專利名稱：：用于檢測樣品中靶細(xì)胞存在與否的方法用于檢測樣品中耙細(xì)胞存在與否的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及用于檢測樣品中靶細(xì)胞存在與否的方法，尤其是用于檢測樣品中靶細(xì)菌存在與否的方法，所述方法包括基于核酸的檢測步驟。目前使用的許多檢測樣品中細(xì)胞類型或微生物的方法依賴于DNA或RNA的鑒定，例如診斷微生物感染、法醫(yī)學(xué)、組織分型和血型分型、檢測遺傳變異等。目前，人們普遍認(rèn)可將使用DNA或RNA鑒定作為一種手段，用于區(qū)分不同細(xì)胞或細(xì)胞類型，或者區(qū)分相同細(xì)胞類型中含有DNA突變的變體。因此，更普遍地通過使用抗體鑒定特征性表面抗原來進(jìn)行的HLA分型也可以替代性地通過鑒定編碼這些抗原的DNA來實(shí)現(xiàn)。微生物感染或污染可以通過檢測靶生物的核酸分析來鑒定，而不是依賴于檢測細(xì)胞或微生物的表現(xiàn)特征(例如通過形態(tài)學(xué)或生物化學(xué)標(biāo)記來檢測)。遺傳變異也可通過相似的手段來鑒定。一般而言，通過在足以確保低水平非特異結(jié)合的條件下與一個(gè)或多個(gè)寡核苷酸雜交來鑒定DNA或RNA。通常，所述雜交的核苷酸成對使用，作為引物用于多種目前可用的體外擴(kuò)增形式中，主要是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechainreaction,PCR)和鏈置換分析(StrandDisplacementAnalysis,SDA)，以及連接酶擴(kuò)增反應(yīng)(LigaseAmplificationReaction,LAR)、自持續(xù)序列復(fù)制(Self-SustainedSequenceReplication,3SR)和Q-p復(fù)制酶擴(kuò)增體系。擴(kuò)增后，可通過測序進(jìn)一步表征DNA,例如使用Sanger法。擴(kuò)增和測序可以組合在一起?；诤怂釘U(kuò)增的所有檢測方法中的一致主題是存在最初的核酸分離步驟，用于將核酸從可干擾所使用的雜交和/或擴(kuò)增技術(shù)的材料(例如蛋白質(zhì))中分離出來。已知一系列用于分離核酸的方法，但是一般而言，它們依賴于一系列復(fù)雜的提取和洗滌步驟，并且進(jìn)行起來費(fèi)時(shí)費(fèi)力。用于從復(fù)雜的起始材料(如血或血液制品或組織)中分離核酸的經(jīng)下進(jìn)行)，然后對核酸用有機(jī)溶劑如苯酚和/或氯仿萃取數(shù)次、乙醇沉淀、離心和透析。這些方法不僅進(jìn)行起來繁復(fù)費(fèi)時(shí)，而且所需相對多的步驟提高了降解、樣品損失或者在同時(shí)處理若干樣品時(shí)樣品交叉污染的風(fēng)險(xiǎn)。因此一直在尋求對核酸分離方法的改進(jìn)。已經(jīng)提出了依賴于4吏用固相的方法。例如在US-A-5，234，809中描述了一種方法，其中在離液劑如胍鹽存在下，核酸與二氧化硅微粒形式的固相結(jié)合，由此與樣品的其余部分分離。WO91/12079描述了一種方法，其中核酸通過沉淀停留在固相表面.一般而言，使用醇和鹽作為沉淀劑。核酸所來源的細(xì)胞可通過過濾、離心或與附著在固相上的抗體親和結(jié)合而首先從樣品中分離。以這種方式濃縮細(xì)胞后，接著從濃縮的細(xì)胞中純化DNA，這通常是通過上述經(jīng)典酚/氯仿抽提法進(jìn)行，也帶有其附帶的缺點(diǎn)。已經(jīng)描述了其它方法(US-B1-6,255,477)，所述方法涉及細(xì)胞與第一固相結(jié)合、裂解這些細(xì)胞和隨后將釋放的核酸與第二固體支持物結(jié)合的連續(xù)步驟。這些方法已經(jīng)被進(jìn)一步開發(fā)，以使細(xì)胞和釋放的核酸與相同的固體支持物結(jié)合(W098/51693和WO01/53525)。發(fā)明人已驚訝地發(fā)現(xiàn)，比WO98/51693中所述簡單得多的方法也是有效的。尤其是不需要將釋放的核酸與固體支持物結(jié)合的單獨(dú)步驟，因而需要更少的試劑和更少的步驟，例如不需要核酸結(jié)合緩沖液。照這樣，通過進(jìn)行起來簡單并快捷的程序來確定樣品中靶細(xì)胞的存在與否，耗時(shí)可少于30分鐘。因此，本發(fā)明第一方面提供了用于檢測樣品中耙細(xì)胞存在與否的方法，所述方法包括(a)將所述樣品中的細(xì)胞與微粒狀可混合固體支持物結(jié)合；(b)將細(xì)胞從該固體支持物上洗脫，而不使用竟?fàn)幏肿悠茐募?xì)胞與固體支持物之間的相互作用；(c)裂解所述細(xì)胞后，檢測所述靶細(xì)胞特征性的核酸存在與否，其中所述固體支持物上沒有固定抗體或抗體片段。檢測步驟(C)通常包括核酸擴(kuò)增方法。術(shù)語"細(xì)胞"在本文中作為一種便利的方式使用，用于指代所有的原核(包括古細(xì)菌和支原體)和真核細(xì)胞以及其它活的實(shí)體如病毒，以及亞細(xì)胞區(qū)室如細(xì)胞器。因此，代表性的"細(xì)胞"包括所有類型的哺乳動(dòng)物和非哺乳動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞、原生質(zhì)體、細(xì)菌、原生動(dòng)物和病毒。該術(shù)語的這種用法并不意味著能推出病毒特異性或細(xì)胞(即原核和真核)特異性檢測方法的互換性。"靶細(xì)胞"也可以是具體的細(xì)胞類型或選定細(xì)胞的變體。例如，靶細(xì)胞可以與樣品中其余細(xì)胞是相同的細(xì)胞類型和來自相同的生物，但是其與樣品中其余細(xì)胞在至少一個(gè)方面不同，例如特定基因中的特定突變。優(yōu)選地，所述細(xì)胞為原核細(xì)胞或真核細(xì)胞，更優(yōu)選為原核細(xì)胞。最優(yōu)選的原核細(xì)胞是革蘭氏陰性菌(例如百日咳博德特氏菌(丑^&&//"pe"MSS/s)和淋病奈瑟氏菌(7V"'S5W/flg0W<WT/we"e))、柔膜細(xì)菌(支原體和尿素原體，眾lj如肺炎支原體(聊co/;/as附fl/wew附ow/fle))和衣原體(例如沙眼衣原體(CA/fl附j(luò);力Vifmc/^挑flf/s)和肺炎衣原體(C7^/fl/iy^ifl/meM附owi'"e))。因此，樣品可以是含有這些細(xì)胞內(nèi)的核酸的任何材料，包括例如食物和相關(guān)制品、臨床和環(huán)境樣品。因此，樣品可以是生物樣品，其可含有任何病毒或細(xì)胞材料，包括所有原核或真核細(xì)胞、病、噬菌體、支原體、原生質(zhì)體和細(xì)胞器。因此這樣的生物材料可包含所有類型的哺乳動(dòng)物和非哺乳動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞、藻類包括藍(lán)-綠藻類、真菌、細(xì)菌、原生動(dòng)物等。因此代表性樣品包括取自人或動(dòng)物體的臨床樣品如全血和血衍生制品，如血漿或血沉棕黃層、尿、糞便、腦脊液或任何其它體液、組織、細(xì)胞培養(yǎng)物、細(xì)胞懸液等，以及例如通過體腔拭子獲得的樣品。其它的代表性樣品包括環(huán)境樣品，如水樣(例如來自湖、河、污水處理廠和其它水處理中心)或土樣或食物樣品。優(yōu)選的樣品為尿、呼吸道樣品以及血漿和其它血液制品組分。所述方法在食物樣品分析以及一般健康和衛(wèi)生應(yīng)用(其中期望監(jiān)測例如食物制備區(qū)域中的細(xì)菌水平)中也具有顯著的效用。例如，可以分析乳制品中的李斯特菌屬。已經(jīng)證明，使用固定化抗體分離細(xì)菌的常規(guī)技術(shù)遠(yuǎn)不如我們使用非特異性配體分離李斯特菌屬的方法有效，這可能是由于固定化抗體的疏水性質(zhì)所致。當(dāng)樣品為水樣時(shí)，配體優(yōu)選為目的微生物的養(yǎng)分?？砂慈缦路治鍪澄飿悠肥紫仍谛枰獣r(shí)(如果是固體樣品)勻槳，然后與合適的孵育培養(yǎng)基(例如蛋白胨水)混合并在371C下孵育過夜。食物如乳酪、水激凌、蛋、人造黃油、魚、蝦、雞、牛肉、豬排、面粉、燕麥片、米飯、胡椒、蔬菜(如番茄、花莖甘藍(lán)、豆類、花生)和杏仁糖可以以此種方式進(jìn)行分析。本發(fā)明的方法對分析食物樣品特別有益，因?yàn)樗鼈兒写罅抗腆w材料(凝塊和脂肪顆粒)，這些固體材料很可能堵塞濾器并在離心后產(chǎn)生沉淀，在這些沉淀中細(xì)菌被包起來，不能被裂解或與抗體結(jié)合。樣品還可包括相對純凈或被部分純化的起始材料，例如通過其它細(xì)胞分離方法獲得的半純凈制備物。本發(fā)明方法中使用的固體支持物為微粒狀，并且是可混合的，即能夠被混合。為了成為"可混合的"，樣品組分和固體支持物組分可在混合步驟中均分散在另一組分之中，即兩種組分均可移動(dòng)。微粒狀材料(例如珠子)由于其更大的結(jié)合容量因而是有利的。纖維被認(rèn)為是可混合的微粒狀固體支持物。優(yōu)選顯示用于細(xì)胞結(jié)合的高表面積的材料。這樣的支持物一般會(huì)具有不規(guī)則的表面，并可例如是多孔的。支持物可以便利地由玻璃、二氧化硅、膠乳或聚合物材料制成。優(yōu)選地，微粒由聚合物材料制成。根據(jù)本發(fā)明使用的微粒狀固體支持物應(yīng)便利地包含珠子，優(yōu)選球形或基本為球形的珠子。珠子的尺寸不是關(guān)鍵性的，但是它們可例如具有至少lnm、優(yōu)選為至少2jim級別的直徑，并具有優(yōu)選不大于10jim、更優(yōu)選不大于6jim的最大直徑。例如，直徑2.8jun和4.5nm的珠子已經(jīng)顯示工作良好。單分散微粒，即尺寸基本均一(例如尺寸的直徑標(biāo)準(zhǔn)差小于5%)的微粒具有下述優(yōu)點(diǎn)它們提供非常均一的反應(yīng)再現(xiàn)性.通過US-A-4336173中所述技術(shù)獲得的單分散聚合物微粒是特別合適的。適用于本發(fā)明方法的非磁性聚合物珠子可得自DynoParticlesAS(Lillestr0m,Norway)以及Qiagen、Pharmacia和Serotec。然而，為了輔助操作和分離，優(yōu)選磁性珠。本文使用術(shù)語"磁性"表示支持物在置于磁場中時(shí)能夠被賦予磁矩，從而能在所述場的作用下移動(dòng)。換言之，包含磁性微粒的支持物可通過磁性聚集而容易地取出，這提供了在細(xì)胞與核酸結(jié)合的步驟之后分離微粒的快速、簡單和有效的方式，并且是比產(chǎn)生剪切力的傳統(tǒng)技術(shù)(如離心)溫和得多的一種方法，所述剪切力可破壞細(xì)胞或降解核酸。因此，使用本發(fā)明的方法，可以通過施加磁場(例如使用永磁體)將與細(xì)胞結(jié)合的磁性微粒移至合適的表面上。在含有樣品混合物的管側(cè)面施加磁體通常足以將微粒聚集在管壁上，并倒掉樣品的其余部分。特別優(yōu)選的是超順磁性微粒，例如Sintef在EP-A-106873中所述的那些，因?yàn)槟軌虮苊夥磻?yīng)時(shí)微粒的磁性聚集和結(jié)塊，從而確保均一性和和實(shí)現(xiàn)核酸抽提。由DynalAS(Oslo,Norway)以DYNABEADS銷售的公知磁性微粒尤其適用于本發(fā)明?？梢愿鶕?jù)US專利4,336,173、4,459,378和4,654,267使珠子改性來制備用于本發(fā)明的功能化包被微粒。因此，珠子或其它支持物可以制備為具有不同類型的功能化表面，例如帶正電或帶負(fù)電、親水或疏水。不同的細(xì)胞對不同表面和支持物顯示不同程度的非特異性結(jié)合，"滴定"每體積單位中固體支持物的量(例如微粒數(shù))從而優(yōu)化細(xì)胞結(jié)合條件并確定最佳支持物面積(例如給定體系中的微粒濃度)可能是有利的。細(xì)胞與固體支持物的結(jié)合可以以任何已知或便利的方式實(shí)現(xiàn)。例如，細(xì)胞與支持物的非特異結(jié)合可以通過適當(dāng)?shù)剡x擇固體支持物和條件來實(shí)現(xiàn)，例如選擇固體支持物表面的化學(xué)或物理性質(zhì)(例如疏水性或電荷)、分離介質(zhì)的pH或組成等。"非特異性結(jié)合"指就存在的所有細(xì)胞的比例以及該細(xì)胞類型中的比例而言，樣品中存在的大部分細(xì)胞(例如細(xì)菌)均與固體支持物結(jié)合。因此，樣品中優(yōu)選至少30%、更優(yōu)選至少50%、最優(yōu)選至少70%或80%的細(xì)胞(包含多種細(xì)胞類型)會(huì)與固體支持物結(jié)合。當(dāng)然，樣品中結(jié)合細(xì)胞的百分比將取決于添加進(jìn)樣品中的固體支持物的量以及細(xì)胞結(jié)合配體(如果存在的話)與細(xì)胞的比例。對于上述百分比而言，假定混合物中存在過量的固體支持物(和細(xì)胞結(jié)合配體，如果適用的話)。優(yōu)選地，固體支持物將是能夠結(jié)合樣品中大部分或所有原核細(xì)胞的固體支持物。更優(yōu)選地，該固體支持物將是還能夠優(yōu)先結(jié)合原核細(xì)胞勝過真核細(xì)胞的固體支持物。盡管因此存在一定程度的選擇性，但是仍然認(rèn)為該結(jié)合是非特異性的。結(jié)合步驟中使用的條件可影響這些能力，因此結(jié)合步驟中使用的條件應(yīng)當(dāng)相應(yīng)地進(jìn)行選擇。技術(shù)人員能夠調(diào)整結(jié)合條件，以針對其需要進(jìn)行優(yōu)化。因此，非特異性結(jié)合步驟優(yōu)選導(dǎo)致樣品中大部分或所有原核細(xì)胞與固體支持物結(jié)合。更優(yōu)選地，非特異性結(jié)合步驟導(dǎo)致樣品中大部分或所有原核細(xì)胞結(jié)合，但是沒有或幾乎沒有真核細(xì)胞結(jié)合.靶細(xì)胞的性質(zhì)也可能起作用，例如已經(jīng)顯示，某些疏水細(xì)胞可容易地與疏水表面非特異性結(jié)合，而親水細(xì)胞可與更親水的表面結(jié)合。還已觀察到，帶負(fù)電的細(xì)胞(如B淋巴細(xì)胞)與帶弱正電的表面具有高水平的非特異性結(jié)合。因此，可以使用這樣的固體支持物，其具有帶適當(dāng)電荷的表面用于結(jié)合想要的細(xì)胞類型。可使用適當(dāng)?shù)木彌_液等作為細(xì)胞結(jié)合步驟的介質(zhì)，以實(shí)現(xiàn)適合細(xì)胞結(jié)合的條件，因此簡單地使固體支持物與樣品在適當(dāng)?shù)慕橘|(zhì)中接觸會(huì)導(dǎo)致結(jié)合?？稍谂c固體支持物接觸之前、同時(shí)或之后向樣品中便利地添加具有適當(dāng)電荷、滲透性等的緩沖液。有利地，可以根據(jù)本發(fā)明通過使用沉淀劑將細(xì)胞沉淀在支持物上來實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的非特異性結(jié)合，例如將細(xì)胞與支持物在存在醇和鹽時(shí)接觸，例如向樣品中添加含有醇和鹽的緩沖液。醇和鹽在分離和純化方法(例如沉淀)中的用途是很普遍的，并且這類步驟中使用的任何合適的醇或鹽均可根據(jù)本發(fā)明使用。因此，醇可以便利地為任何鏈烷醇，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)低級鏈烷醇如異丙醇和乙醇是合適的。其它合適的醇包括甲醇和正丁醇。鹽可以通過任何便利的來源(例如鈉或鉀的氯化物或乙酸鹽，或乙酸銨)提供。醇和鹽的適當(dāng)濃度可以根據(jù)所使用的確切體系和試劑來確定。一般而言，發(fā)現(xiàn)向樣品中添加0,5到3倍體積(例如l倍體積)的醇是合適的。醇可以在50-100%(重量/體積)的濃度下便利地使用。發(fā)現(xiàn)使用例如0.1M到10.0M、更特別地0.1M到7.0M(例如0.1M到3.0M)的鹽濃度是合適的，并且鹽可便利地以上述濃度包含在醇溶液中。因此，可以使用含有期望的醇和鹽濃度的所謂"細(xì)胞結(jié)合緩沖液"?；蛘撸}和醇可以單獨(dú)添加。使用醇作為本發(fā)明細(xì)胞的沉淀劑對于該方法在臨床診斷方案中的用途是有利的，因?yàn)槭褂么急４媾R床樣品非常普遍。因此，可以簡單地將患者樣品添加至含醇的細(xì)胞結(jié)合緩沖液中，由此保存樣品并準(zhǔn)備用于純化核酸。作為用鹽/醇沉淀的備選方案，其它沉淀劑也可以單獨(dú)或與鹽和/或醇組合使用，例如聚乙二醇(PEG)或其它具有類似特性的高分子量聚合物。這些聚合物的濃度可取決于確切的系統(tǒng)(例如聚合物和細(xì)胞類型)而變化，但是一般使用1%到50%(重量/體積)的濃度，例如2-30%。具有吞噬活性的細(xì)胞可以通過其"結(jié)合"或"吞噬"微粒狀固相(例如珠子)的能力而被捕獲，由此能夠容易地進(jìn)行收集。在這種情況下，含細(xì)胞的樣品將簡單地在合適的條件下與固相接觸或孵育。這類細(xì)胞捕獲不依賴于特異性結(jié)合。也可以提供帶有幫助細(xì)胞非特異性結(jié)合的部分的固體支持物，所述部分為例如被細(xì)胞非特異性結(jié)合的碳水化合物、蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段或多肽。因此，例如用碳水化合物包被的固體支持物通過細(xì)胞表面上的受體與細(xì)胞非特異性結(jié)合。用于將碳水化合物和其它蛋白質(zhì)或多肽固定在固體表面上的技術(shù)是本領(lǐng)域公知的.如果在支持物上使用配體來實(shí)現(xiàn)非特異性結(jié)合，則認(rèn)為該配體是"非特異性配體"。"非特異性"配體應(yīng)當(dāng)是能夠結(jié)合多于一種細(xì)胞類型、優(yōu)選結(jié)合多于2或3種、更優(yōu)選結(jié)合多于5或7種(例如多于IO或14種)不同細(xì)胞類型的配體。配體與細(xì)胞表面上負(fù)責(zé)結(jié)合的其結(jié)合配偶體之間存在相互作用，這不像細(xì)胞通過沉淀結(jié)合時(shí)可能的情況那樣只是在細(xì)胞與固體支持物之間存在一般的吸引或結(jié)合。配體的非特異性特性不是指其能夠與細(xì)胞表面上的部分無差別地結(jié)合或聯(lián)合，而是其結(jié)合配偶體不對某種細(xì)胞或細(xì)胞類型具有特異性。因此，可以認(rèn)為所述配體是一般結(jié)合配體。如上所述，盡管被認(rèn)為是非特異性結(jié)合，但是優(yōu)選優(yōu)先結(jié)核細(xì)胞的配體，但是結(jié)合樣品中大部分或所有原核細(xì)胞的配體是最優(yōu)選的。優(yōu)選地，非特異結(jié)合不涉及蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。因此，如果所述非特異性配體是蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段或多肽，則主要結(jié)合配偶體不是蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)的部分。優(yōu)選地，非特異性配體是非蛋白質(zhì)性的。優(yōu)選地，所述非特異性配體是碳水化合物。合適的碳水化合物包括單糖、寡糖(包括二糖和三糖)和多糖。合適的單糖包括己糖和戊糖(在適當(dāng)時(shí)為吡喃糖和呋喃糖形式)，以及糖衍生物如醛糖酸(aldonicacid)和糖醛酸(uronicacid)和脫氧糖或氨基糖、脫水糖和糖醇。合適的單糖可以為以下示例甘露糖(例如D-甘露糖)、半乳糖(例如D-半乳糖)、葡萄糖(例如D-葡萄糖)、果糖、巖藻糖(L-巖藻糖)、N-乙?；?葡糖胺、N-乙酰基-半乳糖胺、鼠李糖、半乳糖胺、葡糖胺(例如D-葡糖胺)、半乳糖醛酸、葡糖醛酸、N-乙酰神經(jīng)氨酸、甲基D-甘露吡喃糖苷(甘露糖苷)、a-甲基-葡糖苷、半乳糖苷、核糖、木糖、阿拉伯糖、糖二酸鹽、甘露醇、山梨醇、肌醇、甘油及這些單體的衍生物。其中優(yōu)選甘露糖、半乳糖、脫水半乳糖和巖藻糖。特別優(yōu)選的是寡糖和多糖，它們是單糖單體的多聚體，例如摻入上述單糖單體及其衍生物的多聚體。寡糖包含2到12個(gè)、優(yōu)選4到8個(gè)共價(jià)連接的單糖單元，所述單元可以是相同或不同的，并可以是線性或分支的，優(yōu)選是分支的，例如具有2到6個(gè)單位的寡聚甘露糖(oligomannosyl)、麥芽糖、蔗糖、海藻糖、纖維二糖和水揚(yáng)苷，尤其是麥芽糖。用于生產(chǎn)寡糖的方法描述于Pan等InfectionandImmunity(1997)，4199-4206。多糖包含13個(gè)或更多個(gè)共價(jià)連接的單糖單元，所述單糖單元可以是相同的或不同的，并可以是線性的或分支的，優(yōu)選是分支的。合適的多糖應(yīng)富含甘露糖、半乳糖、脫水半乳糖、葡萄糖和/或果糖，例如半乳甘露聚糖(本文中稱作GUM1)(SigmaG-0753),人們認(rèn)為它是甘露糖的直鏈多聚體，每四個(gè)甘露糖上帶有一個(gè)半乳糖分支。其它多糖包括阿拉伯膠(SigmaG9752)(人們認(rèn)為它是半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖和葡糖醛酸的支鏈多聚體)和卡拉牙膠(GumKaraya)(SigmaG0503)(人們認(rèn)為它是半乳糖、鼠李糖和葡糖醛酸的部分乙?；亩嗑垠w)。由甘露糖和半乳糖亞單元組成的多糖是優(yōu)選的配體類型，另一實(shí)例是瓜爾膠(guar)(Sigma,G1429),它具有pi,4連接的線性甘露糖主鏈，約每隔一個(gè)單元帶有在一個(gè)1，6a鍵連接的半乳糖側(cè)單元。甘露糖與半乳糖的比例為約1.8:1到約2:1。另一優(yōu)選的配體類型是由甘露糖、半乳糖和脫水半乳糖亞單元組成的多糖，如角叉菜膠。作為合適配體的糖衍生物包括肝素、硫酸類肝素和硫酸葡聚糖。硫酸化的糖是優(yōu)選的糖衍生物類別。合適的蛋白質(zhì)配體包括能夠如上所述與細(xì)胞非特異結(jié)合的凝集素或其衍生物片段。抗體或抗體片段不認(rèn)為是合適的蛋白質(zhì)?；谧鳛槲⑸镳B(yǎng)分的分子的配體也是有用的配體?？梢赃@樣根據(jù)本發(fā)明方法用作非特異性配體的微生物養(yǎng)分包括維生素例如煙酸、核黃素、硫胺、吡噴醇、泛酸、葉酸、生物素和鈷氨酰胺，以及鐵螯合分子/化合物如氯高鐵血紅素、乳鐵蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、血紅蛋白和某些鐵栽體如氣菌素(aerobactin)、鐵色素(SigmaF8014)、鐵腸螯素(ferrienterochelin)、腸菌素(enterobactin)和ferrixanine。最后，如上所述，對具有帶電、疏水或親水表面的固體支持物的非特異性細(xì)胞結(jié)合可以通過使用緩沖液(常與鹽組合)以達(dá)到適于結(jié)合的pH條件來實(shí)現(xiàn)。確切的緩沖液和條件將根據(jù)細(xì)胞類型、固體支持物等而變化。一般地，將多種成分混合并簡單地使其靜置合適的時(shí)間，以允許細(xì)胞與支持物結(jié)合。然后可以通過任何便利的手段將支持物從溶液中移出，所述手段當(dāng)然應(yīng)取決于支持物的性質(zhì)，并包括將支持物從樣品上清液中移出或?qū)悠窂闹С治镏幸瞥龅乃行问剑珉x心、傾析、移液等。該過程中的條件不是關(guān)鍵性的，并且已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，例如分離前在固相存在下將樣品與"細(xì)胞結(jié)合緩沖液"簡單地混合，并允許其在室溫下放置例如5到30分鐘(例如20分鐘)是^t利的。如上所述，反應(yīng)時(shí)間不是關(guān)鍵性的，短至5分鐘的時(shí)間通常就足夠。然而，如果便利的話也可使用較長的時(shí)間，例如20分鐘到3小時(shí)，或甚至過夜?；旌峡赏ㄟ^任何便利的手段完成，包括如通過攪拌、振蕩、吸打、倒置或用交變磁場進(jìn)行簡單的攪動(dòng)。另外，必要時(shí)可使用更高或更低的溫度，但并不必需。"細(xì)胞結(jié)合"組合物中其它任選的成分包括高分子量聚合物例如PEG等，弱的不帶電去污劑如TritonX-100、NP-40等，DNA酶和其他酶，只要它們使細(xì)胞保持完整即可。優(yōu)選的"細(xì)胞結(jié)合"組合物是例如PBS、檸檬酸緩沖液和含有Ca2+和Mg2+的溶液。盡管本發(fā)明優(yōu)選非特異性細(xì)胞結(jié)合，但是使用經(jīng)修飾以允許選擇性捕獲含有核酸的期望細(xì)胞的固體支持物也是可能的。能夠特異性結(jié)合細(xì)胞的配體實(shí)例包括某些鐵載體和環(huán)狀分子，例如類固醇分子和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子。"特異性"表示配體僅能夠通過該配體的特異性結(jié)合區(qū)與單一細(xì)胞類型或單一種或?qū)俚募?xì)胞結(jié)合。這可在核酸分離中引入一定程度的選擇性，因?yàn)閺?fù)雜混合物中只有來自期望靶來源的核酸可以分離。因此，例如，這樣的支持物可用于僅從樣品中分離和取出所期望的把細(xì)胞類型等。這類選擇性細(xì)胞捕獲基質(zhì)的制備是本領(lǐng)域公知的，并已描述在文獻(xiàn)中。細(xì)胞與固體支持物結(jié)合，然后可通過移出結(jié)合有細(xì)胞的固體支持物或通過移出(例如通過傾倒)樣品的其余部分而將細(xì)胞與樣品的其余部分分離。當(dāng)固體支持物有磁性時(shí)，對支持物/細(xì)胞復(fù)合物的操作特別方便。洗脫涉及破壞細(xì)胞與固體支持物之間的相互作用。如上所述，該相互作用可以經(jīng)由與固體支持物結(jié)合的配體來實(shí)現(xiàn)。根據(jù)本發(fā)明，洗脫不涉及使用竟?fàn)幏肿訉?shí)現(xiàn)這種破壞。竟?fàn)幏肿邮且韵率龇绞浇Y(jié)合第二分子或第二分子區(qū)域的分子所述結(jié)合阻止或阻礙至少一個(gè)其它分子與第二分子或第二分子區(qū)域的結(jié)合。所述竟?fàn)幏肿雍土硪环肿釉诘诙肿踊虻诙肿訁^(qū)域中的結(jié)合位點(diǎn)可以是相同的或重疊的?；蛘?，它們可以是不同的，但具有立體限制，意即竟?fàn)幏肿拥慕Y(jié)合將排斥或部分排斥另一分子。例如，竟?fàn)幏肿雍?或另一分子的巨大尺寸可以使得一個(gè)的結(jié)合阻止另一個(gè)接近其結(jié)合位點(diǎn)，即使這些位點(diǎn)彼此不顯著接近?；蛘撸瑑蓚€(gè)結(jié)合區(qū)可以在它們所在分子的一級結(jié)構(gòu)中彼此分離，但是由于該分子所采取的三級構(gòu)象而彼此接近。當(dāng)細(xì)胞借助于固定在固體支持物上的配體與該固體支持物結(jié)合時(shí)，細(xì)胞/固體支持物復(fù)合物可以被對應(yīng)于該復(fù)合物組分的竟?fàn)幏肿悠茐?。例如，竟?fàn)幏肿涌梢耘c固體支持物上的配體或細(xì)胞上的結(jié)合配偶體相同，或者是其保留發(fā)揮竟?fàn)幏肿庸δ艿哪芰Φ钠?、類似物或同系物。竟?fàn)幏肿右部梢耘c配體或結(jié)合配偶體中參與結(jié)合反應(yīng)的區(qū)域相同，或者是其保留發(fā)揮竟?fàn)幏肿庸δ艿哪芰Φ钠巍㈩愃莆锘蛲滴?。竟?fàn)幏肿涌梢宰鳛楦蠓肿拥囊徊糠侄嬖凇Ｍǔ＞範(fàn)幏肿踊蚱渌诜肿釉谌芤褐袑⑹怯坞x的。因此，如果結(jié)合在配體A與結(jié)合配偶體B之間發(fā)生，則竟?fàn)幏肿涌梢允茿或其片段、類似物或同系物?；蛘呔?fàn)幏肿涌梢允荁或其片段、類似物或同系物。通常竟?fàn)幷邞?yīng)適當(dāng)?shù)剡^量于A或B。技術(shù)人員將能夠設(shè)計(jì)不包括竟?fàn)幏肿拥暮线m洗脫條件。通常會(huì)使用適用于要使用的細(xì)胞和固體支持物的洗脫液。洗脫液的優(yōu)化將不會(huì)過分繁冗。合適的洗脫液的例子是水、弱堿性水、牛血清白蛋白(BSA)水溶液，以及水性鹽溶液如氯化鈉、氯化鐘或氯化鎂。洗脫液可以用常用的緩沖液如Tris和MOPS進(jìn)行緩沖。洗脫液的選擇可受到將使用的下游檢測方法的影響。例如，如果PCR是選擇的擴(kuò)增技術(shù)，則洗脫液可包含適當(dāng)水平的氯化鎂用于PCR反應(yīng)。事實(shí)上，已經(jīng)顯示，洗脫可以用適用于后續(xù)擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)緩沖液來進(jìn)行，并且這是本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案。例如，如果SDA是選定的擴(kuò)增反應(yīng)，則洗脫液可以便利地是SDA反應(yīng)緩沖液，這樣，洗脫產(chǎn)物可以直接用于SDA反應(yīng)。洗脫可以在室溫下進(jìn)行，但是可以通過在升高的溫度(例如30-45x:)下進(jìn)行洗脫步驟來幫助洗脫。如下文所述，細(xì)胞的裂解可以通過加熱細(xì)胞來實(shí)現(xiàn)，因此存在一個(gè)能增強(qiáng)洗脫但又不發(fā)生裂解的溫度窗口。該窗口的位置會(huì)取決于涉及的細(xì)胞。例如，病毒和適應(yīng)力強(qiáng)的細(xì)菌如分枝桿菌和衣原體合理地是抗熱的，因此所述窗口相對較大。對于更脆弱細(xì)胞如真核細(xì)胞而言，所述窗口將較小。然而如下文所述，可能期望在方法的這一步中裂解所分離的細(xì)胞。靶細(xì)胞的檢測通過檢測乾細(xì)胞的特征性序列來實(shí)現(xiàn)，其中使用通?；诤怂釘U(kuò)增的核酸檢測技術(shù)。許多類型的擴(kuò)增反應(yīng)是本領(lǐng)域已知的，如上所述，PCR、SDA、LAR、3SR和Q-p復(fù)制酶擴(kuò)增系統(tǒng)都是常見的例子。優(yōu)選的擴(kuò)增方法是PCR和SDA及其改良形式，例如使用嵌套引物和實(shí)時(shí)PCR(核酸擴(kuò)增技術(shù)的綜述參閱如Abramson和Myers，1993,CurrentOpinioninBiotechnology,4:41-47，SDA的描述參閱如Walker等1992NucleicAcidResearch，20:1691-1696)。可以通過本領(lǐng)域描述的許多手段對基于PCR的步驟或其它檢測步驟的結(jié)果進(jìn)行檢測或顯影。例如，可以在電泳凝膠(例如溴化乙錠染色的瓊脂糖凝膠)上使用已知技術(shù)對PCR或其它擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳?；蛘?，可使用DIANA系統(tǒng)，這是嵌套引物技術(shù)的改良形式。在DIANA(固定4t擴(kuò)增核酸的檢測(DetectionofImmobilisedAmplifiedNucleicAcids))系統(tǒng)(參閱Wahlberg等，Mol.CellProbes4:285(1990))中，內(nèi)部的第二對引物分別帶有用于固定以允許捕獲擴(kuò)增的DNA的手段，以及用于附著標(biāo)簽以允許識別的標(biāo)簽或手段。這提供了下述雙重優(yōu)點(diǎn)降低的背景信號以及用于檢測擴(kuò)增DNA的快速且簡單的手段。任選地，可以向本發(fā)明的方法中引入一個(gè)或多個(gè)洗滌步驟。特別是與支持物結(jié)合的細(xì)胞在從樣品中分離出來后可以經(jīng)受至少一次洗滌步何溶液作為洗滌緩沖液。一般而言，優(yōu)選低到中度離子強(qiáng)度的緩沖液，例如pH8.0的10mMTris-HCl/10mMNaCl。將BSA摻入洗滌緩沖液中也是一種選擇。必要時(shí)也可以使用其它標(biāo)準(zhǔn)的洗滌介質(zhì)(例如含醇的)，例如用70%乙醇洗滌。優(yōu)選70%乙醇或PBS的洗滌溶液。便利地，洗滌溶液和結(jié)合溶液可以相同。裂解通過物理手段實(shí)現(xiàn)，即不需要裂解性化學(xué)品。這包括加熱、滲透沖擊(osmoticshock)、聲裂法、冰凍和微波處理?？?吏用一種或多種這些處理，并優(yōu)選通過將細(xì)胞在合適的溫度下加熱合適的時(shí)間和/或?qū)⒓?xì)胞在低滲溶液中洗脫來實(shí)現(xiàn)裂解。優(yōu)選將細(xì)胞加熱至50*0至95"C，更優(yōu)選55X:至85"C，最優(yōu)選60t:至80"。加熱的持續(xù)時(shí)間應(yīng)取決于細(xì)胞將加熱到的溫度和涉及的細(xì)胞類型，但是通常通過加熱至少5分鐘、優(yōu)選至少7分鐘、最優(yōu)選至少10分鐘實(shí)現(xiàn)裂解。低滲溶液優(yōu)選為水。這種簡單方式的裂解是特別合適的，因?yàn)椴恍枰獙⑨尫诺暮怂崤c固體支持物結(jié)合。被洗脫的細(xì)胞可直接用在核酸檢測方法中，通常用于核酸擴(kuò)增反應(yīng)中。為了將核酸用于擴(kuò)增，細(xì)胞的裂解是必需的，但是不需要單獨(dú)的裂解步驟或者組合的洗脫和裂解步驟，擴(kuò)增反應(yīng)中設(shè)計(jì)成使核酸變性的初始加熱步驟也可以用于裂解細(xì)胞。在這種情況下，優(yōu)選通過將細(xì)胞加熱至8on至ioox:、更優(yōu)選卯ic至98x:、最優(yōu)選卯k:至9sx:來進(jìn)行裂解。因此，在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中提供了用于檢測樣品中靶細(xì)胞存在與否的方法，所述方法包括(a)將所述樣品中的細(xì)胞與微粒狀并且可混合的固體支持物結(jié)合；(b)將細(xì)胞從該固體支持物上洗脫而不使用竟?fàn)幏肿悠茐募?xì)胞與固體支持物之間的相互作用；(c)通過加熱裂解被洗脫的細(xì)胞；和(d)檢測所述靶細(xì)胞的特征性核酸存在與否，其中所述固體支持物上沒有固定抗體或抗體片段。使用上述洗脫液的洗脫步驟可以完全或部分地在上述裂解溫度下進(jìn)行，從而洗脫和裂解可以在一個(gè)便利的步猓中實(shí)現(xiàn)。然后可以將得到的產(chǎn)物直接用于擴(kuò)增反應(yīng)。這使得檢測方法非常簡單和便利。因此，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于檢測樣品中靶細(xì)胞存在與否的方法，所述方法包括(a)將所述樣品中的細(xì)胞與微粒狀并且可混合的固體支持物結(jié)合；(b)在足夠高的溫度下將細(xì)胞從固體支持物洗脫而不使用竟?fàn)幏肿悠茐募?xì)胞與固體支持物之間的相互作用，以引起所述細(xì)胞的裂解；和(c)檢測所述乾細(xì)胞的特征性核酸存在與否，其中所述固體支持物上沒有固定抗體或抗體片段。實(shí)施本發(fā)明方法所需的多種試劑和成分可便利地以試劑盒形式提供。這樣的試劑盒代表了本發(fā)明的另一方面。最簡單而言，本發(fā)明的這一方面提供了用于檢測樣品中靶細(xì)胞存在與否的試劑盒，所述試劑盒包含(a)微粒狀并且可混合的固體支持物，其中所述固體支持物上沒有固定抗體或抗體片段；任選的(b)用于使細(xì)胞結(jié)合所述固體支持物的手段；任選的(c)洗脫液；和任選的(d)用于檢測所述靶細(xì)胞的特征性核酸存在與否的手段。多種手段(b)、(c)和(d)和固體支持物可以如上文關(guān)于本發(fā)明方法的描述和討論。典型的試劑盒可包含固體支持物(例如包被有多糖如角叉菜膠或者蛋白質(zhì)如凝集素的磁性微粒)、結(jié)合/洗滌緩沖液(例如PBS)和洗脫液(例如SDA反應(yīng)緩沖液)。任選的成分(d)可包括在基于擴(kuò)增的檢測技術(shù)中使用的適當(dāng)?shù)囊锕押塑账嵝蛄?。任選地，這樣的試劑盒中還可包括緩沖液、鹽、聚合物、酶等。使用該試劑盒的合適方案將為如下，所述方案假定選擇磁性或可磁化的珠子作為固體支持物(a):-組合結(jié)合緩沖液(b)和珠子，添加尿樣的等分試樣并混合(例如在Eppendorf管中)，-置于磁體影響下，并允許細(xì)菌/珠子復(fù)合物移動(dòng)至管的側(cè)面，-吸出并棄去上清液，-洗滌珠子并移出上清液，-添加洗脫液(c)并在80"C下孵育，-使用磁體將珠子與上清液分離，移出上清液的等分試樣并用作PCR反應(yīng)中的模板，所述PCR反應(yīng)使用對靶細(xì)胞特征性核酸具有特異性的引物，其任選地由組分(d)提供。在另一方面中，本發(fā)明提供了用于檢測樣品中靶細(xì)胞存在與否的方法，所述方法包括(a)將所述樣品中的細(xì)胞與微粒狀并且可混合的固體支持物結(jié)合；(b)用簡單洗脫液將細(xì)胞從固體支持物上洗脫；(c)裂解所述細(xì)胞后，檢測所述靶細(xì)胞的特征性核酸存在與否，其中所述固體支持物上沒有固定抗體或抗體片段。細(xì)胞的洗脫使用簡單洗脫液來實(shí)現(xiàn)。"簡單洗脫液"表示實(shí)現(xiàn)洗脫而不使用竟?fàn)幏肿悠茐募?xì)胞與固體支持物之間相互作用的任何溶液，所述相互作用可通過與固體支持物結(jié)合的配體來實(shí)現(xiàn)。上文討論的洗脫液均被認(rèn)為是合適的洗脫液?，F(xiàn)在將在以下的非限制性實(shí)施例中參照附圖更詳細(xì)地描述本發(fā)明，在附圖中圖l是凝膠的照片，其顯示來自從樣品中分離的沙眼衣原體的PCR產(chǎn)物，所述樣品先前根據(jù)實(shí)施例1的方法證實(shí)為沙眼衣原體陽性(通過鏈置換證實(shí)，BDProbeTec)。M:標(biāo)記物；U1-U11:樣品；(+)/(-):初始孵育時(shí)用/不用磁性混合。圖2是來自兩種不同樣品的擴(kuò)增產(chǎn)物的解鏈分析，所述樣品在不同的洗滌條件下根據(jù)實(shí)施例2的方法分離，A:樣品2;B:樣品3。圖3是不同擴(kuò)增產(chǎn)物的解鏈分析，所述擴(kuò)增產(chǎn)物來自在不同洗滌條件下根據(jù)實(shí)施例3的方法分離的樣品(A)和根據(jù)BugsnBeads方案(GenpointAS，Norway)分離的樣品(B)(Refseth等，2004,AmericanBiotechnologyLaboratory,June,p26-28)。圖4是得自核酸逆轉(zhuǎn)錄的cDNA的實(shí)時(shí)PCR分析，所述核酸分離自人呼吸道合胞病毒(hRSV)的合并臨床樣品10-3稀釋度的一式三份樣品(a、b和c)。實(shí)施例1使用以下樣品制備方案與PCR分析的組合來分析十一種尿樣，所述尿樣先前通過市售的檢測系統(tǒng)(BDProbeTec,BectonDickinson)確定為沙眼衣原體陽性。手工向1.5ml樣品管中添加700jil尿樣(四個(gè)平行重復(fù))，并裝入TecanMiniprep75的樣品架運(yùn)栽體(samplerackcarrier)內(nèi)。分離操作的其余部分自動(dòng)進(jìn)行。將BUGS'nBEADSTMBW緩沖液(GenpointAS，Norway)和300ng磁珠(U曙版，GenpointAS,Norway)加入樣品中。賻育期間對一半樣品進(jìn)行磁混合。孵育15分鐘后，使用磁性分離器將細(xì)菌/珠子復(fù)合物固定在管的側(cè)面并去除上清液。用70%EtOH洗滌珠子一次，重懸于100nl水中并在80"C孵育10分鐘，以去除殘余的乙醇。孵育后通過磁性分離固定珠子，并將15jil上清液轉(zhuǎn)移至預(yù)先裝入PCR預(yù)混物(mastermix)的PCR板。將PCR板轉(zhuǎn)移至MJOpticon實(shí)時(shí)機(jī)器上用于擴(kuò)增。按如下進(jìn)行PCR擴(kuò)增。50fil的總體積使用15jil模板。使用20pmol置于沙眼衣原體隱蔽性質(zhì)粒中的引物(正向5'GCAAAAATACACTTGTGGGAGAA3'和反向5'GGTGCTCAGACTCCGACATAAT3')、0.2mMdNTP、1.25UHotGoldStar(Eurogentec)、5mMMgCl2、lx反應(yīng)緩沖液(Eurogentec)、用于檢測的SYBR綠和0.02%BSA進(jìn)行擴(kuò)增。使用MJOpticon(MJResearch)應(yīng)用以下的PCR程序首先在95"C激活和變性10分鐘，然后是95"C變性15秒、651C退火45秒和721C合成30秒的42個(gè)循環(huán)。將10fil擴(kuò)增產(chǎn)物上樣到用溴化乙錠染色的2%瓊脂糖凝膠上。結(jié)果顯示于圖l中。在測試的十一種尿樣中，七種在所有的平行重復(fù)中均為陽性，一種(U9)使用磁混合時(shí)為陽性，兩種在不使用磁混合樣品的一個(gè)平行重復(fù)中為陽性，一種尿樣(U1)在所有平行重復(fù)中均為陰性。結(jié)果顯示，在初始孵育期間進(jìn)行或不進(jìn)行混合都可以進(jìn)行分離。實(shí)施例2一式三份地用不同洗滌緩沖液測試三種尿樣。所測試的洗滌液1.70%EtOH2.含0.05%BSA的sdH203.來自BUGS'nBEADS試劑盒的經(jīng)稀釋的BW-緩沖液4.來自BUGS'nBEADS試劑盒的BW-緩沖液5.含有0.05%BSA的來自BUGS'nBEADS試劑盒的BW-緩沖液使用以下樣品制備方案與PCR分析組合來分析三種尿樣，所述尿樣先前通過市售的檢測系統(tǒng)(BDProbeTec，BectonDickinson)確定為沙眼衣原體陽性。手工向1.5ml樣品管中添加700jil每種尿樣(四個(gè)平行重復(fù))，并裝入TecanMiniprep75的樣品架運(yùn)栽體內(nèi)。分離操作的其余部分由自動(dòng)系統(tǒng)進(jìn)行。將BUGS'nBEADSTMBW緩沖液和300嗎磁珠(U-形式)加入樣品中。孵育期間對一半樣品進(jìn)行磁混合。孵育15分鐘后，使用磁性分離器將細(xì)菌/珠子復(fù)合物固定在管的側(cè)面并去除上清液。然后用洗滌溶液l到5之一將珠子洗滌一次，重懸于100jil水中并在80"C孵育10+5分鐘，以去除殘余的乙醇。孵育后通過磁性分離來固定珠子，將80nl上清液轉(zhuǎn)移至PCR條并將15jil手工轉(zhuǎn)移至預(yù)先裝入PCR預(yù)混物的PCR板。將PCR板轉(zhuǎn)移至MJOpticon實(shí)時(shí)機(jī)器上用于擴(kuò)增。如下進(jìn)行PCR擴(kuò)增。在50jil總體積中使用15nl模板。使用20pmol置于沙眼衣原體隱蔽性質(zhì)粒中的引物(正向5'GCAAAAATACACTTGTGGGAGAA3，和5，GGTGCTCAGACTCCGACATAAT3，、0,2mMdNTP、1.25UHotGoldStar(Eurogentec)、5mMMgCl2、1x反應(yīng)緩沖液(Eurogentec)、用于檢測的SYBR綠(Eurogentec)和0.02%BSA進(jìn)行擴(kuò)增。使用MJOpticon(MJResearch)應(yīng)用以下的PCR程序首先在95"C激活和變性10分鐘，然后是95n變性15秒、65匸退火45秒和721C合成30秒的45個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增后進(jìn)行從60-95°C(0.2C/s)的解鏈曲線分析。結(jié)果顯示在圖2中。所有樣品均存在解鏈曲線，這顯示分離細(xì)菌細(xì)胞后可以使用不同的洗滌溶液，并產(chǎn)生成功的DNA分離。實(shí)施例3制備膿腫分枝桿菌(Mycobacteriumabscessus)的連續(xù)稀釋液(102到10-7),使用70%EtOH作為洗滌液在TecanMinipr印75上進(jìn)行分離步驟，然后用PCR進(jìn)行分析。為了比較，使用手工操作的完整BUGS，nBEADS方案分析樣品。對于機(jī)器人分離，在PCR中使用30jil模板，而手工分離的樣品則使用15nl。用于機(jī)器人分離的方案如下。平行地手工向1.5ml樣品管中添加700nl每種樣品。然后添加BUGS，nBEADSTMBW緩沖液和300fig磁珠(U-形式)。室溫孵育15分鐘后，使用磁性分離器將細(xì)菌/珠子復(fù)合物固定在管的側(cè)面并去除上清液。用70%EtOH洗滌珠子一次，重懸于100nl水中并在80"C孵育10+5分鐘，以去除殘余的乙醇。孵育后通過磁性分離來固化珠子，并將80nl上清液轉(zhuǎn)移至PCR條中。然后將自動(dòng)分離的15fil模板和手工分離的30fil模板轉(zhuǎn)移至PCR板。然后將PCR板轉(zhuǎn)移至MJOpticon實(shí)時(shí)機(jī)器上用于擴(kuò)增。如下進(jìn)行PCR擴(kuò)增。在50jil總體積中使用15nl/30jil模板。使用20pmol置于分枝桿菌特異性hsp56基因中的引物(正向5,ACCAACGATGGTGTGTCCAT3，和5，CTTGTCGAACCGCATACCCT3,、0.2mMdNTP、1.25UHotGoldStar(Eurogentec)、5mMMgCl2、lx反應(yīng)緩沖液(Eurogentec)、用于檢測的SYBR綠(Eurogentec)和0.02%BSA進(jìn)行擴(kuò)增。使用MJOpticon(MJResearch)應(yīng)用以下的PCR程序首先在95"C激活和變性10分鐘，然后是95"變性15秒、65C退火45秒和72匸合成30秒的45個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增后進(jìn)行從60-95°C(0.2C/s)的解鏈曲線分析。結(jié)果顯示在圖3中。解鏈曲線的存在表明分離了來自分枝桿菌的DNA，因此這些數(shù)據(jù)是該分離方案可用于膿肺分枝桿菌的證據(jù)。解鏈曲線與使用完整BUGS'nBEADS步驟實(shí)現(xiàn)的解鏈曲線相當(dāng)，因此本分離方案與完整的BUGS'nBEADS步驟相當(dāng)。實(shí)施例4使用實(shí)施例1中所述方法在TecanMiniprep75移液機(jī)器人上與SDA—起分析尿樣，所述尿樣先前使用完整BUGS'nBEADS方案和鏈置換擴(kuò)增(SDA)(BDProbetec，BectonDickinson)確定為陽性或陰性。測試了以下參數(shù)BUGS'nBEADS試劑盒的C和U形式珠子70%乙醇作為洗滌緩沖液來自BUGS，nBEADS試劑盒的BW緩沖液作為洗滌緩沖液含有0.05%BSA的來自BUGS'nBEADS試劑盒的BW緩沖液作為洗滌緩沖液通過與SDA反應(yīng)緩沖液(BDProbeTec稀釋液)在室溫下孵育10分鐘進(jìn)行洗脫通過與SDA反應(yīng)緩沖液(BDProbeTec稀釋液)在80"C下孵育10分鐘進(jìn)行洗脫通過與SDA反應(yīng)緩沖液(BDProbeTec稀釋液)在80X:下孵育5分鐘然后在室溫下孵育5分鐘進(jìn)行洗脫所有樣品均平行分離，一個(gè)用于測試沙眼衣原體(CT)，一個(gè)用于擴(kuò)增對照(amplificationcontrol,AC)以使對鏈置換擴(kuò)增的任何可能抑制可見。AC不包括在完整BUGS'nBEADs步驟中。DNA分離后，根據(jù)BDProbetec手冊進(jìn)行SDA。結(jié)果顯示于下表l中。所有先前確定為陽性的沙眼衣原體樣品使用實(shí)施例1中所述方法均顯示為陽性。BUGS'nBEADS試劑盒(Genpoint)的C形式和U形式珠子均給出了陽性的結(jié)果，證明可使用不同的固體支持物。所有的AC均高于ProbeTec試劑盒制造商所定義的抑制樣品取舍點(diǎn)(cut-off)。不管使用何種洗滌緩沖液和洗滌后的洗脫條件，對沙眼衣原體均獲得陽性結(jié)果。這顯示在室溫下洗脫仍然是有效的。這顯示裂解所分離的細(xì)胞不是必需的。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>CT:使用鏈置換擴(kuò)增對沙眼衣原體的MOTA值A(chǔ)C:使用鏈置換擴(kuò)增對擴(kuò)增對照的MOTA值=:抑制GZ-灰區(qū)(grayzone)*來自BUGS'nBEADS試劑盒的C形式珠子實(shí)施例5使用以下的方案一式三份地分析人呼吸道合胞病毒(hRSV)的l(T3稀釋樣品。最初的10-3稀釋液在Copan病毒轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基中從合并的臨床痰樣品產(chǎn)生，所述樣品先前確定為hRSV陽性。手工向1.5ml樣品管中添加100nl稀釋的hRSV樣品(三個(gè)平行重復(fù))。然后添加150ng磁珠(U-形式)。在室溫下孵育15分鐘后，使用磁性分離器將細(xì)菌/珠子復(fù)合物固定在管的側(cè)面并去除上清液。用10mMTris洗滌珠子一次，重懸于50[il水中并在80"C孵育10分鐘。孵育后通過磁性分離來固定珠子，并將45fil上清液轉(zhuǎn)移至已準(zhǔn)備好用于逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的新管中。使用以下的反應(yīng)條件和LightCycler480進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。在20fil的終體積中組合了9jil模板(來自上述步驟的上清液)、六聚體引物(0.02fig/jd)、包含RT酶(20U/jil;RevertAidTMM-MuLVRT，F(xiàn)ermentas)的反應(yīng)混合物和核糖核酸酶如制劑(2U/nl;RiboLock,Fermentas)。然后將反應(yīng)混合物在25"C孵育5分鐘，然后在42"C孵育60分鐘，之后在70匸孵育10分鐘進(jìn)行滅活。然后使用LightCycler480根據(jù)Whiley等J.Clin.Microbiol.2002，40(12):4418-4422進(jìn)行FRETPCR檢測。使用的引物是RSupp(5'-GCCAAAAAATTGTTTCCACAATA-3，)和RSlow(5'-TCTTCATCACCATACTTTTCTGTTA-3')。4吏用的探針是RSV-LCl(5'-GTTGTTCTATAAGCTGGTATTGATGCA-3，熒光素)和RSV-LC2(Cy5-GGAATTCACATGGTCTACTACTGACTGT-3，罅酸鹽)。將18pl預(yù)混物(lx反應(yīng)緩沖液、3.5mMMgCl2、200jiMdNTP和Taq聚合"(HotGoldStar)0.025U/fd、400nM每種引物和200nM每種探針)與2jil模板(逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的產(chǎn)物)一起使用，并首先在95X:孵育10分鐘，然后是95"C10秒、45秒和72"C15秒的45個(gè)循環(huán)。結(jié)果示于圖4。權(quán)利要求1.用于檢測樣品中靶細(xì)胞存在與否的方法，所述方法包括(a)將所述樣品中的細(xì)胞與微粒狀并且可混合的固體支持物結(jié)合；(b)將細(xì)胞從該固體支持物上洗脫，而不使用競爭分子破壞細(xì)胞與固體支持物之間的相互作用；(c)裂解所述細(xì)胞后，檢測所述靶細(xì)胞的特征性核酸存在與否，其中所述固體支持物上沒有固定抗體或抗體片段。2.權(quán)利要求l的方法，其中所述細(xì)胞是原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。3.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述細(xì)胞是革蘭氏陰性菌、柔膜細(xì)菌或衣原體。4.權(quán)利要求3的方法，其中所述細(xì)胞選自百日咳博德特氏菌(丑0n/"e〃fl/leWwss/s)、淋病奈瑟氏菌(AWssw*/"g<fitfir/wee)、肺炎支原體(Afycop/fls附a/mewmo/fiVie)、沙目艮衣原體(C^/fl考W"加cAo附flris)和肺炎衣原體(C^/fl考fif/flr)。5.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述樣品是環(huán)境樣品、臨床樣品或食物樣品。6.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述固體支持物包括珠子。7.權(quán)利要求6的方法，其中所述珠子是磁珠。8.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中樣品中所述細(xì)胞與固體支持物的結(jié)合是非特異性結(jié)合。9.權(quán)利要求8的方法，其中將所述固體支持物在允許樣品中的細(xì)胞與該固體支持物非特異結(jié)合的介質(zhì)存在下與樣品接觸。10.權(quán)利要求9的方法，其中所述允許細(xì)胞與固體支持物非特異結(jié)合的介質(zhì)含有沉淀劑。11.權(quán)利要求10的方法，其中所述沉淀劑是醇和/或鹽和/或聚乙二醇。12.權(quán)利要求ll的方法，其中所述醇選自異丙醇、乙醇、曱醇和正丁醇。13.權(quán)利要求11或12的方法，其中所述鹽選自乙酸鈉、乙酸鉀、氯化鈉、氯化鉀和乙酸銨。14.權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)的方法，其中細(xì)胞與固體支持物的所述結(jié)合借助于固定在該固體支持物上的非特異性細(xì)胞結(jié)合部分來進(jìn)行。15.權(quán)利要求14的方法，其中所述非特異性細(xì)胞結(jié)合部分是多糖，包括甘露糖、半乳糖、脫水半乳糖、葡萄糖、果糖和/或其衍生物。16.權(quán)利要求14或15的方法，其中所述多糖選自GUM1、阿拉伯膠、梧桐膠、瓜爾膠、角叉菜膠、肝素、硫酸類肝素和硫酸葡聚糖。17.權(quán)利要求9以及14至16中任一項(xiàng)的方法，其中所述允許樣品中細(xì)胞與固體支持物非特異性結(jié)合的介質(zhì)是PBS、檸檬酸緩沖液、含有Ca^的溶液或含有Mg^的溶液。18.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其還包括其他步驟，在所述步驟中通過將結(jié)合有細(xì)胞的固體支持物從樣品其余部分中移出而將與固體支持物結(jié)合的細(xì)胞與樣品的其余部分分離。19.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述洗脫在選自以下的洗脫液中進(jìn)行水、弱堿性水、牛血清白蛋白水溶液以及氯化鈉、氯化鉀和/或氯化鎂的水溶液。20.權(quán)利要求19的方法，其中所述洗脫液含有Tris或MOPS。21.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述耙細(xì)胞特征性核酸的存在與否通過基于核酸擴(kuò)增的技術(shù)進(jìn)行檢測。22.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中細(xì)胞的裂解通過加熱和/或通過滲透休克進(jìn)行。23.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中細(xì)胞從固體支持物上的洗脫和裂解在單個(gè)步驟中完成。24.權(quán)利要求23的方法，其中所述裂解通過在低滲溶液中和/或升高的溫度下洗脫來進(jìn)行。25.權(quán)利要求1到22中任一項(xiàng)的方法，其中所述細(xì)胞直接用于核酸檢測方法。26.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，還包括一個(gè)或多個(gè)洗滌步驟。27.用于檢測樣品中靶細(xì)胞存在與否的試劑盒，所述試劑盒包含(a)微粒狀并且可混合的固體支持物，其中所述固體支持物上沒有固定抗體或抗體片段；任選的(b)用于使細(xì)胞結(jié)合所述固體支持物的手段；任選的(c)洗脫液；和任選的(d)用于檢測所述靶細(xì)胞的特征性核酸存在與否的手段。全文摘要本發(fā)明涉及用于檢測樣品中靶細(xì)胞存在與否的方法，所述方法包括(a)將所述樣品中的細(xì)胞與微粒狀可混合固體支持物結(jié)合；(b)將細(xì)胞從固體支持物上洗脫，而不使用競爭分子破壞細(xì)胞和固體支持物之間的相互作用；(c)裂解所述細(xì)胞后，檢測所述靶細(xì)胞的特征性核酸存在與否，其中所述固體支持物上沒有固定抗體或抗體片段。還提供了用于實(shí)施本發(fā)明方法的試劑盒。文檔編號C12Q1/02GK101374960SQ200680046310公開日2009年2月25日申請日期2006年12月12日優(yōu)先權(quán)日2005年12月12日發(fā)明者馬克·安格萊斯迪奧里亞克申請人:簡珀恩特聯(lián)合股份有限公司