專利名稱：：細胞的重新編程和遺傳修飾的制作方法細胞的重新編程和遺傳修飾發(fā)明領域本發(fā)明涉及細胞，具體說是待重新編程細胞的重新編程和遺傳修飾。本發(fā)明特別涉及將細胞重新編程為多能狀態(tài)和遺傳修飾細胞，例如重新編程之前補償這種細胞的遺傳缺陷。發(fā)明背景在胚胎發(fā)育期間，多能細胞分化成許多不同類型的細胞，這些細胞由表觀基因組中特定基因亞組被激活或被抑制而定。顯然，分化的表觀基因組通過核轉(zhuǎn)移到去核卵母細胞中和通過與ES或EG細胞的融合可回復為多能性細胞。在ES與EG-T細胞雜交中，T細胞的失活X染色體、沉默的印記基因和沉默的0ct4-GFP報導轉(zhuǎn)基因被重新激活(Tada等，1977和2001)。然而，ES與EG-T細胞雜交證明在體內(nèi)對所有三個原始胚層都有影響，從而顯示了其多能性(Tada等，1977和2001)。其它研究也證明，中樞神經(jīng)系統(tǒng)、骨髓和脾細胞的核與ES細胞融合后顯示有多能潛力(Matveeva等，1998;Terada等，2002;Ying等，2002)。而且，ES-分化的雜交細胞的體細胞基因組染色質(zhì)狀態(tài)分析顯示獲得了ES細胞基因組的性能(Kimura等，2004)。綜合在一起，這些結果表明雜交細胞不單單是聯(lián)合了二個基因組，而有可能是供體的體細胞基因組經(jīng)歷了全面的重新編程。雖然已通過將體細胞的核轉(zhuǎn)移(SCNT)到去核卵母細胞中產(chǎn)生了活的動物，但成功率極低，大多數(shù)胚胎在發(fā)育早期即死亡(見Hochedlinger和Jaenisch，2003)。主要原因可能是供體基因組重新編程中的錯誤(Humpherys等，2001,2002;Kang等，2001,2002;Xue等，2002;Santos等，2003)。而且在一定比例例子中，早期克隆胚胎顯示了多能性相關基因0ct4的不完全激活，提示大多數(shù)克隆的胚胎不能建立真正的多能胚胎細胞群(Bortvin等，2003)。支持此觀點的是，若無包括從克隆的胚胎產(chǎn)生ES細胞的額外步驟，不可能從B細胞核產(chǎn)生成年小鼠(Hochedlinger和Jaenisch，2002)。因此，需要提高表觀遺傳重新編程的效率?；蚪M重編程也發(fā)生在體內(nèi)。進入生殖嵴10.5dpc-11.5dpc處的原基胚細胞(PGC)經(jīng)歷了基因組的廣泛脫甲基化，沉默的X染色體重新被激活和刪除印記(Hajkova，2002;Sato等，2003;Tam等，1994)。近年來有報導說重新編程是早期胚胎的特征(Mak等，2004;Okamoto等，2004)。在這些研究中，證明X染色體被印記而失活發(fā)生在晚期桑椹胚和胚泡球的所有細胞中。在這些階段，失活的X染色質(zhì)顯示與其它表觀遺傳標記都富含H3-K9二甲基化和H3-K27三甲基化。這是令人驚奇的，因為X染色體失活是細胞分化的一種標志，它的狀態(tài)穩(wěn)定可經(jīng)遺傳傳遞，僅在多能細胞中是可逆的(Wutz和Jaenisch，2000)。至關重要的是，失活的X顯示消除了表觀遺傳標記，并且在外胚層母細胞(epiblast)中4.5dpc附近被重新激活(Mak等，2004;Okamoto等，2004)。出乎意料的是，對植入小鼠卵母細胞中的XX體細胞核中的X染色體進行表觀遺傳動力學分析，顯示其顯然能分化為正常胚胎(Bao等，2005)。卵母細胞不會刪除失活X的表觀遺傳標記三甲基H3-K27，而持續(xù)存在直到發(fā)生X重新被激活時形成外胚層。這提示卵母細胞和外胚層在基因組重新編程上具有不同的性能。產(chǎn)生重新編程的因素不明。然而這些因素必然存在于將產(chǎn)生多能外胚層的胚泡細胞中以及負責ES-分化雜交細胞的X重新激活的ES細胞中。同樣，這些因素也必然存在于遷移到生殖嵴的PGC中和ES細胞中。Nanog蛋白是哺乳動物多能細胞中存在的一種含獨特同源結構域的蛋白質(zhì)，為早期發(fā)育所必需。與胚泡中多能細胞的形成同時發(fā)生的是，雌性XX胚胎中先前已失活的親代染色體被重新激活。重激活限于表達Nanog蛋白的那些細胞而在無Nano蛋白的胚胎中不會發(fā)生。早期胚胎表達Nanog蛋白可能細胞未來是多能外胚層細胞(epiblastcell),其在ES細胞分化和胚胎發(fā)育期間快速下調(diào)(Chambers等，2003;Mitsui等，2003)。此外，當ES細胞過度表達Nanog蛋白時其具有獨特性能，在缺乏其它必須因子Lif和血清(BMP-4)時能自我更新(Chambers等，2003;Ying等，2003)。而且，Nanog蛋白在多能EG細胞中和PGC中表達時，這些細胞發(fā)生重編程(Chambers等，2003;Yamaguchi等，2005)。體外對無Nanog蛋白的ES細胞和分離的內(nèi)細胞塊(InnerCellMasses,ICMs)的特征鑒定顯示這些細胞不能保持在非分化狀態(tài)，而是分化成為內(nèi)胚層樣細胞(Mitsui等，2003)。WT和^Vfl"0g-/-4.5dpc及滯育雌性胚胎的比較研究顯示X染色體重新被激活只發(fā)生在WT胚胎的Nanog表達細胞。WO03/064463描述了Nanog與LIF聯(lián)用來重編程細胞或細胞核。然而，在本文所述的比較性實施例中，發(fā)現(xiàn)Nanog表達不足以誘導重新編程。出于細胞治療的目的，需要遺傳修飾細胞，特別是修飾多能細胞使其產(chǎn)生后代。與細胞核重編程相協(xié)調(diào)，已知可采用(例如)載體來遺傳修飾細胞。例如，已采用SCNT產(chǎn)生的遺傳修飾細胞來治療免疫缺陷(Rideout等，2002)。但是這些方法可能在基因組中留下人造物質(zhì)。細胞治療的產(chǎn)品應是二倍體細胞，但是已知二倍體細胞融合將產(chǎn)生四倍體細胞，此細胞的染色體分離是不均勻的，可能產(chǎn)生各種不同的非整倍體類型細胞(Matveeva等，1998)。這對于管理當局將是不可接受的。因此需要提高細胞核重編程的效率。但如上所述目前的效率低下。也需要在重編程細胞中導入遺傳修飾從而使其產(chǎn)生二倍體后代。本發(fā)明的一個目的是對上述問題進行改進或至少提供一種替代方法。本發(fā)明具體實施方式的一個目的是提供改進的重編程方法和用此法獲得的細胞。本發(fā)明具體實施方式的另一個目的是提供遺傳修飾細胞的方法，任選隨后重編程該修飾的細胞和產(chǎn)生其后代。發(fā)明概述本發(fā)明利用Nanog蛋白的表達和/或MEK抑制劑來重編程細胞。發(fā)明詳述本發(fā)明提供從分化的基因組獲得多能基因組的方法，該方法包括使多能細胞與分化的細胞融合；和在融合的細胞中過度表達Nanog蛋白?？赏ㄟ^在融合步驟之前在多能細胞中過度表達Nanog蛋白，在融合步驟之前在分化細胞中過度表達Nanog蛋白，或即在融合步驟后在融合細胞中過度表達Nanog蛋白而過度表達Nanog蛋白。通過在細胞中導入表達Nanog蛋白的遺傳構建物適當過度表達Nanog蛋白。也可通過在細胞中導入，在存在能提高Nanog蛋白在細胞中表達的培養(yǎng)基組分下培養(yǎng)該細胞來過度表達Nanog蛋白。在本發(fā)明一具體實施方式中，該方法包括使多能細胞與分化細胞融合形成融合細胞；其中用MEK抑制劑處理多能細胞、分化細胞和融合細胞的至少一種?；蛴肕EK抑制劑處理多能細胞和分化細胞二者。已有益地發(fā)現(xiàn)利用Nanog蛋白，通過其直接過度表達，或通過利用(例如)MEK抑制劑使其過度表達，以此方式能提髙獲得具有多能性質(zhì)細胞的效率。據(jù)信用MEK抑制劑處理可導致上調(diào)Nanog蛋白的表達。本發(fā)明人也有益地發(fā)現(xiàn)進一步培養(yǎng)多能細胞后，可獲得含分化細胞基因信息的二倍體細胞。在本發(fā)明的方法中，保持對融合細胞的培養(yǎng)使其自發(fā)性丟失染色體直到其染色體組減少和回復為二倍體。通常所產(chǎn)生的二倍體多能細胞中至少含有一條或多條分化細胞的染色體。因此，可獲得多能細胞將其用于產(chǎn)生分化的后代，其包括來自含有所需基因或所需染色體或其它所需遺傳物質(zhì)的分化細胞的細胞和組織。適合的多能細胞是胚胎干(ES)細胞、胚胎癌(EC)細胞或胚胎生殖腺(EG)細胞，在以下更詳細說明的本發(fā)明具體實施方式中，已成功融合了ES細胞與分化細胞導致產(chǎn)生多能基因組。所述的分化細胞可以是體細胞，通常認為基本上所有的體細胞都適合用于本文所述的應用。所述分化細胞也可以是干細胞，而且認為本發(fā)明的應用不限于任何具體干細胞，而一般可擴大到各種干細胞，特別是神經(jīng)干細胞、造血干細胞等。在本發(fā)明的具體實施方式應用中，當所述分化細胞是神經(jīng)干細胞時已成功地進行了重新編程。可通過各種不同方法提供Nanog蛋白。在一實施方式中，在多能細胞中過度表達Nanog蛋白來提供Nanog蛋白，在另一實施方式中，在分化細胞中表達Nanog蛋白來提供Nanog蛋白。任選地，通常也用含編碼Nanog蛋白的核苷酸序列和適當啟動子的載體轉(zhuǎn)染一種或多種細胞，直接在多能細胞和分化細胞二者或之一中表達Nanog蛋白。優(yōu)選地，本發(fā)明方法可導致Nanog蛋白在多能細胞中過度表達，認為其實際表達水平比ES細胞的內(nèi)源性表達水平高2倍至15倍是適宜的，優(yōu)選高3—10倍，在一個或多個實施例中采用高于正常水平5倍。認為本發(fā)明通?？捎糜诓溉閯游锛毎?，包括小鼠、人、豬、綿羊、牛、山羊，在所有例子中，多能細胞和分化細胞優(yōu)選來自同一種動物。優(yōu)選的還有，多能細胞與分化細胞二者都是小鼠細胞或人細胞。迄今報導ES細胞融合后存在染色體分離不均勻(Matveva等，2005)。然而，按照本發(fā)明，重編程方法包括培養(yǎng)這種融合細胞以獲得二倍體細胞。因此，有益地和令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，按照本發(fā)明的技術，染色體的分離實際上不會不均勻，而可獲得含二倍體染色體組的細胞。這些細胞的分析通常表明它們含有源自多能細胞的染色體和源自分化細胞的染色體的混合物，即混合的染色體。因此，在本發(fā)明的一優(yōu)選實施方式中，使多能細胞與分化細胞融合產(chǎn)生四倍體細胞，所述方法包括獲得該四倍體細胞的后代，和鑒定其后代是否有(例如)自發(fā)性染色體丟失而成為二倍體。實際上，獲得的細胞群中二倍體細胞占很大比例。不想受任何理論的束縛，這二種情況下這些細胞都有高比例的細胞回復為二倍體狀態(tài)，而且培養(yǎng)這些細胞時宜持續(xù)存在Nanog蛋白，真正二倍體細胞有存活優(yōu)勢。因此，獲得了含有衍生自二種最初的原始細胞各自染色體的二倍體細胞群。因此本發(fā)明提供了通過實施所述的重編程步驟，從分化細胞產(chǎn)生體細胞或干細胞的機會，然后培養(yǎng)獲得的作為該融合細胞后代的二倍體多能細胞，并從該二倍體多能細胞產(chǎn)生分化的細胞。本發(fā)明還提供遺傳修飾細胞的方法，該方法包括提供含染色體的第一種細胞，提供含染色體的第二種細胞，使第一種細胞與第二種細胞融合形成融合細胞，和培養(yǎng)該融合細胞以獲得含有第一種細胞至少一個染色體和第二種細胞至少一個染色體的二倍體細胞。任選在第一種細胞、第二種細胞和/或融合細胞中過度表達Nanog蛋白。例如，可用MEK抑制劑處理第一種細胞、第二種細胞和融合細胞的至少一種。第一種細胞和第二種細胞優(yōu)選二者都是二倍體細胞，可以二者都是小鼠細胞或二者都是人細胞。如此獲得的細胞含有源自第一種細胞和第二種細胞的染色體，因此可利用此方法來組合二種不同來源的遺傳物質(zhì)。獲得所產(chǎn)生的二倍體細胞后，可對其檢測以鑒定此二倍體細胞中最終染色體是何種具體組合，需要時可進行選擇以鑒定含有特別需要的染色體組合的細胞。在此方法操作時，優(yōu)選第一種細胞和第二種細胞之一是多能細胞。第一種細胞和第二種細胞之另一種任選是多能細胞，可以是體細胞，任選干細胞。在以下實施例中，另一種細胞是神經(jīng)干細胞。按照本發(fā)明可實現(xiàn)對含有特定染色體組合細胞的選擇。因此，本發(fā)明的一種實施方式包括鑒定含有所需基因拷貝和同一基因被修飾產(chǎn)生的不良拷貝的第一種細胞，鑒定含有不良基因修飾形式的第二種細胞，使第一種細胞與第二種細胞融合，培養(yǎng)該融合細胞，以及鑒定該融合細胞的含有所需基因拷貝和不良基因修飾形式的后代。以此方式，可將第一種細胞和第二種細胞的基因組合而產(chǎn)生沒有遺傳缺陷、沒有不良基因的細胞。不難利用此技術鑒定和分離含或不含所需的染色體/基因組合的細胞，從而獲得沒有缺陷的工程改造的純細胞群或分離細胞。本發(fā)明通常探索用于治愈第一種細胞的遺傳缺陷，此種不良基因是具有缺陷的基因，第二種細胞中該基因的修飾形式能治愈(此缺陷)。本發(fā)明另一實施方式包括將經(jīng)工程改造而改變了某正常內(nèi)源性基因表達的第一種細胞，與含有該內(nèi)源性基因正常拷貝的第二種細胞融合，培養(yǎng)該融合細胞，鑒定含有該基因正?？截惡驮摶蚬こ谈脑煨问蕉叩脑撊诤霞毎暮蟠１景l(fā)明通常通過對某基因表達的補償性改變探索用于治療疾病。對于治療或修飾基因也任選將其經(jīng)工程改造加入第二種細胞內(nèi)，如果不能得到與第一種細胞融合產(chǎn)生正確基因組合的第二種細胞時，此法可能適用。因此本發(fā)明方法中，產(chǎn)生合適的第二種細胞可包括遺傳修飾該第二種細胞，然后與第一種細胞融合將不良基因的修飾形式引入第二種細胞。如與本發(fā)明其它方面內(nèi)容相關的說明中，已發(fā)現(xiàn)所產(chǎn)生的細胞，雖然最初或可能是非整倍體，一般是四倍體，可能以可接受的速率經(jīng)過染色體分離成為二倍體細胞，產(chǎn)生的細胞可用于(例如)進一步培養(yǎng)，產(chǎn)生后代細胞和細胞治療。本發(fā)明另一方面提供細胞融合的方法，該方法包括在存在MEK抑制劑時融合第一種細胞與第二種細胞。第一種細胞優(yōu)選多能細胞，可以是ES、EC或EG細胞。第二種細胞也可以是多能細胞，但優(yōu)選體細胞，更優(yōu)選干細胞。如本文它處所述，可在第一種細胞和/或第二種細胞中表達Nanog蛋白來提供Nanog蛋白。也如本文它處所述，可在存在MEK抑制劑時培養(yǎng)第一種細胞、第二種細胞和/或融合細胞。理想的是采用本發(fā)明方法來獲得二倍體細胞，實施此方法時發(fā)現(xiàn)，含有二種細胞初始合并染色體的最初細胞回復為二倍體狀態(tài)的頻率很高。本發(fā)明方法包括融合第一和第二種細胞產(chǎn)生非整倍體細胞，和培養(yǎng)該融合細胞獲得其二倍體后代。本發(fā)明也提供按本發(fā)明任何一方面方法獲得的細胞。本發(fā)明提供利用細胞進行細胞治療的其它方法，和將本發(fā)明細胞用于制備進行治療，優(yōu)選細胞治療的藥物中的應用。本發(fā)明的治療方法包括給予病人有效量的本發(fā)明細胞。另一種治療方法包括給予患者有效量的經(jīng)遺傳修飾的本發(fā)明細胞。治療可適當?shù)匕ㄨb定需要遺傳修飾的細胞的患者，鑒定治療該患者所需的遺傳修飾，和按本發(fā)明任何一種實施方式的方法制備遺傳修飾的細胞。還有，本發(fā)明在重新編程通過多能細胞與體細胞融合獲得的細胞中采用了Nanog蛋白。所述多能細胞通常是ES細胞，所述體細胞通常是干細胞，在一具體實施方式中是神經(jīng)干細胞。本發(fā)明也提供利用Nanog蛋白來改進體細胞核轉(zhuǎn)移獲得多能細胞的方法。因此，本發(fā)明的核轉(zhuǎn)移方法包括將體細胞的核轉(zhuǎn)移到受體細胞中形成核轉(zhuǎn)移細胞，并在此核轉(zhuǎn)移細胞中過度表達Nanog蛋白。從而實現(xiàn)效率提高的供體體細胞核重新編程。在一實施方式中，本發(fā)明也提供利用MEK抑制劑來改進體細胞核轉(zhuǎn)移獲得多能細胞的方法。因此，本發(fā)明的核轉(zhuǎn)移方法包括將體細胞的核轉(zhuǎn)移到受體細胞中形成核轉(zhuǎn)移細胞，和用MEK抑制劑處理該核轉(zhuǎn)移細胞。從而實現(xiàn)效率提高的供體體細胞核重新編程。所述受體細胞通常是卵母細胞，優(yōu)選去核卵母細胞，也優(yōu)選與供體同種動物的卵母細胞。在本發(fā)明優(yōu)選實施方式中，所述MEK抑制劑是MEK1抑制劑。本領域知道合適的MEK抑制劑例子，包括MEK1抑制劑PD184352和Davies等，2000所述的抑制劑。本發(fā)明的這些和其它方面內(nèi)容所述的最終后代可包括克隆的非人動物(人的克隆形式不是本發(fā)明的一部分)和多能細胞培養(yǎng)物。因此，本發(fā)明的其它實施方式中提供了獲得活的非人動物的方法，包括本發(fā)明的細胞融合或核轉(zhuǎn)移方法，和包括用本發(fā)明的細胞融合或核轉(zhuǎn)移方法獲得多能干細胞培養(yǎng)物的方法。所述供體體細胞更優(yōu)選干細胞，特別是神經(jīng)干細胞。如本文所述通過在供體體細胞中表達來提供Nanog蛋白。也可如本文所述利用MEK抑制劑。如本文所述，MEK抑制劑能上調(diào)Nanog蛋白表達。優(yōu)選在供體體細胞中過度表達Nanog蛋白，其表達水平要高于ES細胞中Nanog蛋白表達的正常內(nèi)源水平，例如比ES細胞內(nèi)源表達的Nanog蛋白水平高2—15倍。本發(fā)明的一實施方式核轉(zhuǎn)移采用含基因缺陷的供體體細胞，用本領域己知方法糾正所得多能細胞中的基因缺陷而用于治療疾病。認為此實施方式通常可用于哺乳動物細胞，包括小鼠、人、豬、綿羊、牛、山羊，在所有例子中，受體卵母細胞和供體體細胞細胞優(yōu)選來自同一種動物。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，所述細胞預先用MEK抑制劑處理。本文所述的Nanog蛋白指WO03/064463中所述的多肽家族，包括所述的優(yōu)選多肽，因此指(例如)含有200-400個氨基酸的多能決定因子的多肽。具體說是，本文SEQIDNO:2代表的小鼠多能決定因子、本文SEQIDNO:4代表的人多能決定因子、本文SEQIDNO:6代表的大鼠多能決定因子和本文SEQIDNO:8代表的獼猴多能決定因子，全面參考了WO03/064463的內(nèi)容并將其納入本文。Nanog蛋白也指能將細胞維持于多能狀態(tài)而在細胞內(nèi)起作用的一種因子，它含有同源域，具體是與本文SEQIDNO:2、4、6或8的同源域序列至少有50%相同性的同源域，或與某給定種類動物細胞的因子相關，與該同種動物的多能決定因子同源域至少有50%序列相同性的同源域。通常，一個同源域長約60個氨基酸，該因子所含的同源域中任一20個氨基酸的片段與SEQIDNO;2、4、6或8同源域至少有35%序列相同。Nanog蛋白還指分離的多肽，其包含(a)含SEQIDNO:2、4、6或8所示氨基酸序列的多肽分子；(b)上述(a)肽分子的天然變體；(c)上述(a)或(b)的直向同源物，和(d)可用于診斷或治療的它們的生物學活性片段、類似物和衍生物。Nanog蛋白還包括SEQIDNO:2、4、6或8多肽(特別是成熟多肽)以及與SEQIDNO:2、4、6或8多肽至少有50%相似性(優(yōu)選至少50%相同性)的多肽，更優(yōu)選與SEQIDNO:2、4、6或8多肽至少有90%相似性(優(yōu)選至少90。/。相同性)，還要優(yōu)選與SEQIDNO:2、4、6或8多肽至少有95%相似性(優(yōu)選至少95%相同性)，也包括這類多肽的某部分，所述部分通常含至少30個氨基酸，更優(yōu)選至少50個氨基酸。二條多肽之間的"相似性"可通過比較一條多肽的氨基酸序列及其保守性氨基酸取代物與另一條多肽的相應序列而確定。已知有多種不同方法可計算序列的相似性和相同性。通常，進行此種計算的合適方法利用程序如Smith-Waterman、BLAST或FASTA，并利用一張或優(yōu)選二張或甚至三張相似性表格進行數(shù)據(jù)庫檢索。Blosum和PAM(PointAcceptedMutation)矩陣是適用于數(shù)據(jù)庫檢索和序列比對的氨基酸相似性矩陣。如果采用Smith-Waterman或FASTA，確保空格開放罰分足夠大應是恰當?shù)?，如果最初進行的檢索沒有發(fā)現(xiàn)任何同源序列，那么可能需要嘗試不同的算法，當開始時采用啟發(fā)式算法BLAST或FASTA之一時尤其如此。在以下本發(fā)明更詳細的實施例中，采用神經(jīng)干細胞作為體細胞，即作為分化的表觀基因組來源。神經(jīng)干(NS)細胞是可擴展的細胞，可對其進行遺傳操作(Conti等，2005)。這些細胞可衍生自胚胎、成人大腦和ES細胞。NS細胞可形成均一細胞群，以可重復方式表達放射狀神經(jīng)膠質(zhì)細胞的形態(tài)和分子特征。此外，移植試驗顯示這些細胞不會轉(zhuǎn)化，甚至在長期擴展后也不轉(zhuǎn)化(Conti等，2005)。在ES細胞中過度表達Nanog蛋白能在ESxNS細胞融合后促進NS細胞基因組的重新編程。另外，Nanog蛋白表達是NS細胞重新編程所必需，如同A^m^-A&S細胞不能產(chǎn)生ES-NS雜交細胞所顯示的那樣。然而，在我們的試驗中，通過在A^7ogV-五S共同細胞中導入轉(zhuǎn)基因而表達Nanog蛋白拯救了這種性能，而在NS細胞中拯救的程度較低。比較了ES-ES與ES-NSFACS分選雜交細胞產(chǎn)生ES-樣集落的能力，提示ES細胞的Nanog蛋白過度表達是重新編程NS細胞基因組所需的唯一因素。在此項研究中，我們分析了編程內(nèi)容的結果，提供了一種依據(jù)Nanog蛋白從分化(細胞)基因組建立多能基因組的系統(tǒng)。在以下更詳細描述的其它實施例中，在胚胎干細胞(ES)中表達的Nanog蛋白使得與神經(jīng)干細胞(NS)融合后獲得多能雜交細胞的頻率提高200倍。這不可能用Nanog蛋白對細胞活力或克隆形成能力的作用來解釋。強迫NS細胞表達Nanog蛋白不能使其轉(zhuǎn)變?yōu)镋S細胞表明，重新編程需要除Nanog蛋白以外的其它因素。然而，表達Nanog蛋白的ES細胞與NS細胞形成多能雜交細胞的效率與沒有重新編程的ESxES相同。這意味著Nanog蛋白水平是將NS細胞表觀基因組重新編程到多能雜交體的唯一限制因素。另外相對正常的但無Nanog蛋白的ES細胞與NS細胞融合后，不能產(chǎn)生任何多能雜交細胞。通過導入Nanog蛋白轉(zhuǎn)基因完全恢復了它們的這種能力。這些發(fā)現(xiàn)證明，雖然Nanog蛋白對維持多能特性是非必需的，但它在原初早期胚胎細胞和分化細胞核的重新編程過程中協(xié)調(diào)形成多能表觀基因組中起關鍵作用。以下也描述了利用MEK抑制劑來提高獲得具有多能性質(zhì)細胞和上調(diào)此種細胞表達Nanog蛋白的效率。業(yè)已證明如果用MEK抑制劑處理細胞可促進融合細胞的重新編程，效果與采用Nanog蛋白轉(zhuǎn)基因相似。在本發(fā)明的另一實施方式中，在細胞重新編程中采用MEK抑制劑。所述細胞優(yōu)選體細胞。在優(yōu)選的實施方式中，所述細胞在體外重新編程。所述細胞優(yōu)選不是融合細胞。還提供重新編程體細胞的方法，包括用MEK抑制劑處理細胞。在此方面內(nèi)容中，能夠重新編程體細胞使之回復為多能細胞，從而能夠不通過細胞融合或核轉(zhuǎn)移產(chǎn)生多能細胞。本文所述的MEK抑制劑指通用的MEK抑制劑。所述的也指MEK1抑制劑，例如PI84352(Davies等，2000)。已發(fā)現(xiàn)PI84352與其它已知MEK抑制劑相比具有更高的特異性和效力?，F(xiàn)通過以下實施例和附圖所述的具體實施方式說明本發(fā)明圖1顯示Nanog蛋白表達是體內(nèi)X重新激活所必需的。圖2顯示Nanog蛋白提高了ES細胞產(chǎn)生ES-分化細胞雜交集落的能力。圖3顯示PEG在細胞活力和分化中的作用。圖4顯示對ES-NS雜交細胞中NS表觀基因組的分析。圖5顯示對融合混合物的FACS分析。圖6顯示Nanog蛋白為產(chǎn)生ES樣ES-NS雜交細胞集落所必需。圖7(補充圖1)顯示雜交克隆的染色體計數(shù)。圖8(補充圖2)顯示刪除轉(zhuǎn)基因Nanog后ES-NS雜交細胞表現(xiàn)出多能性。圖9顯示PD184352在形成多能ES-NS雜交細胞集落中的作用。更詳細說，圖1顯示Nanog蛋白表達是體內(nèi)X重新激活所必需的。(A-D)是Nanog雜合小鼠之間交配產(chǎn)生的雌鼠(XX)4.5dpc和滯育胚胎的Eed和Nanog蛋白的免疫熒光。分圖(A，B)顯示所分析胚胎的完整共聚焦投影圖。箭頭指出的為Nanog蛋白陽性細胞。(C，D)是A和BNanog蛋白陽性胚胎的高倍放大圖。注意Nanog蛋白陽性細胞缺乏的Eed大焦點(白色箭頭)。分圖顯示所分析胚胎的部分共聚焦投影圖。紅箭頭指出細胞核有大的Eed焦點(失活X)的例子。胚胎的細胞核用Dapi復染。(E，F(xiàn))表小結了對4.5(E)和滯育(F)胚胎Nanog蛋白陽性細胞中存在(有Xi)或不存在(無Xi)Eed大焦點的評分。圖2顯示Nanog蛋白提高了ES細胞產(chǎn)生ES-分化細胞雜交集落的能力。(A-F)說明含有用Leishmans染色的雜交集落的平板。包括RH和RHNES細胞與ES04GiP(A)、NS04GiP(胚胎)(B)、NSTGFP(D)、NS04GiP(成人)(E)和MEKTGFP(F)的融合物的評分集落呈現(xiàn)紅綠熒光(見右側的例子)。評分的EF4xNS04GiPGFPIH細胞(C)集落只呈現(xiàn)綠色熒光。所有評分的集落都顯示ES的形態(tài)，評分是在細胞培養(yǎng)期間進行的。(G)是RH、RHN、EF4、EF4cre3、ES04GiP、NS04GiP(胚胎)禾口NSTGFP細胞中的Nanog、Oct4和Sox2蛋白水平的分析，a-微管蛋白用作加樣對照。注意ES04GiP細胞在嘌呤霉素選擇下培養(yǎng)，受Oct4調(diào)控序列的驅(qū)動，因此其代表了相對純的ES細胞群。圖3顯示PEG在細胞活力和分化中的作用。(A)直方圖表明RH和RHN細胞經(jīng)PEG處理24小時后，貼附于100mm平板的ES細胞數(shù)。接種了106個細胞。(B)說明含有用堿性磷酸酶(AP)染色的RH和RHN細胞集落的96孔板。使PEG處理和不處理的細胞在培養(yǎng)板中靜置4小時，然后用胰蛋白酶消化，將FACS分選的單個細胞移入96孔板。然后培養(yǎng)細胞12天。(C)表小結了96孔板的數(shù)據(jù)。圖4顯示對ES-NS雜交細胞中NS表觀基因組的分析。(A-D)是XXNSTGFP、XYRH、XYRHN、XXXYRH-NSTGFP和XXXYRHN-NSTGFP細胞中的三甲基H3-K27(me3H3-K27)(A)、泛素化H2A(ubH2A)(B)、Xist的RNAFISH(C)和Oct4(D)的免疫熒光照片。黃色箭頭指出XXNSTGFP細胞中存在me3H3-K27、ubH2A或XistRNA核小體。顯示這些標記的細胞百分比以黃色標出。白色箭頭表示存在Oct4或XistRNA的新生轉(zhuǎn)錄物。顯示有預期等位基因表達的細胞百分比用白色標出。所有細胞核用Dapi復染。(E)是NSTGFP、NS04GiP、RH、RHN、RH-NSTGFP(克隆1禾卩2)禾口RHN-NSTGFP(克隆1禾卩2)細胞中Blbp、01ig2和Oct4的RT-PCR分析。Gapdh用作普遍表達的對照cl-克隆。圖5顯示對融合混合物的FACS分析。(A-C)說明檢測RHxNSTGFP、RHNxNSTGFP、RHNxES04GiP、RHNxMEFTGFP禾口RHNxTTGFP細胞的紅綠熒光的FACS散點圖。(A)提供了對雜交細胞群的分析和FACS分選進行門控的模擬融合物；(B)PEG處理后24小時的融合混合物；(C)B門內(nèi)的FACS分選雜交細胞的純度核査。(D)接種B門內(nèi)分選的雜交細胞，根據(jù)每一次接種的雜交細胞形成集落的百分率對形成的集落評分。這些評分說明了FACS分選細胞的純度。(E)表示重復實驗的評分。圖6顯示Nanog蛋白為產(chǎn)生ES樣ES-NS雜交細胞集落所必需。(A，B)說明含有經(jīng)堿性磷酸酶染色的RCxNS04GiP、RCAV-xNS04GiP、RCA-ANZxNS04GiP、RCA-/-xNS04GiPNP、RCB-AxNS04GiP、RCB-ANZxNS04GiP、RCB-AxNS04GiPNP細胞之間融合產(chǎn)生的雜交細胞集落的平板。各平板圖下顯示了評分。(D)ES04GiP、RC、RCA-A、RCB-/-、RCA-/-NZ、RCB-/-NZ、NS04GiP禾口NS04GiPNP細胞中的Nanog、Oct4和Sox2蛋白水平分析，采用a-微管蛋白作為加樣對照。(E)ES04GiP、NS04GiPNP和NS04GiP細胞中Blbp、01ig2、GFP和Oct4的RT-PCR分析。Gapdh用作普遍表達的對照。(F)PEG在RC、RCB-A禾口RCB-/-NZ細胞活力中的作用。直方圖表明經(jīng)PEG處理24小時后貼附于100mm平板的ES細胞數(shù)。接種了2乂106個細胞。圖7(補充圖1)顯示雜交克隆的染色體計數(shù)。實施例顯示RH-NS04GiP(A)、RHN-NS04GiP(B)、RH-NSTGFP(C)和RHN-NSTGFP(C)的分裂中期(染色體)分散情況。計數(shù)了每個雜交細胞系3個克隆8—n個細胞的分裂中期染色體數(shù)，在各圖下方示出。cl-克隆。圖8(補充圖2)顯示刪除轉(zhuǎn)基因Nanog后ES-NS雜交細胞表現(xiàn)出多能性。(A)EF4和神經(jīng)干細胞(NS)04GiPRB細胞的示意圖。EF4細胞含有組成性表達的側接loxP位點的Nanog蛋白轉(zhuǎn)基因，可用cre重組酶刪去Nanog而導致GFP組成性表達。NS04GiPRB含有受Oct4啟動子序列驅(qū)動的GFP轉(zhuǎn)基因和能組成性表達紅色熒光素轉(zhuǎn)基因。灰色框表示IRES序歹ij。(B)EF4-NSRB04GiP雜交細胞呈現(xiàn)綠(GFP)和紅色(dsRED)熒光。這些標記是供體NS細胞基因組表達的。(C)cre刪除Nanog基因后的EF4-NSRB04GiP細胞。注意GFP表達增加。(D)說明EF4-NSRB04GiPcre雜交細胞的胚胎樣小體(EB)分化。(E)分化(diff)第3、5、7和8天時EF4-NS04GiPRBcreEB細胞中T-brachyury(短尾表型相關基因)表達的RT-PCR分析。也分析了未分化雜交細胞和親代/供體細胞系。Gapdh用作普遍表達的對照。(F)接種的EBs細胞ot-肌動蛋白(藍色)的免疫熒光照片。圖9顯示對PD184352在形成多能ES-NS雜交細胞集落中作用的分析。(A-C)RHxNSTGFP融合細胞紅綠熒光的FACS分析。(A)PEG處理后24小時的融合混合物；(b)A門內(nèi)的FACS分選雜交細胞的純度核查。(C)接種A中分選的雜交細胞，根據(jù)每一次接種的雜交細胞形成集落的百分率對形成的集落評分。這些評分說明了FACS分選細胞的純度。(D)數(shù)據(jù)小結。(E)雜交細胞集落形態(tài)的舉例。實施例l早期胚胎中表達Nanog蛋白是必須的并且與漸進性X重新激活相關己知X-染色體的體內(nèi)重激活發(fā)生在雌性胚胎外胚層母細胞的4.5dpc周圍(Mak等，2004;Okamoto等，2004)。為了研究假定Nanog蛋白在體內(nèi)參與重編程，我們用免疫熒光法檢查了4.5dpcNanog-A胚胎的Eed和Nanog蛋白表達。Eed是胚胎植入前X染色體失活的標志(Silva等，2003;Mak等，2004;Okamoto等，2004)。Nanog-A之間交配產(chǎn)生的25只胚胎有6只缺乏Nanog蛋白染色，其中4只為雌性。Nanog蛋白陰性胚胎顯示其所有的核存在一個大的Eed焦點，除去凋亡和Eed染色極差的細胞外(圖1A)。雌性Nanog蛋白陽性胚胎顯示有不同數(shù)量的Nanog蛋白陽性ICM細胞(圖1E)。與此胚胎其余部分相反，一定比例的這些細胞不呈現(xiàn)Eed焦點，這與X重激活相一致(圖1C，E)。Nanog-A胚胎一般較小。為確定這是否是因為發(fā)育遲緩所致我們分析了滯育的6.5dpc胚胎(圖1B)。31只被檢胚胎中8只缺乏Nanog蛋白染色，其中3只為雌性。如同4.5dpc胚胎，這些胚胎的所有細胞中也呈現(xiàn)存在Eed焦點。相反，雌性Nanog蛋白陽性胚胎的幾乎所有Nanog蛋白陽性細胞不呈現(xiàn)Eed焦點(圖1D-F)。結論，此數(shù)據(jù)表明Nan0g-/-雌性胚胎不能重激活沉默的X-染色體，提示Nanog蛋白在外胚層基因重編程中起作用。實施例2過度表達Nanog蛋白的ES細胞產(chǎn)生ES樣ES-分化細胞雜交集落的能力增強為研究Nanog蛋白是否參與重編程，我們利用了ES細胞與其它ES、NS、小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)和胸腺細胞(T)的融合細胞，測定WT細胞和受Nanog操縱的細胞產(chǎn)生ES樣ES-分化細胞雜交集落的能力。用三種不同的細胞融合方法，即電融合、聚乙二醇(PEG)介導的融合和共培養(yǎng)時細胞的自發(fā)融合(Matveeva等，1998;Terada等，2002;Ying等，2002)預先產(chǎn)生多能雜交細胞。我們用PEG誘導的融合產(chǎn)生雜交細胞時，起初用組成性表達紅色熒光素和潮霉素抗性基因的RHES細胞，和過度表達Nanog蛋白的RHES衍生細胞RHN。使這些細胞與攜帶有含小鼠Oct4基因調(diào)控序列的轉(zhuǎn)基因的ES和NS細胞二者融合(Yeom等，1996)，產(chǎn)生了GFP和嘌呤霉素抗性(04GiP)(Ying等，2002)。此轉(zhuǎn)基因只在多能細胞中表達，因此ES-NS細胞融合后只有當NS細胞基因組重編程時才發(fā)生這種重激活。NS細胞衍生自14.5dpc胚胎的前腦。為了在不同的融合對中產(chǎn)生可比較的結果，采用同樣的參數(shù)同時進行融合。ES細胞與ES或NS細胞融合成功后，培養(yǎng)平板中出現(xiàn)了耐藥的紅色和綠色熒光細胞集落。這些集落恒定地顯示ES形態(tài)但核增大。獨立于Nanog蛋白表達，ES細胞之間的融合產(chǎn)生了含有大量雜交集落的平板(圖2A)。相反，ESxNS細胞融合結果不同。與RHxNS04GiP融合相比，RHNxNS04GiP融合顯示產(chǎn)生了數(shù)量高得多的集落，相差約200倍(圖2B)。為了驗證表達Nanog蛋白的ES細胞產(chǎn)生ES-NS雜交細胞集落的能力增強，我們用固定的NanogES細胞(EF4)和cre刪除的衍生EF4cre3細胞進行了實驗(Chambers等，2003)。使這些細胞與攜帶有能賦予組成性潮霉素藥物抗性的第二種轉(zhuǎn)基因CAG-egfp-Ires-Hygro(GFPIH)的NS04GiP衍生細胞融合。EF4細胞系原先顯示在缺乏LiF時能自我更新，而EF4cre3細胞系在胚泡注射后能產(chǎn)生嵌合體(Chambers等，2003)。與以上結果一致，EF4xNS細胞融合產(chǎn)生了大量的耐藥性集落，而EF4cre3xNS細胞融合不能產(chǎn)生耐藥性集落(圖2C)。為了進一步鑒定此現(xiàn)象，我們采用了能組成性表達融合蛋白TAUGFP和嘌呤霉素抗性基因的獨立NS細胞系TGFP(Pratt等，2000)。使這些細胞與RH和RHNES細胞融合。獲得的結果仍然相反，與RHNxNSTGFP融合產(chǎn)生了大量的雜交集落，而RHxNSTGFP融合只產(chǎn)生了一個雜交集落(圖2D)。此現(xiàn)象也見于ESxNS(ES和成年衍生的)融合物，以及較低程度見于ESxT禾口ESxMEF融合物(圖2E，F(xiàn))。為更詳細檢查此種相關性，我們比較了細胞系之間的Nanog、Oct4和Sox2水平(圖2G)。在RHN和EF4ES細胞中測到高水平的Nanog蛋白，而發(fā)現(xiàn)其余的ES細胞系Nanog蛋白水平類似地較低。就EF4和EF4cre3細胞系而言，測得的Nanog蛋白水平相差5倍(Yates和Chambers,2005)。所用的所有ES細胞系之間多能標記物Oct4和Sox2沒有差異。如期望的那樣NS細胞顯示表達了Sox2。綜合這些結果表明，ES細胞過度表達Nanog蛋白顯著提高了這些細胞產(chǎn)生ES-NS而非ES-ES雜交細胞集落的能力，這支持了Nanog蛋白在重編程中起到作用的觀點。實施例3與RHnanogES細胞相比，PEG不能誘導RH細胞死亡和分化增加為了評估PEG處理可能對RH或RHNES細胞具有促分化作用，我們分析了細胞的存活和分化。細胞存活的評分為PEG處理后24小時貼附于100mm平板的ES細胞數(shù)。接種106個PEG處理的RH和RHNES細胞后第二天分別計數(shù)到6.6xl()S和5.3xl()S個細胞(圖3A)。為了驗證是否可能誘導分化和PEG處理的ES細胞生長和改變形成ES細胞集落能力，對經(jīng)PEG處理和未處理的RH和RHNES細胞進行單細胞FACS分選。FACS分選后約12天，用堿性磷酸酶(AP)染色各孔作未分化狀態(tài)ES細胞的鑒定。大多數(shù)接種的未處理的RH和RHNES細胞形成了未分化集落(圖3B，C)，而PEG處理的細胞顯示集落總數(shù)減少。RH的集落減少約50%，但對RHN集落形成的影響小得多。未觀察到分化增加，39個RH集落只有4個，73個RHN集落有1個是AP陰性。綜合這些數(shù)據(jù)表明，PEG能在一定程度上誘導RH和RHNES細胞死亡，但不誘導細胞分化。經(jīng)過FACS和PEG處理后，RHN細胞的集落形成能力提高了2倍，這并不足以解釋觀察到的雜交體增加200倍。實施例4雜交細胞的染色體分離并以顯著頻率回復為二倍體細胞為確定ES-NS雜交細胞，我們觀察了其染色體組成和NS細胞表觀基因組的身份。為分析前者，我們觀察了來源于RHxNS0ct4GiP、RHnanogxNSOct4GiP、RHxNSTGFP和RHnanogxNSTGFP之間融合產(chǎn)生的12種獨立的ES-NS雜交細胞克隆。傳代5次后，這些克隆在分裂中期大部分時間顯示有80條染色體(補充圖l)6個ES-NS克隆的分析(只對JS細胞基因組進行分析)顯示，存在的二倍體細胞群隨著傳代數(shù)而增加。這可能是由于與四倍體細胞相比二倍體細胞有生長優(yōu)勢。12代時分析了這些克隆中的二個克隆，顯示二倍體細胞(40條染色體)分別占30%和50%。此外，細胞群由二種不同細胞組成，一種有接近40條染色體，另一種有80條染色體，提示發(fā)生了一次染色體分離。需要進一步分析來評價這些新的重編程二倍體雜交細胞中的NS細胞基因組比例。然而，此數(shù)據(jù)意指，可通過細胞融合從分化細胞獲得未分化的二倍體ES細胞。實施例5在ES-NS雜交細胞中NS基因組獲得了ES細胞身份為評價ES-NS雜交細胞中NS細胞表觀基因組身份，我們觀察了失活X染色體的狀態(tài)以及Oct4與神經(jīng)干細胞基因Blbp和01ig2的等位基因表達。與XX多能細胞相反，XX分化細胞有一個失活的X染色體。在各種細胞學標記中，發(fā)現(xiàn)失活X染色體伴有XistRNA，而且富含三甲基化的H3-K27和泛素化的H2A(Brown等，1992;Napoles等，2004;Silva等，2003)。與NS細胞分化狀態(tài)同時，共聚焦分析揭示有一個由XistRNA、三甲基化H3-K27和單一泛素化H2A組成的核小體(圖4A-C)。此外，發(fā)現(xiàn)失活X的H3-K9乙?；潭鹊?，H3-K4甲基化程度低且富含組蛋白變體macroH2A(數(shù)據(jù)未顯示)。因此如果XXXYES-NS雜交細胞中發(fā)生重編程，此失活的X應丟失這些沉默標記。這正是所觀察到的，隨著XistRNA核小體丟失和替代，檢測到ES細胞的三個針尖Xist信號特征，它們對應于Xist的新生轉(zhuǎn)錄物(圖4C)。另外，ES-NS雜交細胞染色質(zhì)狀態(tài)的免疫熒光分析顯示丟失了三甲基H3-K27和單泛素化的H2A核小體(圖4A，B)。XXXYES-NS雜交細胞Oct4表達的RNAFISH分析揭示每個細胞核存在3或4個針尖信號，證明NS細胞來源的Oct4等位基因重新激活(圖4D)。XXXYES-NS雜交細胞的特征鑒定包括在NS細胞中表達但在ES細胞中沉默的01ig2和Blbp基因的表達分析(Conti等，2005)。與上述結果一致，RT-PCR分析揭示在ES-NS雜交細胞中Blbp和OHg2二基因都關閉了(圖4E)。為研究多能活性，使過度表達Nanog蛋白的ES和NS細胞之間融合產(chǎn)生的雜交細胞分化，形成胚胎樣小體，分析中胚層標記T-brachyury(短尾表型相關基因)的表達(補充圖2)。考慮到Nanog蛋白過度表達會抑制分化(Chambers等，2003)，采用了EF4-NS04GiPRB雜交細胞。如前所述，EF4細胞含有固定的Nanog轉(zhuǎn)基因使其可利用cre重組酶的活性被刪除，而NS04GiPRB組成性表達紅色熒光蛋白和滅菌素抗性基因(補充圖2A)。因此，EF4-NS04GiPRB雜交細胞呈現(xiàn)NS來源的紅綠熒光(補充圖2B)。經(jīng)cre重組酶處理后，觀察到Nanog蛋白過度表達喪失，因為雜交細胞呈現(xiàn)的綠色熒光增強(補充圖2C)。然后通過撤回Lif和形成胚胎小體(EB)使這些EF4-NS04GiPRBcre雜交細胞分化，并分析其T-brachyury(短尾表型相關基因)表達(補充圖2D，E)。如預期的那樣，在供體細胞或未分化雜交細胞中未檢測到T-braehyury(短尾表型相關基因)表達。然而根據(jù)多能潛力，它應在分化的雜交細胞中表達。也接種了EB，每孔1一3個，分析是否存在收縮細胞。大約70%(24/35)的孔顯示有搏動細胞，其骨骼肌和心肌細胞a-肌動蛋白的特異性標記染色陽性(補充圖2F)。綜合而言，此數(shù)據(jù)表明，就所有分析的標記而言，ES-NS雜交細胞中的NS基因組獲得了ES細胞身份。此外，雜交保留了多能性。實施例6ES細胞中Nanog蛋白過度表達是細胞融合后NS細胞重新編程所需的唯一因素ES細胞過度表達Nanog蛋白可能比WTES細胞更具融合性。為說明此觀點，融合后24小時用FACS分析了細胞群RHxNSTGFP和RHNxNSTGFP中是否存在呈現(xiàn)紅綠雙熒光的原代雜交細胞。如預期的那樣，雙陽性細胞數(shù)目較低。RHxNSTGFP禾PRHNxNSTGFP中雙陽性細胞分別占0.17%和0.1%(圖5B)。此外，我們檢測了FACS分選的原代雜交細胞形成集落的能力。在此階段，可能發(fā)生重新編程，但不可能完成，因為先前曾證明細胞融合后約48小時首先檢測到Oct4調(diào)控序列驅(qū)動的GFP表達(Tada等，2001;Do和Scholer，2004)。所以除了考慮例如細胞周期的協(xié)調(diào)外，此階段的雜交細胞必須克服表觀基因組分化產(chǎn)生ES樣細胞集落。FACS分選后3天用潮霉素和嘌呤霉素共同選擇板中的原代雜交細胞。二次獨立實驗的結果顯示分選的RHxNSTGFP融合的原代雜交細胞并不產(chǎn)生雜交集落(圖5D，E)。相反，2000個和700個FACS分選細胞分別產(chǎn)生的34個和11個雜交集落分別獲自RHNxNSTGFP融合物(圖5D，E)。這些結果提出了重新編程中Nanog過度表達的相關性的問題。為了解決這一問題，將形成的RHN-NSTGFP集落數(shù)量與RHN-ES04GiP相比，后者被認為是每個接種的雜交體形成集落的參比單位?？紤]到雙陽性FACS分選細胞的總數(shù)中雜交集落所占的比例，RHN-NSTGFP和RHN-ES04GiP原代雜交體產(chǎn)生ES樣集落的能力基本相同(圖5D，E)。結論是，ES-NS雜交體的FACS分選和分析證明Nanog蛋白過度表達不能增強細胞融合，但證實它促進了ES樣ES-NS雜交集落的產(chǎn)生。也表明Nanog蛋白可能是在產(chǎn)生ES-NS雜交集落中克服表觀基因組差異所需的唯一限制因素。實施例7重新編程中作為供體細胞的神經(jīng)細胞在體細胞核轉(zhuǎn)移(SCNT)中，所用的供體細胞類型能影響胚泡的ES細胞衍生效率(Hoechedlinger禾tlJaenisch2002;Blelloch等，2004;Eggan等，2004;Inoue等，2005)。在這些研究中，ES細胞顯示可獲得最佳結果，提示供體細胞的分化狀態(tài)是一個重要因素。NS細胞是體細胞中的多能干細胞(Conti等，2005)，含有某些可塑性表觀基因組。在我們的實驗中RHN-NS原代雜交細胞顯示能產(chǎn)生ES樣雜交細胞集落，效率與RHN-ES原代雜交細胞相同。為了解這是否是由于NS的表觀基因組性能所致，或只是由于Nanog蛋白過度表達所致，我們分析了MEF和胸腺細胞(T)原代雜交細胞產(chǎn)生ES樣集落的能力。使MEF和T細胞與RH和RHNES細胞融合。象RH-NS那樣，RH-MEF和RH-T原代雜交細胞不能產(chǎn)生ES樣集落(數(shù)據(jù)未顯示)。RHN-MEF和RHN-T原代雜交細胞能產(chǎn)生ES樣集落但效率比RHN-ES和RHN-NS原代雜交細胞低得多(分別為0.08%和0.33%)(圖5A-E)。這些數(shù)據(jù)表明，與分化的對應細胞相比，NS細胞的表觀基因組似乎更容易發(fā)生與Nanog過度表達的ES細胞融合而致的重新編程。實施例8(比較實施例)NS細胞中的Nanog蛋白表達不足以導致重新編程為了研究Nanog蛋白表達是否足以導致NS基因組重編程為ES細胞基因組，用Nanog(NS04GiPNP)轉(zhuǎn)染了NS細胞。這些細胞穩(wěn)定表達了Nanog，此蛋白的水平與ES細胞中的相似(圖6D)。此外，細胞正常增殖，顯示表達了NS細胞的標志Blbp和01ig2蛋白(圖6E)。然而沒有受Oct4調(diào)控序列驅(qū)動的內(nèi)源性Oct4或GFP表達。當接種在標準的GMEM或N2B27ES培養(yǎng)基時，如先前報導的那樣(Conti等，2005)，細胞分化成星形細胞類型的細胞。其它采用二種強效表觀基因去穩(wěn)定劑曲古柳菌素A和5-氮雜胞嘧啶核苷的實驗也不能重編程表達Nanog蛋白的NS細胞(資料未顯示)。綜合在一起，這些結果提示ES細胞成分以外，Nanog蛋白表達不足以實施例9Nanog蛋白是產(chǎn)生ES樣ES-NS雜交細胞集落所必需的培養(yǎng)無Nanog蛋白的分離的ICM和ES二種細胞不能使其維持在非分化狀態(tài)(Mitsui等，2003)。這些結果的解釋是，表明Nanog蛋白對維持多能狀態(tài)具有重要作用。然而，采用條件性刪除方法，我們產(chǎn)生的Nanog-/—ES樣細胞(RC-/-)可表達多能標志，通過一系列傳代仍維持多能能力。此方法包括將固定的Nanog轉(zhuǎn)基因引入ES細胞然后耙向刪除內(nèi)源性Nanog基因和最后利用ere切除Nanog轉(zhuǎn)基因。RC-A細胞是真正的ES細胞的進一步證據(jù)來自以下事實，即通過引入靶向載體后可選擇到驅(qū)動G418和潮霉素抗性基因的內(nèi)源性Nanog啟動子。這得以選出純的ES-樣細胞群，其Oct4和Sox2水平與其它表達Nanog蛋白的ES細胞群相似(圖6D)。為研究Nanog蛋白是否為重編程所必需，平行進行了RC-A或其親代細胞系RC與NS04GiP細胞的融合。也使RC-A細胞與表達轉(zhuǎn)基因Nanog的NS04GiP，即NS04GiPNP細胞融合。最后，將用表達Nanog蛋白轉(zhuǎn)基因拯救的細胞(RC-/-NZ)與NS04GiP細胞融合。這些實驗采用二個獨立的靶向克隆11<:-/-八和8進行。為了獲得雜交細胞集落數(shù)目的有意義讀數(shù)，接種了2xl06:2xl(^個融合的混合細胞群。不出所料，親代細胞系RC與NS04GiP融合產(chǎn)生了雜交集落(圖6A，B)。相反，RC-A細胞則完全喪失了此種能力。用Nanog拯救RC-A細胞，RC-/-NZ不僅獲得了產(chǎn)生雜交集落的能力而且進一步增強了與RC細胞的親緣關系。此結果與RC-/-NZ細胞存在較高水平Nanog蛋白相關(圖6D)。令人感興趣的是，RC-Z-細胞當與表達Nanog蛋白的NS04GiPNP細胞融合后也能產(chǎn)生雜交集落。綜合在一起，這些結果提示，存在Nanog蛋白表達是ESxNS細胞融合后NS基因組重編程所必需的。實施例10用MEK抑制劑提高Nanog蛋白的表達27已證明MEK抑制劑PD184352能提高ES細胞中的Nanog蛋白水平。也通過測定細胞融合使NS細胞轉(zhuǎn)化為多能細胞研究了PD184352對重編程的作用。使組成性表達dsRed熒光蛋白和潮霉素抗性的RHES細胞與表達通過IRES與嘌呤霉素抗性連鎖的融合蛋白TauGFP的胚胎衍生神經(jīng)干細胞(NSTGFP)融合。融合前后3天用3uM的PD184352處理融合RH細胞之一。對照不加PDI84352。融合后24小時分選出處理和未處理的原代雜交細胞，接種平板(圖9A—C)。3天后，向ES培養(yǎng)液中加入潮霉素和嘌呤霉素進行選擇。給表達dsRed2和GFP熒光及顯示ES細胞形態(tài)的集落評分(圖9D，E)。結果顯示PD184352使ES-NS雜交集落形成提高45倍。令人感興趣的是，與表達Nanog蛋白的ES細胞相比，PD184352處理的RH細胞每平板雜交細胞形成的雜交集落的百分率正好低2倍(2.25%比4%)。此結果顯示PD184352提高了融合細胞中的重編程。此種作用可能是由于處理的RH細胞中Nanog蛋白水平升高所致。因此，如果內(nèi)源性表達Nanog蛋白，那么可用MEK抑制劑來上調(diào)Nanog蛋白而獲得相關作用，如促進重新編程。參考文獻BaoS，MiyoshiN，Okamotol，JenuweinT，HeardE，AzimS腦niM.InitiationofepigeneticreprogrammingoftheXchromosomeinsomaticnucleitransplantedtoamouseoocyte.(啟動移植到小鼠卵母細胞中的體細胞核X染色體表觀基因重編程)EMBORep.2005年8月；6(8):748-54。BortvinA，EgganK，SkaletskyH，AkutsuH，BerryDL，YanagimachiR，PageDC，JaenischR.IncompletereactivationofOct4-relatedgenesinmouseembryosclonedfromsomaticnuclei.(細胞核克隆的小鼠胚月臺Oct4-相關基因的不完全重激活).Development.2003年4月;130(8):1673-80。BrownCJ，HendrichBD，RupertJL，LafreniereRG，XingY，LawrenceJ，WillardHF.ThehumanXISTgene:analysisofa17kbinactiveX-specificRNAthatcontainsconservedrepeatsandishighlylocalizedwithinthenucleus.(人XIST基因含保守性重復序列的17kb無活性X-特異性RNA的分析，其主要位于核中)Cell.1992年10月30日；71(3):527-42。ChambersI，ColbyD，RobertsonM，NicholsJ，LeeS,TweedieS，SmithA.FunctionalexpressioncloningofNanog，apluripotencysustainingfactorinembryonicstemcells.(胚胎干細胞中多能維持因子Nanog蛋白的功能性表達克隆)Cell.2003年5月30日；113(5):643-55。ContiL，PollardSM，GorbaT，ReitanoE，ToselliM，BiellaG，SunY，SanzoneS，YingQL，CattaneoE，SmithA.Niche-IndependentSymmetricalSelf-RenewalofaMammalianTissueStemCell.(哺乳動物組織干細胞的Niche-依賴性對稱自我更新)PLoSBiol.2005年8月16日；3(9):e283。DaviesSP，ReddyH，CaivanoM，CohenP.Specificityandmechanismofactionofsomecommonlyusedproteinkinaseinhibitors(某些常用的蛋白'激酶抑制劑的特異性和作用機制).BiochemJ.351，95-105。DoJT，ScholerHR.Nucleiofembryonicstemcellsreprogramsomaticcells.(用胚胎干細胞核重編程體細胞).StemCells.2004;22(6):941-9。HajkovaP，ErhardtS，LaneN，HaafT，El-MaarriO，ReikW，WalterJ，SuraniMA.Epigeneticreprogramminginmouseprimordialgermcells.(小鼠原基胚細胞中的表觀基因重編程).MechDev.2002年9月；117(l-2):15-23.HochedlingerK，JaenischR.MonoclonalmicegeneratedbynucleartransferfrommatureBandTdonorcells.(成熟B和T供體細胞的核轉(zhuǎn)移產(chǎn)生了單克隆小鼠)Nature.2002年2月28曰;415(6875):1035-8.2002年2月10日電子公開。HochedlingerK，JaenischR.Nucleartransplantation,embryonicstemcells,andthepotentialforcelltherapy.(核轉(zhuǎn)移、胚胎干細胞和細胞治療潛力)NEnglJMed.2003年7月17曰;349(3):275-86。HumpherysD，EgganK，AkutsuH，HochedlingerK，RideoutWM3rd，BiniszkiewiczD，YanagimachiR，JaenischR.EpigeneticinstabilityinEScellsandclonedmice.(ES細胞和克隆小鼠中的表觀基因不穩(wěn)定)Science.2001年7月6日；293(5527):95-7。HumpherysD，EgganK，AkutsuH，F(xiàn)riedmanA，HochedlingerK，YanagimachiR，LanderES，GolubTR，JaenischR.Abnormalgeneexpressioninclonedmicederivedfromembryonicstemcellandcumuluscellnuclei.(胚月臺干細胞和卵丘細胞核產(chǎn)生的克隆小鼠中的異?；虮磉_)ProcNatlAcadSciUSA.2002年10月1日；99(20):12889-94.2002年9月16日電子公開。KangYK，KooDB，ParkJS，ChoiYH，ChungAS，LeeKK，HanYM.Aberrantmethylationofdonorgenomeinclonedbovineembryos.(克隆牛胚月臺中供體基因組的畸變甲基化)NatGenet.2001年6月；28(2):173-7。KangYK，ParkJS，KooDB，ChoiYH，KimSU，LeeKK，HanYM.Limiteddemethylationleavesmosaic-typemethylationstatesinclonedbovinepre-implantationembryos.(克隆的牛預植入胚胎中有限的去甲基化留下了鑲嵌型甲基狀態(tài))EMBOJ.2002年3月1日；21(5):1092-100。KimuraH，TadaM，NakatsujiN，TadaT.Histonecodemodificationsonpluripotentialnucleiofreprogrammedsomaticcells(對重編程體細胞多能核的組蛋白密碼修飾)MolCellBiol.2004年7月;24(13):5710國20。MakW，NesterovaTB，deNapolesM，AppanahR，YamanakaS，OtteAP，BrockdorffN.ReactivationofthepaternalXchromosomeinearlymouseembryos.(小鼠早期胚胎中親代X染色體的重激活)Science.2004年1月30日；303(5658):666-9。MatveevaNM，ShiovAG，KaftanovskayaEM，MaximovskyLP，ZhelezovaAI，GolubitsaAN,BayborodinSI，F(xiàn)okinaMM，SerovOL.Invitroandinvivostudyofpluripotencyinintraspecifichybridcellsobtainedbyfusionofmurineembryonicstemcellswithsplenocytes.(小鼠胚胎干細胞與脾細胞融合獲得的種間雜交細胞多能性的體內(nèi)外研究)MolReprodDev.1998Jun;50(2):128-38。MitsuiK，TokuzawaY，It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述第一種細胞融合，以將所述不良基因的修飾形式引入所述第二種細胞內(nèi)。26.如權利要求14一25中任何一項所述的方法，其包括在存在Nanog蛋白時培養(yǎng)所述細胞。27.如權利要求14一26中任何一項所述的方法，其包括在所述第一種細胞和/或第二種細胞中表達Nanog蛋白。28.—種細胞融合方法，其包括在存在Nanog蛋白時融合第一種細胞與第二種細胞。29.—種細胞融合方法，其包括在存在MEK抑制劑時融合第一種細胞與第二種細胞。30.如權利要求28或29所述的方法，其特征在于，所述第一種細胞是多能細胞。31.如權利要求28—30中任何一項所述的方法，其特征在于，所述第一種細胞是ES、EC或EG細胞。32.如權利要求28—31中任何一項所述的方法，其特征在于，所述第二種細胞是體細胞。33.如權利要求32所述的方法，其特征在于，所述第二種細胞是干細胞。34.如權利要求33所述的方法，其特征在于，所述干細胞是神經(jīng)干細胞。35.如權利要求28—34中任何一項所述的方法，其包括在所述第一種細胞中表達Nanog蛋白。36.如權利要求28—35中任何一項所述的方法，其特征在于，所述第一種和第二種細胞融合產(chǎn)生非整倍體細胞，所述方法包括培養(yǎng)所述融合細胞以獲得其二倍體后代。37.—種獲得活的非人動物的方法，所述方法包括權利要求28—36中任何一項所述的細胞融合方法。38.如前述任何一項權利要求所述的方法，其特征在于，所述MEK抑制劑是MEK1抑制劑。39.如權利要求38所述的方法，其特征在于，所述MEK1抑制劑是PD184352。40.如前述任何一項權利要求所述的方法，其特征在于，用約0.1-25pM的MEK抑制劑處理所述細胞。41.如權利要求40所述的方法，其特征在于，用約l-5pM的MEK抑制劑處理所述細胞。42.—種用前述任何一項權利要求所述方法獲得的細胞。43.如權利要求42所述的細胞在制備治療用藥物中的應用。44.如權利要求43所述的應用是細胞治療。45.—種治療方法，包括給予患者有效量的權利要求42所述的細胞。46.—種治療方法，包括給予患者有效量的權利要求14一27中任何一項所獲得的遺傳修飾細胞。47.如權利要求46所述的治療方法，其包括鑒定需要遺傳修飾細胞的患者，鑒定治療所述患者所需的遺傳修飾，和按權利要求14一27中任何一項所述方法制備遺傳修飾細胞。48.Nanog蛋白在重新編程多能細胞與體細胞融合獲得的細胞中的應用。49.如權利要求48所述的應用，其特征在于，所述多能細胞是ES細胞。50.如權利要求48或49所述的應用，其特征在于，所述體細胞是神經(jīng)干細胞。51.MEK抑制劑在重新編程多能細胞與體細胞融合獲得的細胞中的應用。52.如權利要求51所述的應用，其特征在于，所述多能細胞是ES細胞。53.如權利要求50或51所述的應用，其特征在于，所述體細胞是神經(jīng)干細胞。54.—種核轉(zhuǎn)移方法，所述方法包括將體細胞核轉(zhuǎn)移給受體細胞形成核轉(zhuǎn)移細胞，和在所述核轉(zhuǎn)移細胞中過度表達Nanog蛋白。55.如權利要求54所述的方法，其特征在于，所述受體細胞是卵母細胞。56.如權利要求54所述的方法，其特征在于，所述受體細胞是去核卵母細胞。57.如權利要求54—56中任何--項所述的方法，其包括以ES細胞中Nanog蛋白內(nèi)源表達水平的2—15倍的水平表達Nanog蛋白。58.—種核轉(zhuǎn)移方法，其包括將體細胞核轉(zhuǎn)移給受體細胞形成核轉(zhuǎn)移細胞，和用MEK抑制劑處理所述核轉(zhuǎn)移細胞。59.如權利要求58所述的方法，其特征在于，所述受體細胞是卵母細胞。60.如權利要求58所述的方法，其特征在于，所述受體細胞是去核卵母細胞。61.—種獲得活的非人動物的方法，所述方法包括權利要求54—60中任何一項所述的核轉(zhuǎn)移方法。62.—種獲得多能干細胞培養(yǎng)物的方法，所述方法包括權利要求54—60中任何一項所述的核轉(zhuǎn)移方法。63.MEK抑制劑在上調(diào)Nanog蛋白表達中的應用。64.MEK抑制劑在重新編程細胞中的應用。65.如權利要求64所述的應用，其特征在于，所述細胞是體細胞。66.如權利要求64或65所述的應用，其特征在于，所述細胞在體外重新編程。67.如權利要求64—66中任何一項所述的應用，其特征在于，所述細胞不是融合細胞。68.—種重新編程體細胞的方法，所述方法包括用MEK抑制劑處理細胞。全文摘要本發(fā)明提供了重新編程細胞和任選遺傳修飾細胞的方法。通過在存在Nanog蛋白和MEK抑制劑時使多能細胞與分化細胞相融合從分化的基因組中獲得多能基因組。通過提供各自含有染色體的第一種和第二種細胞，使第一種細胞與第二種細胞融合和培養(yǎng)該融合細胞以獲得含有第一種細胞的至少一條染色體和第二種細胞的至少一條染色體的二倍體細胞，從而遺傳該細胞。細胞融合的方法包括在存在Nanog蛋白或MEK抑制劑時使第一種細胞與第二種細胞融合。也描述了如此獲得的細胞和它們的應用。文檔編號C12N5/18GK101331226SQ200680047374公開日2008年12月24日申請日期2006年11月13日優(yōu)先權日2005年11月11日發(fā)明者A·G·史密斯,I·查姆伯斯,J·R·達席爾瓦申請人:愛丁堡大學管理處