專利名稱：：用于減輕肌肉炎癥的乳清生長(zhǎng)因子提取物的組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生產(chǎn)用作營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑的包含乳制品的組合物。更具體地，本發(fā)明涉及包含乳清生長(zhǎng)因子提取物(wheygrowthfactorextract,WGFE)的組合物，及其在減輕進(jìn)行抗阻運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練的個(gè)體中肌肉炎癥的方法中的用途。
背景技術(shù)：
：應(yīng)當(dāng)才艮據(jù)本領(lǐng)域的當(dāng)前狀況來(lái)理解本發(fā)明。然而，以下論述并不^1承認(rèn)所引用的任何資料在本申請(qǐng)優(yōu)先權(quán)日時(shí)已在澳大利亞公開(kāi)、使用或者作為公知常識(shí)的一部分。對(duì)人甚至動(dòng)物應(yīng)用營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑以改善總體健康或者提高例如運(yùn)動(dòng)成績(jī)是公知的。營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑并不意在提供完全飲食所必需的所有營(yíng)養(yǎng)，而是通常旨在補(bǔ)充飲食攝入以使?fàn)I養(yǎng)更加全面。已經(jīng)認(rèn)識(shí)到維生素、礦物質(zhì)和在這種補(bǔ)充劑中存在的其它物質(zhì)發(fā)揮著重要的生理作用，并且某些維生素、礦物質(zhì)和/或其他補(bǔ)充劑成分的缺乏已經(jīng)與某些疾病的發(fā)生、總體健康的下降或運(yùn)動(dòng)成績(jī)的降低聯(lián)系起來(lái)。相反，已知營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑在多種條件下增強(qiáng)多種生理狀態(tài)。營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑有許多目標(biāo)對(duì)象，例如生病的患者、康復(fù)中的患者、老年人以及執(zhí)行高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)方案的希望提高成績(jī)和/或從這種運(yùn)動(dòng)中得到恢復(fù)的人。參加健身的人和參加高強(qiáng)度體育運(yùn)動(dòng)的人的營(yíng)養(yǎng)需求是非常特殊的，無(wú)論是為了降低身體脂肪和增加無(wú)脂肪肌肉(leanmuscle)量，還是為了改善從高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)中的恢復(fù)都是如此?；謴?fù)包括克服運(yùn)動(dòng)所誘發(fā)炎癥的能力。炎癥是對(duì)組織損傷或破壞的局部應(yīng)答。其特征為急性型疼痛、熱、發(fā)紅、腫脹、和功能喪失。因此，降低肌肉炎癥包括但不限于降低肌肉中的任何一種或多種前述癥狀。炎性應(yīng)^#抗肌肉蛋白質(zhì)的合成，并且造成人在高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)(包括抗P且運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練)后1至2天所經(jīng)歷的大部分身體不適(MaclntyreDL等，SportsMed.1995;20(1):24-40;MaclntyreDL等，EurJApplPhysiol.2001;84(3):180-6)。如果炎癥嚴(yán)重的話，可以開(kāi)些抗炎藥物如皮質(zhì)類固醇。然而，應(yīng)用這些藥物可能造成有害的副作用，并且在許多情況下對(duì)于竟技運(yùn)動(dòng)員而言是禁用的。負(fù)重或抗阻運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練在活化的肌肉中引發(fā)廣泛的應(yīng)答。存在由肌肉牽張和勞損(stretchandstrain)以及由本地合成或在血流中循環(huán)的生長(zhǎng)因子所激活的合成代謝信號(hào)途徑。在活化位于肌肉床(musclebed)內(nèi)的干細(xì)胞(衛(wèi)星細(xì)胞)(Anderson&Wozniak，CanJPhysiolPharmacol.2004;82(5):300-10)快速增殖所需的細(xì)胞事件順序的調(diào)節(jié)中，調(diào)節(jié)多種基因的表達(dá)是必需的過(guò)程，所述細(xì)胞在增殖后成熟并最終與現(xiàn)有肌纖維融合或者連接在一起，產(chǎn)生新的肌纖維。衛(wèi)星細(xì)胞活化的調(diào)節(jié)因子包括多配體蛋白聚糖-3(Syndecan-3)(衛(wèi)星細(xì)胞增殖所必需的跨膜硫酸肝素蛋白聚糖)、Pax-7(衛(wèi)星細(xì)胞活化必需的和肌肉組織修復(fù)必需的蛋白質(zhì))(Seale等，DevBiol.2004;275(2):287-300,Cornelisonetal.,DevBiol.2001;239(l):79-94)。參與運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的肌肉修復(fù)和炎癥過(guò)程的其它基因包括小分子量趨化因子(CCL2和CCL4)和早期應(yīng)奪_基因jun-B和c-fos。如果可獲得對(duì)運(yùn)動(dòng)恢復(fù)具有有益效果的天然食品(比如來(lái)源于乳的產(chǎn)品)，那么它將是易于獲得并且安全的治療性補(bǔ)充劑。在現(xiàn)有技術(shù)中已知由保持在特定超免疫狀態(tài)的母牛生產(chǎn)乳制品，所述^fe疫狀態(tài)是通過(guò)用劑量足夠高的抗原實(shí)施周期性加強(qiáng)免疫所建立的，所述乳制品可用于治療多種疾病，包括關(guān)節(jié)炎、皮炎和腫瘤性疾病(EPO064103Al，BeckLR)。然而，正常牛乳中不包含存在于前i^免疫動(dòng)物所產(chǎn)生的乳中的特定'抗炎因子，，盡管相信它包^欣水平的其它抗炎因子。本領(lǐng)域的技術(shù)人員會(huì)理解，根據(jù)EP0064103Al生產(chǎn)抗炎乳制品是非常昂貴和耗時(shí)的。在現(xiàn)有技術(shù)中還已知生產(chǎn)抗炎的乳制品，所述乳制品中包含富含免疫球蛋白的初乳。初乳是在乳腺分泌物穩(wěn)定成乳之前，M后馬上產(chǎn)生的前期乳(pre-milk)。初期初乳在產(chǎn)犢后最初6小時(shí)內(nèi)獲得，其包含的蛋白質(zhì)是48小時(shí)后得自同一母牛的乳中的4倍。初乳的免疫球蛋白級(jí)分中含有抗體、乳鐵蛋白和免疫增強(qiáng)劑。乳鐵蛋白被認(rèn)為可增強(qiáng)初乳的抗炎效果，是美國(guó)專利6,475,511(GohlkeMB)的主題。認(rèn)為免疫球蛋白在消化道中發(fā)揮局部免疫功能。蛋白質(zhì)補(bǔ)充劑已被進(jìn)行阻抗運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練的人廣泛使用，以促進(jìn)肌肉蛋白質(zhì)合成，從而修復(fù)肌肉組織和促進(jìn)肌肉生長(zhǎng)。營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑可以以飲品或食品的形式提供，包括應(yīng)用時(shí)與液體混合的蛋白質(zhì)粉、營(yíng)養(yǎng)唪和點(diǎn)心(snackfood)、片劑、膠嚢和其它制品。市售的合適蛋白質(zhì)源包括水解的乳蛋白質(zhì)、i^白酸鹽、大豆蛋白分離物和M濾的脫脂乳制備的乳蛋白濃縮物。也可以利用基于其它蛋白質(zhì)源(如乳清蛋白質(zhì))的營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑，并且可以以果汁的形式提供，但是認(rèn)為這是不夠的，因?yàn)樗鼈兾赐瑫r(shí)提供脂質(zhì)源(WO02/15720)。此外，還考慮到一些來(lái)源于乳的蛋白質(zhì)不易被腸吸收，或者不能承受消化系統(tǒng)的嚴(yán)苛環(huán)境，從而不具有治療作用。乳清生長(zhǎng)因子提取物就是這樣一種乳制品，認(rèn)為其在攝入后，由于分子比如生長(zhǎng)因子的斷裂而易于至少部分喪失生物活性。此外，由于其分離方法，WGFE僅含有低水平的免疫球蛋白，如上所述，免疫球z蛋白被i人為是重要的抗炎因子。盡管如此，有報(bào)導(dǎo)說(shuō)乳清蛋白質(zhì)補(bǔ)充劑能夠在參加抗阻運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練的人中提供益處。已有報(bào)導(dǎo)說(shuō)參加健身的人可利用乳清蛋白質(zhì)分離物(wheyproteinisolate,WPI)和乳蛋白分離物(milkproteinisolate,MPI)(均與乳清生長(zhǎng)因子提取物的組成不同)快速獲得無(wú)脂肪肌肉量/尺寸并減少身體脂肪。WPI富含支鏈氨基酸，被認(rèn)為是"快速"發(fā)揮作用的，而MPI主要是酪蛋白，代謝較慢并且有效促進(jìn)肌肉生長(zhǎng)。在大鼠模型中應(yīng)用WPI或乳清蛋白濃縮物與#^酸谷氨酰胺、亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸的組合以改善肌肉疲勞是WO2004/049830Al(TsuchitaH等)的主題。該作者測(cè)量來(lái)自比目魚肌的酪氨酸釋ii作為疲勞的指標(biāo)。本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)，包含乳清生長(zhǎng)因子提取物的組合物可改變與運(yùn)動(dòng)誘發(fā)的肌肉炎癥相關(guān)的基因表達(dá)。在本發(fā)明人進(jìn)行的另一研究中，施用了乳清生長(zhǎng)因子提取物的受訓(xùn)運(yùn)動(dòng)員報(bào)告其運(yùn)動(dòng)后的酸痛降低。重要的是，根據(jù)本發(fā)明，可以從普通的散裝乳制品(bulkmilkproduct)中分離乳清生長(zhǎng)因子提取物，而無(wú)需使母牛保持在超免疫狀態(tài)或者收集相對(duì)于其它乳制品而言供應(yīng)有限的初乳。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明涉及WGFE組合物和應(yīng)用所述組合物使進(jìn)行抗阻運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練的人降低其肌肉炎癥水平的方法，所述肌肉炎癥水平的降低超過(guò)現(xiàn)有技術(shù)中組合物所獲得的降低。因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種組合物及其使用方法，與現(xiàn)有技術(shù)中的組合物相比，本發(fā)明的組合物在降低肌肉炎癥方面有所改善/更有效。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供降低骨格肌炎癥的組合物，其中包含乳清生長(zhǎng)因子拔:取物，所述乳清生長(zhǎng)因子^^取物通過(guò)陽(yáng)離子交換層析分離自乳制品。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供肌肉抗炎組合物，其中包含乳清生長(zhǎng)因子^取物，所述乳清生長(zhǎng)因子提取物通過(guò)包括以下步驟的方法分離自乳制p口ra)將所述乳制品應(yīng)用于SPSepharose陽(yáng)離子交換柱，b)用低離子強(qiáng)度的緩沖液洗滌該柱，c)在pH6.5下用緩沖液洗脫WGFE級(jí)分，該緩沖液包含0.4-0.5M的NaCl或者相當(dāng)?shù)碾x子強(qiáng)度。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供肌肉抗炎組合物，其中包含乳清生長(zhǎng)因子拔^取物，所述乳清生長(zhǎng)因子揭:取物通過(guò)包括以下步驟的方法分離自乳制品a)將所述乳制品應(yīng)用于SPSepharose陽(yáng)離子交換柱，b)用包含0.008M或更低濃度NaCl的緩沖液洗滌該柱，c)在pH6.5下用緩沖液洗脫WGFE級(jí)分，該緩沖液包含0.4M的NaCl或者相當(dāng)?shù)碾x子強(qiáng)度。在本發(fā)明的另一方面中，提供根據(jù)上述的組合物，其中所述乳清生長(zhǎng)因子提取物從選自以下的乳制品中分離全乳、干酪乳清、凝乳酶酪蛋白乳清(rennetcaseinwhey)、酸性M白乳清或其濃縮物或者脫脂乳。在本發(fā)明的另一方面中，提供根據(jù)上述的組合物，其用作肌肉抗炎劑。在本發(fā)明的另一方面中，提供降低進(jìn)行抗阻運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練的受試者中骨骼肌炎癥的方法，其包括對(duì)該受試者施用有效量的包含乳清生長(zhǎng)因子拔_取物的纟且合物。在本發(fā)明的另一方面中，提供降低進(jìn)行抗阻運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練的受試者中骨骼肌炎癥的方法，其包括對(duì)該受試者施用有效量的包含乳清生長(zhǎng)因子提取物的組合物，所述乳清生長(zhǎng)因子提取物通過(guò)包括以下步驟的方法分離自乳制a)將所述乳制品應(yīng)用于SPSepharose陽(yáng)離子交換柱，b)用低離子強(qiáng)度的緩沖液洗滌該柱，c)在pH6.5下用緩沖液洗脫WGFE級(jí)分，該緩沖液包含0.4-0.5M的NaCl或者相當(dāng)?shù)碾x子強(qiáng)度。在本發(fā)明的另一方面中，提供降低進(jìn)行抗阻運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練的受試者中骨骼肌炎癥的方法，其包括向該受試者施用有效量的包含乳清生長(zhǎng)因子提取物的組合物，所述乳清生長(zhǎng)因子提取物通過(guò)包括以下步驟的方法分離自乳制p口a)將所述乳制品應(yīng)用于SPSepharose陽(yáng)離子交換柱，b)用包含0.008M或更低濃度NaCl的緩沖液洗滌該柱，c)在pH6.5下用緩沖液洗脫WGFE級(jí)分，該緩沖液包含0.4M的NaCl或者相當(dāng)?shù)碾x子強(qiáng)度。在本發(fā)明的另一方面中，提供降低進(jìn)行抗阻運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練的受試者中骨骼肌炎癥的方法，其中每日劑量中所施用的乳清生長(zhǎng)因子提取物為至少5mg/kg體重至12.5mg/kg體重。優(yōu)選地，乳清生長(zhǎng)因子提取物的日劑量為至少25mg/kg體重。在本發(fā)明的另一方面中，拔:供通過(guò)陽(yáng)離子交換層析分離自乳制品的乳清生長(zhǎng)因子提取物用于生產(chǎn)藥物的用途，所述藥物用于治療需要降低骨骼肌炎癥的受試者。在本發(fā)明的另一方面中，提供通過(guò)上述方法分離自乳制品的乳清生長(zhǎng)因子提取物用于生產(chǎn)藥物的用途，所述藥物用于治療需要降低骨骼肌炎癥的受試者。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供包含乳清生長(zhǎng)因子提取物和其他蛋白質(zhì)源的降低骨骼肌炎癥的組合物，所述乳清生長(zhǎng)因子4C取物通過(guò)陽(yáng)離子交換層析分離自乳制品。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，所述其他蛋白質(zhì)源是乳清蛋白質(zhì)，優(yōu)選乳清蛋白質(zhì)分離物(WPI)，更優(yōu)選包含以下的乳清蛋白質(zhì)分離物水分5.0%脂肪0.5%pH(5%溶液)6.3灰分3.7%乳糖0.5%蛋白質(zhì)(TNx6.38)卯.0%鈉0.7%磷0.3%釣0.15%在本發(fā)明的另一方面中，提供降低進(jìn)行抗阻運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練的受試者中骨骼肌炎癥的方法，包括對(duì)所述受試者施用有效量的組合物，所述組合物包含乳清生長(zhǎng)因子提取物和其他蛋白質(zhì)源，例如乳清，優(yōu)選WPI。在本發(fā)明的另一方面中，提供降低進(jìn)行抗阻運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練的受試者中肌肉炎癥的方法，包括對(duì)所述受試者施用組合物，所述組合物含有效量的乳清生長(zhǎng)因子提取物以及分開(kāi)攝入的其他蛋白質(zhì)源，所述提取物通過(guò)陽(yáng)離子交換層析分離自乳制品。優(yōu)選地，每日劑量中所施用的其他蛋白質(zhì)源為至少225mg/kg體重(干重)，優(yōu)選至少435mg/kg體重(干重)。在本發(fā)明的另一方面中，本發(fā)明的組合物每?jī)商旎蛉煲淮沃炼噙_(dá)每天至少一次地施用，優(yōu)選在抗阻運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練之前施用和/或之后立即施用、更優(yōu)選在抗阻運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練之后立即施用、最優(yōu)選在運(yùn)動(dòng)之后20分鐘至2小時(shí)施用。在本發(fā)明的另一方面中，提供通過(guò)陽(yáng)離子交換層析分離自乳制品的乳清生長(zhǎng)因子提取物和其他蛋白質(zhì)源用于生產(chǎn)藥物的用途，所述藥物用于治療需要降低骨骼肌炎癥的受試者。在本發(fā)明的另一方面中，提供包含本發(fā)明組合物的食品或飲品，其用于降低進(jìn)行抗阻運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練的受試者中骨骼肌炎癥的方法中。在本發(fā)明另一方面中，提供本發(fā)明組合物用于生產(chǎn)降低進(jìn)行抗阻運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練的受試者中骨骼肌炎癥的食品或飲品的用途。圖1:在試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)(訓(xùn)練前)和用20gWPI(A組)、1gWGFE+20gWPI(Bl纟且)、或2gWGFE+20gWPI(B2纟且)處理12周后(訓(xùn)練后)，在靜息時(shí)和3小時(shí)抗阻運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練后成年受試者股外側(cè)肌中MyoD、肌細(xì)胞生成素(myogenin)和肌細(xì)胞抑制素(myostatin)基因(mRNA)表達(dá)的倍數(shù)變化。結(jié)果表示為平均值士SEM。圖2:在試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)(訓(xùn)練前)和用20gWPI(A組)、1gWGFE+20gWPI(Bl組)、或2gWGFE+20gWPI(B2組)處理12周后(訓(xùn)練后)，在靜息時(shí)和3小時(shí)抗阻運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練后成年受試者股外側(cè)肌中Pax7和多配體蛋白聚糖3基因(mRNA)表達(dá)的倍數(shù)變化。結(jié)果表示為平均值±SEM。圖3:試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)(訓(xùn)練前)和用20gWPI(A組)、lgWGFE+20gWPI(Bl組)、或2gWGFE+20gWPI(B2組)處理12周后(訓(xùn)練后)，通過(guò)免疫組織化學(xué)染色分析所顯示的來(lái)自3小時(shí)抗阻運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練后成年受試者股外側(cè)肌組織切片中Pax7陽(yáng)性核的百分比。圖4:試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)(訓(xùn)練前)和用20gWPI(A組)、lgWGFE+20gWPI(Bl組)、或2gWGFE+20gWPI(B2組)處理12周后(訓(xùn)練后)，在靜息時(shí)和3小時(shí)抗阻運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練后成年受試者股外側(cè)肌中IGF-1結(jié)合蛋白4和5基因(mRNA)表達(dá)的倍數(shù)變化。結(jié)絲示為平均值士SEM。圖5:試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)(訓(xùn)練前)和用20gWPI(A組)、1gWGFE+20gWPI(Bl組)、或2gWGFE+20gWPI(B2組)處理12周后(訓(xùn)練后)，在靜息時(shí)和3小時(shí)抗阻運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練后成年受試者股外側(cè)肌中JunB和c-fos基因(mRNA)表達(dá)的倍數(shù)變化。結(jié)果表示為平均值士SEM。圖6:試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)(訓(xùn)練前)和用20gWPI(A組)、1gWGFE+20gWPI(Bl組)、或2gWGFE+20gWPI(B2組)處理12周后(訓(xùn)練后)，在靜息時(shí)和3小時(shí)抗阻運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練后成年受試者股外側(cè)肌中CCL2、4和7基因(mRNA)表達(dá)的倍數(shù)變化。結(jié)果表示為平均值士SEM。圖7:接觸脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)并在初乳(樣品2BC)、100mg/mlWPI(樣品4BC)、100mg/mlWGFE(樣品6BC)、多種乳級(jí)分或者僅LPS(對(duì)照)存在下培養(yǎng)的RAW細(xì)胞的TNF-a產(chǎn)生(ng/ml)。還向培養(yǎng)物中同時(shí)加入WGFE和LPS(樣品WGFE+LPS)。圖示的值表示在3次獨(dú)立試驗(yàn)中獲得的平均應(yīng)答的算術(shù)平均值士SEM。圖8:接觸脂多糖(LPS)并在100mg/mlWPI或100mg/mlWGFE存在下培養(yǎng)的RAW細(xì)胞的TNF-a產(chǎn)生(ng/ml)的比較。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及包含WGFE的組合物及其使進(jìn)行抗阻運(yùn)動(dòng)的受試者能夠降低其肌肉炎癥水平的用途，所述炎癥水平的降低超過(guò)現(xiàn)有技術(shù)中的組合物所能達(dá)到的降低。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供包含乳清生長(zhǎng)因子提取物的降低骨骼肌炎癥的組合物，所述乳清生長(zhǎng)因子提取物通過(guò)陽(yáng)離子交換層析分離自乳制品。用于本發(fā)明的乳清生長(zhǎng)因子提取物可以通過(guò)例如澳大利亞專利號(hào)645589(PCT/AU91/00303)(其通過(guò)參考并入本文)中所述方法分離自乳、脫脂乳、乳衍生物、乳清、初乳和初乳衍生物。這種方法基本上依賴于強(qiáng)陽(yáng)離子交換層析iMM刀始材料中選擇性提^5成性蛋白質(zhì)，從而組成乳清生長(zhǎng)因子提取物。產(chǎn)生WGFE級(jí)分的方法生產(chǎn)用于本發(fā)明的WGFE的一種優(yōu)選方法是使用裝有SP(磺丙基)Sepharose的柱。對(duì)該柱應(yīng)用乳制品(優(yōu)選脫脂乳)流，直至所應(yīng)用的乳體積達(dá)到"柱中的樹脂體積的高達(dá)1000倍。用低離子強(qiáng)度(<0.008MNaCl或相當(dāng))的緩沖液去除柱中殘留的乳10分鐘。用緩沖液從所述柱中洗脫WGFE級(jí)分，該緩沖液包含相當(dāng)于0.4-0.5MNaCl(然而其它陽(yáng)離子也是適合的)、最優(yōu)選0.4MNaCl的鈉離子。流動(dòng)相可具有4艮寬的pH范圍，比如4.5-9.0，優(yōu)選5.5-7.5，最優(yōu)選約6.5。在上限和下限時(shí)，蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和蛋白質(zhì)結(jié)合陽(yáng)離子交換樹脂的能力都受到影響。5.5-7.5范圍內(nèi)的pH提供最高WGFE產(chǎn)率。適于吸附WGFE組分的陽(yáng)離子交換樹脂類型可以包括如Sepharose陽(yáng)離子交換樹脂珠之類的樹脂。例如，分別包含磺丙基官能團(tuán)和羧甲基基團(tuán)的SPSepharoseBigBeads和CMSepharose珠(GEHealthcare的產(chǎn)品)是適合的。陽(yáng)離子交換樹脂珠的大小優(yōu)選為45-300nm。對(duì)于本發(fā)明的WGFE純化而言，45-165和100-300范圍內(nèi)的兩種SPS印harose輛是適合的?？蓪?duì)WGFE級(jí)分進(jìn)行的進(jìn)一步處理之一是通過(guò)如透析或超濾進(jìn)行脫鹽。因此，在本發(fā)明的另一方面中，提供根據(jù)上述的組合物，其中所述乳清生長(zhǎng)因子提取物分離自乳清或脫脂乳。用作初始材料的乳清可以是干酪乳清、凝乳酶酪蛋白乳清、酸性酪蛋白乳清或其濃縮物。用于本發(fā)明的乳清生長(zhǎng)因子提取物和蛋白質(zhì)源的量應(yīng)足以降低肌肉炎癥或者具有療效。在本發(fā)明的另一方面中，提供給藥方案，其中每日劑量中施用的乳清生長(zhǎng)因子提取物為至少5mg/kg體重至12.5mg/kg體重。優(yōu)選地，乳清生長(zhǎng)因子提取物的日劑量為至少25mg/kg體重。在本發(fā)明的另一方面中，提供降低進(jìn)行抗P且運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練受試者中骨骼肌炎癥的方法，包括對(duì)所述受試者施用有效量的包含乳清生長(zhǎng)因子提取物的組合物。與僅施用蛋白質(zhì)源的受試者相比，當(dāng)所述組合物包含其他蛋白質(zhì)源(可以是任何適于消費(fèi)的蛋白質(zhì)源，比如WPI)時(shí)，運(yùn)動(dòng)后肌肉炎癥降低。所述蛋白質(zhì)源可得自全乳，優(yōu)選得自乳清蛋白質(zhì)，更優(yōu)選得自乳清蛋白質(zhì)分離物(WPI)?？蓮腗urrayGoulburnCoOpCompanyLtd.購(gòu)得商品名為NatraProTM的這樣一種乳清蛋白質(zhì)分離物。NatraProTMWPI的典型組成包括水分5.0%脂肪0.5%pH(5%溶液)6.3灰分3.7%乳糖0.5%蛋白質(zhì)(TNx6.38)卯.0%鈉0.7%磷0.3%鈣0.15%優(yōu)選地，本發(fā)明的組合物還包含蛋白質(zhì)源，并且在給藥方案中，每日劑量中所施用的其他蛋白質(zhì)源為至少225mg/kg體重(干重)，優(yōu)選至少435mg/kg體重(干重)。所述其他蛋白質(zhì)源可以與WGFE組合物配制在一起，或者配制成與WGFE組合物分開(kāi)施用。在本發(fā)明的另一方面中，提供乳清生長(zhǎng)因子提取物用于生產(chǎn)藥物的用途，所述藥物用于治療需要降低骨骼肌炎癥的受試者。例如，運(yùn)動(dòng)員可能需要抗阻運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練以加強(qiáng)其肌肉力量，從而提高成績(jī)，或者克服引^肉萎縮的虛弱性損傷。肌肉炎癥可由例如腿部淤血('corked'thigh)或者肌肉撕裂引起。包含本發(fā)明組合物的藥物還可以幫助所述受試者迅速恢復(fù)，從而恢復(fù)訓(xùn)練和/或參加竟賽。在有挫傷傾向的受試者比如老年人中也可能發(fā)生肌肉炎癥。在本發(fā)明的另一方面中，提供降低進(jìn)行抗阻運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練的受試者中骨骼肌炎癥的方法，包括對(duì)該受試者施用有效量的包含乳清生長(zhǎng)因子提取物和其他蛋白質(zhì)源的組合物。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的是，可以在訓(xùn)練當(dāng)天或者訓(xùn)練當(dāng)天和/或其它時(shí)間施用本發(fā)明的組合物，只要施用方案導(dǎo)致骨骼肌炎癥降低即可。優(yōu)選在運(yùn)動(dòng)當(dāng)天施用，更優(yōu)選'f^fcf在運(yùn)動(dòng)之前施用和/或運(yùn)動(dòng)之后立即施用。更優(yōu)選在運(yùn)動(dòng)后20分鐘至2小時(shí)進(jìn)行施用。因此，在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方面中，提供如上所述的方法，其中在運(yùn)動(dòng)之后立即施用。與僅施用WPI的受試者相比，在抗P且運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練之后立即施用1gWGFE加20gWPI或者2gWGFE加20gWPI的受試者顯示出炎癥相關(guān)基因表達(dá)調(diào)節(jié)的提高(見(jiàn)實(shí)施例和結(jié)果)。此外，與施用WPI的受試者相比，施用WGFE的受試者報(bào)告運(yùn)動(dòng)后酸痛減輕，這支持WGFE在減輕運(yùn)動(dòng)后肌肉炎癥方面的作用。此外，本發(fā)明的組合物可用于在期望降低肌肉炎癥的非人類哺乳動(dòng)物如馬、靈緹犬(greyhound)等中降低肌肉炎癥。在本發(fā)明的另一方面中，提供包含本發(fā)明組合物的食品或飲品，其用于降低進(jìn)行抗阻運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練的受試者中骨骼肌炎癥的方法。在本發(fā)明另一方面中，提供本發(fā)明組合物用于生產(chǎn)降低進(jìn)行抗阻運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練的受試者中骨骼肌炎癥的食品或飲品的用途。WPI通常包含約卯％(重量/體積)蛋白質(zhì)；因此，20gWPI包含約18g蛋白質(zhì)作為營(yíng)養(yǎng)源。乳清生長(zhǎng)因子提取物通常包含約85%(重量/體積)蛋白質(zhì)；因此，2g乳清生長(zhǎng)因子提取物包含約1.7g蛋白質(zhì)作為營(yíng)養(yǎng)源。應(yīng)當(dāng)理解，在本文中描述的發(fā)明并不僅限于所公開(kāi)的具體特征實(shí)施例。實(shí)施例實(shí)蘑伊M.游床微實(shí)施了一項(xiàng)臨床試驗(yàn)，其中20名年輕男性參加了三個(gè)月的隨機(jī)雙盲抗阻訓(xùn)練計(jì)劃。根據(jù)澳大利亞專利號(hào)645589(PCT/AU91/00303)概括描述的方法(更詳細(xì)描述見(jiàn)上文)制備乳清生長(zhǎng)因子提取物。每種乳清蛋白質(zhì)制劑均包^^人工^^未劑(NutrasweetTM，NutrasweetCompany,USA)。在每次運(yùn)動(dòng)(exercisesession)后立即服用乳清蛋白質(zhì)制劑，每個(gè)受試者在監(jiān)督下每周完成三次運(yùn)動(dòng)。將受試者隨機(jī)分配至三個(gè)補(bǔ)充劑組之一A組20gNatraPro(WPI)/劑量；n-7Bl組20gNatraPro(WPI)加1gWGFE/劑量；n=6B2組20gNatraPro(WPI)加2gWGFE/劑量；n=7NatraProTMWPI的典型組成包括水分5.0%脂肪0.5%pH(5。/。溶液)6.3灰分3.7%乳糖0.5%蛋白質(zhì)(TNx6.38)卯.0%鈉0.7%磷0.3%鉀0.15%肌肉分析應(yīng)用透皮針活檢技術(shù)從右腿股外側(cè)肌收集肌肉樣品。對(duì)切下的肌肉組織進(jìn)行目測(cè)檢查，仔細(xì)地解剖去除任何脂肪或結(jié)締組織，通過(guò)吸附去除多余的血，并立即冷凍在液氮中用于后續(xù)分析。將一部分肌肉組織包埋在水性包埋^h質(zhì)中，并在用液氮冷卻的異戊烷中冷凍，用于后續(xù)的免疫組織化學(xué)分析。免戯織化學(xué)M個(gè)樣品的連續(xù)切片(10nm)包埋在顯微鏡載片上，用于M^蛋白重鏈纖維類型的分析?；贐ehan的方案，應(yīng)用基于M^蛋白快和慢亞型的免疫組織化學(xué)技術(shù)*查纖維類型分布以及肌肉橫截面積。使用標(biāo)準(zhǔn)免細(xì)鄉(xiāng)《基絲這分析根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明書使用TOTALLYRNA試劑盒和試劑(AmbionInc.)從骨骼Rtt品中提取RNA。使用Agilent2100生物分析儀(AgilentTechnologies,Inc.)測(cè)定總RNA濃度和質(zhì)量。隨后，使用AMV逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒方案和試劑(Promega)將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。應(yīng)用經(jīng)PrimerExpress2.0軟件設(shè)計(jì)的基因特異性引物在AppliedBiosystems7500實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)上實(shí)施基因表達(dá)分析。節(jié)度教分析應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)western印跡技術(shù)和針對(duì)4M^蛋白重鏈蛋白亞型共同節(jié)段的抗體(Zymed)來(lái)檢查總Ji/L^蛋白重鏈蛋白質(zhì)含量。結(jié)果結(jié)果表示為平均值士SEM，使用Bonforoni事后檢驗(yàn)通過(guò)雙因素ANOVA計(jì)算顯著性。在訓(xùn)練之前和之后均未觀察到年齡、體重、身高或BMI值方面的顯著差異。表l-受試者特征<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>基因表達(dá)分析沒(méi)有觀察到訓(xùn)練或治療對(duì)MyoD和肌細(xì)胞生成素表達(dá)的一致影響，然而訓(xùn)練顯著提高了肌肉LIM蛋白(MLP)的表達(dá)(圖1)。Pax7和多配體蛋白聚糖3(衛(wèi)星細(xì)胞募集和增殖的兩種標(biāo)志物)的表達(dá)在訓(xùn)練12周后分別提高為2倍和7倍，并且蛋白質(zhì)表達(dá)數(shù)據(jù)對(duì)此也提供支持(圖2和3)。Bl組中IGFBP4和IGFBP5表達(dá)(圖4)在12周時(shí)應(yīng)答于劇烈運(yùn)動(dòng)而顯著提高。與肌肉炎癥相關(guān)的早期應(yīng)答基因jun-B和c-fos的運(yùn)動(dòng)后正常上調(diào)在Bl和B2補(bǔ)充劑組中均有所減弱，提示在這些組中應(yīng)^Jl應(yīng)減少(圖5)(ChenYW等，JApp.Physiol.2003;95(6):2485-94)。在12周時(shí)，與對(duì)照A組相比，在B1組和B2組中，CCL4和CCL7的靜息和運(yùn)動(dòng)后表達(dá)水平在單次抗阻運(yùn)動(dòng)之后均(顯著)提高(圖6)。實(shí)施例2:WGFE對(duì)RAW細(xì)胞中LPS誘導(dǎo)的TNF-a表達(dá)的影響實(shí)施體外研究以測(cè)試各種乳制品級(jí)分對(duì)RAW細(xì)胞中LPS誘導(dǎo)的促炎a-TNF表達(dá)的影響。在LPS存在下培養(yǎng)RAW細(xì)胞，1^添加初乳(樣品2BC)、100mg/mlWPI(樣品4BC)、100mg/mlWGFE(樣品6BC)、多種乳級(jí)分。在一個(gè)樣品中，在LPS刺激之后不添加乳制品(陽(yáng)性對(duì)照)。還將WGFE和LPS同時(shí)添加到培養(yǎng)物中(樣品WGFE+LPS)。圖示數(shù)值表示在3次獨(dú)立試驗(yàn)中獲得的平均^JI的算術(shù)平均值士SEM(圖7)。比較WGFE和WPI抑制LPS誘發(fā)的TNF-a表達(dá)的效果(圖8)。按照實(shí)施例1制備乳清生長(zhǎng)因子提取物。數(shù)據(jù)支持WGFE降低抗l!Bit動(dòng)訓(xùn)練之后的肌肉炎癥反應(yīng)。體外數(shù)據(jù)提示，WGFE通過(guò)抑制TNF-a表達(dá)來(lái)降低炎癥。數(shù)據(jù)還支持，WGFE與其他蛋白質(zhì)源如WPI組合時(shí)降低運(yùn)動(dòng)后炎性應(yīng)答的程度高于僅施用WPI(—種已知由進(jìn)行抗阻運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練的受試者使用的蛋白質(zhì)源)時(shí)所觀察到的降低。權(quán)利要求1.一種肌肉抗炎組合物，其中包含乳清生長(zhǎng)因子提取物，所述乳清生長(zhǎng)因子提取物通過(guò)陽(yáng)離子交換層析分離自乳制品。2.—種肌肉抗炎組合物，其中包含乳清生長(zhǎng)因子提取物，所述乳清生長(zhǎng)因子提取物通過(guò)包括以下步驟的方法分離自乳制品a)將所述乳制品應(yīng)用于SPSepharose陽(yáng)離子交換柱，b)用低離子強(qiáng)度的緩沖液洗滌該柱，c)在pH6.5下用緩沖液洗脫WGFE級(jí)分，該緩沖液包含0.4-0.5M的NaCl或者相當(dāng)?shù)碾x子強(qiáng)度。3.—種肌肉抗炎組合物，其中包含乳清生長(zhǎng)因子提取物，所述乳清生長(zhǎng)因子^l取物通過(guò)包括以下步驟的方法分離自脫脂乳a)將所述脫脂乳應(yīng)用于SPSepharose陽(yáng)離子交換柱，b)用低于0.008MNaCl的緩沖液洗滌該柱，c)在pH6.5下用包含0.4MNaCl的緩沖液洗脫WGFE級(jí)分。4.權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)的肌肉抗炎組合物，所述組合物還包含其他蛋白質(zhì)源。5.權(quán)利要求4的組合物，其中所述蛋白質(zhì)源是乳清蛋白質(zhì)。6.權(quán)利要求5的組合物，其中所述乳清蛋白質(zhì)是乳清蛋白質(zhì)分離物(WPI)。7.權(quán)利要求6的組合物，其中所述乳清蛋白質(zhì)分離物包含水分5.0%脂肪0.5%pH(5。/o溶液)6.3灰分3.7%乳糖0.5%蛋白質(zhì)(TNx6.38)90.0%鈉0.7%磷0.3%鉀0.15%。8.權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)的組合物，其中所述乳清生長(zhǎng)因子提取物分離自干酪乳清、凝乳酶酪蛋白乳清、酸性酪蛋白乳清或脫脂乳。9.權(quán)利要求8的組合物，其中所述乳清生長(zhǎng)因子提取物分離自脫脂乳。10.權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)的組合物，其用作肌肉抗炎劑。11.降低進(jìn)行抗阻運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練的受試者中肌肉炎癥的方法，其包括對(duì)所述受試者施用權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)的組合物，所述組合物中包含有效量的乳清生長(zhǎng)因子提取物。12.權(quán)利要求11的方法，其中所述組合物以至少5mg/kg體重至12.5mg/kg體重的乳清生長(zhǎng)因子提取物、優(yōu)選至少25mg/kg體重的乳清生長(zhǎng)因子提取物的日劑量施用。13.權(quán)利要求11或12的方法，其中所述組合物包含其他蛋白質(zhì)源。14.降低進(jìn)行抗PJii:動(dòng)訓(xùn)練的受試者中肌肉炎癥的方法，包括對(duì)所述受試者施用組合物，所述組合物中包含有效量的乳清生長(zhǎng)因子提取物以及分開(kāi)攝入的其他蛋白質(zhì)源，所述乳清生長(zhǎng)因子提取物通過(guò)陽(yáng)離子交換層析分離自乳制品。15.權(quán)利要求13或14的方法，其中所述組合物以至少5mg/kg體重至12.5mg/kg體重的乳清生長(zhǎng)因子提取物、優(yōu)選至少25mg/kg體重的乳清生長(zhǎng)因子提取物，以及至少225mg/kg體重的其他蛋白質(zhì)源的日劑量施用。16.權(quán)利要求15的方法，其中所述其他蛋白質(zhì)源為權(quán)利要求5至7中任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)源。17.權(quán)利要求11至16中任一項(xiàng)的方法，其中所述對(duì)受試者的施用每2天或3天一次至多達(dá)每天至少一次地it行。18.權(quán)利要求11至16中任一項(xiàng)的方法，其中所述對(duì)受試者的施用在抗阻運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練之前進(jìn)行和/或之后立即進(jìn)行。19.權(quán)利要求11至16中任一項(xiàng)的方法，其中所述施用在抗阻運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練之后立即進(jìn)行。20.權(quán)利要求18的方法，其中所述施用在運(yùn)動(dòng)之后20分鐘至2小時(shí)進(jìn)行。21.乳清生長(zhǎng)因子提取物用于生產(chǎn)治療抗阻運(yùn)動(dòng)所誘發(fā)肌肉炎癥的藥物的用途，所述提取物通過(guò)陽(yáng)離子交換層析分離自乳制品。22.乳清生長(zhǎng)因子提取物用于生產(chǎn)治療抗阻運(yùn)動(dòng)所誘發(fā)肌肉炎癥的藥物的用途，所述提取物根據(jù)權(quán)利要求2或3的方法分離自乳制品。23.權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)的組合物用于生產(chǎn)治療抗阻運(yùn)動(dòng)所誘發(fā)肌肉炎癥的藥物的用途。24.用于權(quán)利要求11至20中任一項(xiàng)方法的包含權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)所述組合物的食品、飲品、片劑或膠嚢劑。25.權(quán)利要求24的食品，所述食品為營(yíng)##或點(diǎn)心的形式。26.權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)的組合物用于生產(chǎn)降低進(jìn)行抗阻運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練的受試者中肌肉炎癥的食品、飲品、片劑或膠囊劑的用途。27.肌肉抗炎組合物，其基本如說(shuō)明書實(shí)施例所述。28.乳清生長(zhǎng)因子提取物的用途，其基本如說(shuō)明書實(shí)施例所述。29.降低進(jìn)行抗PiLi^動(dòng)訓(xùn)練的受試者中肌肉炎癥的方法，其基本如說(shuō)明書實(shí)施例所述。全文摘要本發(fā)明涉及生產(chǎn)用作營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑的包含乳制品的組合物。更具體地，本發(fā)明涉及包含乳清生長(zhǎng)因子提取物的組合物，及其在減輕進(jìn)行抗阻運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練的個(gè)體中肌肉炎癥的方法中的用途。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供包含乳清生長(zhǎng)因子提取物的組合物用于減輕運(yùn)動(dòng)誘發(fā)的肌肉炎癥的用途，所述提取物通過(guò)陽(yáng)離子交換層析分離自乳制品。文檔編號(hào)A23J1/20GK101282736SQ200680037586公開(kāi)日2008年10月8日申請(qǐng)日期2006年9月8日優(yōu)先權(quán)日2005年9月9日發(fā)明者大衛(wèi)·卡梅倫-史密斯,米歇爾·羅尼申請(qǐng)人:墨累古爾本合作有限公司