專利名稱：：用于制備l-甲硫氨酸的微生物和方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及用于有效制備L-甲硫氨酸的微生物和方法。具體地，本發(fā)明涉及微生物和方法，其中甲硫氨酸途徑中高羊毛氨酸的形成和/或積累被減少和/或防止。
背景技術：
：當前，世界上每年曱硫氨酸產量為約500,000噸。甲硫氨酸是家畜或家禽伺料中第一種限制氨基酸，并且由于該原因，主要作為飼料補充劑應用。與其他工業(yè)氨基酸相比，甲硫氨酸幾乎只作為通過化學合成產生的外消旋物應用。因為動物可以代謝曱硫氨酸的兩種立體異構體，所以直接喂飼化學方法生產的外消旋混合物是可能的(D'Mello和Lewis,EffectofNutritionDeficienciesinAnimals:AminoAcids,Rechgigl(Ed.)，CRCHandbookSeriesinNutritionandFood,441-490，1978)。然而，在通過生物技術方法代替現有的化學生產中仍然存在很大興趣。這是由于在較低水平的補充時，L-曱硫氨酸是比D-曱硫氨酸更好的含硫氨基酸來源(Katz和Baker，(1975)Poult.Sci，545，1667-74)。此外，化學方法使用相對危險的化學品并且產生大量廢物流?；瘜W生產的所有這些缺點都可以通過有效的生物技術方法避免。對于其他氨基酸，如谷氨酸，已知使用發(fā)酵方法生產它們。為了這些目的，已經證明某些微生物，如大腸桿菌(E.coli)和谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)尤其合適。通過發(fā)酵產生氨基酸具有僅僅產生L-氨基酸的特別優(yōu)點。此外，避免了在化學合成中使用的引起環(huán)境問題的化學品，如溶劑等等。然而，通過微生物發(fā)酵生產甲硫氨酸將僅僅是化學合成的備選方案，如果它允許以與化學生產相當的價格在商業(yè)規(guī)模上生產甲硫氨酸的話。所以，通過大規(guī)模培養(yǎng)被開發(fā)以產生和分泌大量L-甲硫氨酸的細菌生產L-甲硫氨酸是所希望的目標。該方法的改進可以涉及發(fā)酵措施，如攪拌和提供氧氣，或者營養(yǎng)培養(yǎng)基的組成，如發(fā)酵期間的糖濃度，或者例如通過離子交換層析對產物的處理，或者微生物自身的內在輸出性質。還使用誘變、選擇和突變體選擇方法來改善這些微生物的輸出性質。以這種方式得到了耐受抗代謝物或者對于具有調節(jié)重要性的代謝物為營養(yǎng)缺陷的高生產菌林。重組DNA技術也在幾年來被用于通過擴增個體氨基酸生物合成基因和研究對氨基酸生產的影響來改進產生L-氨基酸的微生物菌抹。Rttckert等人，JournalofBiotechnology2003，104，213-228提供了谷氨酸棒桿菌中L-曱硫氨酸生物合成途徑的分析?？梢宰C實MetZ(也稱作MetY)和MetB的已知功能，并且證明MetC(也稱作AecD)是胱硫醚-p-裂合酶。此外，在該研究中鑒定了催化L-高半胱氨酸向L-甲硫氨酸轉化的MetE和MetH。WO02/097096使用來自棒桿菌細菌的核苷酸序列，其編碼McbR抑制基因(也稱作MetD)，和使用細菌制備氨基酸的方法，在所述細菌中MetD抑制基因被減弱。根據WO02/097096，該轉錄調節(jié)子McbR的減弱提高了棒桿菌細菌中L-甲硫氨酸的產量。在WO02/097096中還描述除了減弱McbR抑制基因外，對于L-曱硫氨酸的制備優(yōu)選增強或過表達編碼胱硫醚-，合酶的MetB基因。特定分子產量提高的菌林的選擇是耗時和困難的方法。因此，仍然非常需要有效產生L-甲硫氨酸和/或具有顯著增加的L-甲硫氨酸含量的微生物，其可以用于得到甲硫氨酸化合物。發(fā)明概述本發(fā)明的一個目的是提供在微生物中有效產生L-甲硫氨酸的方法。本發(fā)明的另一目的是提供有效產生L-曱硫氨酸的微生物。如從說明書將變得顯而易見的是，通過獨立權利要求的主題得到本發(fā)明的這些和其他目標。本發(fā)明的其他實施方案通過從屬權利要求定義。根據本發(fā)明的一個實施方案，提供了用于制備L-甲硫氨酸的微生物，其中尤其在甲硫氨酸途徑中高羊毛氨酸的形成和/或積累被減小和/或防止。L-曱硫氨酸的生物合成途徑中高羊毛氨酸的形成和/或積累的這種減小和/或防止使得微生物可能產生和分泌大量希望的分子，即L-曱硫氨酸。在本發(fā)明的另一實施方案中，提供了微生物，其中與野生型微生物相比，轉錄調節(jié)蛋白McbR的含量和/或生物活性減小并且其中尤其在甲硫氨酸途徑中高羊毛氛酸的形成和/或積累被減d、和/或防止。根據本發(fā)明的另一實施方案，提供了微生物，其中通過與野生型微生物相比減小胱石克醚-，合酶(MetB，EC2.5.1.48)的含量和/或生物活性來減小和/或防止甲硫氨酸途徑中高羊毛氨酸的形成和/或積累。在本發(fā)明的另一實施方案中，通過減弱或^:壞和/或消除編碼MetB的基因減小MetB的含量和/或生物活性。根據本發(fā)明方法的另一實施方案，被破壞的MetB基因防止功能MetB蛋白質在培養(yǎng)的微生物中的表達。在根據本發(fā)明微生物的一個實施方案中，編碼McbR的基因被減弱，優(yōu)選被破壞和更優(yōu)選消除。具體地，被減弱的McbR基因可以防止根據本發(fā)明的微生物中功能McbR蛋白質的表達。根據另一實施方案,提供了微生物，其中導入和/或過量產生編碼甲硫氨酸合酶的同源或異源的基因，其中所述甲硫氨酸合酶能夠將高半胱氨酸有效轉化成甲硫氨酸，即metE(EC2.1.1.13)和/或metH(EC2.1.1.14)。根據本發(fā)明的另一方面，提供了制備L-甲硫氨酸的方法，其包括下面的步驟-培養(yǎng)和/或發(fā)酵微生物，其產生L-甲硫氨酸并且其中曱硫氨酸途徑中高羊毛氨酸的形成和/或積累被減少和/或防止；和-分離L-曱硫氨酸。根據本發(fā)明方法的另一實施方案，培養(yǎng)生物，其中轉錄調節(jié)子蛋白McbR的含量和/或生物活性與野生型微生物相比減少。根據本發(fā)明方法的另一實施方案，培養(yǎng)微生物，其中編碼McbR的基因被減弱和/或^f皮壞和/或消除。根據本發(fā)明方法的另一實施方案，所述被破壞的McbR基因防止功能McbR蛋白質的表達。根據本發(fā)明方法的另一實施方案，培養(yǎng)微生物，其中引入編碼胱硫醚P-裂合酶(MetC)突變體的異源基因，其中所述胱石克醚p-裂合酶(MetC)突變體能夠將高羊毛氛酸有效轉化成高半胱氨酸。根據本發(fā)明方法的另一實施方案，培養(yǎng)微生物，其中引入編碼胱硫醚，合酶(MetB)的異源基因，其中所述胱硫醚Y-合酶(MetB)能夠將O-乙酰基-高絲氨酸和半胱氨酸有效轉化為胱硫醚并且不能將O-乙?；?高絲氨酸和高半胱氨酸轉化為高羊毛氨酸。根據本發(fā)明方法的另一實施方案，培養(yǎng)微生物，其中與野生型微生物相比，選自O-乙酰基-高絲氨酸硫化氫解酶(sulfohydrolase)(MetZ)、鈷(I)胺素依賴性甲硫氣酸合酶I(MetH)和鈷(I)胺素獨立的甲硫氨酸合酶11(MetE)的蛋白質的含量和/或生物活性增加。根據本發(fā)明方法的另一實施方案，培養(yǎng)微生物，其中與野生型微生物相比，編碼選自O-乙酰基-高絲氨酸硫化氫解酶(MetZ)、鈷(I)胺素依賴性曱硫氨酸合酶I(MetH)和鈷(I)胺素獨立的曱硫氨酸合酶II(MetE)的至少一種基因被增強和/或過表達。根據本發(fā)明方法的另一實施方案，所述微生物選自棒桿菌細菌、分枝桿菌、鏈霉菌科(streptomycetaceae)、沙門氏菌屬(salmonella)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、志賀氏菌屬(Shigella)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、沙雷氏菌屬(Serratia)和假單胞菌屬(Pseudomonas)。根據本發(fā)明方法的進一步優(yōu)選的實施方案，所述生物是谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)、大腸軒菌、酉良酒酵母(Saccharomyces)或枯草芽孢桿菌(Bacillussu固s)。根據本發(fā)明方法的另一實施方案，所希望的L-氨基酸在培養(yǎng)基中或在微生物的細胞中被濃縮。在本發(fā)明的另一方面，提供了從發(fā)酵液制備含有L-甲硫氨酸的動物飼料添加劑的方法，其包括下面的步驟-培養(yǎng)和/或發(fā)酵微生物，該微生物產生L-甲硫氨酸并且其中發(fā)酵培養(yǎng)基中甲硫氨酸途徑中高羊毛氨酸的形成和/或積累被減少和/或防止；-從含有L-曱疏氨酸的發(fā)酵液除去水；-除去0到100重量％，如10到90重量％或20到80重量％或30到70重量％或40到60重量％或約50%重量。/。發(fā)酵期間形成的生物量，和-干燥發(fā)酵液以得到粉末或顆粒形式的動物飼料添加劑。此外，本發(fā)明的另一方面涉及微生物，尤其谷氨酸棒桿菌在生產L-甲硫氨酸中的用途，在所述微生物中甲硫氨酸途徑中高羊毛氨酸的形成和/或積累,皮減少和/或防止。附圖描述圖la是微生物如谷氨酸棒桿菌中L-甲硫氨酸生物合成途徑模型。所涉及的酶是MetA(高絲氨酸轉乙?；?、MetB(胱硫醚個合酶)、MetZ(O-乙?；呓z氨酸硫化氫解酶)、MetC(胱硫醚-P-裂合酶)、鈷(I)胺素依賴性曱硫氨酸合酶I(MetH)和鈷(I)胺素獨立的甲硫氨酸合酶II(MetE)。圖lb顯示了L-高羊毛氨酸(S-[(3S)-3-氨基-3-羧基丙基l-L-高半胱氨酸)的結構。圖2顯示了在MetC測定法(圖2a)和MetB測定法(圖2b)的不同時間點412nm下游離SH基團的光度測量鐠。x軸中在80到140分鐘之間的中斷等于通過超濾分離MetB的時間。通過灰色虛線箭頭指出MetC的加入。用HPLC測量的對應的底物和產物濃度分別在表3a和3b中給出。圖3描繪了MBDSTFA衍生的胱硫醚(A)和高羊毛氨酸(B)的GC/MS質譜。m/z-678和m/z-692分別等于胱硫醚和高羊毛氨酸的m信號。用質量漂移(massshift)14也可以觀察到特征性m-15、m-57和m-302。m/z=170、m/z=244和m/z==272是兩種分子中高半胱氨酸殘基的特征性片段。圖4顯示了質粒pH430AMcbR(a)、pH238deltaAhom/Ahsdh-hsk(b)和pSL315(c)。示例性實施方案詳述在詳細描述本發(fā)明的示例性實施方案前，給出下面的定義。術語"曱硫氨酸合成的效率"描述了甲硫氨酸的碳產率。該效率通過以碳底物形式進入該系統的能量輸入的百分比計算。在本發(fā)明全文中，除非指出相反，該值以百分數值給出((摩爾曱硫氨酸)(摩爾碳底物)"xlOO)。術語"高羊毛氨酸合成效率"描述了高羊毛氨酸的碳產率。該效率通過以碳底物形式進入該系統的能量輸入的百分比計算。在本發(fā)明全文中，除非指出相反，該值以百分數值給出((摩爾高羊毛氨酸)(摩爾碳底物)"xlOO)。根據本發(fā)明的優(yōu)選的碳源是糖，如單糖、二糖或多糖。例如，選自葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、核糖、山梨糖、核糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖、棉子糖、淀粉或纖維素的糖可以用作尤其優(yōu)選的碳源。術語"甲硫氨酸合成的增加的效率"涉及與最初的野生型生物相比已經被遺傳修飾并且具有較高甲硫氨酸合成效率的生物之間的比較。術語"曱硫氨酸的產率"描述了曱硫氨酸的產率，其以單位重量的細胞量得到的甲硫氨酸的量來計算。術語"曱硫氨酸途徑"是本領域公知的并且描述了一系列反應，其在野生型生物中發(fā)生并且導致甲硫氨酸的生物合成。該途徑可以在生物與生物之間不同。生物特異性途徑的細節(jié)可以從網站h加〃www.genome.iD/hegg/metabolism.html上所歹Q的教科書和科學文獻得到。具體地，在本發(fā)明的意義內的甲硫氨酸途徑在圖1中顯示。術語"高羊毛氨酸產率"描述了高羊毛氨酸的產率，其以單位重量細胞量得到的高羊毛氨酸的量來計算。ii減少和/或防止甲硫氨酸途徑中高羊毛氨酸的形成和/或積累指與根據本發(fā)明甲石危氨酸途徑的酶如MetB、MetC、MetZ、MetE和/或MetH的活性不改變的產生甲石克氨酸的^f鼓生物中的效率和/或產率和/或量相比，以優(yōu)選小于90%、小于70%、小于50%、小于30%、小于25%、小于20%、小于15%、小于10%、小于5%或小于2%的效率和/或產率和/或量產生高羊毛氨酸。如上面關于甲硫氨酸和高羊毛氨酸給予的定義對應地應用于甲硫氨酸途徑的其他代謝物。為了本發(fā)明的目的，術語"生物"或"微生物"指通常用于產生氨基酸如甲硫氨酸的任何生物。具體地，術語"生物"涉及原核生物、低等真核生物和植物。優(yōu)選的一組上述生物包括放線細菌、藍細菌、變形菌(proteobacteria)、橙色綠屈撓菌(Chloroflexusaurantiacus)、梨形菌(Pirellulasp.)l、鹽桿菌和/或甲烷球菌，優(yōu)選棒桿菌細菌、分枝桿菌、鏈霉菌、沙門氏菌、大腸桿菌、志賀氏菌和/或假單胞菌。尤其優(yōu)選的微生物選自谷氨酸棒桿菌、大腸桿菌、芽孢桿菌屬微生物，尤其枯草芽孢桿菌，和鏈霉菌屬微生物。然而，本發(fā)明的生物還可以包含酵母，如栗酒裂殖酵母(Schizosaccharomycesprobe)或cerevisiae和巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)。對于本發(fā)明，術語"過量產生L-甲硫氨酸的微生物"指微生物，其中與野生型微生物相比，甲硫氨酸產生的效率和/或產率和/或量增加至少100%、至少200%、至少300%、至少400%、至少500%、至少600%、至少700%、至少800%、至少卯0%或至少1000%或以上。對于^l生物生產，本發(fā)明也考慮植物。此類植物可以是單子葉植物或雙子葉植物，如單子葉或雙子葉作物植物、食品作物或飼料植物。單子葉植物的實例是屬于燕麥屬(avena)、小麥屬(triticum)、黑麥屬(secale)、大麥屬(hordeum)、稻屬(oryza)、小米、狼尾草屬(pennisetum)、狗尾草屬(setaria)、高粱屬(粟)、玉米(玉蜀黍)等等的植物。雙子葉作物植物包括棉、豆科，像pulse，尤其苜蓿、大豆、油菜籽、番茄、甜菜、馬鈴薯、觀賞植物，以及樹。其他作物植物可以包括水果(尤其蘋果、梨、櫻桃、葡萄、柑桔、菠蘿和香蕉)、油椰、茶樹、可可樹和咖啡樹、煙草、劍麻以及有關的藥用植物、蘿芙木和洋地黃。尤其優(yōu)選谷類小麥、黑麥、燕麥、大麥、稻、玉米和粟、甜菜、油菜籽、大豆、番茄、馬鈴薯和煙草。其他作物植物可以從US6,137,030得到。術語"野生型生物"或"野生型微生物"涉及沒有纟皮遺傳修飾的生物。術語"代謝物"指用于生物的代謝途徑中的作為前體、中間體和/或終產物的化合物。此類代謝物不僅可以作為化學結構單元，而且也可以對酶和它們的催化活性發(fā)揮調節(jié)活性。從文獻已知此類代謝物可以抑制或刺激酶活性(Stryer,Biochemistry,(1995)W.H.Freeman&Company,NewYork,NewYork)。為了本發(fā)明的目的，術語"外部代謝物"包括底物，如葡萄糖、硫酸鹽、硫代硫酸鹽、亞疏酸鹽、硫化物、氨、氧等等。在一些實施方案中，(外部)代謝物包含所稱作的Cl-代謝物。后一代謝物可以作為例如曱基供體并且包含化合物如甲酸鹽、甲醛、甲醇、甲硫醇、二甲基二硫醚等等。術語"產物"包括甲硫氨酸、生物量、co2、等等。氨基酸包含所有蛋白質的基本結構單元，并且同樣對于生物中的正常細胞功能是必需的。術語"氨基酸"是本領域公知的。產蛋白質氨基酸(其有20種)作為蛋白質的結構單元，其中它們通過肽鍵連接，而非產蛋白質氨基酸通常不在蛋白質中發(fā)現(見Ullmann'sEncyclopaediaofIndustrialChemistry,A2版，57-97頁，VCH，Weinheim(1985))。氨基酸可以為D或L光學構型，然而L-氨基酸通常是天然存在的蛋白質中發(fā)現的唯一類型。20種產蛋白質氨基酸的每一種的生物合成和降解途徑已經在原核生物和真核生物中被良好表征(見例如，Stryer，L.Biochemistry,第三版，578-590頁(1988))。必需氨基酸，即組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、色氨酸和纈氨酸(它們由于它們生物合成的復雜性而通常是營養(yǎng)需要的)可通過筒單的生物合成途徑容易轉化為剩余的11種非必需氨基酸，即丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、脯氨酸、絲氨酸和酪氨酸。高等動物不保留合成這些氨基酸中一些氨基酸的能力，但是必需氨基酸必需從食物提供以便發(fā)生正常蛋白質合成。除了它們在蛋白質生物合成中的功能外，這些氨基酸自身是有趣的化合物，并且已經發(fā)現許多在食品、銅料、化學、化妝品、農業(yè)和制藥工業(yè)中具有多種應用。賴氨酸不僅是人，而且是單胃動物，如家禽和豬的營養(yǎng)中重要的氨基酸。谷氨酸最常用作風味添加劑，并且在食品工業(yè)中與天冬氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸和半胱氨酸一樣被廣泛使用。甘氨酸、L-甲硫氨酸和色氨酸都被用于制藥工業(yè)。谷氨酰胺、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、組氨酸、精氨酸、脯氨酸、絲氨酸和丙氨酸用于制藥和化妝品工業(yè)。蘇氨酸、色氨酸和D/L-曱硫氨酸是常用的飼料添加劑(Leuchtenberger，W.(1996)，Aminoacids-technicalproductionanduse,p.466-502，Rehm等人(編者)Biotechnology，巻6，14a章，VCH:Weinheim)。此外，已經發(fā)現這些氨基酸可用作合成氨基酸和蛋白質的合成前體，所述合成氨基酸和蛋白質如N-乙?；腚装彼?、S-羧基曱基-L-半胱氨酸、(S)-5-羥基色氨酸和Ullmann'sEncyclopaediaofIndustrialChemistry,Vol.A2，p.57-97,VCH:Weinheim，1985中描述的其他氨基酸。這些天然氨基酸在能夠產生它們的生物如細菌中的生物合成已經被良好表征(細菌氨基酸生物合成和調節(jié)的綜述見UmbargerH.E.(1978)，Ann.Rev.Biochem.47:533-606)。谷氨酸通過a-酮戊二酸(檸檬酸途徑中的中間體)的還原胺化合成。谷氨酰胺、脯氨酸和精氨酸各自隨后從谷氨酸產生。絲氨酸的生物合成是三步過程，以3-磷酸甘油酸(糖酵解的中間體)開始，并且在氧化、轉氨基作用和水解步驟后得到該氨基酸。半胱氨酸和甘氨酸都從絲氨酸產生；半胱氨酸高半胱氨酸與絲氨酸的縮合形成，甘氨酸通過絲氨酸轉羥曱基酶催化的反應中通過側鏈p碳原子向四氫葉酸的轉移形成。苯丙氨酸和酪氨酸從糖酵解和磷酸戊糖途徑前體赤鮮糖-4-磷酸和磷酸烯醇丙酮酸在9步生物合成途徑中合成，它們僅僅在預苯酸的合成后的最后兩步不同。色氨酸也從這兩種最初的分子產生，但是它的合成是ll步途徑。酪氨酸也可以在苯丙氨酸羥化酶催化的反應中從苯丙氨酸合成。丙氨酸、纈氨酸和亮氨酸都是糖酵解的終產物丙酮酸的生物合成產物。天冬氨酸從檸檬酸途徑的中間體草酰乙酸形成。天冬酰胺、曱硫氨酸、蘇氨酸和賴氨酸都通過天冬氨酸的轉化產生。異亮氨酸也可以從蘇氨酸形成。復雜的9步途徑導致從活化糖5—磷酸核糖基-l-焦磷酸產生組氨酸。細胞的蛋白質合成需求過量的氨基酸不能被儲存而是被降解而為細胞的主要代謝途徑提供中間體(綜述見Stryer，L.，Biochemistry,第三版，21章"Aminoaciddegradationandtheureacycle",p.495-516(1988》。盡管細胞能夠將不想要的氨基酸轉化成有用的代謝中間體，但是氨基酸生產在能量、前體分子和合成它們必須的酶方面是代價高的。從而，并不驚奇的是氨基酸生物合成受到反饋抑制的調節(jié)，其中特定氨基酸的存在用于減慢或者完全停止它的自身生產(氨基酸生物合成途徑中反饋機制綜述見Stryer，L.，Biochemistry,第三版，第24章"Biosynthesisofaminoacidsandheme",p.575-600(1988))。從而，任何具體氨基酸的輸出受到細胞中存在的該氨基酸的量的限制。革蘭氏陽性土壤細菌谷氨酸棒桿菌被廣泛用于不同氨基酸的工業(yè)生產。盡管主要的工業(yè)產品賴氨酸和谷氨酸的生物合成已經被研究多年，但是關于曱硫氨酸生物合成途徑的調節(jié)的知識還很有限。至少該途徑的關鍵酶是已知的(見圖1)。谷氨酸棒桿菌通過用高絲氨酸-O-乙酰轉移酶(MetA)(EC2.3.1.31)乙?；罨呓z氨酸。還表明轉硫作用和直接巰基化都被用于產生高半胱氨酸(Hwang，B.J.，Yeom，H.J.，Kim，Y.，Lee，H.S.，J.Bacteriol.2002，1845，1277-86)。轉硫作用通過胱硫醚-，合酶(EC2.5.1.48)催化(Hwang，B.J.，Kim，Y.,Kim，H.B.，Hwang，H.J.，Kim,J.H.，Lee，H.S.，MolCells1999，93，300-8)。在該反應中，半胱氨酸和O-乙?；?高絲氨酸結合成胱硫醚，其被胱硫醚-p-裂合酶(MetC，其也被稱作AecD)(EC4.4.1.8沐解(Kim，J.W.，Kim，H.J"Kim,Y.，Lee，M.S.，Lee，H.S.，MolCells2001，112，220-5;Ruckert等人，2003，同上)成高半胱氨酸、丙酮酸和氨。在直接巰基化作用中，O-乙?；呓z氨酸硫化氫解酶(MetZ，也稱作MetY)(EC2.5.1.49)(Ruckert等人，2003，同上)將O-乙酰基高絲氨酸和疏化物轉化成高半胱氨酸和乙酸。最后，谷氨酸棒桿菌有兩種不同的酶用于高半胱氨酸的S-甲基化產生甲硫氨酸(Lee，H.S.，Hwang,B.J.，Appl.Microbiol.Biotechnol.2003，625-6，459-67;Ruckert等人，2003，同上)，即鈷(I)胺素依賴性曱硫氨酸合酶I(MetH)(EC2.1.1.13)和鈷(I)胺素獨立的甲硫氨酸合酶II(MetE)(EC2.1.1.14)。前一種酶利用5-甲基四氬葉酸，后一種利用5-甲基四氫蝶酰三-L-谷氨酸作為甲基供體。最近，發(fā)現了TetR家族的推定的轉錄調節(jié)蛋白(Rey等人，JournalofBiotechnology2003，103，51-65)。表明該調節(jié)子阻遏屬于甲硫氨酸和硫代謝的幾種基因的轉錄。該調節(jié)蛋白的基因敲除導致增加表達編碼高絲氨酸脫氫酶的hom、編碼O-乙酰高絲氨酸硫化氫解酶的metZ、編碼S-腺苷甲硫氨酸(SAM)合酶(EC2.5.1.6)的metK、編碼半胱氨酸合酶(EC2.5丄47)的cysK、編碼推定的NADPH依賴性亞硫酸還原酶的cysl，和最后編碼推定的鏈烷磺酸單加氧酶的ssuD。Rey等人(MolecularMicrobiology2005，56，871-887)也發(fā)現在mcbR陰性菌林中顯著誘導metB基因。本發(fā)明至少部分基于發(fā)現了減少和/或防止高羊毛氨酸的形成，尤其減少和/或防止甲硫氨酸途徑中高羊毛氨酸的形成和/或積累可以提高所希望的化合物如L-甲硫氨酸在微生物中合成的效率和/或產率。可以通過減小O-乙酰-高絲氨酸和高半胱氨酸向高羊毛氨酸的MetB催化的轉化效率和/或產率或抑制所述轉化來減小和/或防止曱硫氨酸途徑中高羊毛氨酸的形成和/或積累。減小O-乙酰-高絲氨酸和高半胱氨酸向高羊毛氨酸的MetB催化的轉化效率或抑制所述轉化指與MetB的活性沒有改變的產生曱硫氨酸的微生物中高羊毛氨酸的效率和/或產率和/或量相比，高羊毛氨酸以小于90%、小于70%、小于50%、小于30%、小于25%、小于20%、小于15%、小于10%、小于5%或小于2%的效率和/或產率和/或量產生。額外或備選地，通過提高高羊毛氨酸與水的MetC催化的切割成高半胱氨酸、2-氧代丁酸和NH/的效率和/或產率可以減小和/或防止甲硫氨酸途徑中高羊毛氨酸的形成和/或積累。提高高羊毛氨酸與水的MetC催化的切割成高半胱氨酸、2-氧代丁酸和NH/的效率指與MetB和/或MetC的活性不改變的產生甲硫氨酸的微生物中的效率和/或產率和/或量相比，從高羊毛氨酸產生高半胱氨酸的效率和/或產率和/或量增加至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少98%。如果轉錄調節(jié)蛋白McbR的含量和/或生物活性與野生型微生物相比減小，那么微生物中L-甲硫氨酸合成的效率和/或產率可以甚至進一步提高。所以，在本發(fā)明的一方面，提供了微生物，其中轉錄調節(jié)蛋白McbR的含量和/或生物活性與野生型微生物相比減小，并且其中防止了甲硫氨酸途徑中高羊毛氨酸的形成。微生物如谷氨酸棒桿菌中轉錄調節(jié)子McbR的敲除對細胞代謝具有嚴重的后果。例如，谷氨酸棒桿菌中轉錄調節(jié)子McbR的敲除對細胞代謝具有強烈影響。表型包括減慢的生長、降低的生物量產率和甲硫氨酸前體如半胱氨酸和高半胱氨酸的細胞內積累。有趣的是，不能觀察到甲硫氨酸積累。然而，在本發(fā)明上下文中已經發(fā)現McbR的敲除也導致高羊毛氨酸的積累和蘇氨酸獨立的異亮氨酸合成。在以前的研究中已經描述了其他生物的高羊毛氨酸積累。大腸桿菌的甲硫氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株積累大量的高羊毛氨酸(Hiiang，H.T.，Biochemistry1963，2，296-8)。曱硫氨酸營養(yǎng)缺陷型構巢曲霉(Aspergillusnidulans)也積累高羊毛氨酸(Paszewski,A"Grabski，J"ActaBiochim.Pol.1975,223,263-8)。所研究的兩種生物的共同之處是曱硫氨酸合酶的敲除。人肝臟胱硫醚酶也可以積累高羊毛氨酸(Tallan，H.H.等人，BiochemBiophysResCommun1971，432,303-10)。此夕卜，將日音色產色鏈霉菌(Streptomycesphaeochromogenes)的胱硫醚酶用于體外合成高羊毛氨酸(Kanzaki，H.等人，AgricBiolChem1986，502，391-397)并且來自擬南芥(Arabidopsisthaliana)的胱硫醚v合酶在體外從高半胱氨酸和O-乙?；?高絲氨酸產生高羊毛氨酸(Ravanel，S.等人，BiochemJ1998,331(Pt2)，639-48)。對于生物如谷氨酸棒桿菌，現在已經發(fā)現高羊毛氨酸的形成(圖3)是由于高細胞內高半胱氨酸水平引起的MetB的副反應。由于低底物特異性和升高的高半胱氨酸滴定度，MetB意外地利用高半胱氨酸代替半胱氨酸與O-乙?；?高絲氨酸一起作為底物。該反應產生高羊毛氨酸而不是胱硫醚。MetC對高羊毛氨酸的弱切割導致高羊毛氨酸的大量積累。升高的高半胱氨酸水平，特別是在McbR敲除菌林(其也被稱作谷氨酸棒桿菌AMcbR菌抹)中升高的高半胱氨酸水平可以由高絲氨酸脫氫酶(Hom)、O-乙?；呓z氨酸硫化氫解酶(MetZ)和S-腺苷甲硫氨酸合酶(MetK)的過表達引起(Rey等人，2003,同上)。Hom和MetZ可能導致高半胱氨酸滴定度的直接升高，而MetK將甲硫氨酸轉化成SAM，其然后通過S-腺苷高半胱氨酸轉變成為高半胱氨酸。除了升高的高半胱氨酸水平外，McbR敲除菌林中MetB的過表達也促進高羊毛氨酸形成?，F在已經發(fā)現McbR敲除菌林的凈且提物與野生型相比可以顯示出幾乎3倍的MetB活性。為了證實通過MetB的副反應在谷氨酸棒桿菌中形成高羊毛氨酸，在谷氨酸棒桿菌AMcbR中敲除MetB。MetB的敲除完全防止了谷氨酸棒桿菌AMcbR中高羊毛氨酸的積累，從而支持了我們的發(fā)現。MetC對高羊毛氨酸的緩慢切割導致打開代謝循環(huán)，其中高半胱氨酸被回收，但是O-乙?；?高絲氨酸被轉化為乙酸、2-氧代丁酸和氨。該循環(huán)不僅僅浪費乙?；?CoA，而是提供了重要的異亮氨酸前體2-氧代丁酸。這使得AMcbR菌林能夠通過蘇氨酸獨立的途徑合成異亮氨酸。所以，根據本發(fā)明的另一實施方案，與野生型微生物相比，通過減少胱硫醚-Y-合酶(MetB)的含量和/或生物活性，減小和/或防止了微生物的甲硫氨酸途徑中高羊毛氨酸的形成和/或積累。通過減弱和/或破壞和/或除去編碼MetB的基因，胱硫醚-Y-合酶(MetB)的含量和/或生物活性與野生型微生物相比被降低。具體地，根據本發(fā)明的微生物中被破壞的MetB基因防止表達功能性MetB蛋白質。如實施例中所示，MetB的敲除完全防止了微生物如谷氨酸棒桿菌和谷氨酸棒桿菌AMcbR中高羊毛氨酸的積累。此外，通過導入編碼胱硫醚-p-裂合酶(MetC)突變體的異源基因，減小和/或防止了曱硫氨酸途徑中高羊毛氨酸的形成，所述突變體能夠將高羊毛氨酸有效轉變?yōu)楦甙腚装彼?。能夠將高羊毛氨酸有效轉變?yōu)楦甙腚装彼岬碾琢蛎?p-裂合酶(MetC)突變體的特征在于從高羊毛氨酸產生高半胱氨酸的效率和/或產率和/或量與MetB和/或MetC的活性沒有改變的產生曱硫氨酸的微生物中的效率和/或產率和/或量相比增加至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少卯％、至少95%或至少98%。高半胱氨酸和半胱氨酸的積累可以被認為對于曱硫氨酸過量產生是有益的，尤其如果積累的高半胱氨酸通過metH和/或metE的活性被催化而進一步代謝成甲硫氨酸。此外，通過導入編碼胱硫醚個合酶(MetB)突變體的異源基因可以減小和/或防止甲硫氨酸途徑中高羊毛氨酸的形成，所述突變體能夠將O-乙?；?高絲氨酸和半胱氨酸有效轉化為胱硫醚并且不能將O-乙?；?高絲氨酸和高半胱氨酸轉化為高羊毛氨酸。能夠將O-乙?；?高絲氨酸和半胱氨酸有效轉化為胱硫醚的胱硫醚個合酶(MetB)突變體的特征在于從半胱氨酸和O-乙?；?高絲氨酸產生胱硫醚的效率和/或產率和/或量與MetB的活性沒有改變的產甲石克氨酸的^L生物中的效率和/或產率和/或量相比增加至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少98%。不能將O-乙?；?高絲氨酸和高半胱氨酸轉化為高羊毛氨酸的胱硫醚-，合酶(MetB)突變體的特征在于產生高羊毛氨酸的效率和/或產率和/或量與MetB的活性沒有改變的產甲硫氨酸的微生物中的效率和/或產率和/或量相比小于70%、小于50%、小于30%、小于25%、小于20%、小于15%、小于10%、或小于5%。根據本發(fā)明的另一實施方案，提供了微生物，其中選自O-乙酰基-高絲氨酸硫化氫解酶(MetZ)、鈷(I)胺素依賴性甲硫氨酸合酶I(MetH)和鈷(I)胺素獨立的甲硫氨酸合酶II(MetE)的蛋白質的含量和/或生物活性與野生型微生物相比被增強和/或過表達。酶的含量或量和/或生物活性的增加或減小必須在反應應該被進一步推進或引導的方向方面理解。將增加酶的含量和/或生物活性或減小酶的含量和/或生物活性理解為以這樣的方式影響酶的量和/或活性使得得到更多或更少的根據圖1中所示途徑的產物。在本發(fā)明的一個實施方案中，修飾甲硫氨酸途徑的僅僅一種酶的量和/或活性可以是足夠的。備選地，可以修飾該代謝途徑的多種酶的量和/或活性。備選地，可以同時影響甲硫氨酸途徑的多種或所有酶的量和/或活性。怎樣通過遺傳修飾得到此類生物屬于本領域中常識。在下面的表中給出了甲硫氨酸途徑的酶的特定實例，可以修飾所述酶的含量和/或生物活性以便增加曱硫氨酸合成效率。表l插入p24-31表1通過在遺傳上改變本發(fā)明的生物，可以增加甲硫氨酸合成的效率和/或產率，使得這些過量產生甲硫氨酸的生物的特征在于以優(yōu)選至少50%、至少60%、至少65%、至少70。/q、至少750/。、至少80°/。、或至少85%的效率和/或產率產生甲硫氨酸。與野生型孩史生物相比，根據本發(fā)明的過量產生曱硫氨酸的生物中曱硫氨酸生產的效率和/或產率和/或量優(yōu)選增加至少100%、至少200°/。、至少300%、至少400%、至少500%、至少600%、至少700%、至少800%、至少卯0%或至少10000%或以上。根據本發(fā)明的微生物可以選自棒桿菌細菌、分枝桿菌、鏈霉菌、沙門氏菌屬、大腸桿菌、志賀氏菌屬、芽孢桿菌屬、沙雷氏菌屬和假單胞菌屬。本發(fā)明的生物優(yōu)選包括棒桿菌屬，尤其嗜乙酰乙酸棒桿菌(Corynebacteriumacetoacidophilum)、C.acetoglutamicum、嗜乙酰棒桿菌(C.acetophilum)、C.ammoniagenes、谷氛酸棒桿菌、百合棒桿菌(C.lilium)、C.nitrilophilus或C.spec的孩先生物。4艮據本發(fā)明的生物還包括短桿菌屬(Brevibacterium)成員，如Brevibacteriumharmoniagenes、Brevibacteriumbotanicum、B.divaraticum、B,flavam、希氏短軒菌(B.healii)、B.ketoglutamicum、B.ketosoreductum、B.lactofermentum、B.linens、B.paraphinolyticum和B.spec。具體地，4奉桿菌屬樣i生物可以選自谷氨酸棒桿菌(ATCC13032)、Corynebacteriumacetoglutamicum(ATCC15806)、嗜乙酰乙酸棒桿菌(ATCC13870)、Corynebacteriumthermoaminogenes(FERMBP-1539)、棲糖蜜才奉桿菌(Corynebacteriummelassecola)(ATCC17965)、谷氨酸棒桿菌(KFCC10065)、谷氨酸棒桿菌(DSM17322)、Corynebacteriumeffidens(YS-314)和谷氨酸才奉桿菌(ATCC21608)。縮寫KFCC指韓國典型培養(yǎng)物保藏中心(KoreanFederationofCultureCollection),而縮寫ATCC指美國典型培養(yǎng)物保藏中心(AmericanTypeStrainCultureCollectionCollection)?？s寫DSM指德意志微生物保藏中心(GermanResourceCentreforBiologicalMaterial)。埃希氏菌屬^t生物可以選自大腸桿菌。沙門氏菌屬^:生物可以選自鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)。在本發(fā)明的一些實施方案中，所述生物選自谷氨酸棒桿菌、大腸桿菌、釀酒酵母和枯草芽孢桿菌。關于增加或減少酶的含量或量和/或生物活性，可以使用本領域中已知的用于增加宿主如上述生物中蛋白質的量和/或活性的所有方法。通過表達各自蛋白質的外源形式可以增加酶的量。此外，通過影響啟動子和/或增強子元件的活性和/或其他調節(jié)活性，如磷酸化、蘇素化、泛蛋白化等等，可以增加內源蛋白質的表達，所述啟動子和/或增強子元件的活性和/或其他調節(jié)活性在轉錄、翻譯或翻譯后水平上調節(jié)各自蛋白質的活性。此外，簡單地增加例如前述酶的量、所述蛋白質的活性可以通過使用酶增加，所述酶攜帶允許該酶的增加的活性的特定突變。此類突變可以例如，失活酶的負責反饋抑制的區(qū)域。通過突變，例如，通過導入非保守突變，所述酶不再提供反饋調節(jié)并且從而如果產生了更多產物，該酶的活性不被下調?？梢詫⑼蛔儗朊傅膬仍纯截愔?，或者可以通過過表達外源酶的對應的突變形式來提供。此類突變可以包含點突變、缺失或插入。點突變可以是保守的或非保守的。此外，缺失可以包含僅僅兩個或三個氨基酸到各自蛋白質的整個結構域。從而，蛋白質活性和量的增加可以通過不同的途徑實現，例如，通過在轉錄、翻譯或蛋白質水平關閉抑制性調節(jié)機制或者通過與野生型相比增加編碼這些蛋白質的核酸的基因表達，例如，通過誘導內源metC基因或者通過導入編碼MetC的核酸。在一個實施方案中，與野生型相比酶活性和量各自的增加通過增加編碼此類酶如MetC、MetZ、MetE和MetH的核酸的基因表達來實現?？梢詮母髯詳祿烊缭贜CBI(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/)、EMBL(httD:〃www.embl.org)、Expasv(http:〃www.expasv.org/)、KEGG(http:〃www.genome.ad.ip/kegg/kegg.html)等等得到序列。實例在表1中給出。在進一步的實施方案中，通過向生物，優(yōu)選谷氨酸棒桿菌或大腸桿菌中導入編碼表l中酶的核酸來增加表l中酶的量和/或活性。原則上，可以使用具有表l中所列蛋白質的酶促活性的不同生物的蛋白質(如果設想增加所述量和/或活性)。對于真核生物來源的此類酶的含有內含子的基因組核^列，對于宿主生物不能或不可以使得能夠剪接對應的mRNA的情況，將使用已經被加工的核酸序列，像對應的cDNA。說明書中提到的所有核酸可以是例如RNA、DNA或cDNA序列。在根據本發(fā)明的用于制備具有提高的曱硫氨酸合成效率的生物的一個方法中，將編碼上述功能或非功能的反饋調節(jié)的或反饋獨立的酶之一的核酸序列轉移到微生物如谷氨酸棒桿菌或大腸桿菌中。該轉移分別導致酶的表達增加和對應地通過所希望的反應途徑的更多的代謝流量。根據本發(fā)明，增加或導入蛋白質的量和/或活性通常包括下面的步驟a)產生載體，其在5，到3'方向包含下面的核酸序列，優(yōu)選DNA序列-在本發(fā)明的生物中有功能的啟動子序列；-有效連接到其的編碼表l蛋白質或其功能等同部分的DNA序列；-在本發(fā)明的生物中有功能的終止序列；b)將來自步驟a)的載體轉移到本發(fā)明的生物，如谷氨酸棒桿菌或大腸桿菌中并任選地，整合到各自的基因組中。當在本發(fā)明的范圍內提到酶的功能等同部分時，意指編碼表l的酶的核列的片段，其表達將導致具有各自全長蛋白質的酶促活性的蛋白質。根據本發(fā)明，非功能酶具有與其功能酶和功能等同部分分別相同的核酸序列和氨基酸序列，但是在一些位置具有核苷酸或氨基酸的點突變、插入或缺失，導致所述非功能酶不能或者僅僅在非常有限的程度上能夠催化各自的反應。這些非功能酶與仍然能夠催化各自反應但是不再被反饋調節(jié)的酶不同。非功能酶也包含表l中的此類酶，其在核酸序列水平或氨基酸序列水平具有點突變、插入或缺失，并且不能夠或仍然能夠與所述酶的生理學結合配偶體相互作用。此類生理學結合配偶體包含例如，各自的底物。非功能突變體不能夠催化這樣的反應，而衍生該突變體的野生型酶可以催化所述反應。根據本發(fā)明，術語"非功能酶"不包含此類基因或蛋白質，其與各自的功能酶在氨基酸水平和核酸水平分別具有非必需序列同源性。不能催化各自反應并且與各自的酶不具有必需序列同源性的蛋白質因此在定義上不是指術語本發(fā)明的"非功能酶"。在本發(fā)明的范圍內，非功能酶也稱作失活的或者無活性的酶。因此，根據本發(fā)明的具有上述點突變、插入和/或缺失的表l的非功能酶的特征是與才艮據本發(fā)明的表1的野生型酶或者其功能等同部分具有基本的序列同源性。根據本發(fā)明，通常將基本序列同源性理解為指DNA分子或蛋白質各自的核i^f列或氨基^列與表1中蛋白質或其功能等同部分的核^列或氨基酸序列具有至少40%同一性、優(yōu)選至少50%同一性、更優(yōu)選至少60%同一性、還優(yōu)選至少70%同一性、尤其優(yōu)選至少90%同一性、尤其優(yōu)選至少95%同一性、最優(yōu)選至少98%同一性。將兩種蛋白質的同一性理解為在蛋白質的各自全長上氨基酸的同一性，尤其通過借助DNAStar,Inc.,Madison,Wisconsin(USA)的Lasergene軟件應用CLUSTAL方法(Higgins等人,(1989)，Comput.Appl.Biosci.，5(2)，151)比較計算的同一性。借助DNAStar,Inc.,Madison,Wisconsin(USA)的Lasergene軟件應用CLUSTAL方法(Higgins等人,(1989),Comput.Appl,Biosci.,5(2)，151)也可以計算同源性。將相應地理解DNA序列的同一性。上述方法可以用于增加編碼表l的功能或非功能的、反饋調節(jié)的或反饋獨立的酶或其功能等同部分的DNA序列的表達。包含調節(jié)序列，像啟動子和終止子序列的此類栽體的用途是本領域技術人員已知的。此外，本領域技術人員知道怎樣將來自步驟a)的載體轉移到生物如谷氨酸棒桿菌或大腸桿菌中和載體的哪些性質必須能夠整合到它們的基因組中。如果通過將編碼來自另一生物像例如大腸桿菌的酶的核酸轉移來增加生物如谷氨酸棒桿菌中的酶含量，那么希望轉移例如來自大腸桿菌的核酸序列編碼的氨基酸序列，通過將所述多肽序列根據遺傳密碼回譯成主要包含那些密碼子的核酸序列進行所述轉移，所述那些密碼子由于生物特異性密碼子用法而被更通常地使用。通過相關生物的已知其他基因的計算機評估可以確定密碼子用法。根據本發(fā)明，還將編碼表1酶的核酸的基因表達和活性的增加理解為操作生物、尤其谷氨酸棒桿菌或大腸桿菌的各自內源酶的表達。這可以例如，通過改變編碼這些酶的基因的啟動子DNA序列來實現。通過DNA序列的缺失或插入可以實現此類改變，所述改變導致這些酶的改變的、優(yōu)選增加的表達速率。內源基因的啟動子序列的改變通常導致該基因的表達量的改變和因此也導致在細胞或生物中可檢測到的活性的改變。此外，通過調節(jié)蛋白可以實現內源基因的分別改變的和增加的表達，所述調節(jié)蛋白不在轉化的生物中發(fā)生并且與這些基因的啟動子相互作用。這種調節(jié)子可以是由DNA結合結構域和轉錄激活結構域組成的嵌合蛋白質，如WO96/06166中所述。增加內源基因的活性和含量的另一可能性是例如通過過表達上調涉及內源基因轉錄的轉錄因子。轉錄因子過表達的測量是本領域技術人員已知的并且也為本發(fā)明范圍內的表l的酶公開。此外，通過內源基因拷貝的定向誘變可以實現內源基因活性的改變。通過影響酶的翻譯后修飾可以實現編碼表1酶的內源基因的改變。這可以例如，通過調節(jié)涉及酶的轉錄后修飾的酶像激酶或磷酸酶的活性來實現，通過對應的措施像過表達或基因沉默可以實現所述調節(jié)。在另一實施方案中，可以提高酶的效率，或者可以破壞它的別構控制區(qū)使得防止化合物生產的反饋抑制。類似地，通過替代、缺失或添加可以缺失或改變降解酶4吏得它對于表1的目的酶的降解活性降低而不損害細胞的生活力。在每種情況下，可以增加這些希望的精細化學品之一的總體產率或生產速率。還可能的是表1的蛋白質和核酸分子中的此類改變可以提高除了甲硫氨酸之外的精細化學品的產量，所述精細化學品為如其他含硫化合物，像半胱氨酸或谷胱甘肽、其他氨基酸、維生素、輔因子、營養(yǎng)制品、核苷酸、核苷和海藻糖。任一種化合物的代謝必定與細胞內的其他生物合成和降解途徑纏繞，并且一個途徑中的必需輔因子、中間體或底物可能由另一此類途徑提供或限制。因此，通過調節(jié)表l的一種或多種蛋白質的活性，除了可以影響導致甲硫氨酸的途徑外，還可以影響另一精細化學品生物合成或降解途徑的活性產生或效率。也可以基于來自不同代謝過程的化合物的細胞水平調節(jié)酶表達和功能，并且基本生長必須的分子如氨基酸和核苷酸的細胞水平可以重要地影響大規(guī)模培養(yǎng)的微生物的生活力。從而，調節(jié)表1的酶的氨基酸生物合成酶使得它們不再應答反饋抑制或者使得它們的效率或更新提高將導致通過甲硫氨酸生產途徑的代謝流量更高。這些上述用于增加或引入表l酶的量和/或活性的策略不意在限定；這些策略的改變將是本領域普通技術人員容易明白的。對于降低或抑制或減少表1任一種酶的量或含量和/或活性，也可以利用多種策略。例如，通過特異結合基因啟動子序列的適體的表達也可以調節(jié)表l的內源酶的表達。取決于結合刺激性或抑制性啟動子區(qū)的適體，表l酶的量和(在該情況中)活性可以;故增加或減少。還可以以這樣的方式設計適體以便特異結合酶自身和例如通過結合各自酶的催化中心減小酶的活性。適體的表達通常通過基于載體的過表達(見(Famulok等人，(1999)CurrTopMicrobiolImmunol,243,123-36)。此外，通過本領域技術人員公知的多種實驗措施可以實現減小表l的內源酶的量和活性。這些措施通常以術語"基因沉默"或"減弱基因"或"破壞基因，，或"消除基因"概述。例如，可以沉默內源基因的表達，通過將具有編碼反義順序的所述酶或其部分的DNA序列的上述載體轉移到生物如谷氨酸棒桿菌和大腸桿菌可以實現所述沉默。這是基于細胞中此類載體的轉錄導致RNA，其可以與內源基因轉錄的mRNA雜交并且因此防止其翻譯?？梢赃x擇有效連接以反義方向克隆的核酸的調節(jié)序列，其指導所述反義RNA分子在多種細胞類型中的連續(xù)表達，例如，可以選擇病毒啟動子和/或增強子或者調節(jié)序列，其指導反義RNA的組成型、防止特異性或細胞特異性表達。反義表達載體可以是重組質粒、噬菌?；蛘邷p毒病毒的形式，其中產生處于高效調節(jié)區(qū)控制下的反義核酸，其活性可以通過在載體所導入的細胞類型確定。關于使用反義基因調節(jié)基因表達的討論，見Weintraub,H.等人,AntisenseRNAasamoleculartoolforgeneticanalysis,Reviews-TrendsinGenetics,Vol.l(l)，1986。原則上，反義策略可以與核酶方法結合。核酶是催化活性RNA序列，其如果偶聯到反義序列，就催化切割靶序列(Tanner等人，(1999)FEMSMicrobiolRev.23(3)，257-75)。這可以增強反義策略的效率。在植物中，通過RNA干擾或稱作共抑制的方法實現基因沉默。其他方法是通過向生物中引入RNA/DNA寡核苷酸(Zhu等人，(2000)Nat.Biotechnol.18(5)，555-558)或借助同源重組產生敲除突變體(Hohn等人,(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.96，8321國8323.)向內源基因中引入無義突變。為了產生同源重組微生物，制備含有編碼表l的酶的基因的至少一部分的載體，所述基因中已經被引入缺失、添加或替代從而改變，如功能上破壞所述內源基因。優(yōu)選地，該內源基因是谷氨酸棒桿菌或大腸桿菌基因，但是它可以是來自相關細菌或甚至來自酵母或植物來源的同源物。在一個實施方案中，設計載體使得當同源重組時，內源基因被功能地破壞，即，不再編碼功能蛋白，所述載體也被稱作"敲除"載體。備選地，可以設計載體使得當同源重組時，內源基因被突變或改變但是仍然編碼功能蛋白(例如，可以改變上游調節(jié)區(qū)從而改變表l的內源酶的表達)。在同源重組載體中，所述內源基因的改變部分在其5，和3'末端側是該內源基因的額外核酸以允許在載體攜帶的外源基因和(微)生物中內源基因之間發(fā)生同源重組。所述額外的側翼內源核酸對于與內源基因的成功的同源重組具有足夠長度。通常，在載體中包括幾百堿基到幾千堿基的側翼DNA(都在5，和3，末端)(同源重組載體的描述見例如，Thomas,K.R.，和Capecchi，M.R.(1987)Ce1151:503和SchSfer等人Gene.1994145:69-73.)。使用已知的技術將載體導入微生物(例如，電穿孔)中，并且選擇其中所導入的內源基因已經與表1的內源酶同源重組的細胞。在另一實施方案中，破壞宿主中表l酶的內源基因(例如，通過同源在另一實施方案中，宿主中表l酶的內源基因或引入的基因已經通過一種或多種點突變、缺失或倒位改變，但是仍然編碼功能酶。在再一個實施方案中，(微)生物中表l酶的內源基因的一種或多種調節(jié)區(qū)(例如，啟動子、阻遏物或誘導物)已經被改變(例如，通過缺失、截短、倒位或點突變)，使得調節(jié)內源基因的表達。本領域技術人員將明白含有編碼表l的酶和蛋白質修飾的一種以上的基因的宿主細胞可以用本發(fā)明的方法容易地產生，并且意在被本發(fā)明包括。此外，通過特異性DNA結合因子，如鋅指轉錄因子類型的因子也可能進行基因抑制(以及基因過表達)。此外，可以將抑制靶蛋白自身的因子導入細胞中。蛋白質結合因子可以例如是上述適體(FamuIok等人，(1999)CurrTopMicrobiolImmunol.243，123-36)。其他蛋白質結合因子可以選自酶特異性抗體，所述蛋白質結合因子在生物中的表達引起表l酶的量和/或活性減少。單克隆、多克隆或重組酶特異性抗體的產生按照標準方案(GuidetoProteinPurification,Meth.Enzymol.182，pp.663-679(19卯)，M.P.Deutscher，ed.)?？贵w的表達也可以從文獻知道(Fiedler等人，(1997)Immunotechnology3，205-216;Maynard和Georgiou(2000)Annu.Rev.Biomed.Eng.2，339-76)。所提到的技術是本領域技術人員公知的。因此，還公知用于例如反義方法的核酸構建體必須具有多大的大小和各自的核酸序列必須具有多高的互補性、同源性或同一性。術語互補性、同源性和同一性是本領域^a術人員已知的。在本發(fā)明范圍內，序列同源性和同源性分別通常被理解為指DNA分或蛋白質分子的各自的核酸序列或氨基酸序列有至少40%、優(yōu)選至少50%、更優(yōu)選至少60%、還優(yōu)選至少70%、尤其優(yōu)選至少卯％、尤其優(yōu)選至少95%、最優(yōu)選至少98%同一性。這里，同源性和同一性程度分別指編碼序列的全長。術語"互補性"描述核酸分子與另一核酸分子由于兩個互補堿基之間的氫鍵而雜交的能力。本領域技術人員已知為了能夠相互雜交，兩個核酸分子不必具有100%互補性。與另一核酸序列雜交的核酸序列優(yōu)選與所述另一核酸核酸序列至少40%、至少50%、至少60%、優(yōu)選至少70%、尤其優(yōu)選至少80%、還尤其優(yōu)選至少90%、尤其優(yōu)選至少95%，最優(yōu)選至少98或100%互補。如果核酸分子在相同的5，-3，順序具有相同的核苷酸，那么這些核酸分子是同一的。反義序列與內源mRNA序列的雜交通常在細胞條件下在體內發(fā)生或在體外發(fā)生。根據本發(fā)明，在體內或在體外在足夠嚴格以確保特異雜交的條件下進行雜交。(見例如，Sambrook等人,MolecularCloning,ColdSpringHarborPress)。術語"特異雜交"指這樣的情況，其中在嚴格條件下，分子優(yōu)先結合某個核酸序歹'J(如果該核酸序列是例如，DNA或RNA分子的復雜混合物的部分)。術語"嚴格條件"因此指這樣的條件，在此類條件下，核酸序列優(yōu)先結合靶序列，但是不結合或至少在限制降低的程度下結合其他序列。嚴格條件取決于環(huán)境。較長的序列在較高溫度下特異雜交。通常，以這樣的方式選擇嚴格條件使得雜交溫度比使用確定的離子強度和確定的pH值時特定序列的解鏈溫度(Tm)低約5°C。Tm是與靼序列互補的分子中50%的分子與所述耙序列雜交時的溫度(使用確定的pH值、確定的離子強度和確定的核酸濃度)。通常，嚴格條件包括0.01到l.OM鈉離子(或者另一種鹽的離子)的鹽濃度和7.0到8.3之間的pH值。對于短的分子(例如，對于包含10到50個核苷酸的此類分子)，溫度為至少30。C。此外，嚴格條件可以包括加入去穩(wěn)定劑，像例如，曱酰胺。典型的雜交和洗滌緩沖液為下面的組成。預雜交溶液0.5%SDS5xSSC50mMNaP04，pH6.80.1%焦磷酸鈉5xDenhardt試劑100照鮭精雜交溶液預雜交溶液lx106cpm/mL探針(5-10min95°C)20xSSC:3MNaCl0.3M檸檬酸鈉用HC1調節(jié)pH750xDenhardt試劑5g菲可5g聚乙烯吡咯烷酮5g牛血清白蛋白調節(jié)到500mLA.dest.雜交的典型步驟如下任選的在lxSSC/0.1%SDS中65°C洗滌印跡30分鐘預雜交50-55。C下至少2h雜交55-60。C下過夜洗滌5分鐘2xSSC/0.1%SDS雜交溫度30miii雜交溫度30min雜交溫度45mill5min2xSSC/0.1%SDSlxSSC/0.1%SDS0.2xSSC/0.1%SDS65。CO.lxSSC室溫術語"有義"和"反義"以及"反義方向"是本領域技術人員已知的。此外，本領域技術人員已知用于反義方法的核酸分子必須多長和它們與它們的靶序列必須具有多高的同源性或互補性。因此，本領域技術人員也已知用于基因沉默方法的核酸分子必須多長。對于反義目的，在100個核苷酸、80個核苷酸、60個核苷酸、40個核苷酸和20個核苷酸的序列長度上的互補性可以是足夠的。更長的核苷酸長度將當然也是足夠的。也可以想到上述方法的組合應用。如果根據本發(fā)明，使用在5，-3，方向有效連接到在生物中有活性的啟動子的DNA序列，那么通?？梢詷嫿ㄝd體，其在轉移到生物的細胞后，允或竟爭和阻斷。特定酶的活性也可以通過在生物中過表達其非功能突變體而減小。從而，不能催化所討論的反應但是能夠結合例如底物或輔因子的非功能突變體可以通過過表達勝過內源酶并且因此抑制所述反應。用于減小宿主細胞中酶的量和/或活性的其他方法是本領域技術人員公知的。本發(fā)明的另一方面涉及載體，優(yōu)選表達載體，其含有編碼表l的酶(或其部分)的核酸或其組合。如本文所用的術語"載體"指核酸分子，其能夠運輸它已經連接的另一核酸分子。一種類型的載體是"質粒"，其指環(huán)狀雙鏈DNA環(huán)，其中可以連接額外的DNA區(qū)段。另一類型的載體是病毒栽體，其中可以將額外的DNA區(qū)段連接到病毒基因組中。某些載體能夠在它們所導入的宿主細胞中自主復制(例如，具有細菌復制原點的細菌載體和附加型哺乳動物載體)。其他載體(例如，非附加型哺乳動物載體)當導入宿主細胞時整合到宿主細胞的基因組中，從而隨著宿主基因組一起復制。此外，某些載體能夠指導它們有效連接的基因的表達。此類載體在本文中被稱作"表達載體"。通常，在重組DNA技術中使用的表達載體通常為質粒形式。在本申請中，"質粒"和"載體"可以互換使用，因為質粒是最常用的載體形式。然而，本發(fā)明不意在包括此類其他形式的表達載體，如病毒載體(例如，復制缺陷型逆轉錄病毒、腺病毒和腺伴隨病毒)，其具有等同功能。本發(fā)明的重組表達載體可以包含編碼表1的酶的核酸，其為適于在宿主細胞中表達各自核酸的形式，這表示所述重組表達載體包括基于用于表達的宿主細胞所選的一種或多種調節(jié)序列，其有效連接待表達的核酸序列。在重組表達載體中，"有效連接"意指目的核苷酸序列以允許表達所述核苷列(例如，在體外轉錄/翻譯系統中或當載體被導入宿主細胞時在宿主細胞中)的方式連接到調節(jié)序列。術語"調節(jié)序列"意在包括啟動子、抑制子結合位點、激活子結合位點、增強子和其他表達控制元件(例如，終止子、多聚腺苷酸化信號，或者mRNA二級結構的其他元件)。此類調節(jié)序歹'J伊J長口在Goeddel;GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology185，AcademicPress,SanDiego,CA(19卯)中描述。調節(jié)序列包括指導核苷酸序列在多種類型的宿主細胞中組成型表達的那些調節(jié)序列和指導核苷酸序列僅僅在某些宿主細胞中表達的那些調節(jié)序列。優(yōu)選的調節(jié)序列是例力口，啟動子，長口cos-、tac畫、trp-、tet國、trp畫tet-、lpp曙、lac畫、lpp-lac-、laclq-、T7-、T5-、T3曙、gal-、trc-、ara-、SP6-、arny、SP02、e-Pp-orePL、sod、ef-tu、groE，它們優(yōu)選在細菌中使用。額外的調節(jié)序列是例如來自酵母和真菌的啟動子，如ADC1、MFa、AC、P-60、CYCl、GAPDH、TEF、rp28、ADH，來自植物的啟動子，如CaMV/35S、SSU、OCS、lib4、usp、STLS1、B33、nos或泛蛋白或菜豆蛋白啟動子。還可能使用人工啟動子。本領域技術人員將理解表達載體的設計可以取決于諸如待轉化的宿主細胞的選擇、所希望的蛋白質表達水平等因素?？梢詫⒈景l(fā)明的表達載體導入宿主細胞中從而產生編碼表1中酶的核酸所編碼的蛋白質或肽，包括融合蛋白或肽?？梢栽O計本發(fā)明的重組表達載體用于在原核或真核細胞中表達表1的酶。例如，可以在細菌細胞，如谷氨酸棒桿菌、枯草芽孢桿菌和大腸桿菌、昆蟲細胞(使用桿狀病毒表達載體)、酵母和其他真菌細胞(見Romanos，M.A,等人(1992)，Yeast8:423-488;vandenHondel，C.A.M.J.J.等人(1991)在MoreGeneManipulationsinFungi,J.W.Bennet&L.L.Lasure，編著，p.396-428:AcademicPress:SanDiego;和vandenHondel,C.A.M，J.J.&Punt,P.J.(1991)在AppliedMolecularGeneticsofFungi，Peberdy，J.F.等人，編著，p.1-28，CambridgeUniversityPress:Cambridge)、藻類和多細胞才直物細胞(見Schmidt,R.和Willmitzer，L.(1988)PlantCellR印.583-586)中表達表1的酶的基因。合適的宿主細胞在Goeddel，GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology185，AcademicPress,SanDiego，CA(19卯)中進一步討論。備選地，例如使用T7啟動子調節(jié)序列和T7聚合酶，可以在體外轉錄和翻譯重組表達載體。通常用含有指導融合或非融合蛋白質表達的組成型或誘導型啟動子的載體進行原核生物中蛋白質的表達。融合載體向其中編碼的蛋白質加入許多氨基酸，通常加入重組蛋白的氨基末端，也加入C-末端或者融合在蛋白質中合適的區(qū)域中。合適的融合載體通常用于三種目的1)增加重組蛋白質的表達；2)增加重組蛋白的溶解度；和3)通過作為親和純化中的配體幫助重組蛋白的純化。通常，在融合表達載體中，將蛋白酶剪切位點導入融合部分和重組蛋白的接頭處以使得能夠在純化融合蛋白后分離重組蛋白與融合部分。此類酶，和它們的同源識別序列包括因子Xa、凝血酶和腸激酶。典型的融合表達載體包括pQE(Qiagen)、pGEX(PharmaciaBiotechInc;Smith,D.B.和Johnson,K.S.(1988)Gene67:31-40)、pMAL(NewEnglandBiolabs，Beverly,MA)和pRIT5(Pharmacia，Piscataway，NJ)，它們分別融合谷胱甘肽S轉移酶(GST)、麥芽糖E結合蛋白或者蛋白A。谷氨酸棒桿菌載體的實例可以見棒桿菌手冊2005Eggeling，L.Bott，M.，編者.，CRCpressUSA。合適的誘導型非融合大腸桿菌表達載體的實例包括pTrc(Amann等人，(1988)Gene69:301-315)、pLG338、pACYC184、pBR322、pUC18、pUC19、pKC30、pRep4、pHSl、pHS2、pPLc236、pMBL24、pLG200、pUR2卯、pIN-III113-Bl、egtll、pBdCI和pETlld(Studier等人，GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology185，AcademicPress,SanDiego,California(19卯)60曙89;和Pouwels等人，編著(1985)CloningVectors.Elsevier:NewYorkIBSN0444904018)。耙基因從pTrc載體的表達依賴于宿主RNA聚合酶從雜合trp-lac融合啟動子的轉錄。靶基因從pETlld載體的表達取決于共表達的病毒RNA聚合酶(T7gnl)從T7gnlO-lac融合啟動子的轉錄。該病毒聚合酶由宿主菌株BL21(DE3)或HMS174(DE3)從含有處于lacUV5啟動子的轉錄控制下的T7gnl基因的固有的X原噬菌體提供。對于其他品種細菌的轉化，可以選擇合適的載體。例如，已知質粒pIJ101、pIJ364、pIJ702和pIJ361可用于轉化鏈霉菌，而質粒pUBllO、pC194或pBD214適于轉化芽孢桿菌種。用于將遺傳信息轉移到纟奉桿菌中的一些質粒包括pHM1519、pBLl、pSA77或pAJ667(Pouwels等人，編著(1985)CloningVectors.Elsevier:NewYorkIBSN0444904018)。最大化重組蛋白質表達的一種策略是在蛋白酶剪切重組蛋白的能力受損的宿主細菌中表達所述蛋白質(Gottesman，S.，GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology185，AcademicPress,SanDiego，California(19卯)119-128)。另一種策略是改變將插入到表達載體中的核酸的核酸序列從而每種氨基酸的各自密碼子是優(yōu)先用于被選擇用于表達的細菌(如谷氨酸棒桿菌)中的那些密碼子(Wada等人(l":2)NucleicAcidsRes.20:2111-2118)?？梢酝ㄟ^標準DNA合成技術進行本發(fā)明的核酸序列的此類改變。在另一實施方案中，蛋白質表達載體是酵母表達載體。用于在酵母釀酒酵母中表達的載體的實例包括pYepSecl(Baldari，等人(1987)EmboJ.6:229-234)、2i、pAG-l、Yep6、Yepl3、pEMBLYe23、pMFa(Kurjan和Herskowitz，(1982)Ce1130:933-943)、pJRY88(Schultz等人，(1987)Gene54:113畫123)和pYES2(InvitrogenCorporation,SanDiego，CA)。載體和用于構建適合用于其他真菌，如絲狀真菌的載體的方法包括在vandenHondel，C.A.M.J.J.&Punt,P.J.(1991)在AppliedMolecularGeneticsofFungi中，J.F.Peberdy，等人，編著，p.1-28，CambridgeUniversityPress:Cambridge,和Pouwels等人，編著(1985)CloningVectors.Elsevier:NewYork(IBSN0444904018)中描述的那些。為了本發(fā)明的目的，將有效連接理解為啟動子、編碼序列、終止子和任選地其他調節(jié)元件以這樣的方式順序排列使得當表達編碼序列時，每個調節(jié)元件才艮據其測定可以完成它的功能。在另一實施方案中，表l的蛋白質可以在單細胞植物細胞(如藻類)或在來自高等植物(如種子植物，如作物植物)的植物細胞中表達。植物表達載體的實例包括在Becker,D.，Kemper，E.，Schdl，J.和Masterson,R,(1992)PlantMol.Biol.20:1195-1197;和Bevan,M.W.(1984)Nuc1.Acid.Res.12:8711-8721中描述的那些，并且包括pLGV23、pGHlac+、pBIN19、pAK2004、和pDH51(Pouwels等人，編著(1985)CloningVectors.Elsevier:NewYorkIBSN0444卯4018)。對于用于原核和真核細胞的其他合適的表達系統，見Sambrook，J.等人MolecularCloning:ALaboratoryManual.第三版，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY,2003的第16和17章。為了本發(fā)明的目的，將有效連接理解為啟動子、編碼序列、終止子和,順序排列使得當表達編碼序列時，每個調節(jié)元件才艮據其測定可以完成它的功能。在另一實施方案中，重組哺乳動物表達載體能夠指導核酸優(yōu)先在特定細胞類型，例如在植物細胞中表達(例如，使用組織特異性調節(jié)元件來表達核酸)。組織特異性調節(jié)元件是本領域已知的。本發(fā)明的另一方面涉及已經導入本發(fā)明的重組表達載體的生物或宿主細胞。術語"宿主細胞，，和"重組宿主細胞，，在本文中可互換使用?？梢岳斫獯祟愋g語不僅指具體的受試細胞，而且指這種細胞的后代或潛在后代。因為由于突變或環(huán)境影響，在連續(xù)世代中可能發(fā)生某些修飾，此類后代可以實際上與親本細胞不相同，但是仍然包括在如本文所用的該術語的范圍內。宿主細胞可以是任何原核或真核細胞。例如，表l的酶可以在細菌細胞如谷氨酸棒桿菌或大腸桿菌、昆蟲細胞、酵母或植物中表達。其他合適的宿主細胞是本領域技術人員已知的。可以通過常規(guī)的轉化或轉染技術向原核或真核細胞中導入載體DNA。如本文所用的，術語"轉化"和"轉染"、"接合"和"轉導，，意指用于將外源核酸(例如，線性DNA或RNA，例如，線性化載體或沒有載體的僅僅基因構建體)或載體形式的核酸(例如，質粒、噬菌體、噬粒、噬菌粒、轉座子或其他DNA)導入宿主細胞的多種本領域公知的技術，包括磷酸4丐或氯化鈣共沉淀、DEAE-葡聚糖介導的轉染、脂轉染、自然感受態(tài)、化學介導的轉移或者電穿孔。用于轉化或轉染宿主細胞的合適的方法可以見Sambrook，等人(MolecularCloning:ALaboratoryManual.第三版,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpring'HarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY，2003)。谷氨酸棒桿菌載體的實例可以見棒桿菌手冊(Eggeling,L.Bott，M.，編著，CRCpressUSA2005)和其他實驗室手冊。如本文所用的"坎貝爾進"(Campbellin)指最初宿主細胞的轉化體，其中整個環(huán)狀雙鏈DNA分子(例如，質粒)通過單個重組事件(雜交進事件)被整合到染色體中，并且有效導致所述環(huán)狀DNA分子的線性化形式插入到染色體的第一個DNA序列中，該第一個DNA序列與所述環(huán)狀DNA分子的第一個DNA序列同源。該名稱來自AlanCampbell教授，他首次提出該類型的重組。"被坎貝爾進"指已經整合到"坎貝爾進"轉化體的染色體中的線性化DNA序列。"坎貝爾進"含有雙份的第一個同源DNA序列，其每個拷貝包括并且圍繞一個拷貝的同源重組交換位點。如本文所用的"坎貝爾出"指"坎貝爾進"轉化體的后代細胞，其中已經在"被坎貝爾進"DNA的線性化插入的DNA上含有的第二個DNA序列和與所述線性化插入序列的第二個DNA序列同源的染色體來源的第二個DNA序列之間發(fā)生了第二次同源重組事件(交換出事件)，所述第二次重組事件導致缺失(拋棄)一部分整合的DNA序列，但是重要的是也導致一部分(這可以小至單個堿基)整合的"被坎貝爾進"的DNA保留在染色體中，使得與最初的宿主細胞相比，"坎貝爾出"細胞在染色體中含有一個或多個有意的改變(例如，單堿基替代、多個堿基替代、插入異源基因或DNA序列、插入額外的一個或多個拷貝的同源基因或經修飾的同源基因，或者插入包含一個以上的上面列出的這些前述實例的DNA序列)。"坎貝爾出"細胞或菌林通常，但不一定通過對一部分(希望被拋棄的部分)"被坎貝爾進"的DNA序列中所含的基因進行反選擇得到，所述基因如枯草芽孢桿菌sacB基因，其當在約5%到10%蔗糖存在下生長的細胞中表達時是致死性的。使用或不使用反選擇，可以通過使用任一種可篩選的表型通過篩選希望的細胞得到或鑒定所希望的"坎貝爾出，，細胞，所述表型為諸如但不限于，菌落形態(tài)、菌落顏色、抗生素抗性的存在或缺失、通過聚合酶鏈式反應檢測的給定DNA序列的存在或缺失、輔源營養(yǎng)的存在或缺失、酶的存在或缺失、菌落核酸雜交、抗體篩選等等。術語"坎貝爾進，，和"坎貝爾出，，也可以在多種時態(tài)中用作動詞指上述方法或過程?？梢岳斫鈱е?坎貝爾進，，或"坎貝爾出，，的同源重組事件可以在同源DNA序列的DNA堿基范圍內發(fā)生，并且因為同源序列將對于該范圍的至少部分是相互相同的，所以通常不可能精確地指出交換事件發(fā)生的地方。換句話說，不可能精確地指出哪個序列最初來自所插入的DNA，哪個最初來自染色體DNA。此外，第一個同源DNA序列和第二個同源DNA序列通常通過部分非同源區(qū)域分隔，并且該非同源區(qū)域保留在"坎貝爾出"細胞的染色體中。對于實際情況，在谷氨酸棒桿菌中，通常第一個和第二個同源DNA序列通常長為至少約200個堿基對，并且可以長達幾千個堿基對。然而，該程序可以改變以用于更短或更長的序列。例如，第一個和第二個同源序列的長度可以為約500到2000個堿基，并且通過將笫一個和第二個同源序列以大約相同的長度排列，優(yōu)選具有小于200個堿基對的不同，最優(yōu)選兩個序列較短者為較長者長度(堿基對)的至少70%，方便從"坎貝爾進"得到"坎貝爾出"。為了鑒定和選擇這些整合體，通常將編碼選擇標記(例如，抗生素抗性)的基因與目的基因一起導入宿主細胞中。優(yōu)選的選擇標記包括賦予對藥物如卡那霉素、氯霉素、四環(huán)素、G418、潮霉素和曱氨蝶呤的抗性的那些選擇標記。可以將編碼選擇標記的核酸導入宿主細胞中與編碼表1的酶相同的載體上，或者可以導入到不同的載體上。可以通過藥物選擇鑒定用所導入的核酸穩(wěn)定轉染的細胞(例如，已經摻入選擇標記基因的細胞將存活，而其他細胞將死亡)。在另一實施方案中，可以產生重組微生物，其含有允許所選擇的和/或導入的基因增強表達的系統?；蛟诟逩C生物^^氨酸棒桿菌中改變的和增強的表達的實例在WO2005/059144、WO2005/059143和WO2005/059093中描述。在另一實施方案中，產生含有所選系統的重組微生物，所述系統允許所導入的基因的受調節(jié)的表達。例如，在載體上包括處于lac操縱子控制下的表1基因允許該基因僅在IPTG存在下表達。此類調節(jié)系統是本領域公知的。在一個實施方案中，所述方法包括在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明的生物(其中已經導入了編碼例如表l酶的重組表達載體，或者基因組中已經導入了編碼野生型或改變的酶的基因)以產生甲硫氨酸。在另一實施方案中，該方法還包括從培養(yǎng)基或宿主細胞分離甲硫氨酸。為了修飾生物的代謝流以產生曱硫氨酸合成更有效的生物，改變酶的量和/或活性不限于表l中列出的酶。與表l的酶同源并且在另一生物中執(zhí)行相同功能的任何酶可以完全適合調節(jié)所述量和/或活性以便通過過表達影響代謝流。在上文已經給出了同源性和同一性的定義。本領域技術人員熟悉常用微生物如谷氨酸棒桿菌和大腸桿菌的培養(yǎng)。從而，將在下面給出關于谷氨酸棒桿菌培養(yǎng)的一般教導?？梢詮拇竽c桿菌培養(yǎng)的標準教科書得到對應的信息。大腸桿菌菌林分別在MB和LB培養(yǎng)液中常規(guī)地生長(Follettie，M.T.，Peoples,O.，Agoropoulou，C,和Sinskey，AJ.(1993)J.Bacteriol.175，4096-4103)。大腸桿菌的基本培養(yǎng)基分別是M9和改良的MCGC(Yoshihama，M.，Higashiro，K.，Rao，E.A.，Akedo，M.，Shanabmch，WG.，Follettie，M.T.，Walker,G.C，和Sinskey,A.J.(1985)J.Bacteriol.162,591-507)。葡萄糖可以以1%的終濃度加入?？股乜梢砸韵旅娴牧考尤?微克/毫升)氨芐青霉素，50;卡那霉素，25;萘啶酸，25。氨基酸、-敝生物和其他補充物可以以下面的量加入甲石克氨酸，9.3mM;精氨酸，9.3mM;組氨酸，9.31111\1;硫胺素，0.05mM。大腸桿菌細胞通常在37。C生長。經遺傳修飾的棒桿菌通常在合成的或天然的生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)。用于棒桿菌的多種不同的生長培養(yǎng)基是公知的和容易得到的(Lieb等人(1989)Appl.Microbiol.Biotechnol"32:205-210;vonderOsten等人(1998)BiotechnologyLetters,11:11-16;專利DE4,120,867;Liebl(1992)"TheGenusCorynebacterium,在TheProcaryotes,第II巻，Balows，A.等人，編著Springer-Verlag)。谷氨酸棒桿菌載體的實例可以見棒桿菌手冊(Eggeling，L.Bott，M"編著，CRCpressUSA2005)。這些培養(yǎng)基由一種或多種碳源、氮源、無機鹽、維生素和微量元素組成。優(yōu)選的碳源是糖，如單糖、二糖或多糖。例如，葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、核糖、山梨糖、核糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖、棉子糖、淀粉或纖維素可以用作非常好的碳源。還可以通過復雜化合物如糖蜜或來自糖精煉的其他副產物為培養(yǎng)基提供糖。還有利的是提供不同碳源的混合物。其他可能的碳源是醇和有機酸，如甲醇、乙醇、乙酸或乳酸。氮源通常是有機或無機氮化合物，或者含有這些化合物的物質。示例性氮源包括氨氣或銨鹽，如NH4C1或(NH4)2S04、NH4OH、硝酸鹽、尿素、氨基酸或者復雜氮源，像玉米漿、大豆粉、大豆蛋白、酵母提取物、肉膏和其他。使用不同的硫源可能過量產生甲硫氨酸?？梢允褂昧蛩猁}、硫代硫酸鹽、亞硫酸鹽和進一步還原的硫源，像H》和硫化物和衍生物。有機疏源，像甲硫醇、硫代乙醇酸鹽、硫氰酸鹽、硫脲、含硫氨基酸像半胱氨酸和其他含硫化合物也可以用于實現有效的甲硫氨酸生產。甲酸鹽和/或甲硫醇與其他C1源如甲醛、甲醇和二甲基二硫醚也可能作為補充物?？梢园ㄔ谂囵B(yǎng)基中的無機鹽化合物包括鉤、鎂、鈉、鈷、鉬、鉀、錳、鋅、銅和鐵的氯化物、磷酸鹽或硫酸鹽?？梢詫Ⅱ匣衔锛尤肱囵B(yǎng)基中以在溶液中保持金屬離子。尤其有用的螯合化合物包括二羥基酚，像兒茶酚或原兒茶酸，或者有機酸，如檸檬酸。培養(yǎng)基通常也含有其他生長因子，如維生素或生長促進劑，其實例包括生物素、核黃素、硫胺素、葉酸、煙酸、泛酸鹽和吡哆醇。生長因子和鹽通常來自復雜培養(yǎng)基組分，如酵母提取物、糖蜜、玉米漿和其他。培養(yǎng)基化合物的精確組成非常依賴于直接的實驗并且為每種特定情況單獨決定。關于培養(yǎng)基優(yōu)化的信息可以在教科書"AppliedMicrobiol.Physiology,APracticalApproach(eds.P.M.Rhodes,P.F.Stanbury,IRLPress(1997)pp.53-73，ISBN0199635773)中得到。還可能從供應商選擇生長培養(yǎng)基，像標準l(Merck)或BHI(腦心浸液，DIFCO)或其他。所有培養(yǎng)基組分都應該被消毒，可以通過加熱(1.5巴和121。C下20分鐘)或通過過濾除菌消毒?？梢詫⒏鹘M分一起消毒或如果需要，單獨消毒。所有培養(yǎng)基組分可以在生長開始時存在，或者它們可以被任選連續(xù)或分批加入。為每個實驗單獨限定培養(yǎng)條件。溫度應該為15。C到45。C的范圍內。溫度應該保持恒定或者在實驗期間可以;故改變。培養(yǎng)基的pH可以為5到8.5，優(yōu)選約7.0，并且可以通過向培養(yǎng)基中加入緩沖液維持。用于該目的的示例性緩沖液是磷酸鉀緩沖液。可以備選或同時使用合成緩沖液，如MOPS、HEPES、ACES和其他。還可能通過在生長期間加入NaOH或NH4OH保持恒定培養(yǎng)pH。如果利用復雜培養(yǎng)基組分如酵母提取物，那么因為許多復雜化合物具有高緩沖能力，所以可以減少對額外緩沖液的需要。如果用發(fā)酵罐培養(yǎng)微生物，那么也可以使用氨氣控制pH。培育時間通常為幾小時到幾天。選擇該時間以允許在培養(yǎng)液中積累最大量的產物?？梢栽诙喾N容器中進行所公開的生長實驗，所述容器為如不同大小的微量滴定板、玻璃管、玻璃瓶或者玻璃或金屬發(fā)酵罐。為了篩選大量克隆，應該在微量滴定板、玻璃管或有或者沒有擋板的搖瓶中培養(yǎng)微生物。優(yōu)選地，使用100mL搖瓶，其裝有10%(按體積計)所需的生長培養(yǎng)基。所述搖瓶應該在旋轉搖床上用100-300rpm(轉/分鐘)的速度范圍搖動(振幅25mm)。應該通過濕潤空氣的保持減小蒸發(fā)損失；或備選地，應該進行蒸發(fā)損失的數學校正。如果將測試遺傳修飾的克隆，也應該測試未經修飾的對照克隆或者含有無任何插入片段的基本質粒的對照克隆。使用在瓊脂板上生長的細胞將培養(yǎng)基接種到OD600為0.5-1.5，所述瓊脂板如已經在30。C溫育的CM平板(10g/L葡萄糖，2,5g/LNaCl，2g/l尿素，10g/L聚胨，5g/L酵母提取物，5g/L肉膏，22g/LNaCl,2g/L尿素，10g/L聚胨，5g/L酵母提取物，5g/L肉膏，22g/L瓊脂，用2MNaOH調節(jié)到pH6.8)。通過引入來自CM平板的谷氨酸棒桿菌細胞的鹽水懸浮液或者加入該細菌的液體預培養(yǎng)物完成該培養(yǎng)基的接種。盡管已經關于谷氨酸棒桿菌和L-甲硫氨酸的產生描述了本發(fā)明，但是應該指出本發(fā)明也可以應用于其他微生物和產生其他氨基酸。此外，應該指出"包含"不排除任何其他成分或步驟并且"一個"不排除復數。此外，應該指出已經關于上面實施方案之一描述的特征或步驟也可以與上述其他實施方案的其他特征或步驟組合使用。通過下面的實施例進一步闡明本發(fā)明，不應將這些實施例理解為限定。將該申請全文中引用的所有參考文獻、專利申請、專利、公布的專利申請、表、附件和序列的內容引入本文作為參考。實施例細菌菌抹.從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(Manassas，VA，USA)得到谷氨酸棒桿菌ATCC13032(野生型)。如下構建敲除突變體谷氨酸棒桿菌M1840為來自野生型ATCC13032的AMcbR菌抹(Rey等人，2003，同上)。將ATCC13032用質粒pH430(SEQIDNo.l)轉化并"坎貝爾進"以產生"坎貝爾進"菌林。然后將"坎貝爾進，，菌林"坎貝爾出，，以產生"坎貝爾出"菌抹M1840,其含有McbR基因的缺失。將谷氨酸才奉桿菌M1840用質粒pH238(SEQIDNo.2)轉化并"坎貝爾進"以產生"坎貝爾進"菌抹。然后將"坎貝爾進，，菌林"坎貝爾出"以產生"坎貝爾出，，菌林M1840Ahom，Ahsk，其含有高絲氨酸脫氫酶和高絲氨酸激酶基因的缺失。將將谷氨酸棒桿菌M1840用質粒p(SEQIDNo.3)轉化并"坎貝爾進"以產生"坎貝爾進"菌株。然后將"坎貝爾進"菌林"坎貝爾出"以產生"坎貝爾出"菌株M1840AmetB，其含有MetB基因的缺失。在該菌抹中，沒有觀察到可測量的胱-克醚，合酶.化學品.酪蛋白氨基酸、牛肉膏、聚胨和酵母提取物由Difco(Detroit，USA)提供。所有其他化學品為分析級別并且從Griissing(Filsum，德國)、AcrosOrganics(Geel,比利時)、Merck(Darmstadt，德國)、Aldrich(Steinheim,德國)和Fluka(Buchs，瑞士)提供。示蹤底物99%13C6]葡萄糖和98%"Ctl蘇氨酸由CambrigeIsotopesInc.(Andova，MA，USA)提供。99%["N硫酸銨從CamproScientific(Veenendaal，荷蘭)購買。34S]硫酸鹽由BASFAG(Ludwigshafen，德國)友情提供。培養(yǎng)基和生長條件.用于接種的細胞生長在富培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基含有10.00g/L葡萄糖、2.50g/LNaCl、2.00g/L尿素、5.00g/L酵母提取物、5.0g/L牛肉膏、5.0g/L聚胨、20.0g/L酪蛋白氨基酸和20.0g/L瓊脂(對于平板)。細胞在平板上30。C保持。在具有25mL富液體培養(yǎng)基的250mL帶擋板的搖瓶中過夜生長預培養(yǎng)物。將細胞通過離心(2分鐘，10000g，4°C)收獲，用0.9。/oNaCl洗滌兩次，并用于在第二次預培養(yǎng)中接種在基本培養(yǎng)基上。如上述收獲第二次預培養(yǎng)物并用作主要培養(yǎng)的起始物，在基本培養(yǎng)基上進行?；九囵B(yǎng)基組成如下40.00g/L葡萄糖、1.00g/LK2HP04、1.00g/LKH2P04、42.00g/LMOPS、54.00g/LACES、20.00g/L(NH4)2S04、0.30g/L3，4畫二羥基苯曱酸、0.01g/LCaCl2、0.25g/LMgS04*7H20、0.01g/LFeS04*7H20、0.01g/LMnS04*H20、0.002g/LZnS04*7H20、0.2mg/LCuS04*5H20、0.02mg/LNiCl2*6H20、0.02mg/LNa2Mo04*2H20、0.1mg/L氰鈷胺素、0.3mg/L硫胺素、0.004mg/L磷酸吡噴醛、0.1mg/L生物素。為了培養(yǎng)營養(yǎng)缺陷型突變體M1840H238和表征曱硫氨酸生物合成途徑，將培養(yǎng)基分別補充10mM蘇氨酸、高絲氨酸、甲疏氨酸、胱硫醚和高半胱氨酸。在旋轉搖床上50mL帶擋板的搖瓶中的5mL培養(yǎng)物中在250rpm(搖動半徑2.5cm)和3(TC下進行示蹤實驗。在晚指數期收獲細胞。其他實驗在旋轉搖床上(250rpm，30'C，搖動半徑2，5cm)500mL帶擋板的搖瓶中的50mL培養(yǎng)基中進行。代謝組.如以前描述的提取細胞內代謝物(Kromer等人，2004)。將經洗滌(1120)的生物量水解48小時(105'C，6NHC1)。中和水解物(6NNaOH)。對于GC/MS分析，將樣品U00iaL提取物或50hL水解物)凍干，重懸浮在50nL溶劑(二甲基甲酰胺中0.1%吡啶)中并最后用50nLN-甲基(叔丁基二曱基甲硅烷基)三氟乙酰胺在80。C衍生1小時。如以前描述的進行用GC/MS的標記分析(Wittmann，C.等人，AnalBiochem2002，3072，379-82)。除了脯氨酸外，曱硫氨酸代謝的所有產蛋白質氨基酸和中間體，包括高半胱氨酸、高絲氨酸、O-乙?；呓z氨酸和胱硫醚都在HPLC上如別處描述的進行定量(Kromer等人，AnalBiochem.2005;340:171-3)。使用HPLC用胱^^醚校準因數進行高羊毛氨酸的定量。酶的過表達和純化.用載體pQE30(Qiagen)克隆谷氨酸棒桿菌的MetB和MetC。用該載體的表達包括向所表達的蛋白質的N-末端加入His-標記。用質粒轉化大腸桿菌并通過氨節(jié)青霉素抗性(100jig/mL)選擇。將轉化的大腸桿菌培養(yǎng)(100ng/mL氨千青霉素，37°C，230rpm)在terrific培養(yǎng)液(Losen等人，BiotechnolProg2004，204，1062-8)上并在光密度1(600nm)下通過加入lmM異丙基硫代半乳糖苷(終濃度)誘導。在誘導生長16小時后通過離心(4225g，15分鐘，2。C)收獲細胞，洗滌并重懸浮在礴酸鹽緩沖液(IOOmM，100fiM磷酸吡噴醛，1mg/mLDNA酶I，pH7.4，4。C)中并通過聲處理(5xl5秒，20微米)提取。通過離心(30分鐘，2。C，和20000g)分離粗提物與細胞殘渣。通過在裝配HiTrap螯合鎳-瓊脂糖(Sepharose)柱(5mL，Amersham)的用含有0.5MNaCl的0.02M磷酸鈉緩沖液(pH7.4)平衡的AKTA純化儀900(AmershamBiosciences,LittleChalfont，英國)上通過親和層析最終純化重組的MetB和MetC。將蛋白質加到柱子后，將其用10體積的0.02M磷酸鈉緩沖液洗滌。用含有0.5MNaCl和0.5M咪唑的0.02M磷酸鈉緩沖液(pH7.4)以線性梯度進行洗脫。用SDS-PAGE檢查含有所述蛋白質的級分的純度并將它們合并在一起。通過超濾從蛋白質分離咪唑。MetB和MetC的體外測定法.通過分光光度法(Heliosa，ThermoElectronic,Dreieich，德國)跟蹤MetB和MetC的活性。使用EUman試劑(412nm處消光)(EUman和Lysko，1979)通過游離SH基團的增加或減少測量酶活性。對于MetB測定，測定混合物含有1.25mM半胱氨酸或高半胱氨酸和3mMO-乙酰基高絲氨酸，對于MetC測定法，測定混合物含有1.25mM胱石危醚或約1.25mM高羊毛氨酸。高羊毛氨酸不能通過商業(yè)途徑獲得。因此使用MetB測定法的產物進行MetC測定。通過超濾除去MetB。從而，在該測定中不能調節(jié)高羊毛氨酸濃度。此外，測定溶液由磷酸鹽緩沖液(IOOmM，pH7.5)和10吡,醇基-5-磷酸(MetB和MetC的輔因子)組成。從測定混合物取65jiL樣品并在任何時候注射到935nL停止溶液中。停止溶液由磷酸緩沖液(IOOmM,pH7.5)與38%乙醇和1mM二硫硝基苯甲酸(DTNB)組成。乙醇終止了酶活性并且DTNB與高半胱氨酸或半胱氨酸形成黃色絡合物。該測定對于高達1.5mM游離SH基團給出線性結果。從雙倒數Lineweaver-Burk圖確定Km值。表2顯示了在高絲氨酸/甲硫氨酸和蘇氨酸營養(yǎng)缺陷型谷氨酸棒桿菌AMcbR，Ahom，Ahsk中的異亮氨酸、蘇氨酸和丙氨酸標記。培養(yǎng)發(fā)生在天然標記的高絲氨酸和[U"C-葡萄糖(99。/o)和[U"C-蘇氨酸(98%)。顯示了蛋白質水解產物中不同質量同素異構物(isotopomer)的相對豐度。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>表3顯示了與其他生物相比谷氨酸棒桿菌的MetC和MetB的Km值。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>L-高羊毛氨酸L-半胱氨酸L-高半胱氨酸70(鳥博德特氏菌)4540(大腸桿菌)258(谷氨酸棒桿菌)180(菠菜)50(大腸桿菌)541(谷氨酸棒桿菌)(Gentry-Weeks,C.R.等人，J.Biol.Chem.1993,26810,7298-314)(Dwivedi，C.M.等人，同上)(本研究)(Ravanel等人，ArchBiochemBiophys1995,3161，572-84)(Holbrook等人，Biochemistry19卯,292,435-42)(本研究)結果對McbR敲除的生理應答.谷氨酸棒桿菌中轉錄調節(jié)子McbR的敲除對細胞代謝具有嚴重后果。菌林谷氨酸棒桿菌M1840與野生型的不同僅僅在于McbR的敲除，顯示出減慢的生長速率0.18[h"。相比，野生型生長速率為0.h_1。此外，在M1840中生物量產率顯著降低。而野生型產生0.55g生物量g葡萄糖1,M1840僅僅產生0,36g生物量g葡萄糖。這些結果表明細胞代謝對于McbR敲除非常敏感。在指數生長期間，谷氨酸棒桿菌M1840顯示出升高的細胞內高半胱氨酸和半胱氨酸滴定度。與野生型相比，細胞內高半胱氨酸濃度從0.1升高到2.9n摩爾gcDw"并且半胱氨酸從0.3升高到2.8n摩爾gcDw"。這等于分別為29和9.3倍增加。顯然的是McbR的敲除導致重要的曱硫氨酸前體積累。然而，HPLC和GC/MS鐠也顯示出額外的強烈信號，其可以被鑒定為高羊毛氨酸(圖lb)。高羊毛氨酸的鑒定.高羊毛氨酸結構與胱硫醚的差別在于含有額外的亞甲基(圖lb)。在天然高羊毛氨酸中兩個a-碳原子都具有S構型。用得自胱硫醚的HPLC校準因數定量高羊毛氨酸。與等基因的野生型菌林ATCC13032中1.3pmolgcDw"相比，指數生長的谷氨酸棒桿菌M1840(=ATCC13032AMcbR)中250nmolgCDW"的積累使得該^J^酸是除了谷氨酸("SjimolgcDw-1)之外第二重要的氨基酸。通過標記實驗和GC/MS片段模式鑒定高羊毛氨酸。用[U"C-葡萄糖、["N-硫酸銨、[34S-硫酸鹽單獨培養(yǎng)谷氨酸棒桿菌M1840并隨后進行細胞提取和用GC/MS的標記分析證實所觀察到的代謝物的碳、氮和硫含量與高羊毛氨酸(CsN2S0匹配。GC/MS中高羊毛氨酸的所觀察到的質量片段m(m/z=692)，m-15(m/z=677),m-57(m/z=635)比它們在胱硫醚中的副本重14個質量(圖3)，表明存在額外的亞甲基。此外，在胱硫醚、高半胱氨酸和甲硫氨酸中可以觀察到高半胱氨酸殘基的特征片段m/z=170，m/z=244和m/z=272。當基因組中缺失metB時，所得的菌林M1840AMetB(對應于ATCC13032AMcbRAMetB)顯示出僅僅約0.33jimolgCDW"高羊毛氨酸積累，接近分析中的檢測極限。該觀察明確地表明metB缺失導致防止形成和/或積累物質高羊毛氨酸并從而證明具有胱硫醚Y-合酶活性的酶如metB將支持高羊毛氨酸積累，其對于甲硫氨酸產生可以是有害的。細胞代謝中高羊毛氨酸的來源.用[u"c-葡萄糖和[u"q-蘇氨酸和天然標記的高絲氨酸培養(yǎng)谷氨酸棒桿菌AMcbR，Ahom，Ahsk突變體清楚地表明高羊毛氨酸來自高絲氨酸。就像高絲氨酸一樣，高羊毛氨酸的標記揭示了天然的標記模式，表明葡萄糖與蘇氛酸都不提供高羊毛氨酸合成的必須前體。在額外實驗中，將該菌林在相同條件下培養(yǎng)，只是喂祠甲硫氨酸、胱硫醚或高半胱氨酸代替高絲氨酸。這些實驗表明該菌林能夠用這些底物生長，但是我們觀察到在胱硫醚上減慢的生長，確證了Ruckert等人(2003，同上)的發(fā)現。用這三種底物喂飼不導致高羊毛氨酸的顯著積累。這表明曱硫氨酸途徑中該代謝物的積累必須在高半胱氨酸形成前被定位。以相反方向起作用的MetB、MetZ或MetC可以^皮認為是高羊毛氨酸形成酶的可能的候選者。MetB和MetC的分離和表征.為了進一步解決涉及曱硫氨酸途徑中高羊毛氨酸積累的問題，在大腸桿菌中過表達MetB和MetC并分離。用酶測定法表征分離的蛋白質。它們的天然底物半胱氨酸和胱疏醚的Km值分別在為其他生物的對應的酶發(fā)現的Km值相同的范圍內(表3)。MetB對半胱氨酸的Km值為258jiM,而對高半胱氨酸的Km值為541nM，為前者的兩倍以上。假定谷氨酸棒桿菌AMcbR中高半胱氨酸和半胱氨酸的相等的細胞內濃度，所觀察到的Km值可以表明兩種底物在體內都被MetB使用。MetC對胱石克醚的Km為107nM，該值位于大腸桿菌和沙門氏菌胱^5危醚酶的Km值之間(表3)。由于缺少純的高羊毛氨酸，不能測定對該底物的Km值。但是大腸桿菌胱硫醚酶的對應的值為4.5mM(表2)，表明高羊毛氨酸的切割非常弱。通過將O-乙?；?高絲氨酸和半胱氨酸或高半胱氨酸分別溫育進一步表征MetB。通過光度法跟蹤半胱氨酸(圖2A)和高半胱氨酸(圖2B)的消耗。此外，在0分鐘、80分鐘和205分鐘從酶測定取樣品并通過HPLC分析。MetB將半胱氨酸和O-乙酰基-高絲氨酸有效轉化為胱硫醚。它當與O-乙?；?高絲氨酸和高半胱氨酸溫育時形成高羊毛氨酸。80分鐘后通過超濾從測定中除去MetB并加入MetC。MetC的加入導致完全切割胱硫醚，導致高半胱氨酸的積累，也反映在光度測定中消光的增加(圖2A)。高羊毛氨酸僅僅被MetC微弱切割，導致高半胱氨酸的稍微增加和輕微減少的高羊毛氨酸濃度。該切割太微弱而不能用光度計跟蹤。這表明MetC對高羊毛氨酸的Km值可以與大腸桿菌中的一樣高。實際上，大腸桿菌的MetC對胱石充醚的Km值(40nM)和對高羊毛氨酸的Km值(4.5mM)(Dwivedi,C.M.等人，Biochemistry1982，2113，3064-9)表明高羊毛氨酸被MetC更緩慢地切割。Uren(Uren，J.R.，MethodsEnzymol1987，143，483-6)發(fā)現了相似的結果。有趣的是，胱硫醚的切割和高半胱氨酸的積累也導致積累少量高羊毛氨酸。這表明MetC也能夠形成高羊毛氨酸。然而，首先不含有MetB的使用O-乙?；?高絲氨酸和高半胱氨酸的對照當加入MetC時不產生高羊毛氨酸。這表明MetC不能使用這些底物產生高羊毛氨酸?？赡艿氖窃陔琢蛎亚懈钇陂g的高半胱氨酸積累被MetC用于胱硫醚-P-合酶(CysM)反應。MetC可以使用測定中存在的高絲氨酸代替絲氨酸作為來自O-乙?；?高絲氨酸的雜質并從而形成高羊毛氨酸。使用僅僅O-乙?；?高絲氨酸或高半胱氨酸的對照測定和使用高絲氨酸代替O-乙酰基-高絲氨酸的對照在使用MetB或MetC時不產生任何產物。此外，MetC對高羊毛氨酸的水解切割不僅導致形成高半胱氨酸，而且類似于胱硫醚切割，也應該產生氨和2-氧代丁酸。后者是異亮氨酸的前體。這將導致從甲疏氨酸生物合成到異亮氨酸形成的代謝途徑，避開了蘇氨酸作為異亮氨酸的已知的唯一來源。對異亮氨酸代謝的影響.異亮氨酸從CV前體(蘇氨酸)和C3-前體(丙酮酸)形成。在最后的分子中，異亮氨酸的兩個碳原子來自丙酮酸。如果Cr前體不被標記并標記丙酮酸，那么觀察到質量漂移為2。在GC/MS中研究的異亮氨酸片段含有異亮氨酸骨架的碳2到6。當蘇氨酸和葡萄糖被完全標記時，m/z=200中的質量漂移應該為m+5。然而，如果用高絲氨酸來源的Cj形成異亮氨酸，那么觀察到m+2的漂移，其來自經標記的丙酮酸。實際上，在McbR-敲除菌株中觀察到來自不同于蘇氨酸的備選前體的異亮氨酸形成。谷氨酸棒桿菌AMcbR，Ahom，Ahsk中約13%的產蛋白質異亮氨酸從來自天然標記的高絲氨酸的前體形成，并且不是從培養(yǎng)基中提供的經標記的蘇氨酸形成(表3)。這被觀察為異亮氨酸的m+2質量同素異構物(m/z-200)的13%豐度。產蛋白質蘇氨酸與細胞外蘇氨酸同樣標記，并且丙氨酸反映了丙酮酸標記，與細胞外葡萄糖標記相同。顯而易見的是谷氨酸棒桿菌能夠獨立于蘇氨酸產生異亮氨酸。額外的異亮氨酸前體最可能是來自甲硫氨酸代謝的2-氧代丁酸。通常該有機酸在異亮氨酸代謝中通過蘇氨酸氨裂合酶對蘇氨酸的脫氨基作用形成。在甲硫氨酸代謝中，存在可能形成2-氧代丁酸的備選反應。曱硫氨酸甲硫醇-裂合酶(EC4.4.1.11)、高半胱氨酸疏化氫裂合酶(EC4.4.1.2)或胱疏醚半胱氨酸-裂合酶(EC4.4.1.1)可能負責2-氧代丁酸的形成。通過用甲硫氨酸、高半胱氨酸或胱硫醚喂飼突變體并且同時喂飼完全碳標記的葡萄糖和蘇氨酸，排除了這些可能性(表2)。此外，在這些研究中，異亮氨酸標記的改變與高羊毛氨酸的積累相聯系，表明高羊毛氨酸的MetC切割最可能負責蘇氨酸獨立的異亮氨酸合成。<image>imageseeoriginaldocumentpage51</image>ccaggctcaaggcgcgcatgcccgacggcgaggatctcgtcgtgacccatggcgatgcctgcttgccgaatatcatggtggaaaatggccgcttttctggattcatcgactgtggccggctgggtgtggcggaccgctatcaggacatagcgttggctacccgtgatattgctgaagagcttggcggcgaatgggctgaccgcttcctcgtgctttacggtatcgccgctcccgattcgcagcgcatcgccttctatcgccttcttgacgagttcttctgagcgggactctggggttcgaaatgaccgaccaagcgacgcccaacctgccatcacgagatttcgattccaccgccgccttctatgaaaggttgggcttcggaatcgttttccgggacgccggctggatgatcctccagcgcggggatctcatgctggagttcttcgcccacgctagcggcgcgccggccggcccggtgtgaaataccgcacagatgcgtaaggagaaaataccgcatcaggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaaggacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttaaaggccggccgcggccgccatcggcattttcttttgcgtttttatttgttaactgttaattgtccttgttcaaggatgctgtctttgacaacagatgttttcttgcctttgatgttcagcaggaagctcggcgcaaacgttgattgtttgtctgcgtagaatcctctgtttgtcatatagcttgtaatcacgacattgtttcctttcgcttgaggtacagcgaagtgtgagtaagtaaaggttacatcgttaggatcaagatccatttttaacacaaggccagttttgttcagcggcttgtatgggccagttaaagaattagaaacataaccaagcatgtaaatatcgttagacgtaatgccgtcaatcgtcatttttgatccgcgggagtcagtgaacaggtaccatttgccgttcattttaaagacgttcgcgcgttcaatttcatctgttactgtgttagatgcaatcagcggtttcatcacttttttcagtgtgtaatcatcgtttagctcaatcataccgagagcgccgtttgctaactcagccgtgcgttttttatcgctttgcagaagtttttgactttcttgacggaagaatgatgtgcttttgccatagtatgctttgttaaataaagattcttcgccttggtagccatcttcagttccagtgtttgcttcaaatactaagtatttgtggcctttatcttctacgtagtgaggatctctcagcgtatggttgtcgcctgagctgtagttgccttcatcgatgaactgctgtacattttgatacgt加ccgtcaccgtcaaagattgatttataatcctctacaccgttgatgttcaaagagctgtctgatgctgatacgttaacttgtgcagttgtcagtgtttgtttgccgtaatgtttaccggagaaatcagtgtagaataaacggatttttccgtcagatgtaaatgtggctgaacctgaccattcttgtgtttggtcttttaggatagaatcatttgcatcgaatttgtcgctgtctttaaagacgcggccagcgtttttccagctgtcaatagaagtUcgccgactttttgatagaacatgtaaatcgatgtgtcatccgca加taggatctccggctaatgcaaagacgatgtggtagccgtgatagtttgcgacagtgccgtcagcgttttgtaatggccagctgtcccaaacgtccaggccttttgcagaagagatatttttaattgtggacgaatcaaattcagaaacttgatatttttcatttttttgctgttcagggatttgcagcatatcatggcgtgtaatatgggaaatgccgtatgtttccttatatggcttttggttcgtttctttcgcaaacgcttgagttgcgcctcctgccagcagtgcggtagtaaaggttaatactgttgcttgttttgcaaactttttgatgttcatcgttcatgtctccttttttatgtactgtgttagcggtctgcttcttccagccctcctgtttgaagatggcaagttagttacgcacaataaaaaaagacctaaaatatgtaaggggtgacgccaaagtatacactttgccctttacacattttaggtcttgcctgctttatcagtaacaaacccgcgcgatttacttttcgacctcattctattagactctcgtttggattgcaactggtctattttcctcttttgtttgatagaaaatcataaaaggatttgcagactacgggcctaaagaactaaaaaatctatctgtttcttttcattctctgtattttttatagtttctgttgcatgggcataaagttgcctttttaatcacaattcagaaaatatcataatatctcatttcactaaataatagtgaacggcaggtatatgtgatgggttaaaaaggatcggcggccgctcgatttaaatcSeqIDNo.2:>pH238tcgagaggcctgacgtcgggcccggtaccacgcgtcatatgactagttcggacctagggatatcgtcgacatcgatgctcttctgcgttaattaacaattgggatccatgacctcagcatctgccccaagctttaaccccggcaagggtcccggctcagcagtcggaattgcccttttaggattcggaacagtcggcactgaggtgatgcgtctgatgaccgagtacggtgatgaacttgcgcaccgcattggtggcccactggaggttcgtggcattgctgtttctgatatctcaaagccacgtgaaggcgttgcacctgagctgctcactgaggacgcttttgcactcatcgagcgcgaggatgttgacatcgtcgttgaggttatcggcggcattgagtacccacgtgaggtagttctcgcagctctgaaggccggcaagtctgttgttaccgccaataaggctcttgttgcagctcactctgctgagcttgctgatgcagcggtgtttaagtttagtggatggggatgctcgtgagtctggcattaaggtgcttgagcttgaggttgcgggaccagtcaaggttgaagttaaccaaccttaggcccaacaaggaaggcccccttcgaatcaagaagggggccttattagtgcagcaattattcgctgaacacgtgaaccttacaggtgcccggcgcgttgagtggtttgagttccagctggatgcggttgttttcaccgaggctttcttggatgaatccggcgtggatggcgcagacgaaggctgatgggcgtttgtcgttgaceacaaatgggcagctgtgtagagcgagggagtttgcttcttcggtttcggtggggtcaaagcccatttcgcggaggcggttaatgagcggggagagggcttcgtcgagttcttcggcttcggcgtggttaatgcccatgacgtgtgcccactgggttccgatggaaagtgctttggcgcggaggtcggggttgtgcattgcgtcatcgtcgacatcgccgagcatgttggccatgagttcgatcagggtgatgtattctttggcgacagcgcggttgtcggggacgcgtgtttggaagatggatcctctagacccgggatttaaatcgctagcgggctgctaaaggaagcggaacacgtagaaagccagtccgcagaaacggtgctgaccccggatgaatgtcagctactgggctatctggacaagggaaaacgcaagcgcaaagagaaagcaggtagcttgcagtgggcttacatggcgatagctagactgggcggttttatggacagcaagcgaaccggaattgccagctggggcgccctctg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