專利名稱：：培養(yǎng)容器和培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及培養(yǎng)容器和培養(yǎng)方法，特別是涉及氧和二氧化碳的氣體交換性能優(yōu)異、適合在低濕度下培養(yǎng)細(xì)胞、微生物等的密閉型培養(yǎng)容器和培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
：通常，用于培養(yǎng)細(xì)胞、微生物等的培養(yǎng)箱的箱內(nèi)濕度非常高，達(dá)95%以上，在產(chǎn)生霉或細(xì)菌等衛(wèi)生方面存在問題，在醫(yī)療用的細(xì)胞培養(yǎng)中上述問題尤其重要。因此，必須嚴(yán)格進(jìn)行濕度管理和衛(wèi)生管理，培養(yǎng)箱內(nèi)所裝的加濕用水需要事先滅菌以防止產(chǎn)生霉或細(xì)菌，并且必須定期補(bǔ)充該滅菌水。而且，裝入培養(yǎng)箱后根據(jù)需要必須通過紫外線照射進(jìn)行滅菌以保持加濕用水的無菌性，因此培養(yǎng)箱內(nèi)需要紫外線照射設(shè)備。如上所述，在以往的細(xì)胞、微生物等的培養(yǎng)中必需保持培養(yǎng)箱內(nèi)為高濕度，故存在濕度管理和衛(wèi)生管理麻煩、培養(yǎng)成本高的問題。為了解決上述衛(wèi)生性等問題，以往有人提案了各種密閉型培養(yǎng)容器并已使用。例如，在日本特開昭63-214178號公才艮、日本實(shí)開平2-93999號公報、日本實(shí)開平4-129800號公報和日本特開平3-277268號公報所公開的培養(yǎng)袋中，考慮到氧和二氧化碳等的氣體交換性能而將容器材料本身設(shè)計(jì)為高透氣性，但上述培養(yǎng)袋存在以下問題培養(yǎng)液量多、培養(yǎng)液中的氣體擴(kuò)散成為控速因素，導(dǎo)致在容器壁附近和最遠(yuǎn)離容器壁的部分溶解氣體濃度產(chǎn)生差別，無法達(dá)到最佳溶解氣體濃度，因此與開放系統(tǒng)中的培養(yǎng)相比培養(yǎng)效率差。另夕卜，作為培養(yǎng)袋的替代品，有人提案了象日本特開2004-129568號公報和日本特表2004-514432號公報所公開的具備透氣膜的剛性扁平薄型培養(yǎng)容器并已使用。該培養(yǎng)容器為扁平薄型，相對于培養(yǎng)液量而言表面積大，故氣體交換性能好，但是在低濕度下使用時蒸發(fā)的水蒸氣量太多，隨著培養(yǎng)液成分的濃度變化而產(chǎn)生各種問題。即，由于水分蒸發(fā)，培養(yǎng)液中緩沖系統(tǒng)的濃度升高、pH上升，導(dǎo)致細(xì)胞活性下降或培養(yǎng)效率降低，有時還損傷細(xì)胞。另夕卜，培養(yǎng)液所使用的緩沖液中含有HEPES緩沖液(N-2-羥乙基哌。秦-N，-2-乙磺酸緩沖液)或使用Earle鹽、Hanks鹽組成的緩沖液等，上述緩沖液具有細(xì)胞毒性，添加量受到限制，因此不希望培養(yǎng)液的濃度隨水分蒸發(fā)而變高。另外，上述緩沖液還影響鈣或鎂的濃度，故使用濃度受到限制，培養(yǎng)液的濃度變高對培養(yǎng)產(chǎn)生不良影響。此外，從成為抑制培養(yǎng)的要因的乳酸鹽或脲氮等細(xì)胞自身產(chǎn)生的廢物濃度變高以及細(xì)胞的滲透壓存在容許范圍的角度考慮，也不希望培養(yǎng)液中緩沖系統(tǒng)的濃度變高。另外，若水蒸氣逸出，則取而代之的是空氣進(jìn)入容器內(nèi)，容器內(nèi)產(chǎn)生氣泡，若該氣泡迸裂則有可能損傷細(xì)胞等?；蛘?，在剛性容器中容器內(nèi)變?yōu)樨?fù)壓，這也有可能損傷細(xì)胞等。另一方面，通常溫度越高從培養(yǎng)容器中蒸發(fā)的水分量越多。這雖然也是由于構(gòu)成容器的材料的透濕度變高的緣故，但主要是由于相對濕度變低。例如，比較25"和37。C的相對濕度時，37。C下的飽和水蒸氣壓幾乎為25。C下的2倍，因此若25。C下的相對濕度為50。/。，則37"下的相對濕度為其二分之一即25%,蒸發(fā)速度變?yōu)榧s1.5倍?？梢韵氲皆诓豢刂茲穸鹊那闆r下在37。C左右的溫度下會達(dá)到如此低的濕度，雖然考慮這一點(diǎn)是重要的，但顧及這一點(diǎn)的培養(yǎng)容器還不存在。因此，現(xiàn)有的培養(yǎng)容器通常以在37。C、高濕度下使用為前提，還不存在為低濕度下使用而設(shè)計(jì)的培養(yǎng)容器。另外，上述文獻(xiàn)中雖然也記述了容器中使用的透氣膜的氣體透過系數(shù)、透濕度、材質(zhì)等，但關(guān)于為了在低濕度下使用容器而考慮透氣膜的膜面積和培養(yǎng)液的內(nèi)容量的知識以及將蒸發(fā)的水蒸氣量抑制在何種程度為佳則完全沒有記載。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明鑒于上述現(xiàn)有的細(xì)胞培養(yǎng)容器的問題而設(shè)，著眼于與在需要嚴(yán)格的濕度管理或衛(wèi)生管理的高濕度下進(jìn)行培養(yǎng)相比，在低濕度下進(jìn)行培養(yǎng)在衛(wèi)生、成本、管理等所有方面都有利，目的在于提供培養(yǎng)容器和培養(yǎng)方法，所述培養(yǎng)容器的一部分是由透氣膜形成的，該培養(yǎng)容器具有高氣體交換性能，同時即使在低濕度下也可將培養(yǎng)液的水分蒸發(fā)所引起的濃度變化抑制在不產(chǎn)生問題的范圍內(nèi)，可進(jìn)行長期的細(xì)胞、微生物等的培養(yǎng)。達(dá)到上述目的的本發(fā)明的培養(yǎng)容器，其特征在于具有透氣膜，當(dāng)規(guī)定內(nèi)容量為V(ml)、透氣膜的膜面積為S(cm2)、37。C下的氧透過率為Po2(ml/cm^天.大氣壓)、二氧化碳透過率為Pco2(ml/cm^天'大氣壓)、透濕度為Pmo(g/cm、天)時，透氣膜具有P。2xS/V〉2.0的氧透過率、Pco2xS/V〉8.0的二氧化碳透過率以及Pmc)XS/V0.02的透濕度。本發(fā)明的另一方面提供培養(yǎng)容器，該培養(yǎng)容器整體具有扁平形狀，且至少單面具有上述透氣膜。達(dá)到上述目的的本發(fā)明的培養(yǎng)方法，其特征在于當(dāng)注入培養(yǎng)液重量為m(g)、培養(yǎng)時間為t(hr)時，使用上述培養(yǎng)容器在相對濕度50%以下、使PH2oxS/mxt/24S0.10下進(jìn)行培養(yǎng)。本發(fā)明的培養(yǎng)方法的一個方案，其特征在于培養(yǎng)對象為動物細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的培養(yǎng)容器，其具有氧、二氧化碳?xì)怏w的高氣體交換性能，同時可以在無需嚴(yán)才各的濕度管理、定期供應(yīng)滅菌水和通過紫外線照射對箱內(nèi)的加濕用水進(jìn)行滅菌等麻煩的衛(wèi)生管理、可節(jié)約培養(yǎng)成本的低濕度下將培養(yǎng)液的水分蒸發(fā)所引起的濃度變化抑制在不產(chǎn)生問題的范圍內(nèi)。根據(jù)本發(fā)明的培養(yǎng)方法，通過使用上述培養(yǎng)容器在相對濕度50%以下進(jìn)行培養(yǎng)，在無需嚴(yán)^f各的濕度管理或衛(wèi)生管理且衛(wèi)生方面、成本、管理等有利的低濕度下將培養(yǎng)液的水分蒸發(fā)所引起的濃度變化抑制在不產(chǎn)生問題的范圍內(nèi)，可以在最佳條件下進(jìn)行長期培養(yǎng)。附圖簡述圖l表示本發(fā)明一實(shí)施方案的細(xì)胞培養(yǎng)容器，(a)為斜視圖，(b)為圖l(a)的A-A斷面圖。實(shí)施發(fā)明的最佳方式以下參照附圖來說明本發(fā)明的實(shí)施方案。本發(fā)明的培養(yǎng)容器為密閉型培養(yǎng)容器，也可以由各專利文獻(xiàn)所記載的含有撓性樹脂制薄片的袋狀培養(yǎng)袋構(gòu)成，優(yōu)選的容器形態(tài)如上述曰本特開2004-129568號公報和日本特表2004-514432號公報所記載，是由具剛性的材料制成的、整體為扁平形狀的密閉容器，該容器具備相互間隔對置的兩個平面狀表面和上述平面狀表面間的側(cè)部，上述平面狀表面中的至少一個表面具有透氣膜。圖l表示本發(fā)明的培養(yǎng)容器的一個實(shí)施方案，(a)為斜-現(xiàn)圖，(b)為圖l(a)的A-A斷面圖。細(xì)胞等的培養(yǎng)容器l整體為長方形、扁平形狀的容器，由聚乙烯、聚丙烯、氯乙烯等具有某種程度的撓性和剛性的塑料制成。該框架2通過射出成形等形成長邊3、短邊4和窗部5，利用適當(dāng)方法在該框架2的表里兩面形成透氣膜5、5,使以框架2的厚度為預(yù)定間隔對置。應(yīng)說明的是，該框架2設(shè)有段差，使外周側(cè)變厚、內(nèi)周側(cè)變薄，外周側(cè)設(shè)計(jì)為厚是為了確保剛性和確保用于安裝部件所必需的部位，上述部件用于填充、取出內(nèi)容液；內(nèi)周側(cè)的窗部調(diào)整為用于確保規(guī)定的內(nèi)容液填充空間的厚度。而且，透氣膜5由允許培養(yǎng)氣體通過而不允許污染細(xì)胞的微生物等通過的材質(zhì)制成，可從后述樹脂中選擇適當(dāng)?shù)牟馁|(zhì)。該培養(yǎng)容器l中，框架2和由形成于該框架2的表里兩面的透氣膜5、5形成的空間6[圖1(b)]構(gòu)成容納適合培養(yǎng)細(xì)胞等的內(nèi)容液的內(nèi)容液填充空間，該空間6的容積成為容器1的規(guī)定內(nèi)容量。另外，在框架2的長邊3的其中之一3a上帶有內(nèi)容液填充管7和取出管8,從上述內(nèi)容液填充管7向容器1內(nèi)填充細(xì)胞與培養(yǎng)液的混合液即內(nèi)容液，利用適當(dāng)公知的方法進(jìn)行密封，內(nèi)容液的填充密封結(jié)束后按預(yù)定的溫度、濕度、氣體組成和濃度培養(yǎng)預(yù)定時間，培養(yǎng)結(jié)束后從內(nèi)容液取出管8取出內(nèi)容液。尚需說明的是，上述容器l可以是可改變內(nèi)容積的形態(tài)，此時規(guī)定內(nèi)容量V可變，但透氣膜5的面積S是一定的，因此即使根據(jù)應(yīng)該培養(yǎng)的細(xì)胞等、填充的培養(yǎng)液量來改變?nèi)萜鱨的規(guī)定內(nèi)容量，也可以在確定的可培養(yǎng)的內(nèi)容量范圍內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。透氣膜5必需是氧和二氧化碳的氣體交換性能優(yōu)異、適合在低濕度下進(jìn)行培養(yǎng)的透濕度極小的材質(zhì)，當(dāng)37。C下的氧透過率為Po2、二氧化碳透過率為PC02、透濕度為PH20時，透氣膜5必需具有Po2XS/V〉2.0的氧透過率、Pco2xSA^8.0的二氧化碳透過率以及PH2oxS/V〈0.02的透濕度。而且，上述透氣膜5為氧透過率、二氧化碳透過率和透濕度不受相對濕度影響的材質(zhì)，滿足上述要求的透氣膜優(yōu)選以聚烯烴或氟樹脂為主要成分的單層或多層所形成的透氣膜。滿足上述條件的透氣膜的材質(zhì)的例子有由乙烯、丙烯、丁烯、戊烯、己烯、庚烯、辛烯等烯烴類和降冰片烯或四環(huán)十二碳烯等環(huán)狀烯烴類中的一種乃至多種烯烴系單體聚合的同聚物或共聚物樹脂，例如聚乙烯、聚丙烯、聚丁烯-1、聚-4-曱基戊烯-l、環(huán)狀烯烴共聚物等聚烯烴。此外，材質(zhì)的例子還有聚苯乙烯、四氟乙烯-六氟丙烯共聚物等氟樹脂、硅酮聚合物等，優(yōu)選根據(jù)應(yīng)該培養(yǎng)的細(xì)胞種類、培養(yǎng)箱的濕度等培養(yǎng)條件從上述樹脂中選擇適當(dāng)?shù)牟馁|(zhì)。另外，透氣膜5優(yōu)選具有某種程度的張力使在形成框架時不松弛，且可見光透過性優(yōu)異。以下給出本發(fā)明的實(shí)施例。實(shí)施例[測定]1.培養(yǎng)容器的規(guī)定內(nèi)容量培養(yǎng)容器的規(guī)定內(nèi)容量V(ml)是指在透氣膜和框架所圍成的空間中，在透氣膜與對面維持平衡的狀態(tài)下、且培養(yǎng)空間完全填滿培養(yǎng)液的狀態(tài)下的培養(yǎng)液量。2.透氣膜的膜面積透氣膜的膜面積S(cm、是指不考慮膜表面的微細(xì)凹凸等，被框架包圍的假定為平滑膜而算出的膜面積。3.氧透過率和二氧化-友透過率氧透過率和二氧化碳透過率如下測定利用氣體透過率測定裝置(GPM-250:GLSciences社)，使用含有氮(65%)、氧(15%)和二氧化碳(20%)的混合氣體作為供給氣體，在37。C下進(jìn)行測定。4.透濕度透濕度使用透濕度測定裝置(PERMATRAN-W3/30:Mocon社)在37"C下測定。[評價]1,培養(yǎng)液(內(nèi)容液)蒸發(fā)比例向培養(yǎng)容器中填充規(guī)定內(nèi)容量V(ml)的含有培養(yǎng)液和細(xì)胞的預(yù)定濃度的懸浮液，之后測定容器總重量Wo(g)，從中扣除事先測定的容器的單體重量w(g)，算出培養(yǎng)液的初期填充重量(Wo-w)。進(jìn)行培養(yǎng)后，同樣測定容器總重量W(g),并將其從培養(yǎng)前的容器總重量Wo(g)中扣除，求出蒸發(fā)的培養(yǎng)液重量(Wo-W)。計(jì)算培養(yǎng)液的蒸發(fā)比例時，用蒸發(fā)的培養(yǎng)液重量(Wo-W)除以培養(yǎng)液的初期填充重量(Wo-W),以(Wo-W)/(Wo-w)的形式求出。2.增殖倍率培養(yǎng)后計(jì)測回收的總細(xì)胞數(shù)，由培養(yǎng)開始時接種的總細(xì)胞數(shù)求出增殖倍率。考慮到回收時的損失或計(jì)數(shù)不均，將相對于在相對濕度100%的條件下培養(yǎng)的細(xì)胞(對照)產(chǎn)生90%以上的增殖倍率時用"o，，表示，增殖倍率在其以下時用"x，，表示。[實(shí)施例l]將長邊的長度為127mm、短邊的長度為85mm、厚度為5.8mm的由高密度聚乙烯制成的框架的內(nèi)側(cè)減薄，設(shè)置長邊的長度為83.3mm、短邊的長度為60mm、厚度為2mm的窗部。在該框架的窗部的表里兩面以由厚度為20pm的聚丙烯(PP)層和厚度為80/mi的利用金屬茂系催化劑得到的線狀低密度聚乙烯(LLDPE)層形成的厚度為100^m的共擠出薄膜作為透氣膜、以該LLDPE層為內(nèi)側(cè)進(jìn)行熱封，作成如表l所示的圖l的構(gòu)成的培養(yǎng)容器。自內(nèi)容液填充管向該培養(yǎng)容器中填充規(guī)定內(nèi)容量的IOml內(nèi)容液并進(jìn)行密封，上述內(nèi)容液為在無血清培養(yǎng)液(細(xì)胞科學(xué)研究所制AiyS505N,含700IU/mlIL-"中按4000個細(xì)胞/ml的濃度接種來源于小鼠的細(xì)胞毒性T細(xì)胞CTLL-2的內(nèi)容液。接著，在37。C、相對濕度20%、二氧化碳濃度為5%的環(huán)境下培養(yǎng)95小時，評價培養(yǎng)液(內(nèi)容液)的蒸發(fā)比例、增殖倍率。其結(jié)果如表2所示。[實(shí)施例2]如表l所示，除了以將厚度為30/mi的TPX(三井化學(xué)制，聚-4-曱基戊烯-1)和厚度為70^m的LLDPE用聚氨酯系粘合劑層合的多層薄膜作為培養(yǎng)容器的透氣膜以外，與實(shí)施例1同樣進(jìn)行培養(yǎng)和評價。[實(shí)施例3]如表l所示，除了以將厚度為30〃m的FEP(Daikin工業(yè)制，四氟乙烯'六氟丙烯共聚物)和厚度為70^n的LLDPE用聚氨酯系粘合劑層合的多層薄膜作為培養(yǎng)容器的透氣膜以外，與實(shí)施例1同樣進(jìn)行培養(yǎng)和評價。[比4交例1]除了使用聚苯乙烯(PS)制的框架，并且如表l所示以厚度為100/mi的PS薄膜作為培養(yǎng)容器的透氣膜以外，與實(shí)施例l同樣進(jìn)行培養(yǎng)和評價。[比較例2〗除了將厚度為100〃m的LLDPE薄膜四邊密封作成內(nèi)側(cè)的非熱封邵分的長邊長度為215mm、短邊長度為150mm的培養(yǎng)袋，并以該袋的容器壁作為透過膜制成表l所示的培養(yǎng)容器以外，與實(shí)施例l同樣進(jìn)行培養(yǎng)和評價。[比較例3]在實(shí)施例l中，除了通過使框架窗部的厚度為6mm,培養(yǎng)容器的規(guī)定內(nèi)容量為3倍以外，與實(shí)施例1同樣進(jìn)行培養(yǎng)和評價。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>200680046267.8說明書第10/11頁表2<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>由表l、2的結(jié)果可知實(shí)施例13的細(xì)胞培養(yǎng)容器在氧交換性能、二氧化碳交換性能、水蒸氣阻擋性能等所有方面均滿足本發(fā)明的要求性能值，表明上述細(xì)胞培養(yǎng)容器適合低濕度下的細(xì)胞培養(yǎng)。相對于此，比較例l的細(xì)胞培養(yǎng)容器在氧透過率(氧交換性能)、二氧化碳透過率(二氧化碳交換性能)和透濕度(水蒸氣阻擋性能)方面均未達(dá)到本發(fā)明的要求性能；而比較例2和3的細(xì)胞培養(yǎng)容器在氧透過率(氧交換性能)和二氧化碳透過率(二氧化碳交換性能)方面未達(dá)到本發(fā)明的要求性能，判定不適合用作低濕度下的培養(yǎng)容器。本發(fā)明的培養(yǎng)容器還可用于培養(yǎng)微生物，特別適合用于培養(yǎng)動物細(xì)胞。尚需說明的是，培養(yǎng)時的溫度通常為動物細(xì)胞等在3540。C下進(jìn)行培養(yǎng)，大腸桿菌等微生物在1560。C下進(jìn)行培養(yǎng)。產(chǎn)業(yè)實(shí)用性本發(fā)明可以適用于培養(yǎng)方法和培養(yǎng)容器，特別是適合用作具有氧、二氧化碳?xì)怏w的高氣體交換性能，同時在無需嚴(yán)格的濕度管理、定期供應(yīng)滅菌水和通過紫外線照射對箱內(nèi)的加濕用水進(jìn)行滅菌等麻煩的衛(wèi)生管理、可節(jié)約培養(yǎng)成本的低濕度下可以將培養(yǎng)液的水分蒸發(fā)所引起的濃度變化抑制在不產(chǎn)生問題的范圍內(nèi)，氧和二氧化碳的氣體交換性能優(yōu)異，適合在低濕度下培養(yǎng)細(xì)胞、微生物等的密閉型培養(yǎng)容器和培養(yǎng)方法。權(quán)利要求1.培養(yǎng)容器，其特征在于具有透氣膜，當(dāng)規(guī)定內(nèi)容量為V(m1)、透氣膜的膜面積為S(cm2)、37℃下的氧透過率為PO2(ml/cm2·天·大氣壓)、二氧化碳透過率為PcO2(ml/cm2·天·大氣壓)、透濕度為PH2O(g/cm2·天)時，透氣膜具有PO2×S/V＞2.0的氧透過率、PcO2×S/V＞8.0的二氧化碳透過率以及PH2O×S/V＜0.02的透濕度。2.權(quán)利要求l的培養(yǎng)容器，該容器整體具有扁平形狀，且至少單面上具有上述透氣膜。3.培養(yǎng)方法，其特征在于當(dāng)注入培養(yǎng)液重量為m(g)、培養(yǎng)時間為t(hr)時，使用權(quán)利要求1或2的培養(yǎng)容器在相對濕度50%以下、使PH2。xS/mxt/24幼.10下進(jìn)行培養(yǎng)。4.權(quán)利要求3的培養(yǎng)方法，其特征在于培養(yǎng)對象為動物細(xì)胞。全文摘要培養(yǎng)容器，其具有透氣膜，當(dāng)規(guī)定內(nèi)容量為V(ml)、透氣膜的膜面積為S(cm<sup>2</sup>)、37℃下的氧透過率為P<sub>O#-[2</sub>](ml/cm<sup>2</sup>·天·大氣壓)、二氧化碳透過率為P<sub>CO#-[2</sub>](ml/cm<sup>2</sup>·天·大氣壓)、透濕度為P<sub>H#-[2</sub>O](g/cm<sup>2</sup>·天)時，透氣膜具有P<sub>O#-[2</sub>]×S/V＞2.0的氧透過率、P<sub>CO#-[2</sub>]×S/V＞8.0的二氧化碳透過率以及P<sub>H#-[2</sub>O]×S/V＜0.02的透濕度。文檔編號C12M3/00GK101326279SQ20068004626公開日2008年12月17日申請日期2006年10月12日優(yōu)先權(quán)日2005年10月14日發(fā)明者波多野靖,田中鄉(xiāng)史申請人:東洋制罐株式會社