專利名稱：用于鑒定臨床樣品中的人乳頭瘤病毒的體外診斷試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于鑒定臨床樣品中的人乳頭瘤病毒(HPV)的體外診斷試 劑盒和方法。本發(fā)明還涉及用于所述試劑盒和方法的裝置。
更具體而言，在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中涉及使用用于基因型分析 HPV的探針而特異性檢測臨床樣品中的人乳頭瘤病毒基因型的體外診斷 試劑盒，組合包括所述探針的核酸點陣和標(biāo)準(zhǔn)實驗室反應(yīng)小瓶的平臺，自 動處理結(jié)果的裝置和使用所述體外診斷試劑盒診斷HPV感染的方法。
背景技術(shù)：
迄今為止，已經(jīng)描述了約100種人乳頭瘤病毒(HPV)類型。當(dāng)在HPV 區(qū)域E6、E7和L1的至少10%的基因序列與任何先前已知的類型不同時， 認(rèn)為一種HPV類型為新的類型。亞型或變體與主要類型的不同小于2-5。/。。 這些病毒具有對人上皮細(xì)胞的向性，并且已經(jīng)與嚴(yán)重的人類疾病相聯(lián)系，
特別是與生殖器和口腔粘膜癌癥相聯(lián)系。
已經(jīng)從肛殖黏膜分離了大約50種HPV類型。取決于它們與宮頸癌的 相關(guān)性，已經(jīng)將它們分成低危類型(例如，HPV類型6， 11, 42， 43和44) 和高危類型(例如，類型16, 18, 31,33和45)。由于高危類型HPVs的持 續(xù)感染是宮頸癌的主要病因因素，所以檢測并且鑒定HPV類型非常重要。
HPV基因型的檢測和鑒定通過HPVDNA檢測進行。這些方法可以通 過HPV DNA的直接檢測或通過檢測擴增的HPV DNA而進行。在HPV DNA的直接檢測的方法中有美國馬里蘭州Gaithersburg Md.,的Digene 公司(Digene Corp.)的雜合體捕獲(HC)方法和原位雜交技術(shù)。HC是FDA 核準(zhǔn)的技術(shù)，其基于信號-擴增雜交方法。使用的雜交探針是HPV特異的 RNA序列。在將這些探針與來自臨床樣品的變性的HPV DNA—起溫育 后，形成可以使用特異性抗體進行檢測的RNA/DNA雜合體。HC方法允
許區(qū)分高危和低危HPV類型，但是它不能鑒定HPV類型。這種檢測方法 的其它缺點在于，探針混合物的使用通常導(dǎo)致在來自兩種類型的HPV類 型之間的交叉反應(yīng)。
通過擴增病毒基因組而鑒定HPV類型的方法主要通過聚合酶鏈?zhǔn)椒?應(yīng)(PCR)進行。HPV的基因型分析可以通過使用只識別一種特異類型的類 型-特異性PC.R進行。備選方法是應(yīng)用通用引物PCR擴增所有HPV類型。 乳頭瘤病毒通過隨后分析所擴增的基因片段的序列而分析類型。這一序列 的分析可以使用不同方法，諸如DNA測序、限制性片段長度多態(tài)性(RFLP) 或核酸雜交而進行。己認(rèn)為雜交技術(shù)，諸如反向印記雜交，最適合用于診 斷目的(Kleter等.J Clin Microbiol.(臨床微生物學(xué)雜志)1999, 37: 2508-2517; Van den Brule等.J Clin Microbiol (臨床微生物學(xué)雜志).2002, 40: 779-787)。
最近，已經(jīng)開發(fā)了微點陣技術(shù)(參見，例如，美國專利號5,445,934)。 術(shù)語微點陣意指許多小點的分析，以促進能夠同時分析數(shù)千DNA序列的 大規(guī)模核酸分析。如本領(lǐng)域中己知，反向印記通常在膜上進行，而微點陣 通常在固體支持物上進行，并且還可以以更小的規(guī)模進行。微點陣技術(shù)己 經(jīng)成功地應(yīng)用于HPV診斷領(lǐng)域(參見，專利公布WO0168915和No. CA2484681)。
然而，使用微點陣技術(shù)仍然存在不足，其需要昂貴的設(shè)備和費力的操 作。這種不便由提供'點陣-管'的專利申請?zhí)朥S2005064469解決。術(shù)語 '點陣-管，描述具有實驗室反應(yīng)容器(例如，1.5mlEppendorf管)的典 型的形狀和大小的反應(yīng)容器，微點陣排列在它的基底上，可以在其中進行 基于微點陣的檢測。
發(fā)明目的
考慮上述，本發(fā)明的一個目的是提供用于特異性鑒定可能在臨床樣品 中存在的HPV類型的可靠方法。
更具體地，本發(fā)明的一個目的是提供使用'點陣-管'平臺特異性鑒 定HPV類型的方法。
提供特異性檢測和/或鑒定不同的HPV類型的探針也是本發(fā)明的一個
目的。
本發(fā)明的另一個目的是提供檢測和/或診斷HPV類型的試劑盒，其包 括試劑、規(guī)程和在'點陣-管'上排列的HPV特異性探針，所述試劑盒允 許可靠地特異性檢測和/或診斷可能在臨床樣品中存在的HPV類型。
按照本發(fā)明的第一方面，提供檢測并且分析樣品中的人乳頭瘤病毒 (HPV)的類型的測定，所述測定包括在樣品上進行核酸擴增反應(yīng)，所 述擴增反應(yīng)意欲以非類型特異性方式擴增HPV目標(biāo)序列；從任意擴增產(chǎn) 物獲得單鏈寡核苷酸；可能的情形中，允許單鏈寡核苷酸與在固體支持物 上提供的多種HPV類型-特異性探針進行雜交，所述支持物位于適合容納 所述樣品的反應(yīng)容器內(nèi)；并且檢測雜交的寡核苷酸。
本發(fā)明的方面還提供檢測并且分析樣品中的人乳頭瘤病毒病毒(HPV)
的類型的測定，所述測定包括在樣品上進行核酸擴增反應(yīng)，所述樣品與
具有固定在其上的多種HPV類型-特異性探針的固體支持物接觸，擴增反 應(yīng)意欲以非類型特異性方式擴增HPV目標(biāo)序列；從任意擴增產(chǎn)物獲得單 鏈寡核苷酸；在可能的情形中，允許單鏈寡核苷酸與HPV類型-特異性探 針進行雜交；并且檢測雜交的寡核苷酸。
所述擴增反應(yīng)優(yōu)選地是PCR。單鏈寡核苷酸可以通過將存在的任意雙 鏈寡核苷酸變性，例如通過加熱變性而獲得。單鏈寡核苷酸優(yōu)選地允許在 嚴(yán)格條件下雜交；所述條件是本領(lǐng)域的技術(shù)人員所理解的，但是優(yōu)選地包 括將變性的寡核苷酸與靶目標(biāo)在55。C在含有1XSSC的緩沖液中溫育。
在優(yōu)選的實施方案中，所述樣品和固體支持物包含在反應(yīng)容器內(nèi)；例 如，在US2005064469中所述。
優(yōu)選地使用對至少5， 10, 15， 20， 25, 30, 35, 40，或42種HPV類型特異 的探針，所述HPV類型優(yōu)選地選自HPV類型6， 11, 16, 18, 26， 30， 31， 32， 33 34/64, 35, 39， 40, 42, 43, 44, 45, 51， 52, 53， 54, 56, 57, 58, 59, 61, 62, 66， 67， 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 81， 82, 83, 84, 85和89。探針便利地在長度上為 20-40 nt，優(yōu)選地25-35 nt，更優(yōu)選地28-32 nt，并且最優(yōu)選地約30nt。所 有的探針不必是相同長度。探針便利地對HPV的Ll區(qū)域特異。每種類型
特異的探針可以與對另一種HPV類型特異的探針在至少1個，2個，3個
或優(yōu)選地多于3個nt不同。優(yōu)選的探針選自包括SEQ ID NO 1-SEQ ID NO 133的組；這些探針中的一些檢測如下文所述相同的HPV類型。優(yōu)選地， 多種探針對同一種HPV類型特異，并且更優(yōu)選地使用至少兩種對待檢測 的每種HPV類型特異的探針。這些探針的混合物可以固定在固體支持物 上的相同位置，或者每種類型特異性探針可以固定在不同位置。每種對相 同的HPV類型特異的探針優(yōu)選地檢測HPV耙點序列的不同部分。
所述探針可以在固體支持物上一式兩份，以提供關(guān)于豐余的多個檢測 區(qū)域。
還可以檢測一種或多種對照序列；例如，固定在固體支持物上的探針， 其不與任何HPV型的靶點序列雜交。探針可以是人基因組耙點序列；那 么測定可以包括從樣品中擴增人靶點序列并且檢測擴展是否發(fā)生。通過使 用固定在固體支持物上的非特異性標(biāo)記的序列，可以引入進一步的對照； 標(biāo)記的檢測可以確保所述標(biāo)記正確地工作。通過包括對照擴增序列，其可 以通過用與人靶目標(biāo)相同的引物擴增，但是其由在固體支持物上的不同的 寡核苷酸檢測，而還可以提供其它的對照。這種對照確保擴增正確地工作。
本發(fā)明還提供包含在其上固定多種HPV型-特異的探針的固體支持物 的反應(yīng)容器。還提供用于檢測和分析HPV類型的試劑盒，其包括這樣的 反應(yīng)容器，與核酸擴增混合物組合。所述混合物可以包括HPV共有引物 諸如MY09和MY11;和任選地HMB01;擴增人耙點序列的引物；和對 照擴增靶點序列，其包括與人靶點序列的側(cè)連部分相對應(yīng)的序列，以致使 用相同的引物將發(fā)生兩種靶點序列的擴增。所述試劑盒還可以包括關(guān)于其 使用的用法說明。
附圖簡述


圖1顯示在具有12x 11 = 132個位置的微點陣表面上的探針排列。數(shù) 字與序列表的SEQIDNO對應(yīng)。單個探針固定在兩個不同位置，以用于 檢測21種不同的HPV類型，DNA樣品定性對照和擴增對照。LR=用于 位置參照的探針(SEQ ID NO 140 + SEQ ID NO 141)。
圖2顯示在具有12 x 11 = 132個位置的微點陣表面上的探針排列。數(shù)
字與序列表的SEQ ID NO對應(yīng)。單個探針或探針的混合物固定在兩個不 同位置，以用于檢測23種不同的HPV類型，DNA樣品定性對照和擴增 對照。LR=用于位置參照的探針(SEQIDNO 140 + SEQIDNO 141)。
圖3顯示在具有12 x 11 = 132個位置的微點陣表面上的探針排列。數(shù) 字與序列表的SEQIDNO對應(yīng)。探針的混合物固定在兩個不同位置，以 用于檢測42種不同的HPV類型和DNA樣品定性對照。LR =用于位置 參照的探針(SEQ ID NO 140 + SEQ ID NO 141); Ml = SEQ ID NO 76 + SEQ ID NO 77 + SEQ ID NO 78; M2 = SEQ ID NO 122 + SEQ ID NO 123 + SEQ ID NO 124; M3 = SEQ ID NO 116 +SEQ ID NO 117 +SEQ ID NO 118 + SEQ ID NO 119。
圖4顯示在具有12x10= 120個位置的微點陣表面上的探針排列。數(shù) 字與序列表的SEQ ID NO對應(yīng)。單個探針或探針的混合物固定在三個不 同位置，以用于檢測35種不同的HPV類型，DNA樣品定性對照和擴增 對照。LR=用于位置參照的探針(SEQIDNO 140 + SEQIDNO 141); Ml =SEQ ID NO 76 + SEQ ID NO 77 + SEQ ID NO 78; M2 = SEQ ID NO 122 + SEQ ID NO 123 + SEQ ID NO 124。
圖5顯示在具有12x10= 120個位置的微點陣表面上的探針排列。數(shù) 字與序列表的SEQ ID NO對應(yīng)。單個探針或探針的混合物固定在兩個不 同位置，以用于檢測14種不同的HPV類型，DNA樣品定性對照和擴增 對照。LR=用于位置參照的探針(SEQIDNO 140 + SEQ ID NO 141); M4 =SEQ ID NO 100 + SEQ ID NO 101 + SEQ ID NO 102。
圖6顯示用于作為擴增的陽性對照的PCR反應(yīng)中的重組質(zhì)粒pPG44 的示意性表示。
圖7顯示本發(fā)明所用的'點陣管'的照片。
發(fā)明詳述
特異性檢測和/或鑒定HPV型的方法包括下述步驟 (i)擴增樣品DNA:擴增從臨床樣品獲得的DNA，優(yōu)選地通過使用對 于所有HPV已知的類型的通用引物的PCR進行擴增，所述通用引物側(cè)連 充分可變以允許進一步的基因型分析的基因組區(qū)域。盡管PCR是優(yōu)選的
擴增方法，樣品中目標(biāo)序列的擴增可以通過本領(lǐng)域已知的任何其它方法 (連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，基于轉(zhuǎn)錄的擴增系統(tǒng)，鏈置換擴增等)實現(xiàn)。在本發(fā)
明的一個實施方案中，使用引物MYll和MY09 (Manosetal.,人癌癥的 分子診斷(Molecular Diagnostics of Human Cancer); Furth M, Greaves MF， eds.;冷泉港出版公司(Cold Spring Harbor Press). 1989， vol. 7:209-214)，其
擴增可變的LI區(qū)域。
在其擴增過程中在擴增的DNA中引入標(biāo)記，以允許進一步的檢測， 優(yōu)選引入可以通過比色方法檢測的信號的標(biāo)記。在優(yōu)選的實施方案中，至 少一種所用的引物在5，端使用生物素標(biāo)記。然而，可以使用本領(lǐng)域己知的 任何其它類型的標(biāo)記(例如，洋地黃毒苷)。此外，標(biāo)記擴增的DNA可 以備選地通過在PCR混合物中添加攜帶標(biāo)記的修飾核苷酸(例如，生物 素化的或洋地黃毒苷dUTP衍生物)而實現(xiàn)。在某些實施方案中可以使用 放射活性標(biāo)記，或熒光團。
(ii) 雜交將來自步驟(i)的擴增的DNA變性(例如，通過熱變性)并且 應(yīng)用到具有在表1中所示的那些探針中(SEQ ID NO: l-133)的一種或多種 探針的'點陣-管'中。還可以使用在擴增后制備單鏈DNA的其它方法。 表1所示的每種探針(SEQ ID NO: 1- 133)能夠特異性地與唯一一種HPV 型的從步驟(i)擴增的Ll區(qū)域雜交，并且因此，當(dāng)這種類型在生物樣品中 存在時，能夠特異性地鑒定這種HPV類型。樣品中不同的HPV類型可以 通過將來自所述HPV類型的擴增的DNA與至少一種但是優(yōu)選地多于一 種探針雜交而鑒定。
(iii) 檢測DNA雜合體可以通過識別與配體特異性結(jié)合的標(biāo)記或者 通過免疫檢測而檢測到。在優(yōu)選的實施方案中，生物素標(biāo)記這樣檢測，艮P， 通過與綴合辣根-過氧化物酶(HRP)的鏈霉抗生物素蛋白的特異結(jié)合，和隨 后N-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)轉(zhuǎn)化成在相應(yīng)的特異性探針結(jié)合的具體位置沉 淀的藍(lán)色顏料來檢測。本領(lǐng)域公知的其它類型的綴合物也可以適用于本發(fā) 明的目的(例如，鏈霉抗生物素蛋白-Au綴合物)?？梢粤硗鈶?yīng)用熒光標(biāo) 記的檢測系統(tǒng)，間接或直接標(biāo)記的熒光標(biāo)記的檢測系統(tǒng)。備選地，可以使 用其它基于酶的系統(tǒng)。
(iv) 分析并且處理結(jié)果這樣處理的'點陣-管'可以使用簡單的光學(xué)
裝置，諸如光學(xué)顯微鏡或由CLONDIAG芯片技術(shù)GmbH(Jena，德國)制造 的ATR01和ATS讀數(shù)儀讀取。
在一個備選的實施方案中，擴增和雜交步驟可以在同一點陣-管中進 行；即，樣品添加到點陣-管中，然后在所述管內(nèi)擴增樣品并且與探針雜
一_父。
一種制備'點陣-管，的方法在專利申請?zhí)朥S2005064469中公開。在 本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，5，胺-連接的寡核苷酸探針在已知的不 同位置結(jié)合在固體支持物表面。所述探針可以單個或者作為混合物固定在 固體支持物上的描述(delineated)的位置。在一個優(yōu)選的實施方案中，兩 種類型特異性探針用于每種HPV類型，其為包括在一種類型特異性探針 的區(qū)域內(nèi)已經(jīng)發(fā)生核苷酸改變的變體的所有HPV正確分型提供額外的保 證。優(yōu)選地，應(yīng)用能夠在所擴增產(chǎn)物的分開區(qū)域雜交的兩種類型-特異性 探針。
所述探針或探針混合物可以固定在固體支持物的單一位置，優(yōu)選地在 固體支持物的兩個不同位置，并且更優(yōu)選地在固體支持物的三個不同位 置。圖l-5示例探針在微點陣表面的不同排列的示意圖。
在本發(fā)明中所用的'點陣-管'可以包括一種或多種選自序列表的核 苷酸序列(SEQIDNO: l-133)的HPV探針。另外它可以包括用于對照特異 性檢測的一種或多種探針，所述對照如PCR反應(yīng)對照或來自樣品對照的 DNA的合適性(adequacy)。此外，它還可以包括一種或多種標(biāo)記的寡核 苷酸(例如，生物素修飾的寡核苷酸)，用于檢測反應(yīng)的陽性對照和用于 布置參照，以致所有其余的探針都可以定位。
HPV類型鑒定的特異性探針設(shè)計如下。所有參照HPVs的序列都保存 在GenBank，包括已知的變體，對于擴增的L1區(qū)域，使用常規(guī)核酸比對 程序如BioEdit (4，S.6.版本；Hall. Nucl Acids Symp Ser.(核酸專題論集系 列)1999,41:95-98)進行比對，并且定位了在不同HPV類型中的大部分可 變序列區(qū)域。從這些可變序列區(qū)域選擇用作特異性探針的潛在寡核苷酸序 列，優(yōu)選地具有如下特征長度為20-40個堿基，優(yōu)選地約30個堿基長 度；優(yōu)選地沒有二級結(jié)構(gòu)或長于4個的連續(xù)相同的核苷酸鏈；優(yōu)選地具有 50%的G+C比例，并且在所有選擇的探針中Tm盡可能相似得多；并且
優(yōu)選地在不同的HPV類型序列中錯配的核苷酸盡可能多地位于寡核苷酸 序列的中心。
使用NCBI網(wǎng)頁的BLAST程序，將按照上述選擇的每種潛在的探針 序列針對在擴增的Ll區(qū)域的所有已知的HPV序列進行比較(Altschul等. Nucleic Acid Res.(核酸研究)1997,25:3389-3402)。最終，選擇當(dāng)與所有 已知的HPV類型比較時(除了當(dāng)與所述寡核苷酸探針特異性針對的HPV 類型比較時)具有至少三個核苷酸錯配的探針，優(yōu)選具有多于三個錯配的 探針。
本發(fā)明提供用于42種臨床上最重要的HPV類型的特異性檢測的探針 (表l;SEQ IDNO l-133)，所述42種臨床上最重要的HPV類型為6， 11, 16, 18, 26， 30, 31, 32, 33， 34/64, 35, 39, 40, 42， 43, 44, 45, 51, 52, 53, 54, 56, 57, 58, 59, 61， 62, 66, 67, 68, 69, 70， 71, 72, 73, 74, 81, 82， 83, 84, 85和89。探針 序列表示為從5'到3'端的單鏈DNA寡核苷酸。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實 施方案中，探針序列與反義鏈對應(yīng)，但是對于本領(lǐng)域的任一技術(shù)人員都是 顯而易見的，這些探針可以按照原樣，或者以它們的互補形式，或者以它 們的RNA形式(其中T被U取代)的任一種使用。本發(fā)明的探針還可以 通過加入或改變它們序列中的一個或多個沒有顯著影響它的功能的核苷 酸而制備。
表L'
SEQIDNO探針名HPV類型序列(5' —3')
1AS6TGTATGTGGAAGATGTAGTTACGGATGCAC
26B4SCATGACGCATGTACTCTTTATAATCAGAATT
311A1'-AS11TGTATGTAGCAGATTTAGACACAGATGCAC
411B111CATGGCGCATGTATTCCTTATAATCTGAM"
516A16GTAGATMGGCAGCACATAATGACATATTT
S16E-AS16TTCTGAAGTAGATATGGCAGCACATAATGA
"7"C3ISCGTCTGCAGTTAAGGTTATTTTGCACAGTT
816CAAAATAGTGGAATTCATAGAATGTATG窗
16C516CTATAAGTATCTTCTAGTGTGCCTCCTGGG
丄0:《1S
1118B318CTTATTTTCAGCCGGTGCAGCATCCTTTT
121BC2IBAAGTTCCAATCCTCTAAAATACTGCTATTC
1318C318TCCTTTAAATCCACATTCCAAAACTTTAACT
142SA1--AS25TGGTTTAAATGGAGTGGATGCAGATGCTGC
152SB226ATCTTCCTTTGGCACAGGAGGGGCGTTACG
1626C126CATATTCTTCGCCATGTCTTJVrAAATTGTT
1726C326TCCTCCAATATGGAGGCATTCATTAAATGT
182SC42SGATCTTCCTTTGGCACAGGAGGGGCCTTAC
193DA130CTTGTGGCAGCTGGGGGTGACAATCCAATA
20308130GATAACGTTTGTGTGGTTGCAGATATAGTC
2130C130TTCCAGCCCTCAAGTAAAGTGGAGTTCATA
2231A-AS31TGTAGTATCACTGTTTGCAATTGCAGCACA
2331B531AGAACCTGAGGGAGGTGTGGTCAATCCAAA
2431C231TCAAATTCCTCACCATGTCTTAAATACTCTTTA
2531C531AAAATAGCAGGATTCATACTGTGAATATATG
2632AGTTAGTAGACTTGTATGTGTCTTCAGTTGTT
2732B132TTCCCAAAATGAATAGTCAGAAAAAGGATC
2B33A233TACTGTCACTAGTTACTTGTGTGCATAAAG
2933B1.-AS33GTATATTTACCTAAGGGGTCTTCCTTTTCC
3033C133AATGTATATTTACCTAAGGGGTCTTCCTTT
3133C333TTCTGCAGTTMGGTAACTTTGCA1AGTTG
3234/"ATATGGTGGAGT1GTACTTGTGGATTGTGT
3334/64TCCTTAGGAGGTTGCGGACGCTGACMGTA
3435A1--AS35GTCACTAGAAGACACAGCAGAACACACAGA
3535B135AATGGATCATCTTTAGGTTTTGGTGCACTG
3635C435TTACATAGCGATATGTGTCCTCTAAGGTAC
3735TTTGACAAGTTACAC CCTGTGATGTTACAT
3839A1'-AS39GGTATGGAAGACTCTATAGAGGTAGATAATG
3939B139GTATCTGTMGTGTCTACCAAACTGGCAGA
4033C239TAGAGGTAGATAATGTAAAGTTGGTACTAC4139C3d39
4239C439
4333C4d39
4440
45機l40
4S42M42
474 2B1-AS42
4842C142
4942C54 2
5042C642
5143A143
5243B1-AS43
53"A144
5444
5545B145
5S45B4-AS45
5745Cld45
5B4 5C3d"
5945C445
6051A1-AS51
6151B1Sl
6251C351
6351
S451C551
6552A1-AS52
6S52B252
6753A153
S853B153
S954A154
7054
7154
725S
7356B156
7457Ald57
"7557B157
7658A1■58
"58Bla58
7858Blb58
7959
805SB1-AS59
815SC3_3d59
8259
8359
8461A161
8561B161
8661B261
6762A162
8862
8962S262
90SS.
9165
92SSB266
GTAAATCMACTCCTCC織TGCCTGRTAT
CATCAGTTGTTAATGTGACAGTACACAGTT
CATCAGTTGTTAA窗KACAGTACACAGTT
CTTGAAATTACTGTTAT潔ATGGGGTTGG
CCTCCAACAACGTAGGATCCATTGCATGAA
G窗MGTATCACCAGATGTTGCAGTGGCA
TAGCCTGACAGCGAATAGCTTCTGATTGTA
TGACAGCGAATAGCTTCTGATTGTACATAC
TCCTCTAATATGTTAGGATTCATATTGTGTA
TTCTAAAGTTCCTGAAGGTGGTGGTGCAAC
ATATGTACTGGGCACAGTAGGGTCAGTAGA
AAGCAGAGGCAGGTGGGGACACACCAAAAT
TMATGTAGACGGAGGGGACTGTGTAGTGG
CGCATGTATTGCTTATATTGTTCACTAGTAT
CTGCTTTTCTGGAGGTGTM窗CCTTTT
GGCACAGGATTTTGTGTAGAGGCACMAAT
TACTATASTGCTTMACTTAGTAGGRTCAT
CCACYAAACTTGTAGTAGGTGGTGGAGGKA
CAGGTAACAGCAACTGMTGCACAAAACGA
TAAATGTTGGGGAAACCGCAGCAGTGGCAG
TGGAGGGGTGTCCTTTTGACAGCTAGTAGC
ATGGTAGGATCCATTGTGTGTAAATMGCC
CCACTGTTCAAGAATGGTAGGMCCMTGT
CCA lACTAGCAGACGGAGGTAATGTTAATC
TTATATGTGCTTTCCTTTTTAACCTCAGCA
GTGTCCTCCAAAGATGCAGACGGTGCTGG
AACCTCAGCAGACAGGGMATTTTACATAG
AAGCTAGTGGCAACAGGAGGCGACAAACCT
GCTMCCTGCGTC面GCTGTAGCACACAA
AACTACT窗AGCTGGGGGGGT潔ACCAA
ATCTGCTGTAAGGGT窗GGTACATAACTG
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TTTATCTTCTAGGCTGGTGGCCACTGGCGG
TATAATTAGTT1CTGTGKTTACAGTGGCAC
AGTCCTCTAGCAACCGCGCATCCATGTTAT
MATTCTTCAACATGACGTACATMTCCTT
TCTTCTTTAGTTACTTCAGTGCATAATGTC
CCTTCCTTAGTTACTTCAGTGCATAATGTC
CTGGCATMTCTTTAAAACTGGTAGGTGTG
TCCTGTTTAACTGGCGGTGCGCTGTCCTTT
GAAGVAGTAGTAGAAGCACACACAGAAAGA
TTCCTCCACATGTCTGGCATATTCTTTAJIA
GTGGTATTCATATTATGAATGTATGJlCATT
TMATTC.TACAGGGGGGGATGTAGCAG
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MATTCCCTAAAGCTTGTGGCTTTATATTC
GTGGAAGGGGGAGGTAAAACCCCAAAGTTC
ATACGGGTCCACCTTGGGACGGGTAGGCAG
AMTGTCATTTGCGCATACGGGTCCACCTT
GTTAMGTGCTTTTAGCTGCMTAATAGTC
CACATGGCGAAGGTATTGMTGATTTCACG9366C3d66CCAATRTTCCAATCGTCT^ATAAAGTATTA
9466C46SCTGTGCTTTTAATATACCTATATTTATCCT
9567TCTTCCTTTGCTGTTGGAGGGGATGTTTTT
966"7B167TGGTGTGTATGTATTGCATAACATTTGCAG
"67B267GTTTTCATTTTTGTATGTAGCCTCTGATTT
6BAGGTGCAGGGGCGTCTTTTTGACATGTAAT
99S8B16BAGCGGTATGTATCTAC-AAGACTAGCAGATG
10068C化TACATCAGTTGACAATGTTATAGTACACAAC
10168C4c68TACATCAGTGGATAATGTTATAGTACACAAC
10268C7CMGACTAGCAGMGGTGGAGGGGCAACAC
103S9A169ATGGTTTAAAAGTGGCAGATGCAGATTGTG
10469B159TGTGCAGGGGCATCGCGTTGACATGTAGTA
105"70A1-AS70ARACTTTGTAGG GCTATATACAGCAGGTAT
10670B170TGGTGGAGGGGTAACTCCTATATTCCAATT
10771A171AATATTCCATGAARCTAGAGGCTTTATATG
10871B171TTTTTCTGCAGGAGGAGGACTGTTTTTCTG
10972A172TCTGATACAGAGGACGCTG寧GGCAGTACAA
UO72B172GTGGCGAAGATACTCACGAAAAT TAGAAGC
11173A173TAGAGTTGGCATACGTTGTAGTAGAGCTAC
11273
11373B173AGGAGGTTGAGGACGTTGGCAACTAATAGC
11']73T- r' r1 ￡ r1 '丁'廣T ■■ r" (， s 2 T b T ， T ;s r: A t, t> t 「 ， t ， c
11573C473TTCCTCTAAAGTACCTGACGGTGGTGGGGT
11674Ala74TTAAATTTGCATAGGGATTGGGCTTTGCTT
11774Alb74TTAAATTGGCATAGGGATTAGGCTTTGCTT
11874AGCAGAAGGCGATTGTGAGGTAGGAGCACA
11974Blb74AGCAGGAGGGGATTGTGTAGTAGGCGCACA
12081A181TTCTGCAGCAGCAGATGTAGCTGTGCAAAT
12181B181CTGTCCAAAATGACATGTCGGCATAAGGGT
12282A2a-AS82TGCA&CAGATGGAGTAACAGCAGTGCTAAT
12382A2b-AS82TGCAACTGATGGAGTAGCAGCAGTGCTAAT
12482B182TGTAGAATCCATGGTGTGCAGGTAAGCCAT
12583A183TTCATTAGCCTGTGTAGCAGCAGCTGAAAT
12S83Bld83CACTCATCYAATAAATGTTCATTCATACTAT
12784A184ATATTCTGATTCGGTGTTGGTAGCAGCACT
1288 4B184AAATAGGACATGACCTCTGGAGTCAGACGG
12985A185ATATAGATGGAACTGGATTAGTAGTTGCAG
13085B1B5CCTTTTTTTGTGGAACAACCACATCCTTCT
1318 9A189TCCTTAAAGCGTGTAGAACTGTMTCTGTG
1328 9B189ATCTCAGGCGTTAGGTGTATCTTACATAGT
1338 9C189AATGGCCCGAGAGGTAAGAAAGCGATAGGT
所述序列的核苷酸指定如下G為鳥嘌呤，A為腺嘌呤，T為胸腺嘧
啶，C為胞嘧啶，R為G或A， Y為T或C， M為A或C,K為G或T, S 為G或C，W為A或T,H為A或C或T,B為G或T或C,V為G或C或 A, D為G或A或T,并且最后，N為G或A或T或C。在本發(fā)明中所用核 苷酸可以是核糖核苷酸、脫氧核糖核苷酸和修飾的核苷酸，如肌苷酸或包 含不主要(essentialy)改變它們的雜交特征的修飾基團的核苷酸。
本發(fā)明的探針可以通過不同方法獲得，諸如化學(xué)合成(例如，通過常 規(guī)磷酸三酯方法)或遺傳工程技術(shù)，例如通過重組質(zhì)粒的分子克隆，在所 述重組質(zhì)粒中已經(jīng)插入對應(yīng)的核苷酸序列并且以后可以通過用核酸酶消 化而獲得對應(yīng)的核苷酸序列。
對于一些HPV類型，從在所提及的HPV類型的不同變體的具體位置 上含有不同核苷酸的序列區(qū)域設(shè)計探針。在這些情形中，使用簡并探針， 即，在所提及的位置分別含有備選的核苷酸的寡核苷酸的混合物。這是關(guān) 于探針39C3d [SEQ ID NO 41]， 39C4d [SEQ ID NO 43], 45Cld [SEQ ID NO 57], 45C3d [SEQ ID NO 58], 57Ald [SEQ ID NO 74]， 59C3一3d [SEQ ID NO 81], 66B1 [SEQ ID NO 91], 66C3d [SEQ ID NO 93],禾tl 83Bld [SEQ ID NO 126]的情形。備選地，包含準(zhǔn)確相同的序列區(qū)域但是在特定位置的核 苷酸組成不同的兩種寡核苷酸的等摩爾混合物用作單一探針(下列寡核苷 酸的混合物58Bla [SEQ ID NO 77]和58Blb [SEQ ID NO 78]; 68C4b [SEQ ID NO 100]禾Q 68C4c [SEQ ID NO 101]; 74Ala [SEQ ID NO 116]和 74Alb [SEQ ID NO 117]; 74Bla [SEQ ID NO 118]禾Q 74Blb [SEQ ID NO 119];和寡核苷酸82A2a-AS [SEQ ID NO 122]和82A2b-AS [SEQ ID NO 123]的混合物)。
本發(fā)明公開的所有探針都已經(jīng)證明在所述"點陣管"平臺上在相同的 雜交條件下特異性雜交它們的靶點序列。這一事實使得可以通過使用這種 微點陣平臺使用這些探針同時鑒定42種不同的HPV類型。由于其余的 HPV類型是臨床不相關(guān)的，所以通過使用在本發(fā)明中研發(fā)的所述"點陣 管"鑒定的HPV類型的高數(shù)量使得這種方法還被認(rèn)為是直接的檢測方法。
診斷方法的一個弱點是出現(xiàn)假陰性。在本方法的情形中，假陰性可以 由于低質(zhì)量的DNA樣品或由于在待分析的樣品中存在DNA聚合酶抑制劑而引起。本發(fā)明舉例說明通過使用兩種類型的對照而消除這些假陰性的 方法。
優(yōu)選地使用由患者自身DNA的擴增物組成的一種對照，以保證DNA 樣品的良好質(zhì)量。來自人DNA的任何序列片段都可以用作這一 目的的耙 點。認(rèn)為來自單拷貝基因諸如CFTR基因的片段是在本發(fā)明中用于DNA 質(zhì)量的陽性對照的特別適合的靶點。設(shè)計引物CFTR-F4 (SEQ ID IMO 134) 和CFTR-R5 (SEQ ID NO 135)，用于擴增來自CFTR基因的892 bp的片段。 使用單拷貝相對多拷貝靶點和與HPV擴增的片段相比更大的質(zhì)量DNA 對照擴增產(chǎn)物的大小，艮卩，分別為892 bp相對大約450 bp，允許在用于 擴增HPV基因組的U區(qū)域的同一反應(yīng)混合物中包含用于CFTR擴增的引 物，而具有最小程度的競爭作用。因此，質(zhì)量DNA對照可以詞時在分析 樣品的同一反應(yīng)管中運行，而不影響HPV檢測的靈敏性。
可以使用作為檢測PCR反應(yīng)失敗，例如，由于存在DNA聚合酶抑制 劑引起的失敗的擴增陽性對照的第二種對照。在一個優(yōu)選的實施方案中， 擴增陽性對照由可以使用與擴增CFTR基因片段所用的相同的引物和相 同的PCR條件進行擴增的重組質(zhì)粒組成。引物的大小和內(nèi)部序列在PCR 產(chǎn)物之間不同，這是由CFTR基因的擴增和重組質(zhì)粒的擴增導(dǎo)致。在這種 方法中，兩種擴增產(chǎn)物的類型可以通過凝膠電泳或通過用特異性探針雜交 而容易地區(qū)分。圖6顯示具有這些特征的重組質(zhì)粒pPG44的示意圖。
質(zhì)粒pPG44通過分子克隆技術(shù)構(gòu)建。簡言之，使用由美國威斯康辛 州麥迪遜市普洛麥格公司(Promega Corporation, Madison，WI, USA)提供 的商購試劑盒，將側(cè)連CFTR引物CFTR-F4禾D CFTR-R5的由從載體 pBluescript II SK + (Stratagene, La JoIIa,加州，美國)的位置124到位置 1285的1162 bp的片段組成的DNA插入片段克隆到pGEM -T Easy載體 中。將得到的重組質(zhì)粒pPG44的純化的制備物通過使用限制性酶和通過 序列分析而進一步特征性描述。質(zhì)粒pPG44以線性形式用作擴增方法的 陽性對照。
在分析樣品的同一 PCR擴增混合物中存在所提及的重組質(zhì)粒作為陽 性對照防止假陰性結(jié)果的出現(xiàn)，即，它甚至在樣品中存在目標(biāo)HPV基因 組時，防止給出陰性結(jié)果，原因在于，當(dāng)沒有擴增產(chǎn)物產(chǎn)生時，必定假設(shè)PCR擴增沒有正確運行，而不能得出關(guān)于樣品中存在還是不存在HPV基 因組的結(jié)論。
表2提供特異性檢測所述的兩種類型的陽性對照，即，DNA質(zhì)量對 照和擴增反應(yīng)對照的探針(SEQ ID NO 136-139和SEQ ID NO 145-147)。與 本發(fā)明的任何擴增產(chǎn)物沒有顯著相同性的寡核苷酸序列(SEQ ID NO 140-141)也在所述表2中提供。當(dāng)固定在微點陣的表面時，生物素修飾的 寡核苷酸SEQ ID NO 140和SEQ ID NO 141作為PCR產(chǎn)物檢測反應(yīng)的陽 性對照，并且作為布置參照，以致所有其余的探針都可以放置。
表2:
SEQ ID NO探針名對照類型序列(5，一3，)
136CFTR-A1-AS樣品DNA質(zhì)ii; TTCTCCACCCACTACGCACCCCCGCCAGCA
137CFTR-B3樣品DNA質(zhì)Jt GGGCTCAAGCTCCTAATGCCAAAGACCTACTACTCTG
145CFTR-B 1-AS樣品DNA質(zhì)I1 .CAAGCTCCTAATGCCARAGACCTACTACTC
146CFTR-B2樣品DNA質(zhì)，1 GGGCTCAAGCTCCTAATGCCAAAGACCTACTACTC
138CIA 1-ASPCR反應(yīng)CTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTAT
139CIA 2-ASPCR反應(yīng)TCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATG
147CIA 3-ASPCR反應(yīng)GAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGAC
140標(biāo)記-l檢測和定位GCAGTATAAGATTATTGATGCCGGAAC
141標(biāo)記-2檢測和定位GTCAAAACCTGGGATAGTAGTTTTACC
本發(fā)明還涉及用于特異性檢測臨床樣品中的HPV類型的體外診斷試
劑盒。優(yōu)選地，所提及的試劑盒包括任何或全部下述成分?jǐn)U增混合物， 包括擴增緩沖液，dNTPs，引物和對照質(zhì)粒；洗滌緩沖液；檢測試劑；點 陣管，其包含含有HPV類型-特異的探針的固體支持物；用于獲得和制備 樣品的試劑。盡管熟練的技術(shù)人員應(yīng)該能夠確定適當(dāng)?shù)脑噭┖谐煞趾途彌_ 液組成，但是具體的成分將取決于所述試劑盒意欲使用的準(zhǔn)確條件。
實施例
下文提供的實施例只是舉例說明本發(fā)明，而不以任何方式限制后附的 權(quán)利要求的范圍。實施例1:制備'點陣-管'
本發(fā)明的'點陣管，在CLONDIAG芯片技術(shù)GmbH(Jena，德國)制備 如下。將來自Eppendorf由聚丙烯制成的并且具有1.5 ml的指定接收體積 的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)測試管通過重熔而進行改進，以致在所述管中模塑具有粘合邊 的用于微點陣支持物的開放的凹進處。
要插入這些管的微點陣通過使用MicroGrid II Arrayer (生物機器人 (BioRobotics),劍橋，英國)生產(chǎn)。將由具有來自序列表的序列的5'端氨 基-修飾的寡核苷酸組成的探針布置在載玻片(載玻片大小75 mmX25 mm)的環(huán)氧化玻璃表面上的確定位點，并且共價固定。單一微點陣包含 12 x 10 = 120，或12 x 11 = 132個可以布置寡核苷酸的具體位置。這些位 置具有0.2 mm的間隔，以致在每一微點陣中包含的DNA文庫覆蓋2.4 mm x 2.4 mm的面積，并且，以這種方式每個載玻片總計可以產(chǎn)生多于100 種相同的DNA文庫。取決于實驗的類型，可以在這些位置的每一個位置 上放置每種單一探針或它們的混合物。通常，當(dāng)進行關(guān)于探針選擇的特異 性和靈敏性實驗時，在每個位置放置單一探針。 一旦探針已被驗證，可以 將能夠在特異的HPV類型擴增產(chǎn)物的分開區(qū)域雜交的探針的混合物放置 在迸行HPV基因型測定鑒定的相同位置。圖1-5顯示本發(fā)明所用的微點 陣內(nèi)的探針的不同排列。在每個微點陣中包含每種探針或探針混合物的兩 次或三次重復(fù)。
除了用于HPV基因型分析和用于檢測擴增對照以及DNA對照合適性 的特異性探針之外，微點陣在一些位置包括與本發(fā)明的任何擴增序列都沒 有顯著相同性的參照標(biāo)記，所述參照標(biāo)記由5'端生物素修飾的寡核苷酸 (標(biāo)記-l [SEQ ID NO 140]和標(biāo)記-2 [SEQ ID NO 141])組成。這些參照標(biāo)記 用于檢驗檢測反應(yīng)的正確性能和通過讀數(shù)儀的成像的光學(xué)定位，因此所有 其余的探針都可以定位，并且進行數(shù)據(jù)分析。
所有的寡核苷酸都從1XQMT點樣溶液I (Quantifoil Micro Tools GmbH, Jena,德國)放置在在所述載玻片上。在每種點樣溶液中的寡核苷酸 的總濃度在2.5 ^M參照標(biāo)記到20iiM特異性探針的范圍內(nèi)。然后，通過 在6(TC烘焙30分鐘，然后進行多步洗滌處理，而將寡核苷酸共價連接到 玻璃表面的環(huán)氧化物基團上。將晾干的載玻片分割成3.15 mm x 3.15 mm的玻璃片，嚴(yán)格來說，這就是我們所稱為的微點陣。在'點陣管'制備的
最后步驟中，然后將這些微點陣插入到前文提及的改進的Eppendorf管中， 并且膠合到粘合邊上。圖7顯示按照本實施例所述生產(chǎn)的'點陣管'的照片。
實施例2:制備DNA樣品
2.1. HPV DNA標(biāo)準(zhǔn) 用于評估類型-特異的探針的特異性和靈敏性的HPV DNAs是含有擴
增的L1區(qū)域(HPV類型6， 11, 13, 16, 18, 26， 31, 33, 35, 39,40,42, 44， 45, 51: 52, 53, 54, 56, 58, 61, 62， 66, 68， 70, 71, 72, 73, 81, 82， 83， 84, 85和89)的重 組質(zhì)粒，或者是從臨床樣品提取的DNAs，所述臨床樣品的擴增的Ll區(qū) 域通過DNA測序進一步特征性描述。重組質(zhì)粒通過分子克隆技術(shù)構(gòu)建。 簡言之，使用由美國威斯康辛州麥迪遜市普洛麥格公司(Promega Corporation, Madison, WI, USA)提供的商購試劑盒，將從每種HPV類型 擴增的L1區(qū)域克隆到pGEM^-T Easy載體中。將從每種重組質(zhì)粒獲得的 純化的制備物通過序列分析而進一步特征性描述。將1-10 pg質(zhì)粒DNA 用于特異性實驗的評估。
來自K562細(xì)胞系的DNA (目錄號DD2011,普洛麥格公司，Madison, WI,美國)用于評估CFTR特異性探針的特異性和靈敏性。
2.2. 臨床樣品
為了檢測HPV的目的，首先需要從剩余的生物材料中分離DNA。DNA 制備步驟根據(jù)樣品來源而不同。提供從各種來源的樣品制備DNA的具體
^ A.藥簽樣品用潔凈、干燥的棉簽采取。通過向具有樣品的容器中 直接加入1.5ml鹽水，并且用力振蕩，而回收來自臨床藥簽的細(xì)胞。將樣 品物質(zhì)轉(zhuǎn)移到1.5mlEppendorf管中，并且通過離心沉淀。倒掉上清，并 且將沉淀的細(xì)胞懸浮在100 nl的裂解緩沖液中，所述裂解緩沖液含有10 mM Tris-HCl (在25 °C pH 9.0), 50 mM KCl， 0.15 mM MgCl2, 0.1 % Triton X-100，0.5。/。吐溫20,和0.25mg/ml蛋白酶K。將這一混合物在56。C溫育大約2小時，并且通過將所述混合物在IO(TC加熱10分鐘而使蛋白酶K 熱失活。碎片通過離心沉淀，并且將上清轉(zhuǎn)移到潔凈并且無菌的管中。隨
后將5 pl整分試樣用于PCR反應(yīng)。
B. 細(xì)胞混懸液這種類型的樣品指用于基于子宮頸陰道液的細(xì)胞學(xué)
檢測中所用的樣品。子宮頸標(biāo)本用刷子或刮刀(spatula)采集，并且重懸 在PreservCyt溶液(Cytyc公司，Marlborough, MA,美國)中。將1 ml的整 分試樣離心，并且將沉淀重懸在l ml鹽水中。再一次離心步驟后，將沉 淀重懸在100 ^與在A段中用于藥簽樣品相同的裂解緩沖液中，并且以 與在那一部分相同的方式繼續(xù)流程。
C. 福爾馬林固定的和石蠟包埋的活組織切片在本方法中使用5 , 寬度的一些組織切片，典型地2-5片切片，這取決于所述活組織切片的表 面積。將切片置于1.5 ml無菌管中，并且加入100 ial與在A段中用于藥 簽樣品相同的裂解緩沖液。除了使用蛋白酶K的溫育進行3小時以外， 以與在那一部分相同的方式繼續(xù)流程。
備選地，將設(shè)計用于從來自各種來源的樣品分離DNA的商業(yè)試劑盒 (NucleoSpir^組織試劑盒，目錄號635966，來自BD生物科學(xué)克隆技術(shù)(BD Biosciences Clontech) , Palo Alto， CA,美國)用于處理藥簽、細(xì)胞混懸液或 福爾馬林固定的和石蠟包埋的活組織切片樣品。在這種情形中，DNA分 離流程的起始如在A、 B和C部分所述。取代100 ^的裂解緩沖液，向樣 品中加入180 pl的緩沖液Tl。流程按照供應(yīng)商關(guān)于從細(xì)胞和組織中分離 基因組DNA的說明書而繼續(xù)。
不管是臨床樣品類型還是DNA制備方法，陰性對照都在每一批次的 樣品中平行運行。這些由1 ml鹽水組成的陰性對照以與在部分A中相同 的方法進行處理。
實施例3: PCR擴增
進行使用共有引物MY11和MY09的PCR擴增(Manos等，Molecular Diagnostics of Human Cancer(人類癌癥的分子診斷)；Furth M, Greaves MF， eds,; Cold Spring Harbor Press (冷泉港出版社).1989,巻7: 209-214)。在 所述PCR反應(yīng)中還包含第三種引物，HMBOl，其通常與MY09和MY11組合使用以擴增只使用MY09和MY11不能有效擴增的HPV類型 51(Hildesheim等，J Infect Dis.(傳染病雜志)1994, 169; 235-240)。簡言之， PCR擴增在50 ^tl的終體積反應(yīng)中進行，所述反應(yīng)中包含lOmMTris-HCl pH8.3, 50mMKCl， 1 mM MgCl2， 0.3pM每種引物MY09和MY11 (SEQ ID NO 142和143), 0.03 iiM引物HMBOl (SEQ ID NO 144), 200 (iM每種dNTP, 4個單位的AmpliTaq Gold DNA聚合酶(應(yīng)用生物系統(tǒng)(Applied Biosystems) , Foster City, CA,美國)，和5 pi每種來自實施例2丄的HPV DNA標(biāo)準(zhǔn)或來自實施例2.2.的臨床樣品DNA。為了檢測樣品DNA的適 合性，還將0.08 每種引物CFTR-F4和CFTR-R5 (SEQ ID NO 134和 135)加入到反應(yīng)混合物中。另外，為了檢驗擴增過程并且消除由于反應(yīng)失 敗導(dǎo)致的假陰性結(jié)果，在分析樣品的同一反應(yīng)管中包含20 fg內(nèi)部對照 pPG44。用于所述PCR反應(yīng)的所有正向引物(MYll [Seq ID NO 143]和 CFTR-F4 [Seq ID NO 134])都在5'端生物素修飾，以致隨后可以檢測任何 擴增的DNA。
由5 pi來自實施例2.2.的空白樣品或5 去離子水組成的陰性對照與 樣品DNA平行處理。使用這些種類的陰性對照用來檢驗在樣品處理的任 一點或在PCR反應(yīng)設(shè)置中沒有發(fā)生污染，并且所有陽性結(jié)果表示DNA在 樣品中的真實存在。
PCR反應(yīng)在以下述循環(huán)概述編程的Mastercycler熱循環(huán)器(Eppendorf， Hamburg,德國)中進行1個初始變性循環(huán)，95°C 9分鐘；45個循環(huán)，在 94°C 30秒，55°C 60秒和72匸90秒；和一種最后延伸循環(huán)，72°C 8分 鐘。擴增之后，將5(il每種反應(yīng)物用于使用特異性探針的后續(xù)檢測。
實施例4:使用'點陣管'同時鑒定HPV基因型
在使用前，通過向每個管中加入300iil0.5XPBS-吐溫20緩沖液，并 且將它們顛倒幾次，而將'點陣管'預(yù)洗。使用與真空系統(tǒng)連接的巴斯德 移液器，移除每個管內(nèi)的所有液體。
通過將它們在95。C加熱10分鐘，并且然后立即將它們在冰上冷卻5 分鐘，而將實施例3的擴增反應(yīng)物變性。將5微升變性的擴增反應(yīng)物和 100 ^雜交溶液(250 mM磷酸鈉緩沖液，pH 7.2; SSC 1 X ; 0.2% Triton X-100; 1 mMEDTA,pH8.0) —起用于在實施例1中制備的'點陣管'。雜 交反應(yīng)在熱混合器comfort (Eppendorf, Hamburg,德國)中進行，通過將'點 陣管，在550 rpm搖動下在55t:溫育1小時而進行。溫育期間后，使用與 真空系統(tǒng)連接的巴斯德移液器，將雜交反應(yīng)物移除，并且用300 0.5X PBS-吐溫20緩沖液進行洗滌步驟。
通過在550 rpm搖動下在100 pl 0.075嗎/ml聚-HRP鏈霉抗生物素蛋 白(Pierce生物技術(shù)公司(Pierce Biotechnology Inc.) , Rockford, IL,美國) 溶液中在30。C溫育15分鐘，而檢測雜交的DNA。然后，迅速將來自^點 陣管'的所有液體移除，并且進行如上文提及的兩個洗滌步驟。顯色反應(yīng) 在100 ^ True Blue 過氧化物酶底物(KPL, Gaithersburg, MD,美國)中進 行，其由含有3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)的緩沖溶液和H202組成，顯色 反應(yīng)通過在25。C溫育10分鐘進行。這樣產(chǎn)生的有顏色的沉淀物引起在微 點陣的具體位置的光學(xué)透射的改變，其可以使用由CLONDIAG芯片技術(shù) GmbH (Jena,德國)制造的ATROl和ATS讀數(shù)儀讀取。任選地，ATS讀數(shù) 儀可以具有安裝的特殊軟件，以用于自動處理使用本發(fā)明研發(fā)的'點陣管' 獲得的樣品分析結(jié)果。序列表
<uo>基諾米加公司
<120>用于鑒定臨床樣品中的人乳頭瘤病毒的體外診斷試劑盒
"30> GBP290"0
<160> 1"
"70> Patentln version 3，3
<210> 1
<2U> 30
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<220>
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<210>3
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<化0>3
tgtstgtsgc agatttagsc acagatgcac
<210>4
<211>30
<212>
<213>人工的
<220>
<223>探針
<400:>4
catggcgcat gtattcctta taatctgaat
<210> 5
<211> 30
<212> D肌 <213>人工的<220>
<223>探針 <徹> 5
gtagatstgg cagcacataa tgscatattt 30
<211> 30 DMA
<213>人工的 <22D>
<223> 探針
ttctgaagta gatatggcag cacataatga 30
<210> 7
《21》 30
<212> DWA <213>人工的
<220>
<223:>探針
"00> *
aactgtgcaa aatsacctta actgcagacg 3D
<210> 8
<211> 31
<212> DWA <213>人工的
<220>
<223>探針
<400> 8
atac3tstT3t tctatgsatt ccactatttt g 31
<210> 9
<211> 30
<212> D貼 <213>人工的
<220>
<223>探針
cccaggaggc acactagaag atacttatag 30
<210> 10
<211> 30
<212> DWA <213>人工的
<220>
<223> 探針
<400> 103tcatsttgc ccaggtacag gagsctgtgt 30
<210>11
<211>29
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>探針
<綱>11
cttattttca gccggtgcsg<210>12
<211>30
<212>
<213>人工的
<220>
<223>探針
<400>12
gsatsg!cagt attttagagg
<2;io>13
<211>31
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>探針
13
agttasagtt ttggaatgtg<210>14
<211>30
<212>DWA
<213>人工的
<220>
<223>探針
14
tggtttaaat ggagtggatg<210>15
<211>30
<212>DWA
<213>人工的
<220>
<223>探針
<■>15
29
30
31
csgatgctgc 30
atcttccttt ggcacaggag gggcgttacg 3D
<210> 1S <211> 30<212> DWA <213>人工的
<220>
<223>探針 <4O0> 16
ascaatttst aagacstggc gasgsatstg
<210> 17
<2U> 30
<212> DWA <213>人工的
,n ^n、
探針 <400> 17
acatttsatg aatgcctcca tattggagga
<210> 18 <2ll> 30 <212> DWA <213>人工的
<220>
<223>探針 <■> 13
gtaacgcccc tcctgtgcca aaggaagatc
<210> 19
<211> 30
<212> DNA <213>人工的
<220>
<223>探針
"00> 19
cttgtggcsg ctgggggtga caatccaata
<210> 20
<211> 30
<212> DNA <213>人工的
<220>
<223>探針
<400> 20
gatascgttt gtgtggttgc agatatagtc
<210> 21
<211> 30
<212> DNA <213>人工的
<220>
<223>探針
說明書第23/47頁
30
30
30
30"00>21
ttccagccct casgtaaagt
22
30
<212>DWA
<213>人工的
<220>
<223>探針
<400>22
tgtsgt:atca ctgtttgcaa
<210>23
<211>30
<212>
<213>人工的
<220>
<223>探針
23
agascctgag ggaggtgtgg<210>24
<2U>33
<:212>DNA
<:213>人工的
<220>
<223>探針
<400>24
<210>25
<211>31
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>探針
<400>25
catatattca cagtatgsat<210>26
<211>32
<212>
<213>人工的
<22D>
<223>探針
<400>26
30
30
30
gtgaggastt tga 33
31
agttagtsga cttgtstgtg tcttcagttg tt 32<210>27
<21l:>30
<212>
<213>人工的
<220>
<223>探針
"00>27
ttcccaaast gsatsgtcag aaaasggstc 30
<2i0>28
<211>30
<212>DWA
<213>人工的
<220>
<223>探針
"00>28
tactgtcsct agttacttgt gtgcstaaag 30
<210>29
<211>30
<212>DWA
<213>人工的
<220>
<223>探針
<400>29
gtstatt:t3C ctaaggggtc ttccttttcc 30
<210> <211>
<213>
30 30 DMA
人工的
<220>
<223>探針 <400> 30
aaaggsagac cccttaggta aatatacstt 3D
<210>31
<2U>3D
<212>DWA
<213>人工的
<220>
<223>探針
<400>31
C33ct3tgc3 asgttscctt sactgcsgsa 30
<21D> 32
<211> 30
<212> DMA <213>人工的
<220>
<223>探針
32
jtggs gttgtscttg
<210>33
<211>30
<212>加A
人工的
<220>
<223>探針
33
tccttaggag gttgcggacg《210>34
<211>30
<212>加A
<213>人工的
<223>探針
<400>34
gtcactagas gacscagcsg<210>35
<211>30
<212>
<213>人工的
<220>
探針
<400>35
astggatcat ctttsggttt<210>36
<211>30
<212>
<213>人工的
<220>
<223>探針
<400>3S
gtsccttags ggacacstst
37
30
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>探針
O300>37
30
ctgscstgta 30
30
30
cgctatgtaa 30
3tgt33C3tc 3C3ggctgta acttgtcass 3D<21D>38
<2王1>3i
<212>D貼
<213>人工的
<220>
<223>探針
<棚>38
jgaag actctataga
39
<2U>30
<212>D貼
<213>人工的
<220>
<223>探針
<400>
gtatctgtsa gtgtctacca<210>40
<211>30
<212>DNA
<213>人工的
<220>
探針
<400;>
gtagtaccsa ctttacatta
41
<2U>30
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>探針
<4 00>41
ataycaggca cgtggaggag<2iD>42
<211>30
<212>DMA
<213>人工的
<220>
<223>探針
<■>42
aactgtgtac tgtcacatta<210>43
<211>30
<212>DMA
31
asctggcags 30
30
tatgstttac 30
30
<213>人工的 <22。>
<223>探針 <柳> 43
aactgtgtac tgtmacatta scaactgatg 30
<210>
<211>30
<212>DWA
<213>人工的
<220>
<223>探針
<400>44
cttgsastta ctgttsttst atggggttgg 30
<210> 45 <211:> 30 <212> DWA
人工的
<220>
<223>探針 "DO> 45
cctccsacaa cgtaggatcc: attgcatgaa 30
<210> 4 6
《211> 30
<212> 加A
<213>人工的 <220>
<223>探針
gtstatgtat caccagatgt tgcagtggca 30
<210> "
<211> 3D
<212> DWA
<2i3>人工的 <220>
<223>探針
tsgcctgsca gcgaatsgct tctgattgta 30
<210> 4 8
<211> 30
<212> 歸 <213>人工的
<220>
<223> 探針gtatgtacaa tcsgaagcta ttcgctgtca 30
<210>49
<21"31
人工的
<220>
<223>探針
<棚>
taeacaatat gsstcctaac atattagsgg a 31
<21D>50
<211>30
<213>人工的
<220>
<223>探針
"00>50
gttgcaccac cacettcagg aactttagas 30
<210>
51 3D DNA
人工的
<220>
<223> 探針 <400> 51
atatgtactg ggcscsgtag ggtcagtaga 3D
<210> <211> <212> <213>
<220> <223>
52 30
人工的
探針
<4 00> 52
aagcagaggc aggtggggac acaccaaaat 30
<210> 53
<211> 30
<212> O貼 <213>人工的
<220>
<223>探針 <400> 53
tatatgtaga cggaggggac tgtgtagtgg 30
<210> 54<211>
<212>鵬
人工的
<220>
<223>探針
<400>5。
cgcstgtstt gcttstattg ttcactagta t 31
<210> <211> <212> <213>
<220>
55 29
人工的
探針
"00> 55
ctgcttttct ggsggtgtag tatcctttt 29
<212> <213>
56 30
人工的
<220>
<223>探針 <400> 55
ggcacaggat tttgtgtaga ggcacatast 30
<210>5*
<211>30
<213>人工的
<220>
<223>探針
<■>57
atgaycctac taagtttasg cast3tsgta 30
<:210> <211> <:212> <213>
<220> <223>
5B 30 DMA 人工的
探針
<權(quán)> 58
tmcctccacc acctactaca agtttrgtgg 30
<210> 59
<2U> 30
<212> DWA <213>人工的
<220>
《223>探針 <400> 59
tcgttttgtg castcagttg ctgttacctg 30
<210>60
<211>30
<212>DWA
<213>人工的
<220>
<223>探針
<■>60
jttgg gg33sccgc3
61
<2U>30
<213>人工的
<220>
<223>探針
<400>61
tggaggggtg tccttttgac<210>62
<211>30
<212>
<213>人工的
<220>
<223>探針
62
ggcttsttts C3cacsatgg<210>63
<2U>30
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>探針
<400>
acs3tggatc ctaccattct
64
<2U>30
<212>DWA
<213>人工的
<220>
<223>探針
30
sgctsgtsgc 3D
3D
30
<400> 54
gattaacatt acctccgtct gctagtttgg 30<210:>S5
<2U>30
<212>DWA
<213>人工的
<220>
<223>探針
"00>65
ttstatgtgc tttccttttt<210>66
<211>29
DWA
<213>人工的
<220>
<223>探針
30
<400> 66
gtgtcctcca aagatgcaga cggtggtgg 29
<213>
<220> <223>
67 30
人工的 探針
<400> 。
aacctcagca gacagggsta ttttacatag 30
<210>6B
<21》30
<212>DWA
<213>人工的
<220>
<223>探針
<400>
aeigctagtgg cascaggagg《210>63
<211>30
<212>D肌
<213>人工的
<223>探針
<4D0:>69
30
gctstcctgc gtggatgctg tagcacacaa 30
<211> 30 <212> DWA <213>人工的
<220>
<223>探針 <徹> 70
asctacttgt agctgggggg gttataccas 30
<210> <211> <212> <213>
71 30 DWA
人工的
<220>
<223>探針 <400> "U
atctgctgta agggttatgg tacataactg 30
<:210> <211> <212> <2U>
72 30
人工的
<220>
<223>探針 <400> 72
tgtctaaggt sctgattsat ttttcgtgcs 30
<210> <211>
<213>
73 30 DMA
人工的
<220>
<"3>探針 <■> 73
tttstcttct aggctggtgg ccactggcgg 30
<210> 74
<211> 30
<212> DWA <213>人工的
<220> <223>探針
"00> *74
tataattagt ttctgtgktt acagtggcac 30
<210> 75
<211> 30
<2i2> DWA <213>人工的
<220>
<223>探針
<400> 75agtcctctsg cssccgcgcs tccatgttat 30
《210>7S
<211>30
<212>DW
<213>人工的
<220>
<223>探針
76
at3ttcttcs scatgacgt
77
<211>30
<212>DWA
<213>人工的
<220>
<223>探針
30
<400> 77
tcttctttag ttacttcsgt gcataatgtc 30
<210>78
<211>30
<212>DWA
<213>人工的
<220>
<223>探針
<400>78
ccttccttsg ttacttcagt<210>73
<2U>30
<212>DWA
<213>人工的
<220>
<223>探針
CtggC3t3tt Cttt3333Ct<210>B0
3D
DNA
<213>人工的
<220>
<223>探針
<400>80
tcctgtttaa ctggcggtgc
81
30
30
30
ggtgtccttt 30<212> 鵬 <213>人工的
<223>探針
<400> Bl 30 tctttctgtg tgtgcttcta ctactbcttc
<210>82
<211:>30
<212>
<213>人工的
<220>探針
<223><400>82
fc 30 tttaaagaat atgccagaca tgtggsggaa
<210>B3
<2U>30
<212>
<213>人工的
<220>探針
<223><■>B3
30
aatgtcatac attcataats tgaataccac
<210> <2U> <212> <213>
84 30
人工的
<220>
<223>探針
<化0> 84 30 tatattcaga t3cagg柳g gatgtsgcag
<210> B5
<211> 30
<212> DWA <213>人工的
<220>
<223>探針
st為acttggc atagcgatcc tccttgggcg 30
<:210> B6
<211> 30
<212> 鵬 <213>人工的
<220>巡補 <223>探針"00>85
3tattCCCt3 3i<210>B7
<211>30
DMA
<213>人工的
<220>
<223>探針
87
30
gtggaagggg gaggtaaasc cccaaagttc 30
83
<211>30
<2i2>
<213>人工的
<220>
<223>探針
< >88
atacgggtcc accttgggac<210>89
<211>30
<212>
<213>人工的
<220>
<223>探針
30
<400> 83
aaatgtcatt tgcgcatscg ggtccscctt 30
<210>90
30
加A
<213>人工的 '
<22D>
<223>探針
<400>90
gttaatgtgc ttttagctgc
92
<211>30
<213>人工的
<220>
<223>探針
<400>91
30
tggcgsaggt 3ttgattgat ttcacgkgca 3D<T210> <211> <212> <213>
<220>
<223>探針
<400>92
cscstggcga a〖<210>93
30
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>探針
<400>93
ggtattgat tgatttcacg 30
taatacttta ttagacgatt ggaayattgg 30
<210>94
3D
DNA
人工的
<220>
<223>探針
<權(quán)>
aggataaata taggtatatt<210>35
<211>30
<212>DWA
<213>人工的
<223>探針
<400>95
tcttcctttg ctgttggsgg ggatgttttt 30
<210>
<211> 30
<212> , <213>人工的
《220>
<223>探針
tggtgtgtat gtattgcata acatttgcag 30
《210> 97
<211> 30
<212> DNA <213:>人工的
的
D人
<220>
<223>探針
<4DO>97
gttttC5ttt tt
98
<2U>30
<212>
<213>人工的
<220>
<223>探針
98
99
<211>30
<212>DWA
<213>人工的
<220>
<223>探針
<徹>99
agcggt5tgt st<210>i00
31
<212>
ttgtatgtag cctctgattt 30
30
5tctscaaga ctsgcagatg 30
<213>人工的 <220>
<223>探針 <■> 100
gttgtgtact ataacattgt csactgatgt a 31
<210>101
<211>31
<212>DMA
<2">人工的
<220>
<223>探針
gttgtgtact ataacsttat<210>102
30
<2:u>DMA
<:213>人工的
<220>
<223>探針
< >1D2
31
gtgttgcccc tccaccatct gctagtcttg 30<210>103
<211>30
<213>人工的
<220>
<223>探針
<400>103
atggtt:taaa agtggcsgat
<210>104
<211>3D
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>探針
"00>
tgtgcagggg仁atcgcgttg<210>105
<211>30
<212>
<213>人工的
<220>
<223>探針
<400>105
S33Ctttgta gggctstata<210>106
<211>30
<212>
人工的
<22D>
<223>探針
<400>106
tggtggaggg gtaactccta
107
<2U>30
<212>
<213>人工的
<220>
<223>探針
<400>
aatsttccat gsaactagag
103
<211>30
<212>D貼
30
30
cagcaggtat 30
30
30<213>人工的 <220>
<223>探針 <400> 108
tttttctgca ggaggaggsc tgtttttctg 30
<212> <213>
<220> <223>
1D9 30 隱 人工的
探針
<400> 109
tctgstacag aggacgctgt ggcagtacaa 30
<210>
<212> <213>
UO 30
人工的
<223>探針 <楊> 110
gtggcgaags tsctcacgaa aattagaagc 30
<210> 111 <2U> 30 <212> DRA
<213>人工的
<220> <223>探針
< > 111
tagagttggc atscgttgts gtagagctac 30
<210> <2U> <212> <213>
112
30
鵬
人工的
<220>
<223>探針 <400> U2
gagttggcat acgttgtsgt sgagctacta 30
<210> U3
<211> 30
<213>人工的
<220>
<223>探針
<400> 113
aggaggttga ggacgttggc aactsstagc 30
<2U> <2i2> <23>
114
30 D肌 人工的
<220>
<223>探針 < > 114
ctstgaattc tactatattg gaagagtgga 30
<210>115
<211>30
<212>
<213>人工的
<220>
<223>探針
115
accccaccac cgtcaggtac<210>
<211>30
<212>D肌
<213>人工的
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權(quán)利要求
1. 用于檢測并且分析樣品中人乳頭瘤病毒(HPV)的類型的測定，所述測定包括在樣品上進行核酸擴增反應(yīng)，所述擴增反應(yīng)意欲以非類型特異性方式擴增HPV目標(biāo)序列；從任意擴增產(chǎn)物獲得單鏈寡核苷酸；在可能的情形中，允許單鏈寡核苷酸與在固體支持物上提供的多種HPV類型-特異性探針進行雜交，所述支持物位于適合容納所述樣品的反應(yīng)容器內(nèi)；并且檢測雜交的寡核苷酸。
2. 權(quán)利要求l的測定，其中所述HPV類型-特異性探針包括DNA。
3. 權(quán)利要求1或2的測定，其中所述核酸擴增步驟在反應(yīng)容器內(nèi)與 固體支持物上的HPV類型-特異性探針接觸的樣品上進行。
4. 權(quán)利要求1或2的測定，其中所述核酸擴增步驟在將擴增的樣品 引入到所述反應(yīng)容器以與在固體支持物上的HPV類型-特異性探針接觸之 前在樣品上進行。
5. 前述權(quán)利要求中任一項的測定，其中選擇所述探針，以在對于所 有探針都相同的雜交條件下與HPV目標(biāo)序列特異性結(jié)合。
6. 前述權(quán)利要求中任一項的測定，其中使用對于至少20種HPV類 型特異的探針。
7. 前述權(quán)利要求中任一項的測定，其中使用對于HPV類型6， 11,16, 18, 26， 30, 31, 32, 33, 34/64， 35, 39, 40, 42， 43, 44， 45, 51, 52, 53, 54， 56, 57, 58, 59, 61, 62, 66, 67, 68, 69， 70， 71, 72, 73， 74, 81, 82， 83, 84， 85和89中的 至少20種特異的探針。
8. 前述權(quán)利要求中任一項的測定，其中所述探針長度為20-40 nt。
9. 前述權(quán)利要求中任一項的測定，其中所述探針是25-35 nt。
10. 前述權(quán)利要求中任一項的測定，其中所述探針是28-32 nt。
11. 前述權(quán)利要求中任一項的測定，其中所述探針是約30nt。
12. 前述權(quán)利要求中任一項的測定，其中所述探針對HPV的L1區(qū)域特異。
13. 前述權(quán)利要求中任一項的測定，其中每種探針有至少2nt與對另 一種HPV類型特異的探針不同。
14. 前述權(quán)利要求中任一項的測定，其中每種探針有至少3nt與對另 一種HPV類型特異的探針不同。
15. 前述權(quán)利要求中任一項的測定，其中一種或多種探針選自包括 SEQ ID NO 1-SEQ ID NO 133的組。
16. 前述權(quán)利要求中任一項的測定，其中所有的探針都選自包括SEQ ID NO 1-SEQ ID NO 133的組。
17. 前述權(quán)利要求中任一項的測定，其中多種探針選自下述SEQ IDs 組的一種或多種1或2; 3或4; 5-9; 10-13; 14-18; 19, 20，或21; 22-25; 26 或27; 28-31; 32或33; 34-37; 38-43; 44或45; 46-50; 51或52; 53或54; 55-59; 60-64; 65或66; 67或68; 69， 70或71; 72或73; 74或75; 76, 77，或78; 79-83; 84, 85,或86; 87, 88，或89; 90-94; 95, 96或97; 98-102; 103或104; 105或 106; 107或108; 109或110; 111-115; 116-119; 120或121; 122， 123,或124; 125或126; 127或128; 129或130; 131， 132或133。
18. 權(quán)利要求17的測定，其中探針選自所述組的每一組。
19. 權(quán)利要求17的測定，其中每種探針選自所述組，并且至少一種 探針選自所述組的每一組。
20. 權(quán)利要求17的測定，其中兩種或多種探針選自所述組的每一組。
21. 前述權(quán)利要求中任一項的測定，其中所述探針選自下述SEQIDs: 2, 4, 7, 8, 9， 12, 13, 16, 17, 18， 19， 20， 21， 24, 25, 26, 27， 30, 31, 32, 33, 36, 37， 40, 41， 42, 43, 45, 48， 49， 50, 51, 52， 53, 54, 57, 58， 59, 61, 62, 63， 64, 66, 67, 68， 70, 71, 73， 74, 75， 76, 81， 82, 83, 84, 85, 86， 87, 88, 89, 91, 92， 93, 94, 95, 96, 97, 100， 101， 102, 103, 104， 105, 106, 107, 108, 109， 110, 112, 114, 115, 116, 117， 118, 119, 120, 121, 124， 126, 128, 129, 130, 131, 132, 133。
22. 前述權(quán)利要求中任一項的測定，其中多種探針是對同一種HPV 類型特異的。
23. 前述權(quán)利要求中任一項的測定，其中多種探針是對每種待檢測的 HPV類型特異的。
24. 權(quán)利要求22或23任一項的測定，其中所述多種探針的每一種固 定在固體支持物的同一區(qū)域。
25. 權(quán)利要求22-23中任一項的測定，其中所述多種探針的每一種固 定在固體支持物的不同區(qū)域。
26. 權(quán)利要求23-25中任一項的測定，其中對于同一種HPV類型特異 的每種探針檢測所述HPV目標(biāo)序列的不同部分。
27. 前述權(quán)利要求中任一項的測定，其中至少一種探針存在于固體支 持物的至少兩個不同位置。
28. 前述權(quán)利要求中任一項的測定，其中所有探針都存在于固體支持 物的至少兩個不同位置。
29. 前述權(quán)利要求中任一項的測定，其還包括檢測一種或多種對照序列。
30. 權(quán)利要求29的測定，其中所述對照序列包括固定在固體支持物 上不與任何HPV類型的目標(biāo)序列雜交的探針。
31. 權(quán)利要求29的測定，其中所述對照序列包括人類基因組的目標(biāo) 序列。
32. 權(quán)利要求31的測定，其中所述人類目標(biāo)序列包括至少CFTR基 因的片段。
33. 前述權(quán)利要求中任一項的測定，其還包括擴增已知的對照序列， 和檢測擴增的產(chǎn)物。
34. 前述權(quán)利要求中任一項的測定，其包括將擴增反應(yīng)混合物與樣品 組合以進行擴增反應(yīng)。
35. 前述權(quán)利要求中任一項的測定，其中所述擴增反應(yīng)是PCR。
36. 前述權(quán)利要求中任一項的測定，其中單鏈寡核苷酸通過將任何存 在的雙鏈寡核苷酸變性而獲得。
37. 權(quán)利要求36的測定，其中所述變性步驟在包含在反應(yīng)容器內(nèi)的 樣品上進行。
38. 前述權(quán)利要求中任一項的測定，其中所述單鏈寡核苷酸被允許在 嚴(yán)格條件下雜交。
39. 用于檢測并且分析樣品中人乳頭瘤病毒(HPV)的類型的測定，所 述測定包括在包含其上固定了多種HPV類型-特異性探針的固體支持物的反應(yīng)容 器中，在樣品上進行核酸擴增反應(yīng)，所述擴增反應(yīng)意欲以非類型特異性方 式擴增HPV目標(biāo)序列；從任意擴增產(chǎn)物獲得單鏈寡核苷酸；在可能的情形中，允許單鏈寡核苷酸與所述HPV類型-特異性探針進 行雜交；并且檢測雜交的寡核苷酸；其中所述擴增反應(yīng)在與所述固體支持物接觸的樣品中進行。
40. 用于進行檢測和分析樣品中HPV的類型的測定的反應(yīng)容器，所 述容器包括其上固定了多種HPV類型-特異性探針的固體支持物，并且適 合容納與所述固體支持物接觸的樣品。
41. 權(quán)利要求40的容器，其中所述容器適合在與所述固體支持物接 觸的樣品上進行核酸擴增反應(yīng)。
42. 權(quán)利要求40或41的容器，其中選擇所述探針，以在對于所有探 針都相同的雜交條件下與HPV目標(biāo)序列特異性結(jié)合。
43. 權(quán)利要求40-42中任一項的容器，其中選擇所述探針，以在包含 適于進行核酸擴增反應(yīng)的反應(yīng)混合物的樣品中特異性地結(jié)合HPV目標(biāo)序
44. 權(quán)利要求40-43中任一項的容器，其中所述HPV類型-特異性探 針包括DNA。
45. 權(quán)利要求40-44中任一項的容器，其包括對至少20種HPV類型 特異的探針。
46. 權(quán)利要求40-44中任一項的容器，其包括對于HPV類型6， 11, 16, 18, 26, 30, 31， 32, 33, 34/64, 35， 39， 40, 42， 43, 44, 45, 51, 52, 53， 54, 56, 57, 58, 59, 61， 62, 66， 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 81, 82, 83, 84, 85和89中的 至少20種特異的探針。
47. 權(quán)利要求40-46中任一項的容器，其中所述探針長度為20-40 nt。
48. 權(quán)利要求40-47中任一項的容器，其中所述探針是25-35 nt
49. 權(quán)利要求40-48中任一項的容器，其中所述探針是28-32 nt。
50. 權(quán)利要求40-49中任一項的容器，其中所述探針是約30nt。
51. 權(quán)利要求40-50中任一項的容器，其中所述探針對HPV的L1區(qū)域特異。
52. 權(quán)利要求40-51中任一項的容器，其中用于特定的HPV類型的每 種探針有至少2 nt與對另一種HPV類型特異的探針不同。
53. 權(quán)利要求40-52中任一項的容器，其中用于特定的HPV類型的每 種探針有至少3 nt與對另一種HPV類型特異的探針不同。
54. 權(quán)利要求40-53中任一項的容器，其中一種或多種探針選自包括 SEQ ID NO 1陽SEQ ID NO 133的組。
55. 權(quán)利要求40-54中任一項的容器，其中所有的探針都選自包括 SEQ ID NO 1- SEQ ID NO 133的組。
56. 權(quán)利要求40-55中任一項的容器，其中多種探針選自下述SEQ IDs 組的一種或多種1或2; 3或4; 5-9; 10-13; 14-18; 19, 20,或21; 22-25; 26 或27; 28-31; 32或33; 34-37; 38-43; 44或45; 46-50; 51或52; 53或54; 55-59; 60-64; 65或66; 67或68; 69, 70或71; 72或73; 74或75; 76, 77,或78; 79-83; 84, 85,或86; 87, 88，或89; 90-94; 95， 96或97; 98-102; 103或104; 105或 106; 107或108; 109或110; 111-115; 116-119; 120或121; 122, 123，或124; 125或126; 127或128; 129或130; 131， 132或133。
57. 權(quán)利要求56的容器，其中探針選自所述組的每一組。
58. 權(quán)利要求56的容器，其中每種探針選自所述組，并且至少一種 探針選自所述組的每一組。
59. 權(quán)利要求56的容器，其中兩種或多種探針選自所述組的每一組。
60. 權(quán)利要求40-59中任一項的容器，其中所述探針選自下述SEQ IDs: 2, 4, 7, 8, 9, 12, 13, 16, 17, 18, 19, 20， 21, 24, 25, 26, 27， 30, 31， 32， 33, 36, 37, 40， 41， 42， 43， 45, 48， 49， 50， 51, 52， 53， 54， 57， 58, 59, 61, 62, 63， 64， 66, 67, 68， 70, 71， 73， 74, 75, 76， 81, 82， 83， 84, 85， 86， 87， 88, 89, 91， 92, 93， 94, 95, 96, 97， 100, 101, 102, 103， 104, 105, 106， 107, 108, 109, 110, 112, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 124， 126, 128, 129, 130, 131, 132, 133。
61. 權(quán)利要求40-60中任一項的容器，其中多種探針是對同一種HPV 類型特異的。
62，權(quán)利要求40-61中任一項的容器，其中多種探針是對每種待檢測的HPV類型特異的。
63. 權(quán)利要求61或62任一項的容器，其中所述多種探針的每一種固 定在固體支持物的同一區(qū)域。
64. 權(quán)利要求61或62任一項的容器，其中所述多種探針的每一種固定在固體支持物的不同區(qū)域。
65. 權(quán)利要求62-64中任一項的容器，其中對于同一種HPV類型特異 的每種探針檢測所述HPV目標(biāo)序列的不同部分。
66. 權(quán)利要求40-65中任一項的容器，其中至少一種探針種類存在于 固體支持物的至少兩個不同位置。
67. 權(quán)利要求40-66中任一項的容器，其中所有探針種類都存在于固 體支持物的至少兩個不同位置。
68. 權(quán)利要求40-67中任一項的容器，其還包括在固體支持物上的一 種或多種對照序列。
69. 權(quán)利要求68的容器，其中所述對照序列包括固定在固體支持物 上不與任何HPV類型的目標(biāo)序列雜交的探針。
70. 權(quán)利要求68的容器，其中所述對照序列包括人類基因組的目標(biāo) 序列。
71. 權(quán)利要求70的容器，其中所述人類目標(biāo)序列包括至少CFTR基 因的片段。
72. 用于檢測并且分析HPV類型的試劑盒，其包括權(quán)利要求40-71中 任一項的反應(yīng)容器，與下述一項或多項組合i) 用于DNA提取和/或純化的試劑；ii) 核酸擴增混合物；iii) 用于顯現(xiàn)核酸與反應(yīng)容器的探針雜交的試劑。
73. 權(quán)利要求72的試劑盒，其中所述擴增混合物是在與包括具有HPV 類型-特異性探針的固體支持物的反應(yīng)容器分開的反應(yīng)容器中提供。
74. 權(quán)利要求72的試劑盒，其中所述擴增混合物是在包括具有HPV 類型-特異性探針的固體支持物的反應(yīng)容器中提供。
75. 權(quán)利要求72-74中任一項的試劑盒，其中所述擴增混合物包括標(biāo) 記的dNTPs。
76. 權(quán)利要求72-75中任一項的試劑盒，其中所述擴增混合物包括與 HPV目標(biāo)序列的片段雜交的HPV共有引物。
77. 權(quán)利要求76的試劑盒，其中所述HPV共有引物包括MY09和 MY11;和任選地HMBOl。
78. 權(quán)利要求72-77中任一項的試劑盒，其中所述擴增混合物包括用 于擴增人目標(biāo)序列的引物。
79. 權(quán)利要求78的試劑盒，其中所述人目標(biāo)序列與HPV目標(biāo)序列長度不同。
80. 權(quán)利要求78或79的試劑盒，其中所述人目標(biāo)序列是至少CFTR基因的片段。
81. 權(quán)利要求SO的試劑盒，其中所述引物包括CFTR-F4(SEQIDNO 134)和CFTR-R5 (SEQ ID NO 135)的至少一種。
82. 權(quán)利要求76-81中任一項的試劑盒，其中所述引物是標(biāo)記的引物。
83. 權(quán)利要求72-82中任一項的試劑盒，其包括對照擴增目標(biāo)序列。
84. 權(quán)利要求83的試劑盒，其中對照擴增目標(biāo)序列包括與人目標(biāo)序 列的側(cè)翼部分相對應(yīng)的序列，以致使用相同的引物將發(fā)生兩種目標(biāo)序列的 擴增。
85. 用于檢測并且分析HPV類型的探針，所述探針選自SEQ ID NO 1-133。
86. 權(quán)利要求85的探針，其選自下述SEQIDs:2,4,7，8，9, 12, 13, 16， 17， 18, 19, 20， 21, 24, 25, 26, 27, 30, 31, 32， 33, 36, 37， 40, 41, 42， 43， 45， 48, 49， 50， 51, 52, 53, 54, 57， 58, 59, 61， 62， 63, 64， 66, 67, 68， 70， 71, 73, 74, 75， 76, 81， 82, 83， 84, 85, 86， 87, 88， 89, 91， 92， 93, 94, 95, 96, 97, 100, 101， 102, 103, 104, 105， 106, 107, 108, 109, 110, 112, 114, 115, 116， 117, 118, 119, 120, 121， 124， 126， 128, 129， 130, 131, 132, 133。
87. 用于擴增CFTR的引物，所述引物選自CFTR-F4(SEQIDNO 134) 和CFTR-R5 (SEQ ID NO 135)。
全文摘要
本發(fā)明描述用于檢測并且分析樣品中的HPV的類型的方法和試劑盒，其為用于所述方法的反應(yīng)容器。通用HPV引物用來通過PCR擴增樣品；然后將擴增的樣品與HPV類型-特異性探針的點陣雜交，以確定所述HPV的類型。
文檔編號C12Q1/70GK101379196SQ200680037144
公開日2009年3月4日 申請日期2006年8月4日 優(yōu)先權(quán)日2005年8月5日
發(fā)明者伊雷妮·加斯孔·埃斯科瓦爾, 比利亞埃爾莫薩·賈因·瑪麗亞·路易莎 申請人:基諾米加公司