專利名稱：：用于產(chǎn)生香茅醛的方法用于產(chǎn)生香茅醛的方法檸檬醛是抗微生物的辟，它賦予植物植物如檸檬草(lemongrass)和澳洲檸檬桃金娘(Australianlemonmyrtle)特征性檸檬香氣。它還可便利地作為工業(yè)中間體例如在維生素A和E的合成中獲得。已經(jīng)報(bào)道通過還原或氧化醛基[l]、偶姻形成[2和裂合酶活性[1，3而對(duì)檸檬醛的幾種生物轉(zhuǎn)化。本研究的目的是篩選使檸檬醛中oc，p-不飽和碳鍵還原以產(chǎn)生手性產(chǎn)物香茅醛的酶活性(圖1)。檸檬醛是反式異構(gòu)體香葉醛與順式異構(gòu)體橙花醛的混合物，然而對(duì)這兩種異構(gòu)體中任一異構(gòu)體的底物專一性可能不是重要的，因?yàn)榘被峥梢源呋悩?gòu)化[41。產(chǎn)物(R)-(+)-香茅醛的有價(jià)值用途是經(jīng)Prins反應(yīng)而后繼環(huán)合至異蒲勒醇，隨后7K合成(lR,2S，5R)-(-)-薄荷醇[5]。非生物學(xué)策略因它們受限的立體選擇性(檸檬醛具有三個(gè)雙鍵)和對(duì)映選擇性而仍受到挑戰(zhàn)[6(見圖1)。使其它a，P-不飽和羰基的碳雙鍵還原的酶已經(jīng)在文獻(xiàn)中報(bào)道。它們主要屬于黃素和NADPH依賴性還原酶的"老黃酶(oldyellowenzyme)"家族，這由Williams和Bruce[7在可能的生物技術(shù)應(yīng)用方面綜述。另一個(gè)實(shí)例是來自紅平紅球菌(Rhodococcuserythropolis)的香芽酮還原酶，該酶使用未鑒定的熱穩(wěn)定輔因子并且不依賴于添加的NADH或NADPH[8。為檢測檸檬醛至香茅醛的生物轉(zhuǎn)化，相應(yīng)酶必須有活性，還原用電子必須可獲得，非常的疏水性底物檸檬醛必須以足夠的濃度接觸酶并且香茅醛形成必須比任何后續(xù)的轉(zhuǎn)化更快。因此，開發(fā)了篩選策略以試驗(yàn)用于檸檬醛轉(zhuǎn)化的多種微生物。本發(fā)明的第一個(gè)實(shí)施方案是用于通過以所選擇的來自發(fā)酵單孢菌屬(Zymomonas)、檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)、假絲酵母屬(Candida)、酵母屬(Saccharomyces)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、假絲酵母屬(Candida)、伊薩酵母屬(Issatchenkia)、根霉屬(Rhiz叩us)的還原酶酶促還原檸檬醛而產(chǎn)生光學(xué)活性香茅醛的方法，其中還原在兩相液體系統(tǒng)中完成。該方法的優(yōu)選實(shí)施方案使用所選擇的來自運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單孢菌(Zymomonasmobilis)、弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacterfreundii)、皺落假絲酵母(Candidarugosa)、貝酵母(Saccharomycesbayanus)、酉良酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、馬克斯克魯維酵母(Kluyveromycesmarxianus)、產(chǎn)脫假絲酵母(Candidautilis)、東方伊薩酵母(Issatchenkiaorientalis)、爪唾根霉(Rhizopusjavanicus)的還原酶。以上提及的微生物是本領(lǐng)域眾所周知的并且可以通過已知方法分離或來自公共保藏中心如ATCC和DSMZ。運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單孢菌已經(jīng)尤其作為ATCC10998、ATCC29192、ATCC31821、ATCC35001、ATCC39985保藏。弗氏檸檬酸桿菌已經(jīng)尤其作為ATCC8090D、ATCC11811保藏。皺落假絲酵母已經(jīng)尤其作為DSM70761保藏。東方伊薩酵母已經(jīng)尤其作為DSM3433、DSM6128、DSM11956、DSM70075、70079保藏。還原酶可以分離或純化的形式或作為"全細(xì)胞酶(whole-cell-enzyme)"使用，其中所述的"全細(xì)胞酶"應(yīng)當(dāng)意指酶與微生物一起用于本發(fā)明的方法。微生物也可以受到透化以改善底物、產(chǎn)物、輔因子轉(zhuǎn)移入和轉(zhuǎn)移出細(xì)胞。術(shù)語"還原酶"應(yīng)當(dāng)不僅意指分離的酶，還意指包含酶的提取物、溶液或混懸液、其中酶已被固定的載體和含有酶的全細(xì)胞。本發(fā)明的改良實(shí)施方案是利用因檸檬醛的同時(shí)還原而氧化的輔因子。作為輔因子，可以在本發(fā)明方法的條件下氧化的每種物質(zhì)都是合適的。優(yōu)選的輔因子系統(tǒng)是可以在等摩爾或甚至更高的量上使用或可以通過已知系統(tǒng)如電化學(xué)方法或酶再生系統(tǒng)如葡萄糖-6-磷酸脫氫酶進(jìn)行再生的NADH或NADPH。若再生輔因子，則在該方法中優(yōu)選低于等摩爾的量。兩相液體系統(tǒng)意指含有相互不較大程度地混合的兩種液相的系統(tǒng)。優(yōu)選其中一種相含有有^L液體而第二相含有水或基于水的溶劑的兩相液體系統(tǒng)。更優(yōu)選其中有機(jī)相由醚如乙醚、曱基叔丁基醚(MTBE)或芳香烴如苯和曱苯構(gòu)成的兩相液體系統(tǒng)。作為第二液相，優(yōu)選緩沖的水溶液。本發(fā)明研究了用于立體專一性和對(duì)映專一性地將辟類檸檬醛(異構(gòu)體香葉醛和橙花醛)的a,p-不飽和碳鍵還原成香茅醛的生物學(xué)策略。46種原核和真核微生物的常規(guī)含水篩選表明僅革蘭氏陰性細(xì)菌運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單孢菌能夠形成香茅醛。這種含水系統(tǒng)的缺點(diǎn)是底物檸檬醛在含水介質(zhì)中的低溶解度。在具有運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單孢菌細(xì)胞的兩相生物轉(zhuǎn)化系統(tǒng)中，形成了比未添加有機(jī)溶劑的系統(tǒng)中高至多到10倍濃度的香茅醛。最佳結(jié)果用有機(jī)溶劑甲苯、甲基叔丁基醚(MTBE)、異戊醇和二乙醚實(shí)現(xiàn)。有機(jī)介質(zhì)在使用全細(xì)胞的生物催化反應(yīng)中提供幾種優(yōu)勢(shì)[91。一個(gè)益處是底物和/或產(chǎn)物溶解度提高。有機(jī)相提供底物在反應(yīng)中高的總濃度并同時(shí)維持7K相中有毒或抑制性化合物的低水平。使細(xì)胞透化是有機(jī)溶劑的另一益處。除了"凍融"循環(huán)之外，還使用有機(jī)溶劑如甲苯用于透化已經(jīng)報(bào)道用于多種生物，例如克魯維酵母[10和運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單孢菌[11，引起經(jīng)細(xì)胞膜的被動(dòng)流動(dòng)(passiveilux)增加。EDTA的存在可以導(dǎo)致外膜透性的顯著提高，如對(duì)大腸桿菌所示[12。使用20。/。v/v甲苯或MTBE作為有機(jī)溶劑，46個(gè)菌林中先前檢驗(yàn)呈陰性的IO林菌林證明是陽性的。與含水系統(tǒng)相比，本方法代表在篩選用于將檸檬醛生物轉(zhuǎn)化成香茅醛的潛在微生物上成功得多的策略。最高的產(chǎn)物濃度在原核菌抹運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單孢菌和弗氏檸檬酸桿菌獲得，分別具有(S)-對(duì)映體>99%和75%的對(duì)映體過量值(6.6.)。與之相對(duì)，真核菌林顯示相反的對(duì)映專一性，鈹落假絲酵母、貝酵母和釀酒酵母分別具有(R)對(duì)映體大于98%、97%和96%的e.e.值。在使用全細(xì)胞的生物轉(zhuǎn)化中遭遇的一個(gè)問題是因細(xì)胞內(nèi)眾多催化劑所致的副產(chǎn)物形成。有趣的是，用運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單孢菌進(jìn)行試驗(yàn)的大部分有機(jī)溶劑引起醇副產(chǎn)物香葉醇、橙花醇和香茅醇整體減少。類似地EDTA對(duì)原核菌林和真核菌抹均減少醇的形成并且在大多數(shù)情況下提高香茅醛濃度。這些在產(chǎn)物和副產(chǎn)物形成上的相反作用可能提示對(duì)檸檬醛中醛基的還原和碳雙鍵的還原由不同酶催化。對(duì)a，p-不飽和羰基中雙鍵的酶還原已經(jīng)描述。尤其"老黃酶(OYE)"家族的氧化還原酶即在酵母、植物和細(xì)菌中常見的黃素依賴性酶[13接受種類龐大的a，p-不飽和醛和酮[7、14、15]。然而，沒有報(bào)道由OYE對(duì)檸檬醛的轉(zhuǎn)化。進(jìn)行了酵母OYEl、2和3蛋白質(zhì)序列針對(duì)最近公開的運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單孢菌ZM4基因組中翻譯讀碼框的BLASTP(www.ncbi.nlm.nih.gov)搜索[16。觀察到與具有未知功能的推定NADH:黃素氧化還原酶(ZM01885)的最密切相似性。然而，對(duì)酵母OYE的氨基酸相似性小于50%。香茅醛形成是否與OYE家族的酶相關(guān)仍然未知，并且需要過量表達(dá)相應(yīng)的基因以便開發(fā)高產(chǎn)量的生物方法。實(shí)驗(yàn)微生物培養(yǎng)20林酵母菌抹、9林絲狀真菌菌林和17祙細(xì)菌菌林從新南威爾士大學(xué)培養(yǎng)物收集中心(世界培養(yǎng)物收集編號(hào)248)得到。酵母菌抹、絲狀真菌和細(xì)菌運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單孢菌和掌形發(fā)酵單孢菌(Zymobacterpalmae)在YPG培養(yǎng)基(3g/1酵母提取物，5g/1蛋白胨，10g/lD-葡萄糖，pH6.9)中培育。乳酸細(xì)菌在來自O(shè)xoid的MRS(deMan，Rogosa，Sharpe)肉湯(pH6.2)中培育。來自O(shè)xoid的營養(yǎng)肉湯(pH7.4)用于全部其它細(xì)菌。對(duì)于檸檬色動(dòng)性球菌(Planococcuscitreus)和哈維氏弧菌(Vibrioharveyi),營養(yǎng)肉湯中補(bǔ)充以3%[w/vNaCl。生長溫度是30。C或37。C，這取決于哪個(gè)溫度更接近已報(bào)道的最佳生長溫度。培養(yǎng)物在定軌搖床中于150轉(zhuǎn)/分鐘攪拌，除干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)、腸膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)和費(fèi)氏丙酸桿菌(Propionibacteriumfreimdenreichii)的非攪拌培養(yǎng)之外。全部培養(yǎng)物培育至穩(wěn)定期。為了產(chǎn)生透化細(xì)胞，生物質(zhì)在緩沖液(50mMMOPS/KOHpH7)中洗滌兩次并重懸于一半體積的緩沖液(對(duì)酵母和絲狀真菌而言)或四分之一體積的緩沖液(對(duì)細(xì)菌培養(yǎng)物而言)中。使用液氮和25。C水浴，將混懸液凍融三次并且隨后以等分試樣在-20。C貯存。在含水系統(tǒng)中的培養(yǎng)物篩選檸檬醛(5mM)以異丙醇中0.2M溶液的形式添加。2.5。/。[v/v異丙醇發(fā)揮兩種功能增加疏水性底物檸檬醛的溶解度并且作為胞內(nèi)醇脫氫酶的底物潛在發(fā)揮作用以再生NAD(P)H。每種培養(yǎng)物進(jìn)行三個(gè)實(shí)驗(yàn)?；钚詼y定(用于確定檸檬醛還原酶活性的GC測定)方法500^1才羊品或水(空白)100pllM磷酸鉀，pH7.0100pllM葡萄糖溶液100jul溶液，在每一情況下具有10MNADPH/NADH100pl葡萄糖脫氫酶大腸桿菌細(xì)胞混懸液25fil在DMSO中的10%順/反式檸檬醛溫育在35°C至少15小時(shí)，劇烈搖動(dòng)提取向每個(gè)樣品添加250jil氯仿并充分?jǐn)嚢柚辽?分鐘。隨后離心3分鐘。將下層有機(jī)相取出并在4A分子篩上干燥，轉(zhuǎn)移至帶微量襯管(microinset)的HPLC小玻璃瓶中，通過GC進(jìn)行測量。純化酶(通過對(duì)面積比較而估計(jì))的e.e.值超過98%。a.培養(yǎng)基中的全細(xì)胞添加5mL新鮮培養(yǎng)基至溫度不變的5niL穩(wěn)定期培養(yǎng)物，150轉(zhuǎn)/分鐘攪拌1小時(shí)并且隨后添加在異丙醇中的檸檬醛。在3小時(shí)后及在24小時(shí)后，1ml肉湯以0.2ml新鮮制備的在氯仿中的0.30/。[v/vl-辛醇(GC內(nèi)標(biāo))溶液提取?；厥沼袡C(jī)相，用異丙醇稀釋并通過GC進(jìn)行分析。b.透化的細(xì)胞+NADH在定軌搖床上于150轉(zhuǎn)/分鐘并在30°C振搖的2ml螺口蓋小玻璃瓶含有在1ml總體積中的0.5ml融化的透化細(xì)胞，其中所述總體積中具有終濃度50mMpH7的MOPS緩沖液、10mMNADH,5mM檸檬醛和2.5%[v/v異丙醇。在3小時(shí)后，全部樣品用如上文的氯仿/辛醇提取。c.透化的細(xì)胞+NADPH再生系統(tǒng)方法與b中所述相同，除了NADH由具有終濃度1.5mMNADP+、10mM葡萄糖-6-磷酸、3.3mMMgCl2和0.4U/ml葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的NADPH再生系統(tǒng)替換之外。在兩相系統(tǒng)中的培養(yǎng)物篩選在生物轉(zhuǎn)化之前，0.5mL透化細(xì)胞與0.15ml曱苯在2ml螺旋蓋玻璃小瓶中渦旋混合并且在室溫溫育10分鐘。隨后添加其它組分以產(chǎn)生具有如含7JC/NADPH系統(tǒng)那樣相同組成的1mL水相，僅無檸檬醛和異丙醇。反應(yīng)通過添加0.05mL在甲苯中的0.4M檸檬醛而啟動(dòng)并且將小瓶在30。C在輪上垂直轉(zhuǎn)動(dòng)。在3小時(shí)后，全部樣品用0.4ml新鮮制備的在氯仿中的0.15。/。v/vl-辛醇(GC內(nèi)標(biāo))提取。在離心后，取出0.4mL下層有機(jī)相(曱苯/氯仿混合物)用于GC分析。將形成香茅醛的菌林如下文詳述在曱苯和曱基叔丁基醚(MTBE)兩相系統(tǒng)中進(jìn)行比較。生物轉(zhuǎn)化圖2-4中所示的生物轉(zhuǎn)化如對(duì)兩相培養(yǎng)物篩選那樣實(shí)施，但是用4ml螺旋蓋玻璃小瓶中的0.8ml水相和0.2ml有機(jī)溶劑，以磁力方式攪拌以維持有機(jī)溶劑在水相中的乳液。組成和條件的細(xì)節(jié)在分別的中給出。在啟動(dòng)反應(yīng)前，以定義的生物質(zhì)濃度的0.5mL已洗滌細(xì)胞與0.15mL分別的有機(jī)溶劑在冰上攪拌30分鐘。反應(yīng)通過添加0.05mL在相同有機(jī)溶劑中的0.4M檸檬醛而啟動(dòng)。分析方法薛類的濃度由4吏用毛細(xì)管柱(來自Varian的ChrompackCP-SIL5B，50Mx0.25mm，0.12jim相厚度)的氣相色譜(GC)確定，以氮?dú)庾鳛檩d氣(0.98ml7分鐘)并且具有氫(20ml/分鐘)及空氣(300ml/分鐘)的火焰離子化檢測器(250。C)。注射體積是ljil，分流比29:1。注射溫度是250°C并且柱溫度在100°C維持9分鐘并隨后以50。C/分鐘提高至240°C。使用1-辛醇作為內(nèi)標(biāo)，萜濃度基于已經(jīng)接受如樣品那樣的相同提取方法處理的標(biāo)準(zhǔn)物進(jìn)行計(jì)算。為分離香茅醛和異蒲勒醇，初始柱溫度是75。C持續(xù)12分鐘。橙花醇和香茅醇在任一先前條件下未得到分離。它們的分離以及手性分析用SupelcoBetaDex225柱(30mx0.25mm,0.25]iim相厚度)進(jìn)行。分流比是1:35，柱流速是2.77ml/分鐘，柱溫度是95。C持續(xù)35分鐘，以5。C/分鐘增加至160°C。香茅醛通過從兩個(gè)GC柱中與香茅醛標(biāo)準(zhǔn)物共洗脫而鑒定。實(shí)施例1在含水系統(tǒng)中的培養(yǎng)物篩選對(duì)20林酵母菌抹、9林絲狀真菌菌林和17抹細(xì)菌菌林在三種含水系統(tǒng)中試驗(yàn)檸檬醛轉(zhuǎn)化使用在培養(yǎng)基中的全細(xì)胞或者洗滌和透化的細(xì)胞以及NADH或NADPH。僅透化運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單孢菌與NADPH才形成香茅醛。NADPH再生系統(tǒng)或NADPH的直接添加均支持香茅醛形成。香葉醇是在全細(xì)胞培養(yǎng)物中以及向透化細(xì)胞添加NADH或NADPH時(shí)眾多測試菌林的主要產(chǎn)物。也形成橙花醇和/或香茅醇。因此，用于還原醛基的酶活性與雙鍵還原所需的活性相竟?fàn)帯?shí)施例2溶劑對(duì)由運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單孢菌所致檸檬醛轉(zhuǎn)化的影響使用運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單孢菌以試驗(yàn)有機(jī)/水兩相系統(tǒng)將檸檬醛轉(zhuǎn)化成香茅醛的可行性。圖2a顯示在缺乏和存在多種水溶性(星號(hào))和水不溶性溶劑時(shí)的香茅醛形成，其中所述的溶劑按官能性分類2種正烷、9種脂族醇、3種酮、2種酯、2種醚和3種芳族溶劑。與無任何有機(jī)溶劑的對(duì)照相比，4種溶劑即異戊醇、MTBE、二乙醚和甲苯支持高約IO倍的產(chǎn)物水平。作為額外優(yōu)點(diǎn)，大部分溶劑引起副產(chǎn)物香葉醇、橙花醇和/或香茅醇的水平降低(圖2b)。對(duì)照實(shí)驗(yàn)即對(duì)香葉醇、橙花醇及香茅醇標(biāo)準(zhǔn)物的提取證實(shí)相對(duì)于內(nèi)標(biāo)，它們的提取未受例如樣品中異丙醇、甲苯或MTBE存在的影響。因此下降的副產(chǎn)物水平可以歸因于酶還原醛基的減少。選擇甲苯和MTBE用于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。實(shí)施例3在兩相系統(tǒng)中的培養(yǎng)物篩選在水/甲苯篩選系統(tǒng)中，香茅醛由先前在含水篩選系統(tǒng)中未鑒定的幾個(gè)菌林自檸檬醛形成。為了比較，調(diào)節(jié)這些培養(yǎng)物至相似的生物質(zhì)濃度，并且曱苯和MTBE兩相系統(tǒng)的香茅醛產(chǎn)生在圖3中顯示。在甲苯系統(tǒng)中，2林細(xì)菌菌林實(shí)現(xiàn)比9林真核菌林高至少5倍的香茅醛濃度。在MTBE系統(tǒng)中，弗氏檸檬酸桿菌形成比甲苯存在下更少的香茅醛。對(duì)東方伊薩酵母得到陽性結(jié)果，其中東方伊薩酵母在甲苯系統(tǒng)中不形成香茅醛。添加5mMEDTA對(duì)大部分菌林導(dǎo)致更高的香茅醛濃度，但是這對(duì)弗氏檸檬酸桿菌和絲狀真菌爪哇根霉產(chǎn)生相反作用(圖3b)。由運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單孢菌形成的香茅醛不受EDTA影響。就MTBE/EDTA系統(tǒng)中的副產(chǎn)物形而言，酵母菌抹和細(xì)菌弗氏檸檬酸桿菌產(chǎn)生大部分香葉醇、一些橙花醇和少量香茅醇。尤其是，酵母屬菌林形成多達(dá)13mM香葉醇。省去EDTA則對(duì)酵母屬菌林增加醇副產(chǎn)物形成約10%，并且對(duì)運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單孢菌增加甚至9倍。在任何實(shí)驗(yàn)中未檢測到異蒲勒醇。產(chǎn)物香茅醛的對(duì)映體過量(e.e.)值列于表1。對(duì)運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單孢菌而言，細(xì)菌酶優(yōu)先形成6丄.值>99%的(8)-對(duì)映體，并且對(duì)弗氏檸檬酸桿菌而言，細(xì)菌酶優(yōu)先形成6丄.值>75%的(8)-對(duì)映體。相反，酵母菌林主要產(chǎn)生(R)-香茅醛，例如皺落假絲酵母產(chǎn)生超過98%的e.e.值。表l:由多種菌林在含有5mMEDTA的7jC/MTBE兩相系統(tǒng)中所形成的香茅醛的對(duì)映體過量(圖3b)菌抹%e.e.對(duì)映體運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單孢菌>99(s)-弗氏檸檬酸桿菌75(s)-皺落假絲酵母>98(R)-貝酵母>97(R)-釀酒酵母>96(R)-馬克斯克魯維酵母>95(R)-產(chǎn)朊假絲酵母>94(R)-東方伊薩酵母64(R)-爪哇根霉_>94(R)-檸檬醛生物轉(zhuǎn)化曲線圖4顯示在水/曱苯及在7K/MTBE兩相系統(tǒng)中由運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單孢菌所致檸檬醛生物轉(zhuǎn)化的曲線。對(duì)前者而言，香茅醛濃度的增加以極為線性的方式繼續(xù)進(jìn)行3小時(shí)時(shí)間。當(dāng)NADPH再生系統(tǒng)的濃度加倍時(shí)，實(shí)現(xiàn)相同的香茅醛終濃度。這表明該反應(yīng)不受NADPH再生系統(tǒng)限制。兩種檸檬醛異構(gòu)體即香葉醛及橙花醛的濃度均隨時(shí)間降低。未檢測到醇即橙花醇、香葉醇和香茅醇。對(duì)于水/MTBE兩相系統(tǒng)，觀察到香茅醛形成隨時(shí)間變慢，盡管兩種檸檬醛異構(gòu)體即香葉醛和橙花醛均隨時(shí)間以線性方式消耗。就醇副產(chǎn)物而言，形成0.34mM的香葉醇和小于0.1mM的香茅醇。3小時(shí)后的摩爾平衡表明初始底物在甲苯系統(tǒng)中丟失16%，并且在MTBE系統(tǒng)中丟失10%。在比較時(shí)，沒有生物質(zhì)的對(duì)照經(jīng)3小時(shí)未顯示檸檬醛或香茅醛的丟失。然而，具有煮沸的生物質(zhì)的對(duì)照以如生物轉(zhuǎn)化中觀察到的相似程度丟失檸檬醛和香茅醛。實(shí)施例4自運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單孢菌分離和表征還原酶運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單孢菌的培養(yǎng)細(xì)胞在由以下組成的培養(yǎng)基中培育細(xì)菌用蛋白胨10gA酵母提取物10g/1葡萄糖*112020g/1KH2P041g/1(NH4)2S041g/1MgS04*7H200.5g/1pH7.0;滅菌121。C20分鐘。為此目的，在每一情況下將800mL培養(yǎng)基導(dǎo)入lL錐形燒瓶(無擋板)并在100轉(zhuǎn)/分鐘和30。C溫育至少48小時(shí)(通常約65-72小時(shí))。由離心去除輕微混濁(slightclouding)。生物質(zhì)產(chǎn)量低(約2.0-2.5g/1濕生物質(zhì))。蛋白質(zhì)的純化勻漿化106g濕生物質(zhì)重懸于500mL破裂緩沖液(20mMTris/HCl，2mMEDTA，10片/L全蛋白酶抑制劑，pH8.0)中，并且pH用NaOH從pH6.6校正至7.5。混懸液的100mL等分試樣與100mL玻璃珠(直徑0.1-0.2mm)混合并且在球磨中以5000轉(zhuǎn)/分鐘破裂12分鐘。玻璃珠經(jīng)Gl玻璃抽吸濾器以抽吸作用除去并且洗滌。濾液(710ml)于12000轉(zhuǎn)/分鐘(Sorva11，4。C)離心30分鐘。上清液(610ml，18.6mg/ml蛋白質(zhì)，pH7.4,電導(dǎo)率2.6mS/cm)分成3個(gè)200ml等分試樣并在-20。C貯存。離子交換層析(Q-SepharoseFF)將勻漿物施加(15ml/分鐘)至Q-SepharoseFF層析柱(直徑5cm,體積400ml)上，以20mMTris/HCl,pH8.0，2mMEDTA,2片全蛋白酶抑制劑/L(緩沖液A)預(yù)洗滌。為此目的，將融化的粗制勻漿物用緩沖液A稀釋成500ml(電導(dǎo)率1.6mS/cm,pH8.0)。在上樣后，柱用1000mL緩沖液A洗滌(15ml/分鐘)。隨后用線性梯M開至100%緩沖液B(具有0.5MNaCl的緩沖液A，pH8.0)(1500ml)。隨后將又一個(gè)750mL100%B用于洗滌。在每一情況下，將10個(gè)12ml級(jí)分合并并進(jìn)行測試。疏水層析(TSK-Phenyl)來自Q-S印harose柱的目的級(jí)分用于上樣(142ml，pH7.0，用32.2g石克酸銨調(diào)節(jié)至40%飽和度；500mg蛋白質(zhì))。來自Pharmacia的苯基-Sepharose柱具有2.6cm直徑，體積170ml,并且以每分鐘10ml運(yùn)行。該柱用緩沖液A:40%硫酸銨飽和度，2mMEDTA，2片全蛋白酶抑制劑/L,20mM磷酸二氫鈉pH7.0)平衡。在上樣后，柱用緩沖液A洗滌直至達(dá)到吸光度基線。隨后用線性梯度展開至100%緩沖液B(無硫酸銨的緩沖液A，3個(gè)柱體積)。在結(jié)束時(shí)，柱用2.5個(gè)柱體積的緩沖液C(具有20。/。異丙醇的緩沖液B)洗脫。在每一情況下，將10個(gè)級(jí)分合并且測定活性。收集第61至70級(jí)分(92ml)。分子篩層析(Superdex)來自苯基Sepharose柱的目的級(jí)分(卯ml)用46.4g硫酸銨(80。/。飽和度)沉淀并且通過離心取出沉淀。將沉淀在運(yùn)行緩沖液(20mM磷酸鈉，pH6.8,1片全蛋白酶抑制劑/L，1mMEDTA)(9ml)中重懸并施加至Superdex柱(4ml/分鐘，2分鐘級(jí)分)。收集活性級(jí)分27和28。使用以上全部方法，對(duì)所有三份勻漿物均進(jìn)行處理。得到含有總計(jì)18.8mg蛋白質(zhì)的67mL目的級(jí)分。親和層4斤(BIueSepharoseFF)藍(lán)色SepharoseFF柱(直徑2.6cm，50ml，Pharmacia)在20mM磷酸二氫鈉pH6.8，l片全蛋白酶抑制劑/L，lmMEDTA中平衡。來自分子篩層析的合并目的級(jí)分以3ml流量施加。柱隨后用150mL的相同緩沖液洗滌并隨后用添加0,5MNaCl的該緩沖液(130ml)洗滌。使用第二洗滌緩沖液實(shí)施洗脫，其中向第二洗滌緩沖液在每一情況下還已經(jīng)添加1mMNADH和NADPH。在用該緩沖液洗脫之前，將柱在所述緩沖液中溫育16小時(shí)。收集活性級(jí)分。蛋白質(zhì)在所選擇條件下不與藍(lán)色Sepharose結(jié)合。然而，其它蛋白質(zhì)以如此方式除去，導(dǎo)致成功的純化。親和層析(4-羥基苯曱酸親和柱)親和柱的制備50mL氨基己酸Sepharose用5L水洗滌。濾餅重懸于40mL水中。4.2g的4-乙酸基苯曱酸(受保護(hù)的羥基苯甲酸)溶解于50mlDMF中并調(diào)節(jié)至pH4.7(10MNaOH)。將3.9gEDC溶解于10mL水中并且在15分鐘內(nèi)添加至偶聯(lián)混合物中。將pH用HC1維持在4.7。添加另一份50mlDMF并且將混合物在室溫?cái)嚢?6小時(shí)。柱材料以抽吸作用經(jīng)G2玻璃抽吸濾器去除，并且用1L50。/。水/DMF溶液洗涂。隨后，用1L水洗滌。柱材料隨后重懸于200mlNaHC03冷溶液中并且添加2mL乙酸酐。在冰上實(shí)施脫保護(hù)卯分鐘，強(qiáng)烈產(chǎn)生co2。反應(yīng)溶液以抽吸作用除去并且柱材料用水洗滌。隨后，將柱材料在1M咪唑溶液pH7.9中攪拌1小時(shí)，隨后再次以抽吸作用取出并且用水洗滌，并且也在這種狀態(tài)下貯存。蛋白質(zhì)也不與該柱結(jié)合。Mono-Q層析Mono-Q層析柱(lmlPharmacia)用20mM磷酸鈉，pH7.5，1片全蛋白酶抑制劑/L，1mMEDTA進(jìn)行平衡。(1ml/分鐘)施加130mL來自藍(lán)色Sepharose柱的流通物(pH7.5,2.7mS/cm)。柱隨后用相同緩沖液洗滌。這里，蛋白質(zhì)再次在上樣期間被洗脫，而雜質(zhì)與柱結(jié)合。疏7K層析(Resource-Phenylsepharose，F(xiàn)PLC)1mlResource柱(Amersham)用20mM磷酸鈉，pH7.0，2片全蛋白酶抑制劑/L，2mMEDTA,40%石克酸銨飽和度進(jìn)行平衡。來自Mono-Q-Sepharose柱的140mL流通物(pH7.5，2.7mS/cm)用31.6g硫酸銨調(diào)節(jié)至40%飽和度并施加(160ml,1ml/分鐘)。柱隨后用相同緩沖液洗滌。柱使用線性梯度展開至不含硫酸銨的相同緩沖液。收集活性級(jí)分并將其通過SDS凝膠電泳展開(圖1)。條帶在40kDa處并進(jìn)行氨基端測序。在下表2中總結(jié)了純化。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>氨基端測序得到下列氨基端序列PSLFDPIRFGAFTAKNRIWMAPLTRGR以這個(gè)已鑒定的氨基端肽在運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單孢菌公開的基因組(SeoJ.S等，"生乙醇細(xì)菌運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單孢菌ZM4的基因組序列"，Nat.Biotechnol.23:63-68(2005)，EMBLAE008692)中進(jìn)行的計(jì)算機(jī)搜索鑒定該蛋白質(zhì)是具有358個(gè)氨基酸和39489道爾頓分子量的NADH黃素氧化還原酶(EMBLAE008692,AAV90509.1，原始登錄號(hào)Q5NLA1.)。參考文獻(xiàn)[1W.A.M.Wolken,M.J.vanderWerf,Appl.Microbiol.Biotechnol.57(2001)731.[2B.Stumpf，K.Kieslich,Appl.Microbiol.Biotechnol.34(1991)598.[3W.A.M.Wolken,W.J.V.VanLoo，J,Tramper,M.J.vanderWerf，Eur.J.Biochem.269(2002)5卯3.[4W.A.M.Wolken，R.tenHave,M.J.vanderWerf,J.Agric.食物Chem.48(2000)5401.[5A.F.Trasarti，A.J.Marchi,C.R.Apesteguia，J.Catal.224(2004)484.[6P.MSki畫Arvela，N.Kumar,D.Kubicka，A.Nasir，T.Heikkim，V.P.Lehto，R.Sjoholm,T.Salmi，D.Y.Murzin，J.Mol.Cat.A:CheM240(2005)72.[7R.E.Williams,N.C.Bruce,Microbiology148(2002)1607.8M.J.vanderWerf，A.M.Boot,Microbiology146(2000)1129.[9R.Le6n，P.Fernandes，H.M.Pinheiro,J.M.S.Cabral，EnzymeMicrob.Technol.23(1998)483.[10M.Decleire,W.DeCat,N.VanHuynh，EnzymeMicrob.Technol.9(1987)300.[11U.H.Chun,P丄.Rogers,Appl.Microbiol.Biotechnol.29(1988)19.[12H.J.P.Marvin,M.B.A.TerBeest，B.Witholt，J.Bacteriol.171(1989)5262.[13K.Kitzing,T.B.Fitzpatrick,C.Wilken，J.Sawa，G.P.Bourenkov，P.Macheroux，T.Clausen,J.Biol.Chem.280(2005)27904.[14A.D.N.Vaz，S.Chakraborty，V.Massey，Biochemistry34(1995)4246.[15K.Stott,K.Saito，D.J.Thiele，V.Massey，268(1993)6097.[16J.S.Seo，H.Chong，H.S.Park,K.O.Yoon,C.Jung,J.J.Kim，J.H.Hong，H.Kim,J.H.Kim，J丄Kil，C.J.Park,H.M.Oh，J.S.Lee，S.J.Jin，H.W.Urn,H.J.Lee,S.J.Oh，J.Y.Kim，H.L.Kang，S.Y.Lee，K.J.Lee，H爭S.Kang，NatureBiotechnol.23(2005)63.附圖描述圖l:種檬醛(香葉醛和橙花醛)至香茅醛的生物轉(zhuǎn)化圖2:由運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單孢菌細(xì)胞在NADPH再生系統(tǒng)和多種溶劑存在下對(duì)檸檬醛的生物轉(zhuǎn)化a)產(chǎn)物香茅醛；b)副產(chǎn)物香葉醇、橙花醇和香茅醇的總和。初始條件20y。v/v有機(jī)溶劑，20mM檸檬醛，5mM二硫蘇糖醇，3.3mMMgCl2，1.5mMNADP+,10mM葡萄糖-6-磷酸，0.4U/ml葡萄糖-6-磷酸脫氬酶，約14g/1DCM運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單孢菌，50mMMOPS/KOH,pH7.0，在30。C持續(xù)3小時(shí)。*以星號(hào)標(biāo)記的溶劑溶解于水中，全部其它溶劑形成乳液。MTBE-甲基叔丁基醚，nd-未檢測到。AU—壬意單位化合物的GC面積除以內(nèi)標(biāo)的GC面積。給出三個(gè)重復(fù)的平均值和誤差條表示最高結(jié)果和最低結(jié)果。對(duì)于曱苯，面積比對(duì)應(yīng)于1.4mM香茅醛的濃度。圖3:在a)水/甲苯兩相系統(tǒng)和b)水/甲基^L丁基醚(MTBE)兩相系統(tǒng)中由細(xì)菌、酵母和絲狀真菌所形成的香茅醛的比較(在30。C溫育3小時(shí)，組成如圖2中所示，生物質(zhì)濃度約12gDCM/1)。給出兩個(gè)重復(fù)的平均值和誤差條表示最高結(jié)果和最低結(jié)果。nd-未檢測到。圖4:由運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單孢菌在具有NADPH再生系統(tǒng)的a)水/曱苯和b)水/曱基^又丁基醚(MTBE)兩相系統(tǒng)(30。C，組成如圖2中所示，生物質(zhì)濃度約14gDCM/l)中所致的檸檬醛生物轉(zhuǎn)化。給出三個(gè)重復(fù)的平均值和誤差條表示最高結(jié)果和最4氐結(jié)果。權(quán)利要求1.使用所選擇的來自如下屬和種的還原酶通過酶促還原檸檬醛而產(chǎn)生光學(xué)活性香茅醛的方法運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單孢菌(Zymomonasmobilis)、弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacterfreundii)、皺落假絲酵母(Candidarugosa)、貝酵母(Saccharomycesbayanus)、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、馬克斯克魯維酵母(Kluyveromycesmarxianus)、產(chǎn)朊假絲酵母(Candidautilis)、東方伊薩酵母(Issatchenkiaorientalis)、爪哇根霉(Rhizopusjavanicus)，其中還原反應(yīng)是在兩相液體系統(tǒng)中完成的。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中(S)-香茅醛通過所選擇的來自運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單孢菌、弗氏檸檬酸桿菌的酶產(chǎn)生。3.根據(jù)權(quán)利要求l所述的方法，其中(R)-香茅醛通過所選擇的來自皺落假絲酵母、貝酵母、釀酒酵母、馬克斯克魯維酵母、產(chǎn)朊假絲酵母、東方伊薩酵母、爪哇根霉的酶產(chǎn)生。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中酶是所選擇的來自圖5中所示的酶。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中兩相液體系統(tǒng)由MTBE和水形成。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中使用緩沖水溶液作為兩相液體系統(tǒng)的一個(gè)相。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中還原酶偶聯(lián)至NADPH再生系統(tǒng)。全文摘要本發(fā)明涉及使用來自運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單孢菌(Zymomonasmobilis)的還原酶酶促還原檸檬醛而產(chǎn)生光學(xué)活性香茅醛的方法。文檔編號(hào)C12P7/24GK101415831SQ200680043009公開日2009年4月22日申請(qǐng)日期2006年11月10日優(yōu)先權(quán)日2005年11月17日發(fā)明者A·米勒,B·羅舍,B·豪爾,R·施蒂默爾,T·弗里德里希申請(qǐng)人:巴斯夫歐洲公司