專利名稱：：嗜熱球菌屬某種(菌株9°n-7)dna連接酶的發(fā)現(xiàn)、克隆和純化的制作方法嗜熱球菌屬某種(菌株9°N-7)DNA連接酶的發(fā)現(xiàn)、克隆和純化
背景技術(shù)：
：嗜熱球菌屬(777wmococcM力是古細(xì)菌門(^r/2aea)的一個屬。這些古老的生物在包括高溫的極端條件下的多種環(huán)境中生長。在實(shí)驗(yàn)室中培養(yǎng)這些生物的能力是非常有限的，以致關(guān)于它們的生物化學(xué)或它們的代謝鮮為人知。連接酶是在雙鏈體DNA中的單鏈切口位點(diǎn)上催化磷酸二酯鍵形成的酶。連接酶也催化雙鏈體DNA的共價鍵，一般是平末端對平末端，或者一個粘末端對另一個粘末端。連接酶已經(jīng)從多種細(xì)菌中克隆，包括一種熱穩(wěn)定連接酶——水生棲熱菌(777^mz^a^fl"cw力(％《連接酶)。該連接酶已在美國專利第6,054,564號中描述。僅一些嗜熱球菌已被分離，關(guān)于它們可能含有的連接酶的特性或者編碼這類蛋白的基因知之甚少(參見，例如Nakatani等，BacfenWogy182:6424-6433(2000))。從不同屬的古細(xì)菌——熱球菌屬(p,ococcw)——得到的連接酶例如在美國專利第5，506，137和5,700,672號以及在Keppetipola等J!5acfen'o/ogy187:6902-6908(2005)中已被描述。連接酶已被用于分子生物學(xué)的許多技術(shù)中，包括DNA擴(kuò)增、測序和單核苷酸多態(tài)性的檢測。尋找在高溫下穩(wěn)定并且具有快速動力學(xué)和嚴(yán)格特異性的改善的連接酶一直是所需求的。發(fā)明概述在本發(fā)明的一實(shí)施方式中，提供了具有DNA連接酶活性的基本上純的重組蛋白質(zhì)，其中該蛋白質(zhì)與SEQIDNO:13具有至少91%的氨基酸序列同一性。在本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方式中，提供具有DNA連接酶活性的基本上純的蛋白質(zhì)，其中DNA連接酶用選自下列的DNA序列編碼(a)與SEQIDNO:2基本上相同的序列；(b)與SEQIDNO:2基本上互補(bǔ)的序列；(c)在嚴(yán)格條件下，與SEQIDNO:2基本上雜交的序列；和(d)編碼SEQIDNO:13的序列。在上述實(shí)施方式中指出的蛋白質(zhì)的進(jìn)一步的特征在于在大約10(TC的溫度下溫育30分鐘后，連接酶保留了至少25%的連接酶活性。而且，該連接酶可能的進(jìn)一步特征在于在連接過程中其使用ATP作為輔因子，然而就這一目的而言，NAD+沒有提供可檢測的效用。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，提供了編碼DNA連接酶的DNA，該DNA具有選自下列的序列(a)與SEQIDNO:2基本上相同的序列；(b)與SEQIDNO:2基本上互補(bǔ)的序列；(c)在嚴(yán)格條件下，與SEQIDNO:2基本上雜交的序列；禾卩(d)編碼SEQIDNO:13的序列。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，描述了含有上述DNA的載體。另外，提供了能從載體表達(dá)連接酶的宿主細(xì)胞。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，提供了連接磷酸二酯鍵的方法，該方法包括選擇上述類型的DNA連接酶；將連接酶與DNA混合，所述DNA在該DNA的至少一條鏈上含有切口；并且在所述切口連接所述磷酸二酯鍵。在該方法的一實(shí)例中，DNA連接酶是從古細(xì)菌分離物，具體為嗜熱球菌屬某種(7/^mococc船平)(菌株9。N-7)得到的熱穩(wěn)定連接酶。附圖簡述圖la-l至la-5示出9。N-7DNA連接酶變體(SEQIDNOS:l-7)的DNA序列比對。圖lb-l至lb-2示出嗜熱球菌屬某種(菌株9°N-7)DNA連接酶變體(SEQIDNOS:8-15)的蛋白質(zhì)比對。圖2示出插入到litmus28i內(nèi)的嗜熱球菌屬某種(菌株9°N-7)DNA連接酶基因的質(zhì)粒圖。圖3示出插入到pMalC2x內(nèi)的嗜熱球菌屬某種(菌株9。N-7)DNA連接酶基因的質(zhì)粒圖。圖4示出嗜熱球菌屬某種(菌株9。N-7)(SEQIDNO:15)和喜煙嗜熱球菌(772^7wococcw/i/脂'co/a"力(SEQIDNO:16)、克達(dá)卡拉嗜熱球菌(7Tzermococciw^^zferae"w;s)(SEQIDNO:17)、深海熱球菌(尸yracoccwsa肌〕(SEQIDNO:18)禾卩激烈熱球菌(pyracocc附/mh'om力(SEQIDNO:19)的蛋白質(zhì)比對。圖5示出磷酸纖維素柱組份(phosphocellulosecolumnfraction)的SDSPAGE。泳道如下標(biāo)記FT(柱流通)指組份編號23-34;MW指分子量標(biāo)準(zhǔn)。箭頭指出凝膠上與DNA連接酶相應(yīng)的帶的位置。圖6示出9°N-7DNA連接酶的熱穩(wěn)定性。30pl、pH7.5的10mMTrisHCl、2.5mMMgCl2、2.5mMDTT、300ATP和0.1%TritonX-100——其含有3(il以1:100稀釋的純9°N-7DNA連接酶，在pH7.5的10mMTrisHCl、2.5mMMgCl2,、2.5mMDTT、300ATP和0.1%TritonX-100進(jìn)一步連續(xù)三倍稀釋。四組相同的稀釋液在4°C、80°C、90。C或IO(TC下溫育30分鐘。為了終止反應(yīng)，將樣品置于冰上并且將等體積的pH7.5的10mMTrisHC1、2.5mMMgCl2，、2.5mMDTT、300|uMATP、0.1%TritonX-100和50|ng/mlBstEIIXDNA加入到每支管中。然后在45。C下溫育反應(yīng)物15分鐘，在此之后將0.15體積的50%的甘油、lOOmMEDTA和溴酚蘭加入到每支管中。然后在75'C下溫育反應(yīng)物5分鐘，并且在1%瓊脂糖TBE凝膠上進(jìn)行電泳。圖A示出在冰上溫育30分鐘的結(jié)果。圖B示出在8(TC下溫育30分鐘的結(jié)果。圖C示出在9(TC下溫育30分鐘的結(jié)果。圖D示出在10(TC下溫育30分鐘的結(jié)果。對于每一個圖，泳道如下指定泳道1表示沒有進(jìn)一步稀釋；泳道2以1:3稀釋；泳道3以1:9稀釋；泳道4以1:27稀釋；和泳道5以1:81稀釋。圖7示出的凝膠中，9°N-7聚合酶與r"《聚合酶在含有大腸桿菌(E.co")聚合酶和大腸桿菌內(nèi)切酶IV(EndoIV)的修復(fù)混合物中比較。該修復(fù)混合物與脫嘌呤的DNA—起溫育，并且進(jìn)行擴(kuò)增。泳道1是對照。泳道2是在沒有修復(fù)混合物下的DNA;泳道3和4是DNA和含有480單位T"《連接酶的修復(fù)混合物的復(fù)制樣品；和泳道5和6是DNA和含有500單位9°N-7連接酶的修復(fù)混合物的復(fù)制樣品。實(shí)施方式詳述這里使用的術(shù)語"熱穩(wěn)定連接酶(thermostableligase)"指催化DNA連接和在IO(TC下、30分鐘后保持其至少25%活性的酶。在極端溫度下的熱穩(wěn)定性是將嗜熱球菌屬連接酶(古細(xì)菌)和嗜熱菌屬(77^扁"連接酶(細(xì)菌)區(qū)分開的特征。嗜熱球菌屬某種(菌株9。N-"是從水熱噴口(hydrothermalvent)分離的嗜熱球菌的一個種(Southworth等/WAS93:5281(1996))。嗜熱球菌屬某種(菌株9°N-7)DNA連接酶的兩個已知的最接近的親屬(relative)是喜煙嗜熱球菌連接酶和克達(dá)卡拉嗜熱球菌連接酶(JP2000308494-A/1),其在氨基酸水平分別具有88%和90%的同一性。這兩個連接酶都被報道利用NAD+或ATP作為輔因子，從而構(gòu)成一組新類型連接酶。喜煙嗜熱球菌連接酶被Nakatani等(J.Bacteriology182:6424-6433(2000))報道利用NAD+或ATP同樣好，并且克達(dá)卡拉嗜熱球菌連接酶在利用NAD+代替ATP時具有減低水平的活性，然而嗜熱球菌屬某種(菌株9。N-7)利用NAD+時沒有可檢測的活性(實(shí)施例2)。術(shù)語"基本上相同"和"基本上互補(bǔ)"擬指DNA或氨基酸序列與鑒定的序列很大的相同性或同一性，或者與互補(bǔ)序列很大的相同性或同一性。該術(shù)語擬包括在氨基酸或DNA序列中含有與在圖中規(guī)定的最小差異的序列。這種差異可由不明顯干擾蛋白質(zhì)連接功能的誘變事件引起。在本發(fā)明的一實(shí)施方式中，在下列條件下進(jìn)行嚴(yán)格雜交a)雜交0.75MNaCl、0.15TrisHC1、10mMEDTA、0.1%NaCl、0.1%SLS、0.03%BSA、0.03%Ficoil400、0.03%PVP和100jig/ml煮沸的小牛胸腺DNA，在5(TC下大約12小時，禾口；b)用O.IXSET、0.1%SDS、0.1%NaCl和0.1M磷酸鹽緩沖液，在45。C下洗滌3次共30分鐘，并在DNA印跡(SouthemBlot)上檢測雙鏈雜交的DNA的存在。本文引用的所有參考文獻(xiàn)以及2005年9月15號提交的美國臨時專利申請第60/717,296號被引入作為參考。實(shí)施例實(shí)施例I:使用簡并引物克隆嗜熱球菌屬某種(菌株9°N-7)DNA連接酶基因首先通過PCR從嗜熱球菌屬某種(菌株9。N-7)的基因組DNA擴(kuò)增基因。從Nakatani等J.Bact.182(22):6424-6433(2000)(克達(dá)卡拉嗜熱球菌)和Rolland等FEMSMicrobiologyLett.236(2):267-273(2004)(喜煙嗜熱球菌)的參考文獻(xiàn)獲得正向引物序列。具有指定簡并性的共有序列設(shè)計如下正向引物5'CGGTGGTGCATATGRGCGAYATGMRSTACTC(SEQIDNO:20)反向引物5'ATAAACTCTAGATTACYTCTTCGCCTTGAACCTCTCCTGG(SEQIDNO:21)使用嗜熱球菌屬某種(菌株9。N-7)的引物從嗜熱球菌屬某種(菌株9。N-7)的基因組DNA擴(kuò)增DNA連接酶的基因。用來克隆基因的PCR反應(yīng)條件如下100|il反應(yīng)混合物——含有pH8.8的20mMTris-HCL、10mMKC1、10mM(NH4)2S04和4mMMgSO4、0.1%TritonX陽100、200的每種dNTP、50ng嗜熱球菌屬某種(菌株9。N-7)的基因組DNA、正向和反向引物每種500ng、2.5單位的ragDNA聚合酶和0.02單位的VentDNA聚合酶，被加熱到94。Cl分鐘，然后在45'C1分鐘，并且然后在72'C3分鐘。重復(fù)30次該溫度循環(huán)。在完成循環(huán)后，將反應(yīng)溫度降低至室溫，并且加入5單位大腸桿菌DNA聚合酶Klenow片段，并在室溫下進(jìn)一步溫育5分鐘。然后，將反應(yīng)物調(diào)整為70mMEDTA。PCR產(chǎn)物用苯酚提取、用醇沉淀，并在CL6B瓊脂糖自旋柱(sepharosespincolumn)上對其脫鹽。將1700bpPCR產(chǎn)物克隆到大腸桿菌中。EcoRV-切割的litmus28i被用作克隆DNA片段的載體。T4DNA連接酶緩沖液中的10pl連接反應(yīng)物包含80ng插入片段、80nglitmus載體和400單位T4DNA連接酶(NewEnglandBiolabs，Inc.,Ipswich,MA)。連接反應(yīng)在16。C溫育過夜，經(jīng)電穿孔進(jìn)入大腸桿菌TBI細(xì)胞，并在IPTGXGAL平板上鋪板。挑選白色的菌落。9個白色菌落中的一個具有1700bp插入片段。獨(dú)立的電穿孔產(chǎn)生具有1700bp插入片段的另一個克隆。對這兩個克隆中的插入片段進(jìn)行測序。從這些克隆的序列，新的具有較少簡并性的正向引物設(shè)計如下9。N正向引物5'cggtggtgcatatgggcgayatgaggtactccgagctgg(SEQIDNO:22)(2)使用比在實(shí)施例(l)中的引物具有較少簡并性的第二正向引物克隆嗜熱球菌屬某種(菌株9。N-7)的連接酶使用9°N-7正向引物實(shí)施另外4個獨(dú)立的PCR反應(yīng)，其僅包含一個簡并堿基代替了上述(l)中的正向引物——其含有5個簡并堿基。100^1含有50ng嗜熱球菌屬某種(菌株9。N-"基因組DNA、正向和反向引物每種500ng、200pM的每種dNTP和1|alPhusionDNA聚合酶(NewEnglandBiolabs,Inc,Ipswich，MA)的PhusionHF緩沖液(NewEnglandBiolabs,Inc，Ipswich,MA)被加熱到98。C持續(xù)30秒，然后作25個下列過程的循環(huán)98°C10秒，然后70。C30秒，接下來72°C1分鐘。然后在72。C溫育反應(yīng)物5分鐘。每一PCR反應(yīng)的產(chǎn)物作為初始PCR反應(yīng)物處理，并被克隆到litmus28i中，如上所述。通過小量制備DNA，從PCR反應(yīng)得到的兩個獨(dú)立克隆(A1和A3)被證實(shí)含有1700堿基對插入片段，以及從其它三個PCR反應(yīng)(B2、C3、D3)的每一個得到的一個克隆同樣被證實(shí)含有1700堿基對插入片段。然后培養(yǎng)這些克隆，并將它們的粗提物在SDSPAGE上電泳。每一克隆表達(dá)60kd的蛋白質(zhì)。從克隆Al、A3、B2、C3、D3得到的質(zhì)粒和另外的lig7和lig8被純化，并且對插入片段測序。在圖la-l到la-5中提供了DNA序列(SEQIDN0S:l-7)。盡管不希望被理論所限制，但是在序列中觀察到的小差異可由嗜熱球菌屬某種(菌株9。N-7)細(xì)胞群內(nèi)的克隆變異解釋。序列變異是所有第三位置變化，或者保守氨基酸變化?？寺2是連接酶共有序列的代表。DNA連接酶首次在緊密控制的表達(dá)載體中表達(dá)(圖2)。(3)在大腸桿菌中表達(dá)連接酶基因(B2)通過用NdeI和XbaI切割，從litmus載體上剪切B2片段。從瓊脂糖凝膠上切下1700bp片段，并且用瓊脂糖酶消化凝膠切片以釋放所述片段。通過用Ndel禾BXbal切割制備表達(dá)載體pMalC2X(NewEnglandBiolabs,Inc.，Ipswich，MA)，并且使其去磷酸化。在10^1含有400ng插入片段和100ngT4DNA連接酶緩沖液中的載體以及200單位T4DNA連接酶的反應(yīng)物中，在16°〇溫育16小時，將切割的1700bp堿基對PCR片段連接到pMalC2X載體。將連接反應(yīng)物電穿孔入大腸桿菌TB1細(xì)胞，并且攜帶1700bp片段的克隆被分離并且命名為嗜熱球菌屬某種(菌株9。N-7)B2-1(圖3)。在LB培養(yǎng)基中生長克隆，并且用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)。誘導(dǎo)的細(xì)胞的樣品被裂解，并且在SDSPAGE凝膠上電泳，以顯示出與約60kd大小的蛋白質(zhì)相應(yīng)的帶。對從DNA序列得到的蛋白質(zhì)序列的分析表明基因編碼帶有26個罕用精氨酸密碼子的蛋白質(zhì)。因此，含有用于精氨酸的罕用tRNA的宿主細(xì)胞(大腸桿菌BL-2(DE3)RIL)(Stratagene，LaJoIIa,CA)被用來獲得更高水平的表達(dá)。在嗜熱球菌屬某種(菌株9°N-7)誘導(dǎo)后，宿主樣品中的B2-1質(zhì)粒通過SDSPAGE進(jìn)行分析，并且觀察到明顯的60kd帶。(4)嗜熱球菌屬某種(菌株9。N-7)連接酶與其它熱穩(wěn)定DNA連接酶的比較通過CLUSTAL多序列比對，將嗜熱球菌屬某種(菌株9°N-7)DNA連接酶氨基酸序列與其它4種嗜熱DNA連接酶進(jìn)行比較。CLUSTALW(1.82)多序列比對(MultipleSequenceAlignments)序列形式為Pearson。序列1:9。N-7-B2(SEQIDNO:15)564aa序列2:克達(dá)卡拉嗜熱球菌(SEQIDNO:16)562aa序列3:深海熱球菌(SEQIDNO:17)559aa序列4:激烈熱球菌(SEQIDNO:18)561aa序列5:喜煙嗜熱球菌(SEQIDNO:19)559aa同一性得分序列(1:2)比對得分90序列(1:3)比對得分81序列(1:4)比對得分78序列(1:5)比對得分88序列(2:3)比對得分80序列(2:4)比對得分80序列(2:5)比對得分87序列(3:4)比對得分:90序列(3:5)比對得分:78序列(4:5)比對得分:77圖4中給出比對。嗜熱球菌屬某種(菌株9°N-7)DNA連接酶已知最接近的親屬是克達(dá)卡拉嗜熱球菌DNA連接酶，其中具有90%的氨基酸同一性和80.9%的核苷酸同一性。(5)嗜熱球菌屬某種(菌株9。N-7)DNA連接酶的純化使用含有從嗜熱球菌屬某種(菌株9。N-7)得到的DNA連接酶的B2片段的pMalC2X質(zhì)粒(NewEnglandBiolabs,Inc.,Ipswich，MA)轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL-21(DE3)-RIL(Stratagene，LaJolla,CA)。在含有50|ig/ml的氨芐青霉素和25嗎/ml的氯霉素的100mlLB培養(yǎng)基中，在37。C下，生長細(xì)胞。在溫育過夜后，將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到10升發(fā)酵罐中，并且在37°C下溫育，直到達(dá)到0.59的OD600，并且加入O.l克的IPTG。溫育培養(yǎng)物另外的5.75小時，并且收獲。在-20。C，貯藏該細(xì)胞團(tuán)(cellpaste)。在40mlpH7.5的10mMTrisHC1、20mMNaCl、0.1mMEDTA和l.OmMDTT中的10克細(xì)胞團(tuán)被解凍并通過超聲波裂解。將提取物置入0.3mMPMSF和200mMNaCl。通過離心凈化提取物。將凈化的提取物通過0.2MNaCl中的DEAE瓊脂糖柱。然后收集流過該柱的蛋白質(zhì)，并且將其稀釋為100mM的NaCl。將其施用到磷酸纖維素柱，并且用100mM到1.1M的NaCl梯度洗脫被吸收的蛋白質(zhì)。通過SDSPAGE分析該級分(圖5)，收集60kd的主峰，并且將其加熱到75°C，30分鐘。通過離心凈化該溶液，將凈化的溶液稀釋為100mMNaCl，并且將其施用到羥磷灰石柱。將0-13%梯度的硫酸銨運(yùn)用到該柱，收集級分，并且通過在含有50嗎/ml的HindlII人DNA作為底物的T4DNA連接酶緩沖液(NewEnglandBiolabs,Inc.,Ipswich,MA)中溫育多個級分，分析這些級分的活性。在37"C下，溫育該反應(yīng)物10分鐘。通過加入10%的100mMEDTA和50%的甘油和溴酚蘭染料終止反應(yīng)。將反引物加熱到65。C，并且將其負(fù)載到1%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行分析。收集含有大約80%連接酶活性的管，并將其在50y。甘油、pH7.5的10mMTrisHCl、50mMKCl、10mM(NH4)2S04、0.1mMEDTA和1.0mMDTT中透析。純化的嗜熱球菌屬某種(菌株9°N-7)DNA連接酶被貯藏在-20"C。實(shí)施例2:嗜熱球菌屬某種(菌株9°N-7)DNA連接酶的特性推薦的反應(yīng)條件是lOmMTris匿HCl，pH7.52.5mMMgCl22.5mMDTT300|iMATP在45'C下，用于分析活性的典型底物是XDNA。適當(dāng)消化的XDNA可以在XDNA末端示出12-堿基延伸的連接狀態(tài)。一般地，我們使用HindIII或BstEII預(yù)消化的人DNA。在瓊脂糖凝膠電泳上實(shí)施連接分析。ATP的Km顯示在100pM以下。利用TritonX-100刺激該活性。與喜煙嗜熱球菌DNA連接酶不同，嗜熱球菌屬某種(菌株9。N-7)連接酶在存在NAD+的情況下，沒有可檢測的活性。該酶需要鎂離子。2.5mMMgCl2獲得比10mMMgCl2多10倍的活性。在大約100。C下溫育該酶30分鐘后，保留25%至50%之間的活性(圖6)。在90。C下，連接酶能封閉帶切口的DNA。DNA連接酶與BstNBI帶切口的pUC19質(zhì)粒DNA—起溫育，并將松弛的帶切口質(zhì)粒轉(zhuǎn)化成共價閉環(huán)DNA，如通過瓊脂糖凝膠電泳所確定。在8(TC時反應(yīng)速率比在45。C時反應(yīng)速率高。盡管帶切口的質(zhì)粒在9(TC經(jīng)歷變性，但在9(TC在變性前發(fā)生大量的切口封閉，這將所有帶切口的質(zhì)粒轉(zhuǎn)變?yōu)閱捂溬|(zhì)粒。實(shí)施例3:嗜熱球菌屬某種(菌株9°N-7)DNA連接酶在DNA修復(fù)混合物中的應(yīng)用使用包括菌株9。N-7DNA連接酶的酶的混合物，修復(fù)脫嘌呤所破壞的DNA。在實(shí)驗(yàn)反應(yīng)中DNA通過Ide，H等Biochemistry32(32):8276-83(1993)描述的脫嘌呤而受損。XDNA(NEB#N3011,NewEnglandBiolabs，Inc.，Ipswich,MA)被醇沉淀。將DNA以0.5mg/ml的濃度重懸浮在脫嘌呤緩沖液(lOOmMNaCl、lOmM檸檬酸鹽，pH5.0)中，并且在70。C下溫育120分鐘。然后將樣品醇沉淀，并且重新懸浮在0.01MTris、0.001MEDTA，pH8.0的溶液中。在用緩沖液對照校準(zhǔn)后，通過測量含DNA溶液的A，確定DNA的濃度。在下列酶的混合物中，在室溫下溫育受損的DNA達(dá)10分鐘DNA(lng);100|iMdNTPs(NEB#M0447,NewEnglandBiolabs,Ipswich,MA);1mMATP;480單位ra《連接酶(NEB^M0208，NewEnglandBiolabs,Ipswich,MA)或者500單位9°N-7DNA連接酶(NEB弁M0238,NewEnglandBiolabs,Ipswich,MA);0.1單位大腸桿菌DNA聚合酶I(大腸桿菌polI)(NEB#M0209，NewEnglandBiolabs,Inc.,Ipswich,MA);10單位大腸桿菌內(nèi)切酶IV(NEB#M0304，NewEnglandBiolabs,Inc.,Ipswich，MA);1xThermopol緩沖液(NEB弁B9004,NewEnglandBiolabs,Inc.,Ipswich,MA)，至最終體積47.5pL。在反應(yīng)結(jié)尾，將樣品轉(zhuǎn)移到冰上，然后擴(kuò)增。陰性對照如上處理，但是沒有使用酶。DNA擴(kuò)增反應(yīng)根據(jù)Wang等Nucl,AcidsRes.32:1197-1207(2004)的方法，使用下列引物，實(shí)施XDNA的擴(kuò)增CGAACGTCGCGCAGAGAAACAGG(L72-5R)(SEQIDNO:23)和CCTGCTCTGCCGCTTCACGC(L30350F)(SEQIDNO:24)。將2.5^1的擴(kuò)增混合物加入到47.5的上述修復(fù)混合物中。該擴(kuò)增混合物含有IOOjiMdNTPs、5單位7b《DNA聚合酶(NewEnglandBiolabs，Inc.,Ipswich,MA)、0.1單位Vent(exo+)DNA聚合酶(NewEnglandBiolabs,Inc.,Ipswich,MA)、5xl(T11M引物L(fēng)72畫5R和5xl0-11M引物L(fēng)30350F，于lxTherm叩ol緩沖液中。為了矯正酶儲存緩沖液的影響，當(dāng)修復(fù)酶從反應(yīng)中省略時，將適當(dāng)體積的儲存緩沖液加入到反應(yīng)物中。在所有的情況下，使用下列參數(shù)在熱循環(huán)儀(thermalcycler)中進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)在95"C下20秒1個循環(huán)，接下來在94"C下5秒，然后在72t:5分鐘25個循環(huán)。被擴(kuò)增的擴(kuò)增子的大小為5kb。通過1%瓊脂糖凝膠電泳，確定DNA(5kb)擴(kuò)增的結(jié)果。將6x負(fù)載染料(MolecularCloning:ALaboratoryManual,3rded"eds.SambrookandRussell,ColdSpringHarborPress,ColdSpringHarbor,NY:2001，pp.5.4-5.17)加入到5(V1擴(kuò)增反應(yīng)物中。然后，將20|il該溶液和作為尺寸標(biāo)準(zhǔn)的lpg的2-對數(shù)梯度分子量標(biāo)準(zhǔn)(2-logladder)(NEB#N3200，NewEnglandBiolabs,Inc.,Ipswich,MA)—起加載到瓊脂糖凝膠上。權(quán)利要求1.基本上純的重組蛋白質(zhì)，其具有DNA連接酶活性，并且與SEQIDNO13具有至少91％的氨基酸序列同一性。2.基本上純的蛋白質(zhì)，其具有DNA連接酶活性，由選自下列的DNA序列編碼(a)與SEQIDNO:2基本上相同的序列；(b)與SEQIDN02基本上互補(bǔ)的序列；(c)在嚴(yán)格條件下，與SEQIDNO:2雜交的序列；禾口(d)編碼SEQIDNO:13的序列。3.根據(jù)權(quán)利要求l所述的蛋白質(zhì)，其中在大約100。C的溫度下溫育30分鐘后，保留了至少25%的連接酶活性。4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的蛋白質(zhì)，其中在大約IO(TC的溫度下溫育30分鐘后，保留了至少25%的連接酶活性。5.根據(jù)權(quán)利要求l、2、3或4所述的蛋白質(zhì)，其在連接過程中利用ATP而不是NAD+作為輔因子。6.編碼DNA連接酶的DNA，所述DNA具有選自下列的序列(a)與SEQIDNO:2基本上相同的序列；(b)與SEQIDNO:2基本上互補(bǔ)的序列；(c)在嚴(yán)格條件下，與SEQIDNO:2雜交的序列；和(d)編碼SEQIDNO:13的序列。7.載體，含有權(quán)利要求6所述DNA。8.宿主細(xì)胞，其能表達(dá)權(quán)利要求l所述的蛋白質(zhì)。9.連接磷酸二酯鍵的方法，包括(a)選擇根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的連接酶；(b)將所述連接酶與DNA混合，所述DNA在所述DNA的至少一條鏈上含有切點(diǎn)；和(c)在所述切點(diǎn)連接所述磷酸二酯鍵。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述連接酶是從古細(xì)菌分離物得到的熱穩(wěn)定連接酶。11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述古細(xì)菌分離物為嗜熱球菌屬某種(777enwococcww.)(菌株9°N-7)。全文摘要描述了從嗜熱球菌屬某種(Thermococcussp.)(菌株9°N-7)分離的熱穩(wěn)定的DNA連接酶的組合物，以及制備和使用該組合物的方法。在連接過程中，熱穩(wěn)定的DNA連接酶依賴于ATP而不是NAD⁺作為輔因子，并且在100℃下，保持活性。文檔編號C12N9/00GK101287828SQ200680038387公開日2008年10月15日申請日期2006年9月15日優(yōu)先權(quán)日2005年9月15日發(fā)明者E·希爾德克勞特,I·希爾德克勞特申請人:新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室公司