專利名稱：：乳酸的制造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及具有生產(chǎn)乳酸的能力的微生物以及使用了該微生物的乳酸制造方法。
背景技術(shù)：
：作為生產(chǎn)乳酸的微生物，已報(bào)道有乳酸菌屬aa"o^"7/w)、乳球菌屬(Zactococcw)等乳酸菌，根霉菌屬(7/^op^)的絲狀菌、酵母菌屬(Socdww^;c")等酵母以及大腸埃希桿菌，但已知乳酸菌顯示復(fù)雜的營(yíng)養(yǎng)要求性，且乳酸的光學(xué)純度低(非專利文獻(xiàn)1和2);絲狀菌多有甘油、乙醇或富馬酸等副產(chǎn)物(非專利文獻(xiàn)3和4);酵母在使用重組菌株時(shí)也會(huì)副產(chǎn)生大量的乙醇，從而對(duì)于耗糖量的收率低(非專利文獻(xiàn)5)。作為使用了大腸埃希桿菌的乳酸制造方法，已知有使用丙酮酸甲酸裂解酶基因和與有機(jī)酸或乙醇的副產(chǎn)生有關(guān)的基因的缺失株的方法(非專利文獻(xiàn)6)，使用磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶基因和磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的突變株的方法(非專利文獻(xiàn)7)，但乳酸的生產(chǎn)率均較低。大腸埃希桿菌(￡^^n'W&co/O的4-羥基苯甲酸聚異戊烯基轉(zhuǎn)移酶(4國(guó)Hydroxybenzoatepolyprenyltransferase)(以下禾爾作UbiA蛋白質(zhì))以及2-八異戊烯基苯酚2-八異戊烯基-6-甲氧基苯酚黃素還原酶(以下稱作UbiB蛋白質(zhì))是與大腸埃希桿菌中泛醌的生物合成有關(guān)的蛋白質(zhì)，且UbiA蛋白質(zhì)和UbiB蛋白質(zhì)的氨基酸序列及編碼該蛋白質(zhì)的基因的堿基序列是已知的(非專利文獻(xiàn)8和9)。另外，對(duì)于多數(shù)微生物，其染色體DNA的整個(gè)堿基序列是己知的(非專利文獻(xiàn)IO)。已知在大腸埃希桿菌中，泛醌生物合成基因的突變株蓄積有2.5g/L的D-乳酸(非專利文獻(xiàn)11和12)，該突變株(AN59株)為ub正基因的突變株(非專利文獻(xiàn)13)，其它泛醌生物合成基因產(chǎn)物的活性已降低了的株的乳酸的生產(chǎn)率以及泛醌生物合成基因突變株的乙酸產(chǎn)量等是未知的。乙酸是乳酸發(fā)酵時(shí)的副產(chǎn)物，由于妨礙乳酸的精制或聚合化，因此尋求乙酸的副產(chǎn)量少、廉價(jià)的乳酸制造方法。非專利文獻(xiàn)1:Appl.Microbiol.Biotechnol.,45，307(1996)非專利文獻(xiàn)2:EnzymeMicrob.Technol.，26,87(2000)非專利文獻(xiàn)3:Appl.Biochem.Biotechnol.，51，57(1995)非專利文獻(xiàn)4:J.Biosci.Bioeng"97，19(2004)非專利文獻(xiàn)5:Appl.Environ.Microbiol.,71,2789(2005)非專利文獻(xiàn)6:Appl.Environ.Microbiol.，69,399(2003)非專利文獻(xiàn)7:Appl.Environ.Microbiol.，65,1384(1999)非專利文獻(xiàn)8:FEBSLetters,307，347(1992)非專利文獻(xiàn)9:Science,257,771(1992)非專禾ll文獻(xiàn)10:http:〃www.tigr.org/tdb/mdb/mdbcomplete.html非專利文獻(xiàn)11:J.Bacteriol.,99，450(1969)非專利文獻(xiàn)12:Biochem.J.,117,551(1970)非專利文獻(xiàn)13:JBacteriol.,182，5139(2000)
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供乳酸的生產(chǎn)率有所提高的微生物及使用了該微生物的乳酸制造方法。本發(fā)明涉及以下的(1)(8)。(1)一種微生物，其中，4-羥基苯甲酸聚異戊烯基轉(zhuǎn)移酶活性或者2-八異戊烯基苯酚2-八異戊烯基-6-甲氧基苯酚黃素還原酶活性降低或喪失，且所述微生物具有生產(chǎn)乳酸的能力。(2)上述(1)所述的微生物，其具有對(duì)下述蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的基因的一部分或全部缺失了的染色體DNA，所述蛋白質(zhì)為具有4-羥基苯甲酸聚異戊烯基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)或具有2-八異戊烯基苯酚2-八異戊烯基-6-甲氧基苯酚黃素還原酶活性的蛋白質(zhì)。(3)上述(2)所述的微生物，其中，基因?yàn)閷?duì)下述蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的基因具有序列號(hào)1或序列號(hào)2所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，或者與序列號(hào)1或2所示的氨基酸序列具有80%以上的同源性、且具有4-羥基苯甲酸聚異戊烯基轉(zhuǎn)移酶活性或2-八異戊烯基苯酚2-八異戊烯基-6-甲氧基苯酚黃素還原酶活性的蛋白質(zhì)。(4)上述(2)所述的微生物，其中，基因?yàn)榫哂行蛄刑?hào)3或序列號(hào)4所示的堿基序列的基因，或者為在嚴(yán)格條件下和具有與序列號(hào)3或4所示的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列的多核苷酸雜交且對(duì)下述蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的基因，所述蛋白質(zhì)具有4-羥基苯甲酸聚異戊烯基轉(zhuǎn)移酶活性或2-八異戊烯基苯酚2-八異戊烯基-6-甲氧基苯酚黃素還原酶活性。(5)上述(1)(4)任一項(xiàng)所述的微生物，其中，微生物為通過(guò)選自下述[1][5]的方法而強(qiáng)化了生產(chǎn)乳酸的能力的微生物。將控制乳酸的生物合成的機(jī)制的至少一個(gè)緩和或解除的方法[2]將與乳酸的生物合成相關(guān)的酶的至少一個(gè)的表達(dá)強(qiáng)化的方法[3]使與乳酸的生物合成相關(guān)的酶基因的至少一個(gè)的拷貝數(shù)增加的方法將從乳酸的生物合成路徑向該有用物質(zhì)以外的代謝產(chǎn)物分支的代謝路徑的至少一個(gè)弱化或阻斷的方法選擇對(duì)于乳酸類似物的耐性度高于野生型株的細(xì)胞株的方法(6)上述(1)~(5)任一項(xiàng)所述的微生物，其中，微生物是屬于下述屬的微生物歐文氏菌屬(五nW"/fl)、沙雷菌屬(5^raf/a)、沙門菌屬(&z/wo"e〃ar)、埃希氏菌屬(^yc/^Wc//a)、變形桿菌屬(尸rato^)、假單胞菌屬(Pse油附o"os)、酸硫桿狀菌屬(爿c逾/iz'oSflcz7/ws)、不動(dòng)桿菌屬"c/"加6ac&r)、土壤桿菌屬)、芽孢桿菌屬(5ac/腸)、博德特菌屬(Borfifefe〃a)、短根瘤菌屬(萬(wàn)ra辦r/^o&ww)、布魯氏桿菌屬(Brace//(3)、伯霍爾德桿菌屬(Aw^/zo/Jen'")、柄桿菌屬(Cflw/o6ac/w)、綠屈撓菌屬(CWorayfea^)、梭菌屬(C7osfrW"m)、考克斯體屬(Cox/e〃a)、脫亞硫酸菌(D&yw訴to6acten'ww)、地桿菌屬(GeoZa"er)、嗜血桿菌屬(//ae/wc|p/7us)、軍團(tuán)菌屬(丄egz'o"e//(3)、f勾端i累方定體屬(丄ep/os;^'n3)、Afo;gKetococcMs、磁蟲(chóng)累菌屬(M"agnefos/^n'〃wm)、曼氏桿菌屬(Mhwi/2eimz'a)、中生根瘤菌屬(Afesor/^o6/wm)、甲基芽孢桿菌屬(Me^y/o5flc/〃ws)、甲基桿菌屬(A/e鄉(xiāng)/o6acfeWw附)、分枝桿菌屬(綺c。6acfen'歸)、奈瑟球菌屬(iVe^en'a)、亞硝化單孢菌屬(M7myomowos)、念珠藻屬(Mwtoc)、巴斯德菌屬(Pos&wre〃a)、原綠球藻屬(Prac/z/oracoccwj)、紅桿菌屬(7/zocfo^cter)、紅球菌屬(/^odococcM)、紅假單胞菌屬(朋O(io尸sewcto附o"as)、立克次體屬(7/cfeto/a)、志賀菌屬(幼/ge〃a)、中華根瘤菌屬(&"or/n'zo6/ww)、鞘胺醇單胞菌屬(5^/2/wgowo"as)、鏈霉菌屬(5y邵/o，cay)、聚球藻屬(iS;/"ec/zococcw51)、集胞藻屬(^"ec/2oc"to)、弧菌屬(P^Wo)、木質(zhì)部小菌屬(JVye〃a)、耶爾森氏菌屬(yera/"a)、發(fā)酵單胞菌屬(Z，o,歸)或黃單胞菌屬(Xa"f/zcwo腿)。(7)上述(1)~(6)任一項(xiàng)所述的微生物，其中，微生物是選自下述組中的微生物草生歐文氏菌(五rvWw'a^A/co/a)、解淀粉歐文氏菌(五nWm'aam_y/ovora)、胡蘿卜軟腐歐文氏菌(五rvWm'acaratovora)、粘質(zhì)沙雷菌(&rra^wa/rMcera)、鳥(niǎo)氨酸脫羧酶陰性沙雷菌(5^ra^7/cw/a)、居泉沙雷菌(&rnz"a/o"rico/a)、鳥(niǎo)氨酸脫羧酶陽(yáng)性沙雷菌(5"e/ra"a//《we々c/e"s)、腸炎、沙門菌亞屬(Sa/附o"e〃a)、腸炎沙門菌((Sa/mo/e〃aewfe"窗^)、晶'j傷寒沙門菌(5b/wowe〃a/ara妙/z/)、傷寒沙門菌(Sa/mo"e〃a都伯林沙門菌(5"<3/mo"e//acwW/")、鼠傷寒沙門菌((Sa/wo"e//(32)^/n'wz^7'ww)、大腸埃希桿菌(■Esc/zen'c/n'aco//)、雷氏變形菌(尸ra&wsre"gen')、惡臭假單胞菌(i^ez^omowaspi^/da)、螢光假單胞菌(尸s6Wfifomowayy7wor&sceAw)、銅鄉(xiāng)錄假單胞菌(尸sew6fo/Mowasae^wg/wc^a)、《惠阿昆假單胞菌(尸"M(io/noMas^a!cw"/zfle)、螢光假單胞菌(尸sew(io附o"asywo尸&sce"s)、丁香假單胞菌(尸sewdomowas5^rz'"g(3e)、尸sewabmcwasf/zaz(i/"o//zz7w附、嗜酸氧"f七亞鐵硫桿菌(^4c/c/^n'o5acz'〃wsybroo:a'ca"s)、不動(dòng)桿菌(爿cz'"eto6acfer印.)ATCC33305、根癌土壤桿菌(爿groZ^cfen'wmf謡咖"'ms)、嗜堿芽孢桿菌(萬(wàn)acz'腸/2"/od畫(huà)"s)、支氣管炎博德特菌(5orfifefe〃a6rowc/w,se/rica)、晶U百曰咳博"[戈氏菌(5orafefe〃a/arapeWM^/s)、百日咳博德特菌(50^feteZ/apeWi^^)、慢生型大豆根瘤菌(5ra辦WH'zo6/wnya;om'cww)、馬爾他布魯桿菌(Brace〃awe/"e"w;y)、類鼻疽伯霍爾德桿菌(5wr^/zo/(ieWa/weM(ioma〃ez-)、新月柄桿菌(Caw/oZaCercreycewfws)、橙色綠屈撓菌(C7z/oray7e;c附ai/ra"/toc"s)、丙酮丁醇梭菌(C/as/rW,aceto6M0V/cwm)、肉毒梭菌(C7oWnVZ/wm6ofw//"wm)、7艮只隹梭菌(C7os/nW/wmc/^"7e)、伯內(nèi)特考克斯體(Co:n.e〃aZwm幼7)、D&sz^/fo6acterz'ww/z—/erae、芳香族化合物降解耦連鐵還原細(xì)菌(Geo6a"e/^eto〃zVe^ce"s)、杜克雷嗜血桿菌(//oemop/n./i^(iwcre_y/)、嗜月巿軍團(tuán)病桿菌(丄eg/o/7e〃a;wez^wop/H7a)、問(wèn)號(hào),勾端蟲(chóng)累方定體(丄eptosp/ra/"te/Toga"s)、A/ogweococcwsMC-1、趨磁蟲(chóng)累方定菌(A/i3g77efo1s7/n'//wmwagwefofac&cwm)、溶血曼海女母菌(A^ww/2e/附/0/zfle附o/y"cfl)、百脈根中生根瘤菌(Afejor/2/zoZ)/w附/of/)、Mef/^/o6ac/〃"5y/(3ge〃a加、甲基營(yíng)養(yǎng)菌屬(Afe一/oZ)flcfen'wwexfc^we"s)、牛分枝桿菌(柳co6ac加',6cn^s)、麻風(fēng)分枝桿菌(聊co6flCm,ww/eprae)、海分枝桿菌(綺co6acfen'wmwan'wwm)、結(jié)t亥分支桿菌(Afyco6acfen'w附^/6ercw/cw7's)、淋病奈瑟球菌(脂^er/ago"o/r/zo簡(jiǎn))、腦膜炎奈瑟球菌(A^sm'amg"/wg"/^fa)、'歐洲亞石肖"f七毛桿菌(7V"mso附o"oyewra/7a^3)、點(diǎn)形念珠藻(Mwtocjcwc咖rme)、多殺巴斯德菌(PostezW/a卿/to"W")、原核綠藻)、莢膜紅桿菌(i/ocfo6acfercapra/aft)、苯酚降解菌紅球菌菌株(i^odococcws平Wra/")124、沼澤紅假單胞菌(7/zofifo尸sew(iowowasj!a/wWn^)、普氏立克次體(i/c^e^s7a;rowazeA77)、弗氏志賀菌(iS72z-ge〃(3y7exwe"')、苜蓿中華根瘤菌(5V"0W7/206/"wwe///o"')、溶芳烴鞘氨醇單胞菌(Sp/n'"gomomwaramaric!'wrara)、阿維f連霉菌(5y，tom少casotvenm'fz'fe)、天藍(lán)色鏈霉菌(5^e/to^yc&scoe//co/or)、聚球藻(5^"ec/zococcwsw.)WH8102、集胞藻(5^ec/2oqy幼;s)PCC6803、霍亂弧菌(H6n'oc/zo/erae)、苛養(yǎng)木桿菌(J^/e//a/os^^osa)、苛養(yǎng)木桿菌(A/e//a/a幼W/(wa)、鼠疫耶爾森氏菌(^ra/"a)、運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單孢菌(Zy附owo"asmo6Z/z's)、7JC禾擋黃單胞菌(^Yi3"f/zo附o"aso^jzae)禾卩甘藍(lán)黑腐病黃單胞桿菌(^Ta"^2cw70"asca/as/n's)。(8)乳酸的制造方法，其中，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)上述(1)~(7)任一項(xiàng)所述的微生物，從而在培養(yǎng)物中生成乳酸并使其蓄積，然后從該培養(yǎng)物中采集乳酸。通過(guò)本發(fā)明，可以提供乳酸的生產(chǎn)率有所提高的微生物以及使用了該微生物的乳酸制造方法。具體實(shí)施例方式1.本發(fā)明的微生物作為本發(fā)明的微生物，只要是4-羥基苯甲酸聚異戊烯基轉(zhuǎn)移酶活性或2-八異戊烯基苯酚2-八異戊烯基-6-甲氧基苯酚黃素還原酶活性降低或喪失、且具有生產(chǎn)乳酸的能力的微生物，則并無(wú)特別限定，例如可以舉出下述微生物:染色體DNA上的對(duì)具有4-羥基苯甲酸聚異戊烯基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)(以下也稱為UbiA蛋白質(zhì))進(jìn)行編碼的基因或者對(duì)具有2-八異戊烯基苯酚2-八異戊烯基-6-甲氧基苯酚黃素還原酶活性的蛋白質(zhì)(以下也稱為UbiB蛋白質(zhì))進(jìn)行編碼的基因的一部分或全部缺失、且具有生產(chǎn)乳酸的能力的微生物。另外，本說(shuō)明書(shū)中，基因含有結(jié)構(gòu)基因和啟動(dòng)子、操作基因等具有特定控制功能的區(qū)域，作為具有編碼UbiA蛋白質(zhì)或UbiB蛋白質(zhì)的基因的一部分或全部缺失了的染色體DNA的微生物，由于染色體DNA上的該基因的堿基序列中有堿基的缺失，因此可以舉出下述微生物(l)編碼UbiA蛋白質(zhì)或UbiB蛋白質(zhì)的基因的啟動(dòng)子或操作基因等的轉(zhuǎn)錄控制不發(fā)揮功能、且不表達(dá)UbiA蛋白質(zhì)或UbiB蛋白質(zhì)的微生物，(2)產(chǎn)生移碼、且UbiA蛋白質(zhì)或UbiB蛋白質(zhì)不作為具有活性的蛋白質(zhì)而表達(dá)的微生物，(3)對(duì)UbiA蛋白質(zhì)或UbiB蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的基因中的結(jié)構(gòu)基因的一部分或全部缺失的微生物等，可以優(yōu)選舉出(3)的微生物，更優(yōu)選對(duì)UbiA蛋白質(zhì)或UbiB蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的基因中的結(jié)構(gòu)基因全部缺失的微生物。編碼UbiA蛋白質(zhì)或UbiB蛋白質(zhì)的基因中的結(jié)構(gòu)基因的一部分缺失可以是結(jié)構(gòu)基因部分的1個(gè)堿基缺失，優(yōu)選結(jié)構(gòu)基因中的510個(gè)堿基缺失、更優(yōu)選該基因中的1050個(gè)堿基缺失、進(jìn)一步優(yōu)選該基因中的50-100個(gè)堿基缺失。作為4-羥基苯甲酸聚異戊烯基轉(zhuǎn)移酶活性或2-八異戊烯基苯酚2-八異戊烯基-6-甲氧基苯酚黃素還原酶活性有所降低的微生物，與具有編碼野生型UbiA蛋白質(zhì)或UbiB蛋白質(zhì)的基因的微生物相比，只要是其活性有所降低的微生物則無(wú)特別限定，一般可以舉出降低至60%以下、優(yōu)選40%、更優(yōu)選20%以下、進(jìn)一步優(yōu)選10%以下、特別優(yōu)選5%以下的微生物。編碼UbiA蛋白質(zhì)或UbiB蛋白質(zhì)的基因只要是編碼具有4-羥基苯甲酸聚異戊烯基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)的基因或編碼具有2-八異戊烯基苯酚2-八異戊烯基-6-甲氧基苯酚黃素還原酶活性的蛋白質(zhì)的基因，則無(wú)特別限定，例如可以舉出編碼具有序列號(hào)1或2所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的基因；對(duì)與具有序列號(hào)1或2所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)具有80%以上、優(yōu)選卯％以上、更優(yōu)選95%以上、進(jìn)一步優(yōu)選98%以上、特別優(yōu)選99%以上的同源性，且具有4-羥基苯甲酸聚異戊烯基轉(zhuǎn)移酶活性或2-八異戊烯基苯酚2-八異戊烯基-6-甲氧基苯酚黃素還原酶活性的蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的基因；分別編碼具有序列號(hào)1或2所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的基因即具有序列號(hào)3或4所示的堿基序列的基因；在嚴(yán)格條件下和具有與序列號(hào)3或4所示的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列的多核苷酸雜交且對(duì)具有4-羥基苯甲酸聚異戊烯基轉(zhuǎn)移酶活性或2-八異戊烯基苯酚2-八異戊烯基-6-甲氧基苯酚黃素還原酶活性的蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的基因。氨基酸序列或堿基序列的同源性可以使用KarlinandAltschul的算法BLAST[Pro.Natl.Acad.Sci.USA，90，5873(1993)]或FASTA[MethodsEnzymol.，183，63(1990)]來(lái)決定。根據(jù)該算法BLAST,開(kāi)發(fā)了稱為BLASTN和BLASTX的程序[J.Mol.Biol.，215，403(1990)]。根據(jù)BLAST,利用BLASTN來(lái)解析堿基序列時(shí)，參數(shù)例如設(shè)為Score=100、wordlength=12。另外，根據(jù)BLAST,利用BLASTX來(lái)解析氨基酸序列時(shí)，參數(shù)例如設(shè)為Score=50、wordlength=3。使用BLAST和GappedBLAST程序時(shí)，使用各程序的缺省參數(shù)。這些解析方法的具體方法是公知的(http://www.ncbi.nlm.nih.gov.)。另外，這里所說(shuō)的"雜交"是指基因雜交于具有特定堿基序列的多核苷酸或該多核苷酸的一部分。因此，該具有特定堿基序列的多核苷酸或其一部分是可以用作RNA或DNA印跡法解析的探針的多核苷酸，還是可以作為PCR解析的寡核苷酸引物使用的多核苷酸。作為探針使用的多核苷酸可以舉出至少100個(gè)堿基以上、優(yōu)選200個(gè)堿基以上、更優(yōu)選500個(gè)堿基以上的多核苷酸，作為引物使用的多核苷酸可以舉出至少10個(gè)堿基以上、優(yōu)選15個(gè)堿基以上的多核苷酸。多核苷酸的雜交實(shí)驗(yàn)的方法眾所周知，例如只要是本領(lǐng)域技術(shù)人員即可根據(jù)本申請(qǐng)說(shuō)明書(shū)來(lái)決定雜交的條件。該雜交的條件除了記載于分子克隆第2版、第3版(2001年)、MethodsforGeneralandMolecularBacteriolgy,ASMPress(1994)、Immunologymethodsmanual,Academicpress(Molecular)中之外，還可以根據(jù)多數(shù)其它的標(biāo)準(zhǔn)教科書(shū)來(lái)進(jìn)行。上述嚴(yán)格條件優(yōu)選下述的條件將多核苷酸、優(yōu)選固定了DNA的過(guò)濾器和探針、優(yōu)選探針DNA在含有50n/。甲醛、5XSSC(750mM的氯化鈉、75mM的檸檬酸鈉)、50mM的磷酸鈉(pH為7.6)、5X登哈特溶液(Denhardt，ssolution),10%的硫酸葡聚糖和20昭/1的改性后的鮭魚(yú)精子DNA的溶液中、于42'C下孵育1晚，然后在例如約65'C的0.2XSSC溶液中洗滌該過(guò)濾器。但也可以使用更低的嚴(yán)格條件。嚴(yán)格條件的更改可以通過(guò)甲醛的濃度調(diào)整(越降低甲醛濃度則成為越低的嚴(yán)格)、鹽濃度和溫度條件的改變來(lái)進(jìn)行。作為低嚴(yán)格條件，例如可以舉出在含有6XSSCE(20XSSCE為3mo1/1的氯化鈉、0.2mol/l的磷酸二氫鈉、0.02mol/l的EDTA、pH為7.47)、0.5%的SDS、30%的甲醛、100pg/l的改性后的鮭魚(yú)精子DNA的溶液中、于37°C下孵育1晚后，使用5(TC的1XSSC、0.1%SDS溶液中進(jìn)行洗滌的條件。另外，作為更低嚴(yán)格條件，可以舉出在上述低嚴(yán)格條件下使用高鹽濃度(例如5XSSC)的溶液進(jìn)行雜交后洗滌的條件。上述各種條件還可以通過(guò)添加或改變用于抑制雜交實(shí)驗(yàn)的背景而使用的阻斷劑來(lái)設(shè)定。上述阻斷劑的添加為了使條件適合，還可以伴隨雜交條件的改變。作為在上述嚴(yán)格條件下可以雜交的基因，例如可以舉出在使用上述BLAST或FASTA等根據(jù)上述參數(shù)等計(jì)算時(shí)，與序列號(hào)3或4所示的堿基序列具有至少90%以上、優(yōu)選95%以上、更優(yōu)選97%以上、進(jìn)一步優(yōu)選98%以上、特別優(yōu)選99%以上的同源性的基因。可以通過(guò)例如使用基因重組法制造該基因所編碼的蛋白質(zhì)、并測(cè)定該蛋白質(zhì)的活性來(lái)確認(rèn)在嚴(yán)格條件下和具有與序列號(hào)3或4所示的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列的多核苷酸進(jìn)行雜交的基因是對(duì)具有4-羥基苯甲酸聚異戊烯基轉(zhuǎn)移酶活性或2-八異戊烯基苯酚2-八異戊烯基-6-甲氧基苯酚黃素還原酶活性的蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的基因。另外，本發(fā)明的微生物可以優(yōu)選舉出原核生物、更優(yōu)選舉出細(xì)菌。細(xì)菌可以舉出屬于下述屬的微生物歐文氏菌屬(五nWm'a)、沙雷菌屬(5^raf/a)、沙門菌屬(5"a/mo"e〃a)、埃希氏菌屬(Esc/zehc/w'a)、變形桿菌屬()、假單胞菌屬(i^eM必wo"as)、酸硫桿狀菌屬(」c逾/z/o5"c/〃mj)、不動(dòng)桿菌屬(f"eto6"cfer)、土壤桿菌屬(」gnkzcfer/w附)、芽孢桿菌屬(Bac/〃ws)、t専t惠牛寺菌屬(5onie&〃0)、矢豆根瘤菌屬(Sra辦r/^o6/ww)、布魯氏桿菌屬(Sn/ce//a)、伯霍爾德桿菌屬(萬(wàn)wrA:/o/^;fer/a)、柄桿菌屬(Caw/o6ac^)、綠屈撓菌屬(C7z/o一e;cws)、梭菌屬(C7o欲Wwm)、考克斯體屬(Cox/e〃a)、脫亞硫酸菌(Z)esw^^o6acfen'w附)、i也木干菌屬((7eo6flCe廠)、嗜血桿菌屬(//i3ewc(p/w./wj)、軍團(tuán)菌屬(丄eg/o"e〃fl)、鉤端螺方定體屬(丄epto—ra)、Afog"etococcz^、磁螺菌屬(^M3gTetos^W〃ww)、曼氏桿菌屬(^M3""/ze/m/a)、中生根瘤菌屬(Afey。rAizoZuY/m)、甲基芽包桿菌屬(Afe決jVc^ac/〃^)、甲基桿菌屬(Me^y/oZaC',)、分枝桿菌屬(柳co6ac她'ww)、奈瑟球菌屬(AAe/Men'a)、亞硝化單孢菌屬(7Wfmsowo"os)、念珠藻屬(Mwtoc)、巴斯德菌屬(尸oyfeM^〃a)、原綠球藻屬(尸rac似oracocc^)、紅桿菌屬(A/zc^oZ)acfer)、紅球菌屬(//zo^coccws)、紅假單胞菌屬(朋odoi^gM(5fowo膽)、立克次體屬(臉A:e咖'a)、志賀菌屬(幼/ge〃a)、中華根瘤菌屬"/"or/z/zo6/MW)、鞘月安醇單胞菌屬"http://w'"gowo"oy)、鏈霉菌屬(Sfreptow;vces)、聚球藻屬(S"ecAococcws)、集胞藻屬(iS"ec/w，"'s)、弧菌屬(P%n'o)、木質(zhì)部小菌屬(I>>/e//a)、耶爾森氏菌屬(rera/"a)、發(fā)酵單胞菌屬(Zywcwo"os)或黃單胞菌屬(％"wAomo"as)。另外，屬于上述屬的細(xì)菌可以舉出草生歐文氏菌(五rv^m'。&e^/co/fl)、解淀粉歐文氏菌(五rw/m'aamy/ovora)、胡蘿卜軟腐歐文氏菌(EnWm'acaratowra)、粘質(zhì)沙雷菌(&m^"woraycmy)、鳥(niǎo)氨酸脫羧酶陰性沙雷菌(5^raf/a力can'a)、居泉沙雷菌(&m^'fl/owf/co/a)、鳥(niǎo)氨酸脫羧酶陽(yáng)性沙雷菌dSerraf/a/—咖c/ms)、腸炎沙門菌亞屬(5W/附owe〃(3e她Wca)、腸炎沙門菌(5""/,"e〃ae"fe〃Y/必)、畐'J傷寒沙門菌(S"/wo"e〃a/"ra妙/zO、傷寒沙門菌"a/wo"eZ/a0^/')、都伯林沙門菌(5Wmo"e//aJwW/w)、鼠傷寒沙門菌(&z/mowe〃a妙/n'wwn',)、大腸埃希桿菌(Esc/er/c/n'aco//)、雷氏變形菌/^軟"')、惡臭假單胞菌(尸化W(io膨"ay/7wf油)、螢光假單胞菌(/^ewcfcw7o"os,w&scms)、銅綠假單胞菌(/^ewfifowo"asam^/"os<3)、《惠P可昆假單胞菌(Z^ew(icw20"ascbcM"/2ae)、螢光假單胞菌(尸"W(iomo"asy7"omscera)、丁香假單胞菌(尸"w^o附o"oy)、/^ew(abwo""j^w:W"opM顧、嗜酸氧化亞鐵硫桿菌"c逾/7,oBacz7/ws，raoxWa"5)、不動(dòng)桿菌(Jc/"efo6ac&rv.)ATCC33305、根癌土壤桿菌(Jgra6a"e〃、w/wwe/ac/em)、嗜堿芽孢桿菌(Bac/〃w/^/odwrara)、支氣管炎博德特菌(丑orafe〖e〃a6ro"c/z/se;"ca)、雖U百曰咳t専4戈氏菌(5orafete〃a/7(3ra;eWwM/s)、百日咳博德特菌(BoWe&〃a/em^&)、慢生型大豆根瘤菌(Bra辦r/w'zo6z'wm乂^o"z'cww)、馬爾他布魯桿菌(5race〃a附e/"era^)、類鼻疽伯霍爾德桿菌(5wr^/2o/6fen'apsewi/oma〃e/)、新月牛丙桿菌(Caw/o6acfe/-C7^scewdAy)、橙.色綠屈撓菌(C7z/ora/fecus"wra"f/flcw51)、丙酮丁醇梭菌(C7o欲W畫(huà)aceto6w/y//cwm)、肉毒梭菌(C7ayW<i/wmZ>ort///"wm)、艱7隹梭菌(C7c^n'<i/wwd驕"7e)、伯內(nèi)特考克斯體(Cox/e〃aZWT7e"7)、Dasw折toZ)ac^/謂/z咖/mse、芳香族化合物降解耦連鐵還原細(xì)菌(GeoZ>a"wmeto///w^cera)、杜克雷嗜血桿菌(//aewop/n'/wj1c/wc/^yz.)、嗜月市軍團(tuán)病桿菌(丄eg/owe〃ap"ewmop/w7a)、問(wèn)號(hào)鉤端螺旋體(Z取oy//ra/"欣rag";w)、MC-1、趨磁螺旋菌(jW"agwefospz'n'〃Mmwag"e^^"cf/cww)、溶血曼海姆菌(Afoww/ze/附/a/zaemo/j"ca)、百脈根中生根瘤菌(Af&sw/n,zo6z'wm/o"')、Afe/7y/0Z)ac/〃wsyage〃ato、甲基營(yíng)養(yǎng)菌屬(Me^y/oZaCm'畫(huà)exto"era)、牛分枝桿菌(A^co6(3cfen'ww6ov&)、麻風(fēng)分豐支桿菌(Afyco6acfen'ww/e/nae)、海分豐支豐干菌(Afyco6acfen'wmwan'"wm)、結(jié)核分支桿菌(Afyco6acten',fwZ^cw/o^)、淋病奈瑟球菌(iVe&m'ago"orr/2。eae)、腦膜炎奈瑟球菌(A^'認(rèn)n'awem'"g/〖/(afo)、歐洲亞石肖化毛桿菌(A^mswwo"osewra/"e")、點(diǎn)形念珠藻(7Vostoc/7w"cfi/br附e)、多殺巴斯《惠菌(尸awfewre〃aww/toc^/a)、原t亥纟錄藻(尸rac/2/0rac0ccwsw"n'"ws)、莢膜紅桿菌(i/zocfc^cferca/ww/a加)、苯酷降解菌紅球菌菌株(i/zodococcwv.Wra/n)124、沼澤紅假單胞菌(i/20fito尸seM6/o附o"aspa/MWr^)、普氏立克7欠體(i^c^e"s/a/rowflzeA:z7)、弗氏志賀菌(幼/ge〃ayexwen')、苜蓿中華根瘤菌(5V"or/2izo&wm附e/z7加')、溶芳烴鞘氨醇單胞菌(S;W"go附o"asflramaric/vora"s)、阿維鏈霉菌(5^epto，casaver脂誠(chéng)s)、天藍(lán)色鏈毒菌(5^取om少cescoe//co/or)、聚球藻(^wec^ococcwsw.)WH8102、集胞藻(<^"ec/zoc>^/<s)PCC6803、霍亂弧菌(ra^oc/w/erae)、苛養(yǎng)木桿菌a^/e〃a/o^/^wa)、苛養(yǎng)木桿菌(J^/e//a/a幼VZ/osa)、鼠疫耶爾森氏菌(Fera/"a/asto)、運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單孢菌(Zymo附o"os附。6z7&)、7JC禾舀黃單胞菌(^fa"^zcw2o"oso^yzae)禾口甘藍(lán)黑腐病黃單胞桿菌(^m^omo"osca/e欲&)等，更優(yōu)選舉出大腸埃希桿菌(￡.2.本發(fā)明的微生物的制造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明的微生物可以通過(guò)下述方法來(lái)制造(1)使存在于具有生產(chǎn)乳酸的能力的微生物的染色體DNA上的編碼UbiA蛋白質(zhì)或UbiB蛋白質(zhì)的基因的一部分或全部缺失的方法，或者(2)對(duì)染色體DNA上的編碼UbiA蛋白質(zhì)或UbiB蛋白質(zhì)的基因的一部分或全部缺失了的微生物賦予乳酸生產(chǎn)性的方法。具有生產(chǎn)乳酸的能力的微生物只要是具有該能力的微生物就行，沒(méi)有特別限定，作為該微生物，從自然界分離的株本身具有該能力時(shí)，可以舉出該株本身、通過(guò)公知方法人為地賦予生產(chǎn)乳酸的能力的微生物等。作為該公知的方法可以舉出將控制乳酸的生物合成的機(jī)制的至少一個(gè)緩和或解除的方法、將與乳酸的生物合成相關(guān)的酶的至少一個(gè)的表達(dá)強(qiáng)化的方法、使與乳酸的生物合成相關(guān)的酶基因的至少一個(gè)的拷貝數(shù)增加的方法、將從乳酸的生物合成路徑向該有用物質(zhì)以外的代謝產(chǎn)物分支的代謝路徑的至少一個(gè)弱化或阻斷的方法、選擇對(duì)于乳酸類似物的耐性度高于野生型株的細(xì)胞株的方法等。上述公知的方法可以單獨(dú)使用或者組合使用。作為上述(a)的方法，可以舉出將利用丙酮酸甲酸裂解酶基因進(jìn)行的乳酸生物合成控制解除的方法[Appl.Environ.Microboil.,69,399(2003)]，作為(c)的方法，可以舉出將編碼L-乳酸脫氫酶的DNA在染色體DNA上引入6拷貝的方法[Appl.Environ.Microboil.，71，2789(2005)]，作為(d)的方法，可以舉出向磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶基因和磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因引入突變的方法[Appl.Environ.Microboil.，65，1384(1999)]等。對(duì)于染色體DNA上的編碼UbiA蛋白質(zhì)或UbiB蛋白質(zhì)的基因的一部分或全部缺失了的微生物，只要可以獲得該微生物則其獲得方法并無(wú)限定，例如可以利用下述微生物的染色體DNA上的編碼UbiA蛋白質(zhì)或UbiB蛋白質(zhì)的基因的堿基序列信息，向處于微生物染色體DNA上的編碼UbiA蛋白質(zhì)或UbiB蛋白質(zhì)的基因引入堿基的缺失、置換或附加的方法來(lái)獲得。各微生物所具有的編碼UbiA蛋白質(zhì)或UbiB蛋白質(zhì)的基因的堿基序列可以如下確定通過(guò)使用序列號(hào)3或4所示的堿基序列作為查詢(query)的各種DNA序列數(shù)據(jù)庫(kù)的檢索來(lái)確定；通過(guò)將具有與序列號(hào)3或4所示的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列的多核苷酸的全部或一部分作為探針的對(duì)各種微生物染色體DNA的DNA雜交，從而鑒定并獲得編碼UbiA蛋白質(zhì)或UbiB蛋白質(zhì)的基因來(lái)確定；或者使用根據(jù)序列號(hào)3或4所示的堿基序列而設(shè)計(jì)的引物，通過(guò)以各種微生物的染色體DNA為模板的PCR來(lái)鑒定并獲得編碼UbiA蛋白質(zhì)或UbiB蛋白質(zhì)的基因后，通過(guò)常規(guī)方法解析該基因的堿基序列來(lái)確定。供于DNA雜交和PCR的染色體DNA可以均為微生物的染色體DNA，優(yōu)選為屬于下述屬的微生物歐文氏菌屬(￡rvWm'fl)、沙雷菌屬"wrato)、沙門菌屬(&/mo"e//a)、埃希氏菌屬(&c/zm'c/n'a)、變形桿菌屬(尸ratews)、假單胞菌屬(尸M^/omoww)、酸硫桿狀菌屬"cWWo5acz7/w)、不動(dòng)桿菌屬""'"eto6acter)、土壤桿菌屬(々ra6acte"',)、芽孢桿菌屬(&c/〃ws)、博德特菌屬(Borafefe〃a)、短根瘤菌屬(5ra辦r/^oWww)、布魯氏桿菌屬(丑n/ce〃a)、伯霍爾德桿菌屬(5w^/zoWen'a)、豐丙桿菌屬(Gaw/o6acfer)、綠屈撓菌屬(C/2/orq/exus)、梭菌屬(C/oWnWwm)、考克斯體屬(Cox/e//a)、脫亞硫酸菌(Z)a"訴tok7Cten'wm)、地桿菌屬(Geo6a"er)、嗜血桿菌屬(T/aemo;W/z^)、軍團(tuán)菌屬(Zeg/o"e〃a)、鉤端螺旋體屬(丄eptospz'ra)、Mag"etococcw、磁螺菌屬(Mag72etos/zW〃ww)、曼氏桿菌屬(Ma""/2e/mz'a)、中生根瘤菌屬(Afeso油/zo6/wm)、甲基芽孢桿菌屬(MeA;;/o5aa7/^)、甲基桿菌屬(Afef/2少/oZacfen、m)、分枝桿菌屬(Afyco6ac&n'ww)、奈瑟球菌屬(A^heWa)、亞硝化單孢菌屬(A^msomo"os)、念珠藻屬(7Vcwtoc)、巴斯德菌屬(尸mfewW/a)、原綠球藻屬(尸rac/z/oracoccm)、紅桿菌屬(i/zoJo6acfer)、紅球菌屬(及/2oJococcrs)、紅假單胞菌屬(及/wc/oi^ewdomowoy)、立克7欠體屬(//c^e"w.a)、，志賀菌屬(《S72/ge//a)、中華根瘤菌屬(&'"or/^o6/ww)、鞘胺醇單胞菌屬(5^/"gomo"w)、鏈霉菌屬()Sfr取ow戸s)、聚球藻屬(&"ec/zococc^)、集胞藻屬(^y腦/zo，to)、弧菌屬(W6n'o)、木質(zhì)部小菌屬(Xy/e//fl)、耶爾森氏菌屬(&m'"a)、發(fā)酵單胞菌屬(Z>wowo"os)或黃單胞菌屬(Jra"Ao附o"as)，更優(yōu)選可以舉出草生歐文氏菌(￡nWm'a6w6z'co/a)、解淀粉歐文氏菌(五rw'm'aam少/owra)、胡蘿卜軟腐歐文氏菌(五rvWm'acaratovora)、粘質(zhì)沙雷菌(Serra"am『cescms)、鳥(niǎo)氨酸脫羧酶陰性沙雷菌(&rra"a力can'a)、居泉沙雷菌(Serraf/a/o油'co/")、鳥(niǎo)氨酸脫羧酶陽(yáng)性沙雷菌(&庁加'"/z々we/acz'my)、腸炎沙門菌亞屬(5b/附owe〃ae"fe"'ca)、月湯炎沙門菌(5W/mo"e〃aewfer/"D、副傷寒沙門菌(5>a/mo"e//ajpara/^p/n')、傷寒沙門菌(6h/附o"e〃a(v/fo')、都伯林》少門菌(iSa/wo"e〃adw6/z>2)、鼠j另寒沙、門菌(5b/wo"e〃a/>p/H>w/n'ww)、大腸埃希桿菌(￡sc/^r/c/^co//)、雷氏變形菌(戶rateww/《er/)、惡臭假單胞菌(尸sei^omowos/7w"'^)、螢光假單胞菌(尸化wdcw70wasy7womscms)、銅纟錄假單胞菌(戶5^Mc/owo"asflgrwgz'"(wa)、德P可昆4叚單胞菌(尸sewcfomo"as(iacw"/zae)、螢光假單胞菌(i^ewdo膨"os/7womscms)、丁香假單胞菌(i^eM^owo"oss^r/wgae)、i^ewdowo"osf/zaz^>7C!p/2//ww、嗜酸氧"(七亞鐵硫桿菌"c逾/2/a6"c/〃t^ybroox油M)、不動(dòng)桿菌d/"加6acfer)ATCC33305、根癌土壤桿菌"gro6acfe"'wm^附e/a"'era)、嗜堿芽孢桿菌(5a"'〃w/w/ocwrara)、支氣管炎博德特菌(5orafete〃a6ra"c/^ep"ca)、副百日咳博代氏菌(Soriiete〃a/ara/er加^)、百曰咳博德特菌(5on^e〃aj9e池肌's)、慢生型大豆根瘤菌(5ra辦r/^zc^M附7apo^cw附)、馬爾他布魯桿菌(5rwce〃awe/"em&)、類鼻疽伯霍爾德桿菌(5wA;/2o/cfen'a;wewt/oma〃eO、新月柄桿菌(Caw/o6ac敏cmscew加)、澄色綠屈燒菌(C/z/orayZexwsm/ra油'aci/s)、丙嗣丁醇梭菌(C7o5tr/cf/wmacefo^m/y/fcwm)、肉毒梭菌(C7osfnV/fwm6ofw//wm)、艱難梭菌(C7cw^7'^wmd^cz7e)、伯內(nèi)特考克斯體(Cbx/e//aZ"m幼7)、Dew訴to&cter/Mm/za/m'mye、芳香族化合物降解耦連鐵還原細(xì)菌(Geo6ac&rmeto〃/rai"ce/w)、杜克雷嗜血桿菌(77flewop/w7wsdwc^y/)、嗜月市軍團(tuán)病桿菌(JLeg7'o"e〃ap"ew附op/w7a)、問(wèn)號(hào)牽勾立罱蟲(chóng)累方定體(JLe/tos//n3,"fen-oga"s)、A/l3g77eZococcwsMC-1、趨磁蟲(chóng)累方龍菌(AfagTetos/z'nY/wmma^Wofa"/cMm)、溶血曼海姆菌(A/a""/2e/m/a/zaemo/>f/c<3)、百脈根中生根瘤菌(Afesw/^o6/wm/of/)、Afe鄉(xiāng)/o6a"7/ws加ge〃a加、甲基營(yíng)養(yǎng)菌屬(Me勿/o6acten'則e加甲e"s)、牛分枝桿菌(聊co6a"er/扁feovz,s)、麻風(fēng)分枝桿菌(Afyco6acfen'ww/ejwae)、海分t支桿菌(A^co6acter/wwmar/wwm)、結(jié)卞亥分支桿菌(鄉(xiāng)co6ac加.ww2ft^ercw/o^)、淋病奈瑟球菌(7Ve^en'ago"orr/weae)、腦月莫炎奈瑟球菌(A^/^er/a附e"/"g/^fo)、歐洲亞石肖化毛桿菌(M加so附o"oewra/"ea)、點(diǎn)形念珠藻(7Vo加c/w"c爭(zhēng)rme)、多殺巴斯《惠菌(戶osfew/"e〃a附w/foc〖(ia)、原核纟錄藻(iVoc/z/orococcz^wan'"tw)、莢月莫紅桿菌(i/zocfokzcferca戸M/a^s)、苯酚降解菌紅球菌菌株(i^OfifocOCCMs/.)124、沼澤紅假單胞菌(i^oflb尸化wdomomw;^/MMn;y)、普氏立克次體(7/cfeto/apraw"zeh7)、弗氏志賀菌(57n'ge//ay7ex"eW)、苜蓿中華根瘤菌(iSV"or/zizoZ/w附we///o")、溶芳義圣銷氣醇單胞菌(i^/H'wgowowosarawa〃dvorara)、卩可纟隹f連霉菌(5^e/tom少ceym^rw"http://^)、天藍(lán)色鏈霉菌(coe//co/or)、聚球藻(iSywec/zococciw)WH8102、集胞藻(5y"ec/zoc^fe)PCC6803、霍亂弧菌(f%n'oc/w/erae)、苛養(yǎng)木桿菌(々/e//a々幼'^asa)、苛養(yǎng)木桿菌(A/e〃a々幼Vfewa)、鼠疫耶爾森氏菌(1ferw'"a/eW&)、運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單f包菌(^Zy附owowaswo6//^)、7jC禾酉黃單胞菌(jrawAomowas07zae)和甘藍(lán)黑腐病黃單胞桿菌(JTa"Ao的染色體DNA。雜交和PCR除了常規(guī)方法例如記載在分子克隆第2版、第3版(2001年)、MethodsforGeneralandMolecularBacteriolgy、ASMPress(1994)中之外，還可以根據(jù)多個(gè)其它標(biāo)準(zhǔn)教科書(shū)來(lái)進(jìn)行。作為編碼UbiA蛋白質(zhì)或UbiB蛋白質(zhì)的基因，例如可以舉出編碼具有序列號(hào)1或2所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的基因、具有序列號(hào)3或4所示的堿基序列的基因、來(lái)自弗氏志賀菌(57n'ge//ay7ex"eW)2a的ubiA基因和yigR基因(Genbankaccessionno.AE005674)、來(lái)自腸炎沙門菌亞屬(5"a/附o"e〃ae"ter/c")的ubiA基因禾口aarF基因(Genbankaccessionno.NC004631)等。作為向微生物染色體DNA上的基因引入堿基的缺失、置換或附加的方法，可以舉出利用同源重組的方法。作為利用一般的同源重組的方法，可以舉出使用可以將引入有堿基的缺失、置換或附加的突變基因與在想要引入堿基缺失等的宿主細(xì)胞內(nèi)無(wú)法獨(dú)立復(fù)制且具有耐藥劑性基因的質(zhì)粒DNA連接而制作的同源重組用質(zhì)粒的方法。通過(guò)常規(guī)方法將該同源重組用質(zhì)粒引入宿主細(xì)胞后，以耐藥劑性作為指標(biāo)，選擇通過(guò)同源重組而在染色體DNA上合并有該同源重組用質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化株。在不含該藥劑的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所得轉(zhuǎn)化株數(shù)小時(shí)1天后，涂于含有該藥劑的瓊脂培養(yǎng)基和不含該藥劑的瓊脂培養(yǎng)基中，通過(guò)選擇在前一個(gè)培養(yǎng)基中不會(huì)生長(zhǎng)、而在后一個(gè)培養(yǎng)基中可以生長(zhǎng)的株，可以獲得在染色體DNA上產(chǎn)生了第2次同源重組的株。通過(guò)確定染色體DNA上的引入有缺失等的基因所存在的區(qū)域的堿基序列，可以確認(rèn)向染色體DNA上的目標(biāo)基因引入了堿基的缺失、置換或附加。作為通過(guò)上述方法可以向染色體DNA上的目標(biāo)基因引入堿基的缺失、置換或附加的微生物，可以舉出屬于例如埃希氏菌屬的微生物。另外，作為利用高效地向多個(gè)基因引入堿基的缺失、置換或附加的同源重組的方法，可以舉出使用直鏈DNA的方法。具體地為將含有想要引入堿基的缺失、置換或附加的基因的直鏈DNA并入細(xì)胞內(nèi)，在染色體DNA和導(dǎo)入的直鏈DNA之間引起同源重組的方法。本方法只要是高效地并入直鏈DNA的微生物，則可以使用任何微生物，優(yōu)選的微生物可以舉出埃希氏菌屬、更優(yōu)選為大腸埃希桿菌、迸一步優(yōu)選表達(dá)來(lái)自人-噬菌體的重組蛋白質(zhì)組(Red重組體系)的大腸埃希桿菌。作為表達(dá)XRed重組體系的大腸埃希桿菌，可以舉出保有作為具有XRed重組體系基因的質(zhì)粒DNA的pKD46[可以從EscherichiacoliGeneticStockCenter(美國(guó)耶魯大學(xué))獲得]的大腸埃希桿菌JM101株等。作為同源重組所用的DNA，可以舉出(a)在耐藥劑性基因的兩側(cè)上具有存在于作為堿基的缺失、置換或附加的引入對(duì)象的染色體DNA上的區(qū)域兩外側(cè)的DNA或與該DNA具有同源性的DNA的直鏈DNA、(b)直接連接存在于作為堿基的缺失、置換或附加的引入對(duì)象的染色體DNA上的區(qū)域兩外側(cè)的DNA或與該DNA具有同源性的DNA而成的直鏈DNA、(c)在連接有耐藥劑性基因和可以用于負(fù)選擇的基因的DNA兩端具有存在于作為堿基的缺失、置換或附加的引入對(duì)象的染色體DNA上的區(qū)域兩外側(cè)的DNA或與該DNA具有同源性的DNA的直鏈DNA、(d)在上述(a)的直鏈DNA上，在存在于耐藥劑性基因和染色體DNA上的區(qū)域兩外側(cè)的DNA之間進(jìn)一步具有酵母來(lái)源Flp重組酶[Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,82，5875(1985)]所識(shí)別的堿基序列的DNA。作為耐藥劑性基因，只要是對(duì)于宿主微生物顯示敏感性的藥劑而賦予耐藥劑性的耐藥劑性基因，則可以使用任何耐藥劑性基因。當(dāng)在宿主微生物中使用大腸埃希桿菌時(shí)，作為耐藥劑性基因，例如可以舉出耐卡那霉素性基因、耐氯霉素性基因、耐慶大霉素性基因、耐大觀霉素性基因、耐四環(huán)素性基因、耐氨芐西林性基因等?？梢杂糜谪?fù)選擇的基因是指在宿主微生物中表達(dá)該基因時(shí)，在一定培養(yǎng)條件下對(duì)該微生物致死的基因，作為該基因，例如可以舉出屬于芽孢桿菌屬的微生物來(lái)源的sacB基因[Appl.Environ.Microboil.,59,1361-1369(1993)]和屬于埃希氏菌屬的微生物來(lái)源的rpsL基因[Genomics,72,99-104(2001)]等。上述存在于直鏈DNA兩末端的與位于染色體DNA上的成為置換或缺失的引入對(duì)象的區(qū)域的兩外側(cè)的DNA具有同源性的DNA在直鏈DNA中配置在與染色體DNA上的方向相同的方向上，其長(zhǎng)度優(yōu)選為10bp100bp左右、更優(yōu)選為20bp50bp左右、進(jìn)一步優(yōu)選為3040bp左右。酵母來(lái)源的Flp重組酶所識(shí)別的堿基序列是指只要是該蛋白質(zhì)識(shí)別、催化同源重組的堿基序列則無(wú)特別限定，優(yōu)選可以舉出具有序列號(hào)13所示的堿基序列的DNA;和在該DNA中具有1個(gè)數(shù)個(gè)的堿基缺失、置換或附加的堿基序列、且具有酵母來(lái)源的Flp重組酶所識(shí)別、催化同源重組的堿基序列的DNA。具有同源性是指上述直鏈DNA在染色體DNA上的目標(biāo)區(qū)域中具有發(fā)生同源重組的程度的同源性，作為具體的同源性，可以舉出80%以上、優(yōu)選90%以上、更優(yōu)選95%以上、進(jìn)一步優(yōu)選100%的同源性。上述堿基序列的同源性可以使用上述BLAST或FASTA等程序來(lái)確定。上述直鏈DNA可以通過(guò)PCR來(lái)制作。另外，還可以在質(zhì)粒上構(gòu)建含有上述直鏈DNA的DNA后，通過(guò)限制性酶處理來(lái)獲得目標(biāo)直鏈DNA。作為向微生物染色體DNA引入堿基的缺失、置換或附加的方法，可以舉出下述方法1~4。方法1:向宿主微生物引入上述(a)或(d)的直鏈DNA，以耐藥劑性為指標(biāo)，選擇該直鏈DNA通過(guò)同源重組而插入染色體DNA上的轉(zhuǎn)化株的方法。方法2:向通過(guò)上述方法1獲得的轉(zhuǎn)化株引入上述(b)的直鏈DNA，通過(guò)消除利用該方法插入到染色體DNA上的藥劑基因，使微生物的染色體DNA上的區(qū)域置換或缺失的方法。方法3:將上述(c)的直鏈DNA引入宿主微生物，以耐藥劑性為指標(biāo)，選擇該直鏈DNA通過(guò)同源重組而插入染色體DNA上的轉(zhuǎn)化株、合成在與染色體DNA方向相同的方向上連接與存在于染色體DNA上的置換或缺失的對(duì)象區(qū)域兩外側(cè)的DNA具有同源性的DNA而成的DNA，并引入到上述[l]獲得的轉(zhuǎn)化株中。在可以用于負(fù)選擇的基因表達(dá)的條件下，培養(yǎng)進(jìn)行了上述[2]操作的轉(zhuǎn)化株，選擇在該培養(yǎng)中可以生長(zhǎng)的株作為耐藥劑性基因和可以用于負(fù)選擇的基因從染色體DNA上消除了的株。方法4:將上述(d)的直鏈DNA引入宿主微生物，以耐藥劑性為指標(biāo)，選擇該直鏈DNA通過(guò)同源重組而插入染色體DNA上的轉(zhuǎn)化株、向上述[l]獲得的轉(zhuǎn)化株引入Flp重組酶基因表達(dá)質(zhì)粒，使該基因表達(dá)后，獲得對(duì)上述[l]所用的藥劑具有敏感性的株。作為上述方法中使用的將直鏈DNA引入宿主微生物的方法，只要是將DNA引入該微生物的方法則可以使用任何方法，例如可以舉出使用鈣離子的方法[Proc.Natl.Acad.Sci.,USA，69，2110(1972)]、原生質(zhì)體法(日本特開(kāi)昭63-2483942)、電穿孔法[NucleicAcidsRes.，16，6127(1988)]等。在方法2或方法3[2]所用的直鏈DNA中，通過(guò)使用在該DNA的中央部附近并有想要插入染色體DNA上的任意基因的直鏈DNA，可以在消除耐藥劑性基因等的同時(shí)，將任意的基因插入到染色體DNA上。上述方法2~4中，由于是最終所得轉(zhuǎn)化株的染色體DNA上不會(huì)殘留耐藥劑性基因和可以用于負(fù)選擇基因等外來(lái)基因的方法，因此通過(guò)使用該方法，使用相同耐藥劑性基因和可以用于負(fù)選擇的基因來(lái)反復(fù)進(jìn)行該方法，可以容易地制造染色體DNA上位置不同的2個(gè)以上的區(qū)域具有堿基的缺失、置換或附加的微生物。通過(guò)上述方法獲得的突變株的4-羥基苯甲酸聚異戊烯基轉(zhuǎn)移酶活性或2-八異戊烯基苯酚2-八異戊烯基-6-甲氧基苯酚黃素還原酶活性降低或喪失，例如可以通過(guò)利用公知方法測(cè)定該突變株和其原始菌株的泛醌的生產(chǎn)率，并進(jìn)行比較來(lái)確認(rèn)。另外，通過(guò)使本發(fā)明微生物的D-乳酸脫氫酶(EC1丄1.28)活性降低或喪失、更優(yōu)選強(qiáng)化L-乳酸脫氫酶(EC1丄2.27)活性，可以制造L-乳酸的生產(chǎn)率高的微生物；相反，通過(guò)使L-乳酸脫氫酶活性降低或喪失、更優(yōu)選強(qiáng)化D-乳酸脫氫酶活性，可以制造D-乳酸的生產(chǎn)率高的微生物。D-乳酸脫氫酶和L-乳酸脫氫酶的氨基酸序列和編碼該酶的基因的堿基序列在多數(shù)微生物中是已知的，可以從各種數(shù)據(jù)庫(kù)中容易地獲得其序列。因此，D-乳酸脫氫酶或L-乳酸脫氫酶的活性降低或喪失的微生物可以通過(guò)利用所得序列信息、根據(jù)上述方法使存在于染色體DNA上的這些酶基因的一部分或全部缺失而獲得。另外，D-乳酸脫氫酶或L-乳酸脫氫酶的活性有所強(qiáng)化的微生物可以通過(guò)利用公知的方法將這些酶基因弓I入該微生物而獲得。該基因還可以插入染色體DNA上，還可以作為質(zhì)粒DNA存在于染色體外。以大腸埃希桿菌(Esc/2^/c/7/flco//)為微生物、制作L-乳酸的生產(chǎn)率有所提高的微生物時(shí)，可以舉出使大腸埃希桿菌(&c/zeWc/^co//)的D-乳酸脫氫酶基因的ORF全部缺失、且將L-乳酸脫氫酶基因、優(yōu)選枯草桿菌(Bacz7/wsw&z'fc)的L-乳酸脫氫酶基因插入染色體DNA上的方法。3.本發(fā)明的使用了微生物的乳酸制造方法通過(guò)本發(fā)明的方法，可以生產(chǎn)D-乳酸和L-乳酸的任一種。在培養(yǎng)基中培養(yǎng)上述2的本發(fā)明微生物，在培養(yǎng)基中生成乳酸并使其蓄積，從該培養(yǎng)基中采集乳酸，從而可以制造乳酸。在培養(yǎng)基中培養(yǎng)該微生物的方法可以根據(jù)微生物培養(yǎng)所用的通常方法來(lái)進(jìn)行。艮P，只要是含有該微生物可以吸收的碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽類，且高效地進(jìn)行該微生物培養(yǎng)的培養(yǎng)基，則可以使用天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基的任一種。作為碳源，只要是該微生物可以吸收的碳源即可，可以使用葡萄糖、果糖、蔗糖、含有它們的糖蜜，淀粉或淀粉水解物等碳水化合物、醋酸、丙酸等有機(jī)酸，乙醇、丙醇等醇類等。作為氮源，可以使用氨、氯化銨、硫酸銨、乙酸銨、磷酸銨等無(wú)機(jī)酸或有機(jī)酸的銨鹽，其它含氮化合物以及蛋白胨、肉膏、酵母提取物、玉米漿、酪蛋白水解物、豆餅和大豆渣水解物、各種發(fā)酵菌體及其消化物等。作為無(wú)機(jī)鹽，可以使用磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、磷酸鎂、硫酸鎂、氯化鈉、硫酸亞鐵、硫酸錳、硫酸銅、碳酸鈣等。培養(yǎng)通常在振蕩培養(yǎng)或深部通氣攪拌培養(yǎng)等好氧條件下進(jìn)行。培養(yǎng)溫度可以為1540'C、培養(yǎng)時(shí)間通常為5小時(shí)7天。培養(yǎng)中pH保持于3.09.0。pH的調(diào)整使用無(wú)機(jī)或有機(jī)酸、堿溶液、尿素、碳酸鈣、氨等進(jìn)行。培養(yǎng)物中生成并蓄積的乳酸的采集可以通過(guò)使用活性炭或離子交換樹(shù)脂等的通常方法、或者使用離子交換膜的電透析法、在酯化后蒸餾進(jìn)行水解的方法、利用有機(jī)溶劑的提取法、減壓蒸餾使其結(jié)晶化的方法、使用高效液相色譜法等色譜法來(lái)進(jìn)行。以下示出實(shí)施例，但本發(fā)明并非局限于下述實(shí)施例。實(shí)施例1制作編碼UbiA蛋白質(zhì)或UbiB蛋白質(zhì)的基因缺失了的株以大腸埃希桿菌(￡.co//)KM22株[Gene，246，321-330(2000)]的染色體DNA為模板，使用由按照各個(gè)3'末端的25個(gè)堿基雜交于KM22株染色體DNA上的耐卡那霉素性基因兩末端的方式而設(shè)計(jì)的以序列號(hào)5和6所示的堿基序列所構(gòu)成的DNA作為引物對(duì)(primerset)，進(jìn)行PCR。PCR使用LA-Taq，根據(jù)LA-Taq所附的說(shuō)明書(shū)調(diào)制含有染色體DNA片段10ng、引物DNA各20pmo1的25pl的反應(yīng)液，并在下述條件下進(jìn)行在94'C下保溫2分鐘后，重復(fù)94'C下15秒鐘、55'C下20秒鐘、68'C下1分鐘的循環(huán)30次后，在72'C下保溫10分鐘。接著，將在耐卡那霉素性基因的5'末端側(cè)上游附加有序列號(hào)7所示的堿基序列、在3'末端側(cè)下游附加有序列號(hào)8所示的堿基序列的DNA片段通過(guò)與上述相同的方法利用PCR進(jìn)行擴(kuò)增。如下制備編碼UbiA蛋白質(zhì)的基因(以下稱作ubiA基因)缺失用DNA片段以及編碼UbiB蛋白質(zhì)的基因(以下稱作ubiB基因)缺失用DNA片段。以上述獲得的DNA片段為模板，使用由序列號(hào)9和10或序列號(hào)11和12所示的堿基序列所構(gòu)成的DNA作為引物對(duì)，進(jìn)行PCR。由序列號(hào)9和11所示的堿基序列所構(gòu)成的DNA在5'末端側(cè)具有由具有分別與ubiA基因或ubiB基因的5'末端側(cè)區(qū)域附近相同的序列的45個(gè)堿基所構(gòu)成的堿基序列，在3'末端側(cè)具有由序列號(hào)7所示的堿基序列所構(gòu)成的DNA。具有序列號(hào)IO和12所示的堿基序列的DNA在5'末端側(cè)具有由具有分別與ubiA基因或ubiB基因的3'末端側(cè)區(qū)域附近相同的序列的45個(gè)堿基所構(gòu)成的堿基序列，在3'末端側(cè)具有由雜交于序列號(hào)8所示的堿基序列的25個(gè)堿基所構(gòu)成的DNA。PCR使用EX-Taq(TakaraBio公司制)，根據(jù)EX-Taq所附的說(shuō)明書(shū)調(diào)制含有擴(kuò)增DNA片段10ng、引物DNA各lOpmol的50pl的反應(yīng)液，在下述條件下進(jìn)行在94'C下保溫1分鐘后，重復(fù)94t:下30秒鐘、55。C下30秒鐘、72"C下1分鐘的循環(huán)30次后，在4'C下保冷。確認(rèn)在兩末端含有具有與各基因的兩末端的45個(gè)堿基相同區(qū)域的耐卡那霉素性基因(km基因)的DNA片段進(jìn)行了擴(kuò)增，將該DNA片段供于瓊脂凝膠電泳后，從凝膠中切出并進(jìn)行精制。接著，根據(jù)Gene,246,321-330(2000)所記載的方法制備保持可以表達(dá)XRed重組酶的pKD46質(zhì)粒的大腸埃希桿菌(￡.co//)BW25113株[Proc.Natl.Acad.Sci.，USA.，97，6640-6645(2000)]的感受態(tài)細(xì)胞，使用100ng該DNA片段分別進(jìn)行轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化在O.lcm的比色杯(BioRad公司制)中、在1.8KV、25pF的條件下通過(guò)電穿孔進(jìn)行。將轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞使用SOC培養(yǎng)基[20g/1蛋白胨(Difco公司制)、5g/l酵母提取物(Difco公司制)、0.5g/l氯化鈉、0.2ml/l的5mol/lNaOH、10ml/l的lmol/1氯化鎂、10ml/l的lmol/1硫酸鎂、10ml/l的2M葡萄糖]在3(TC下培養(yǎng)3小時(shí)后，將培養(yǎng)液涂布于含有50嗎/ml的卡那霉素和10g/l的葡萄糖的LB瓊脂板上，在3(TC下培養(yǎng)1晚。確認(rèn)生長(zhǎng)的株分別為大腸埃希桿菌(五.co/z')BW25113株的染色體DNA上的ubiA基因或ubiB基因缺失，分別命名為大腸埃希桿菌(￡.co/z')BW25113AubiA株、大腸埃希桿菌CEco//)BW25113AubiB株。實(shí)施例2使用了ubiA基因或ubiB基因缺失株的乳酸的制造(1)將大腸埃希桿菌(Eco//)BW25113AubiA株、大腸埃希桿菌(￡.co//)BW25113AubiB株、以及作為對(duì)照根據(jù)實(shí)施例1所述的方法制作的ub正基因缺失株(五.co/z'BW25113Aub正)、ubiG基因缺失株(￡.co//BW25113AubiG)、ubiH基因缺失株(￡co/i'BW25113AubiH)、大腸埃希桿菌(￡.co//)BW25113株分別接種在裝有5ml的含有10g/l葡萄糖的LB液體培養(yǎng)基的試管中，在37'C下振蕩培養(yǎng)17小時(shí)，獲得培養(yǎng)物。將60pl的該培養(yǎng)物接種在裝有6ml的含有3%碳酸鈣和2%酪蛋白氨基酸的M9液體培養(yǎng)基(4%葡萄糖、11.28g/lM9MinimalSalts(X5)(Difco公司制)、100(imol/l氯化韓、2mmo1/1硫酸鎂、10pg/ml硫酸鐵)的粗型試管中，在37"C下振蕩培養(yǎng)28小時(shí)。離心分離28小時(shí)后的培養(yǎng)物，將其上清從10倍稀釋至30倍，然后使用RocheDiagnostics公司制的F-kitD-ZL-乳酸、F-kit乙酸和F-kit葡萄糖，領(lǐng)啶培養(yǎng)液中蓄積的D-乳酸量和乙酸量。結(jié)果示于表表l<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>表1中n.d.表示未測(cè)定。如表1所示，大腸埃希桿菌(Eco/z')BW25113AubiA株和大腸埃希桿菌(￡.co//)BW25113AubiB株與其它泛醌生物合成基因缺失株相比，D-乳酸生產(chǎn)率更高，且成為乳酸精制時(shí)的雜質(zhì)并阻礙乳酸聚合化的乙酸的副產(chǎn)生量更少。另外，D-乳酸的光學(xué)純度為99%以上。實(shí)施例3使用ubiA基因或ubiB基因缺失株的乳酸的制造(2)將大腸埃希桿菌(五.co//)BW25113AubiA株、大腸埃希桿菌(￡.co//)BW25113AubiB株分別接種在裝有5ml的含有10g/l葡萄糖的LB液體培養(yǎng)基的試管中，在37'C下振蕩培養(yǎng)17小時(shí)，獲得培養(yǎng)物。將55^1的該培養(yǎng)物接種于裝有5ml的含有6%碳酸鈣和2%酪蛋白氨基酸的M9液體培養(yǎng)基(5%葡萄糖、11.28g/lM9MinimalSalts(X5)(Difco公司制)、lOOpmol/l氯化鈣、2mM硫酸鎂、10)ag/ml硫酸鐵)的粗型試管中，在37t下振蕩培養(yǎng)25小時(shí)。25小時(shí)后，在培養(yǎng)物中加入1041^1的30%葡萄糖、104^1的22.56g/l的M9MinimalSalts(X10)(Difco公司制)、104^1的酪蛋白氨基酸、2pl的lmo1/1硫酸鎂、1^1的10mg/ml硫酸鐵、0.06g的碳酸鈣，繼續(xù)培養(yǎng)，在培養(yǎng)48小時(shí)后回收培養(yǎng)物。離心分離培養(yǎng)物，將其上清從10倍稀釋至1000倍，使用RocheDiagnostics公司制的F-kitD-ZL-乳酸、F-kit乙酸和F-kit葡萄糖，測(cè)定培養(yǎng)液中蓄積的D-乳酸量、乙酸量和殘?zhí)橇?。結(jié)果示于表2。表2菌株名D-乳酸(g/1)乙酸(g/1)殘?zhí)橇?g/1)￡.co/ZBW25113AubiA99.62.00.2￡.co/,BW25U3AubiB100.91.40.1如表2所示，大腸埃希桿菌(五.co//)BW25113AubiA株和大腸埃希桿菌(五，co")BW25113AubiB株具有生產(chǎn)約100g/l的D-乳酸的能力，且乙酸的副產(chǎn)量非常低。另夕卜，D-乳酸的光學(xué)純度為99。/。以上。實(shí)施例4制作具有生產(chǎn)L-乳酸的能力的微生物(1)制作D-乳酸脫氫酶基因缺失了的大腸埃希桿菌使用具有耐氯霉素性基因(cat基因)和枯草桿菌(5acz7/wra^'fo)來(lái)源的果聚糖蔗糖酶(Levansucrase)基因(sacB基因、GeneBankaccessionno.BG10388)的直鏈DNA，通過(guò)以下的方法制作保持pKD46質(zhì)粒的大腸埃希桿菌(五.co")BW25113株的染色體DNA上的D-乳酸脫氫酶基因(ldhA基因)缺失了的株。首先，利用PCR法以編碼區(qū)域的上游400bp至下游200bp的區(qū)域獲得sacB基因。PCR以枯草桿菌(及JwZ^'to)168株(可以從各種官方機(jī)關(guān)獲得)的染色體DNA為模板，將由序列號(hào)14和15所示的堿基序列所構(gòu)成的DNA作為引物對(duì)來(lái)進(jìn)行。該P(yáng)CR使用LA-Taq，根據(jù)LA-Taq所附的說(shuō)明書(shū)來(lái)調(diào)制含有染色體DNA100ng、引物DNA各20pmo1的25^1的反應(yīng)液，在下述條件下進(jìn)行在94。C下保溫3分鐘后，重復(fù)94'C下15秒鐘、55°C下20秒鐘、68'C下1.5分鐘的循環(huán)30次后，在72"C下保溫10分鐘。使用PCR純化試劑盒精制通過(guò)上述PCR獲得的擴(kuò)增DNA片段(sacB基因片段)后，溶解于5(V1的水中。接著，以pHSG399質(zhì)粒(TakaraBio公司制)為模板，使用由序列號(hào)16和17所示的堿基序列構(gòu)成的DNA作為引物對(duì)來(lái)進(jìn)行PCR，獲得耐氯霉素性基因(cat基因)片斷。該P(yáng)CR使用LA-Taq，根據(jù)LA-Taq所附的說(shuō)明書(shū)調(diào)制含有質(zhì)粒DNA40ng、引物DNA各20pmo1的25^1的反應(yīng)液，在下述條件下進(jìn)行在94。C下保溫3分鐘后，重復(fù)94。C下15秒鐘、55。C下20秒鐘、68。C下1.5分鐘的循環(huán)30次后，在72C下保溫10分鐘。使用Gelextraction試劑盒精制通過(guò)上述PCR獲得的擴(kuò)增DNA片段(cat基因片段)后，溶解于50pl的水中。接著，以上述獲得的sacB基因片段和cat基因片段為模板，使用由序列號(hào)14和17所示的堿基序列構(gòu)成的DNA作為引物對(duì)來(lái)進(jìn)行PCR。該P(yáng)CR使用LA-Taq，根據(jù)LA-Taq所附的說(shuō)明書(shū)來(lái)調(diào)制含有上述獲得的sacB片段和cat片段各lpl、引物DNA各20pmol的25^1的反應(yīng)液，在下述條件下進(jìn)行在94'C下保溫3分鐘后，重復(fù)94。C下15秒鐘、55"C下20秒鐘、68°C下3分鐘的循環(huán)30次后，在72i:下保溫10分鐘。使用Gelextraction試劑盒來(lái)精制通過(guò)上述PCR獲得的擴(kuò)增DNA片段(sacB基因片段和cat基因片段在相同方向上連接而成的DNA片段)后，溶解于5(^1的水中。接著，以該DNA片段為模板，使用由序列號(hào)18和19所示的堿基序列構(gòu)成的DNA作為引物對(duì)來(lái)進(jìn)行PCR。由序列號(hào)18所示的堿基序列構(gòu)成的DNA在5'末端側(cè)具有由具有與ldhA基因的5'末端側(cè)區(qū)域附近相同的序列的43個(gè)堿基所構(gòu)成的堿基序列，在3'末端側(cè)具有由序列號(hào)7所示的堿基序列所構(gòu)成的DNA。具有序列號(hào)19所示的堿基序列的DNA在5'末端側(cè)具有由與ldhA基因的3'末端側(cè)區(qū)域附近具有互補(bǔ)性的43個(gè)堿基所構(gòu)成的堿基序列，在3'末端側(cè)具有由雜交于序列號(hào)8所示的堿基序列的25個(gè)堿基所構(gòu)成的DNA。該P(yáng)CR使用EX-Taq，根據(jù)EX-Taq所附的說(shuō)明書(shū)來(lái)調(diào)制含有模板DNA片段10ng、引物DNA各lOpmol的50^1的反應(yīng)液，在下述條件下進(jìn)行在94T:下保溫1分鐘后，重復(fù)94'C下30秒鐘、55卩下30秒鐘、72°。下3分鐘的循環(huán)30次后，在4'C下保冷。確認(rèn)通過(guò)上述PCR，將在兩末端具有與ldhA基因的兩末端的43個(gè)堿基相同的區(qū)域、含有sacB基因和cat基因的DNA片段(sacB基因+cat基因片斷)發(fā)生了擴(kuò)增，將該DNA片段供于瓊脂凝膠電泳后，從凝膠中切出并進(jìn)行精制。'接著，根據(jù)實(shí)施例1所記載的方法制備保持pKD46質(zhì)粒的大腸埃希桿菌(Eco"0BW25113株的感受態(tài)細(xì)胞，使用100ng上述獲得的DNA片段進(jìn)行轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化為在O.lcm的比色杯(BioRad公司制)中、在1.8KV、25pF的條件下通過(guò)電穿孔進(jìn)行。將轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞使用SOC培養(yǎng)基在3(TC下培養(yǎng)3小時(shí)后，將培養(yǎng)液涂布于含有30pg/ml的氯霉素的LB瓊脂板上，在3(TC下培養(yǎng)1晚。將生長(zhǎng)的耐氯霉素性株拷貝到SuLB瓊脂培養(yǎng)基[10g/l蛋白胨(Difco公司制)、5g/l酵母提取物(Difco公司制)、10%蔗糖、lml/l的lmol/lNaOH]板上，選擇顯示蔗糖敏感性的株。確認(rèn)顯示耐氯霉素性且蔗糖敏感性的株是大腸埃希桿菌(￡.co//)BW25113株的染色體DNA上的ldhA基因被破壞，并命名為大腸埃希桿菌(五.co/z')BW25113AldhA::cat-sacB株。(2)制作引入有L-乳酸脫氫酶基因的微生物在上述(1)制作的大腸埃希桿菌(五.co//)BW25113AldhA::cat-sacB株的染色體DNA上的ldhA基因區(qū)域上引入枯草桿菌(及w^7/s)來(lái)源的L-乳酸脫氫酶基因(lctE基因)，在大腸埃希桿菌的ldhA基因的啟動(dòng)子控制下如下制成具有l(wèi)ctE基因的大腸埃希桿菌(Eco")。以枯草桿菌(及w^/fc)168株的染色體DNA作為模板，使用由序列號(hào)20和21所示的堿基序列構(gòu)成的DNA作為引物對(duì)的PCR而獲得枯草桿菌(及5"to7&)的lctE基因。由序列號(hào)20所示的堿基序列構(gòu)成的DNA在5，末端側(cè)具有由ldhA基因的起始密碼子上游區(qū)域的45個(gè)堿基所構(gòu)成的堿基序列，在3'末端側(cè)具有由包括lctE基因的起始密碼子的下游區(qū)域的27個(gè)堿基所構(gòu)成的堿基序列。由序列號(hào)21所示的堿基序列所構(gòu)成的DNA在5'末端側(cè)具有由與ldhA基因的終止密碼子的下游區(qū)域具有互補(bǔ)性的45個(gè)堿基所構(gòu)成的堿基序列，在3'末端側(cè)具有由與包括lctE基因的終止密碼子的上游區(qū)域具有互補(bǔ)性的27個(gè)堿基所構(gòu)成的堿基序列。PCR使用PyrobestDNA聚合酶(TakaraBio公司審lj)，根據(jù)酶所附的說(shuō)明書(shū)來(lái)調(diào)制含有染色體DNA100ng、引物DNA各lOpmol的50|il的反應(yīng)液，在下述條件下進(jìn)行在94。C下保溫1分鐘后，重復(fù)9fC下30秒鐘、55'C下30秒鐘、72"C下80秒鐘的循環(huán)30次后，在4'C下保冷。確認(rèn)通過(guò)上述PCR，在末端具有與ldhA基因的上游或下游的45個(gè)堿基相同的區(qū)域的lctE基因片段進(jìn)行了擴(kuò)增，將該DNA片段供于瓊脂凝膠電泳后，從凝膠中切出并進(jìn)行精制。根據(jù)實(shí)施例1所記載的方法制備保持pKD46質(zhì)粒的大腸埃希桿菌(￡.co//)BW25113AldhA::cat-sacB株的感受態(tài)細(xì)胞，使用100ng上述獲得的DNA片段進(jìn)行轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化為在O.lcm的比色杯(BioRad公司制)中、在1.8KV、25pF的條件下通過(guò)電穿孔進(jìn)行。將轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞使用SOC培養(yǎng)基在3(TC下培養(yǎng)3小時(shí)后，將培養(yǎng)液涂布于SuLB瓊脂培養(yǎng)基板上，在30'C下培養(yǎng)1晚。確認(rèn)生長(zhǎng)的耐蔗糖性株是在大腸埃希桿菌(￡.co/0BW25113AldhA::cat-sacB株的染色體DNA上的ldhA基因區(qū)域上引入有l(wèi)ctE基因，并命名為大腸埃希桿菌(五.co//)BW25113AldhA::lctE株。(3)制作ubiB基因缺失株使用含有20mg/l的卡那霉素和10g/l的葡萄糖的LB液體培養(yǎng)基，將實(shí)施例1獲得的大腸埃希桿菌(五.co//)BW25113AubiB株在30。C下培養(yǎng)1晚，將所得培養(yǎng)液0.5ml與1.4ml新的LB液體培養(yǎng)基和lOOpl的0.1M氯化鈣溶液混合。在30。C下振蕩培養(yǎng)56小時(shí)后，將400pl的培養(yǎng)物移至滅菌管中，添加2^1的PI噬菌體湯料(phagestock)，在37""C下保溫10分鐘。在該管中添加3ml保溫于50。C的軟瓊脂溶液(10g/1蛋白胨、5g/1酵母提取物、5mM氯化鈣、lml/1的lmol/1NaOH、3g/l瓊脂)，充分?jǐn)嚢韬?，接種在Ca-LB瓊脂培養(yǎng)基板(10g/l蛋白胨、5g/l酵母提取物、5mM氯化鈣、lml/1的lmol/1NaOH、15g/l瓊脂、板的直徑為15cm)上，在37。C下培養(yǎng)7小時(shí)。接著，用撒布機(jī)微細(xì)地粉碎，從而回收軟瓊脂部分，在1500g、4'C下離心分離10分鐘。在所得上清1.5ml中添加10(^1的氯仿，在4。C下放置1晚后，在15000g下離心分離2分鐘，將所得上清制成噬菌體湯料并保存在4°C。在Ca-LB液體培養(yǎng)基中、在3(TC下培養(yǎng)大腸埃希桿菌(五.co//)BW25113AldhA::lctE株4小時(shí)，將所得培養(yǎng)物的200|al離心分離，除去上清后，將菌體混懸于lOOpl的MC緩沖液(0.1mol/l硫酸鎂、0.005mol/l氯化鈣)中，制備菌體混懸液。將上述獲得的100nl的噬菌體湯料添加于菌體混懸液中并緩慢地混合，在37"C下保溫10分鐘后，添加200^1的lmol/1檸檬酸鈉溶液，離心分離后除去上清，從而洗滌菌體。進(jìn)一步重復(fù)該洗滌操作2次后，混懸于2ml的LB液體培養(yǎng)基中，并在3(TC下培養(yǎng)2小時(shí)。接著，將所得培養(yǎng)物lO(Hil涂布在含有30mg/l卡那霉素和10g/l葡萄糖的LB瓊脂培養(yǎng)基中，并在3(TC下培養(yǎng)。確認(rèn)耐卡那霉素性株ubiB基因缺失，并命名為大腸埃希桿菌(五.co/!')BW25113AubiBAldhA::lctE株。實(shí)施例5L-乳酸的制造將實(shí)施例4獲得的大腸埃希桿菌(￡.co/0BW25113AubiBAldhA::lctE株接種于裝有含有20g/l葡萄糖的2ml的LB液體培養(yǎng)基的試管中，在37°C下振蕩培養(yǎng)24小時(shí)，獲得培養(yǎng)物。將50nl的該培養(yǎng)物接種于裝有5ml的含有6%碳酸鈣和1%酪蛋白氨基酸的M9液體培養(yǎng)基[5%葡萄糖、11.28g/lM9MinimalSalt(X5)(Difco公司制)、100pmo1/1氯化鈣、2mmo1/1硫酸鎂、10pg/l硫酸鐵)的試管中，在37。C下振蕩培養(yǎng)24小時(shí)。離心分離24小時(shí)后的培養(yǎng)物，將其上清從10倍稀釋至100倍，使用RocheDiagnostics公司制的F-kitD-7L-乳酸和F-kit乙酸，測(cè)定培養(yǎng)液中蓄積的L-乳酸量、D-乳酸量和乙酸量。結(jié)果示于表3。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>表3所示，大腸埃希桿菌(Eco")BW25113AubiBAldhA::lctE株不產(chǎn)生D-乳酸、僅產(chǎn)生L-乳酸。即，ubiB基因的缺失株也生產(chǎn)L-乳酸。通過(guò)本發(fā)明，可以高效地制造乳酸。序列表自由正文序列號(hào)5-人工序列的說(shuō)明合成DNA序列號(hào)6-人工序列的說(shuō)明合成DNA序列號(hào)7-人工序列的說(shuō)明合成DNA序列號(hào)8-人工序列的說(shuō)明合成DNA序列號(hào)9-人工序列的說(shuō)明合成DNA序列號(hào)10-人工序列的說(shuō)明合成DNA序列號(hào)ll-人工序列的說(shuō)明合成DNA序列號(hào)12-人工序列的說(shuō)明合成DNA序列號(hào)13-人工序列的說(shuō)明合成DNA序列號(hào)14-人工序列的說(shuō)明合成DNA序列號(hào)15-人工序列的說(shuō)明合成DNA序列號(hào)16-人工序列的說(shuō)明合成DNA序列號(hào)17-人工序列的說(shuō)明合成DNA序列號(hào)18-人工序列的說(shuō)明合成DNA序列號(hào)19-人工序列的說(shuō)明合成DNA序列號(hào)20-人工序列的說(shuō)明合成DNA序列號(hào)21-人工序列的說(shuō)明合成DNA權(quán)利要求1.一種微生物，其中，4-羥基苯甲酸聚異戊烯基轉(zhuǎn)移酶活性或2-八異戊烯基苯酚2-八異戊烯基-6-甲氧基苯酚黃素還原酶活性降低或喪失，且所述微生物具有生產(chǎn)乳酸的能力。2.權(quán)利要求1所述的微生物，其中，微生物具有對(duì)下述蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的基因一部分或全部缺失了的染色體DNA，所述蛋白質(zhì)具有4-羥基苯甲酸聚異戊烯基轉(zhuǎn)移酶活性或2-八異戊烯基苯酚2-八異戊烯基-6-甲氧基苯酚黃素還原酶活性。3.權(quán)利要求2所述的微生物，其中，基因?yàn)閷?duì)下述蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的基因具有序列號(hào)1或序列號(hào)2所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，或者與序列號(hào)1或2所示的氨基酸序列具有80%以上的同源性、且具有4-羥基苯甲酸聚異戊烯基轉(zhuǎn)移酶活性或2-八異戊烯基苯酚2-八異戊烯基-6-甲氧基苯酚黃素還原酶活性的蛋白質(zhì)。4.權(quán)利要求2所述的微生物，其中，基因?yàn)榫哂行蛄刑?hào)3或序列號(hào)4所示的堿基序列的基因，或者為在嚴(yán)格條件下和具有與序列號(hào)3或4所示的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列的多核苷酸雜交且對(duì)下述蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的基因，所述蛋白質(zhì)具有4-羥基苯甲酸聚異戊烯基轉(zhuǎn)移酶活性或2-八異戊烯基苯酚2-八異戊烯基-6-甲氧基苯酚黃素還原酶活性。5.權(quán)利要求14任一項(xiàng)所述的微生物，其中，微生物為通過(guò)選自下述[lh[5]的方法而強(qiáng)化了生產(chǎn)乳酸的能力的微生物，[1]將控制乳酸的生物合成的機(jī)制的至少一個(gè)緩和或解除的方法；[2]將與乳酸的生物合成相關(guān)的酶的至少一個(gè)的表達(dá)強(qiáng)化的方法；[3]使與乳酸的生物合成相關(guān)的酶基因的至少一個(gè)的拷貝數(shù)增加的方法；[4]將從乳酸的生物合成路徑向該有用物質(zhì)以外的代謝產(chǎn)物分支的代謝路徑的至少一個(gè)弱化或阻斷的方法；[5]選擇對(duì)于乳酸類似物的耐性度高于野生型株的細(xì)胞株的方法。6.權(quán)利要求1~5任一項(xiàng)所述的微生物，其中，微生物是屬于下述屬的微生物歐文氏菌屬、沙雷菌屬、沙門菌屬、埃希氏菌屬、變形桿菌屬、假單胞菌屬、酸硫桿狀菌屬、不動(dòng)桿菌屬、土壤桿菌屬、芽孢桿菌屬、博德特菌屬、短根瘤菌屬、布魯氏桿菌屬、伯霍爾德桿菌屬、柄桿菌屬、綠屈撓菌屬、梭菌屬、考克斯體屬、脫亞硫酸菌、地桿菌屬、嗜血桿菌屬、軍團(tuán)菌屬、鉤端螺旋體屬、M^^toco"m、磁螺菌屬、曼氏桿菌屬、中生根瘤菌屬、甲基芽孢桿菌屬、甲基桿菌屬、分枝桿菌屬、奈瑟球菌屬、亞硝化單孢菌屬、念珠藻屬、巴斯德菌屬、原綠球藻屬、紅桿菌屬、紅球菌屬、紅假單胞菌屬、立克次體屬、志賀菌屬、中華根瘤菌屬、鞘胺醇單胞菌屬、鏈霉菌屬、聚球藻屬、集胞藻屬、弧菌屬、木質(zhì)部小菌屬、耶爾森氏菌屬、發(fā)酵單胞菌屬或黃單胞菌屬。7.權(quán)利要求16任一項(xiàng)所述的微生物，其中，微生物是選自下述組中的微生物草生歐文氏菌、解淀粉歐文氏菌、胡蘿卜軟腐歐文氏菌、粘質(zhì)沙雷菌、鳥(niǎo)氨酸脫羧酶陰性沙雷菌、居泉沙雷菌、鳥(niǎo)氨酸脫羧酶陽(yáng)性沙雷菌、腸炎沙門菌亞屬、腸炎沙門菌、副傷寒沙門菌、傷寒沙門菌、都伯林沙門菌、鼠傷寒沙門菌、大腸埃希桿菌、雷氏變形菌、惡臭假單胞菌、螢光假單胞菌、銅綠假單胞菌、德阿昆假單胞菌、螢光假單胞菌、丁香假單胞菌、尸化W(iowoway//wz&"o;7/h7w附、嗜酸氧化亞鐵硫桿菌、不動(dòng)桿菌ATCC33305、根癌土壤桿菌、嗜堿芽孢桿菌、支氣管炎博德特菌、副百日咳博代氏菌、百日咳博德特菌、慢生型大豆根瘤菌、馬爾他布魯桿菌、類鼻疽伯霍爾德桿菌、新月柄桿菌、橙色綠屈撓菌、丙酮丁醇梭菌、肉毒梭菌、艱難梭菌、伯內(nèi)特考克斯體、Dew訴tok7c^^m/2q/^mye、芳香族化合物降解耦連鐵還原細(xì)菌、杜克雷嗜血桿菌、嗜肺軍團(tuán)病桿菌、問(wèn)號(hào)鉤端螺旋體、AfogwetococcwjMC-1、趨磁螺旋菌、溶血曼海姆菌、百脈根中生根瘤菌、Me%;/o^c///wy7age//art、甲基營(yíng)養(yǎng)菌屬、牛分枝桿菌、麻風(fēng)分枝桿菌、海分枝桿菌、結(jié)核分支桿菌、淋病奈瑟球菌、腦膜炎奈瑟球菌、歐洲亞硝化毛桿菌、點(diǎn)形念珠藻、多殺巴斯德菌、原核綠藻、莢膜紅桿菌、苯酚降解菌紅球菌菌株I24、沼澤紅假單胞菌、普氏立克次體、弗氏志賀菌、苜蓿中華根瘤菌、溶芳烴鞘氨醇單胞菌、阿維鏈霉菌、天藍(lán)色鏈霉菌、聚球藻WH8102、集胞藻PCC6803、霍亂弧菌、苛養(yǎng)木桿菌、苛養(yǎng)木桿菌、鼠疫耶爾森氏菌、運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單孢菌、水稻黃單胞菌和甘藍(lán)黑腐病黃單胞桿菌。8.乳酸的制造方法，其中，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求1~7任一項(xiàng)所述的微生物，從而在培養(yǎng)物中生成乳酸并使其蓄積，然后從該培養(yǎng)物中采集乳酸。全文摘要本發(fā)明提供4-羥基苯甲酸聚異戊烯基轉(zhuǎn)移酶活性或2-八異戊烯基苯酚2-八異戊烯基-6-甲氧基苯酚黃素還原酶活性減低或喪失、且具有生產(chǎn)乳酸的能力的微生物，特別是含有對(duì)具有4-羥基苯甲酸聚異戊烯基轉(zhuǎn)移酶活性或2-八異戊烯基苯酚2-八異戊烯基-6-甲氧基苯酚黃素還原酶活性的蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的基因的一部分或全部缺失了的染色體DNA的微生物，以及使用了該微生物的乳酸制造方法。文檔編號(hào)C12N15/09GK101300351SQ20068004132公開(kāi)日2008年11月5日申請(qǐng)日期2006年9月5日優(yōu)先權(quán)日2005年9月5日發(fā)明者伊東干人,加藤真輝子,森英郎,橓田貴美枝申請(qǐng)人:協(xié)和酦酵工業(yè)株式會(huì)社