專利名稱：來自actinobacillus succinogenes 130z(atcc 55618)用于從a.succinogenes c4-途徑 ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明 一般地涉及代謝工程，更具體地，涉及工程化 Actinobacillus succinogenes以生產(chǎn)4b學(xué)產(chǎn)品(Chemicals) , ^口坡3白&復(fù)
(succinate)、延胡索酸(fumamte)、蘋果酸(malate) 、 5-氨基乙酰 丙&復(fù)(5-aminolevulinate ) 、 2-酉同戊二酉菱(2畫oxoglutarate )、 谷氨酉臾
(glutamate)、以及天冬氨酸(aspartate)。具體地，本發(fā)明涉及抑制 C3途徑酶并過度表達(dá)C4途徑酶。本發(fā)明還涉及提高將底物供應(yīng)至C4 途徑的通量(flux)。本發(fā)明還涉及提高來自C4途徑的產(chǎn)品的分泌率。
b. 相關(guān)技術(shù)的描述琥珀酸具有許多工業(yè)精細(xì)化學(xué)應(yīng)用。琥珀酸還可以用作用于 生產(chǎn)大的化學(xué)產(chǎn)品(bulk chemicals )的中間商品化學(xué)給料。它最大的市 場潛能也許在于其作為給料用于生產(chǎn)強(qiáng)于鋼鐵的塑料、生物可降解的螯 合劑、以及綠色溶劑(green solvent)。每年銷售的17,000噸(15,400 公噸)琥珀酸的大部分是從馬來酸以石油化學(xué)方式生產(chǎn)的。琥珀酸也通 過葡萄糖發(fā)酵作為精細(xì)化學(xué)產(chǎn)品生產(chǎn)。為了使發(fā)酵在生產(chǎn)作為商品化學(xué) 產(chǎn)品的琥珀酸中具有竟?fàn)幜?，全部生產(chǎn)成本應(yīng)當(dāng)/人每磅一 (1)美元 ($2.20/kg)降低到約每磅二十(20)美分(44美分/kg)。
授予Datta等人的美國專利No.5,143,833教導(dǎo)了一種通過在 凈爭定條"f牛下培養(yǎng)生產(chǎn)琥王白酉交^J Anaerobiospirillum succiniciproducens樣i 生物來生產(chǎn)琥珀酸的方法。授予Donnelly等人的美國再7>告(Reissued)專利第 RE37,393號教導(dǎo)了 一種用于分離產(chǎn)生琥珀酸的細(xì)菌的方法，所述方法通 過提高缺乏分解代謝丙酮酸的能力的有機(jī)體的生物物質(zhì)(biomass),隨 后在厭氧環(huán)境下在富含葡萄糖的培養(yǎng)基中生長所述生物物質(zhì)，以使分解 代謝丙酮酸的突變體能夠生長。通過這種方法，Donnelly提供了能夠大 量生產(chǎn)琥珀酸的突變體E. coli。所述突變體Escherichia coli來源于缺乏 丙酮酸甲酸裂合酶和乳酸脫氫酶的基因的母體。均授予Gokarn等人的美國專利第6,455,284號和美國專利申 請公開第2003/0087381號教導(dǎo)了代謝工程，以提高朝向草酰乙酸 (oxaloacetate )的碳流，以提高細(xì)菌和工業(yè)發(fā)酵中大的生化制品(如賴 氨酸和琥珀酸)的產(chǎn)量。通過基因工程化細(xì)菌以過度表達(dá)酶-丙酮酸羧化 酶而^f吏所述-友流重新定向。授予Lee等人的美國專利申請公開第2003/0113885號教導(dǎo) 了一種能夠產(chǎn)生有機(jī)酸的新型微生物Mannheimia sp. 55E,以及通過缺 氧和有氧培育而將所述微生物用于生產(chǎn)有機(jī)酸的方法。授予Eikmanns等人的美國專利第6,420,151號教導(dǎo)了編碼磷 酸烯醇式丙酮酸羧激酶的來自棒狀桿菌的分離的核酸，其涉及琥珀酸的 生產(chǎn)。授予Guettler等人的美國專利第5,504,004號和5,723,322號 教導(dǎo)了用于制備琥珀酸的方法，教導(dǎo)了用于所述方法的新型微生物 Actmobacillus succmogenes 130Z,以及獲得所述樣i生物的方法。授予Guettler等人的美國專利第5,573,931號教導(dǎo)了用于制 備琥珀酸的方法、用于所述方法的A. succmogenes變異體，以及用于獲 得所述變異體的方法。雖然上述方法可以用于生產(chǎn)琥珀酸，但是Actmobacillus succinogenes仍然是已知的最好的琥珀酸生產(chǎn)者。A. succinogenes是屬 于Pasteurellaceae的革蘭氏陰性的嗜二氧化碳的(capnophilic )、厭氧 桿菌。在最佳條件下A. succmogenes生產(chǎn)最多一百(100)克/升的琥珀 酸。在工程化E. coli菌抹以大量生產(chǎn)琥珀酸方面已經(jīng)付出了很多努力，但是沒有一種工程化的E. COll菌抹在琥珀酸生產(chǎn)方面超過A.succmogenes。碳流在微生物代謝中被嚴(yán)格調(diào)節(jié)，包括朝向草酰乙酸的碳 通量?？朔@種碳通量的控制將可能提高想要的產(chǎn)物(如琥珀酸、延胡 索酸、蘋果酸、5-氨基乙酰丙酸、2-酮戊二酸、和谷氨酸)的產(chǎn)量。
雖然相關(guān)技術(shù)教導(dǎo)了琥珀酸的生產(chǎn)，但是仍然存在對改進(jìn)的 生產(chǎn)化學(xué)產(chǎn)品(如琥珀酸、延胡索酸、蘋果酸、5-氨基乙酰丙酸、2-酮 戊二酸、谷氨酸、和天冬氨酸)的方法的需要，所述方法通過抑制C3 途徑酶和過度表達(dá)C4途徑酶，并且還通過提高供應(yīng)底物到C4途徑的通 量和提高產(chǎn)品的分泌率來進(jìn)行。發(fā)明目的
因此，本發(fā)明的一個目的在于提供能夠被過度表達(dá)、敲除、 或改變以有益于化學(xué)產(chǎn)品生產(chǎn)的基因序列。
本發(fā)明的另一目的在于提供工程化A. succmogenes的方法， 以便通過過度表達(dá)和/或抑制這些基因來生產(chǎn)化學(xué)產(chǎn)品，如琥珀酸、延胡 索酸、蘋果酸、5-氨基乙酰丙酸、2-酮戊二酸、谷氨酸、和天冬氨酸。
通過參考下面的描述，這些目的和其它目的將逐漸變得顯而 易見。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了用于生產(chǎn)琥珀酸的方法，包括提供包括一種 或多種抑制C3酶的基因敲除或修飾的基因工程化的A. succmogenes, 所述C3酶選自由丙酮酸激酶、丙酮酸-甲酸裂合酶(pyruvate-formate lyase)、丙酮酸脫氫酶、及其組合構(gòu)成的組；提供用于培養(yǎng)所述基因工 程化的A. succmogenes的生長培養(yǎng)基；以及在所述生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)所 述基因工程化的A. succmogenes以生產(chǎn)琥珀酸。
本發(fā)明提供了用于生產(chǎn)琥珀酸的方法，包括提供能夠過度 表達(dá)C4酶的基因工程化的A. succmogenes,所述C4酶選自由磷酸烯醇 式丙酮酸羧激酶(PEPCK)、蘋果酸脫氫酶、延胡索酸酶、延胡索酸還 原酶、及其組合構(gòu)成的組；提供用于培養(yǎng)所述基因工程化的A. succmogenes的生長培養(yǎng)基；以及在所述生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述基因工 程4t的A. succmogenes以生產(chǎn)琥珀酸。
本發(fā)明提供了用于生產(chǎn)琥珀酸的方法，包括提供基因工程 化的A. succmogenes,其包括一種或多種抑制C3酶的基因敲除或修飾 并且能夠過度表達(dá)C4酶，所述C3酶選自由丙酮酸激酶、丙酮酸-甲酸 裂合酶、丙酮酸脫氫酶、及其組合構(gòu)成的組，所述C4酶選自由PEPCK、 蘋果酸脫氫酶、延胡索酸酶、延胡索酸還原酶、及其組合構(gòu)成的組；提 供用于培養(yǎng)所述基因工程化的A. succmogenes的生長培養(yǎng)基；以及在所 述生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述基因工程化的A. succmogenes以生產(chǎn)琥珀酸。 在另外的實(shí)施方式中，所述基因工程化的A. succinogenes進(jìn)一步包括對 一種或多種可以橋接C4和C3途徑的基因進(jìn)行的修飾，所述基因選自蘋 果酸酶和草酰乙酸脫羧酶構(gòu)成的組。在另外的實(shí)施方式中，所述基因工 禾呈化的A. succinogenes進(jìn)一步包括才是高通過Embden-Meyerhof-Parnas (EMP)途徑的通量(flux)的一種或多種基因的修飾。在另外的實(shí)施 方式中，所述基因工程化的A. succmogenes進(jìn)一步包括提高通過戊糖石岸 酸途徑(PPP)的通量的一種或多種基因的修飾。在另外的實(shí)施方式中， 所述基因工程化的A. succinogenes進(jìn)一步包括抑制蘋果酸酶的基因敲除 或修飾。在另外的實(shí)施方式中，所述基因工程化的A. succmogenes進(jìn)一 步包括抑制草酰乙酸脫羧酶的基因敲除或修飾。在另外的實(shí)施方式中， 所述基因工程化的A. succmogenes進(jìn)一步包括提高底物攝取的 一種或多 種基因的修飾。在另外的實(shí)施方式中，所述基因工程化的A. succmogenes 進(jìn)一步包括提高底物攝取的一種或多種基因的修飾，所述底物選自阿拉 伯糖、木糖、葡萄糖、果糖、以及蔗糖。在另外的實(shí)施方式中，所述基 因工程化的A. succmogenes進(jìn)一步包括提高化學(xué)產(chǎn)品分泌(chemical excretion)的一種或多種基因的修飾。在另外的實(shí)施方式中，所述一種 或多種基因編碼二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(dicarboxylate transporters )。
本發(fā)明提供了用于生產(chǎn)延胡索酸的方法，包括提供包括一 種或多種抑制C3酶的基因敲除或修飾的基因工程化的A. succmogenes, 所述C3酶選自丙酮酸激酶、丙酮酸-曱酸裂合酶、丙酮酸脫氳酶、及其 組合；提供用于培養(yǎng)所述基因工程化的A. succinogenes的生長培養(yǎng)基； 以及在所述生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述基因工程4t的A. succmogenes以生產(chǎn) 延胡索酸。
本發(fā)明提供了生產(chǎn)延胡索酸的方法，包括提供能夠過度表 達(dá)C4酶的基因工程化的A. succmogenes,所述C4酶選自PEPCK、蘋果酸脫氳酶、延胡索酸酶、及其組合；提供用于培養(yǎng)所述基因工程化的A. succmogenes的生長培養(yǎng)基；以及在所述生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述基因 工程化的A. succmogenes以生產(chǎn)延胡索酸。
本發(fā)明提供了生產(chǎn)延胡索酸的方法，包括提供基因工程化 的A. succmogenes,其包括一種或多種抑制C3酶的基因敲除或修飾并 且能夠過度表達(dá)C4酶，所述C3酶選自丙酮酸激酶、丙酮酸-曱酸裂合 酶、丙酮酸脫氬酶、及其組合，所述C4酶選自PEPCK、蘋果酸脫氳酶、 延胡索酸酶、及其組合；提供用于培養(yǎng)所述基因工程化的A. succmogenes 的生長培養(yǎng)基；以及在所述生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述基因工程化的A. succmogenes以生產(chǎn)延胡索酸。在另外的實(shí)施方式中，所述基因工程化 的A. succmogenes進(jìn)一步包括一種或多種可以橋接C4和C3途徑的基因 的修飾，所述基因選自蘋果酸酶和草酰乙酸脫羧酶。在另外的實(shí)施方式 中，所述基因工程化的A. succmogenes進(jìn)一步包括抑制延胡索酸還原酶 的基因敲除或修飾。在另外的實(shí)施方式中，所述基因工程化的A. succmogenes進(jìn)一步包括一種或多種提高通過(EMP )途徑的通量的基 因的修飾。在另外的實(shí)施方式中，所述基因工程化的A. succmogenes進(jìn) 一步包括一種或多種提高通過PPP的基因的修飾。在另外的實(shí)施方式 中，所述基因工程化的A. succmogenes進(jìn)一步包括抑制蘋果酸酶的基因 敲除或修飾。在另外的實(shí)施方式中，所述基因工程化的A. succinogenes 進(jìn)一步包括抑制草酰乙酸脫羧酶的基因敲除或修飾。在另外的實(shí)施方式 中，所述基因工程化的A. succmogenes進(jìn)一步包括一種或多種提高底物 攝取的基因的修飾。在另外的實(shí)施方式中，所述一種或多種基因提高底 物的攝取，所述底物選自阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、果糖、以及蔗糖。 在另外的實(shí)施方式中，所述基因工程化的A. succinogenes進(jìn)一步包括一 種或多種提高化學(xué)產(chǎn)品分泌的基因的修飾。在另外的實(shí)施方式中，所述 一種或多種基因編碼二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)體。
本發(fā)明提供了生產(chǎn)蘋果酸的方法，包括提供包括一種或多 種抑制C3酶的基因敲除或修飾的基因工程化的A. succmogenes,所述 C3酶選自丙酮酸激酶、丙酮酸-曱酸裂合酶、丙酮酸脫氬酶、及其組合； 提供用于培養(yǎng)所述基因工程化的A. succmogenes的生長培養(yǎng)基；在所述 生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述基因工程化的A. succmogenes以生產(chǎn)蘋果酸。
本發(fā)明提供了生產(chǎn)蘋果酸的方法，包括提供能夠過度表達(dá)C4酶的基因工程化的A. succmogenes,所述C4酶選自PEPCK、蘋果酸 脫氳酶、及其組合；提供用于培養(yǎng)所述基因工程化的A. succmogenes的 生長培養(yǎng)基；以及在所述生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述基因工程化的A. succinogenes以生產(chǎn)蘋果酸。
本發(fā)明提供了生產(chǎn)蘋果酸的方法，包括提供基因工程化的 A. succmogenes,其包括一種或多種抑制C3酶的基因敲除或修飾并且能 夠過度表達(dá)C4酶，所述C3酶選自丙酮酸激酶、丙酮酸-曱酸裂合酶、 丙酮酸脫氫酶、及其組合，所述C4酶選自PEPCK、蘋果酸脫氳酶、及 其組合；提供用于培養(yǎng)所述基因工程化的A. succmogenes的生長培養(yǎng)基； 以及在所述生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述基因工程化的A. succmogenes以生產(chǎn) 蘋果酸。
在另外的實(shí)施方式中，所述基因工程化的A. succmogenes 進(jìn)一步包括一種或多種可以橋接C4和C3途徑的基因的修飾，所述基因 選自蘋果酸酶和草酰乙酸脫羧酶。在另外的實(shí)施方式中，所述基因工程 化的A. succmogenes進(jìn)一步包括抑制延胡索酸還原酶的基因敲除或修 飾。權(quán)利要求22、 23、或24的方法，其中所述基因工程化的A. succmogenes進(jìn)一步包括抑制延胡索酸還原酶的基因敲除或修飾。在另 外的實(shí)施方式中，所述基因工程化的A. succinogenes進(jìn)一步包括一種或 多種提高通過EMP途徑的通量的基因的修飾。在另外的實(shí)施方式中， 所述基因工程化的A. succmogenes進(jìn)一步包括一種或多種才是高通過PPP 的通量的基因的修飾。在另外的實(shí)施方式中，所述基因工程化的A. succmogenes進(jìn)一步包括抑制蘋果酸酶的基因敲除或修飾。在另外的實(shí) 施方式中，所述基因工程化的A. succmogenes進(jìn)一步包括抑制草酰乙酸 脫羧酶的基因敲除或修飾。在另外的實(shí)施方式中，所述基因工程化的 A. succmogenes進(jìn)一步包括一種或多種提高底物攝取的基因的修飾。在 另外的實(shí)施方式中，所述一種或多種基因提高底物的攝取，所迷底物選 自阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、果糖、以及蔗糖構(gòu)成的組。在另外的實(shí)施 方式中，所述基因工程化的A. succmogenes進(jìn)一步包括一種或多種提高 化學(xué)產(chǎn)品分泌的基因的修飾。在另外的實(shí)施方式中，所述一種或多種基 因編碼二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)體。
本發(fā)明提供了生產(chǎn)5-氨基乙酰丙酸的方法包括提供包括 一種或多種抑制C3酶的基因敲除或修飾的基因工程化的A.succmogenes,所述C3酶選自丙酮酸激酶、丙酮酸-曱酸裂合酶、丙酮酸 脫氪酶、及其組合；提供用于培養(yǎng)所述基因工程化的A. succinogenes的 生長培養(yǎng)基；在所述生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述基因工程化的A. succinogenes以生產(chǎn)5-氨基乙酰丙酉臾。
本發(fā)明提供了生產(chǎn)5-氨基乙酰丙酸的方法，包括提供能夠 過度表達(dá)C4酶的基因工程化的A. sucdnogenes，所述C4酶選自琥珀酰 -CoA合成酶、PEPCK、蘋果酸脫氫酶、延胡索酸酶、延胡索酸還原酶、 及其組合；提供用于培養(yǎng)所述基因工程化的A. succmogenes的生長培養(yǎng) 基；以及在所述生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述基因工程化的A. succmogenes以 生產(chǎn)5-氨基乙酰丙酸。
本發(fā)明提供了生產(chǎn)5-氨基乙酰丙酸的方法包括提供基因 工程化的A. succmogenes,其包括一種或多種抑制C3酶的基因敲除或 修飾并且能夠過度表達(dá)C4酶，所述C3酶選自丙酮酸激酶、丙酮酸-甲 酸裂合酶、丙酮酸脫氫酶、及其組合，所述C4酶選自琥珀酰-CoA合成 酶、PEPCK、蘋果酸脫氳酶、延胡索酸酶、延胡索酸還原酶、及其組合； 提供用于培養(yǎng)所述基因工程化的A. succmogenes的生長培養(yǎng)基；以及在 所述生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述基因工程化的A. succinogenes以生產(chǎn)5-氨基 乙酰丙酸。在另外的實(shí)施方式中，所述基因工程化的A. succmogenes進(jìn) 一步包括一種或多種可以橋接C4和C3途徑的基因的修飾，所述基因選 自蘋果酸酶和草酰乙酸脫羧酶。在另外的實(shí)施方式中，所述基因工程化 的A. succmogenes能夠過度表達(dá)導(dǎo)致甘氨酸合成的酶。在另外的實(shí)施方 式中，所述基因工程化的A. succmogenes能夠過度表達(dá)5-氨基乙酰丙酸 合酶。在另外的實(shí)施方式中，所述基因工程化的A. succinogenes進(jìn)一步 包括一種或多種提高通過EMP途徑的通量的基因的修飾。在另外的實(shí) 施方式中，所述基因工程化的A. succmogenes進(jìn)一步包括一種或多種才是 高通過PPP的通量的基因的修飾。在另外的實(shí)施方式中，所述基因工程 化的A. succmogenes進(jìn)一步包括抑制蘋果酸酶的基因敲除或修飾。在另 外的實(shí)施方式中，所述基因工程化的A. succmogenes進(jìn)一步包括抑制草 酰乙酸脫羧酶的基因敲除或修飾。在另外的實(shí)施方式中，所述基因工程 化的A. succinogenes進(jìn)一步包括一種或多種提高底物攝取的基因的修 飾。在另外的實(shí)施方式中，所述一種或多種基因提高底物的攝取，所述 底物選自阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、果糖、以及蔗糖。在另外的實(shí)施方式中，所述基因工程化的A. succmogenes進(jìn)一步包括一種或多種提高化 學(xué)產(chǎn)品分泌的基因的修飾。在另外的實(shí)施方式中，所述一種或多種基因 編碼二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)體。在另外的實(shí)施方式中，所述基因工程化的A. succmogenes進(jìn)一步包括一種或多種甘氨酸合成基因的修飾。
本發(fā)明提供了生產(chǎn)2-酮戊二酸的方法，包括提供包括一種 或多種抑制C3酶的基因敲除或修飾的基因工程化的A. succinogenes， 所述C3酶選自丙酮酸激酶、丙酮酸-甲酸裂合酶、丙酮酸脫氫酶、及其 組合；提供用于培養(yǎng)所述基因工程化的A. succmogenes的生長培養(yǎng)基； 在所述生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述基因工程化的A. succmogenes以生產(chǎn)2-酉同；^二f復(fù)。
本發(fā)明提供了生產(chǎn)2-酮戊二酸(2-oxoglutarate)的方法，包 括提供能夠過度表達(dá)C4酶的基因工程化的A. succmogenes,所述C4 酶選自琥珀酰-CoA合成酶、PEPCK、蘋果酸脫氬酶、延胡索酸酶、延 胡索酸還原酶、及其組合；提供用于培養(yǎng)所述基因工程化的A. succinogenes的生長培養(yǎng)基；以及在所述生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述基因工 程化的A. succinogenes以生產(chǎn)2-酉同戊二酸。
本發(fā)明提供了生產(chǎn)2-酮戊二酸的方法，包括提供基因工程 化的A. succmogenes,其包括抑制C3酶的一種或多種基因敲除或修飾 并且能夠過度表達(dá)C4酶，所述C3酶選自丙酮酸激酶、丙酮酸-甲酸裂 合酶、丙酮酸脫氫酶、及其組合，所述C4酶選自琥珀酰-CoA合成酶、 PEPCK、蘋果酸脫氬酶、延胡索酸酶、延胡索酸還原酶、及其組合；提 供用于培養(yǎng)所述基因工程化的A. succmogenes的生長培養(yǎng)基；以及在所 述生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述基因工程化的A. succinogenes以生產(chǎn)2-酮戊二 酸。
在另外的實(shí)施方式中，所述基因工程化的A. succmogenes 進(jìn)一步包括抑制2-酮戊二酸脫氫酶的基因敲除或修飾并且還能夠過度 表達(dá)2-酮戊二酸受體氧化還原酶(2-oxoglutarate : acceptor oxidoreductase )。在另外的實(shí)施方式中，所述基因工程化的A. succmogenes進(jìn)一步包括一種或多種可以橋接C4和C3途徑的基因的修 飾，所述基因選自蘋果酸酶和草酰乙酸脫羧酶。在另外的實(shí)施方式中， 所述基因工程化的A. succinogenes進(jìn)一步包括一種或多種提高通過 EMP途徑的通量的基因的修飾。在另外的實(shí)施方式中，所述基因工程化的A. succinogenes進(jìn)一步包括一種或多種提高通過PPP的通量的基因的 修飾。在另外的實(shí)施方式中，所述基因工程化的A. succinogenes進(jìn)一步 包括抑制蘋果酸酶的基因敲除或修飾。在另外的實(shí)施方式中，所述基因工程化的A. succinogenes進(jìn)一步包括抑制草酰乙酸脫羧酶的基因敲除或 修飾。在另外的實(shí)施方式中，所述基因工程化的A. succinogenes進(jìn)一步 包括一種或多種提高底物攝取的基因的修飾。在另外的實(shí)施方式中，所 述一種或多種基因提高底物的攝取，所述底物選自阿拉伯糖、木糖、葡 萄糖、果糖、以及蔗糖。在另外的實(shí)施方式中，所述基因工程化的A. succinogenes進(jìn)一步包括一種或多種提高化學(xué)產(chǎn)品分泌的基因的修飾。 在另外的實(shí)施方式中，所述一種或多種基因編碼二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)體。
本發(fā)明提供了生產(chǎn)谷氨酸(glutamate)的方法，包括提供 包括一種或多種抑制C3酶的基因敲除或修飾的基因工程化的A. succinogenes,所述C3酶選自由丙酮酸激酶、丙酮酸-甲酸裂合酶、丙酮 酸脫氬酶、及其組合構(gòu)成的組；提供用于培養(yǎng)所述基因工程化的A. succinogenes的生長培養(yǎng)基；在所述生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述基因工程化 的A. succinogenes以生產(chǎn)谷氛酸。
本發(fā)明提供了生產(chǎn)谷氨酸的方法，包括提供能夠過度表達(dá) C4酶的基因工程化的A. succinogenes,所述C4酶選自由琥珀酰-CoA合 成酶、PEPCK、蘋果酸脫氫酶、延胡索酸酶、延胡索酸還原酶、及其組 合構(gòu)成的組；提供用于培養(yǎng)所述基因工程化的A. succinogenes的生長培 養(yǎng)基；以及在所述生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述基因工程化的A. succinogenes 以生產(chǎn)谷氨酸。
本發(fā)明提供了生產(chǎn)谷氨酸的方法，包括提供基因工程化的 A. succinogenes,其包括一種或多種抑制C3酶的基因敲除或修飾并且能 夠過度表達(dá)C4酶，所述C3酶選自由丙酮酸激酶、丙酮酸-曱酸裂合酶、 丙酮酸脫氫酶、及其組合構(gòu)成的組，所述C4酶選自由琥珀酰-CoA合成 酶、PEPCK、蘋果酸脫氬酶、延胡索酸酶、延胡索酸還原酶、及其組合 構(gòu)成的組；提供用于培養(yǎng)所述基因工程化的A. succinogenes的生長培養(yǎng) 基；以及在所述生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述基因工程化的A. succinogenes以 生產(chǎn)谷氨酸。
在另外的實(shí)施方式中，所述基因工程化的A. succinogenes 進(jìn)一步包括抑制2-酮戊二酸脫氬酶的基因敲除或修飾并且還能夠過度表達(dá)2-酮戊二酸受體氧化還原酶。在另外的實(shí)施方式中，所述基因工程化的A. succinogenes能夠過度表達(dá)谷氨酸脫氳酶。在另外的實(shí)施方式 中，所述基因工程化的A. succinogenes進(jìn)一步包括一種或多種提高通過 EMP途徑的通量的基因的修飾。在另外的實(shí)施方式中，所述基因工程化 的A. succinogenes進(jìn)一步包括一種或多種可以橋接C4和C3途徑的基因 的修飾，所述基因選自由蘋果酸酶和草酰乙酸脫羧酶構(gòu)成的組。在另外 的實(shí)施方式中，所述基因工程化的A. succinogenes進(jìn)一步包括一種或多 種提高通過PPP的通量的基因的修飾。在另外的實(shí)施方式中，所述基因 工程化的A. succinogenes進(jìn)一步包括抑制蘋果酸酶的基因敲除或修飾。 在另外的實(shí)施方式中，所述基因工程化的A. succinogenes進(jìn)一步包4舌抑 制草酰乙酸脫羧酶的基因敲除或修飾。在另外的實(shí)施方式中，所述基因 工程化的A. succinogenes進(jìn)一步包括一種或多種提高底物攝取的基因的 修飾。在另外的實(shí)施方式中，所述一種或多種基因提高底物的攝取，所 述底物選自阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、果糖、以及蔗糖。在另外的實(shí)施 方式中，所述基因工程化的A. succinogenes進(jìn)一步包括一種或多種才是高 化學(xué)產(chǎn)品分泌的基因的修飾。在另外的實(shí)施方式中，所述一種或多種基 因編石馬二羧&復(fù)4爭運(yùn)體(dicarboxylate transporters )。
本發(fā)明提供了生產(chǎn)天冬氨酸(aspartate)的方法，包括提 供包括一種或多種抑制C3酶的基因敲除或修飾的基因工程化的A. succinogenes,所述C3酶選自丙酮酸激酶、丙酮酸-甲酸裂合酶、丙酮酸 脫氬酶、及其組合；提供用于培養(yǎng)所述基因工程化的A. succinogenes的 生長培養(yǎng)基；在所述生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述基因工程化的A. succinogenes以生產(chǎn)天冬氛酸。
本發(fā)明提供了生產(chǎn)天冬氨酸的方法，包括提供能夠過度表 達(dá)C4酶的基因工程化的A. succinogenes,所述C4酶選自琥珀酰-CoA 合成酶、PEPCK、蘋果酸脫氬酶、延胡索酸酶、延胡索酸還原酶、及其 組合；提供用于培養(yǎng)所述基因工程化的A. succinogenes的生長培養(yǎng)基； 以及在所述生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述基因工程化的A. succinogenes以生產(chǎn) 天冬氨酸。
本發(fā)明提供了生產(chǎn)天冬氨酸的方法，包括提供基因工程化 的A. succinogenes,其包括一種或多種抑制C3酶的基因敲除或^多飾并 且能夠過度表達(dá)C4酶，所述C3酶選自丙酮酸激酶、丙酮酸-甲酸裂合酶、丙酮酸脫氳酶、及其組合，所述C4酶選自琥珀酰-CoA合成酶、.PEPCK、蘋果酸脫氫酶、延胡索酸酶、延胡索酸還原酶、及其組合；提 供用于培養(yǎng)所述基因工程化的a. succmogenes的生長培養(yǎng)基；以及在所 述生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述基因工程化的A. succmogenes以生產(chǎn)天冬氨酸。
在另外的實(shí)施方式中，所述基因工程化的A. succmogenes 進(jìn)一步包括抑制2-酮戊二酸脫氫酶的基因敲除或修飾并且還能夠過度 表達(dá)2-酮戊二酸受體氧化還原酶。在另外的實(shí)施方式中，所述基因工 程化的A. succmogenes能夠過度表達(dá)谷氨酸脫氪酶。在另外的實(shí)施方式 中，所述基因工程化的A. succmogenes能夠過度表達(dá)天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶。 在另外的實(shí)施方式中，所述基因工程化的A. succmogenes進(jìn)一步包括一 種或多種能夠提高通過EMP途徑的通量的基因的修飾。在另外的實(shí)施 方式中，所述基因工程化的A. succmogenes進(jìn)一步包i舌一種或多種可以 橋接C4和C3途徑的基因的修飾，所述基因選自蘋果酸酶和草酰乙酸脫 羧酶。在另外的實(shí)施方式中，所述基因工程化的A. succmogenes進(jìn)一步 包括一種或多種提高通過PPP的通量的通量的基因的修飾。在另外的實(shí) 施方式中，所述基因工程化的A. succmogenes進(jìn)一步包括抑制蘋果酸酶 的基因敲除或修飾。在另外的實(shí)施方式中，所述基因工程化的A. succmogenes進(jìn)一步包括抑制草酰乙酸脫羧酶的基因敲除或修飾。在另 外的實(shí)施方式中，所述基因工程化的A. succmogenes進(jìn)一步包括一種或 多種提高底物攝取的基因的修飾。在另外的實(shí)施方式中，所述一種或多 種基因提高底物的攝取，所述底物選自阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、果糖、 以及蔗糖。在另外的實(shí)施方式中，所述基因工程化的A. succmogenes進(jìn) 一步包括一種或多種提高化學(xué)產(chǎn)品分泌的基因的修飾。在另外的實(shí)施方 式中，所述一種或多種基因編碼二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)體。
本發(fā)明提供了生產(chǎn)天冬氨酸的方法，包括提供能夠過度表 達(dá)C4酶的基因工程化的A. succmogenes,所述C4酶選自PEPCK、蘋 果酸脫氫酶、延胡索酸酶、及其組合；提供用于培養(yǎng)所述基因工程化的 A. succmogenes的生長培養(yǎng)基；以及在所述生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述基因 工程化的A. succmogenes以生產(chǎn)天冬氨酸。
本發(fā)明提供了生產(chǎn)天冬氨酸的方法，包括提供基因工程化 的A. succmogenes,其包括一種或多種抑制C3酶的基因敲除或修飾并且能夠過度表達(dá)C4酶，所述C3酶選自丙酮酸激酶、丙酮酸-甲酸裂合酶、丙酮酸脫氬酶、及其組合，所述C4酶選自PEPCK、蘋果酸脫氬酶、 延胡索酸酶、及其組合；提供用于培養(yǎng)所述基因工程化的A. succmogenes 的生長培養(yǎng)基；以及在所述生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述基因工程化的A. succinogenes以生產(chǎn)天冬氛酸。
在另外的實(shí)施方式中，所述基因工程化的A. succinogenes 進(jìn)一步包括抑制延胡索酸還原酶的基因敲除或修飾。在另外的實(shí)施方式 中，所述基因工程化的A. succinogenes能夠過度表達(dá)天冬氨酸解氨酶 (aspartate ammonia-lyase )。在另夕卜的實(shí)施方式中，所述基因工程4t的 A. succmogenes進(jìn)一步包括一種或多種能夠提高通過EMP途徑的通量 的基因的修飾。在另外的實(shí)施方式中，所述基因工程化的A. succmogenes 進(jìn)一步包括一種或多種可以橋接C4和C3途徑的基因的修飾，所述基因 選自由蘋果酸酶和草酰乙酸脫羧酶構(gòu)成的組。在另外的實(shí)施方式中，所 述基因工程化的A. succmogenes進(jìn)一步包括一種或多種提高通過PPP的 通量的基因的修飾。在另外的實(shí)施方式中，所述基因工程化的A. succmogenes進(jìn)一步包括一種或多種提高底物攝取的基因的修飾。在另 外的實(shí)施方式中，所述一種或多種基因提高底物的攝取，所述底物選自 由阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、果糖、以及蔗糖構(gòu)成的組。在另外的實(shí)施 方式中，所述基因工程化的A. succinogenes進(jìn)一步包括一種或多種提高 化學(xué)產(chǎn)品分泌的基因的修飾。在另外的實(shí)施方式中，所述一種或多種基 因編碼二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)體。


圖1示出了本文所提及的將A. succmogenes基因用于化學(xué)產(chǎn) 品 生產(chǎn)的反應(yīng)途徑。
圖2示出了阿拉伯糖:攝取并進(jìn)入中心代謝的途徑。
圖3示出了木糖攝取并進(jìn)入中心代謝的途徑。
圖4示出了果糖攝取并進(jìn)入中心代謝的途徑。
具體實(shí)施方式
本說明書中所引用的所有專利、專利申請、政府出版物、政 府規(guī)章、以及文獻(xiàn)參考的全部內(nèi)容均以引用方式并入本文中。如有沖突，則以本說明書(包括定義)為準(zhǔn)。
基于生物的化學(xué)產(chǎn)品生產(chǎn)是一個成長性產(chǎn)業(yè)， 一些基于生物的化學(xué)產(chǎn)品正在取代基于化石燃料的市場。A. succmogenes是用于工業(yè) 琥珀酸生產(chǎn)以及其它化學(xué)產(chǎn)品生產(chǎn)(包括蘋果酸、延胡索酸、5-氨基乙 酰丙酸、2-酮戊二酸、谷氨酸、和天冬氨酸)的有前途的生物催化劑。 除了生產(chǎn)琥珀酸，野生型A. succmogenes 130Z還生產(chǎn)相當(dāng)數(shù)量的不想 要的甲酸、乙酸、以及乙醇。A. succmogenes發(fā)酵代i射在石壽酸烯醇式丙 酮酸(PEP)和/或丙酮酸處分成產(chǎn)生琥珀酸的C4支路和產(chǎn)生曱酸、乙 酸、和乙醇的C3支路。提高A. succinogenes的琥珀酸生產(chǎn)，允許其它 來自C4途徑的化學(xué)產(chǎn)品的生產(chǎn)，將可能涉及抑制C3途徑酶，并過度表 達(dá)C4途徑酶。此外，可以橋接C4和C3途徑的酶活性(如蘋果酸酶和 草酰乙酸脫羧酶)也可以一皮抑制。隨著C4途徑通量增加，供應(yīng)底物至 C4途徑的通量也隨之增加。可以抑制或過度表達(dá)編碼糖攝取、糖酵解、 PPP、 Entner-Doudoroff途徑中涉及的特異性酶的基因以提高通量。此外， 可以通過過度表達(dá)二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)體而提高化學(xué)產(chǎn)品分泌。
A. succmogenes是作為用于工業(yè)琥珀酸生產(chǎn)的可能的生物催 化劑的細(xì)菌。野生型A. succmogenes 130Z還生產(chǎn)相當(dāng)數(shù)量的不想要的 曱酸、乙酸、以及乙醇。A. succmogenes發(fā)酵代謝在(PEP和/或丙酮酸 處分成產(chǎn)生琥珀酸的C4支路和產(chǎn)生甲酸、乙酸、和乙醇的C3支路。提 高A. succmogenes的琥珀酸生產(chǎn)將可能涉及抑制C3途徑酶，并過度表 達(dá)C4途徑酶。C4途徑不僅對于生產(chǎn)琥珀酸是重要的，而且其它商業(yè)上 重要的化學(xué)產(chǎn)品也是C4途徑的中間產(chǎn)物或可以來源于C4途徑。這些化 學(xué)產(chǎn)品包括蘋果酸、延胡索酸、5-氨基乙酰丙酸、2-酮戊二酸、谷氨酸、 和天冬氨酸。按照DOE/JGI， A. succmogenes 130Z (ATCC 55618 )基因 組正被測序并且草圖序列(draft sequence )目前可以從Zeikus實(shí)驗(yàn)室獲 得。為了有助于設(shè)計用于生產(chǎn)C4相關(guān)的化合物的策略，我們已經(jīng)預(yù)測 了什么基因是重要的，并且已經(jīng)鑒定了草圖序列中存在的相應(yīng)的開放閱 讀框(ORF),以便它們在用于制備化學(xué)產(chǎn)品時能夠被保護(hù)。
工程化A. succmogenes以通過過度表達(dá)和/或抑制合適的基 因來生產(chǎn)化學(xué)產(chǎn)品(例如琥珀酸、延胡索酸、蘋果酸、5-氨基乙酰丙酸、 2-酮戊二酸、谷氨酸、和天冬氨酸)是有利的，原因如下(a)通過知 曉所述基因序列，它們可以被過度表達(dá)、敲除、或改變以有益于化學(xué)產(chǎn)品生產(chǎn)。這是比化學(xué)誘變和選擇壓力更直接和有效的方法；(b)它提 高了琥珀酸產(chǎn)量，超出野生型菌抹的產(chǎn)量；(c)不同于野生型菌抹， 新型、工程化的菌抹不會產(chǎn)生不想要的終產(chǎn)物；(d)它允許生產(chǎn)來自 A. succmogenes的#f的4匕學(xué)產(chǎn)品；以及(e ) A. succinogenes 4t 學(xué)產(chǎn)品生 產(chǎn)是基于可再生資源，并且可以竟?fàn)幉撛诘厝〈诨剂系幕瘜W(xué) 產(chǎn)品市場。
利用A. Succmogenes的C4途徑的化學(xué)產(chǎn)品生產(chǎn)需要C4酶 的過度表達(dá)、C3酶的抑制，以及在一些情況下， 一些C4酶的抑制。圖 1示出了這些反應(yīng)的途徑。催化酶的A. succinogenes基因可以被工程化 以使所述途徑的各種化學(xué)產(chǎn)品的產(chǎn)量最大化。粗箭頭代表C4反應(yīng)。細(xì) 箭頭代表C3反應(yīng)，除了1和20。將蘋果酸脫羧基成為丙酮酸的反應(yīng)也 認(rèn)為是存在的，但是目前所述基因還沒有被鑒定。下面的縮寫和編號名 稱被用在圖中Glc ,葡萄糖；PEP ,磷酸烯醇式丙酮酸 (phophoenolpymvate) ; OAA,草酰乙酸；Mal,蘋果酸；Fum,延胡 索酸；Suc，琥珀酸；SucCoA，琥珀酰-CoA; Gly,甘氨酸；ALA, 5-氨基乙酰丙酸；2oxo, 2-酮戊二酸；Glu,谷氨酸；Pyr，丙酮酸；For, 曱酸；AcCoA,乙酰-CoA; Aide,乙醛；EtOH,乙醇；AcPi，乙酰-磷 酸；Ace,乙酸。1，糖酵解酶；2, PEP羧激酶；3,蘋果酸脫氳酶；4, 延胡索酸酶；5,延胡索酸還原酶；6,琥珀酰-CoA合成酶；7，谷酰基 -tRNA還原酶；8, 2-酮戊二酸:受體氧化還原酶；9, 2-酮戊二酸脫氫酶； 10,谷氨酸脫氳酶；11,丙酮酸激酶；12，丙酮酸曱酸裂合酶；13,丙 酮酸脫氬酶；14,乙醛脫氫酶；15,醇脫氫酶；16,醛脫氫酶；17,磷 酸乙?；?轉(zhuǎn)移酶(phosphate acetyl-transferase ) ; 18, 乙酸激酶(acetate kinase) ; 19,乙酰磷酸酶；20,草酰乙酸脫羧酶。
酶的過度表達(dá)可包括過度表達(dá)天然酶或過度表達(dá)來自其它 細(xì)菌的酶。酶可以如我們試驗(yàn)室的成員在Kim et al. 2004 Plasmid 51: 108-115中所述的那樣在A. succmogenes中過度表達(dá)。隨著化學(xué)產(chǎn)品產(chǎn) 量的提高，到達(dá)PEP支化點(diǎn)的通量會成為限制因素，在這種情況下，糖 攝取和糖酵解中涉及的酶也需要被過度表達(dá)。
當(dāng)抑制或敲除酶時，要留心以確保細(xì)胞得到足夠的用于生長 和維持的基本中間產(chǎn)物(如乙酰-CoA、丙酮酸、琥珀酰-CoA)。切斷或 開放(leave叩en )形成C3和C4途徑之間的旁路的可選途徑也可能是重要的，如草酰乙酸脫羧酶，由contig 169上從74868-75137、 75157-76965、和76976-78283的3個ORF編碼。
鑒定的C4酶包括，^旦不限于由pckA ( PEPCK編號#: AY308832.1 GI:34582584 )編碼的磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK); 由contig 160上從41924-42862的mdh(蘋果酸脫氫酶編號#: AY773261.1 GI:54873671 )編碼的蘋果酸脫氫酶；由contig 92上從3526-4920編碼的 延胡索酸酶；由contig 120上從8954-10744、 10896-11541、 11538-11927、 11947-12291的4個ORF編碼的延胡索酸還原酶；由contig 154上從 44853-46013編碼的琥珀酰-CoA合成酶卩亞單位。a亞單位被截，因?yàn)?所述序列延伸出了所述contig的邊緣之外。a亞單位的88個氨基酸存在 于contig 154的266-1;由contig 154上從43546-44664、 40638-43463、 和contig 100上從4439-5863的3個ORF編碼的2-酮戊二酸脫氫酶。
鑒定的C3酶包括，但不限于由contig 122上從7757-9193 編碼的丙酮酸激酶；由contig 126上從1-2023編碼的丙酮酸甲酸裂合酶。 注意這個基因由于延伸出了所述contig的末端而被截短；由contig 100 上從2-2437、 2498-4381、和4439-5863的3個ORF編碼的丙酮酸脫氫 酶。注意最后的ORF與2-酮戊二酸脫氳酶的ORF相同。這兩種酶共 同使用相同的亞單位(E3部分)；由contig 135上/人211-2835編碼的 乙醛脫氫酶；由contig 164上/人4399-5517編碼的醇脫氳酶；由contig 64 上從3935-4207編碼的乙酰磷酸酶；contig 93上從1070-3的乙酸激酶。 注意由于所述ORF延伸出所述contig的邊緣之外而^f吏得約70個氨基 酸缺失；contig 83上/人1656-1886和1883-3139編碼的將乙醛和NAD轉(zhuǎn) 化為乙酸和NADH的醛脫氳酶。
編碼磷酸乙酰基-轉(zhuǎn)移酶的ORF目前不能被定位，但是基于 密切相關(guān)的基因組的檢測和由A. succmogenes生產(chǎn)的相當(dāng)數(shù)量的乙酸， 所述ORF ,皮iL為是存在的。
其它重要的酶包括，但不限于contig 159上從12卯9-14258 編碼的谷氨酸脫氬酶(glutamate dehydrogenase); 由contig 154上從 13745-14935編碼的天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(aspartate transaminase );以及由 contig 148上從5361-3934編碼的天冬氨酸解氨酶(aspartate ammonia-lyase )?；阼b定的A. succmogenes基因的化學(xué)產(chǎn)品生產(chǎn)的策略I. 琥珀酸的生產(chǎn)
敲除或抑制C3酶，所述C3酶可以或可以不包括丙酮酸 激酶、丙酮酸-甲酸裂合酶、以及丙酮酸脫氳酶。過度表達(dá)C4酶，其可 以包括PEPCK、蘋果酸脫氫酶、延胡索酸酶、以及延胡索酸還原酶中的 一些或全部。實(shí)驗(yàn)室的近期試驗(yàn)表明A. succmogenes具有最大的C4 通量，所述通量必須一皮克H以獲得工業(yè)琥珀酸生產(chǎn)(McKinlay et al. 2005. Actinobacillus succinogenes shows a-ketoglutarate auxotrophy in a chemically defined growth medium. 2005. ， Appl. Environ. Microbiol. 2005. 71: 6651-6656)。II. 延胡索酸的生產(chǎn)
采用與琥珀酸生產(chǎn)相同的方法，但是應(yīng)當(dāng)另外敲除或抑制延 胡索酸還原酶。III. 蘋果酸的生產(chǎn)
采用與延胡索酸生產(chǎn)相同的方法，但是應(yīng)當(dāng)另外敲除或抑制 延胡索酸酶。IV. 5-氨基乙酰丙酸的生產(chǎn)
采用與琥珀酸生產(chǎn)相同的方法，^f旦是還應(yīng)當(dāng)過度表達(dá)琥珀酰 -CoA合成酶。到目前為止僅發(fā)現(xiàn)了 A. succmogenes琥珀酰-CoA合成酶 的完整(3亞單位，但是預(yù)期a亞單位的其余部分存在于完整的基因組序 列中。如果完整的ct亞單位不在完整的基因組序列中，那么就需要外來 基因。hemA基因(戈口,來自Rhodobacter sphaeroides,其在vanderWerf andZeikus. 1996. Appl. Environ. Microbiol. 62 ( 10 ) : 3560-3566中有描 述)也可以被過度表達(dá)以將甘氨酸和琥珀酰-CoA轉(zhuǎn)化為5-氨基乙酰丙 酸。此外，過度表達(dá)導(dǎo)致甘氨酸合成的酶可能是有益的。V. 2-酮戊二酸的生產(chǎn)
采用與5氨基乙酰丙酸相同的方法，但是不需要過度表達(dá)產(chǎn) 生甘氨酸的途徑或hemA。 2-酮戊二酸脫氪酶是單向性地/人2-酮戊二酸 到琥珀酰-CoA,因此我們可以抑制或敲除它并且過度表達(dá)2-酮戊二酸 受體氧化還原酶(如，來自Helicobacter pylori),其在反向三羧酸循環(huán) 中起作用。VI. 谷氨酸的生產(chǎn)
采用與2-酮戊二酸相同的方法，但是還包括過度表達(dá)谷氨酸脫氬酶，其在contig 159上從12909-14258編碼。 VII.天冬氨酸的生產(chǎn)
兩種方法可以用于生產(chǎn)天冬氨酸。在第一種方法中，采用與 谷氨酸相同的方法，但是還包括過度表達(dá)天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(在contig 154 上從13745-14935上編碼)。在第二種方法中，采用與延胡索酸生產(chǎn)相 同的方法，但是還包括過度表達(dá)天冬氨酸解氨酶，由contig 148上從 5361-3934編碼。
已經(jīng)鑒定了來自A. succmogenes基因組序列并對化學(xué)產(chǎn)品 生產(chǎn)重要的A. succmogenes基因序列。在完成基因組序列后，我們將修 訂所述序列，以便校正低序列質(zhì)量，找出在草圖基因組序列中缺失的基 因區(qū)域、并且找出草圖基因組序列中缺失的對于化學(xué)產(chǎn)品生產(chǎn)可能重要 的全部基因序列。我們已經(jīng)手工注釋了草圖基因組序列中的全部開放閱 讀框(ORF)。當(dāng)完成全部基因組序列時，由不同的人注釋每個ORF。
利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增所述基因，并且將所述基因序列通 過本領(lǐng)域已知的方法克隆入質(zhì)粒。 一旦所述基因位于質(zhì)粒中，那么它們 可以被過度表達(dá)、抑制、并且可以被用于敲除如上所述的基因。選擇要 被過度表達(dá)或抑制的確切的基因部分地由代謝研究指導(dǎo)，包括在 McKinlay et al. ( Determining Actinobacillus succinogenes metabolic pathways and fluxes by NMR and GC畫MS analysis of 13C-labeled metabolic product isotopomers. Submitted for publication )中描述的"C-標(biāo)"i己實(shí)馬全。 這些標(biāo)記實(shí)驗(yàn)通過在McKinlay et al. 2005 (Actinobacillus succinogenes shows a-ketoglutarate auxotrophy in a chemically defined growth medium, Appl. Environ. Microbiol. 71 ( 11 ) : 6651-6656 )和授予Zeikus等人的美國專利申請第_號(美國專利申請第_號，要求美國臨時申請第60/717,425號的優(yōu)先4又，MSU 4.1-758 )中開發(fā)和描述的化 學(xué)成分確定培養(yǎng)基而成為可能，其全部內(nèi)容以引用方式并入本文。這些 基因工具用于過度表達(dá)Kimetal. 2004 Plasmid 51: 108-115和美國專利 申請第10/911,961號中描述的A. succinogenes中的基因。我們可以在這 個方法中改進(jìn)基因過度表達(dá)并且我們一直在積極的探求用于A. succinogenes中基因敲除的有效系統(tǒng)。要,皮敲除的基因可以被藥物抗性 盒中斷并且用于置換染色體中未被中斷的野生型基因。培養(yǎng)每個突變體 以評估突變對生長性質(zhì)和化學(xué)產(chǎn)品生產(chǎn)的作用。利用"C-標(biāo)記研究分析突變體以確定所述突變怎樣影響有機(jī)體的中間代謝。
下面是基因輩巴標(biāo)的列表，所述基因粑標(biāo)包括在本文的鑒定和 注解工作中。所述基因編碼蘋果酸酶；丙酮酸羧化酶；PEP象化酶； PEP合酶；丙酮酸-鐵氧化還原蛋白氧化還原酶；葡糖激酶；葡萄糖通透 酶；蔗糖特異性磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)；p-呋喃果糖苷酶；6-磷酸葡糖酸脫水 酶(Entner-Doudoroff途徑)；核酮糖-磷酸3-差向異構(gòu)酶(PPP );蘋 果酸合酶；異檸檬酸裂合酶；異檸檬酸脫氳酶；順烏頭酸酶；檸檬酸合 酶；檸檬酸裂合酶；乳酸脫氫酶；碳酸酐酶；卩-半乳糖苷酶；ATP-依賴 性麥芽糖轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)；Lacl阻遏蛋白；阿拉伯糖轉(zhuǎn)錄活化蛋白AraC;木 糖操縱子活化蛋白，XylR; cAMP受體蛋白，CRP，也稱為降解物活化 蛋白，CAP;以及碳儲存調(diào)節(jié)蛋白，CsrA。
A. succinogenes C3和C4途徑的基因可以用于生產(chǎn)多種化學(xué) 產(chǎn)品。由于這些策略導(dǎo)致高速率的提高的化學(xué)產(chǎn)品生產(chǎn)，由此將底物遞 送至C4途徑的途徑會限制化學(xué)產(chǎn)品生產(chǎn)速率。在本發(fā)明的一些具體實(shí) 施方式中，通過抑制、敲除、過度表達(dá)和修飾/進(jìn)化糖酵解、PPP、和底 物攝取中涉及的特定酶而提高通過這些途徑的通量。在本發(fā)明的又一實(shí) 施方式中，通過靶向編碼二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的基因而提高化學(xué)產(chǎn)品分泌。提 供了編碼這些基因的A. succmogenes草圖基因組序列中的ORF以便它 們可以用于制備化學(xué)產(chǎn)品。
:提高C4-途徑通量可以導(dǎo)致這樣的情況，其中遞送底物到C4 途徑的通量是限制性的。當(dāng)這種情況發(fā)生時，必須影響(i)糖酵解，或 者EMP、 (ii)PPP、以及(iii)底物攝取(如，葡萄糖、木糖、阿拉伯 糖、蔗糖)中涉及的基因。圖2、 3和4分別示出了阿拉伯糖、木糖、 和果糖攝取和進(jìn)入中心代謝的途徑。此外，化學(xué)產(chǎn)品分泌會成為限制性 的，由此二羧酸的輸出中涉及的基因也可能需要被影響。要影響的特定 基因和影響它們的方式部分地一皮代謝研究指導(dǎo)，包括McKmlay et al.(Determining Actinobacillus succinogenes metabolic pathways and fluxes by NMR and GC-MS analysis of C-labeled metabolic product isotopomers. Submitted.)中描述的13C-標(biāo)記研究。這些標(biāo)記實(shí)馬全因McKinlay et al. 2005(Actinobacillus succinogenes shows a-ketoglutarate auxotrophy in a chemically defined growth medium, Appl. Environ. Microbiol., 71 ( 11 ): 6651-6656 )和授予Zeikus等人的美國專利申請第_號(美國專利申請第_號，要求美國臨時申請第60/717,425號的優(yōu)先權(quán)，MSU 4.1-758 )中描述的我們的化學(xué)成分明確的A. succmogenes生長培 養(yǎng)基而成為可能。例如，EMP和PPP之間的通量分布和糖異生發(fā)生的 程度應(yīng)當(dāng)通過"C-標(biāo)記實(shí)驗(yàn)而被揭示。如果存在相當(dāng)數(shù)量的糖異生通量， 那么我們將敲除被認(rèn)為在糖異生中涉及的那些酶，并且觀察效果。此外， 為了生產(chǎn)5-氨基乙酰丙酸，需要甘氨酸作為底物。提高用于5-氨基乙酰 丙酸(ammolevulmate )生產(chǎn)的甘氨酸的通量可能是有價值的。
我們已經(jīng)鑒定了被認(rèn)為在A. succmogenes 1!30Z草圖基因組 序列中編碼特定酶的基因序列，我們預(yù)期其對于改變(i) EMP通量、 (11) PPP通量、(111)底物攝取、(iv) 二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)、(v)以及甘氨 酸合成是重要的。這些基因序列作為附件附加并總結(jié)如下。在完整的 A. succinogenes基因組序列釋放后，對這些序列進(jìn)刊 修飾，因?yàn)樗霾?圖基因組序列包含不良序列質(zhì)量的空隙和區(qū)域。 (i) EMP基因
contig 135上從14164-15858的磷酸葡糖異構(gòu)酶(EC 5.3.1.9 )
contig 163上/人33518-34483的6-石岸酸果糖激酶(EC 2.7.1.11 )
contig 154上從16095-15022的磷酸丙糖異構(gòu)酶(EC 5.3.1.1 )
contig 154上從40514-41299的磷酸丙糖異構(gòu)酶(EC 5.3.1.1 )
contig 163上從42329-43099的磷酸丙糖異構(gòu)酶(EC 5.3.1.1 )
contig 74上從2747-3760的果糖-l,6-二磷酸酶(EC 3.1.3.11 ) (糖異生)[OO"] contig 138上從376-1的編碼果糖1，6-二磷酸醛縮酶的N-末端 的兩個ORF。注意所述完全序列不是已知的延伸出所述contig的邊緣 的ORF。所述序列由于造成移碼的低序列質(zhì)量而纟皮分成2個ORF。(果 糖攝取途徑)。
contig 127上從13295-12330的甘油醛-3-石舞酸脫氫酶(EC 1.2.1.12)。注意由于這個ORF的5，-末端延伸出所述contig的邊緣之 外而使編碼約20個氨基酸的預(yù)計60個堿基缺失。
contig 138上從1655-480的3-磷酸甘油酸激酶(EC 2.7.2.3 )
contig 133上從4053-3370的磷酸甘油酸變位酶(EC 5.4.2.1 )
contig 162上/人48008-48652的》岸酸甘油酸變位酶(EC 5.4.2.1 )
contig 157上從33951-33061的烯醇化酶(EC 4.2.1.11 )。注 意這只是烯醇化酶的C-末端。編碼N-末端的區(qū)域延伸出所述contig 的邊緣之外。潛在的EMP策略
為了提高將底物(即，PEP和丙酮酸)遞送至C4-途徑的通 量，可能需要過度表達(dá)一些或全部EMP酶?？梢酝ㄟ^測量EMP通量(利 用"C-標(biāo)記實(shí)驗(yàn)確定)和酶活性以及利用代謝控制分析計算來估計每種 EMP酶影響C4-途徑通量的程度。作為可選方法，可以通過 Entner-Doudoroff ( ED )途徑通量補(bǔ)充EMP通量，提供了將底物遞送至 C4途徑的兩條途徑。編碼A. succmogenes ED酶6J舞酸葡糖酸脫水酶(6-phosphogluconate dehydratase ) (EC 4.2.1.12)的基因在草圖基因組 序列中未找到，因此，如果其在完全基因組序列中不存在，則可能必須 過度表達(dá)編碼這種酶的外源基因。編碼A. succinogenes ED酶2-酮-3-脫 氧-6畫磷酸葡糖酸醛縮酶(2畫keto隱3畫deoxy-6畫phosphogluconate aldolase)(EC4.2.1.14)的基因于contig 148上從19472-18834和contig 159上從 15090-14452找到。 (ii) PPP基因
contig 146上從10225-8738的葡糖-6-磷酸脫氳酶(EC 1.1.1.49)
contig 115上從8607-7906的6-磷酸葡糖酸內(nèi)酯酶(EC 3.1.1.31 )
contig 115上/人5548-4094的6-石壽酸葡糖酸脫氬酶(EC 1.1.1.44)
contig 141上從5548-4094的6-磷酸葡糖酸脫氬酶(EC 1.1.1.44)[OO卯]核酮糖-磷酸3-差向異構(gòu)酶(EC 5.1.3.1)未在任何contig上 找到，但是可能在完全基因組序列中找到，因?yàn)槊芮邢嚓P(guān)的 Pasteurellaceae具有這種基因。
contig 154上從20162-19710的核糖-5-磷酸異構(gòu)酶(EC 5.3.1.6)
contig 154上從37092-36643的核糖5-磷酸異構(gòu)酶(EC 5.3.1.6)
contig 56上從2978-2337的核糖5-磷酸異構(gòu)酶(EC 5.3.1.6 )
contig 168上從64945-64286的核糖5-磷酸異構(gòu)酶(EC 5.3丄6)
contig 159上從37734-36904的酮糖轉(zhuǎn)移酶N-末端亞單位(EC 2.2.1.1 )
contig 159上從36911-35976的酮糖轉(zhuǎn)移酶C-末端亞單位(EC 2.2.1.1 )
contig 86上從2744-738的酮糖轉(zhuǎn)移酶(EC 2.2.1.1 )。
contig 105上從6033-5368的醛羧轉(zhuǎn)移酶(transaldolase ) ( EC 2.2.1.2)
contig 135上從12149-13102的醛羧轉(zhuǎn)移酶(EC 2.2.1.2 )
潛在的PPP策略通過PPP的通量導(dǎo)致1/6的碳作為C〇2 丟失，并非所有的碳都可以在C4途徑中回收。在存在相當(dāng)數(shù)量的PPP 通量的情況下(有待通過"C-標(biāo)記研究確定)，使化學(xué)產(chǎn)品生產(chǎn)中的碳 回收最大化需要敲除葡糖-6-磷酸脫氫酶，或者如果需要ED途徑通量， 則敲除6-磷酸葡糖酸脫氳酶。這兩種酶是氧化性PPP的一部分。通過轉(zhuǎn) 移最少量的通量通過非氧化性PPP以生產(chǎn)最基本的代謝中間產(chǎn)物而不 丟失作為C02的碳，所述細(xì)胞應(yīng)仍能夠存活，這已經(jīng)在E. coli情況下示 出(Zhao et al. FEMS Microbiol. Lett. 2003. 220: 295-301 and Hua et al. J. Bacteriol. 2003. 185 ( 24 ) : 7053-7067)。
備選地，如果工業(yè)的經(jīng)濟(jì)情形允許丟失一些C02或者如果 還原能力的來源(C4途徑需要)昂貴，則轉(zhuǎn)移通量通過氧化性PPP是 值得的，其給每個葡萄糖提供2個NADPH。為此，EMP酶，葡糖磷酸 異構(gòu)酶，可以被敲除。利用天然或外來的轉(zhuǎn)氫酶或心肌黃酶(diaphorase) 將由此得到的NADPH轉(zhuǎn)變?yōu)镹ADH也可能是必要的，對于E. coll葡糖 磷酸異構(gòu)酶敲除突變體就是這種情況(Canonaco et al. FEMS Microbiol. Lett. 2001. 204: 247-252 ) 。 A. succinogenes轉(zhuǎn)氫酶一皮contig 152上/人 24659-26191、 contig 152上從26203-27654和可能地contig 107上從 11481-10150編碼。(ill)底物攝取基因
(a)阿拉伯糖contig 155上從6574-7389的ABC-型阿拉 伯糖轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)周質(zhì)蛋白；contig 155上從7413-8948的ABC-型阿拉伯糖轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)ATP-結(jié)合蛋白；contig 155上從8964-9932的ABC-型阿拉伯糖 轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)通透酶成分；contig 155上從12637-14124的L-阿拉伯并唐異構(gòu) 酶(EC 5.3.1.4) ; contig 117上從3876-2419的L-木酮糖激酶(EC 2.7.1.53) ; contig 106上從2250-3704的L-木酮糖激酶(EC 2.7.1.53); contig 115上從2782-3474的核酮糖-5-磷酸-4-差向異構(gòu)酶(EC 5丄3.4 )。
( b )木糖contig 155上從21265-22578的木糖異構(gòu)酶(EC 5.3.1.5) ; contig 165上從43481-41883的D畫木酮糖激酶(EC 2.7.1.17) 或L-核酮糖激酶(ribulokinase ) (EC 2.7.1. 16) ; contig 155上從 22646-24091的D-木酮糖激酶(EC 2.7.1.7 ); contig 155上從11012-12616 的D-木酮糖激酶(EC 2.7.1.7) ; contig 155上從40497-38974的ABC-型木糖或核糖轉(zhuǎn)運(yùn)體ATP-結(jié)合蛋白；contig 155上,人21013-20015的 ABC-型木糖轉(zhuǎn)運(yùn)體周質(zhì)蛋白(xylose transporter periplasmic protein ); contig 155上從18411 -17284的ABC-型木糖轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)通透酶成分；contig 155上從19929-18415的ABC-型木糖轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)ATP-結(jié)合成分；contig 165 上從44518-45636的木糖操縱子阻遏蛋白。[OOIO4] (c)葡萄糖contig 99上/人4340_3426的葡糖激酶轉(zhuǎn)錄調(diào) 節(jié)子(EC 2.7.1.2) ; contig 153上從411-13的葡萄糖特異性PTS蛋白 IIA; contig 153上從27639-29498的葡萄糖或(3-葡糖甙特異性PTS蛋白 IIC; contig 165上從40420-39968的葡萄糖或P-葡糖甙特異性PTS蛋白 IIA。
(d)果糖contig 106上從5534-3858的果糖-特異性PTS 蛋白IIC; contig 106上從7985-6483的果糖-特異性PTS蛋白(IIA/FPr ); contig 135上從9001-7952的果糖-特異性PTS蛋白IIC; contig 135上從 9331-9014的果糖-特異性PTS蛋白IIB; contig 135上從9799-9353的甘 露醇/果糖特異性PTS蛋白IIA; contig 106上/人6480-5539的l-石壽酸果 糖激酶(EC 2.7.1.56); contig 54上從6480-5539的l-磷酸果糖激酶(EC 2.7.1.56) ; contig 168上從10269-11198的D-果糖激酶。
( e )通用contig 153上從2202-475的PEP磷酸-轉(zhuǎn)移酶系 統(tǒng)酶I(EI); contig 153上的石壽酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)、HPr-相關(guān)蛋白；contig 165 上/人41787-40432的質(zhì)子/糖同向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(proton/sugar symport protein )。
(f)蔗糖contig 168上從11272-12720的蔗糖轉(zhuǎn)化酶。
(g)糖流出contig 145上從25395-26780的潛在的主要易 化超家族糖通透酶 (potential major facilitator superfamily sugar permease ) ; contig 123上從16827-15997主要易化超家族糖通透酶。
底物攝取策略多種底物對于A. succinogenes的化學(xué)產(chǎn)品 生產(chǎn)是重要的，包括在一般的給料中豐富的那些底物，阿拉伯糖、木糖、 葡萄糖、果糖、以及蔗糖。所有這些糖均非?？赡鼙涣姿徂D(zhuǎn)移酶系統(tǒng) (PTS)、激酶、ABC-型轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)攝取或者通過異化擴(kuò)散(即，質(zhì)子同 向轉(zhuǎn)運(yùn)通透酶)攝取。理想地，我們希望通過通透酶攝取每個糖以便釋 放更多細(xì)胞需要的ATP。如果這不可能，其它系統(tǒng)比PTS更有利，因?yàn)?PTS將PEP轉(zhuǎn)化為丙酮酸，其可能或可能不被容易地羧化為草酰乙酸或 蘋果酸。
阿拉伯糖最可能通過ABC-型轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)被內(nèi)在化。 一旦內(nèi)在 化，它可以通過許多途徑進(jìn)入代謝(圖1)。利用13(3-阿拉伯糖應(yīng)該可 以揭示哪條途徑是最重要的。在這條途徑中的一個、 一些、或者全部基 因可能需要被過度表達(dá)。
木糖最可能通過ABC-型轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)內(nèi)在化并在PPP中作為 木酮糖-5-磷酸進(jìn)入中心代謝(圖2)。如果木糖和葡萄糖共代謝，則提 議的PPP敲除將不是有害的，因?yàn)槟咎沁M(jìn)入6-磷酸葡糖酸脫氫酶的代謝 下游。然而，過度表達(dá)木酮糖下游的PPP^^直得的,…以提'高從木g同牆— 到PEP的通量。此外，我們已經(jīng)鑒定了似乎是木糖操縱子阻遏蛋白的物 質(zhì)。在存在木糖的情況下敲除這個阻遏物可能是值得的，以便使木糖攝 取最大化。
葡萄糖可能被PTS系統(tǒng)或者己糖激酶攝取，己糖激酶還沒 有被鑒定但是活性已經(jīng)被我們的實(shí)驗(yàn)室成員Pil Kim (Kim and Vieille. Glucose phosphorylation mechanisms in succinate-producing Actinobacillus succinogenes. Submitted )禾口 Mariet van der Werf ( Van der Werf etal. Arch. Microbiol. 1997. 167: 332-342 )檢測到。如果證明難以 有效地將丙酮酸羧化為PEP,那么我們將希望敲除PTS系統(tǒng)并過度表達(dá) 己糖激酶。
果糖很可能被PTS或果糖激酶攝取并依賴于攝取系統(tǒng)以果 糖-6-磷酸或果糖1,6-二磷酸和甘油醛3^壽酸進(jìn)入糖酵解中(圖3)。與 葡萄糖一樣，我們將最可能希望敲除PTS系統(tǒng)并過度表達(dá)果糖激酶。由于果糖在糖酵解中進(jìn)入代謝早，在果糖是主要的碳源的情況下，不應(yīng)當(dāng) 使用提議的提高PPP通量的磷酸葡糖異構(gòu)酶突變。
如果存在蔗糖，我們將希望過度表達(dá)蔗糖轉(zhuǎn)化酶以有效地 將蔗糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖和果糖。
為了提高化學(xué)產(chǎn)品生產(chǎn)，我們還希望敲除阻遏底物:攝取的 基因，如糖流出基因。然而，取決于這些糖流出通透酶作用于什么糖， 可能不需要敲除它們。確實(shí)，如果足夠的糖濃度梯度可以引起這些糖流 出通透酶攝取糖，那么通過過度表達(dá)所述基因以提高它們的糖攝取能力 可能是值得的。(iv ) 二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)體基因包括
contig 154上從18087-16792的TRAP C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)(Dct) 系統(tǒng)蛋白。Contig 159上從20342-19050的TRAP-型C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng) 大亞單位
contig 117上7334-6057的TRAP-型C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)小 通透酶成分
contig 122從13540-12269的TRAP-型C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng) 大蛋白成分
contig 148上/人27696-26689的TRAP-型C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)系 統(tǒng)周質(zhì)成分(二羧酸-結(jié)合蛋白)
contig 159上/人21876-20890的TRAP-型C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)系 統(tǒng)周質(zhì)成分(二羧酸-結(jié)合蛋白)
contig 122上從14033-13551的TRAP畫型C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)系 統(tǒng)小通透酶成分
contig 159上從20836-20345的TRAP-型C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)系 統(tǒng)小通透酶成分
contig 154上從18563-18087的TRAP-型C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)系 統(tǒng)小通透酶成分
contig 148上/人26666-26157的TRAP-型C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)系 統(tǒng)小通透酶成分
contig 148上從12484-12975的TRAP-型C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)系 統(tǒng)小通透酶成分
contig 117上/人7813-7331的TRAP-型C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)小通透酶成分
contig 154上從19646-18669的TRAP-型C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)系 統(tǒng)周質(zhì)成分(二羧酸-結(jié)合蛋白)
contig 148上從12245-11259的TRAP-型C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)系 統(tǒng)周質(zhì)成分(二羧酸-結(jié)合蛋白)
contig 122上從15018-14053的TRAP-型C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)系 統(tǒng)周質(zhì)成分(二羧酸-結(jié)合蛋白)
contig 117上從5984-4998的TRAP-型C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng) 周質(zhì)成分
contig 117上從4938-3949的TRAP-型C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng) 周質(zhì)成分
contig 77上從4284-3718的TRAP-型C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)整 體膜成分。注意N-末端編碼區(qū)缺失，原因是所述編碼區(qū)延伸到所述 contig的邊纟象《夕卜。
contig 148上從26147-24867的TRAP-型C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)系 統(tǒng)整體膜成分
contig 148上從12987-14288的TRAP-型C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)整體膜成分
contig 154上從18563-18087的TRAP-型C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)系 統(tǒng)成分二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)體策略
由于存在許多二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)的4美選物，我們通過依次敲除每 個基因并檢測對于特定化學(xué)產(chǎn)品生產(chǎn)率的作用來確定哪些基因?qū)τ谔?定化學(xué)產(chǎn)品生產(chǎn)是重要的。 一旦鑒定出用于分泌特定化學(xué)產(chǎn)品的合適基 因，我們將過度表達(dá)這些基因。 (v)甘氨酸合成基因
絲氨酸脫氨酶或蘇氨酸解氨酶(EC4.3.1.19)，位于contig 141上從10270-11808
contig 137上從2950-1682的甘氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶(EC 2.1.2.1 )
如果發(fā)現(xiàn)甘氨酸可用性限制5-氨基乙酰丙酸生產(chǎn)，則這些 基因均將被過度表達(dá)。表1.鑒定的Actinobacillus succinogenes基因核苷酸序列和開》文閱 讀框(ORF )。磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶蘋果酸脫氬酶延胡索酸酶延胡索酸還原酶琥珀酰-CoA合成酶谷?；?tRNA還原酶2-酮戊二酸脫氬酶谷氨酸脫氫酶天冬氨酸解氨酶天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶丙酮酸激酶丙酮酸脫氫酶丙酮酸-甲酸裂合酶乙醛脫氬酶 .醇脫氫酶?；姿崦?acylphosphatase )醛脫氬酶 乙酸激酶磷酸乙?；?轉(zhuǎn)移酶 草酰乙酸脫羧酶實(shí)施例1
按照DOE/JGI,將A. succmogen6s 130Z ( ATCC 55618 )基 因組測序并將所述序列用于鑒定對于生產(chǎn)C4-相關(guān)化合物重要的基因。 這些基因的序列作為SEQIDNO:l到SEQ ID NO:l 19在本文中披露。
A. succinogenesC3和C4途徑的基因和開》文閱讀框(ORF ) 的核苦酸序列4皮露如下?？梢?人American Type Culture Collection (ATCC )購買A. succinogenes 130Z。本文測序的基因組DNA來自從 ATCC獲得的菌林。編碼PEPCK的pckA和編碼蘋果酸脫氫酶的mdh 均已在E. coli中表達(dá)。PEPCK已經(jīng)在A. succinogenes中被過度表達(dá)。
SEQ ID NO:l是A. succinogenes編碼PEPCK的基因序列。 (PEPCK編號弁AY308832.1 GI:34582584>gi|34582584|gb|AY308832.1|A. succinogenes PEPCK基因，完全cds )。
SEQ ID NO:2是Contig 160上編碼A. succinogenes蘋果酸脫 氫酶的ORF (實(shí)-驗(yàn)室成員Maris Laivemeks先前將這個基因和編碼 PEPCK的pckA測序)EC 1.1.1.37〉SPTR top hit: 'Q5U907 NAD ( H )-依賴性蘋果酸脫氳酶-41924: 42862。
SEQ ID NO:3是蘋果酸DH編號#: AY773261.1 GI:54873671〉gi|54873671|gb|AY773261.1|A. succinogenes質(zhì)粒pKNJ NAD (H)-依賴性蘋果酸脫氬酶(mdh)基因，完全cds
SEQ ID NO:4是Contig 92上編碼A. succinogenes延胡索酸 酶的ORF EC 4.2.1.2 (〉SPTR top hit: 'Q65UJ3 FumC蛋白。Mannheimia sue-3526: 4920)。
Contig 120上編碼A. succinogenes延胡索酸還原酶的ORF: frdB被分成2個重疊的ORF ( FRD鐵硫蛋白和frdB ) 。 EC 1.3.99.1或 1.3.5.1。 SEQ ID NO:5是frdA。 ( 〉PRIAM:琥珀酸脫氳酶。-8954: 10744 )。 SEQ ID NO:6是FRD鐵硫蛋白(〉SPTR top hit: 'Q7VPM7延胡索酸還原 酶鐵-硫-10896: 10970)。 SEQ ID NO:7是FrdB。開頭的11個堿基與鐵 石克蛋白ORF重疊(>SPTR top hit: 'Q65S00 FrdB蛋白。Mannheimia sue -10960: 11541 )。 SEQ ID NO:8是frdC。開頭的四個堿基與frdB產(chǎn)物 的C-末端重疊。(>SPTR top hit: 'Q65RZ9 FrdC蛋白。Mannheimia sue -11538: 11927)。 SEQ ID NO:9是frdD ( 〉SPTR top hit: 'Q65RZ8 FrdD 蛋白。Mannheimia sue-11947: 12291 )。
Contig 154上編碼A. succinogenes琥珀酰-CoA合成酶的 ORF: EC6.2丄5 SEQIDNO:10是卩-亞單位(〉PRIAM:琥珀酸—CoA連 接酶[ADP-形成]。-44853: 46013 ) 。 a-亞單位大部分缺失，然而N-末 端發(fā)現(xiàn)于contig 154 P-亞單位J^因的下游的邊緣，與其它基因組比較時， 它將預(yù)期位于此處。通過對a-亞單位核苷酸序列與A. succinogenes草圖 基因組序列(draft genome sequence )進(jìn)行blast發(fā)現(xiàn)它。SEQ ID NO: 11 是序歹寸 260 attttaattaataaaaacactaaagtgatctgccaggg—attcaccggcggacaagg 205。然而令人吃驚的是所述序列從260: l不匹配。所取的開放閱讀框 從260:1沒有終止密碼子，并且針對nr數(shù)據(jù)庫(88個氨基酸)中所有的細(xì)菌進(jìn)行BLASTp搜索。搜索發(fā)現(xiàn)，在所查詢的全部88個氨基酸上具 有對琥珀酰-CoA a-亞單位幾乎相同的同一性，并包括保守的CoA-結(jié)合 4立點(diǎn)。SEQ ID NO:12是序歹寸260attttaattaataaaaacactaaagtga— tctgccagggsttcaccggcggscaaggcaccttccacagcgaacaggcattggcatscg gcacgaaattagtgggcggtac:cagtccgggtaaaggcggtacgacgcatttgggattgc cggtgtttgatacggtacgcgaagcggtgcaaaaaaccggagccsccgccagcgtgattt stgtgccggrcsecgttctgtaaggeGgccattctggaagcgattgacgccgg 1,
contig 154上編碼A. succmogenes 2-酮戊二酸脫氬酶的 ORF: SEQ ID NO:14是E2 (EC 2.3.1.61 ) 二氳為乾辛酰胺琥珀酰轉(zhuǎn)移酶 (Dihydrolipoamide succmylt認(rèn)sferase ) 〉-43546: 44664。 SEQ ID NO: 15 是El (EC 1.2.4.2 ) ( 〉SPTR top hit: 'Q65SU8 SucA蛋白。Mannheimia suc-40638: 43463 )。 SEQ ID NO: 16是Contig 100上發(fā)現(xiàn)的E3( EC 1.8.1.4 ) 陽注意與丙酮酸脫氫酶相同的ORF (這是正常的)(>SPTR top hit: 'Q65SW9Lpd蛋白。Mannheimia succ-4439: 5863 )。
SEQ ID NO:17是contig 159上編碼A. succinogenes谷氨酸 脫氬酶的ORF(EC 1.4.1.4) (〉PRIAM:谷氨酸脫氫酶(NADP+)。-12909: 14258)。
SEQ ID NO:13是contig 148上編碼A. succinogenes天冬氨 酸解氨酶的ORF ( EC 4.3.11 ) ( 〉SPTR top hit: 'Q7VNH2 AspA蛋白。 Haemophilus ducreyi-5361: 3934 )。
SEQ ID NO: 119是contig 154上編碼A. succinogenes天冬氨 酸轉(zhuǎn)氨酶的ORF ( EC 2.6.1.1 ) ( 〉SPTR top hit: 'P44425天冬氨酸解氨 酶。Haemophilus influenzae-13745: 14935 )。
SEQ ID NO:18是Contig 122上編碼A. succmogenes丙酮酸 激酶的ORF (EC 2.7.1.40) (>PRIAM:丙酮酸激酶。-7757: 9193 )。
Contig 100上編碼A. succinogenes丙酮酸脫氬酶的ORF: SEQ ID NO: 19是EC 1.2.4.1 ( >SPTR top hit: 'P45119丙酮酸脫氬酶El co-2: 2437)。 SEQ ID NO:20是EC 2.3.1.12 ( 〉PRIAM: 二氳石克辛酰胺 S匿琥珀酰轉(zhuǎn)移酶(Dihydrolipoamide S-succmyltransferase )。 -2498: 4381 )。 SEQ ID NO:21是EC 1.8.1.4 ( 〉SPTR top hit: 'Q65SW9 Lpd蛋白。 Mannheimia succ-4439: 5863 )。丙酮酸曱酸裂合酶的截短的ORF-EC 2.3.1.54.1..2023bp
SEQ ID NO:23是Contig 135上編碼A. succinogenes乙醛脫氬酶的ORF。 (EC 1.2.1.10 )乙酰-CoA《"^乙醛(〉SPTR top hit: 'Q65QG3EutG蛋白。Mannheimia suc-211: 2835 )。
SEQ ID NO:24是contig 164上編碼A. succinogenes醇脫氬酶的ORF(E.C. 1.1.1.1) ( 〉SPTR top hit: 'Q8DWE2推定的醇脫氬酶-4399: 5517)。
SEQ ID NO:25是Contig 64上編碼A. succinogenes?；姿?酶(acylphosphatase )的ORF ( EC 3.6.1.7 ) ( 〉SPTR top hit: 'Q9C麗1 假定(Hypothetical)蛋白PM0396。 -3935: 4207)。
SEQ ID NO:26是Contig83上編碼A. succinogenes醛脫氳酶 的ORF EC 1.2.1.3 (〉SPTR top hit: 'Q65SA2 PutA蛋白。Mannheimia suc-1656: 1886 )。
SEQ ID NO:27是Contig 83上編碼A. succinogenes醛脫氬酶 的ORF( 〉SPTR top hit: 'Q65SA2 PutA蛋白。Mannheimia suc-1883: 3139 )。
SEQ ID NO:28是Contig 93上從1070: 3編碼A. succmogenes 乙酸激酶的ORF。在420個預(yù)期的氨基酸中約存在350個氨基酸(EC 2.7.2.1 )。
編碼磷酸乙?；?轉(zhuǎn)移酶的ORF目前還不能被定位，但是 基于與密切相關(guān)的基因組的類似性和A. succmogenes的乙酸生產(chǎn)相信其 是存在的。
Contig 169上編碼A. succmogenes草酰乙酸脫羧酶的ORF: EC 4.1.1.3。 SEQ ID NO:29是oadG ( >SPTR top hit: 'Q65WL3 OadG蛋 白。Mannheimia suc-74868: 75137 ) 。 SEQ ID NO:30是oadA ( >SPTR top hit: 'Q65WL4 OadA蛋白。Mannheimia suc-75157: 76965 )。 SEQ ID NO:31 是oadB (〉PRIAM:草酰乙酸脫羧酶。-76976: 78283 )。EMP基因
SEQ ID NO:32是contig 135上從14164-15858的編碼A. succmogenes磷酸葡糖異構(gòu)酶(EC 5.3.1.9)的ORF
SEQ ID NO:33是contig 163上乂人33518-34483的編碼A. succinogenes 6-》壽酸果糖激酶(EC 2.7.1.11 )的ORF
SEQ ID NO:34是contig 154上從16095-15022的編碼A.succmogenes磷酸丙糖異構(gòu)酶(EC 5.3.1.1 )的ORF
SEQ ID NO:35是contig 154上從40514-41299的編碼A. succmogenes磷酸丙糖異構(gòu)酶(EC 5.3.1.1)的ORF
SEQ ID NO:36是contig 163上從42329-43099的編碼A. succinogenes磷酸丙糖異構(gòu)酶(EC 5.3.1.1)的ORF
SEQ ID NO:38是contig 138上從376-1的編碼A. succmogenes果糖1,6-二-壽酸醛縮酶的N-末端的兩個ORF。注意已知 所述完全序列不是延伸出所述contig的ORF。所述序列由于低序列質(zhì)量 造成移碼而^皮分為2個ORF。(果糖攝取途徑)
SEQ ID NO:39是contig 127上從13295-12330的編碼A. succmogenes甘油醛-3-磷酸脫氳酶(EC 1.2.1.12)的ORF。注意編碼 約20個氨基酸的預(yù)計60個石咸基由于這個ORF的5'-端延伸出所述contig 的邊緣之外而缺失。
SEQ ID NO:40是contig 138上從1655-480的編碼A. succmogenes 3-磷酸甘油酸激酶(EC 2.7.2.3)的ORF
SEQ ID NO:41是contig 133上從4053-3370的編碼A. succmogenes磷酸甘油酸變位酶(EC 5.4.2.1 )的ORF
SEQ ID NO:42是contig 162上從48008-48652的編碼A. succmogenes石壽酸甘油酸變4立酶(EC 5.4.2.1)的ORF
SEQ ID NO:44是contig 146上從10225-8738的編碼A. succmogenes葡糖-6-磷酸脫氪酶(EC 1.1.1.49)的ORF
SEQ ID NO:45是contig 115上從5548-4094的編碼A. succmogenes 6-石壽酸葡糖酸脫氪酶(EC 1.1.1.44)的ORF
SEQ ID NO:46是contig 115上從8607-7906的編碼A. succmogenes 6-磷酸葡糖酸內(nèi)酯酶(EC3.1.1.31)的〇RF
SEQ ID NO:47是contig 141上從5548-4094的編碼A.succmogenes 6-磷酸葡糖酸脫氬酶(EC 1.1.1.44)的ORF
編碼A. succmogenes編碼核酮糖-磷酸3-差向異構(gòu)酶(EC 5.1.3.1)的ORF未在任何contig上發(fā)現(xiàn)，但是可能在完全基因組序列中 發(fā)現(xiàn)。密切相關(guān)的Pasteurellaceae具有這個基因。
SEQ ID NO:48是contigl54上從20162-19710的編碼A. succmogenes核糖-5-磷酸異構(gòu)酶(EC 5.3.1.6)的ORF
SEQ ID NO:50是contig 56上從2978-2337的編碼A. succmogenes編碼核糖5-石壽酸異構(gòu)酶(EC 5.3.1.6 )的ORF
SEQ ID NO:51是contig 168上從64945-64286的編碼A. succmogenes編碼核糖5-石粦酸異構(gòu)酶(EC 5.3.1.6 )的ORF
SEQ ID NO:52是contig 159上從37734-36904的編碼A. succmogenes轉(zhuǎn)酮醇酶(transketolase) N-末端亞單位(EC 2.2.1.1)的 ORF
SEQ ID NO:54是contig86上從2744-738的編碼A. succmogenes轉(zhuǎn)酮醇酶(EC 2.2.1.1)的ORF
SEQ ID NO:55是contig 105上從6033-5368的編碼A. succinogenes轉(zhuǎn)醛醇酶(EC 2.2.1.2 )的ORF
SEQ ID NO:56是contig 135上從12149-13102的編碼A. succmogenes轉(zhuǎn)醛醇酶(EC 2.2.1.2)的ORF (in)底物攝取基因 (a)阿拉伯糖
SEQ ID NO:57是contig 155上從6574-7389的編碼A. succinogenes阿4立伯并唐摔爭運(yùn)體周質(zhì)蛋白(arabinose transporter periplasmic protein )的ORF
SEQ ID NO:58是contig 155上從7413-8948的編碼A. succinogenes阿4立伯糖轉(zhuǎn)運(yùn)體ATP-結(jié)合蛋白的ORF
SEQ ID NO:59是contig 155上從8964-9932的編碼A. succinogenes ABC-型阿拉伯糖轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)通透酶成分的ORF
SEQ ID NO:60是contig 155上從12637-14124的編碼A. succmogenes L-阿拉伯糖異構(gòu)酶(EC 5.3.1.4)的ORF
SEQ ID NO:61是contig 117上從3876-2419的編碼A. succmogenes L-木酮糖激酶(EC 2.7.1.53 )的ORF
SEQ ID NO:63是contig 115上從2782-3474的編碼A. succmogenes核酮糖-5-磷酸-4-差向異構(gòu)酶(EC 5.1.3.4 )的ORF (b )木糖
SEQ ID NO:64是contig 155上從21265-22578的編碼A. succmogenes木糖異構(gòu)酶(EC 5.3.1.5 )的ORF
SEQ ID NO:65是contig 165上從43481-41883的編碼A. succmogenes D-木酮糖激酶(EC 2.7.1.17 )或L-核酮糖激酶(EC 2.7.1. 16 ) 的ORF
SEQ ID N〇:66是contig 155上從22646-24091的編碼A. succmogenes D-木酮糖激酶(EC 2.7.1.17)的ORF
SEQ ID NO:67是contig 155上從11012-12616的編碼A. succmogenes D-木酮糖激酶(EC 2.7.1.17)的ORF
SEQ ID NO:68是contig 155上從40497-38974的編碼A. succmogenes ABC-型木糖或核糖轉(zhuǎn)運(yùn)體ATP-結(jié)合蛋白的ORF
SEQ ID NO:69是contig 155上從21013-20015的編碼A. succmogenes ABC-型木糖轉(zhuǎn)運(yùn)體周質(zhì)蛋白的ORF
SEQ ID NO:70是contig 155上從18411-17284的編碼A. succmogenes ABC-型木糖轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)通透酶成分的ORF
SEQ ID NO:71是contig 155上從19929-18415的編碼A. succmogenes ABC-型木糖轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)ATP-結(jié)合成分的ORF
SEQ ID NO:72是contig 165上從44518-45636的編碼A. succmogenes木糖操縱子阻遏蛋白的ORF (c)葡萄糖
SEQ ID NO:73是contig 99上從4340-3426的編碼A. succinogenes葡糖激酶轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物(EC 2.7.1.2 )的ORF
SEQ ID NO:74是contig 153上從411-13的編碼A.succmogenes葡萄糖特異性PTS蛋白IIA的ORF
SEQ ID NO:75是contig 153上從27639-29498的編碼A. succmogenes葡萄糖或卩-葡糖戒(glucoside )特異性PTS蛋白IIC的ORF
SEQ ID NO:76是contig 165上從40420-39968的編碼A. succmogenes葡萄糖或卩-葡糖戒特異性PTS蛋白IIA的ORF(d) 果糖
SEQ ID NO:77是contig 106上從5534-3858的編碼A. succmogenes果糖特異性PTS蛋白IIC的ORF
SEQ ID NO:78是contig 106上從7985-6483的編碼A. succmogenes甘露醇/果糖特異性PTS蛋白(IIA)的ORF
SEQ ID NO:79是contig 135上從9001-7952的編碼A. succinogenes果糖或甘露并唐特異性PTS蛋白IIC的ORF
SEQ ID NO:80是contig 135上/人9331-9014的編碼A. succmogenes果糖特異性PTS蛋白IIB的ORF
SEQ ID NO:81是contig 135上從9799-9353的編碼A. succmogenes甘露醇/果糖特異性PTS蛋白IIA的ORF
SEQ ID NO:82是contig 106上從6480-5539的編碼A. succmogenes l-石岸酸果糖激酶(EC 2.7.1.56)的ORF
SEQ ID NO:83是contig 54上從6480-5539的編碼A. succmogenes l-磷酸果糖激酶(EC 2.7.1.56)的ORF
SEQ ID NO:84是contig 168上從10269-11198的編碼A. succinogenes果糖激酶的ORF(e) 通用
SEQ ID NO:85是contig 153上從2202-475的編碼A. succmogenes磷酸烯醇式丙酮酸磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)酶I (EI)的ORF
SEQ ID NO:86是contig 153上從2565-2308的編碼A. succmogenes石岸酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)、HPr-相關(guān)蛋白的ORF
SEQ ID NO:87是contig 165上從41787-40432的編碼A. succinogenes質(zhì)子/糖同向4爭運(yùn)蛋白的ORF(f) 蔗糖
SEQ ID NO:88是contig 168上從11272-12720的編碼A. succinogenes蔗斗唐摔爭4^i酶^/〇RF(g)糖流出
SEQ ID NO:89是contig 145上從25395-26780的編碼A. succmogenes潛在主要易化超家族糖通透酶的ORF
SEQ ID NO:90是contig 123上從16827-15997的編碼A. succmogenes主要易化超家族糖通透酶的ORF (iv) 二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)體
SEQ ID NO:91是contig 154上從18087-16792的編碼A. succmogenes TRAP C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)(Dct)系統(tǒng)蛋白的ORF
SEQ ID NO:92是contig 159上從20342-19050的編碼A. succmogenes TRAP-型C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)大亞單位的ORF
SEQ ID NO:93是contig 117上從7334-6057的編碼A. succmogenes TRAP-型C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)小通透酶成分的ORF
SEQ ID NO:94是contig 122上從13540-12269的編碼A. succmogenes TRAP-型C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)大蛋白成分的ORF
SEQ ID NO:96是contig 159上從21876-20890的編碼A. succmogenes TRAP-型C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)周質(zhì)成分(二羧酸-結(jié)合蛋白) 的ORF
SEQ ID NO:97是contig 12上從14033-13551的編碼A. succmogenes TRAP-型C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)小通透酶成分的ORF
SEQ ID NO:98是contig 159上從20836-20345的編碼A. succmogenes TRAP畫型C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)小通透酶成分的ORF
SEQ ID NO:99是contig 154上從18563-18087的編碼A. succmogenes TRAP-型C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)小通透酶成分的ORF
SEQ ID NO:100是contig 148上從26666-26157的編碼A. succmogenes TRAP-型C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)小通透酶成分的ORF
SEQ ID NO:101是contigl48上從12484-12975的編碼A. succmogenes TRAP-型C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)小通透酶成分的ORF
SEQ ID NO:102是contig 117上從7813-7331的編碼A. succmogenes TRAP-型C4-二狻酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)小通透酶成分的ORF
SEQ ID NO: 103是contig 154上從19646-18669的編碼A. succmogenes TRAP-型C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)體系統(tǒng)周質(zhì)成分(二羧酸-結(jié)合蛋 白)的ORF
SEQ ID NO:104是contig 148上從12245-11259的編碼A. succmogenes TRAP-型C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)周質(zhì)成分(二羧酸-結(jié)合蛋白) 的ORF
SEQ ID NO:105 is contig 122上從15018-14053的編碼A. succinogenes TRAP-型C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)周質(zhì)成分(二羧酸-結(jié)合蛋白) 的ORF
SEQ ID NO: 106 is contig 117上從5984-4998的編碼A. succmogenes TRAP-型C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)周質(zhì)成分的ORF
SEQ ID NO:107是contig 117上從4938-3949的編碼A. succmogenes TRAP-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)周質(zhì)成分的ORF
SEQ ID NO: 108是contig 77上從4284-3718的編碼A. succmogenes TRAP-型C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)整體膜成分的ORF。注意 N-末端編碼區(qū)缺失，原因是所述編碼區(qū)延伸到所述contig的邊緣之外。
SEQ ID NO:109是contig 148上從26147-24867的編碼A. succmogenes TRAP-型C4-二叛酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)整體膜成分的ORF。
SEQ ID NO:l 10是contig 148上從12987-14288的編碼A. succmogenes TRAP-型C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)整體膜成分的ORF
SEQ ID NO:lll是contig 154上從18563-18087的編碼A. succmogenes TRAP-型C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)成分的ORF (v)甘氨酸合成
SEQ ID NO:112是編碼A. succmogenes絲氨酸脫氨酶或蘇 氨酸解氨酶(EC 4.3.1.19 )的ORF,存在于contig 141上從10270-11808。
SEQ ID NO:113是contig 137上從2950-1682編碼A. succinogenes甘氨酸幾曱基轉(zhuǎn)移酶(EC 2.1.2.1)的ORF。Entner-Doudoroff途徑基因
SEQ ID NO:114是contig 148上從19472-18834編碼A. succmogenes 2-酮-3-脫氧-6-褲酸葡糖酸醛縮酶(EC 4.2.1.14)的ORF。
SEQ ID NO: 115是contig 159上從15090-14452編碼A. succmogenes 2-酮-3-脫氧-6-磷酸葡糖酸醛縮酶(EC 4.1.2.14)的ORF。轉(zhuǎn)氫酶
SEQ ID NO:116是contig 152上從24659-26191編碼A. succmogenes NAD/NADP轉(zhuǎn)氳酶a亞單位的ORF
SEQ ID NO:l 17是contig 152上從26203-27654的編碼A. succmogenes NAD/NADP轉(zhuǎn)氬酶卩亞單位的ORF.
SEQ ID NO:118是contig 107上從11481-10150編碼A. succinogenes NADH脫氛酶的〇RF.
雖然參照所示的實(shí)施方式描述了本發(fā)明，但是應(yīng)當(dāng)理解本 發(fā)明不限于此。具有本領(lǐng)域普通技術(shù)知識并從本文獲得教導(dǎo)的技術(shù)人員 將認(rèn)識到在本發(fā)明的范圍內(nèi)的另外的修改和實(shí)施方式。因此，本發(fā)明僅 由所附的權(quán)利要求限制。
權(quán)利要求
1. 一種用于生產(chǎn)來自A.succinogenes C4-途徑的化學(xué)產(chǎn)品的方法，包括(a)提供包括一種或多種抑制C3酶的基因敲除或修飾的基因工程化的A.succinogenes；(b)提供用于培養(yǎng)所述基因工程化的A.succinogenes的生長培養(yǎng)基；以及(c)在所述培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述基因工程化的A.succinogenes以生產(chǎn)來自所述A.succinogenes C4-途徑的化學(xué)產(chǎn)品。
2. —種用于生產(chǎn)來自A. succmogenes C4-途徑的化學(xué)產(chǎn)品的方法， 包括(a) 提供能夠過度表達(dá)一種或多種C4酶的基因工程化的A. succinogenes;(b) 提供用于培養(yǎng)所述基因工程化的A. succinogenes的生長培養(yǎng) 基；以及(c) 在所述生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述基因工程化的A. succinogenes 以生產(chǎn)來自所述A. succinogenes C4-途徑的化學(xué)產(chǎn)品。
3. —種生產(chǎn)來自A. succmogenes C4-途徑的化學(xué)產(chǎn)品的方法，包括(a) 提供包括一種或多種抑制C3酶的基因敲除或修飾并且能夠過 度表達(dá)一種或多種C4酶的基因工程化的A. succmogenes;(b) 提供用于培養(yǎng)所述基因工程化的A. succmogenes的生長培養(yǎng) 基；以及(c) 在所述生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述基因工程化的A. succmogenes 以生產(chǎn)來自所述A. succmogenes C4-途徑的化學(xué)產(chǎn)品。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1、 2或3所迷的方法，其中來自所述A. succmogenes C4-途徑的所述化學(xué)產(chǎn)品選自由琥珀酸、延胡索酸、蘋果酸、 5-氨基乙酰丙酸、2-酮戊二酸、谷氨酸、以及天冬氨酸構(gòu)成的組。
5. 才艮據(jù)4又利要求1所述的方法，其中來自所述A. succinogenes C4-途徑的所述化學(xué)產(chǎn)品是琥珀酸并且抑制C3酶的所述一種或多種基因敲 除或修飾選自由丙酮酸激酶、丙酮酸-甲酸裂合酶、丙酮酸脫氫酶、及其 組合構(gòu)成的組。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中來自所述A. succinogenes C4-途徑的所述化學(xué)產(chǎn)品是琥珀酸并且所述一種或多種C4酶選自由PEPCK、蘋果酸脫氫酶、延胡索酸酶、延胡索酸還原酶、及其組合構(gòu)成的組。
7. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中來自所述A. succmogenes C4-途徑的所述化學(xué)產(chǎn)品是琥珀酸，抑制C3酶的所述一種或多種基因敲除 或修飾選自由丙酮酸激酶、丙酮酸-甲酸裂合酶、丙酮酸脫氳酶、及其組 合構(gòu)成的組，并且所述一種或多種C4酶選自由PEPCK、蘋果酸脫氫酶、 延胡索酸酶、延胡索酸還原酶、及其組合構(gòu)成的組。
8. 才艮據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中來自所述A. succinogenesC4-途徑的所述化學(xué)產(chǎn)品是延胡索酸，并且抑制C3酶的所述一種或多種基 因敲除或修飾選自由丙酮酸激酶、丙酮酸-曱酸裂合酶、丙酮酸脫氫酶、 及其組合構(gòu)成的組。
9. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中來自所述A. succmogenes C4-途徑的所述化學(xué)產(chǎn)品是延胡索酸，并且所述一種或多種C4酶選自由 PEPCK、蘋果酸脫氫酶、延胡索酸酶、及其組合構(gòu)成的組。
10. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中來自所述A. succinogenes C4-途徑的所述化學(xué)產(chǎn)品是延胡索酸，抑制C3酶的所述一種或多種基因敲 除或修飾選自丙酮酸激酶、丙酮酸-曱酸裂合酶、丙酮酸脫氫酶、及其組 合構(gòu)成的組，并且所述一種或多種C4酶選自PEPCK、蘋果酸脫氬酶、 延胡索酸酶、及其組合構(gòu)成的組。
11. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述基因工程化的A. succmogenes進(jìn)一步包括抑制延胡索酸還原酶的基因敲除或》f飾。
12. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中來自所述A. succmogenes C4-途徑的所述化學(xué)產(chǎn)品是蘋果酸，并且抑制C3酶的所述一種或多種基因 敲除或修飾選自由丙酮酸激酶、丙酮酸-曱酸裂合酶、丙酮酸脫氫酶、及 其組合構(gòu)成的組。
13. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中來自所述A. succmogenes C4-途徑的所述化學(xué)產(chǎn)品是蘋果酸，并且所述一種或多種C4酶選自PEPCK、 蘋果酸脫氳酶、及其組合構(gòu)成的組。
14. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中來自所述A. succmogenes C4-途徑的所述化學(xué)產(chǎn)品是蘋果酸，抑制C3酶的所述一種或多種基因敲除 或修飾選自由丙酮酸激酶、丙酮酸-曱酸裂合酶、丙酮酸脫氫酶、及其組合構(gòu)成的組，并且所述一種或多種C4酶選自由PEPCK、蘋果酸脫氬酶、及其組合構(gòu)成的組。
15. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述基因工程化的A. succinogenes進(jìn)一步包括抑制延胡索酸還原酶的基因敲除或修飾。
16. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述基因工程化的A. succmogenes進(jìn)一步包括抑制延胡索酸酶的基因敲除或修飾。
17. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中其中來自所迷A. succinogenes C4-途徑的所述化學(xué)產(chǎn)品是5-氨基乙酰丙酸，并且抑制C3酶的所述一種 或多種基因敲除或修飾選自由丙酮酸激酶、丙酮酸-曱酸裂合酶、丙酮酸 脫氬酶、及其組合構(gòu)成的組。
18. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中來自所述A succinogenes C4-途徑的所述化學(xué)產(chǎn)品是5-氨基乙酰丙酸，并且所述一種或多種C4酶選 自由琥珀酰-CoA合成酶、PEPCK、蘋果酸脫氳酶、延胡索酸酶、延胡 索酸還原酶、及其組合構(gòu)成的組。
19. 才艮據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中來自所述A. succinogenes C4-途徑的所述化學(xué)產(chǎn)品是5-氨基乙酰丙酸，抑制C3酶的所述一種或多種 基因敲除或修飾選自由丙酮酸激酶、丙酮酸-甲酸裂合酶、丙酮酸脫氫酶、 及其組合構(gòu)成的組，并且所述一種或多種C4酶選自由琥珀酰-CoA合成 酶、PEPCK、蘋果酸脫氫酶、延胡索酸酶、延胡索酸還原酶、及其組合 構(gòu)成的組。
20. 根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述基因工程化的A. succinogenes能夠過度表達(dá)導(dǎo)致甘氨酸合成的酶。
21. 根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述基因工程化的A. succinogenes進(jìn)一步包括對一種或多種甘氨酸合成基因的修飾。
22. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中來自所述A. succmogenes C4-途徑的所述化學(xué)產(chǎn)品是2-酮戊二酸，并且抑制C3酶的所述一種或多種 基因敲除或修飾選自由丙酮酸激酶、丙酮酸-甲酸裂合酶、丙酮酸脫氳酶、 及其組合構(gòu)成的組。
23. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中來自所述A. succinogenes C4-途徑的所述化學(xué)產(chǎn)品是2-酮戊二酸，并且所述一種或多種C4酶選自由 琥珀酰-CoA合成酶、PEPCK、蘋果酸脫氳酶、延胡索酸酶、延胡索酸 還原酶、及其組合構(gòu)成的組。
24. 才艮據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中來自所述A. succmogenes C4-途徑的所述化學(xué)產(chǎn)品是2-酮戊二酸，抑制C3酶的所述一種或多種基因 敲除或修飾選自由丙酮酸激酶、丙酮酸-甲酸裂合酶、丙酮酸脫氬酶、及 其組合構(gòu)成的組，并且所述一種或多種C4酶選自由琥珀酰-CoA合成酶、 PEPCK、蘋果酸脫氬酶、延胡索酸酶、延胡索酸還原酶、及其組合構(gòu)成 的組。
25. 根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中所述基因工程化的A. succmogenes進(jìn)一步包括抑制2-酮戊二酸脫氫酶的基因敲除或修飾并且 還能夠過度表達(dá)2-酮戊二酸受體氧化還原酶。
26. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中來自所述A. succmogenes C4-途徑的所述化學(xué)產(chǎn)品是谷氨酸，并且抑制C3酶的所述一種或多種基因 敲除或修飾選自由丙酮酸激酶、丙酮酸-甲酸裂合酶、丙酮酸脫氳酶、及 其組合構(gòu)成的組。
27. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中來自所述A. succmogenes C4-途徑的所述化學(xué)產(chǎn)品是谷氨酸，并且所述一種或多種C4酶選自由琥珀 酰-CoA合成酶、PEPCK、蘋果酸脫氬酶、延胡索酸酶、延胡索酸還原 酶、及其組合構(gòu)成的組。
28. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中來自所述A. succmogenes C4-途徑的所述化學(xué)產(chǎn)品是谷氨酸，抑制C3酶的所述一種或多種基因敲除 或修飾選自由丙酮酸激酶、丙酮酸-甲酸裂合酶、丙酮酸脫氫酶、及其組 合構(gòu)成的組，并且所述一種或多種C4酶選自由琥珀酰-CoA合成酶、 PEPCK、蘋果酸脫氫酶、延胡索酸酶、延胡索酸還原酶、及其組合構(gòu)成 的組。
29. 根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中所述基因工程化的A. succmogenes進(jìn)一步包括抑制2-酮戊二酸脫氳酶的基因敲除或^奮飾并且 還能夠過度表達(dá)2-酮戊二酸受體氧化還原酶。
30. 根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中所述基因工程化的A. succmogenes還能夠過度表達(dá)谷氨酸脫氫酶。
31. 才艮據(jù)權(quán)利要求1所迷的方法，其中來自所述A. succmogenes C4-途徑的所述化學(xué)產(chǎn)品是天冬氨酸，并且抑制C3酶的所述一種或多種基 因敲除或修飾選自由丙酮酸激酶、丙酮酸-甲酸裂合酶、丙酮酸脫氳酶、 及其組合構(gòu)成的組。
32. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中來自所述A. succinogenes C4-途徑的所述化學(xué)產(chǎn)品是天冬氨酸，并且所述一種或多種C4酶選自由琥 珀酰-CoA合成酶、PEPCK、蘋果酸脫氬酶、延胡索酸酶、延胡索酸還 原酶、及其組合構(gòu)成的組。
33. 根據(jù)4又利要求3所述的方法，其中來自所述A. succmogenes C4-途徑的所述化學(xué)產(chǎn)品是天冬氨酸，抑制C3酶的所述一種或多種基因敲 除或修飾選自由丙酮酸激酶、丙酮酸-甲酸裂合酶、丙酮酸脫氫酶、及其 組合構(gòu)成的組，并且所述一種或多種C4酶選自由琥珀酰-CoA合成酶、 PEPCK、蘋果酸脫氫酶、延胡索酸酶、延胡索酸還原酶、及其組合構(gòu)成 的組。
34. 根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中所述基因工程化的A. succmogenes進(jìn)一步包括抑制延胡索酸還原酶的基因敲除或修飾。
35. 根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中所述基因工程化的A. succmogenes還能夠過度表達(dá)天冬氨酸解氨酶。
36. 根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中所述基因工程化的A. succmogenes進(jìn)一步包括抑制2-酮戊二酸脫氫酶的基因敲除或4多飾并且 還能夠過度表達(dá)2-酮戊二酸受體氧化還原酶。
37. 根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中所述基因工程化的A. succmogenes還能夠過度表達(dá)谷氨酸脫氫酶。
38. 根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中所述基因工程化的A. succmogenes還能夠過度表達(dá)天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶。
39. 根據(jù)權(quán)利要求1、 2或3所述的方法，其中所述基因工程化的 A. succmogenes進(jìn)一步包括對一種或多種提高通過EMP的通量的基因 的修飾。
40. 根據(jù)權(quán)利要求1、 2或3所述的方法，其中所述基因工程化的 A. succinogenes進(jìn)一步包括對一種或多種提高通過PPP的通量的基因的修飾。
41. 根據(jù)權(quán)利要求1、 2或3所述的方法，其中所述基因工程化的 A. succmogenes進(jìn)一步包括抑制蘋果酸酶的基因敲除或修飾。
42. 根據(jù)權(quán)利要求1、 2或3所述的方法，其中所述基因工程化的 A. succmogenes進(jìn)一步包括抑制草酰乙酸脫羧酶的基因敲除或修飾。
43. 根據(jù)權(quán)利要求1、 2或3所述的方法，其中所述基因工程化的A. succinogenes進(jìn)一步包括對提高底物攝取的一種或多種基因的々多飾。
44. 根據(jù)權(quán)利要求43所述的方法，其中所述一種或多種基因提高底 物的攝取，所述底物選自由阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、果糖、以及蔗糖 構(gòu)成的纟且。
45. 根據(jù)權(quán)利要求1、 2或3所述的方法，其中所述基因工程化的 A. succinogenes進(jìn)一步包括對提高化學(xué)產(chǎn)品分泌的一種或多種基因的修飾。
46. 根據(jù)權(quán)利要求45所述的方法，其中所述一種或多種基因編碼二 羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)體。
全文摘要
本發(fā)明披露了Actinobacillus succinogenes基因和在基因工程化的A.succinogenes中利用這些基因以便提高化學(xué)產(chǎn)品的產(chǎn)量的方法，所述化學(xué)產(chǎn)品如琥珀酸、延胡索酸、蘋果酸、5-氨基乙酰丙酸、2-酮戊二酸、谷氨酸、以及天冬氨酸。所述基因工程化的A.succinogenes菌株能夠過度表達(dá)C4酶。所述基因工程化的A.succinogenes可以具有一種或多種抑制C3酶的基因敲除或修飾。在一些基因工程化的A.succinogenes中，也可以提高供應(yīng)C4途徑底物的通量。
文檔編號C12N1/20GK101278041SQ200680036758
公開日2008年10月1日 申請日期2006年8月4日 優(yōu)先權(quán)日2005年8月5日
發(fā)明者C·維埃耶, J·B·麥金萊, J·G·蔡庫斯, M·萊夫尼克斯 申請人:密執(zhí)安州大學(xué)