專利名稱：：用于擴(kuò)增、定量和鑒定核酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及核酸擴(kuò)增、鑒定和定量的方法，尤其是用于診斷、法醫(yī)和研究用途的擴(kuò)增、定量或鑒定多種基因或基因表達(dá)產(chǎn)物的改進(jìn)方法。本發(fā)明還涉及從少量和已發(fā)生降解的核酸樣品中更準(zhǔn)確地?cái)U(kuò)增、鑒定和定量多種核酸序列。具體地，本發(fā)明涉及同時(shí)擴(kuò)增和定量多種核酸分子，并將參考本申請(qǐng)?jiān)谙挛闹羞M(jìn)行描述。但是應(yīng)理解，本發(fā)明不限于此特定用途領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：本說(shuō)明書(shū)全文中任何現(xiàn)有技術(shù)的討論不應(yīng)以任何方式認(rèn)為是承認(rèn)此現(xiàn)有技術(shù)是公知的，或構(gòu)成本領(lǐng)域普通知識(shí)的一部分。用于分析基因表達(dá)的已知方法包括使用PCR或巢式PCR以從代表許多不同基因的cDNA分子庫(kù)中擴(kuò)增代表單個(gè)基因表達(dá)產(chǎn)物的選定cDNA序列。在單基因PCR反應(yīng)中，一般在一輪PCR中使用一對(duì)引物擴(kuò)增來(lái)自單個(gè)基因的基因表達(dá)產(chǎn)物。在典型的巢式PCR擴(kuò)增反應(yīng)中，通過(guò)兩次連續(xù)PCR^JI擴(kuò)增單個(gè)特別稀有的序列，每一次反應(yīng)各由使用單個(gè)巢式引物組合的30-40個(gè)循環(huán)組成。巢式PCR通常用于獲得稀有序列的克隆，通常不考慮用于定量基因表達(dá)或鑒定基因。為了使用PCR定量基因表達(dá)的水平，通常使用常規(guī)定量實(shí)時(shí)PCR(qPCR)檢測(cè)PCR產(chǎn)物在每個(gè)擴(kuò)增循環(huán)后的實(shí)時(shí)積累，以估計(jì)每種目的PCR產(chǎn)物的量。這通常應(yīng)用可檢測(cè)的報(bào)告子例如嵌入染料、小溝結(jié)合染料或熒光探針，由此使用光來(lái)^JL報(bào)告子發(fā)出熒光，所得熒光通常使用CCD照相機(jī)或光電倍增檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)，例如在US6,713,297中公開(kāi)的，其通過(guò)引用并入本文。盡管單基因分析方法現(xiàn)已成為常規(guī)，但是當(dāng)多重PCR中必須在同一PCR反應(yīng)內(nèi)擴(kuò)增多種基因表達(dá)產(chǎn)物時(shí)，就會(huì)產(chǎn)生困難。在多重?cái)U(kuò)增反應(yīng)中，每一種單獨(dú)的基因表達(dá)產(chǎn)物必須在PCR過(guò)程中竟?fàn)幏磻?yīng)組分，使得在PCR反應(yīng)開(kāi)始時(shí)以高拷貝數(shù)存在的高表達(dá)基因產(chǎn)物通過(guò)隔絕關(guān)M應(yīng)組分而有效阻止低拷貝數(shù)基因產(chǎn)物的擴(kuò)增。這會(huì)產(chǎn)生可能僅代表少數(shù)高表達(dá)基因的擴(kuò)增基因產(chǎn)物庫(kù)。重復(fù)實(shí)驗(yàn)中存在很大的變異，使得對(duì)這些產(chǎn)物的分析更為復(fù)雜，從而準(zhǔn)確定量基因表達(dá)變得十分困難。盡管對(duì)引物和反應(yīng)組分的優(yōu)化可在一定程度上減輕這一問(wèn)題，但是這通常包括大量的實(shí)驗(yàn)，并且隨著在多重反應(yīng)中待分析基因數(shù)量的增加而變得更為困難得多，這樣，能在多方面優(yōu)化的系統(tǒng)中可靠分析的基因最大數(shù)量通常為四種基因?；虮磉_(dá)分析通常需要估計(jì)每種基因的表達(dá)量，這在多重PCR中更為復(fù)雜。解決這一問(wèn)題的現(xiàn)有方法包括應(yīng)用熒光檢測(cè)系統(tǒng)例如Taqman⑧探針，通過(guò)與每種基因表達(dá)產(chǎn)物結(jié)合并釋放特定的可檢測(cè)熒光來(lái)對(duì)它們分別進(jìn)行檢測(cè)(ExnerM.M.和Lewinski.M.A.(2002))。使用LightCycler和ABIPRISM7700序列檢測(cè)系統(tǒng)的多重實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)的靈敏度取決于DNA聚合酶的濃度(MolecularandCellularProbes.2002Oct;16(5):351-7)。這些探針及其應(yīng)用描述于美國(guó)專利號(hào)5，210，015;5,487,972;5,804,375;5,994,056;5,538,848和6,030,787，它們通過(guò)引用并入本文。這需要實(shí)時(shí)熱循環(huán)儀器，以檢測(cè)不同波長(zhǎng)的熒光。另外，Taqman⑧探針售價(jià)昂貴，并且可能由于探針結(jié)合的特定序列要求而限制可分析的特定序列區(qū)域。其它熒光方法包括應(yīng)用通用檢測(cè)系統(tǒng)，例如SYBR綠染料，它在^A到來(lái)自任何基因表達(dá)產(chǎn)物的擴(kuò)增DNA時(shí)發(fā)出熒光，如美國(guó)專利No.5,436,134和5,658,751所公開(kāi)，其通過(guò)引用并入本文。盡管SYBR綠染料并不昂貴，而且具有優(yōu)異的熒光特性，但是它通常不適于在多重PCR中估計(jì)基因表達(dá)水平，因?yàn)闊o(wú)法可靠地對(duì)每種基因產(chǎn)物確定熒光來(lái)源。即使不考慮用作檢測(cè)系統(tǒng)的熒光探針或SYBR綠染料，多重PCR仍然有基因表達(dá)產(chǎn)物竟?fàn)幏磻?yīng)組分的相同問(wèn)題，從而阻礙了對(duì)多種基因的基因表達(dá)的準(zhǔn)確定量。葛遽量才法多重基因表達(dá)測(cè)量的替代方法包括應(yīng)用微陣列。微陣列可用于同時(shí)定量數(shù)千種基因的表達(dá)。但是微陣列通常需要大量的操作員訓(xùn)練，大量的樣品RNA以及昂貴的設(shè)備。另夕卜，盡管可分析的基因數(shù)量大，但是所得的基因表達(dá)定量不準(zhǔn)確得多，經(jīng)常導(dǎo)致假陽(yáng)性。因此，需要簡(jiǎn)單且廉價(jià)的方法，其適用于需要準(zhǔn)確定量多種基因表達(dá)或需要檢測(cè)特定核酸或需要產(chǎn)生多種核酸產(chǎn)物的任何情況。本發(fā)明特別適用于從極少量的樣品中擴(kuò)增和檢測(cè)核酸，所迷樣品例如血點(diǎn)、激光切割顯微術(shù)樣品、單細(xì)胞和包含已部分?jǐn)嗔训暮怂岬臉悠?，例如取自陳年樣品和甲醛固定石蠟包?flrmalin-fixedparaffin-embedded,FFPE)切片的樣品。但是，本發(fā)明的方法同樣可用于較大樣品和高質(zhì)量的樣品?？墒褂帽景l(fā)明的情況實(shí)例包括但不僅限于診斷；預(yù)后；法醫(yī)；環(huán)境和產(chǎn)品測(cè)試和監(jiān)測(cè)；生物武器檢測(cè)；研究等。因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是克服或改善現(xiàn)有技術(shù)的至少一個(gè)缺點(diǎn)，或者提供可用的替代方法。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明涉及核酸擴(kuò)增和定量的方法，特別是用于診斷、法醫(yī)和研究用途的擴(kuò)增和定量或鑒定多種基因表達(dá)產(chǎn)物的改進(jìn)方法。所述方法特別適用于使用少量起始材料定量或鑒定多種基因的表達(dá)，還可用于已發(fā)生降解的樣品，例如獲得自檔案或法醫(yī)材料的樣品。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解，本發(fā)明的方法同樣可用于擴(kuò)增來(lái)自其它來(lái)源(例如基因組DNA或病毒DNA)的核酸。本發(fā)明包括使用兩輪串聯(lián)的擴(kuò)增操作，包括擴(kuò)增多種選定核酸序列的第一輪多重?cái)U(kuò)增應(yīng)^應(yīng)，以及接下來(lái)的多個(gè)第二輪擴(kuò)增反應(yīng)，所述多個(gè)第二輪擴(kuò)增反應(yīng)通常各自進(jìn)一步擴(kuò)增所述選定的核酸序列之一。根據(jù)本發(fā)明的第一個(gè)方面，提供了從核酸分子庫(kù)中擴(kuò)增多種選定核酸分子的方法，其包括(a)在第一輪多重?cái)U(kuò)增反應(yīng)中擴(kuò)增多種選定的核酸分子，所述反應(yīng)包含多種外部引物對(duì)，每對(duì)引物對(duì)一種選定核*列具有特異性，其中允許所述擴(kuò)增反應(yīng)進(jìn)行到擴(kuò)增子之間對(duì)反應(yīng)組分發(fā)生顯著竟?fàn)幹暗狞c(diǎn)；和(b)在多個(gè)第二輪擴(kuò)增反應(yīng)中進(jìn)一步擴(kuò)增所述選定的核酸分子，每個(gè)反應(yīng)各包含作為模板的已完成多重反應(yīng)的一部分以及至少一對(duì)內(nèi)部引物，每對(duì)引物對(duì)一種所述選定核酸序列具有特異性，使得每個(gè)第二輪反應(yīng)分別進(jìn)一步擴(kuò)增多種選定核酸分子中的亞組。根據(jù)本發(fā)明的第二方面，提供了從核酸分子庫(kù)中擴(kuò)增多種選定核酸分子的方法，其包括(a)在第一輪多重?cái)U(kuò)增反應(yīng)中擴(kuò)增多種選定的核酸分子，所述反應(yīng)包含多種外部引物對(duì)，每對(duì)引物對(duì)一種選定核酸序列具有特異性，其中允許所述擴(kuò)增反應(yīng)進(jìn)行到擴(kuò)增子之間對(duì)反應(yīng)組分發(fā)生顯著竟?fàn)幹暗狞c(diǎn)；和(b)在多個(gè)第二輪擴(kuò)增反應(yīng)中進(jìn)一步擴(kuò)增所述選定的核酸分子，每個(gè)反應(yīng)包含作為模板的已完成多重反應(yīng)物的一部分以及至少一對(duì)引物，每對(duì)引物包含內(nèi)部引物和一種所述外部引物，并對(duì)一種所述選定核酸序列具有特異性，使得每個(gè)第二輪反應(yīng)分別進(jìn)一步擴(kuò)增多種選定核酸分子中的亞組。根據(jù)本發(fā)明的第三方面，提供了在核酸分子庫(kù)中估計(jì)選定核酸分子的數(shù)量的方法，其包括(a)在第一輪多重?cái)U(kuò)增反應(yīng)中擴(kuò)增多種選定的核酸分子，所述反應(yīng)包含多種外部引物對(duì)，每對(duì)引物對(duì)一種選定核^列具有特異性，其中允許所述擴(kuò)增反應(yīng)進(jìn)行到擴(kuò)增子之間對(duì)反應(yīng)組分發(fā)生顯著竟?fàn)幹暗狞c(diǎn)；(b)在多個(gè)第二輪擴(kuò)增反應(yīng)中進(jìn)一步擴(kuò)增所述選定的核酸分子，每個(gè)反應(yīng)各包含可檢測(cè)報(bào)告子、作為模板的已完成多重反應(yīng)的一部分以及至少一對(duì)內(nèi)部引物，每對(duì)引物對(duì)一種所a定核酸序列具有特異性，由此每個(gè)第二輪^^應(yīng)分別進(jìn)一步擴(kuò)增多種選定核酸分子中的亞組；和(c)通過(guò)可檢測(cè)報(bào)告子來(lái)監(jiān)測(cè)每個(gè)第二輪擴(kuò)增反應(yīng)，從而估計(jì)每種選定序列的選定核酸分子的數(shù)量。根據(jù)本發(fā)明的第四方面，提供了估計(jì)核酸分子庫(kù)中選定核酸分子的數(shù)量的方法，其包括(a)在第一輪多重?cái)U(kuò)增反應(yīng)中擴(kuò)增多種選定的核酸分子，所述反應(yīng)包含多種外部引物對(duì)，每對(duì)引物對(duì)一種選定核^f列具有特異性，其中允許所述擴(kuò)增反應(yīng)進(jìn)行到擴(kuò)增子之間對(duì)^^應(yīng)組分發(fā)生顯著竟?fàn)幹暗狞c(diǎn)；和(b)在多個(gè)第二輪擴(kuò)增反應(yīng)中進(jìn)一步擴(kuò)增所述選定的核酸分子，每個(gè)反應(yīng)包含可檢測(cè)報(bào)告子、作為模板的已完成多重反應(yīng)的一部分以及至少一對(duì)引物，每對(duì)引物包含內(nèi)部引物和一種所述外部引物，并對(duì)一種選定核酸序列具有特異性，使##個(gè)第二輪反應(yīng)分別進(jìn)一步擴(kuò)增所述多種選定核酸分子中的亞組；和(c)通過(guò)可檢測(cè)報(bào)告子來(lái)監(jiān)測(cè)每個(gè)第二輪擴(kuò)增反應(yīng)，從而估計(jì)每種選定序列的選定核酸分子的數(shù)量。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)第一和第三方面使用完全為巢式形式的多重串聯(lián)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(MultiplexTandem-PolymeraseChainReaction,MT國(guó)PCR)方法，由此每種選定的核酸分子在第一輪擴(kuò)增中使用一對(duì)外部引物進(jìn)行擴(kuò)增，在第二輪擴(kuò)增中使用兩種內(nèi)部引物進(jìn)行擴(kuò)增。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)第二和第四方面使用半巢式MT-PCR方法，由此在第一輪擴(kuò)增中使用一對(duì)外部引物擴(kuò)增每種選定的核酸分子，在第二輪擴(kuò)增中使用包含在第一輪擴(kuò)增中所用外部引物中的一種以及一種內(nèi)部引物的引物對(duì)進(jìn)一步擴(kuò)增選定的核酸序列。優(yōu)選地，所述熒光才艮告子是SYBR綠或SYTO-9染料。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解，還預(yù)期可使用其它的熒光染料。在一些實(shí)施方案中，所述熒光報(bào)告子是熒光探針。在一些實(shí)施方案中，第二輪擴(kuò)增反應(yīng)包含多種引物對(duì)和多種熒光探針，使得每種選定序列的多種選定核酸分子均被擴(kuò)增，并通過(guò)熒光探針來(lái)定量，每種熒光探針?lè)謩e對(duì)一種選定的核酸序列具有特異性。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解，所述第二輪擴(kuò)增反應(yīng)可同時(shí)或依次實(shí)施。優(yōu)選地，所述核酸分子包括DNA分子。優(yōu)選地，第二輪擴(kuò)增>^應(yīng)中所包含引物的Tm高于第一輪擴(kuò)增反應(yīng)中所包含的至少一種外部引物，使得在第二輪擴(kuò)增反應(yīng)中的寡核苷酸引發(fā)顯著偏向于對(duì)具有該較高Tm的引物有利。在一些實(shí)施方案中，至少一種外部引物包含UTP核苷酸，由此所述引物適于通過(guò)UNG酶進(jìn)行消化，在第一輪擴(kuò)增結(jié)束時(shí)通過(guò)UNG酶消化而除去外部引物，由此基本防止了第一輪引物對(duì)第二輪擴(kuò)增反應(yīng)的污染。優(yōu)選地，根據(jù)在反應(yīng)起始時(shí)使用的核酸量來(lái)選擇所使用的多重?cái)U(kuò)增循環(huán)數(shù)，從而通過(guò)將其擴(kuò)增至擴(kuò)增子之間對(duì)反應(yīng)組分發(fā)生顯著竟?fàn)幹暗狞c(diǎn)來(lái)使得擴(kuò)增過(guò)程中擴(kuò)增子之間對(duì)反應(yīng)組分的任何竟?fàn)幮?yīng)最小化，同時(shí)提供對(duì)每種選定核酸序列的特異性擴(kuò)增。例如，當(dāng)使用約50ng至約500ng的核酸時(shí)，優(yōu)選約10個(gè)循環(huán)的多重?cái)U(kuò)增。當(dāng)使用約0.5ng至約50ng的核酸時(shí)，優(yōu)選約15個(gè)循環(huán)的多重?cái)U(kuò)增。當(dāng)使用約0.01ng至約0.5ng的核酸時(shí)，優(yōu)選約20個(gè)循環(huán)的多重?cái)U(kuò)增。本領(lǐng)域技術(shù)人員從本發(fā)明說(shuō)明書(shū)提供的教導(dǎo)中將十分清楚，當(dāng)輸入更少量的核酸時(shí)，可使用更大的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)。優(yōu)選地，使第一輪多重?cái)U(kuò)增反應(yīng)進(jìn)行約1至約30輪。更優(yōu)選地，第一輪多重?cái)U(kuò)增反應(yīng)允許進(jìn)行約5至約25輪，更優(yōu)選地，使第一輪多重?cái)U(kuò)增反應(yīng)進(jìn)行約5至約20輪，最優(yōu)選地，使第一輪多重?cái)U(kuò)增反應(yīng)進(jìn)行約10至約20輪。盡管通常可使用標(biāo)準(zhǔn)多重PCR反應(yīng)來(lái)擴(kuò)增、定量和鑒定僅為有限數(shù)目的不同序列(例如4種序列)，但是令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的方法可用于擴(kuò)增、定量和/或鑒定超過(guò)150種選定的序列。優(yōu)選地，本發(fā)明的多重?cái)U(kuò)增反應(yīng)擴(kuò)增多于約4種選定的核酸分子。更優(yōu)選地，所述多重?cái)U(kuò)增反應(yīng)擴(kuò)增約4至150種選定的核酸分子。更優(yōu)選地，所述多重?cái)U(kuò)增反應(yīng)擴(kuò)增約10至150種選定的核酸分子，最優(yōu)選地，所述多重?cái)U(kuò)增>^應(yīng)擴(kuò)增約20至100種選定的核酸分子。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，對(duì)于給定的樣品和引物組，在第一輪多重?cái)U(kuò)增反應(yīng)中可有效擴(kuò)增的選定核酸分子的最高數(shù)目必須在每種情況下才艮據(jù)所需的擴(kuò)增水平和在第二輪擴(kuò)增中所得定量的準(zhǔn)確度來(lái)確定。優(yōu)選地，所述方法用于檢測(cè)多態(tài)性、突變、插入和缺失的方法中。在一個(gè)實(shí)施方案中，在第二輪擴(kuò)增中使用熒光探針，以檢測(cè)核酸變體，例如多態(tài)性、突變、SNP、曱基化(亞硫酸氫鹽處理之后)、插入和缺失。在一些實(shí)施方案中，所述方法用于疾病和病癥的診斷。在一些實(shí)施方案中，所述方法用于瘤的診斷。在一些實(shí)施方案中，所述瘤是乳腺癌。在一些實(shí)施方案中，所述瘤是結(jié)腸直腸癌。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解，本發(fā)明的方法將可用于可通過(guò)任何給定核酸序列的擴(kuò)增和/或定量來(lái)檢測(cè)的任何疾病或病癥的診斷測(cè)試。在一些實(shí)施方案中，所述方法用于檢測(cè)和鑒定選定的生物。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)高分辨率熔解分析(highresolutionmeltanalysis)來(lái)檢測(cè)和鑒定所述生物。優(yōu)選地，所述生物選自細(xì)菌、病毒、真菌、支原體和寄生蟲(chóng)。優(yōu)選地，所述方法包括高分辨率熔解曲線分析，優(yōu)選產(chǎn)生分辨率范圍為約0.05x:到約0.02x:、更優(yōu)選分辨率小于0.02"c的熔解曲線。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解，本發(fā)明的方法可應(yīng)用于任何可被擴(kuò)增的遺傳材料，其中此材料可來(lái)源于任何生物。優(yōu)選地，所述擴(kuò)增反應(yīng)在熱循環(huán)裝置中自動(dòng)進(jìn)行。優(yōu)選地，所述熱循環(huán)裝置是多孔實(shí)時(shí)熱循環(huán)裝置。在一些實(shí)施方案中，所述熱循環(huán)裝置是連續(xù)流PCR裝置。在一些實(shí)施方案中，所述熱循環(huán)裝置是旋轉(zhuǎn)式熱循環(huán)裝置。根據(jù)本發(fā)明的第五個(gè)方面，提供了鑒定和/或定量至少一種選定的核酸序列的方法，其包括如下步驟(i)將一種或多種選定核酸序列與一種或多種可檢測(cè)才艮告子混合；(ii)通過(guò)測(cè)定所述一種或多種可檢測(cè)報(bào)告子產(chǎn)生的所述信號(hào)來(lái)產(chǎn)生熔解曲線；(iii)由所述熔解曲線鑒定和/或定量所述一種或多種選定的核醋列。優(yōu)選地，產(chǎn)生分辨率范圍為約0.05匸到約0.02匸、更優(yōu)選分辨率小于0.02t:的熔解曲線。圖1.顯示在MT-PCR中引物的排列的示意圖，舉例說(shuō)明了串聯(lián)和半串聯(lián)實(shí)施方案(分別為A和B)，每種方案均以擴(kuò)增和定量4種不同基因的基因表達(dá)產(chǎn)物(1-4)的方法來(lái)顯示。圖2A.通過(guò)半串聯(lián)MT-PCR對(duì)單個(gè)RNA樣品實(shí)施的24種一式三份的基因表達(dá)測(cè)量，其在CorbettResearchRG3000上使用表1和表2的引物以及所述方法一式三份進(jìn)行測(cè)量。圖2B.圖2A所示24種基因測(cè)量的相關(guān)熔解曲線。圖2C.如使用Bioanalyzer分析的圖2A所示24種基因的經(jīng)MT-PCR所形成的產(chǎn)物。圖3A.使用來(lái)源于單個(gè)FFPE材料切片的cDNA進(jìn)行的24種基因表達(dá)產(chǎn)物擴(kuò)增曲線(每種均為一式三份)，其已首先使用15個(gè)循環(huán)的多重PCR作為72種選定基因表達(dá)產(chǎn)物的庫(kù)而進(jìn)行了擴(kuò)增，其中24種隨后在第二輪PCR中進(jìn)行定量。圖3B.圖3A中所示24種基因測(cè)量的熔解曲線。圖4A.如所示在最初20個(gè)循環(huán)的多重?cái)U(kuò)增之后第二輪PCR中得自10pg輸入RNA的24種基因表達(dá)產(chǎn)物擴(kuò)增曲線(每種均為一式三份)。圖4B.圖4A中所示24種基因測(cè)量的熔解曲線。圖5.確定合適的多重?cái)U(kuò)增循環(huán)數(shù)，以避免在擴(kuò)增過(guò)程中擴(kuò)增子之間對(duì)反應(yīng)組分的竟?fàn)?。目前的一組基因中豐度最高的基因(BTF3)在多重PCR步驟#^下的PCR。展示了使用來(lái)自5ng、50ng和500ng輸入RNA的cDNA開(kāi)始每個(gè)擴(kuò)增的擴(kuò)增曲線。圖6A.相對(duì)于比^J^因的基因表達(dá)定量在不同的輸入RNA量下保持不變。圖6B.改變多重?cái)U(kuò)增循環(huán)數(shù)及其對(duì)基因表達(dá)定量的影響。圖7A.第二輪擴(kuò)增之后獲得的熔解曲線，用于測(cè)試在串聯(lián)MT-PCR的第二輪擴(kuò)增反應(yīng)中使用0.5單位Taq/反應(yīng)的效果。圖7B.與圖7A所示相同的實(shí)驗(yàn)，其中使用l.O單位的Taq。圖7C.第二輪擴(kuò)增之后獲得的熔解曲線，用于測(cè)試在串聯(lián)MT-PCR的多重?cái)U(kuò)增步驟之前使用20單位逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄的效果。圖7D.與圖7C所示相同的實(shí)驗(yàn)，其中使用200單位的逆轉(zhuǎn)錄酶。圖8.MT-PCR的其他診斷潛力。EGFR基因在15種細(xì)胞系中的表達(dá)，其中BT20和SKBR3已知為it^達(dá)EGFR。圖9A.通過(guò)MT-PCR定量炎性基因，顯示了一式三份來(lái)自人皮膚活檢樣品的17種炎性基因的表達(dá)。圖9B.圖9A中擴(kuò)增產(chǎn)物的相應(yīng)熔解曲線。圖9C.圖9A中擴(kuò)增產(chǎn)物的Bioanalyzer分析。圖10A.在人乳腺癌細(xì)胞系中通過(guò)高分辨率熔解分析TP53的高變區(qū)。圖10B.在人乳腺癌細(xì)胞系中通過(guò)高分辨率熔解分析無(wú)突變的TP53區(qū)域。圖11A.通過(guò)高分辨率熔解分析多種細(xì)菌菌林中的16SRNA擴(kuò)增子。圖11B.圖IIA所示的歸一化熔解曲線的差異曲線。優(yōu)選實(shí)施方案稱為多重串聯(lián)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(MultiplexTandemPlymeraseChainReactionk,MT-PCR)的兩輪串聯(lián)PCR方法設(shè)計(jì)用于^M目對(duì)少量的核酸樣品中在更少的時(shí)間內(nèi)以更少的花費(fèi)準(zhǔn)確測(cè)量一大組基因的表達(dá)。多重PCR所固有的許多基因表達(dá)產(chǎn)物竟?fàn)幏磻?yīng)組分的問(wèn)題被本發(fā)明所克服，其中將多重?cái)U(kuò)增限制在預(yù)定的循環(huán)數(shù)，以使擴(kuò)增子之間的竟?fàn)幾钚』?。通過(guò)使用兩輪擴(kuò)增提高了靈敏度，使得可以使用從前僅足以定量單個(gè)選定序列的產(chǎn)物(如單基因表達(dá)產(chǎn)物)的樣品量來(lái)測(cè)量所有選定的核酸序列，通常是一組基因的表達(dá)產(chǎn)物。由于第二輪核酸擴(kuò)增可使用快速循環(huán)參數(shù)，所以總處理時(shí)間也得到降低。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，通過(guò)使用SYBR-綠DNA測(cè)量而不使用昂貴的標(biāo)記寡核苷酸探針使費(fèi)用降低，所述寡核苷酸探針是從前在多重反應(yīng)中檢測(cè)多種序列所必需的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，還可使用熒光探針例如Taqman⑧探針，以在第二輪擴(kuò)增反應(yīng)中檢測(cè)和定量單個(gè)選定核酸或多種選定核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物。為分析臨床樣品的基因表達(dá)水平，首先從合適組織中提取RNA,通常來(lái)自保存于甲醛中的活檢樣品、血樣或其它組織。然后通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄從RNA樣品制備cDNA，這可使用隨機(jī)六聚物(用于隨機(jī)引發(fā))來(lái)實(shí)現(xiàn)以制備來(lái)自大量表達(dá)序列的cDNA，或者更優(yōu)選地通過(guò)基因特異性方法實(shí)現(xiàn)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，使用多基因特異性引發(fā)法，利用對(duì)選定的目的核酸具有特異性的每對(duì)外部引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(RT反應(yīng))。這些相同的外部引物其后用于在第一輪多重?cái)U(kuò)增中擴(kuò)增特異性目的基因表達(dá)產(chǎn)物，其方法在下文描述。將相同的引物用于逆轉(zhuǎn)錄，第一輪擴(kuò)增減少了反應(yīng)混合物中所使用的寡核苷酸的數(shù)量?；蛱禺愋砸l(fā)還減少了與RNA降解有關(guān)的問(wèn)題，使得MT-PCR可用于提取自已M多年的甲醛固定石蠟包埋(FFPE)標(biāo)本的RNA。RT反應(yīng)進(jìn)行約1分鐘，i!A以產(chǎn)生后續(xù)擴(kuò)增所需的cDNA。多重?cái)U(kuò)增擴(kuò)增子通常長(zhǎng)度小于約150bp，這有助于高效的逆轉(zhuǎn)錄和后續(xù)擴(kuò)增。還在反應(yīng)中使用少量RT酶而還獲得了改善的結(jié)果，在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，在RT反應(yīng)中使用約1單位/jil的MMLV或superscriptIII酵。逆轉(zhuǎn)錄酶是PCR反應(yīng)的抑制劑，在多重?cái)U(kuò)增之前除去或變性該酶;1有用的。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，在多重?cái)U(kuò)增步驟之前通過(guò)約95X:的加熱步驟變性逆轉(zhuǎn)錄酶。這也使cDNA變性，使其準(zhǔn)備好進(jìn)行第一輪多重?cái)U(kuò)增。優(yōu)選地，在第一輪反應(yīng)中加入載體蛋白以穩(wěn)定所述酶。明膠由于其廉價(jià)且在約95匸時(shí)穩(wěn)定而適用于此目的，但是BSA、晶體蛋白(crystalin)及其它蛋白質(zhì)或穩(wěn)定劑是也可使用的合適替代品。第一輪多重?cái)U(kuò)增通常含有外部引物和在多重?cái)U(kuò)增中共擴(kuò)增許多表達(dá)基因或序列產(chǎn)物所必需的組分。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)很明顯的是，反應(yīng)的形式可才艮據(jù)所使用的設(shè)備進(jìn)行選擇。例如，當(dāng)使用可用于操作72個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)的"基因盤(pán)(Gene-Disc)"(CorbettResearch,Sydney,Australia)時(shí)，使用一個(gè)這樣的盤(pán)可一式三份地定量約24種基因的表達(dá)產(chǎn)物，或定量72種單獨(dú)的基因，或者可使用96孔板的形式一式三份地定量約32種基因表達(dá)產(chǎn)物，或者也可根據(jù)所需的統(tǒng)計(jì)可靠性選擇數(shù)目。下文所述的形式涉及使用CorbettResearch"基因盤(pán)"，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解，可以為方便起見(jiàn)而使用任何其它的合適形式，例如384孔板、96孔板或連續(xù)流式裝置。優(yōu)選地，在每個(gè)第一輪多重?cái)U(kuò)增中，使用約72對(duì)外部引物同時(shí)擴(kuò)增約72種序列，每對(duì)引物代表一種基因或其它表i^f列的表達(dá)產(chǎn)物。優(yōu)選地，設(shè)計(jì)所述外部引物以擴(kuò)增由擴(kuò)增子組成的DNA片段，所述擴(kuò)增子對(duì)于完全巢式MT-PCR是來(lái)自每個(gè)基因表達(dá)產(chǎn)物的約250bp或更短的DNA，或?qū)τ诎氤彩組T-PCR是約150bp或更短的DNA。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解，還可以使用標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室操作將本發(fā)明用于更長(zhǎng)長(zhǎng)度的選定核酸序列，其中改變條件，例如可以增加RT反應(yīng)所用的時(shí)長(zhǎng)和擴(kuò)增過(guò)程中的延伸時(shí)長(zhǎng)，以實(shí)現(xiàn)合適的cDNA合成和擴(kuò)增。為了克服在多重?cái)U(kuò)增過(guò)程中擴(kuò)增子之間竟?fàn)幏磻?yīng)組分的問(wèn)題，所述擴(kuò)增反應(yīng)進(jìn)行相對(duì)低的循環(huán)數(shù)，這取決于所使用的RNA輸入水平。在一個(gè)自動(dòng)化裝置中，可使用嵌入熒光染料(如SYBR-綠染料)來(lái)測(cè)量在多重?cái)U(kuò)增反應(yīng)中總DNA合成的水平，以確保不超過(guò)這個(gè)點(diǎn)?？筛鶕?jù)選定核酸的相對(duì)豐度和可用樣品大小來(lái)優(yōu)化第一輪多重?cái)U(kuò)增中的循環(huán)數(shù)，使得在第一輪多重?cái)U(kuò)增中這些擴(kuò)增子的擴(kuò)增所產(chǎn)生的多核苷酸量不高于在使反應(yīng)進(jìn)行至超過(guò)不再發(fā)生進(jìn)一步擴(kuò)增的循環(huán)數(shù)時(shí)及JL中所產(chǎn)生的多核苷酸總量的約5%。通過(guò)所述方法的這一改動(dòng)，防止了選定核酸序列的庫(kù)(例如基因表達(dá)產(chǎn)物)擴(kuò)增至多重?cái)U(kuò)增過(guò)程中各個(gè)擴(kuò)增子之間對(duì)反應(yīng)組分發(fā)生顯著竟?fàn)幍乃健Ｒ驗(yàn)樗铣傻暮怂峥偭咳匀皇窍鄬?duì)小的，所以試劑總是大大過(guò)量，因此在多重?cái)U(kuò)增>^應(yīng)過(guò)程中擴(kuò)增子之間的竟?fàn)幈伙@著最小化。根據(jù)檢測(cè)反應(yīng)所需的靈敏度選擇多重反應(yīng)的循環(huán)數(shù)。優(yōu)選地，使用約10個(gè)循環(huán)的多重?cái)U(kuò)增來(lái)檢測(cè)來(lái)自約50-500ngRNA樣品的基因表達(dá)。優(yōu)選地，使用約15個(gè)循環(huán)來(lái)檢測(cè)來(lái)自約0.5-50ngRNA的基因表達(dá)，優(yōu)選地，使用約20個(gè)循環(huán)M測(cè)來(lái)自約0.01-0.5ngRNA的基因表達(dá)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解，當(dāng)輸入RNA量更低時(shí)可使用更高的多重及^應(yīng)循環(huán)數(shù)。在實(shí)踐中，當(dāng)4吏用相同類型和量的樣品時(shí)，在4吏用相同多重?cái)U(kuò)增循環(huán)數(shù)的MT-PCR測(cè)定之間進(jìn)行基因表達(dá)的比較。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，此第一輪擴(kuò)增使用10ng的輸入RNA或DNA進(jìn)行15個(gè)循環(huán)，反應(yīng)混合物中包含高水平的核苷三磷酸(約0.3mM)，以進(jìn)一步降低擴(kuò)增子之間竟?fàn)幍目赡苄?。在第一輪多重?cái)U(kuò)增中外部引物的濃度也減少到約O.ljiM，以使當(dāng)所述反應(yīng)產(chǎn)物被轉(zhuǎn)移到第二輪擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)進(jìn)一步減少這些引物的濃度，由此減少這些引物對(duì)第二輪擴(kuò)增反應(yīng)的影響。盡管這減少了多重?cái)U(kuò)增中擴(kuò)增子之間竟?fàn)幍闹匾獑?wèn)題，但是使用這種低擴(kuò)增循環(huán)數(shù)所獲得的擴(kuò)增不提供足以準(zhǔn)確檢測(cè)或定量表達(dá)核酸序列的擴(kuò)增，完成的多重?cái)U(kuò)增反應(yīng)混合物中仍然含有來(lái)自許多表達(dá)核酸序列的擴(kuò)增產(chǎn)物的庫(kù)。在分開(kāi)的第二輪擴(kuò)增反應(yīng)中對(duì)該庫(kù)中特定選定序列的進(jìn)一步擴(kuò)增使得每種基因或表達(dá)序列的擴(kuò)增產(chǎn)物擴(kuò)增至足以在基本為個(gè)體的基礎(chǔ)上進(jìn)行分析，由此準(zhǔn)確檢測(cè)和定量來(lái)自原始核酸序列庫(kù)的每種選定核酸序列。減少第二輪PCR中所使用的引物和Taq聚合酶的量還降低了形成非特異性產(chǎn)物(例如引物二聚體)的可能性。在一些實(shí)施方案中，約0.5單位的Taq用于每個(gè)20jil的第二輪擴(kuò)增反應(yīng)，并且引物濃度降低到約0.2nM。優(yōu)選地，加入約0.2%DMSO以在此^^下促進(jìn)富含GC的擴(kuò)增子的擴(kuò)增。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，約35個(gè)循環(huán)的第二階段擴(kuò)增通常足以允許準(zhǔn)確定量來(lái)自低表達(dá)基因的基因表達(dá)產(chǎn)物。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解，也可改變第一和第二輪擴(kuò)增的循環(huán)數(shù)，以允許在當(dāng)核酸在第一輪多重?cái)U(kuò)增反應(yīng)之前擴(kuò)增自不同量起始材料的情況下定量所述核酸，這樣，所使用的起始材料量越低，通常所需的第一和第二輪擴(kuò)增循環(huán)目高。在一個(gè)實(shí)施方案中，從完成的第一輪多重?cái)U(kuò)增反應(yīng)中取出等分試樣，加入到許多獨(dú)立的管中，每個(gè)管中含有獨(dú)立的第二輪擴(kuò)增反應(yīng)混合物。此等分試樣可在加入到第二輪反應(yīng)混合物中之前進(jìn)行稀釋，或者可轉(zhuǎn)移少量的第一輪產(chǎn)物使得在加入到第二輪擴(kuò)增反應(yīng)混合物時(shí)發(fā)生合適的等分試樣稀釋水平。優(yōu)選地，在加入到每個(gè)第二輪反應(yīng)管前對(duì)第一輪多重?cái)U(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行25x稀釋，其中當(dāng)所述等分試樣稀釋在第二輪擴(kuò)增反應(yīng)中時(shí)進(jìn)一步稀釋到約100x的水平。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解，稀釋水平可變化，但是這通常應(yīng)該高至足以防止殘余的第一輪外部引物影響第二輪擴(kuò)增中每種所選核酸序列定量的準(zhǔn)確度。此稀釋步驟確保從第一輪多重?cái)U(kuò)增反應(yīng)傳遞進(jìn)入第二輪擴(kuò)增的第一輪外部引物的量不顯著，使得笫二輪擴(kuò)增中進(jìn)一步引發(fā)基本上由第二輪引物指導(dǎo)，由此基本上只擴(kuò)增由選定的第二輪引物所引發(fā)的所選分子。優(yōu)選地，每個(gè)單獨(dú)的第二輪擴(kuò)增反應(yīng)包含一對(duì)內(nèi)部引物，對(duì)其進(jìn)行選擇，以與第一輪多重?cái)U(kuò)增中所擴(kuò)增的選定基因或表達(dá)序列之一的一個(gè)擴(kuò)增子的部分區(qū)域互補(bǔ)。每對(duì)內(nèi)部引物擴(kuò)增一個(gè)較短的擴(kuò)增子，在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，這些較短的擴(kuò)增子為約70-90bp或更短。在一個(gè)替代實(shí)施方案中，在第二輪擴(kuò)增反應(yīng)中另外加入一定量的一種第一輪外部引物與一種相應(yīng)的內(nèi)部引物組合，以在半巢式MT-PCR中進(jìn)一步擴(kuò)增所選核酸序列，其中此擴(kuò)增子優(yōu)選約150bp或更短。這樣，通過(guò)在第二輪擴(kuò)增中使每種目的基因或表達(dá)序列的擴(kuò)增反應(yīng)分開(kāi)(其中發(fā)生一批擴(kuò)增)，每種擴(kuò)增子在獨(dú)立的狀態(tài)下在無(wú)其它序列竟?fàn)幍那闆r下進(jìn)行擴(kuò)增，以便于對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步分析。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，通過(guò)在第二輪PCR反應(yīng)管中加入干燥形式的第二輪引物來(lái)減少處理時(shí)間。合適的反應(yīng)管實(shí)例包括"基因盤(pán)，，(CorbettResearch)、96孔PCR板或384孔PCR板(AppliedBiosystems，USA)。然后在第二輪擴(kuò)增之前將第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物/反應(yīng)組分混合物加入到反應(yīng)管中。優(yōu)選地，還使用快速循環(huán)條件進(jìn)行第二輪擴(kuò)增反應(yīng)，以減少錯(cuò)誤引發(fā)的發(fā)生并減少處理時(shí)間。方便地，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，基于72孔"基因盤(pán)"形式在第一輪多重?cái)U(kuò)增含有約36種基因的外部引物，使得每個(gè)擴(kuò)增以一式二份進(jìn)行，其中使用逆轉(zhuǎn)錄自約10ng總RNA的cDNA。第一輪擴(kuò)增反應(yīng)含有外部引物，2%DMSO的存在下每種引物的濃度為約0.1^M。在約10個(gè)擴(kuò)增循環(huán)的第一輪結(jié)束時(shí)，反應(yīng)產(chǎn)物被稀釋約25x,約5jd的這些稀釋產(chǎn)物被加入到第二輪擴(kuò)增中。對(duì)于第二輪擴(kuò)增，使用快速循環(huán)，因?yàn)槟０逯幸呀?jīng)富集了目的基因。另外，內(nèi)部引物設(shè)計(jì)成在多重?cái)U(kuò)增所產(chǎn)生的所選擴(kuò)增子內(nèi)部發(fā)生結(jié)合。這些內(nèi)部引物能夠擴(kuò)增約70-90bp的短擴(kuò)增子，使得在第二輪擴(kuò)增中4吏用短的延伸時(shí)間。通常第二輪擴(kuò)增循環(huán)條件是951C1秒、60*€10秒和72t;i0秒。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解，可在第一輪多重反應(yīng)中擴(kuò)增的序列數(shù)可有所不同，只要包括的其他第一輪外部引物對(duì)在第二輪擴(kuò)增中不導(dǎo)致產(chǎn)生不希望的其他產(chǎn)物或者在第二輪中不影響所選擴(kuò)增子定量的準(zhǔn)確性即可。因?yàn)榧尤氲降诙啍U(kuò)增的反應(yīng)產(chǎn)物富含選定的目的核酸序列，所以第二輪可使用快速循環(huán)條件，并含有濃度有限的引物和酶，這有益于在第二輪擴(kuò)增中形成唯一且正確的擴(kuò)增子產(chǎn)物。這使得第二輪擴(kuò)增產(chǎn)物基本上不被非特異性DNA分子或引物二聚體污染，否則它們將4吏分析更為復(fù)雜或者無(wú)法進(jìn)行。在第二輪擴(kuò)增中使用的反應(yīng)混合物優(yōu)選包含可檢測(cè)報(bào)告子組分，例如熒光染料或含熒光團(tuán)的探針比如Taqmai^探針，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解，使用這樣的探針需要特定的退火溫度。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述報(bào)告子組分是SYBR-綠染料，其以非特異性的方式響應(yīng)于擴(kuò)增DNA的存在而發(fā)出熒光，這樣，熒光水平與第二輪擴(kuò)增>^應(yīng)中存在的擴(kuò)增DNA的量成正比。在擴(kuò)增過(guò)程中優(yōu)選在實(shí)時(shí)PCR儀器中監(jiān)測(cè)第二輪擴(kuò)增反應(yīng)，使得此熒光的顯色受到監(jiān)測(cè)，從而對(duì)每個(gè)反應(yīng)中存在的表達(dá)序列或基因產(chǎn)物的量進(jìn)行定量。在一個(gè)替代實(shí)施方案中，第二輪擴(kuò)增反應(yīng)可包含多種選定核酸序列的引物，由此選定核酸序列的檢測(cè)和定量通過(guò)使用熒光探針例如Taqmai^探針或其它合適標(biāo)記寡核苷酸探針進(jìn)行。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法可用于分析DNA，以檢測(cè)與多種性狀(例如哺乳動(dòng)物疾病的流行性狀和易感性)、SNP、甲基化(亞硫酸氫鹽反應(yīng)之后)、遺傳疾病等相關(guān)的特定序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解，本發(fā)明允許分析少量樣品，使得此方法可用于但不僅限于法醫(yī)分析以及檢測(cè)寄生蟲(chóng)、病毒、真菌、細(xì)菌和支原體、食品污染、組織、水、土壤空氣等的污染，包括生物武器檢測(cè)。在又一個(gè)實(shí)施方案中，在PCR之前對(duì)核酸的處理以及PCR反應(yīng)的制名—吏用適合的裝置自動(dòng)進(jìn)行，所述裝置例如CAS1200機(jī)器人(CorbettResearch)、MultiPROBEII核酸工作站(PerkinElmerLifeandAnalyticalSciences)和epMotionTM5075工作站(Eppendor^)或者本領(lǐng)域/>知的其它這樣的裝置。優(yōu)選地，所述核酸擴(kuò)增系統(tǒng)是PCR系統(tǒng)，如US4，683，202，US4，683，195和US4,965,188中所述的，其通過(guò)引用并入本文。優(yōu)選地，對(duì)核酸的擴(kuò)增、檢測(cè)和定量通過(guò)在自動(dòng)化定量PCR熱循環(huán)裝置中操作并監(jiān)測(cè)反應(yīng)來(lái)實(shí)現(xiàn)，所述裝置例如RotorGeneRG6000(CorbettResearch)、AppliedBiosystems7900HT或者其它合適裝置，其實(shí)例z厶開(kāi)于例如EP1157744和US6,713,297，其通過(guò)引用并入本文。優(yōu)選地，所il^因表達(dá)測(cè)量相對(duì)于在同一批MT-PCR中進(jìn)行的比較基因進(jìn)行表示，并且僅與在基本相似的條件下進(jìn)行的基因表達(dá)測(cè)量進(jìn)行比較。在另一些實(shí)施方案中，所述擴(kuò)增反應(yīng)可以是連接SIM式反應(yīng)、自持續(xù)序歹'J復(fù)制(self-sustainingsequencereplication)、滾環(huán)擴(kuò)增(rollingcircleamplification)、鏈置換擴(kuò)增(stranddisplacementamplification)、等溫DNA擴(kuò)增(isothermalDNAamplification)等。本領(lǐng)域技術(shù)人員還應(yīng)了解，本發(fā)明的方法可應(yīng)用于任何活細(xì)胞或生物，包括但不僅限于哺乳動(dòng)物(包括人)；鳥(niǎo)類；魚(yú)類；植物；爬行類；節(jié)肢動(dòng)物；J3^L動(dòng)物；細(xì)菌；病毒；真菌和支原體。本領(lǐng)域技術(shù)人員還應(yīng)了解，本發(fā)明的方法可用于檢測(cè)樣品中選定核酸的水平，所述樣品為例如可獲得約0.01ngRNA的單個(gè)哺乳動(dòng)物細(xì)胞，還例如來(lái)自單個(gè)FFPE組織切片，其中可獲得約10ngRNA。優(yōu)選地，所述擴(kuò)增反應(yīng)通過(guò)多孔實(shí)時(shí)熱循環(huán)儀或連續(xù)流體PCR裝置中的流體機(jī)器人自動(dòng)處理。在另一個(gè)實(shí)施方案中，第二輪擴(kuò)增包含內(nèi)部引物，其與外部引物相比在較高的溫度下退火(較高的Tm)，使得第二輪擴(kuò)增中的退火步驟在較高溫度下進(jìn)行，以使用內(nèi)部引物特異性引發(fā)第二輪擴(kuò)增，從而基本上防止第二輪擴(kuò)增反應(yīng)中外部引物的引發(fā)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在一種或多種外部引物中摻入一個(gè)或多個(gè)UTP核苷酸，使得這些引物可被UNG酶消化，由此，所述外部引物可在第一輪擴(kuò)增結(jié)束時(shí)被除去，從而基本阻止了第一輪引物污染第二輪擴(kuò)增反應(yīng)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法可用于診斷方法，例如診斷腫瘤，其選自多種良性和惡性實(shí)體瘤以及白血病的形式等。所述核酸分子包括RNA、DNA和cDNA分子，但是應(yīng)理解，還預(yù)期可使用相關(guān)變體，只要它們可被擴(kuò)增即可?？蓳饺牍押塑账崽结樦械臒晒獠糠謱?shí)例包括但不僅限于g-X-羅丹明、熒光素、6-四甲基羅丹明-5(6)-羧酰胺、BODIPY493/503TM、BODIPY-F1-Xtm、(4,6-二氯三漆基)氨基熒光素、6-1^熒光素、6-((5-二甲基氨基萘-l-磺?；?氨基)己酸酯、Oregon綠500TM、Oregon綠488TM、Rhodol緑tm、Oregon綠514TM、羅丹明綠-XTM、NBD-X、四氯熒光素、2，,4，,5，,7，-四溴砜熒光素、BODIPY-F1BR2TM、BODIPY-R6GTM、6-^J^4，-5，國(guó)二氯畫(huà)2'，7'畫(huà)二曱氡基熒光素、BODIPY-530/550TM、六氯熒光素、羧基羅丹明6GTM、BODIPY558/568TM、BODIPY-T證畫(huà)X1^1、1國(guó)(3國(guó)羧基節(jié)基)-4-(5咖(4-甲lL^苯基)噁唑-2-基)溴化吡咬、BODIPY-564/570TM、Cy3TM、6-(四曱基羅丹明-5(6)-羧酰胺基)己酸酯、羅丹明紅-Xtm、BODIPY-576/589TM、BODIPY國(guó)581/591、Texas紅國(guó)xtm、Cy3.5TM、BODIPY國(guó)TR-Xtm、Cy5TM、^J^萘熒光素、Cy5.5TM。定義在本說(shuō)明書(shū)的上下文中，術(shù)語(yǔ)"可檢測(cè)報(bào)告子"指提供用于測(cè)定核酸量的可檢測(cè)手段的組分，這包括放射性標(biāo)記的組分和熒光報(bào)告子，例如染料和摻入了熒光基團(tuán)的探針(例如Taqmai^探針)等等。在本說(shuō)明書(shū)的上下文中，術(shù)語(yǔ)"熒光報(bào)告子"指可檢測(cè)報(bào)告子，其為(l)摻入了能發(fā)出熒光的核普酸堿基的寡核苷酸序列，其結(jié)合特異性靶DNA序列，并以允許定量所述核酸的量的方式發(fā)出特定的可檢測(cè)熒光(也稱為探針或熒光探針)或(2)染料(例如SYBR-綠染料)，其結(jié)合DNA,從而以允許對(duì)所述序列進(jìn)行檢測(cè)和/或定量和/或鑒定的方式發(fā)出焚光。在本說(shuō)明書(shū)的上下文中，術(shù)語(yǔ)"探針"或"熒光探針"指摻入了能夠發(fā)出熒光的核苷酸堿基的寡核苷酸序列，其結(jié)合特異性靶DNA序列，并以允許定量所述核酸的量的方式發(fā)出特定的可檢測(cè)熒光。這也落入"可檢測(cè)報(bào)告子"和"熒光報(bào)告子"的定義之中。在本說(shuō)明書(shū)的上下文中，術(shù)語(yǔ)"聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)"及其縮寫(xiě)"PCR"根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的其一般意義使用。PCR方法的實(shí)例可見(jiàn)于普通分子生物學(xué)教科書(shū)和本領(lǐng)域中所使用的參考手冊(cè)。例如PCRTechnology:PrinciplesandApplicationsforDNAAmplification(1989)HAErlich.編輯StocktonPress,NewYork。PCR的一個(gè)實(shí)例通常用于通過(guò)使用熱穩(wěn)定聚合酶和一些試劑以及兩種短引物來(lái)擴(kuò)增選定的核^列，其中通過(guò)包含與序列結(jié)合的引物來(lái)"選擇"待擴(kuò)增的序列。一種引物通過(guò)互補(bǔ)威基配對(duì)與待擴(kuò)增序列一端的(+)鏈結(jié)合，另一種引物與另一端的(-)鏈結(jié)合。由于新合成的DNA鏈(擴(kuò)增子)可接著作為相同引物序列的額外模板，因此引物退火、鏈延伸和解鏈的連續(xù)輪次產(chǎn)生該選定序列快速且高度特異性的擴(kuò)增。在本說(shuō)明書(shū)的上下文中，術(shù)語(yǔ)"擴(kuò)增子"指通過(guò)核酸擴(kuò)增過(guò)程例如PCR產(chǎn)生的新合成的DNA鏈。在本說(shuō)明書(shū)的上下文中，術(shù)語(yǔ)"引物"和"寡核苷酸"指長(zhǎng)度短的多核苷酸鏈DNA，其用于在核酸擴(kuò)增(通常在PCR反應(yīng)中)或逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中起始擴(kuò)增(復(fù)制)過(guò)程。在本i兌明書(shū)的上下文中，術(shù)語(yǔ)"外部引物"指在一種或多種相應(yīng)內(nèi)部引物所結(jié)合區(qū)域外側(cè)的位點(diǎn)與選定的核酸序列或擴(kuò)增子結(jié)合的引物，如圖1所示。在本i兌明書(shū)的上下文中，術(shù)語(yǔ)"內(nèi)部引物"指與選定擴(kuò)增子結(jié)合的引物，其結(jié)合位置在所述外部引物結(jié)合位置的內(nèi)側(cè)，如圖l所示。在本說(shuō)明書(shū)的上下文中，術(shù)語(yǔ)"巢式PCR"、"完全巢式PCR"或"串聯(lián)PCR"指兩輪或更多輪(步驟)的核酸擴(kuò)增，通常包括兩輪PCR，其中第一輪PCR使用一對(duì)外部引物來(lái)擴(kuò)增選定核酸分子，第二輪擴(kuò)增使用一對(duì)內(nèi)部引物使來(lái)自選定的經(jīng)擴(kuò)增核酸分子的擴(kuò)增子進(jìn)一步擴(kuò)增，所述內(nèi)部引物在外部引物結(jié)合位置的內(nèi)側(cè)結(jié)合擴(kuò)增子。在本說(shuō)明書(shū)的上下文中，術(shù)語(yǔ)"半巢式PCR"或"半串聯(lián)PCR"指一種PCR反應(yīng)類型，其中第一輪外部引物中的一個(gè)也包含在第二輪擴(kuò)增反應(yīng)中，與相應(yīng)的內(nèi)部引物一起引發(fā)選定擴(kuò)增子的擴(kuò)增，所述內(nèi)部引物在其他第一輪引物結(jié)合位置的內(nèi)側(cè)位置上與相同的擴(kuò)增子結(jié)合。在本說(shuō)明書(shū)的上下文中，術(shù)語(yǔ)"多重PCR"或"多重核酸擴(kuò)增"或"多重?cái)U(kuò)增"指核酸擴(kuò)增>^應(yīng)(通常為PCR),其包括多于一對(duì)引物，使得兩種或更多種不同的選定核酸序列在一個(gè)單獨(dú)反應(yīng)管中通過(guò)該反應(yīng)被擴(kuò)增，如圖1所示。在本說(shuō)明書(shū)的上下文中，術(shù)語(yǔ)"選定的核酸分子"和"選定的核酸序列"指具有特定核酸序列的核酸分子。例如，在基因表達(dá)分析的上下文中，一種選定的核^列指特定基因的基因表達(dá)產(chǎn)物，其具有特定的核酸序列，而多種選定的核酸序列指多種特定基因的基因表達(dá)產(chǎn)物。在本說(shuō)明書(shū)的上下文中，術(shù)語(yǔ)"核酸，，指由核苷酸亞基組成的復(fù)雜有機(jī)酸分子。兩種主要的核^！DNA和RNA。這包括所有核酸的亞類，例如基因組DNA、線粒體DNA、葉綠體DNA、cDNA等。它還指多種形式的RNA例如mRNA、tRNA、rRNA、病毒RNA等。在本說(shuō)明書(shū)的上下文中，術(shù)語(yǔ)"cDNA"指通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄從mRNA產(chǎn)生的DNA序列。cDNA的命名是由于其序列與原始mRNA序列互補(bǔ)。在本i兌明書(shū)的上下文中，術(shù)語(yǔ)"哺乳動(dòng)物"包含人、寵物(例如貓和狗)以及家畜(例如馬、牛、豬、綿羊等)。在本說(shuō)明書(shū)的上下文中，術(shù)語(yǔ)"干燥的"指干燥形式的物質(zhì)，常為晶體或粉末。在本說(shuō)明書(shū)的上下文中，術(shù)語(yǔ)"生物"指任何物種的植物、動(dòng)物、細(xì)菌、真菌、病毒、支原體或經(jīng)遺傳改造的生物，并擴(kuò)展到寄生性DNA序列等。在本"i兌明書(shū)的上下文中，術(shù)語(yǔ)"Tm"在應(yīng)用于寡核苷酸引物時(shí)，指寡核苷酸有50%的概率與其互補(bǔ)核酸序列以雙鏈形式結(jié)合時(shí)的溫度。在本說(shuō)明書(shū)的上下文中，術(shù)語(yǔ)"UTP"指三磷酸尿苷。在本說(shuō)明書(shū)的上下文中，術(shù)語(yǔ)"尿嘧啶N-糖^^化酶(UNG)"指能夠在含有脫氧尿普的DNA中水解脫氧核糖糖基與尿嘧咬之間N-糖苷鍵的酶。在本說(shuō)明書(shū)的上下文中，短語(yǔ)"擴(kuò)增子之間對(duì)反應(yīng)組分發(fā)生顯著竟?fàn)幹暗狞c(diǎn)"指擴(kuò)增反應(yīng)中的循環(huán)或階段，在該循環(huán)或階段之后，選定核酸序列的進(jìn)一步擴(kuò)增將對(duì)第二輪擴(kuò)增中所得定量的準(zhǔn)確性有害。不限于任何特定機(jī)制或理論地，所i兌的對(duì)定量的準(zhǔn)確性有害被認(rèn)為是由于擴(kuò)增序列(擴(kuò)增子)之間對(duì)反應(yīng)組分(例如dNTP和引物)的竟?fàn)幩?。隨著循環(huán)數(shù)的增加，這些組分逐漸變得越來(lái)越稀少，由此在反應(yīng)中濃度越來(lái)越低。隨著可用反應(yīng)組分變得越來(lái)越有限，這有利于擴(kuò)增更豐富的核酸種類，其干擾了第二輪擴(kuò)增反應(yīng)中定量的準(zhǔn)確性。因此，根據(jù)輸入核酸的量選擇多重?cái)U(kuò)增的最佳循環(huán)數(shù)，以使擴(kuò)增過(guò)程中擴(kuò)增子之間對(duì)反應(yīng)組分的任何竟?fàn)幾饔米钚』?，同時(shí)提供對(duì)每個(gè)選定核酸序列的特異性擴(kuò)增。在實(shí)踐中，例如當(dāng)使用50-500ng核酸時(shí)，約10個(gè)循環(huán)的多重?cái)U(kuò)增足以將選定核酸分子擴(kuò)增至擴(kuò)增子之間對(duì)反應(yīng)組分發(fā)生顯著竟?fàn)幹暗狞c(diǎn)。類似地，當(dāng)使用0.5-50ng核酸時(shí)，優(yōu)選約15個(gè)循環(huán)的多重?cái)U(kuò)增。當(dāng)使用0.01-0.5ng核酸時(shí)，優(yōu)選約20個(gè)循環(huán)的多重?cái)U(kuò)增。當(dāng)輸入更低量的核酸時(shí)，可使用更大的多重?cái)U(kuò)增循環(huán)數(shù)。本發(fā)明方法中所使用的多重?cái)U(kuò)增反應(yīng)循環(huán)數(shù)通常不引起產(chǎn)生這樣大量的選定核酸序列產(chǎn)物，以致于不利地影響第二輪擴(kuò)增中所估計(jì)定量的準(zhǔn)確性。本發(fā)明將參考非限制性實(shí)施例進(jìn)行更具體的描述。實(shí)施例實(shí)施例l.MT-PCR可用于測(cè)定許多不同基因的表達(dá)，其使用來(lái)自單個(gè)樣品的多重?cái)U(kuò)增，并在第二輪擴(kuò)增中加入SYBR-緣險(xiǎn)測(cè)系統(tǒng)。4吏用通用報(bào)告子例如SYBR-綠報(bào)告子染料對(duì)多個(gè)基因表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行多重?cái)U(kuò)增和測(cè)定目前是不可能的。但是，MT-PCR方法能夠同時(shí)擴(kuò)增許多基因的表達(dá)產(chǎn)物。MT-PCR方法概述于圖1,它是顯示MT-PCR中引物排列的示意圖，展示了串聯(lián)和半串聯(lián)實(shí)施方案。反向外部引物以"RT"標(biāo)出，通常用于在所示擴(kuò)增^^應(yīng)之前的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)過(guò)程中引發(fā)合成對(duì)每種基因具有特異性的cDNA。兩種方法均以擴(kuò)增和定量4種不同基因(1-4)的基因表達(dá)產(chǎn)物的方法顯示，但其在實(shí)踐中通常可用于擴(kuò)增72個(gè)不同基因的表達(dá)產(chǎn)物。在串聯(lián)MT-PCR中，4吏用外部引物作為多重引物，而內(nèi)部引物在第二輪擴(kuò)增反應(yīng)中定量核酸時(shí)使用。在半串聯(lián)MT-PCR中，一種內(nèi)部引物在第一輪多重?cái)U(kuò)增反應(yīng)和第二輪擴(kuò)增反應(yīng)中共用。為了證明MT-PCR方法在定量多種基因的表達(dá)產(chǎn)物上特別有效，從MCF7人上皮細(xì)胞中提取50ngRNA，用于72孔"基因盤(pán)"形式的半串聯(lián)MT-PCR測(cè)定，以使用SYBR-^r測(cè)來(lái)同時(shí)定量72種不同基因的表達(dá)產(chǎn)物。在該方法的第一階段中使用72種寡核苷酸引物對(duì)，其中24種示于表1和2。每對(duì)引物對(duì)一種給定的基因表達(dá)產(chǎn)物具有特異性，將這些與逆轉(zhuǎn)錄酶和Taq聚合酶一起加入到50ngRNA中。在551C下1分鐘逆轉(zhuǎn)錄>^應(yīng)之后(其中反向基因特異性PCR引物發(fā)揮逆轉(zhuǎn)錄引物作用)，所述逆轉(zhuǎn)錄酶在951C下變性5分鐘，接著將72種基因共擴(kuò)增10個(gè)循環(huán)。每個(gè)循環(huán)保持溫度在951C5秒、60C20秒以及72"C20秒。然后，將富含72種基因的相應(yīng)擴(kuò)增子的所得產(chǎn)物分成等分試樣，使用多重?cái)U(kuò)增中所用外部引物中的一種和相應(yīng)的選定擴(kuò)增子特異性內(nèi)部引物一式三份對(duì)每個(gè)等分試樣進(jìn)行擴(kuò)增和定量，其中使用如圖1所示的半串聯(lián)MT-PCR方法。對(duì)于此階段，使用95"C1秒、60riO秒和72lClO秒的循環(huán)。所述測(cè)定的兩個(gè)階段都在RG3000Rotor-Gene實(shí)時(shí)熱循環(huán)儀(CorbettResearch)中進(jìn)行，其可組合任何數(shù)量的保持溫度和循環(huán)條件。72個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)的結(jié)果示于表2A，代表以一式三份進(jìn)行的24種基因表達(dá)測(cè)量。此結(jié)果顯示，每種基因表達(dá)產(chǎn)物均以可再現(xiàn)的形式擴(kuò)增，因?yàn)閷?duì)應(yīng)于一式三份的單個(gè)基因測(cè)量的每組三條線都具有幾乎相同的曲線。重要的是，這些產(chǎn)物還以高特異性擴(kuò)增，因?yàn)槿鐖D2B所示的相應(yīng)熔解曲線證明，在這些反應(yīng)中次要擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)不到，并且圖2C中所示的Bioanalyzer"皿，，圖像展示了在每種情況下每個(gè)反應(yīng)均得到單一的擴(kuò)增產(chǎn)物。表l.半串聯(lián)MT-PCR第一輪引物<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>表2.半串聯(lián)MT-PCR第二輪引物<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>實(shí)施例2.MT-PCR可用于從少量已斷裂核酸的樣品(例如在存檔FFPE組織樣品中存在的)中定量核酸(例如基因表達(dá)產(chǎn)物)。人們非常期望能定量來(lái)自存檔甲醛固定石蠟包埋(FFPE)樣品的基因表達(dá)，但是受到了這些標(biāo)本中低RNA回收(約10ng/10jim切片)的限制，還受到所回收的分子高度斷裂性質(zhì)的限制。不可能使用寡聚-dT引物進(jìn)行線性RNA擴(kuò)增或逆轉(zhuǎn)錄，因?yàn)椴惶赡苋魏蜶NA片段都含有RNA的3，端和待測(cè)量的擴(kuò)增子。因此，目前的方法只允許使用基因特異性或隨機(jī)引發(fā)的逆轉(zhuǎn)錄來(lái)定量來(lái)自每個(gè)樣品中數(shù)目很小的基因的表達(dá)。為了證明MT-PCR方法在高度斷裂和降解的核酸中同時(shí)擴(kuò)增許多基因上特別有效，首先從FFPE異種移植標(biāo)本的單個(gè)切片中提取RNA，所述切片在RNA提取前已M十年。使用蛋白酶K消化和i^柱純化(Ambion)從直徑4mm、厚度10nm的切片中提取RNA。將從FFPE切片中所提取總RNA的三分之一(估計(jì)含有約3ng)用于如實(shí)施例1所述的半串聯(lián)MT-PCR方法，其中使用表l和2所示的外部和內(nèi)部引物，使用15個(gè)循環(huán)的多重?cái)U(kuò)增。一式三份擴(kuò)增的24種基因的基因表達(dá)譜示于圖3A。il^明，所述方法可用于在極少量斷裂RNA中有效且可再現(xiàn)地?cái)U(kuò)增和定量基因表達(dá)產(chǎn)物，如擴(kuò)增曲線的高度再現(xiàn)性所示。重要的是，這些產(chǎn)物還以高特異性擴(kuò)增，因?yàn)榇我獢U(kuò)增產(chǎn)物在這些及^應(yīng)中檢測(cè)不到，如圖3B所示的相應(yīng)熔解曲線所示，所述曲線展示了每種情況下每個(gè)反應(yīng)均產(chǎn)生以單峰代表的單個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物。此結(jié)果證明，所述方法可有效地用于從極少量核酸模板中擴(kuò)增許多不同的核酸序列，所述模板例如得自單個(gè)細(xì)胞、激光切割的組織活檢、法醫(yī)樣品等。實(shí)施例3.MT-PCR用于擴(kuò)增和定量得自單細(xì)胞和激光切割微樣品中的核酸的用途使用包括20個(gè)多重?cái)U(kuò)增循環(huán)的MT-PCR方法來(lái)擴(kuò)增和定量24種基因的表達(dá)產(chǎn)物，其中使用僅為10pgRNA的樣品，&目當(dāng)于通常得自單個(gè)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的總RNA模板的大致量。圖4A顯示從10pgMCF7RNA中定量24種基因，圖4B顯示每種擴(kuò)增產(chǎn)物的相應(yīng)熔解曲線。24種基因表達(dá)產(chǎn)物中的20種被檢測(cè)和定量，沒(méi)有不希望的次要擴(kuò)增產(chǎn)物。此結(jié)果證明，所述方法可有效地用于從極少量核酸模板中擴(kuò)增許多不同的核酸序列，所述模板例如得自單個(gè)細(xì)胞、激光切割的組織活檢、法醫(yī)樣品等。如所示，有必要在多重?cái)U(kuò)增步驟中使用相對(duì)大的循環(huán)數(shù)，以從這樣的少量樣品中有效擴(kuò)增所述核酸，在此情況下20個(gè)循環(huán)是充分的。所述方法特別可用于法醫(yī)應(yīng)用等，在這些情況下樣品經(jīng)常大小非常有限并且同時(shí)核酸為高度降解/斷裂的結(jié)構(gòu)。實(shí)施例4.建立合適的MT-PCR的反應(yīng)條件和>#^1。為了對(duì)給定的多重反應(yīng)系統(tǒng)建立合適的多重?cái)U(kuò)增循環(huán)數(shù)，必須根據(jù)經(jīng)驗(yàn)對(duì)給定的樣品/引物系統(tǒng)確定合適的循環(huán)數(shù)。理想情況下，多重?cái)U(kuò)增步驟應(yīng)該進(jìn)行足夠的循環(huán)數(shù)以提供足夠的擴(kuò)增水平，以便于第二輪擴(kuò)增中對(duì)每種選定核酸序列進(jìn)行準(zhǔn)確定量。但是，多重?cái)U(kuò)增的循環(huán)數(shù)還必須受到限制，使其不允許進(jìn)行至超過(guò)某一循環(huán)數(shù)，在該循環(huán)數(shù)之后選定核酸序列的進(jìn)一步擴(kuò)增將對(duì)第二輪擴(kuò)增中所獲得定量的準(zhǔn)確性有害。對(duì)定量的準(zhǔn)確性有害i人為是由于擴(kuò)增序列(擴(kuò)增子)之間對(duì)反應(yīng)組分(例如dNTP和引物)的竟?fàn)幩?。隨著循環(huán)數(shù)的增加，這些組分逐漸變得越來(lái)越稀少，由此在反應(yīng)中濃度越來(lái)越低。作為建立用于給定的第一輪多重?cái)U(kuò)增反應(yīng)的合適循環(huán)數(shù)的指導(dǎo)，最豐富的mRNA種類或核^列的指數(shù)擴(kuò)增在第一^^擴(kuò)增中必須不顯著增加。所述顯著增加可通過(guò)以下步驟來(lái)檢查使用單獨(dú)的RT反應(yīng)(每個(gè)反應(yīng)中包含不同的RNA輸入量)，然后通過(guò)包含SYBT-綠染料以監(jiān)測(cè)反應(yīng)來(lái)檢測(cè)在第一輪擴(kuò)增過(guò)程中所產(chǎn)生核酸的量。在這種情況下擴(kuò)增反應(yīng)只包含對(duì)一種選定核酸序列(選定的最豐富的RNA種類)具有特異性的引物，因而此>^應(yīng)不是多重?cái)U(kuò)增反應(yīng)，而是單一反應(yīng)。如圖5所示，輸入50-500ngRNA在最初10輪反應(yīng)中只產(chǎn)生少量來(lái)自豐富RNA的核酸，顯示這是4吏用此輸入RNA范圍時(shí)的合適循環(huán)數(shù)。作為建立所用的合適多重?cái)U(kuò)增循環(huán)數(shù)的一般原則，多重?cái)U(kuò)增應(yīng)避免進(jìn)行到超過(guò)合成總量百分?jǐn)?shù)5%的多核苷酸的點(diǎn)，所述總量是指允許所述>^應(yīng)進(jìn)行足夠的循環(huán)數(shù)時(shí)通常產(chǎn)生的量，在該循環(huán)數(shù)后進(jìn)一步的循環(huán)不再產(chǎn)生進(jìn)一步的擴(kuò)增。因此，常規(guī)研究應(yīng)用中推薦10個(gè)循環(huán)的多重PCR。這可與通常使用約50ngRNA分析單個(gè)基因的基因表達(dá)產(chǎn)物的常規(guī)qPCR相比。對(duì)于5-50ng的RNA輸入，前15個(gè)循環(huán)的反應(yīng)只產(chǎn)生少量最豐富RNA的核酸，如圖5所示，因此此量級(jí)的樣品推薦15個(gè)循環(huán)的多重PCR，其包括對(duì)來(lái)自FFPE切片的RNA樣品的分析。對(duì)于0.01-5ngRNA的輸入，在顯著擴(kuò)增豐富RNA種類之前20個(gè)循環(huán)的多重?cái)U(kuò)增是可能的，如圖5所示。因此20個(gè)循環(huán)的多重PCR推薦用于法醫(yī)、微生物和激光切割顯微術(shù)樣品。實(shí)踐中，如果在多重?cái)U(kuò)增步驟中使用25個(gè)或更多個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增來(lái)分析極少量樣品，則這種更高的循環(huán)數(shù)有利于形成引物二聚體和次要產(chǎn)物，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解，在一些情況下使用多于25個(gè)循環(huán)的多重PCR是可行的。類似的靈敏度范圍適用于DNA以及RNA的分析。為了直接比較改變輸入RNA模板量或多重?cái)U(kuò)增循環(huán)數(shù)時(shí)定量的準(zhǔn)確性，改變這些^對(duì)24種基因的基因表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增和定量。在使用0.1ng或1.0ng的RNA(圖6A)以及使用10或15個(gè)循環(huán)的多重?cái)U(kuò)增(圖6B)時(shí)，比較在35個(gè)循環(huán)的第二輪擴(kuò)增中所得的定量。在每種情況中，以對(duì)同一串聯(lián)MT-PCR測(cè)定中比較基因的比值來(lái)對(duì)23種基因的表達(dá)進(jìn)行定量和比較，以使數(shù)據(jù)歸一化。圖6A顯示，當(dāng)使用0.1或1ng的RNA時(shí)獲得相似的測(cè)量，給出0.96的相關(guān)系數(shù)，證明所使用RNA量的倍數(shù)改變可得到相似的相對(duì)定量值。當(dāng)使用不同多重?cái)U(kuò)增循環(huán)數(shù)測(cè)定相同RNA量時(shí)，相關(guān)性仍高于0.96,但是與預(yù)計(jì)一致，在絕對(duì)倍數(shù)差異上出現(xiàn)系統(tǒng)誤差(圖6B)。這證明，當(dāng)對(duì)核酸量進(jìn)行定量例如對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行定量時(shí)，每個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)應(yīng)該只在使用相同多重?cái)U(kuò)增循環(huán)數(shù)的情況下進(jìn)行比較。實(shí)施例5.建立用于串聯(lián)PCR的適當(dāng)?shù)腡aq聚合酶、引物濃度和逆轉(zhuǎn)錄酶，以使引物二聚體的形成最小化。為了定量少量表達(dá)基因的基因表達(dá)產(chǎn)物，通常必須使用更高的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)以擴(kuò)增足以進(jìn)行分析的產(chǎn)物。在這些情況下，經(jīng)常形成引物二聚體，其可能使通過(guò)常規(guī)方法的有效定量變的復(fù)雜或者對(duì)其造成阻礙。為了使用本發(fā)明的方法使這一問(wèn)題最小化，在擴(kuò)增和定量一組稀有基因(ERBB2、ESR1、TP53、MYC和GEM)的基因表達(dá)產(chǎn)物的實(shí)驗(yàn)中，優(yōu)化了應(yīng)包含在第二輪擴(kuò)增反應(yīng)中的Taq聚合酶的水平。在將約0.5單位的139摻入到含有約0.2nM引物和2YoDMSO的20ftl反應(yīng)中時(shí)獲得了最佳性能，其產(chǎn)生如圖7A所示干凈的熔解曲線。在第二輪擴(kuò)增反應(yīng)中使用0.5U或1.0UTaq之間的比較通過(guò)分別示于圖7A和7B的所得熔解曲線進(jìn)行說(shuō)明，這證明當(dāng)使用較高水平的Taq(例如1.0U)時(shí)，可形成引物二聚體。然后在后續(xù)擴(kuò)增之前從RNA模板合成cDNA過(guò)程中改變逆轉(zhuǎn)錄酶(MMLV)量的情況下進(jìn)行相似實(shí)驗(yàn)。然后4吏用所述方法擴(kuò)增選定的高表達(dá)(TOP2A、BTF3、MDM2、RPL35)基因和^JJi基因(ESR1)，通過(guò)圖7C和7D所示熔解曲線來(lái)展示逆轉(zhuǎn)錄(RT)反應(yīng)中MMLV量的變化對(duì)于其后第二輪擴(kuò)增反應(yīng)質(zhì)量的影響。圖7C中熔解曲線顯示，當(dāng)之前的RT反應(yīng)中使用20U的MMLV時(shí)未獲得顯著的次要擴(kuò)增產(chǎn)物。但是，當(dāng)使用約200U的較高水平MMLV時(shí)，導(dǎo)致之后擴(kuò)增出非特異性產(chǎn)物，如圖7D中所示的熔解曲線中的多個(gè)峰所示。使用SuperscriptIII逆轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen)也獲得類似結(jié)果。因此，推薦在典型的20nlRT反應(yīng)中使用約20U逆轉(zhuǎn)錄酶。實(shí)施例6.在多個(gè)實(shí)驗(yàn)中比較定量估值的再現(xiàn)性。在不同的4天，從50ng的同一批RNA進(jìn)行十次獨(dú)立的MT-PCR反應(yīng)。如實(shí)施例1所述，使用第一輪中10個(gè)循環(huán)的多重PCR來(lái)實(shí)施串聯(lián)MT-PCR。在單個(gè)實(shí)驗(yàn)中，將20nlRT混合物分為3x6fil的等分試樣，用于3組各24種基因的測(cè)量，然后進(jìn)行平均得到表3所示的數(shù)據(jù)。比較10個(gè)實(shí)驗(yàn)之間的這些測(cè)量的平均值。一種基因(Natl)從RNA中未得到，得出平坦的循環(huán)曲線。對(duì)于所有23種檢測(cè)基因，Ct值的變異系數(shù)從O.Ol到0.05變化，平均值為0.03,證明在MT-PCR實(shí)驗(yàn)之間的特別高水平的精確度。表3.在多個(gè)實(shí)驗(yàn)之間比較基因表達(dá)定量的估值。<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>平均值0.03實(shí)施例7.MT-PCR在使用細(xì)胞系模型的診斷中用于癌癥相關(guān)基因表達(dá)定量的用途。7.7浙量^^4源勿應(yīng)系尹W差厲《這相信腫瘤來(lái)源的人乳腺癌細(xì)胞系保留了相當(dāng)多的其來(lái)源腫瘤細(xì)胞的遺傳背景和生理特性。在本研究中，我們通過(guò)半巢式MT-PCR在15種人乳腺癌細(xì)胞系中一式三份測(cè)定了24種基因的表達(dá)水平。7.2辦將2nl100nM濃度的表4中所列24對(duì)引物中的每一種與4jil水混合，從而制成外部引物混合物。j"f^l辨f/浙浙務(wù)CV^欲iM^w^在0.2ml管中制備^有一對(duì)表5中所示引物的外部引物混合物，其含有10nl100nM正向引物原液、10nl100jiM相應(yīng)反向引物原液和605jil水。然后<吏用CAS1200機(jī)器人(CorbettResearch)將每種引物混合物一式三份地等分出5filCorbettResearch基因盤(pán)。然后將這些等分試樣在基因盤(pán)中用SpeedVac干燥儀加熱干燥15分鐘，然后4吏用基因盤(pán)熱封器在1601C將所述盤(pán)密封。然后##個(gè)盤(pán)保存于4"C待用。及r-戶c/#濕明膠-不含RNA酶(5ml)將50mg明膠(SigmaG陽(yáng)2625)加入5.0ml水和5plDEPC中，然后在60"C孵育1小時(shí)，期間不時(shí)進(jìn)行混合，然后保存在-20t:待用。IOxrt緩沖液(10ml)含有30mMMgCl2、300mMKCl、1mMDTT和0.1mg/ml明膠的500mMTrisHCl(pH8.5)。以0.5ml的等分試樣^M!"在20"C待用。10xpCR緩沖液(10ml)含有500mMKC1、30mMMgS04和1ng/ml明膠的200mMTrisHCl(pH8.5)。以0.5ml的等分試樣^M^20"C待用。7.3才法簡(jiǎn)言之，使用RNeasy方法(Qiagen)從每種細(xì)胞系的培養(yǎng)物中提取RNA并稀釋，使4f^個(gè)MT-PCR反應(yīng)使用50ng。RT-PCR反應(yīng)混合物制備于0.2ml薄壁PCR管中，包含50ng總RNA、每種引物終濃度均為0.1nM的外部引物混合物、0.3mM的dNTP(Roche)、RT-PCR緩沖液、2。/。DMSO、0.5nl的RNA酶抑制劑、20單位MMLV(Invitrogen)、1單位TaqDNA聚合酶(Invitrogen)。將每個(gè)管置于RG3000(CorbettResearch)中，按照如下進(jìn)行熱處理55t;i分鐘(逆轉(zhuǎn)錄)、951C5分鐘(RT變性)，然后是95"C10秒、601C20秒、72"C20秒的IO個(gè)循環(huán)。這完成了多重PCR步驟，將產(chǎn)物l:50稀釋于水中。,二發(fā)舞X顛合浙將500nl的多重?cái)U(kuò)增產(chǎn)物加入每個(gè)1.5ml的PCR反應(yīng)混合物中以達(dá)到以下終濃度0.2mMdNTP、20/0DMSO、25U/mlTaq、PCR緩沖液、1:20000稀釋的SYBR-綠。然后將20nl的PCR反應(yīng)混合物加4因盤(pán)(含有干燥的內(nèi)部引物)中的每個(gè)位置，PCR進(jìn)行95t:i秒、60"C10秒和72"C10秒的35個(gè)循環(huán)。在72"C延伸步驟結(jié)束時(shí)測(cè)量熒光。應(yīng)注意，此方法使用串聯(lián)和半串聯(lián)MT-PCR也可成功應(yīng)用。7.￥潛果使用串聯(lián)MT-PCR對(duì)每種細(xì)胞系中表皮生長(zhǎng)因子受體基因(EGFR)的表itii行定量。使用內(nèi)部比較基因?qū)Φ米悦糠N細(xì)胞系的數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化，以獲得15種細(xì)胞系的每一種中EGFR表達(dá)的相對(duì)定量，然后如圖8中所示將其并列進(jìn)行比較?？梢?jiàn)，EGFR只在15個(gè)細(xì)胞系中的2種中高表達(dá)，即BT20和SKBR3。BT20和SKBR3均已知it^J^b基因，這一結(jié)^4圖8中并列定量比較的MT-PCR定量結(jié)果中準(zhǔn)確地反映出來(lái)。這類信息在癌癥患者的治療中具有價(jià)值，并且在一些情況下為確定合適的藥物治療提供必要的信息。表4.串聯(lián)MT-PCR第一輪外部引物<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>實(shí)施例8.MT-PCR可廣泛用于任何可通過(guò)PCR測(cè)量的基因定量?jī)?nèi)皮細(xì)胞中炎性基因的表達(dá)為了證明MT-PCR在其它臨^目關(guān)領(lǐng)域的其他應(yīng)用，從分離自人皮膚活檢的100ngRNA中定量17種炎性基因的表達(dá)，使用第一輪10個(gè)循環(huán)的多重?cái)U(kuò)增和之后35個(gè)循環(huán)的第二輪擴(kuò)增進(jìn)行分析。所有17種基因一式三份均高效且準(zhǔn)確地?cái)U(kuò)增，如圖9A所示。應(yīng)注意，一式三份的測(cè)定顯示，每種基因表達(dá)產(chǎn)物的均以高度再現(xiàn)性測(cè)量。圖9B中所示的相應(yīng)熔解曲線還顯示，每個(gè)第二輪擴(kuò)增均得到不含非特異性產(chǎn)物、引物二聚體等污染的單一產(chǎn)物，即^A在35個(gè)循環(huán)的第二輪擴(kuò)增后也是如此。通過(guò)使用Bioanalyzer(AgilentTechnologies)進(jìn)行分析來(lái)進(jìn)一步確認(rèn)擴(kuò)增的特異性，如圖9C所示，其清楚地顯示，在每個(gè)^^應(yīng)中存在單一PCR產(chǎn)物。通過(guò)證明在標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)中單獨(dú)測(cè)定時(shí)它們產(chǎn)生單一產(chǎn)物而!Hi了在此MT-PCR測(cè)定中使用的基因。然后它們一起用于之前對(duì)一組癌癥相關(guān)基因進(jìn)行過(guò)優(yōu)化的高度多重MT-PCR反應(yīng)，而沒(méi)有進(jìn)一步優(yōu)化。這個(gè)例子證明，任何單獨(dú)測(cè)定時(shí)良好運(yùn)行的PCR反應(yīng)在加入到高度多重MT-PCR反應(yīng)而沒(méi)有進(jìn)一步優(yōu)化時(shí)都很可能以基本相似的形式運(yùn)行。實(shí)施例9.MT-PCR與高分辨熔解分析結(jié)合以用于鑒定耙序列。MT-PCR方法也可與高分辨熔解曲線分析結(jié)合，以用于多種用途，例如鑒定靶DNA序列、檢測(cè)異源樣品中不同病毒或細(xì)菌菌林、檢測(cè)和定量SNP、DNA曱基化(亞硫酸氫鹽處理之后)和基因分型(genotyping)。優(yōu)選使用使雙鏈擴(kuò)增子DNA飽和的嵌入染料如SYT09、Eva綠或LC綠的熔解曲線分析實(shí)例包括檢測(cè)多種病毒毒林(Varga，A和James,D(2006)J.ofVirol.Methods132:146-153)、不同細(xì)菌種類(BellCA和PatelR.(2005)DiagnMicrobiolInfectDis.53(4):301畫(huà)6)、DNA甲基化分析(Worm等，(2001)ClinicalChemistry47:1183-1189)和用于癌癥診斷的突變和基因分型分析(Bernard,P.S.和Wittwer，C.T(2002)ClinicalChemistry48(8):1178-1185;PowellB丄.等，(2002)Carcinogenesis23(2):311-315)。高分辨率熔解分析顯然對(duì)任何可通過(guò)PCR測(cè)量的基因具有廣泛可用性。為獲得來(lái)自擴(kuò)增反應(yīng)(可含有一種或多種MT-PCR產(chǎn)物)的熔解曲線謙，將產(chǎn)物逐漸從約60X:加熱到約95r;，其中熒光報(bào)告子(例如SYTO-9染料)在DNA從雙鏈形式變?yōu)閱捂溞问降臏囟认聫臄U(kuò)增產(chǎn)物中迅速解離，造成在特征溫度下所發(fā)出熒光的降低。這種熒光的改變受到連續(xù)監(jiān)測(cè)或者在溫度梯度下定期監(jiān)測(cè)，然后將熒光改變對(duì)溫度梯度軸作圖，獲得熔解曲線鐠。因?yàn)槊糠N特定的靶PCR產(chǎn)物具有特定的熔解溫度(Tm)，因此可通過(guò)其不同的熔解溫度對(duì)其進(jìn)行鑒定，如圖10A和10B中所示。Rotor-gene6000(CorbettResearch)精確的溫度控制允許待測(cè)熔解溫度有小于0.02匸的準(zhǔn)確度。il^以區(qū)分通過(guò)MT-PCR擴(kuò)增的靶標(biāo)中的小突變，或者證實(shí)反應(yīng)中擴(kuò)增了正確的靶標(biāo)。在圖IOA中，通過(guò)MT-PCR從選自2種人乳腺癌細(xì)胞系的8個(gè)樣品中擴(kuò)增TP53基因中易突變的區(qū)域，并通過(guò)Rotor-gene6000上的高分辨率熔解進(jìn)行分析?？梢钥闯?，來(lái)自SKBR3細(xì)胞系的擴(kuò)增產(chǎn)物顯示突變體TP53基因區(qū)(熔解溫度86.46"C)，這可輕易地與具有野生型TP53基因區(qū)域(熔解溫度87.16"C)的MCF7細(xì)胞系擴(kuò)增產(chǎn)物區(qū)分開(kāi)來(lái)。由于TP53基因中的一些高變基序已知具有治療后果，因此這種分析和其他類似分析可用于預(yù)測(cè)藥物，如Powell等(上文)所述。圖10B顯示對(duì)不顯示些突變的TP35基因區(qū)進(jìn)行的比較研究。此區(qū)域也使用MT-PCR在來(lái)自兩種細(xì)胞系的樣品上進(jìn)行擴(kuò)增。在這種情況下，所述曲線表明來(lái)自SKBR3和MCF7的MT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物濕_相同的，具有相同的84.901C的熔解溫度。另外應(yīng)注意，優(yōu)化第二輪擴(kuò)增反應(yīng)組分以提高熔解語(yǔ)的準(zhǔn)確性和可靠性是有利的，在這一點(diǎn)上，第二輪擴(kuò)增混合物中不包含DMSO經(jīng)常是有益的。實(shí)施例10.MT-PCR與高分辨率熔解分析結(jié)合以用于細(xì)菌鑒定仍使用實(shí)施例9中所述的高分辨率熔解曲線分析方法，但是提供比較DNA樣品，使得在熔解曲線歸一化之后測(cè)試DNA可與對(duì)照DNA進(jìn)行比較，以得到高靈敏度的與對(duì)照的一致性或不相似性測(cè)量。在圖11A和11B中，顯示了許多細(xì)菌DNA4^取物在4吏用腸球菌(Enterococcus)16SrRNA基因特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增之后的熔解曲線。其它細(xì)菌與16S序列的相似性意味著它們也產(chǎn)生PCR產(chǎn)物，即使在通過(guò)MT-PCR進(jìn)行巢式擴(kuò)增之后。在對(duì)圖11A中所示區(qū)域之間的熔解曲線歸一化之后，一條熔解曲線被鑒定為真正的腸球菌熔解曲線，將所有其它的熔解曲線與之進(jìn)行比較(圖IIB)。在此圖中，水平線來(lái)自比較腸球菌和被以98%置信度鑒定的另一個(gè)腸球菌樣品。其余的熔解曲線顯示為不同的細(xì)菌，因?yàn)樗鼈兛赡苁悄c球菌的置信度水平非常低(表5)。MT-PCR特別適用于高分辨率熔解分析，因?yàn)楫a(chǎn)物的純度提高了結(jié)果的可靠性。另外，就法醫(yī)分析而言，MT-PCR的靈敏度非常適用于痕量的人組織，就組織分型(tissuetyping)而言，可同時(shí)測(cè)定大量耙標(biāo)4吏得所述方法非常準(zhǔn)確。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，可使用多種熱循環(huán)平臺(tái)和檢測(cè)系統(tǒng)(包括多種熒光報(bào)告子)來(lái)實(shí)施MT-PCR方法和包含或聯(lián)合了高分辨率熔解曲線分析的MT-PCR方法。例如，盡管可使用Rotor-gene6000實(shí)施擴(kuò)增反應(yīng)和熔解曲線分析，但是也可使用其它一些系統(tǒng)來(lái)完成，例如Lightcycler(Roche)、ABIPRISM7000、7700和7900(AppliedBiosystems)、SmartCycler(Cepheid)、iCylcerTM(BioRad)和其它一些如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的這樣的平臺(tái)。因此，可以使用多種熒光才艮告子例如SYBR-綠I、SYT09、LC綠、Eva綠、Lightcycler⑧探針、LUXJM熒光引物等實(shí)施MT-PCR和包含或聯(lián)合了高分辨率熔解曲線分析的MT-PCR，il^t本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是很明顯的。盡管參考許多優(yōu)選實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，在不脫離本發(fā)明范圍的情況下，多種改變和修飾都是可能的。權(quán)利要求1.從核酸分子庫(kù)中擴(kuò)增多種選定的核酸分子的方法，其包括(a)在第一輪多重?cái)U(kuò)增反應(yīng)中擴(kuò)增多種選定的核酸分子，所述反應(yīng)包含多種外部引物對(duì)，每對(duì)引物對(duì)一種選定核酸序列具有特異性，其中允許所述擴(kuò)增反應(yīng)進(jìn)行到擴(kuò)增子之間對(duì)反應(yīng)組分發(fā)生顯著競(jìng)爭(zhēng)之前的點(diǎn)；和(b)在多個(gè)第二輪擴(kuò)增反應(yīng)中進(jìn)一步擴(kuò)增所述選定的核酸分子，每個(gè)反應(yīng)各包含作為模板的已完成多重反應(yīng)的一部分以及至少一對(duì)內(nèi)部引物，每對(duì)引物對(duì)一種所述選定核酸序列具有特異性，使得每個(gè)第二輪反應(yīng)分別進(jìn)一步擴(kuò)增所述多種選定核酸分子中的亞組。2.從核酸分子庫(kù)中擴(kuò)增多種選定核酸分子的方法，其包括(a)在第一輪多重?cái)U(kuò)增反應(yīng)中擴(kuò)增多種選定的核酸分子，所述反應(yīng)包含多種外部引物對(duì)，每對(duì)引物對(duì)一種選定核M列具有特異性，其中允許所述擴(kuò)增反應(yīng)進(jìn)行到擴(kuò)增子之間對(duì)反應(yīng)組分發(fā)生顯著竟?fàn)幹暗狞c(diǎn)；和(b)在多個(gè)第二輪擴(kuò)增反應(yīng)中進(jìn)一步擴(kuò)增所述選定的核酸分子，每個(gè)反應(yīng)包含作為模板的已完成多重反應(yīng)的一部分以及至少一對(duì)引物，每對(duì)引物包含內(nèi)部引物和一種所述外部引物，并對(duì)一種所述選定核酸序列具有特異性，使得每個(gè)笫二輪反應(yīng)分別進(jìn)一步擴(kuò)增所述多種選定核酸分子中的亞組。3.估計(jì)來(lái)自核酸分子庫(kù)的選定核酸分子數(shù)目的方法，其包括(a)在第一輪多重?cái)U(kuò)增反應(yīng)中擴(kuò)增多種選定的核酸分子，所述反應(yīng)包含多種外部引物對(duì)，每對(duì)引物對(duì)一種選定核^f列具有特異性，其中允許所述擴(kuò)增反應(yīng)進(jìn)行到擴(kuò)增子之間對(duì)反應(yīng)組分發(fā)生顯著竟?fàn)幹暗狞c(diǎn)；(b)在多個(gè)第二輪擴(kuò)增反應(yīng)中進(jìn)一步擴(kuò)增所述選定的核酸分子，每個(gè)反應(yīng)各包含可檢測(cè)報(bào)告子、作為模板的已完成多重反應(yīng)的一部分以及至少一對(duì)內(nèi)部引物，每對(duì)51物對(duì)一種所述選定核酸序列具有特異性，由此每個(gè)第二輪反應(yīng)分別進(jìn)一步擴(kuò)增所述多種選定核酸分子中的亞組；和(c)通過(guò)所述可檢測(cè)報(bào)告子來(lái)監(jiān)測(cè)每個(gè)第二輪擴(kuò)增反應(yīng)，從而估計(jì)每種選定序列的選定核酸分子的數(shù)量。4.估計(jì)來(lái)自核酸分子庫(kù)的選定核酸分子數(shù)目的方法，其包括(a)在第一輪多重?cái)U(kuò)增>^應(yīng)中擴(kuò)增多種選定的核酸分子，所述反應(yīng)包含多種外部引物對(duì)，每對(duì)引物對(duì)一種選定核^列具有特異性，其中允許所述擴(kuò)增反應(yīng)進(jìn)行到擴(kuò)增子之間對(duì)反應(yīng)組分發(fā)生顯著竟?fàn)幹暗狞c(diǎn)；和(b)在多個(gè)第二輪擴(kuò)增^^應(yīng)中進(jìn)一步擴(kuò)增所述選定的核酸分子，每個(gè)反應(yīng)包含可檢測(cè)報(bào)告子、作為模板的已完成多重反應(yīng)的一部分以及至少一對(duì)引物，每對(duì)引物包含內(nèi)部引物和一種所述外部引物，并對(duì)一種所述選定核酸序列具有特異性，使得每個(gè)第二輪反應(yīng)分別進(jìn)一步擴(kuò)增所述多種選定核酸分子中的亞組；和(c)通過(guò)所述可檢測(cè)報(bào)告子來(lái)監(jiān)測(cè)每個(gè)第二輪擴(kuò)增反應(yīng)，從而估計(jì)每種選定序列的選定核酸分子的數(shù)量。5.根據(jù)權(quán)利要求3或4的估計(jì)來(lái)自核酸分子庫(kù)的選定核酸分子數(shù)目的方法，其中所述熒光報(bào)告子是"雙鏈DNA的染料。6.根據(jù)權(quán)利要求3或4的估計(jì)來(lái)自核酸分子庫(kù)的選定核酸分子數(shù)目的方法，其中所述熒光報(bào)告子是與單鏈DNA相互作用的熒光探針。7.根據(jù)權(quán)利要求3或4的估計(jì)來(lái)自核酸分子庫(kù)的選定核酸分子數(shù)目的方法，其中所述第二輪擴(kuò)增反應(yīng)包含多種引物對(duì)和多種熒光探針，從而擴(kuò)增每種選定序列的多種選定核酸分子和定量。8.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述核酸分子包括DNA分子。9.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的擴(kuò)增多種選定核酸分子的方法，其中所述第二輪擴(kuò)增^^應(yīng)中所包含的所述引物的Tm高于所述第一輪擴(kuò)增反應(yīng)中所包含的所述外部引物中至少一種，4吏得所述第二輪擴(kuò)增反應(yīng)中的所述寡核苷酸引發(fā)顯著偏向于對(duì)所述具有較高Tm的所述引物有利。10.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的擴(kuò)增多種選定核酸分子的方法，其中至少一種所述外部引物包含UTP核苷酸，由此所述引物可被UNG酶消化。11.才艮據(jù)權(quán)利要求10的擴(kuò)增多種選定核酸分子的方法，其中所述外部引物在所述第一輪擴(kuò)增結(jié)束時(shí)通過(guò)UNG酶消化被除去，從而基本阻止所述笫一輪引物對(duì)所述第二輪擴(kuò)增反應(yīng)的污染。12.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述第一輪多重?cái)U(kuò)增反應(yīng)允許進(jìn)行約1至約30個(gè)循環(huán)。13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中所述第一輪多重?cái)U(kuò)增反應(yīng)允許進(jìn)行約5至約25個(gè)循環(huán)。14.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中所述第一輪多重?cái)U(kuò)增反應(yīng)允許進(jìn)行約5至約20個(gè)循環(huán)。15.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中所述第一輪多重?cái)U(kuò)增反應(yīng)允許進(jìn)行約10至約20個(gè)循環(huán)。16.才艮據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述多重?cái)U(kuò)增反應(yīng)擴(kuò)增多于約4種的選定核酸分子。17.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中所述多重?cái)U(kuò)增反應(yīng)擴(kuò)增約4至150種選定的核酸分子。18.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中所述多重?cái)U(kuò)增反應(yīng)擴(kuò)增約IO至150種選定的核酸分子。19.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中所述多重?cái)U(kuò)增反應(yīng)擴(kuò)增約20至100種選定的核酸分子。20.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的擴(kuò)增多種選定核酸分子的方法，其用于檢測(cè)多態(tài)性、突變、插入和缺失的方法中。21.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的擴(kuò)增多種選定核酸分子的方法，其用于診斷疾病和病癥的方法中。22.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其用于診斷瘤。23.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中所述瘤是乳腺癌。24.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中所述瘤是結(jié)腸直腸癌。25.根據(jù)權(quán)利要求1至21中任一項(xiàng)的擴(kuò)增多種選定核酸分子的方法，其用于檢測(cè)和鑒定選定的生物。26.根據(jù)權(quán)利要求25的方法，其中通過(guò)所述核酸產(chǎn)物的測(cè)序來(lái)檢測(cè)和鑒定所述生物。27.根據(jù)權(quán)利要求25或26的方法，其中所述生物選自細(xì)菌、病毒、真菌、支原體和寄生蟲(chóng)或其組合。28.根據(jù)權(quán)利要求20至27中任一項(xiàng)的方法，其中所述方法包括熔解曲線分析。29.根據(jù)權(quán)利要求28的方法，其中產(chǎn)生分辨率范圍是約0.05匸到約0.02"C的所述熔解曲線。30.根據(jù)權(quán)利要求28的方法，其中產(chǎn)生分辨率小于0.021C的所述熔解曲線。31.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述擴(kuò)增反應(yīng)在熱循環(huán)裝置中自動(dòng)進(jìn)行。32.根據(jù)權(quán)利要求31的方法，其中所述熱循環(huán)裝置是多孔實(shí)時(shí)熱循環(huán)裝置。33.根據(jù)權(quán)利要求31的方法，其中所述熱循環(huán)裝置是連續(xù)流PCR裝置。34.根據(jù)權(quán)利要求31的方法，其中所述熱循環(huán)裝置是旋轉(zhuǎn)式熱循環(huán)裝置。35.鑒定和/或定量至少一種選定的核酸序列的方法，其包括如下步驟(iv)將一種或多種選定的核酸序列與一種或多種可檢測(cè)報(bào)告子混合；(v)通過(guò)測(cè)量所述一種或多種可檢測(cè)報(bào)告子產(chǎn)生的信號(hào)來(lái)建立熔解曲線；(vi)從所述熔解曲線中鑒定和/或定量所述一種或多種選定的核酸序列。36.根據(jù)權(quán)利要求35的方法，其中產(chǎn)生分辨率范圍是約0.05X:到約0.02t:的所述熔解曲線。37.根據(jù)權(quán)利要求35的方法，其中產(chǎn)生分辨率小于0.02t:的所述熔解曲線。全文摘要本發(fā)明涉及從核酸分子庫(kù)中擴(kuò)增以及任選地定量和/或鑒定多種選定核酸分子的改進(jìn)方法。使用第一輪多重?cái)U(kuò)增，其中允許擴(kuò)增反應(yīng)進(jìn)行到擴(kuò)增子之間對(duì)反應(yīng)組分發(fā)生顯著競(jìng)爭(zhēng)之前的點(diǎn)。其后是第二輪擴(kuò)增，其通常包含熒光報(bào)告子以允許定量每種選定的核酸序列。所述方法可用于從多種來(lái)源(如基因表達(dá)產(chǎn)物)中擴(kuò)增和定量核酸，由此，可以從很有限的樣品中和從已降解的存檔樣品中擴(kuò)增和定量許多這樣的產(chǎn)物。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101278061SQ200680036534公開(kāi)日2008年10月1日申請(qǐng)日期2006年8月31日優(yōu)先權(quán)日2005年9月1日發(fā)明者基思·斯坦利申請(qǐng)人:科百特生命科學(xué)有限公司