùn)載體蛋白質(zhì)或去污劑。
在本發(fā)明一些實(shí)施方式中，所述試劑盒是能進(jìn)行本發(fā)明所述的免疫試驗(yàn)的診斷
試劑盒。盡管本發(fā)明免疫試驗(yàn)的細(xì)節(jié)可以隨采用的具體形式而變化，檢測(cè)樣品中hFAS 的方法通常包括使樣品接觸在免疫反應(yīng)性條件下能與hFAS特異性反應(yīng)的抗體。所述 抗體在免疫反應(yīng)性條件下能夠結(jié)合hFAS，可以直接或間接檢測(cè)到所存在的結(jié)合抗體。 現(xiàn)在已經(jīng)大致描述了本發(fā)明，通過(guò)參考以下說(shuō)明性的，除非特別說(shuō)明不是限制 本發(fā)明的實(shí)施例能更容易理解本發(fā)明。
實(shí)施例
實(shí)施例l:產(chǎn)生抗體
產(chǎn)生多克隆抗體的大致方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知。此外，制備單克隆抗體以 及衍生物和其片段的方法也已知。通常，這兩種方法都包括用hFAS蛋白質(zhì)或其多肽 免疫能夠產(chǎn)生抗體的動(dòng)物。所述hFAS蛋白質(zhì)可以是獲自合適來(lái)源的純化的材料，例 如但不限于產(chǎn)生hFAS蛋白質(zhì)的人細(xì)胞。
作為非限制性例子，采用根據(jù)LinnTC (1981) Arch. Biochem. Biophys. 209， 613-619改寫(xiě)的方法。簡(jiǎn)單來(lái)講，使ZR-75-l細(xì)胞生長(zhǎng)成約80-90。/。的集落，用HBSS 沖洗，在冰上裂解。將所述裂解細(xì)胞刮下，在冰上進(jìn)行同質(zhì)化處理，然后在4(TC離 心。除去上清液，再懸于含有7.5WPEG(平均分子量為8000)的裂解緩沖液(20mM Tris-HCl、 ph7.5、 lmMEDTA、 O.lmMPMSF、 0.1。/。意格倍(Igepal)CA-630)。
得到的溶液在4'C搖晃60分鐘，4。C離心，接著將上清液移到新瓶中。加入含 有PEG 8000的裂解緩沖液，直到PEG終濃度達(dá)15。/。，然后重復(fù)搖晃和離心步驟。 除去上清液，將沉淀再懸于pH為7.4的20mMK2HP04中，4。C搖晃溶液過(guò)夜，然后 過(guò)濾通過(guò)0.45pm過(guò)濾器。將經(jīng)過(guò)濾的溶液加到Mono Q柱上，用pH7.4的20mM K2HP04以連續(xù)梯度直到1M KCL進(jìn)行洗脫。通過(guò)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析FAS 片段。確定和收集含有分子量約為270kD的FAS的片段。然而，在本發(fā)明抗體的制備中，優(yōu)選不使用美國(guó)專利5,759,791的實(shí)施例16中 提到的免疫原或方法，以降低產(chǎn)生該文中所述的單克隆抗體的可能性。作為非限制 性例子，可以采用技術(shù)人員已知的脾內(nèi)免疫(參見(jiàn)例如Journal of Tissue Culture Methods, 12:3， 1989)。 M3、 M6和抗-Hpr抗體的制備不采用脾內(nèi)免疫。
實(shí)施例2: ELISA抗原捕捉檢測(cè)FAS蛋白質(zhì)
ELISA平板各行每孔中涂上Mab濃度為2.5pg/ml的lOOpl陽(yáng)性捕捉抗體，和含 有63-2D8和63-4G4(5|ag/ml總抗體)的PBS緩沖液(西格瑪(Sigma)第P-3813號(hào)產(chǎn)品或 等效物)。其它各行每孔中涂上Mab濃度為2.5pg/ml的lOOpl陰性捕捉抗體，和含有 兩種靶向除FAS外的抗原的Mab(5pg/ml總抗體)的PBS緩沖液。可以將所述涂布平 板在4。C下保存過(guò)夜。用PBS洗滌緩沖液(含有吐溫20和乙基汞硫代水楊酸鈉的西格 瑪?shù)赑-3813號(hào)產(chǎn)品或其等效物)洗滌所述平板4次。
平板每孔用150^1 ELISA稀釋/封閉緩沖液(含有HEPES、 Triton-X、 BSA、正常 羊IgG、正常家兔IgG和小鼠MAb的西格瑪?shù)赑-3813號(hào)產(chǎn)品或其等效物)封閉，37°C 培養(yǎng)1小時(shí)。用PBS洗滌緩沖液洗滌所述平板4次。往平板中加入hFAS蛋白質(zhì)(陽(yáng) 性抗原)、陰性抗原和未知樣品。
通過(guò)用ELISA稀釋/封閉緩沖液將ELISA平板中的陽(yáng)性和陰性涂布孔中的hFAS 蛋白質(zhì)從313ng/ml到1.2ng/ml進(jìn)行連續(xù)稀釋對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行滴度。 一旦進(jìn)行滴度，各 組孔中都含有l(wèi)OOpl的各抗原稀釋物。往至少3個(gè)陰性和陽(yáng)性涂布孔中加入ELISA 稀釋/封閉緩沖液，作為陰性抗原對(duì)照。用稀釋/封閉緩沖液l:2稀釋未知樣品，使體 積為ioow，將它們加入兩個(gè)完全一樣的陽(yáng)性和陰性捕捉涂布孔中。
在37'C培養(yǎng)平板1小時(shí)，然后用PBS洗滌緩沖液洗滌4次。將lOOpl濃度為 0.313|ig/ml的生物素化的檢測(cè)器抗體Mab的ELISA稀釋/封閉緩沖液63-3C10加入 各孔。37X:培養(yǎng)平板l小時(shí)，然后用PBS洗滌緩沖液洗滌4次。
將10(^1稀釋成0.05嗎/ml的偶聯(lián)(HRP-標(biāo)記的抗生素蛋白鏈菌素)加入各孔。 37°。培養(yǎng)平板1小時(shí)，然后用PBS洗滌緩沖液洗滌4次。制備酶底物(ABTS 2-組分)， 將100pl組合底物加入各孔，然后37°<3培養(yǎng)30分鐘。
測(cè)量405-410nm處的光密度(OD)。比較陰性抗原對(duì)照和FAS標(biāo)準(zhǔn)曲線間的OD 值。通過(guò)選擇OD值大于陰性抗原對(duì)照平均值處的FAS濃度確定靈敏度或檢測(cè)最低 點(diǎn)(LPD)。 LPD正常應(yīng)該比陰性對(duì)照平均值高約0.100。然而，應(yīng)該注意到，LPD的 上述界定是任意的，本發(fā)明實(shí)踐中還可以采用其它LPD。所有樣品和對(duì)照的陰性捕 捉孔的OD值應(yīng)該低于0.300 OD?？梢匀庋圩x取ELISA平板。認(rèn)為孔中顏色變化強(qiáng)度比無(wú)抗原(陰性)對(duì)照大為陽(yáng)性。
無(wú)論先前有沒(méi)有逐一納入，本文引用的所有參考文獻(xiàn)，包括專利、專利申請(qǐng)和 出版物，均以其全文納入本文作參考。
現(xiàn)在已經(jīng)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了全面描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)意識(shí)到，在不背離本發(fā) 明精神和范圍下，無(wú)需進(jìn)行試驗(yàn)，可以用大范圍內(nèi)的等效參數(shù)、濃度和條件均可進(jìn) 行同樣的發(fā)明。
盡管本發(fā)明與其具體實(shí)施方式
結(jié)合進(jìn)行了描述，應(yīng)該理解還可以有另外的變型。 本發(fā)明企圖涵蓋大致遵從本發(fā)明原理的本發(fā)明任何變體、應(yīng)用或適應(yīng)性改變，包括 本發(fā)明所屬領(lǐng)域內(nèi)已知或慣例推導(dǎo)出的這類(lèi)對(duì)本發(fā)明的背離，和可用于上下文中提 到的必要特征的這類(lèi)對(duì)本發(fā)明的背離。
權(quán)利要求
1. 一種單克隆抗體或其片段，其特異性結(jié)合人脂肪酸合酶(hFAS)但不是稱為M3或M6的單克隆抗體。
2. 如權(quán)利要求1所述的單克隆抗體或其片段，其特征在于，所述單克隆抗體或其 片段能結(jié)合約250kD的hFAS多肽和/或約134kD的hFAS蛋白水解產(chǎn)物。
3. 如權(quán)利要求1所述的單克隆抗體或其片段，其特征在于，所述單克隆抗體或其 片段能結(jié)合MCF-7人乳腺癌細(xì)胞裂解液中與稱為M3或M6的單克隆抗體所結(jié)合多 肽群體不同的多肽群體，或能結(jié)合胰蛋白酶消化的hFAS多肽中與稱為M3或M6的單克隆抗體所結(jié)合多肽 群體不同的多肽群體。
4. 如權(quán)利要求1所述的單克隆抗體或其片段，其特征在于，所述單克隆抗體或其 片段結(jié)合人脂肪酸合酶(hFAS)的結(jié)合特性類(lèi)似于稱為M3的單克隆抗體，和a) 結(jié)合全長(zhǎng)hFAS的親和力比M3更高；或b) 結(jié)合全長(zhǎng)hFAS的親和力比M3更低。
5. 如權(quán)利要求4所述的單克隆抗體或其片段，其特征在于，所述單克隆抗體或其 片段不結(jié)合胰蛋白酶消化的hFAS多肽群中約70kD的hFAS多肽片段，或還能結(jié)合胰蛋白酶消化的hFAS多肽群中約50kD的hFAS多肽片段。
6. 如權(quán)利要求4所述的單克隆抗體或其片段，其特征在于，所述抗體是34-6E7， 它于2006年8月17日作為雜交瘤克隆34-6E7-2G10-15保藏于ATCC，指定登錄號(hào)為_(kāi)，或是63-2D8，它于2006年8月17日作為雜交瘤克隆63-2D8-2E2-lD2保藏于ATCC，指定登錄號(hào)為_(kāi)，或是63-4G4，它于2006年8月17日作為雜交瘤克隆34-63-4G4-B3-2F3保藏于ATCC，指定登錄號(hào)為 ，63-3C10,它于2006年8月17日作為雜交瘤克隆63-3C10-2B8保藏于ATCC，指定登錄號(hào)為
7. 如權(quán)利要求1所述的單克隆抗體或其片段，其特征在于，所述單克隆抗體或其 片段結(jié)合人脂肪酸合酶(hFAS)的結(jié)合特性類(lèi)似于稱為M6的單克隆抗體，和a) 不結(jié)合人MCF-7乳腺癌細(xì)胞裂解液中的約60kD多肽；或b) 能結(jié)合人MCF-7乳腺癌細(xì)胞裂解液中的約40kD多肽。
8. 如權(quán)利要求1所述的單克隆抗體或其片段，其特征在于，所述單克隆抗體或其片段結(jié)合人脂肪酸合成酶(hFAS)的結(jié)合特性類(lèi)似于稱為M6的單克隆抗體，禾口a) 不結(jié)合人ZR-75-l乳腺癌細(xì)胞胰蛋白酶消化裂解液中的約45kD、約34kD、約 16kD、約37kD、約28kD或約7kD多肽；或b) 能結(jié)合人ZR-75-l乳腺癌細(xì)胞胰蛋白酶消化裂解液中的約115kD、約90kD、 約50kD、約85kD、約78kD、約50kD、約40kD或約17kD多肽。
9. 如權(quán)利要求1所述的單克隆抗體或其片段，其特征在于，所述單克隆抗體或其 片段結(jié)合人脂肪酸合成酶(hFAS)的結(jié)合特性類(lèi)似于稱為M6的單克隆抗體，和a) 不結(jié)合人MCF-7乳腺癌細(xì)胞裂解液中的約125kD、約32kD或約9kD多肽；或b) 能結(jié)合人ZR-75-l乳腺癌細(xì)胞胰蛋白酶消化裂解液中的約85kD、約50kD、約 43kD或約24kD多肽。
10. —種表達(dá)權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述抗體的細(xì)胞系。
11. 一種含有權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述抗體或其片段和hFAS多肽的復(fù)合物的組 合物，所述抗體或其片段任選被標(biāo)記。
12. —種通過(guò)免疫組織化學(xué)檢測(cè)FAS多肽的方法，所述方法包括用權(quán)利要求1-9 中任一項(xiàng)所述的抗體或其片段檢測(cè)樣品中的所述多肽。
13. —種裝有權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的抗體或其片段的裝置或試劑盒，所述 裝置或試劑盒任選裝有檢測(cè)所述抗體或其片段，或含有所述抗體的復(fù)合物的標(biāo)記物。
14. 如權(quán)利要求13所述的裝置，其特征在于，所述裝置采用夾心試驗(yàn)或競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn) 檢測(cè)樣品中存在的hFAS的一種側(cè)向流動(dòng)裝置。
15. —種檢測(cè)hFAS多肽的存在的方法，所述方法包括形成含有權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的抗體或其片段和hFAS多肽的復(fù)合物；和 任選用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)或放射免疫試驗(yàn)(RIA)檢測(cè)所述復(fù)合物。
16. 如權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于，所述hFAS多肽存在于個(gè)體樣品中， 檢測(cè)到所述復(fù)合物表明所述對(duì)象患有癌癥。
17. —種監(jiān)測(cè)對(duì)象疾病病程或復(fù)發(fā)的方法，所述方法包括根據(jù)形成含有權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的抗體或其片段和所述hFAS多肽的復(fù) 合物來(lái)測(cè)定所述對(duì)象樣品中的hFAS多肽水平，其中任選用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)或放射免疫試驗(yàn)(RIA)進(jìn)行所述測(cè)定，和 其中hFAS水平表明所述疾病的病程或復(fù)發(fā)。
18. 如權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，所述疾病是癌癥。
19. 一種確定是否給予對(duì)象FAS抑制劑的方法，所述方法包括 根據(jù)形成含有權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的抗體或其片段和所述hFAS多肽的復(fù)合物來(lái)測(cè)定所述對(duì)象樣品中的hFAS多肽水平；和根據(jù)檢測(cè)到的hFAS水平確定是否給予FAS抑制劑其中任選用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)或放射免疫試驗(yàn)(RIA)進(jìn)行所述測(cè)定。
20. —種向含有惡變前細(xì)胞的對(duì)象提供化學(xué)保護(hù)的方法，所述方法包括 根據(jù)形成含有權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的抗體或其片段和所述hFAS多肽的復(fù)合物來(lái)測(cè)定所述對(duì)象樣品中的hFAS多肽水平；和根據(jù)檢測(cè)到的hFAS水平給予所述對(duì)象FAS抑制劑，其中任選用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)或放射免疫試驗(yàn)(RIA)進(jìn)行所述測(cè)定。
全文摘要
本發(fā)明涉及能識(shí)別人脂肪酸合酶(hFAS)的與先前已知抗-hFAS抗體不同的單克隆抗體(MAb)。還提供了包含此MAb的組合物、衍生物和試劑盒，以及在各種應(yīng)用中利用此MAb的方法。
文檔編號(hào)C12N9/10GK101432308SQ200680036509
公開(kāi)日2009年5月13日 申請(qǐng)日期2006年8月17日 優(yōu)先權(quán)日2005年8月17日
發(fā)明者J·L·埃爾德瑞琪, S·邁杰豪西 申請(qǐng)人:菲思根診斷學(xué)有限公司