專利名稱：分離的多肽、編碼其的多核苷酸、表達(dá)其的轉(zhuǎn)基因植物和使用其的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
和背景 本發(fā)明涉及分離的多肽、編碼其的多核苷酸、表達(dá)其的轉(zhuǎn)基因植物和使用其的方法。具體而言，本發(fā)明可以用于增加轉(zhuǎn)基因植物的肥料使用效率和脅迫抗性以及生物量、活力(vigor)和產(chǎn)量。
肥料是支持“綠色革命”的燃料，直接造成過去40年中農(nóng)作物產(chǎn)量的不尋常地增加。如果沒有肥料使用的相應(yīng)增加，那么農(nóng)作物產(chǎn)量中的急劇上升決不可能發(fā)生。然而，近年來，關(guān)于肥料使用，特別是氮肥對(duì)水和大氣污染的環(huán)境影響的關(guān)注日益增加。對(duì)于肥料使用的限制已在幾個(gè)國(guó)家中立法，并且預(yù)計(jì)在未來有進(jìn)一步的限制。在未來將必需肥料的更多使用，以支持在有限的土地資源上為了快速的人口增長(zhǎng)而進(jìn)行食物和纖維生產(chǎn)。
肥料通常被提及為農(nóng)業(yè)中的頭號(hào)日常開支費(fèi)用。在作為主要肥料提供的3種常量營(yíng)養(yǎng)物[氮(N)、磷酸鹽(P)和鉀(K)]中，氮是唯一一種通常需要每年補(bǔ)充的，特別是對(duì)于占全世界超過一半的種植面積的谷物。
促進(jìn)植物生長(zhǎng)的常見方法一直是且繼續(xù)是天然以及合成營(yíng)養(yǎng)物(肥料)的使用。合成營(yíng)養(yǎng)物通常以植物可用的形式提供常量營(yíng)養(yǎng)物，例如尿素，和/或無機(jī)硝酸鹽、磷酸鹽或類似化合物。盡管此類營(yíng)養(yǎng)物可以或多或少地在農(nóng)民方便時(shí)應(yīng)用，并且可以每當(dāng)認(rèn)為需要時(shí)應(yīng)用，但合成營(yíng)養(yǎng)物的過量使用和合成營(yíng)養(yǎng)物的無效利用是造成環(huán)境問題的主要因素，所述環(huán)境問題例如為地下水的富營(yíng)養(yǎng)化、硝酸鹽污染、磷酸鹽污染等。
氮是植物的基本常量營(yíng)養(yǎng)物，負(fù)責(zé)氨基酸和核酸、輔基、植物激素、植物化學(xué)防御等的生物合成。氮通常是植物生長(zhǎng)中的限速元素，并且所有大田作物對(duì)于無機(jī)氮肥具有基本依賴性。因?yàn)榉柿蠌拇蠖鄶?shù)土壤類型中被快速耗盡，所以它必須在生長(zhǎng)季節(jié)期間2或3次提供給生長(zhǎng)中的農(nóng)作物。通常以硝酸銨、硝酸鉀或尿素形式提供的氮肥一般占與農(nóng)作物(例如玉米和小麥)相關(guān)的成本的40％。已估計(jì)，到2050年，全世界每年將使用超過1億5千萬噸氮肥。植物對(duì)氮的使用效率增加將使得能夠用較低的肥料輸入，或備選地在品質(zhì)較差的土壤上種植農(nóng)作物，并因此將在發(fā)達(dá)和發(fā)展中的農(nóng)業(yè)系統(tǒng)中具有顯著的經(jīng)濟(jì)影響。氮肥的不希望有的效應(yīng)的概述由Byrnes，F(xiàn)ertilizer Research，26，第209-215頁(yè)(1990)呈現(xiàn)。盡管植物能夠從環(huán)境中吸收有機(jī)氮，但是所利用的氮的大部分通常來自對(duì)銨(NH4+)和硝酸鹽(NO3-)形式的無機(jī)氮的攝取，及其隨后在稱為同化的過程中轉(zhuǎn)變成有機(jī)氮。
氮同化過程開始于NO3-順次地通過硝酸鹽還原酶(NR)和亞硝酸鹽還原酶(NiR)而轉(zhuǎn)變成NH4+。隨后，氮通過谷氨酰胺合酶(GS)而摻入谷氨酸(Glu)中，從而獲得谷氨酰胺(Gln)。氮同化的主要途徑是GS/GOGAT循環(huán)(谷氨酰胺合酶/谷氨酸-酮戊二酸胺轉(zhuǎn)移酶)。其余氨基酸通過轉(zhuǎn)氨基作用而從Gln、Glu和Asn合成。
氮(作為氨基酸或以硝酸鹽的形式)移動(dòng)至枝條，在那里它在植物發(fā)育的快速步驟期間和向上直至開花時(shí)貯存于葉和桿(stalk)中。例如，在玉米中，在籽粒萌芽期間和直至開花時(shí)植物積聚大量有機(jī)氮。一旦植物的受精發(fā)生，籽粒就開始形成且變成植物氮的主要儲(chǔ)庫(kù)(sink)。貯存的氮隨后可以從充當(dāng)貯存區(qū)室的葉和桿中重新分布直至籽粒形成。
存在用于限定植物氮代謝的3種主要效率參數(shù) 氮攝取效率是地上生物量中N的量(gr Nt)除以施用的N的量(gr/公頃)； 氮利用效率(utilization efficiency)是籽粒產(chǎn)量(gr/植物)除以地上生物量中N的量(gr Nt)；和 氮使用效率(useefficiency)是籽粒產(chǎn)量(gr/植物)除以施用的N的量(gr/公頃)。
氮攝取效率[地上生物量中N的量(gr Nt)/施用的N的量(gr/公頃)]是植物所并入的總氮量，并且是“攝取”(植物的轉(zhuǎn)運(yùn)能力)、同化過程的代謝效率和植物大小發(fā)育速率的函數(shù)，因?yàn)樵谏L(zhǎng)期間產(chǎn)生的桿和葉的物質(zhì)團(tuán)是實(shí)際的氮貯存器官。在最終轉(zhuǎn)移至籽粒(產(chǎn)量)的枝條中發(fā)現(xiàn)的同化氮的級(jí)分在酶促方面受到控制，并因此是用于轉(zhuǎn)基因操作的潛在位點(diǎn)。這個(gè)參數(shù)實(shí)際上等于氮利用效率(NUE)。更佳的籽粒至枝條N-分配將最可能改善籽粒的產(chǎn)量和蛋白質(zhì)含量。
類似地，可以對(duì)其他與產(chǎn)量和總體植物耐受性有直接關(guān)聯(lián)的常量營(yíng)養(yǎng)物(例如磷(P)和鉀(K))進(jìn)行使用和利用效率的相同計(jì)算。
關(guān)于主要農(nóng)作物的NUE僅為30-70％，這由于使用的過量肥料而對(duì)于農(nóng)民的投入費(fèi)用有直接的負(fù)面影響，所述過量的肥料很快會(huì)變成生態(tài)負(fù)擔(dān)。因此，含硝酸鹽的廢物代表了具有全球意義的環(huán)境問題。硝酸鹽滲流入水中引起湖泊、河流和海洋的富營(yíng)養(yǎng)化(由于導(dǎo)致缺氧和海洋動(dòng)物區(qū)系的破壞的藻類生長(zhǎng)而危及水體)。飲用水中的硝酸鹽污染可以引起高鐵血紅蛋白血癥，其對(duì)嬰兒和正在哺乳的母親特別有害。事實(shí)上，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)被視為地面和沿岸水體以及飲用水供應(yīng)的最大的硝酸鹽污染者。
植物中肥料使用效率(FUE)的遺傳改良可以經(jīng)由傳統(tǒng)育種或經(jīng)由基因工程來產(chǎn)生。然而，迄今為止，既沒有轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品，也沒有常規(guī)育種增強(qiáng)的FUE材料被公布用于商業(yè)用途。在關(guān)于這點(diǎn)的原因中，最重要的是培育者在最有利的肥料條件下選擇他們的原種(elite)系，從而忽略了FUE的改良(產(chǎn)量才是銷售的主要驅(qū)動(dòng)力，而不是投入成本的減少)。在關(guān)于改善的FUE的轉(zhuǎn)基因解決方案方面的努力由公司例如Monsanto(參見例如Choo等人的美國(guó)專利申請(qǐng)20020046419；Edgerton等人的美國(guó)專利申請(qǐng)2005010879；和Chomet等人的美國(guó)專利申請(qǐng)2006 0179511)、Arcadia Biosciences和Biogemma來進(jìn)行。
近來，發(fā)表了綜述，其中概括了通過由學(xué)院實(shí)驗(yàn)室采取的轉(zhuǎn)基因手段來改善FUE的努力(Good AG等人，Trends Plant Sci.2004 Dec；9(12)597-605)。Yanagisawa和同事(Proc Natl Acad Sci U SA.2004 May 18；101(20)7833-8)報(bào)道了鼓舞人心的結(jié)果，他們發(fā)現(xiàn)，經(jīng)遺傳改造而獲得的碳骨架生產(chǎn)增加(2-酮戊二酸，來自GS/GOGAT循環(huán)的OG)支持了轉(zhuǎn)基因擬南芥(Arabidopsis)在低氮條件下的生長(zhǎng)。因?yàn)樵S多酶參與碳骨架生產(chǎn)，所以所述轉(zhuǎn)基因是激活參與該途徑的多個(gè)基因的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子(Dof1)。在低氮條件下，擬南芥轉(zhuǎn)基因植物中的氮含量高約30％。Good等人的美國(guó)專利號(hào)6,084,153公開了脅迫響應(yīng)性啟動(dòng)子用于控制丙氨酸胺轉(zhuǎn)移酶(AlaAT)的表達(dá)的用途。Good等人進(jìn)一步公開了，當(dāng)與對(duì)照植物相比較時(shí)，轉(zhuǎn)基因卡諾拉油菜植物改善了干旱和氮缺乏耐受性。然而，Yanagisawa等人的Dof1構(gòu)建體和Good等人的干旱誘導(dǎo)的AlaAT構(gòu)建體都沒有在商業(yè)品系中在真實(shí)的田間條件下進(jìn)行評(píng)估。因此，結(jié)果的經(jīng)濟(jì)關(guān)聯(lián)性仍有待證實(shí)。
因此，鑒定這樣的多核苷酸和多肽具有廣泛公認(rèn)的需要并且將是高度有利的，所述多核苷酸和多肽改善在表達(dá)其的轉(zhuǎn)基因植物中的肥料使用/攝取效率，所述轉(zhuǎn)基因植物沒有上述局限性。
發(fā)明概述 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了核酸構(gòu)建體，其包含與選自SEQ IDNO68、1、4、5、8、9、11、13、16、19、20、23、24、27、30、32、37、42、49、50、51、53、54、55、56、57、58、64、69、70、73、77、78、79、80、84、86、87、93、94、98、101、102、103、104、105、106、107、108和109的核苷酸序列至少85％同一的核酸序列，和能夠指導(dǎo)所述核酸序列在宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子序列。
根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案中更進(jìn)一步的特征，所述核酸序列如SEQID NO68、1、4、5、8、9、11、13、16、19、20、23、24、27、30、32、37、42、49、50、51、53、54、55、56、57、58、64、69、70、73、77、78、79、80、84、86、87、93、94、98、101、102、103、104、105、106、107、108、109、219-767、1317、1318、1319、1320、1321、1322、1323、1324、1325、1326、1327、1328、1329、1330、1331、1332、1333、1334、1335或1336中所示。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了分離的多肽，其包含與SEQ IDNO177、110、113、114、117、118、120、122、125、128、129、132、133、136、139、141、146、151、158、159、160、162、163、164、165、166、167、173、178、179、182、186、187、188、189、193、195、196、202、203、207、210、211、212、213、214、215、216、217或218中所示氨基酸序列至少85％同源的氨基酸序列。
根據(jù)本發(fā)明的另外一個(gè)方面，提供了包含外源多核苷酸的植物細(xì)胞，所述外源多核苷酸包含編碼多肽的核酸序列，所述多肽具有與SEQID NO177、110、113、114、117、118、120、122、125、128、129、132、133、136、139、141、146、151、158、159、160、162、163、164、165、166、167、173、178、179、182、186、187、188、189、193、195、196、202、203、207、210、211、212、213、214、215、216、217或218至少85％同源的氨基酸序列。
根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案中更進(jìn)一步的特征，所述植物細(xì)胞形成植物的部分。
根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案中更進(jìn)一步的特征，所述氨基酸序列如SEQ ID NO177、110、113、114、117、118、120、122、125、128、129、132、133、136、139、141、146、151、158、159、160、162、163、164、165、166、167、173、178、179、182、186、187、188、189、193、195、196、202、203、207、210、211、212、213、214、215、216、217、218、768-1051、1053-1098、1100-1315或1316中所示。
根據(jù)本發(fā)明的另外一個(gè)方面，提供了增加植物對(duì)脅迫條件的耐受性的方法，所述方法包括在所述植物中表達(dá)編碼多肽的外源多核苷酸，所述多肽具有與SEQ ID NO177、110、113、114、117、118、120、122、125、128、129、132、133、136、139、141、146、151、158、159、160、162、163、164、165、166、167、173、178、179、182、186、187、188、189、193、195、196、202、203、207、210、211、212、213、214、215、216、217、218、1341或1343至少85％同源的氨基酸序列，從而增加所述植物對(duì)所述脅迫條件的耐受性。
根據(jù)本發(fā)明的另外一個(gè)方面，提供了增加植物的生物量、活力和/或產(chǎn)量的方法，所述方法包括在所述植物中表達(dá)編碼多肽的外源多核苷酸，所述多肽具有與SEQ ID NO177、110、113、114、117、118、120、122、125、128、129、132、133、136、139、141、146、151、158、159、160、162、163、164、165、166、167、173、178、179、182、186、187、188、189、193、195、196、202、203、207、210、211、212、213、214、215、216、217、218、1341或1343至少85％同源的氨基酸序列，從而增加所述植物的生物量、活力和/或產(chǎn)量。
根據(jù)本發(fā)明的另外一個(gè)方面，提供了增加植物的肥料使用效率和/或攝取的方法，所述方法包括在所述植物中表達(dá)編碼多肽的外源多核苷酸，所述多肽具有與SEQ ID NO177、110、113、114、117、118、120、122、125、128、129、132、133、136、139、141、146、151、158、159、160、162、163、164、165、166、167、173、178、179、182、186、187、188、189、193、195、196、202、203、207、210、211、212、213、214、215、216、217、218、1341或1343至少85％同源的氨基酸序列，從而增加所述植物的肥料使用效率和/或攝取。
根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案中更進(jìn)一步的特征，所述表達(dá)通過下述來實(shí)現(xiàn) (a)用所述外源多核苷酸轉(zhuǎn)化所述植物的細(xì)胞； (b)從所述細(xì)胞產(chǎn)生成熟植物；和 (c)在適合于在所述成熟植物中表達(dá)所述外源多核苷酸的條件下培養(yǎng)所述成熟植物。
根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案中更進(jìn)一步的特征，所述轉(zhuǎn)化通過將核酸構(gòu)建體引入所述植物細(xì)胞中來實(shí)現(xiàn)，所述核酸構(gòu)建體包含所述外源多核苷酸和至少一種能夠指導(dǎo)所述外源多核苷酸在所述植物細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。
根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案中更進(jìn)一步的特征，所述至少一種啟動(dòng)子是組成型啟動(dòng)子。
根據(jù)下述本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中進(jìn)一步的特征，所述啟動(dòng)子是組成型啟動(dòng)子。
根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案中更進(jìn)一步的特征，所述組成型啟動(dòng)子是CaMV 35S啟動(dòng)子。
根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案中更進(jìn)一步的特征，所述啟動(dòng)子是誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。
根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案中更進(jìn)一步的特征，所述誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是非生物脅迫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。
根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案中更進(jìn)一步的特征，所述啟動(dòng)子是組織特異性啟動(dòng)子。
根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案中更進(jìn)一步的特征，所述組織是根組織。
根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案中更進(jìn)一步的特征，所述宿主細(xì)胞是植物細(xì)胞。
根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案中更進(jìn)一步的特征，所述植物細(xì)胞形成雙子葉植物細(xì)胞的部分。
根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案中更進(jìn)一步的特征，所述植物細(xì)胞形成單子葉植物細(xì)胞的部分。
根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案中更進(jìn)一步的特征，所述脅迫條件是非生物脅迫。
根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案中更進(jìn)一步的特征，所述非生物脅迫選自鹽度、干旱、低溫、高溫、重金屬毒性、無氧生活、滲壓劑和營(yíng)養(yǎng)物缺乏。
根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案中更進(jìn)一步的特征，所述營(yíng)養(yǎng)物是氮。
根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案中更進(jìn)一步的特征，所述植物是雙子葉植物。
根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案中更進(jìn)一步的特征，所述植物是單子葉植物。
根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案中更進(jìn)一步的特征，所述多核苷酸包含選自SEQ ID NO68、1、4、5、8、9、11、13、16、19、20、23、24、27、30、32、37、42、49、50、51、53、54、55、56、57、58、64、69、70、73、77、78、79、80、84、86、87、93、94、98、101、102、103、104、105、106、107、108、109、219-767、1317、1318、1319、1320、1321、1322、1323、1324、1325、1326、1327、1328、1329、1330、1331、1332、1333、1334、1335、1336、1340或1342的核酸序列。
根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案中更進(jìn)一步的特征，所述氨基酸序列如SEQ ID NO177、110、113、114、117、118、120、122、125、128、129、132、133、136、139、141、146、151、158、159、160、162、163、164、165、166、167、173、178、179、182、186、187、188、189、193、195、196、202、203、207、210、211、212、213、214、215、216、217、218、768-1051、1053-1098、1100-1316、1341或1343中所示。
根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案中更進(jìn)一步的特征，所述條件是非生物脅迫條件。
根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案中更進(jìn)一步的特征，所述條件是肥料缺乏條件。
根據(jù)本發(fā)明的另外一個(gè)方面，提供了用于灌溉的方法，所述方法包括 (a)在土壤上或土壤中放置滴灌系統(tǒng)，以獲得在X和Y方向上彼此相隔20-40cm分布的灌溉孔；和 (b)以0.5-2升水/小時(shí)的灌溉速率通過每個(gè)所述灌溉孔進(jìn)行連續(xù)灌溉。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步的方面，提供了用于模擬干旱條件的灌溉系統(tǒng)，其包含 (i)具有在X和Y方向上彼此相隔20-40cm分布的灌溉孔的滴灌系統(tǒng)；和 (ii)用于以0.5-2升水/小時(shí)通過每個(gè)所述灌溉孔進(jìn)行連續(xù)灌溉的水供應(yīng)和控制系統(tǒng)。
本發(fā)明通過提供這樣的多核苷酸和多肽成功地解決了目前已知布置的缺點(diǎn)，所述多核苷酸和多肽在表達(dá)其的轉(zhuǎn)基因植物中改善肥料使用/攝取效率。
除非另有定義，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解相同的含義。盡管可以在本發(fā)明的實(shí)踐和測(cè)試中使用與本文描述的那些相似或等價(jià)的方法和材料，但下文描述了合適的方法和材料。在沖突的情況下，以本專利說明書(包括定義)為準(zhǔn)。此外，材料、方法和實(shí)施例僅是舉例說明性的而不意欲是限制性的。
附圖簡(jiǎn)述 在此僅作為例子通過參考附圖來描述本發(fā)明。在現(xiàn)在詳細(xì)地具體參考附圖的情況下，應(yīng)當(dāng)強(qiáng)調(diào)，所顯示的細(xì)節(jié)僅作為例子并且是為了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案的舉例說明性討論，并且為提供被認(rèn)為是本發(fā)明的原則和概念方面的最有用和容易理解的描述而呈現(xiàn)。在這點(diǎn)上，不試圖比對(duì)于本發(fā)明的基本理解來說所需的更詳細(xì)地顯示本發(fā)明的結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)，使用附圖進(jìn)行的描述使得下述內(nèi)容對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的本發(fā)明的幾種形式如何能夠在實(shí)踐中具體體現(xiàn)。
在附圖中

圖1A是示意性的圖解，描述了干旱中植物根系的發(fā)育。不足的土壤濕度誘導(dǎo)較深根系的形成。該圖改編自JE Weaver[RootDevelopment of Field Crops.McGraw Hill Inc.，New York，第291頁(yè)(1926)]。
圖1B是示意性的圖示，其顯示了被選擇用于改善NUE性狀的生物學(xué)策略以及所述策略向在計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)挖掘(computational datamining)期間執(zhí)行的查詢的變換。
圖2A-D顯示了FUE_1的數(shù)字化表達(dá)。
圖3A-D是曲線圖，顯示了作為土壤中的氮含量的函數(shù)的對(duì)照基因(氮轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和谷氨酰胺合酶)的表達(dá)。植物在10升罐中生長(zhǎng)，使用濃度漸增的NH4NO3(0.005、0.05、0.5和5mM)或KNO3(0.01、0.1、1或5mM)。植物生長(zhǎng)約30天，并將組織在液氮中進(jìn)行速凍。從組織中提取RNA，并隨后用DNA酶進(jìn)行處理。將RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，并用于使用實(shí)時(shí)PCR的定量測(cè)定法。對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)化，將每個(gè)點(diǎn)處的表達(dá)除以4個(gè)持家基因的表達(dá)的幾何平均值，如實(shí)施例2中所述的。顯示的結(jié)果是標(biāo)準(zhǔn)化的表達(dá)和于所檢查的最高濃度(5mM NH4NO3或5mM KNO3)時(shí)測(cè)量的表達(dá)水平之間的比率。
圖4A-K是曲線圖，顯示了與氮利用率(availability)相關(guān)的本發(fā)明多核苷酸序列的表達(dá)。
圖5A-E是曲線圖，顯示了與氮利用率反相關(guān)的本發(fā)明多核苷酸序列的表達(dá)。
圖6是用于從數(shù)字圖像中對(duì)植物蓮座型葉叢面積進(jìn)行定量的技術(shù)的示意性逐步圖示。處理步驟過濾掉個(gè)體植物的綠色部分。在指定獨(dú)個(gè)ROIs(目的區(qū)(Region of Interest))后，計(jì)算由蓮座型葉叢區(qū)域覆蓋的面積并輸出至工作表。
圖7A-B是照片，顯示了本發(fā)明的多核苷酸增加氮使用效率的能力。圖7A是在TT105啟動(dòng)子下表達(dá)FUE_504(SEQ ID NO108)的轉(zhuǎn)基因-T1植物。圖7B是在35S啟動(dòng)子下表達(dá)FUE_43(SEQ ID NO70)的1個(gè)代表性轉(zhuǎn)基因事件。植物在非常受限的氮條件(0.05和0.2mM結(jié)合無機(jī)氮(combined inorganic nitrogen))下生長(zhǎng)。對(duì)照植物(在相同啟動(dòng)子下表達(dá)報(bào)道基因的植物或非轉(zhuǎn)基因植物)類似地進(jìn)行處理。將小植株大小方面的眾所周知的差異變換成所測(cè)量的小植株鮮重方面的顯著差異。
圖8是照片，顯示了來自表達(dá)FUE_34_Evo(SEQ ID NO54)的3個(gè)獨(dú)立轉(zhuǎn)基因事件的轉(zhuǎn)基因植物。如通過三盲測(cè)定法(triple blindassay)所測(cè)定的，該植物在每個(gè)結(jié)節(jié)處顯示出令人印象深刻的分枝。來自該植物的根系也是高度分枝和緊湊的(未顯示)。
圖9顯示了表達(dá)FUE_40(也稱為FUE6/40，SEQ ID NO11)的植物的5個(gè)獨(dú)立轉(zhuǎn)基因事件。明顯值得注意的是，花莖是異常筆直和不易彎曲的。此外，可以計(jì)數(shù)到異常高數(shù)目的長(zhǎng)角果。因此，表達(dá)FUE_40的轉(zhuǎn)基因植物是非常多產(chǎn)的。
圖10依照本發(fā)明的教導(dǎo)的灌溉系統(tǒng)的圖解。
優(yōu)選實(shí)施方案的描述 本發(fā)明涉及分離的多肽、編碼其的多核苷酸、表達(dá)其的轉(zhuǎn)基因植物和使用其的方法。具體而言，本發(fā)明可以用于增加轉(zhuǎn)基因植物的肥料使用效率和脅迫抗性以及生物量、活力和產(chǎn)量。
參考附圖和隨附的說明可以更好地理解本發(fā)明的原則和操作。
在詳細(xì)解釋至少一個(gè)本發(fā)明的實(shí)施方案前，應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明在其應(yīng)用方面不限制于下述說明書中所示的或由實(shí)施例例示的細(xì)節(jié)。本發(fā)明能夠是其他實(shí)施方案或者能夠以各種方式來實(shí)踐或施行。此外，應(yīng)當(dāng)理解，本文所使用的措辭和術(shù)語用于描述目的，并且不應(yīng)被視為限制性的。
由于氮(N)肥成本的增加和農(nóng)作物植物生產(chǎn)的利潤(rùn)處于風(fēng)險(xiǎn)中，因此科學(xué)家面臨開發(fā)改善N使用效率(NUE)的策略的挑戰(zhàn)。因此，施肥不足或施肥過多導(dǎo)致利潤(rùn)喪失。較低的N施用率導(dǎo)致減少的生物量，如可以由減少的分蘗、大小、差的籽粒灌漿、減少的產(chǎn)量以及低的氨基酸和蛋白質(zhì)含量所證明的。備選地，氮的過量施用可以導(dǎo)致減少的產(chǎn)量、更高的投入成本和增加的對(duì)環(huán)境的危險(xiǎn)。
在使本發(fā)明變?yōu)閷?shí)際的同時(shí)，本發(fā)明人通過艱苦的生物信息學(xué)分析和實(shí)驗(yàn)揭示了多核苷酸序列和由其編碼的多肽，其可以用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物具有改善的肥料使用效率、脅迫耐受性、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值(例如，氨基酸和蛋白質(zhì)含量)、生物量、產(chǎn)量和/或活力。
如在下文和隨后的實(shí)施例部分中所舉例說明的，基于幾個(gè)標(biāo)準(zhǔn)來選擇玉米多核苷酸序列(參見隨后的實(shí)施例部分的實(shí)施例1)。這些包括在根尖處，特別是在水分脅迫的根(例如，干旱)中高水平的計(jì)算出的數(shù)字化表達(dá)。關(guān)于上述多核苷酸序列的第二次過濾基于它們的直向同源序列(即，雙子葉植物或其他單子葉植物物種)的數(shù)字化表達(dá)。選擇出顯示與玉米基因(例如受試的經(jīng)脅迫處理的植物的根文庫(kù))相似的數(shù)字化表達(dá)的直向同源基因。數(shù)據(jù)挖掘和注釋工具用于過濾出可能對(duì)細(xì)胞代謝具有廣泛影響的基因。例如，選擇出可以修飾根構(gòu)造(architecture)、增加氮貯存能力、改善氮同化過程和增強(qiáng)滯綠(stay-green)性狀的基因。最終選擇出那些基因用于分子驗(yàn)證(參見實(shí)施例3和9)。應(yīng)用于鑒定本發(fā)明的多核苷酸序列的計(jì)算機(jī)過濾的示意性圖示呈現(xiàn)于圖1B中，并且其僅為了舉例說明而提供。
如此鑒定的序列通過實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。如實(shí)施例6-11中所示，已證明表達(dá)本發(fā)明的核酸序列的轉(zhuǎn)基因植物具有增加的肥料使用/攝取效率、對(duì)非生物脅迫的耐受性、生物量和產(chǎn)量。這些結(jié)果強(qiáng)烈地支持本發(fā)明方法的穩(wěn)健性，并證實(shí)這些基因在農(nóng)業(yè)中的用途。
因此，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面提供了核酸構(gòu)建體，其包含與選自SEQ ID NO68、1、4、5、8、9、11、13、16、19、20、23、24、27、30、32、37、42、49、50、51、53、54、55、56、57、58、64、69、70、73、77、78、79、80、84、86、87、93、94、98、101、102、103、104、105、106、107、108、109、1340和1342的核苷酸序列至少約70％、至少約75％、至少約80％、至少約81％、至少約82％、至少約83％、至少約84％、至少約85％、至少約86％、至少約87％、至少約88％、至少約89％、至少約90％、至少約91％、至少約92％、至少約93％、至少約93％、至少約94％、至少約95％、至少約96％、至少約97％、至少約98％、至少約99％或更多例如100％同一的核酸序列。
核酸序列可以編碼多肽序列，所述多肽序列包含與SEQ ID NO 177、110、113、114、117、118、120、122、125、128、129、132、133、136、139、141、146、151、158、159、160、162、163、164、165、166、167、173、178、179、182、186、187、188、189、193、195、196、202、203、207、210、211、212、213、214、215、216、217、218、1341或1343至少約70％、至少約75％、至少約80％、至少約81％、至少約82％、至少約83％、至少約84％、至少約85％、至少約86％、至少約87％、至少約88％、至少約89％、至少約90％、至少約91％、至少約92％、至少約93％、至少約93％、至少約94％、至少約95％、至少約96％、至少約97％、至少約98％、至少約99％或更多例如100％同源的氨基酸序列。
同源性(例如同源性百分比)可以使用任何同源性比較軟件來測(cè)定，所述同源性比較軟件包括例如國(guó)立生物技術(shù)信息中心(NationalCenter of Biotechnology Information，NCBI)的BlastP軟件，例如通過使用缺省參數(shù)。
同一性(例如同源性百分比)可以使用任何同源性比較軟件來測(cè)定，所述同源性比較軟件包括例如國(guó)立生物技術(shù)信息中心的BlastP軟件，例如通過使用缺省參數(shù)。
根據(jù)本發(fā)明的這個(gè)方面的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，分離的多核苷酸如SEQ ID NO68、1、4、5、8、9、11、13、16、19、20、23、24、27、30、32、37、42、49、50、51、53、54、55、56、57、58、64、69、70、73、77、78、79、80、84、86、87、93、94、98、101、102、103、104、105、106、107、108、109、219-767、1317、1318、1319、1320、1321、1322、1323、1324、1325、1326、1327、1328、1329、1330、1331、1332、1333、1334、1335或1336中所示。
本發(fā)明的核酸序列(在本文中也稱為分離的多核苷酸)指單或雙鏈核酸序列，其是分離的且以RNA序列、互補(bǔ)多核苷酸序列(cDNA)、基因組多核苷酸序列和/或復(fù)合的多核苷酸序列(例如，上述的組合)的形式提供。
如本文所使用的，短語“互補(bǔ)多核苷酸序列”指通過使用逆轉(zhuǎn)錄酶或任何其他RNA依賴性DNA聚合酶而從信使RNA的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的序列。此類序列隨后可以通過使用DNA依賴性DNA聚合酶而在體內(nèi)或體外進(jìn)行擴(kuò)增。
如本文所使用的，短語“基因組多核苷酸序列”指衍生(分離)自染色體的序列，因此它代表了染色體的連續(xù)的部分。
如本文所使用的，短語“復(fù)合的多核苷酸序列”指這樣的序列，其是至少部分地互補(bǔ)的和至少部分地基因組的。復(fù)合的序列可以包括編碼本發(fā)明的多肽所需的某些外顯子序列，以及插入其間的某些內(nèi)含子序列。內(nèi)含子序列可以是任何來源的，包括其他基因，并且通常將包括保守的剪接信號(hào)序列。此類內(nèi)含子序列可以進(jìn)一步包括順式作用表達(dá)調(diào)控元件。
本發(fā)明的多肽的核酸序列可以就植物表達(dá)進(jìn)行優(yōu)化。此類優(yōu)化的序列在SEQ ID NO1317、1319、1320、1321、1322、1324、1325、1326、1327、1328、1329、1330、1331、1332、1333、1334、1335和1336中提供。此類序列修飾的例子包括但不限于，更緊密地接近在目的植物物種中通常發(fā)現(xiàn)的那種的經(jīng)改變的G/C含量，和去除在所述植物物種中非典型地發(fā)現(xiàn)的密碼子(通常被稱為密碼子優(yōu)化)。
短語“密碼子優(yōu)化”指選擇合適的DNA核苷酸用于在結(jié)構(gòu)基因或其片段內(nèi)使用，所述DNA核苷酸接近目的植物內(nèi)的密碼子使用。因此，優(yōu)化的基因或核酸序列指這樣的基因，在所述基因中天然或天然存在的基因的核苷酸序列已進(jìn)行修飾，以便利用在植物中統(tǒng)計(jì)學(xué)上優(yōu)選的或統(tǒng)計(jì)學(xué)上偏好的密碼子。核苷酸序列通常在DNA水平上進(jìn)行檢查，并且使用任何合適的程序來確定對(duì)于在植物物種中的表達(dá)來說優(yōu)化的編碼區(qū)，例如如Sardana等人(1996，Plant Cell Reports 15677-681)中所描述的。在這種方法中，密碼子使用的標(biāo)準(zhǔn)差(密碼子使用偏倚的量度)可以通過下述方式來計(jì)算首先找到該天然基因的每種密碼子的使用相對(duì)于高度表達(dá)的植物基因的密碼子使用的平方比例偏差(squared proportional deviation)，隨后計(jì)算平均方差(averagesquared deviation)。使用的公式為1SDCU＝n＝1N[(Xn-Yn)/Yn]2/N，其中Xn指在高度表達(dá)的植物基因中密碼子n的使用頻率，其中Yn指在目的基因中密碼子n的使用頻率，和N指在目的基因中的密碼子總數(shù)目。使用Murray等人(1989，Nuc Acids Res.17477-498)的數(shù)據(jù)，匯編出來自雙子葉植物的高度表達(dá)基因的密碼子使用的表格。
依照關(guān)于特定植物細(xì)胞類型的優(yōu)選密碼子使用來優(yōu)化核酸序列的一種方法基于密碼子優(yōu)化表的直接使用，而不進(jìn)行任何額外的統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算，所述密碼子優(yōu)化表例如為通過日本的NIAS(NationalInstitute of Agrobiological Sciences)DNA庫(kù)在密碼子使用數(shù)據(jù)庫(kù)(Codon Usage Database)中在線提供的那些(http://www.kazusa.or.jp/codon/)。該密碼子使用數(shù)據(jù)庫(kù)包含用于許多不同物種的密碼子使用表，其中每個(gè)密碼子使用表基于在Genbank中存在的數(shù)據(jù)通過統(tǒng)計(jì)學(xué)方法來確定。
通過使用上述表來確定在特定物種(例如，稻)中每種氨基酸的最優(yōu)選或最偏愛的密碼子，編碼目的蛋白質(zhì)的天然存在的核苷酸序列可以是針對(duì)那種特定植物物種進(jìn)行優(yōu)化的密碼子。這通過序列方式來完成關(guān)于氨基酸，用統(tǒng)計(jì)學(xué)上更偏愛的相應(yīng)密碼子替換在特定物種基因組中可能具有低統(tǒng)計(jì)學(xué)發(fā)生率的密碼子。然而，可以選擇一種或多種較不偏好的密碼子，以刪除現(xiàn)有的限制位點(diǎn)，以在潛在有用的接頭處形成新的限制位點(diǎn)(5′和3′末端以添加信號(hào)肽或末端盒，可以用于切割片段并將片段剪接在一起以產(chǎn)生正確的全長(zhǎng)序列的內(nèi)部位點(diǎn))，或消除可能負(fù)面影響mRNA穩(wěn)定性或表達(dá)的核苷酸序列。
天然存在的編碼核苷酸序列可以在任何修飾前已包含相應(yīng)于在特定植物物種中的統(tǒng)計(jì)學(xué)上偏好的密碼子的許多密碼子。因此，天然核苷酸序列的密碼子優(yōu)化可以包含確定天然核苷酸序列內(nèi)的哪些密碼子就特定植物而言不是統(tǒng)計(jì)學(xué)上偏好的，并且依照特定植物的密碼子使用表來修飾這些密碼子，以產(chǎn)生密碼子優(yōu)化的衍生物。經(jīng)修飾的核苷酸序列可以就植物密碼子使用來說是全部或部分優(yōu)化的，條件是由經(jīng)修飾的核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)以比由相應(yīng)的天然存在或天然的基因編碼的蛋白質(zhì)更高的水平產(chǎn)生。通過改變密碼子使用來構(gòu)建合成基因在例如PCT專利申請(qǐng)93/07278中得到描述。
因此，本發(fā)明包括上文描述的核酸序列；其片段，可與之雜交的序列，與其同源的序列，與其直向同源的序列，以不同的密碼子使用編碼相似多肽的序列，特征在于突變例如一個(gè)或多個(gè)核苷酸的刪除、插入或置換(天然存在的，或者隨機(jī)地或以靶向方式人工誘導(dǎo)的)的經(jīng)改變的序列。
本發(fā)明的核酸序列可以編碼先前未表征的多肽。
因此，本發(fā)明提供了這樣的多肽，其具有與選自SEQ ID NO177、110、113、114、117、118、120、122、125、128、129、132、133、136、139、141、146、151、158、159、160、162、163、164、165、166、167、173、178、179、182、186、187、188、189、193、195、196、202、203、207、210、211、212、213、214、215、216、217、218、1341或1343的氨基酸序列至少約70％、至少約75％、至少約80％、至少約81％、至少約82％、至少約83％、至少約84％、至少約85％、至少約86％、至少約87％、至少約88％、至少約89％、至少約90％、至少約91％、至少約92％、至少約93％、至少約93％、至少約94％、至少約95％、至少約96％、至少約97％、至少約98％、至少約99％，或更多例如100％同源的氨基酸序列。
根據(jù)本發(fā)明的這個(gè)方面的一個(gè)實(shí)施方案，分離的多肽包含選自177、110、113、114、117、118、120、122、125、128、129、132、133、136、139、141、146、151、158、159、160、162、163、164、165、166、167、173、178、179、182、186、187、188、189、193、195、196、202、203、207、210、211、212、213、214、215、216、217、218、768-1051、1053-1098、1100-1315、1316、1341或1343的氨基酸序列。
本發(fā)明還包括與上述多肽同源或直向同源的序列，上述多肽的片段，以及具有突變例如一個(gè)或多個(gè)氨基酸的刪除、插入或置換(天然存在的，或者隨機(jī)地或以靶向方式人工誘導(dǎo)的)的多肽。
本發(fā)明的多核苷酸和多肽用于植物表達(dá)。
如本文所使用的，術(shù)語“植物”包含整株植物、植物的祖先和后代以及植物部分，包括種子、枝條、莖、根(包括塊莖)，以及植物細(xì)胞、組織和器官。因此，術(shù)語“植物”還包含懸浮培養(yǎng)物、胚胎、分生組織區(qū)域、愈傷組織、葉、配子體、孢子體、花粉和小孢子。在本發(fā)明的方法中特別有用的植物包括屬于綠色植物(Viridiplantae)總科的所有植物，特別是具有商業(yè)價(jià)值的單子葉植物和雙子葉植物，包括選自下述非限制性列表的飼料或草料用豆科植物、觀賞植物、食物農(nóng)作物、樹或灌木金合歡屬物種(Acacia spp.)、槭屬物種(Acerspp.)、獼猴桃屬物種(Actinidia spp.)、七葉樹屬物種(Aesculusspp.)、新西蘭貝殼杉(Agathis australis)、Albizia amara、三色桫欏(Alsophila tricolor)、須芒草屬物種(Andropogon spp.)、落花生屬物種(Arachis spp)、檳榔(Areca catechu)、Asteliafragrans、鷹嘴紫云英(Astraga luscicer)、多小葉紅蘇木(Baikiaeaplurijuga)、樺屬物種(Betula spp.)、蕓苔屬物種(Brassica spp.)、木欖(Bruguiera gymnorrhiza)、紅紫丁香(Burkea africana)、紫鉚(Butea frondosa)、Cadaba farinosa、朱纓花屬物種(Calliandraspp)、茶(Camel lasinensis)、美人蕉(Canna indica)、辣椒屬物種(Capsicum spp.)、決明屬物種(Cassia spp.)、距瓣豆(Centroema pubescens)、木瓜屬物種(Chaenomeles spp.)、肉桂(Cinnamomum cassia)、小果咖啡(Coffea arabica)、Colophospermum mopane、繡球小冠花(Coronillia varia)、Cotoneaster serotina、山楂屬物種(Crataegus spp.)、甜瓜屬物種(Cucumis spp.)、柏木屬物種(Cupressus spp.)、銀蕨(Cyatheadealbata)、榅桲(Cydonia oblonga)、Ciyptomeria laponica、香茅屬物種(Cymbopogon spp.)、Cynthea dealbata、榅桲(Cydoniaoblonga)、Dalbergia monetaria、大葉骨碎補(bǔ)(Davaliladivaricata)、山螞蝗屬物種(Desmodium spp.)、粗糙蚌殼蕨(Dicksonia squarosa)、Diheteropogon amplectens、迪奧豆屬物種(Dioclea spp)、鐮扁豆屬物種(Dolichos spp.)、Doiycnium rectum、Echinochloa pyramidalis、Ehrartiaspp.、穇子(Eleusinecoracana)、畫眉草屬物種(Era grestis spp.)、刺桐屬物種(Erythrinaspp.)、桉屬物種(Eucalyptus spp)、Euclea schimpen、Eulaliavillosa、蕎麥屬物種(Fagopyrum spp.)、Felloa sellowiana、草莓屬物種(Fragaria spp.)、千斤拔屬(Flemingia spp.)、Freycinetiabanksii、東亞老鸛草(Geraniu mthunbergi)、銀杏(Ginkgo biloba)、野大豆(Glycine javanica)、墨西哥丁香屬物種(Gliricidia spp.)、陸地棉(Gossypium hirsutum)、銀樺屬物種(Grevillea spp.)、鞘籽古夷布提木(Guibourtia coleosperma)、巖黃芪屬物種(Hedysarum spp.)、牛鞭草(Hemarthia altissima)、黃茅(Heteropogon contortus)、大麥(Hordeum vulgare)、紅苞茅(Hyparrhenia rufa)、小連翹(Hypericum erectum)、Hypertheliadissoluta、異花木藍(lán)(Indigo incarnata)、鳶尾屬物種(Iris spp.)、麻瘋樹(Jatropha curcas)、Leptarrhena pyrolifolia、胡枝子屬物種(Lespediza spp.)、萵苣屬物種(Lettuca spp.)、銀合歡(Leucaenaleucocephala)、Loudetia simplex、Lotonus bainesi、百脈根屬物種(Lotus spp.)、Macrotyloma axifiare、蘋果屬物種(Malus spp.)、木薯(Maniho tesculenta)、紫苜蓿(Medicago sativa)、水杉(Metasequoia glyptostroboides)、香蕉(Musa sapientum)、煙草屬物種(Nicotianum spp.)、驢食豆屬物種(Onobtychis spp.)、鳥足豆屬物種(Ornithopus spp.)、稻屬物種(Oryza spp.)、Peltophorum african urn、狼尾草屬物種(Pennisetum spp.)、Perseagratissima、碧冬茄屬物種(Petunia spp.)、菜豆屬物種(Phaseolusspp.)、檳榔竹(Phoenix canariensis)、新西蘭劍麻(Phormiumcookianum)、石楠屬物種(Photinia spp.)、白云杉(Picea glauca)、松屬物種(Pinus spp.)、豌豆(Pisum sativum)、新西蘭羅漢松(Podocarpus totara)、Pogonarthria flecki、Pogonarthriasquarrosa、楊屬物種(Populus spp.)、瓜葉牧豆(Prosopiscineraria)、花旗松(Pseudotsuga menziesi)、Pterolobiumstellatum、西洋梨(Pyrus communis)、櫟屬物種(Quercus spp.)、厚葉石斑木(Rhaphiolepsis umbellata)、美味棒花棕(Rhopalostylissapida)、Rhu.s natalensis、歐洲醋栗(Ribes grossularia)、茶藨子屬物種(Ribes spp.)、刺槐(Robinia pseudoacacia)、薔薇屬物種(Rosa spp.)、懸鉤子屬物種(Rubus spp.)、柳屬物種(Salixspp.)、紅裂稃草(Schyzachyrium sanguineurn)、金松(Sciadopitysverticillata)、北美紅杉(Sequoia sempen′irens)、巨杉(Sequoiadendron giganteum)、兩色高粱(Sorghum bicolor)、菠菜屬物種(Spinacia spp.)、Sporobolus fimbriatus、Stiburusalopecuroides、矮柱花草(Stylosanthos humilis)、葫蘆茶屬物種(Tadehagi spp)、落羽杉(Taxodium distichum)、阿拉伯黃背草(Themeda triandra)、三葉草屬物種(Trifollum spp.)、小麥屬物種(Triticum spp.)、異葉鐵杉(Tsuga heterophylla)、越桔屬物種(Vaccinium spp.)、蠶豆屬物種(Vicia spp.)、葡萄(Vitisvinifera)、Watsonia pyramidata、馬蹄蓮(Zantedeschiaaethiopica)、玉蜀黍(Zea mays)、莧屬植物、洋薊、天門冬、球花甘藍(lán)、抱子甘藍(lán)、卷心菜、卡諾拉油菜(canola)、胡蘿卜、花椰菜、芹菜、散葉甘藍(lán)(collard greens)、亞麻、羽衣甘藍(lán)、兵豆、油用油菜(oilseed rape)、咖啡黃葵、洋蔥、馬鈴薯、稻、大豆、稻草、甜菜、甘蔗、向日葵、番茄、南瓜、茶、樹。備選地，可以使用藻類及其他非綠色植物。
在植物內(nèi)表達(dá)本發(fā)明的外源多核苷酸可以通過下述方式來實(shí)現(xiàn)用外源多核苷酸轉(zhuǎn)化植物的一種或多種細(xì)胞，隨后從轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中產(chǎn)生成熟植物，并且在適合于在成熟植物內(nèi)表達(dá)外源多核苷酸的條件下培養(yǎng)成熟植物。
優(yōu)選地，轉(zhuǎn)化通過將核酸構(gòu)建體引入植物細(xì)胞中來實(shí)現(xiàn)，所述核酸構(gòu)建體包含本發(fā)明的外源多核苷酸和至少一種能夠指導(dǎo)外源多核苷酸在植物細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。合適的轉(zhuǎn)化方法的更多細(xì)節(jié)在下文提供。
如本文所使用的，術(shù)語“啟動(dòng)子”指位于基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游的DNA區(qū)域，RNA聚合酶與所述DNA區(qū)域結(jié)合以起始RNA的轉(zhuǎn)錄。啟動(dòng)子控制基因在何處(例如，植物的哪個(gè)部分，動(dòng)物內(nèi)的哪個(gè)器官，等等)和/或何時(shí)(例如，在生物體生存期中的哪個(gè)階段或狀況)表達(dá)。
任何合適的啟動(dòng)子序列可以被本發(fā)明的核酸構(gòu)建體使用。下述類型的啟動(dòng)子是用于過表達(dá)所選基因的啟動(dòng)子的非限制性例子通用啟動(dòng)子、根特異性啟動(dòng)子、根尖特異性啟動(dòng)子、干旱誘導(dǎo)的根啟動(dòng)子、生物脅迫誘導(dǎo)的啟動(dòng)子、非生物脅迫誘導(dǎo)的啟動(dòng)子、氮誘導(dǎo)的啟動(dòng)子、銨或硝酸鹽誘導(dǎo)的啟動(dòng)子、磷肥誘導(dǎo)的啟動(dòng)子、葉特異性啟動(dòng)子、誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、組成型啟動(dòng)子、具有2個(gè)或更多個(gè)上述特征的啟動(dòng)子、或其他新型啟動(dòng)子。
啟動(dòng)子的選擇很大程度上基于目的表型，并且通過如下因素來確定，例如組織(例如，種子、果實(shí)、根、花粉、維管組織、花、心皮等)、可誘導(dǎo)性(例如，對(duì)創(chuàng)傷、熱、冷、干旱、光、病原體等作出響應(yīng))、時(shí)機(jī)、發(fā)育階段等。眾多已知的啟動(dòng)子已得到表征，并且可以有利地用于促進(jìn)本發(fā)明的多核苷酸在目的轉(zhuǎn)基因植物或細(xì)胞中表達(dá)。然而，應(yīng)當(dāng)采取措施以選擇將會(huì)介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因的所需表達(dá)水平的啟動(dòng)子，以便避免再分配過量能源，這可能影響最終產(chǎn)量、強(qiáng)度、質(zhì)量和倒伏以及葉病原體的發(fā)生率。這還應(yīng)從經(jīng)濟(jì)觀點(diǎn)進(jìn)行審視。
合適的組成型啟動(dòng)子包括例如，CaMV35S啟動(dòng)子(SEQ ID NO1337；Odell等人，Nature 313810-812，1985)；擬南芥At6669啟動(dòng)子(SEQ ID NO1514，PCT No WO2004/104162)；TT105(SEQ IDNO1339，PCT NO.WO2004/081173)；玉米Ubi 1(Christensen等人，Plant Sol.Biol.18675-689，1992)；稻肌動(dòng)蛋白(McElroy等人，Plant Cell 2163-171，1990)；pEMU(Last等人，Theor.Appl.Genet.81581-588，1991)；和合成的Super MAS(Ni等人，The PlantJournal 7661-76，1995)。其他組成型啟動(dòng)子包括美國(guó)專利號(hào)5,659,026；5,608,149；5.608,144；5,604,121；5.569,5975.466,785；5,399,680；5,268,463；和5,608,142中的那些。
合適的組織特異性啟動(dòng)子包括但不限于，葉特異性啟動(dòng)子，例如由下述參考文獻(xiàn)描述的Yamamoto等人，Plant J.12255-265，1997；Kwon等人，Plant Physiol.105357-67，1994；Yamamoto等人，Plant Cell Physiol.35773-778，1994；Gotor等人，Plant J.3509-18，1993；Orozco等人，Plant Mol.Biol.231129-1138，1993；和Matsuoka等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 909586-9590，1993。特別優(yōu)選的是根啟動(dòng)子，例如ROOTP啟動(dòng)子[SEQ ID NO1338；基因ATXTH19的上游區(qū)(AT4G30290，木葡聚糖內(nèi)轉(zhuǎn)葡糖基酶(Xyloglucan endotransglucosylase)/水解酶19，在Vissenberg K，等人Plant Cell Physiol.2005Jan；46(1)192-200中描述]。
已知各種植物基因啟動(dòng)子響應(yīng)于環(huán)境的、激素的、化學(xué)軛、發(fā)育的信號(hào)并且以組織活性方式調(diào)節(jié)基因表達(dá)。例子為，種子特異性啟動(dòng)子的(例如美國(guó)專利號(hào)5,773,697中描述的油菜籽蛋白、菜豆蛋白或DC3啟動(dòng)子)，在果實(shí)成熟期間有活性的果實(shí)特異性啟動(dòng)子，例如dru1啟動(dòng)子(美國(guó)專利號(hào)5,783,393)或2A11啟動(dòng)子(美國(guó)專利號(hào)4,943,674)和番茄多聚半乳糖醛酸酶啟動(dòng)子(Bird等人(1988)PlantMol.Biol.11651-662)，根特異性啟動(dòng)子，例如ARSK1，和在美國(guó)專利號(hào)5,618,988、5,837,848和5,905,186中公開的那些，表皮特異性啟動(dòng)子，包括CUT1(Kunst等人(1999)Biochem.Soc.Tians.28651-654)，花粉活性啟動(dòng)子例如PTA29、PTA26和PTA13(美國(guó)專利號(hào)5,792,929)，在維管組織中有活性的啟動(dòng)子(Ringli和Keller(1998)Plant Mol.Biol.37977-988)，花特異性的(Kaiser等人(1995)Plant Mol.Biol.28231-243)，花粉(Baerson等人(1994)Plant Mol.Biol.261947-1959)，心皮(Ohl等人(1990)Plant Cell 2837-848)，花粉和胚珠(Baerson等人(1993)PlantMol.Biol.22255-267)，生長(zhǎng)素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(例如van der Kop等人(1999)Plant Mol.Biol.39979-990或Baumann等人(1999)Plant Cell 11323-334中描述的啟動(dòng)子)，細(xì)胞分裂素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(Guevara-Garcia(1998)Plant Mol.Biol.38743-753)，響應(yīng)赤霉素的啟動(dòng)子(Shi等人(1998)Plant Mol.Biol.381053-1060，Willmott等人(1998)Plant Mol.Biol.38817-825)等等。另外的啟動(dòng)子是響應(yīng)下述因素而引起表達(dá)的那些熱(Ainley等人(1993)Plant Mol.Biol.2213-23)，光(例如，Kuhlemeier等人(1989)Plant Cell1471-478中描述的豌豆rbcS-3A啟動(dòng)子，以及Schaffier和Sheen(1991)Plant Cell 3997-1012中描述的玉米rbcS啟動(dòng)子)，創(chuàng)傷(例如，Siebertz等人(1989)Plant Cell 1961-968中描述的wun1)，病原體(例如Buchel等人(1999)Plant Mol.Biol.40387-396中描述的PR-1啟動(dòng)子，和Manners等人(1998)Plant Mol.Biol.381071-1080中描述的PDF1.2啟動(dòng)子)，和化學(xué)藥品例如茉莉酮酸甲酯或水楊酸(Gatz(1997)Annu.Rev.Plant Physiol.PlantMol.Biol.4889-108)。此外，表達(dá)的時(shí)機(jī)可以通過使用諸如在衰老時(shí)(Gan和Amasino(1995)Science 2701986-1988)；或在種子發(fā)育晚期時(shí)(Odell等人(1994)Plant Physiol.106447-458)起作用的那些啟動(dòng)子的啟動(dòng)子來控制。
啟動(dòng)子的其他例子是SUC2啟動(dòng)子(Truernit和Sauer，Planta.(1995)196564-70)，和脅迫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子例如RD29A(Yamaguchi-Shinozaki和Shinozaki K.Plant Cell(1994)6251-264)，來自PlantProm數(shù)據(jù)庫(kù)的啟動(dòng)子(Shahmuradov等人Nucleic Acids Res.(2003)31114-7)，稻CatB啟動(dòng)子(Iwamoto等人Plant Physiol Biochem.(2004)42241-9)，磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因家族的根特異性和磷酸鹽缺乏誘導(dǎo)型大麥啟動(dòng)子(HvPht1；1和HvPht1；2)(Schunmann等人(2004)；55855-65)，在專利號(hào)WO 2004/081173、專利號(hào)US 5633363、專利號(hào)WO 2000/15662、專利號(hào)WO 2004/013169、專利號(hào)US 2005/010974、專利號(hào)WO2005/035770、專利號(hào)US 2001/0047525、專利號(hào)US 5837848、專利號(hào)US 6018099等中舉例說明的組織特異性和組成型啟動(dòng)子。
本發(fā)明的核酸構(gòu)建體優(yōu)選地進(jìn)一步包含合適的選擇標(biāo)記和/或復(fù)制起點(diǎn)。優(yōu)選地，所使用的核酸構(gòu)建體是穿梭載體，其可以在大腸桿菌(其中構(gòu)建體包含合適的選擇標(biāo)記和復(fù)制起點(diǎn))中繁殖并且與細(xì)胞中的繁殖相容。根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)建體可以是例如質(zhì)粒、桿粒、噬菌粒、粘粒、噬菌體、病毒或人工染色體。
本發(fā)明的核酸構(gòu)建體可以用于穩(wěn)定地或瞬時(shí)地轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞。在穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化中，本發(fā)明的外源多核苷酸被整合到植物基因組中，如此它代表了穩(wěn)定的和經(jīng)遺傳的性狀。在瞬時(shí)的轉(zhuǎn)化中，外源多核苷酸由轉(zhuǎn)化的細(xì)胞表達(dá)，但它不整合到基因組中，如此它代表了瞬時(shí)性狀。
存在用于將外源基因引入單子葉植物和雙子葉植物中的各種方法(Potrykus，I.，Annu.Rev.Plant.Physiol.，Plant.Mol.Biol.(1991)42205-225；Shimamoto等人，Nature(1989)338274-276)。
引起外源DNA穩(wěn)定整合到植物基因組DNA中的原則方法包括2種主要方法 (i)土壤桿菌(Agrobacterium)介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移Klee等人(1987)Annu.Rev.Plant Physiol.38467-486；Klee和Rogersin Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants，第6卷，Molecular Biology of Plant Nuclear Genes，由Schell，J.和Vasil，L.K.編輯，Academic Publishers，San Diego，Calif.(1989)第2-25頁(yè)；Gatenby，in Plant Biotechnology，由Kung，S.和Arntzen，C.J.編輯，Butterworth Publishers，Boston，Mass.(1989)第93-112頁(yè)。
(ii)直接DNA攝取Paszkowski等人，in Cell Culture andSomatic Cell Genetics of Plants，第6卷，Molecular Biology ofPlant Nuclear Genes，由Schell，J.和Vasil，L.K.編輯，AcademicPublishers，San Diego，Calif.(1989)第52-68卷；包括用于將DNA直接攝取到原生質(zhì)體中的方法，Toriyama，K.等人(1988)Bio/Technology 61072-1074。由植物細(xì)胞的短暫電休克誘導(dǎo)的DNA攝取Zhang等人Plant Cell Rep.(1988)7379-384，F(xiàn)romm等人Nature(1986)319791-793。通過粒子轟擊將DNA注射到植物細(xì)胞或組織內(nèi)，Klein等人Bio/Technology(1988)6559-563；McCabe等人Bio/Technology(1988)6923-926；Sanford，Physiol.Plant.(1990)79206-209；通過使用微量移液管(micropipette)系統(tǒng)Neuhaus等人，Theor.Appl.Genet.(1987)7530-36；Neuhaus和Spangenberg，Physiol.Plant.(1990)79213-217；細(xì)胞培養(yǎng)物、胚胎或愈傷組織的玻璃纖維或碳化硅須晶轉(zhuǎn)化，美國(guó)專利號(hào)5,464,765；或通過直接使DNA與正在萌發(fā)的花粉一起溫育，DeWet等人，Experimental Manipulation of Ovule Tissue，編輯Chapman，G.P.和Mantell，S.H.和Daniels，W.Longman，London，(1985)第197-209頁(yè)；和Ohta，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1986)83715-719。
土壤桿菌系統(tǒng)包括使用包含指定DNA區(qū)段的質(zhì)粒載體，所述指定DNA區(qū)段整合到植物基因組DNA中。植物組織的接種方法依植物物種和土壤桿菌遞送系統(tǒng)而變化。廣泛使用的方法是葉盤操作程序，其可以用任何為起始全植物分化提供良好來源的組織外植體來進(jìn)行。Horsch等人，Plant Molecular Biology Manual A5，Kluwer AcademicPublishers，Dordrecht(1988)第1-9頁(yè)。補(bǔ)充的方法采用與真空滲入相組合的土壤桿菌遞送系統(tǒng)。土壤桿菌系統(tǒng)在轉(zhuǎn)基因雙子葉植物的制備中特別可行。
存在直接將DNA轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞中的各種方法。在電穿孔中，使原生質(zhì)體短暫暴露于強(qiáng)電場(chǎng)。在顯微注射中，使用非常小的微量移液管直接將DNA機(jī)械注射到細(xì)胞內(nèi)。在微粒轟擊中，將DNA吸附在微粒例如硫酸鎂晶體或鎢顆粒上，并對(duì)微粒進(jìn)行物理加速?gòu)亩M(jìn)入細(xì)胞或植物組織中。
穩(wěn)定轉(zhuǎn)化后，進(jìn)行植物繁殖。植物繁殖的最常見方法是通過種子。然而，通過種子繁殖的再生具有這樣的缺點(diǎn)，即由于雜合性而在農(nóng)作物中缺乏一致性，因?yàn)榉N子根據(jù)由孟德爾法則控制的遺傳方差(genetic variances)而由植物產(chǎn)生?；旧希總€(gè)種子在遺傳上都是不同的，并且每個(gè)種子將伴隨其自身特異的性狀而生長(zhǎng)。因此，優(yōu)選的是，產(chǎn)生轉(zhuǎn)化的植物，從而使得再生的植物具有與親本轉(zhuǎn)基因植物相同的性狀和特征。因此，優(yōu)選的是，轉(zhuǎn)化的植物通過微繁殖法(micropropagation)進(jìn)行再生，所述微繁殖提供了轉(zhuǎn)化的植物的快速且一致的繁殖。
微繁殖法是從單個(gè)組織塊生長(zhǎng)出新一代植物的方法，所述單個(gè)組織塊已從所選親本植物或栽培品種上切離。這種方法允許大量繁殖具有表達(dá)融合蛋白的優(yōu)選組織的植物。所產(chǎn)生的新一代植物在遺傳上等同于原始植物，并且具有原始植物的所有特征。微繁殖法允許在短時(shí)間段中大量產(chǎn)生優(yōu)質(zhì)植物材料，并且提供以保留原始轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)化植物的特征的方式快速增殖所選栽培品種。對(duì)植物進(jìn)行克隆的優(yōu)點(diǎn)是植物增殖的速度以及所產(chǎn)生的植物的品質(zhì)和一致性。
微繁殖法是需要在階段之間改變培養(yǎng)基或生長(zhǎng)條件的多階段操作程序。因此，微繁殖方法涉及4個(gè)基本階段階段1，最初的組織培養(yǎng)；階段2，組織培養(yǎng)物增殖；階段3，分化和植物形成；和階段4，溫室培養(yǎng)和鍛煉(hardening)。在階段1(最初的組織培養(yǎng))期間，建立組織培養(yǎng)物并證實(shí)不含污染物。在階段2期間，增殖最初的組織培養(yǎng)物直至產(chǎn)生足夠數(shù)目的組織樣品以達(dá)到生產(chǎn)目的。在階段3期間，將在階段2中生長(zhǎng)的組織樣品分開并生長(zhǎng)為個(gè)體小植株。在階段4時(shí)，將轉(zhuǎn)化的小植株轉(zhuǎn)移至溫室以進(jìn)行鍛煉，在其中逐漸增加植物對(duì)光的耐受性從而使得它可以在自然環(huán)境中生長(zhǎng)。
優(yōu)選地，就目的性狀(例如，改善的FUE、脅迫耐受性等)進(jìn)一步選擇如上所述產(chǎn)生的成熟的轉(zhuǎn)化植物。此類篩選測(cè)定法的例子在下文和隨后的實(shí)施例部分中提供。因此，例如，可以在正?；蛎{迫條件下就改善的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值(例如改善的油、氨基酸和/或蛋白質(zhì)含量，以及N含量本身)來篩選轉(zhuǎn)基因植物，如下文將進(jìn)一步描述的。備選地或另外地，使轉(zhuǎn)化和未轉(zhuǎn)化的(野生型)植物暴露于非生物脅迫條件，例如水惡化，亞適溫度，營(yíng)養(yǎng)物缺乏，或優(yōu)選地鹽脅迫條件。鹽脅迫可以以許多方式來實(shí)現(xiàn)，例如通過用高滲溶液灌溉植物，通過在高滲生長(zhǎng)溶液(例如，霍格蘭溶液)中以水培方式培養(yǎng)植物，或通過在高滲生長(zhǎng)培養(yǎng)基(例如，MS培養(yǎng)基)中培養(yǎng)植物。因?yàn)椴煌参镌谒鼈儗?duì)鹽度的耐受性方面顯著不同，所以優(yōu)選根據(jù)具體植物栽培品種或變種的具體特征來調(diào)整灌溉水、生長(zhǎng)溶液或生長(zhǎng)培養(yǎng)基中的鹽濃度，以便對(duì)植物的生理學(xué)和/或形態(tài)學(xué)施加輕度或中度的影響(關(guān)于合適濃度的指導(dǎo)，請(qǐng)參見Bernstein和Kafkafi，Root Growth Under SalinityStress InPlant Roots，The Hidden Half第3版Waisel Y，EshelA和Kafkafi U.(編輯)Marcel Dekker Inc.，New York，2002，和其中的參考文獻(xiàn))。在暴露于脅迫條件后，經(jīng)常地監(jiān)控植物直至在野生型植物中出現(xiàn)實(shí)質(zhì)的生理學(xué)和/或形態(tài)學(xué)影響。隨后，將不顯示實(shí)質(zhì)的生理學(xué)和/或形態(tài)學(xué)影響，或者顯示比野生型植物更高的生物量的轉(zhuǎn)化植物鑒定為耐受非生物脅迫的植物。
盡管穩(wěn)定轉(zhuǎn)化是目前優(yōu)選的，但本發(fā)明也設(shè)想了葉細(xì)胞、分生細(xì)胞或全植物的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化。
瞬時(shí)轉(zhuǎn)化可以通過上述的直接DNA轉(zhuǎn)移方法中的任何一種或者通過使用經(jīng)修飾的植物病毒進(jìn)行的病毒感染來實(shí)現(xiàn)。
已顯示對(duì)于轉(zhuǎn)化植物宿主有用的病毒包括CaMV、TMV和BV。使用植物病毒的植物轉(zhuǎn)化在下述文獻(xiàn)中得到描述美國(guó)專利號(hào)4,855,237(BGV)，EP-A 67,553(TMV)，日本公開申請(qǐng)?zhí)?3-14693(TMV)，EPA 194，809(BV)，EPA 278,667(BV)，和Gluzman，Y.等人，Communications in Molecular BiologyViral Vectors，Cold SpringHarbor Laboratory，New York，第172-189頁(yè)(1988)。用于在許多宿主(包括植物)中表達(dá)外源DNA的假病毒顆粒在WO87/06261中得到描述。
優(yōu)選地，本發(fā)明的病毒是無毒力的，因此不能引起嚴(yán)重癥狀例如減少的生長(zhǎng)率、花葉病、環(huán)斑病、卷葉病、黃化、條斑病、痘形成、瘤形成和紋孔病。合適的無毒力病毒可以是天然存在的無毒力病毒或人工減毒的病毒。病毒減毒可以通過使用本領(lǐng)域眾所周知的方法來實(shí)現(xiàn)，包括但不限于，亞致死性加熱、化學(xué)處理或通過定向誘變技術(shù)，例如由Kurihara和Watanabe(Molecular Plant Pathology 4259-269，2003)，Gal-on等人(1992)，Atreya等人(1992)和Huet等人(1994)所描述的。
合適的病毒毒株可以從可得的來源例如美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，或者通過從受感染植物中分離而獲得。從受感染的植物組織中分離病毒可以通過本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)來實(shí)現(xiàn)，例如由Foster和Tatlor(編輯)“Plant Virology ProtocolsFrom Virus Isolationto Transgenic Resistance(Methods in Molecular Biology(HumanaPr)，第81卷)”，Humana Pr ess，1998所描述的。簡(jiǎn)而言之，將被認(rèn)為包含高濃度的合適病毒的受感染植物的組織，優(yōu)選嫩葉和花瓣，在緩沖液(例如，磷酸鹽緩沖溶液)中磨碎以產(chǎn)生受病毒感染的汁液，所述汁液可以在隨后的接種中使用。
用于在植物中引入和表達(dá)非病毒外源多核苷酸序列的植物RNA病毒的構(gòu)建由上述參考文獻(xiàn)以及下述參考文獻(xiàn)所展示Dawson，W.O.等人，Virology(1989)172285-292；Takamatsu等人EMBO J.(1987)6307-311；French等人Science(1986)2311294-1297；和Takamatsu等人FEBS Letters(1990)26973-76。
當(dāng)病毒是DNA病毒時(shí)，可以對(duì)病毒本身進(jìn)行合適的修飾。備選地，為了易于構(gòu)建具有外源DNA的所需病毒載體，可以首先將病毒克隆到細(xì)菌質(zhì)粒中。隨后，可以將病毒從質(zhì)粒中切出。如果病毒是DNA病毒，那么可以使細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)與病毒DNA附著，所述病毒DNA隨后被細(xì)菌復(fù)制。這種DNA的轉(zhuǎn)錄和翻譯將產(chǎn)生使病毒DNA殼體化的外殼蛋白。如果病毒是RNA病毒，那么病毒一般以cDNA進(jìn)行克隆并插入質(zhì)粒內(nèi)。隨后，該質(zhì)粒用于進(jìn)行所有構(gòu)建。隨后，RNA病毒通過下列過程來產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒的病毒序列，和翻譯病毒基因以產(chǎn)生使病毒RNA殼體化的外殼蛋白。
用于在植物中引入和表達(dá)非病毒外源多核苷酸序列(例如包括在本發(fā)明構(gòu)建體中的那些)的植物RNA病毒的構(gòu)建由上述參考文獻(xiàn)以及美國(guó)專利號(hào)5,316,931所展示。
在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了植物病毒多核苷酸，其中已從病毒多核苷酸中刪除了天然外殼蛋白編碼序列，插入了非天然的植物病毒外殼蛋白編碼序列和非天然啟動(dòng)子，優(yōu)選地是非天然的外殼蛋白編碼序列的亞基因組啟動(dòng)子，所述啟動(dòng)子能夠在植物宿主中表達(dá)、包裝重組植物病毒多核苷酸，和通過重組植物病毒多核苷酸確保宿主的全身感染。備選地，外殼蛋白基因可以通過在其內(nèi)插入非天然的多核苷酸序列來失活，從而產(chǎn)生蛋白質(zhì)。重組植物病毒多核苷酸可以包含一種或多種另外的非天然的亞基因組啟動(dòng)子。每種非天然的亞基因組啟動(dòng)子能夠在植物宿主中轉(zhuǎn)錄或表達(dá)鄰近基因或多核苷酸序列，并且不能彼此以及與天然亞基因組啟動(dòng)子重組。非天然的(外源的)多核苷酸序列可以插入至鄰近天然植物病毒亞基因組啟動(dòng)子，或者鄰近天然和非天然的植物病毒亞基因組啟動(dòng)子，如果包括超過一種多核苷酸序列。非天然的多核苷酸序列在宿主植物中在亞基因組啟動(dòng)子的控制下進(jìn)行轉(zhuǎn)錄或表達(dá)，以產(chǎn)生所需產(chǎn)物。
在第二個(gè)實(shí)施方案中，提供了與第一個(gè)實(shí)施方案中相同的重組植物病毒多核苷酸，除了下列之外將天然外殼蛋白編碼序列置于鄰近所述非天然外殼蛋白亞基因組啟動(dòng)子之一而不是非天然外殼蛋白編碼序列。
在第三個(gè)實(shí)施方案中，提供了重組植物病毒多核苷酸，其中天然外殼蛋白基因鄰近其亞基因組啟動(dòng)子，并且將一種或多種非天然的亞基因組啟動(dòng)子插入病毒多核苷酸內(nèi)。插入的非天然的亞基因組啟動(dòng)子能夠在植物宿主中轉(zhuǎn)錄或表達(dá)鄰近的基因，并且不能彼此以及與天然亞基因組啟動(dòng)子重組。非天然的多核苷酸序列可以插入至鄰近所述非天然的亞基因組植物病毒啟動(dòng)子，從而使得所述序列在宿主植物中在亞基因組啟動(dòng)子的控制下進(jìn)行轉(zhuǎn)錄或表達(dá)，以產(chǎn)生所需產(chǎn)物。
在第四個(gè)實(shí)施方案中，提供了與第三個(gè)實(shí)施方案中相同的重組植物病毒多核苷酸，除了下列之外天然外殼蛋白編碼序列被非天然的外殼蛋白編碼序列替換。
病毒載體通過由重組植物病毒多核苷酸編碼的外殼蛋白進(jìn)行殼體化，從而產(chǎn)生重組植物病毒。所述重組植物病毒多核苷酸或重組植物病毒用于感染合適的宿主植物。所述重組植物病毒多核苷酸能夠在宿主中復(fù)制，在宿主中全身性地傳播，并在宿主中轉(zhuǎn)錄或表達(dá)外源基因(外源多核苷酸)，以產(chǎn)生所需蛋白質(zhì)。
用于給植物接種病毒的技術(shù)可以在下述參考文獻(xiàn)中找到Foster和Taylor(編輯)“Plant Virology ProtocolsFrom Virus Isolationto Transgenic Resistance(Methods in Molecular Biology(HumanaPr)，第81卷)”，Humana Press，1998；Maramorosh和Koprowski(編輯)“Methods in Virology”7卷，Academic Press，New York1967-1984；Hill，S.A.“Methods in Plant Virology”，Blackwell，Oxford，1984；Walkey，D.G.A.“Applied Plant Virology”，Wiley，New York，1985；以及Kado和Agrawa(編輯)“Principles andTechniques in Plant Virology”，Van Nostrand-Reinhold，New York。
除了上述外，還可以將本發(fā)明的多核苷酸引入葉綠體基因組中，從而使得能夠獲得葉綠體表達(dá)。
用于將外源多核苷酸序列引入葉綠體基因組中的技術(shù)是已知的。這種技術(shù)涉及下述操作程序。首先，對(duì)植物細(xì)胞進(jìn)行化學(xué)處理以便使每個(gè)細(xì)胞的葉綠體數(shù)目減少至約1個(gè)。隨后，經(jīng)由粒子轟擊將外源多核苷酸引入細(xì)胞內(nèi)，以為了將至少一個(gè)外源多核苷酸分子引入葉綠體內(nèi)。選擇外源多核苷酸以使得它可經(jīng)由同源重組整合到葉綠體的基因組中，所述同源重組通過葉綠體所固有的酶而容易地實(shí)現(xiàn)。為此，除了目的基因外，外源多核苷酸包含源自葉綠體基因組的至少一段多核苷酸鏈段。此外，外源多核苷酸包含選擇標(biāo)記，所述選擇標(biāo)記通過順次的選擇操作程序而用于確定葉綠體基因組的所有或基本上所有拷貝在此類選擇后將包含外源多核苷酸。關(guān)于這種技術(shù)的更多細(xì)節(jié)在美國(guó)專利號(hào)4,945,050；和5,693,507中找到，所述專利通過提及而合并入本文。因此，多肽可以通過葉綠體的蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)來產(chǎn)生，并且變得整合到葉綠體的內(nèi)膜中。
因?yàn)橹参镏械谋景l(fā)明的性狀(例如，NUE和非生物脅迫耐受性)可以涉及累加地或協(xié)同地起作用的多種基因(參見，例如，Quesda等人，Plant Physiol.130951-063，2002)，所以本發(fā)明還設(shè)想在單個(gè)宿主植物中表達(dá)多個(gè)外源多核苷酸，以從而達(dá)到優(yōu)良的NUE、耐受性、生物量和/或產(chǎn)量。
在單個(gè)宿主植物中表達(dá)多個(gè)外源多核苷酸可以通過將多個(gè)核酸構(gòu)建體共引入到單個(gè)植物細(xì)胞內(nèi)來達(dá)到，每個(gè)所述核酸構(gòu)建體包含不同的外源多核苷酸。隨后，經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞可以使用上文描述的方法再生為成熟植物。
備選地，在單個(gè)宿主植物中表達(dá)多個(gè)外源多核苷酸可以通過將單個(gè)核酸構(gòu)建體共引入到單個(gè)植物細(xì)胞中來達(dá)到，所述單個(gè)核酸構(gòu)建體包含多個(gè)不同的外源多核苷酸。此類構(gòu)建體可以被設(shè)計(jì)成具有單個(gè)啟動(dòng)子序列，所述單個(gè)啟動(dòng)子序列可以轉(zhuǎn)錄包括所有不同外源多核苷酸序列的多順反子信息。為了使得能夠共翻譯由該多順反子信息編碼的不同多肽，多核苷酸序列可以經(jīng)由內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)序列進(jìn)行互連，所述IRES序列促進(jìn)位于IRES序列下游的多核苷酸序列的翻譯。在這種情況下，編碼上述不同多肽的經(jīng)轉(zhuǎn)錄的多順反子RNA分子將從加帽的5′末端和多順反子RNA分子的2個(gè)內(nèi)部IRES序列開始翻譯，從而在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生所有不同的多肽。備選地，構(gòu)建體可以包含各自與不同的外源多核苷酸序列連接的幾個(gè)啟動(dòng)子序列。
用包含多個(gè)不同外源多核苷酸的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞可以使用上文描述的方法再生為成熟植物。
備選地，在單個(gè)宿主植物中表達(dá)多個(gè)外源多核苷酸可以通過將不同的核酸構(gòu)建體(包含不同的外源多核苷酸)引入到多個(gè)植物內(nèi)來達(dá)到。隨后，再生的轉(zhuǎn)化植物可以進(jìn)行雜交育種，并且使用常規(guī)植物育種技術(shù)就優(yōu)良性狀例如NUE、非生物脅迫耐受性和/或生物量來選擇所得到的后代。
如上所述，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物可以用于改善眾多商業(yè)上需要的性狀，它們都是相互關(guān)連的，如下文所討論的。
如本文所使用的，術(shù)語“性狀”指可以總體(直接或間接地)改善植物的商業(yè)價(jià)值的植物特征或品質(zhì)。
如本文所使用的，術(shù)語“改善”或“增加”指本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物的性狀比非轉(zhuǎn)基因植物(例如，轉(zhuǎn)染的模擬物，或首次用于實(shí)驗(yàn)的)改善或增加至少約2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多。
下述是可以使用本發(fā)明的多核苷酸或多肽來改善的性狀的舉例說明性例子。
肥料使用效率——盡管下文將更詳細(xì)闡述氮(N)使用效率(NUE)，但應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明設(shè)想了通過本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物增加/改善從土壤中吸收的所有礦物質(zhì)和有機(jī)部分的總體肥料使用效率，例如磷酸鹽(PUE)和鉀(KUE)。
N被植物使用的效率尤其受到N攝取效率和N利用效率的影響。植物攝取的N量(或N含量，kg N)與供應(yīng)/施加的N量(kg Ns)之比是攝取效率(kg Nkg-1 Ns)，而籽粒產(chǎn)量(kg籽粒)與N攝取(kgN)之比是N利用效率(NUE，kg籽粒kg-1N)。參見Moll1982 Analysisand interpretation of factors which contribute to efficiencyof nitrogen utilization.Argon.J.74562-564。NUE還受到經(jīng)由氨揮發(fā)、硝化作用-反硝化作用、瀝濾和流失而引起的N損失的影響，所述N損失減少N對(duì)植物的可用性。
本發(fā)明人認(rèn)識(shí)到，改變根構(gòu)造的基因可以用于改善NUE。基本原理是將根的較大部分置于其中肥料被瀝濾掉的較深土壤層中，或增加其中肥料被濃縮的土壤覆蓋層。這種策略已證明對(duì)于大豆(Miller，CR，IOchoa，KL Nielsen，D Beck，JP Lynch.2003.Genetic variationfora dventitious rooting in response to low phosphorusavailabilitypotential utility for phosphorus acquisition fromstratified soils.Functional Plant Biology 30973-985)和玉蜀黍(Zhu，J，JP Lynch.2004.The contribution of lateral rootingto phosphorus acquisition efficiency in maize(Zea mays L.)seedlings.Functional Plant Biology 31949-958)以及其他農(nóng)作物植物中的磷缺乏是成功的。根形態(tài)發(fā)生明顯受到發(fā)育程序編制以及受到環(huán)境條件的影響。干旱導(dǎo)致根結(jié)構(gòu)的顯著向下發(fā)育，以達(dá)到位于較深土壤層中的水(參見圖1A)，而局部營(yíng)養(yǎng)物可用性引起局部根側(cè)生長(zhǎng)(outgrowth)，這增加了根系的總吸收表面。根系的發(fā)育通常是高度不對(duì)稱的，并且反映了根針對(duì)環(huán)境因素調(diào)整其生長(zhǎng)和發(fā)育的能力?；蚝突虮磉_(dá)控制發(fā)育改變，如在ANR1(其是在NO3-信號(hào)傳導(dǎo)中具有作用的推定的轉(zhuǎn)錄因子)的情況下。當(dāng)ANR1通過反義或共抑制被下調(diào)時(shí)，所得到的轉(zhuǎn)基因品系在它們對(duì)于NO3-的局部化供應(yīng)所作出的根應(yīng)答方面是有缺陷的(Zhang，H.，F(xiàn)orde，B.G.1998，AnArabidopsis MADS box gene that controls nutrient-inducedchanges in root architecture，Science 270407)。因此，改變本發(fā)明的多核苷酸在轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)可以對(duì)根形態(tài)發(fā)生具有所需影響，它們中的一些可以正面影響NUE和非生物/生物脅迫耐受性和/或增加植物產(chǎn)量和活力。具體例子包括FUE_7、FUE_16和FUE_34_Evo。
另外選擇了增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)貯存的那些基團(tuán)，其減少胞質(zhì)濃度，從而降低對(duì)于負(fù)責(zé)不同形式肥料的攝取的膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的能量屏障。這樣，可以獲得較高的肥料攝取率。類似地，如從任何酶促反應(yīng)或途徑中所預(yù)期的，如果肥料同化的產(chǎn)物被有效地從細(xì)胞環(huán)境中去除，那么可以預(yù)期形成這種產(chǎn)物的酶促途徑以加速的速度發(fā)生，從而導(dǎo)致改善的同化或使用效率。
在改善FUE的另外一種方法中，鑒定了第三組基因。那些基因與參與無機(jī)肥料形式轉(zhuǎn)變成有機(jī)材料(同化過程)的生物化學(xué)途徑有關(guān)。解放同化過程中的瓶頸允許有希望實(shí)現(xiàn)增加的營(yíng)養(yǎng)物使用效率，如轉(zhuǎn)錄因子Dof1的情況(Yanagisawa Sd，Akiyama A，Kisaka H，UchimiyaH，Miwa T.Metabolic engineering with Dof1t ranscription factorin plantsImproved nitrogen assimilation and growth underlow-nitrogen conditions.Proc Natl Acad Sci U S A.2004 May 18；101(20)7833-8)。使用這種方法發(fā)現(xiàn)的基因解除了生物化學(xué)瓶頸，導(dǎo)致增加的肥料使用效率。FUE_101和FUE_102包含轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性，并因此可以用于改善營(yíng)養(yǎng)物攝取。
貯存能力——本發(fā)明的多核苷酸和多肽序列旨在增強(qiáng)植物的總體貯存能力。通過植物在其發(fā)育早期中吸收和貯存礦物質(zhì)氮的能力來預(yù)先確定關(guān)于籽粒生產(chǎn)的能力(Hirel等人，Plant Physiol，March 2001，第125卷，第1258-1270頁(yè))。因此，以硝酸鹽或氨基酸形式的增加的貯存能力非?？赡茉黾幼蚜．a(chǎn)量。本發(fā)明包括改善植物的氮或任何代謝營(yíng)養(yǎng)物貯存能力的分子機(jī)制。例子包括氨基酸、蛋白質(zhì)、淀粉和油、纖維、灰分、葉綠素和礦物質(zhì)含量。
植物蛋白質(zhì)含量與籽粒中的N濃度直接相關(guān)(參見Mosse 1990 J.Agric.Food Chem.3818-24)。這對(duì)于改善食物的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值是非常有價(jià)值的。例如，與消費(fèi)平均蛋白質(zhì)(6-7％)的精白米的兒童相比較，消費(fèi)高蛋白(10％)的精白米的兒童顯示出改善的生長(zhǎng)[Juliano(1993)Rice in Human Nutrition.IRRI和FAO，Rome]。因此，在使N從生長(zhǎng)部分再移動(dòng)至可食部分(例如，籽粒)方面顯示出高效率的轉(zhuǎn)基因植物是非常有價(jià)值的。因?yàn)樵陂_花時(shí)的氮水平?jīng)Q定籽粒產(chǎn)量，所以本發(fā)明的多核苷酸序列的過表達(dá)將改善籽粒產(chǎn)量和/或在整個(gè)植物水平上增強(qiáng)籽粒的蛋白質(zhì)含量。此外，植物的溶解物含量增加阻止了由于熱、干旱、鹽度、滲壓劑等引起的蒸發(fā)和水損失，因此提供了對(duì)上述脅迫的更佳的植物耐受性。預(yù)期FUE_501、FUE_502、FUE_503、FUE_504或FUE_49、FUE_51、FUE_52、FUE_53或FUE_100和FUE_101的過表達(dá)增加其中它們進(jìn)行了表達(dá)的組織的貯存能力。這可以導(dǎo)致更強(qiáng)的儲(chǔ)庫(kù)能力，和由于增強(qiáng)的從土壤中的吸收而導(dǎo)致更好地使用所施加的肥料(特別是氮)。因?yàn)樵陂_花時(shí)的氮水平?jīng)Q定籽粒產(chǎn)量，所以預(yù)期上述基因的過表達(dá)也將改善籽粒產(chǎn)量和/或增強(qiáng)籽粒的蛋白質(zhì)含量和整個(gè)植物蛋白質(zhì)水平。此外，植物的溶解物含量增加將阻止由于熱、干旱、鹽度、滲壓劑等引起的蒸發(fā)和水損失，從而提供了對(duì)上述脅迫的更佳的植物耐受性。
延遲的葉衰老(senescence)或“滯綠”——使?fàn)I養(yǎng)物攝取在植物周期內(nèi)較久地延伸，從而提供了增加的貯存氮的能力以及在籽粒灌漿期間提供光合產(chǎn)物的能力。如果植物在授粉期間具有更多的綠葉，那么更多的氮將可用于重新分布至谷粒，引起肥料使用效率和可能地還有籽粒產(chǎn)量方面的改善。本發(fā)明中呈現(xiàn)的基因中的一些增加“滯綠”性狀或顯示出增加的生長(zhǎng)(更快的生長(zhǎng)和/或更大的葉和桿)，作為改善肥料使用效率、籽粒產(chǎn)量和植物的總體脅迫耐受性的機(jī)制。
轉(zhuǎn)化酶是已知當(dāng)在衰老激活啟動(dòng)子下表達(dá)時(shí)延遲衰老的酶(Balibrea Lara等人，Plant Cell 161276-1287，2004)。FUE_30和FUE_31具有預(yù)測(cè)的轉(zhuǎn)化酶活性，并因此可以延長(zhǎng)植物的滯綠特征并因此增加植物中貯存氮的總體能力以用于在籽粒灌漿期間的重新分布。
除了其他過程外，細(xì)胞分裂素尤其參與葉衰老的抑制。FUE_55是與tRNA異戊烯基轉(zhuǎn)移酶具有驚人的相似性的基因，所述tRNA異戊烯基轉(zhuǎn)移酶是細(xì)胞分裂素代謝途徑中重要的酶。FUE_55在根或枝條中增加的表達(dá)將增加細(xì)胞分裂素的水平，從而導(dǎo)致葉擴(kuò)展和細(xì)胞復(fù)制增強(qiáng)、衰老延遲、組織的儲(chǔ)庫(kù)強(qiáng)度增加、氮利用增強(qiáng)等。
玉米素是天然存在的細(xì)胞分裂素。FUE_505是推定的含AP2結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子，基于微陣列實(shí)驗(yàn)，它與ARR基因(擬南芥應(yīng)答調(diào)節(jié)蛋白)緊密地聚類在一起，所述ARR基因介導(dǎo)枝條對(duì)于細(xì)胞分裂素的應(yīng)答。ARR基因是玉米素應(yīng)答性的，并且在向氮饑餓植物添加氮后被誘導(dǎo)。FUE_505與ARRs一起的共調(diào)節(jié)表明了在細(xì)胞分裂素應(yīng)答中的作用。由于枝條的細(xì)胞分裂素應(yīng)答的連續(xù)活化，F(xiàn)UE_505的組成型表達(dá)將很可能延遲葉衰老并改善氮利用和植物生長(zhǎng)。
脅迫耐受性——預(yù)期本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物顯示出對(duì)生物和非生物脅迫的耐受性。
本文使用的短語“脅迫”指對(duì)于植物的代謝、生長(zhǎng)、繁殖和/或生存力的任何不利影響。因此，非生物脅迫可以通過亞最佳環(huán)境生長(zhǎng)條件來誘導(dǎo)，例如鹽度、水剝奪、泛濫、冰凍、低或高溫、重金屬毒性、無氧生活、營(yíng)養(yǎng)物缺乏(還包括營(yíng)養(yǎng)物的不易接近，例如由于瀝濾)、大氣污染或UV照射。生物脅迫可以例如通過環(huán)境中發(fā)現(xiàn)的病原體來誘導(dǎo)。
如本文所使用的，短語“脅迫耐受性”指植物忍耐脅迫(非生物)而在代謝、生長(zhǎng)、生產(chǎn)力和/或生存力方面不遭受本質(zhì)改變的能力。優(yōu)選地，本發(fā)明的經(jīng)遺傳改造的植物顯示出比非轉(zhuǎn)基因植物多至少約2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或甚至更高的耐受性。
植物經(jīng)歷一系列環(huán)境攻擊。這些中的幾種(包括鹽脅迫、普遍滲透脅迫、干旱脅迫和冰凍脅迫)具有影響全植物和細(xì)胞的水可用性的能力。隨后，不意外地，涉及針對(duì)這種脅迫集合的植物應(yīng)答。在近期的綜述中，Zhu指出，“大多數(shù)對(duì)水脅迫信號(hào)傳導(dǎo)的研究主要集中于鹽脅迫，這是因?yàn)橹参飳?duì)鹽和干旱的應(yīng)答密切相關(guān)并且它們的機(jī)制相互重疊”(Zhu(2002)Ann.Rev.Plant Biol.53247-273)。針對(duì)這組脅迫的類似應(yīng)答和途徑的許多例子已得到證明。例如，CBF轉(zhuǎn)錄因子已顯示出制約對(duì)于鹽、冰凍和干旱的抗性(Kasuga等人(1999)Nature Biotech.17287-291)。擬南芥rd29B基因響應(yīng)于鹽和脫水脅迫而被誘導(dǎo)，這是主要通過ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程介導(dǎo)的過程(Uno等人(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9711632-11637)，導(dǎo)致與在rd29B啟動(dòng)子內(nèi)的上游元件結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子的活性改變。在冰葉日中花(Mesembryanthemum crystallinum)(冰花)中，Patharker和Cushman已證明，鈣依賴性蛋白激酶(McCDPK1)通過暴露于干旱和鹽脅迫而被誘導(dǎo)(Patharker和Cushman(2000)Plant J.24679-691)。還證明，脅迫誘導(dǎo)的激酶磷酸化轉(zhuǎn)錄因子，估計(jì)可能改變其活性，盡管靶轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄物水平并不響應(yīng)于鹽或干旱脅迫進(jìn)行改變。類似地，Saijo等人證實(shí)，當(dāng)過表達(dá)時(shí)，稻鹽/干旱誘導(dǎo)的鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶(OsCDPK7)賦予稻以增加的鹽和干旱耐受性(Saijo等人(2000)PlantJ.23319-327)。
暴露于脫水調(diào)動(dòng)了植物中與冰凍脅迫時(shí)類似的存活策略(參見，例如，Yelenosky(1989)Plant Physiol 89444-451)，并且干旱脅迫誘導(dǎo)冰凍耐受性(參見，例如，Siminovitch等人(1982)PlantPhysiol 69250-255；和Guy等人(1992)Planta 188265-270)。除了低溫馴化蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)，允許植物在低水條件下存活的策略可以包括例如減少表面積、或者產(chǎn)生表面油或蠟。在另一個(gè)例子中，植物的溶解物含量增加阻止了由于熱、干旱、鹽度、滲壓劑等引起的蒸發(fā)和水損失，因此提供了對(duì)上述脅迫的更佳的植物耐受性。
應(yīng)當(dāng)理解，參與對(duì)于一種脅迫的抗性的某些途徑(如上所述)還將參與對(duì)于由相同或同源基因調(diào)節(jié)的其他脅迫的抗性。當(dāng)然，全部抗性途徑是相關(guān)的，不是相同的，并因此并非控制對(duì)一種脅迫的抗性的所有基因?qū)⒖刂茖?duì)其他脅迫的抗性。然而，如果基因制約對(duì)于這些脅迫之一的抗性，那么測(cè)試對(duì)于這些相關(guān)脅迫的抗性對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯而易見的。評(píng)估脅迫抗性的方法在隨后的實(shí)施例部分中進(jìn)一步提供。
預(yù)期本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物忍耐脅迫的能力影響植物生物量、活力和產(chǎn)量。還預(yù)期相反面呈現(xiàn)出良好的結(jié)果，實(shí)質(zhì)上，預(yù)期改善的生物量、活力和/或產(chǎn)量改善了本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物對(duì)脅迫條件的忍耐力。
如本文所使用的，短語“植物生物量”指在生長(zhǎng)季節(jié)中由植物產(chǎn)生的組織的量或數(shù)量，其還可以決定或影響植物產(chǎn)量或每生長(zhǎng)面積的產(chǎn)量。
如本文所使用的，短語“植物活力”指在給定時(shí)間中由植物產(chǎn)生的組織的量或數(shù)量。因此，增加活力可以決定或影響植物產(chǎn)量或每生長(zhǎng)時(shí)間或生長(zhǎng)面積的產(chǎn)量。
如本文所使用的，短語“植物產(chǎn)量”指作為植物生產(chǎn)的產(chǎn)物而被產(chǎn)生和收獲的組織的量或數(shù)量。因此，增加產(chǎn)量可以影響可在某一特定生長(zhǎng)時(shí)間中從植物獲得的經(jīng)濟(jì)利益。
為了分析轉(zhuǎn)基因?qū)χ参锷韺W(xué)的影響，可以評(píng)估總產(chǎn)量和生物量，植物對(duì)于肥料缺乏和非生物脅迫的耐受性，所述非生物脅迫例如為干旱、鹽度、冷和熱脅迫、冰凍等。同樣具有重要性的是，評(píng)估植物在其任何部分是否包含含量增加的蛋白質(zhì)、游離氨基酸、油和任何其他具有價(jià)值的代謝化合物。
下文概述了可以用于證明本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物或轉(zhuǎn)基因是否合格的測(cè)定法(這些和其他測(cè)定法的進(jìn)一步描述在隨后的實(shí)施例部分中提供)。
肥料使用效率——為了分析轉(zhuǎn)基因植物是否對(duì)肥料更有應(yīng)答性，植物在具有有限量的肥料的瓊脂平板或罐中生長(zhǎng)。就其總體大小、到達(dá)開花所需時(shí)間、產(chǎn)量、枝條和/或籽粒的蛋白質(zhì)含量來評(píng)估植物。關(guān)于肥料使用效率的測(cè)試的一種示例方法在Yanagisawa等人(Proc NatlAcad Sci U S A.2004；1017833-8)的工作中提供，其中就在限制氮的條件下(例如以硝酸鹽或銨形式的0.01mM、0.05mM、0.15mM、0.3mM、1mM、3mM氮)的生長(zhǎng)率來檢查轉(zhuǎn)基因擬南芥的種子。所檢查的參數(shù)是成熟植物的總體大小、其濕重和干重、產(chǎn)生的種子重量、平均種子大小和產(chǎn)生的種子數(shù)目/植物。可以進(jìn)行測(cè)試的其他參數(shù)是葉的葉綠素含量(因?yàn)榈参餇顟B(tài)和葉翠綠程度是高度相關(guān)的)、種子或其他植物部分(例如葉或枝條)的氨基酸和總蛋白質(zhì)含量、油含量等。類似地，并不提供限制量的氮，而是可以添加濃度漸增的磷酸鹽或鉀。再次，所測(cè)量的相同參數(shù)與上文列舉的相同。以這種方法，除了氮使用效率(NUE)之外，通過檢查轉(zhuǎn)基因植物在營(yíng)養(yǎng)物限制條件下茁壯成長(zhǎng)的能力來評(píng)估磷酸鹽使用效率(PUE)和鉀使用效率(KUE)。
氮測(cè)定——用于植物的結(jié)構(gòu)部分中N濃度測(cè)定的操作程序包括將有機(jī)N轉(zhuǎn)變成NO3-的過硫酸鉀消化法(Purcell和King 1996 Argon.J.88111-113)，經(jīng)修飾的Cd-介導(dǎo)的NO3-至NO2-的還原(Vodovotz 1996Biotechniques 20390-394)和通過Griess測(cè)定法測(cè)量亞硝酸鹽(Vodovotz 1996，同上)。針對(duì)NaNO2的標(biāo)準(zhǔn)曲線在550nm處測(cè)量吸光度值。該操作程序在Samonte等人，2006Agron.J.98168-176中詳細(xì)描述。
籽粒蛋白質(zhì)濃度——將籽粒蛋白質(zhì)含量(g籽粒蛋白質(zhì)m-2)估計(jì)為籽粒N的質(zhì)量(g籽粒Nm-2)乘以k-5.13的N/蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換率的乘積(Mosse 1990，同上)。籽粒蛋白質(zhì)濃度被估計(jì)為籽粒蛋白質(zhì)含量/籽粒的單位質(zhì)量之比(g籽粒蛋白質(zhì)kg-1籽粒)。
油含量——油的量表示為干重百分比。油含量被定義為通過用特定溶劑(通常為己烷或石油醚)萃取而可以從種子中取出的材料(脂質(zhì))的最大量。油含量通過將種子磨碎并在連續(xù)萃取器中萃取油來直接測(cè)量。間接的油含量分析可以使用核磁共振(NMR)光譜法或近紅外(NI)光譜法來進(jìn)行。NMR技術(shù)測(cè)量液態(tài)樣品中由氫原子吸收的共振能，而NI利用樣品對(duì)于近紅外輻射能(1100-2500nm)的吸收。盡管NIR法的精確性不如萃取法好，但NMR法在進(jìn)行仔細(xì)校準(zhǔn)時(shí)產(chǎn)生非常準(zhǔn)確和精確的結(jié)果。
干旱耐受性測(cè)定法/滲壓劑測(cè)定法——實(shí)施對(duì)干旱的耐受性，以鑒定在急劇水剝奪后賦予更佳的植物存活的基因。為了分析轉(zhuǎn)基因植物是否對(duì)干旱更有耐受性，可以進(jìn)行在培養(yǎng)基中由非離子型滲壓劑山梨糖醇產(chǎn)生的滲透脅迫。使對(duì)照和轉(zhuǎn)基因植物發(fā)芽并在植物瓊脂平板中生長(zhǎng)4天，這之后將它們轉(zhuǎn)移至包含500mM山梨糖醇的平板中。該處理引起生長(zhǎng)遲緩，隨后通過測(cè)量植物重量(濕和干)、產(chǎn)量，和通過作為到達(dá)開花所需時(shí)間進(jìn)行測(cè)量的生長(zhǎng)率來比較對(duì)照和轉(zhuǎn)基因植物。
相反地，用過表達(dá)上述候選基因的植物進(jìn)行基于土壤的干旱篩選。使來自對(duì)照擬南芥植物或過表達(dá)本發(fā)明多肽或使本發(fā)明多肽沉默的其他轉(zhuǎn)基因植物的種子發(fā)芽并轉(zhuǎn)移至罐。在停止灌溉并將罐置于吸水紙上以增強(qiáng)土壤干燥速度后獲得干旱脅迫。當(dāng)大多數(shù)對(duì)照植物產(chǎn)生嚴(yán)重萎蔫時(shí)，將轉(zhuǎn)基因和對(duì)照植物彼此相比較。在獲得相當(dāng)部分的對(duì)照植物顯示出嚴(yán)重萎蔫后給植物再加水。就下列2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)中的每一個(gè)，與對(duì)照相比較而對(duì)植物進(jìn)行分級(jí)對(duì)干旱條件的耐受性和再加水后的恢復(fù)(存活)。
鹽度耐受性測(cè)定法——預(yù)期對(duì)于高鹽具有耐受性的轉(zhuǎn)基因植物在高鹽中顯示出更好的發(fā)芽、幼苗活力和生長(zhǎng)。取決于其發(fā)育階段，植物在其對(duì)NaCl的耐受性方面不同，因此評(píng)估了種子發(fā)芽、幼苗活力和植物生長(zhǎng)應(yīng)答。鹽度耐受性測(cè)試采用不同發(fā)育階段的植物，并且用從底部和從上方施加的濃度漸增的NaCl(例如50mM、100mM、200mM、400mM)來灌溉它們，以確保鹽的均勻分散。在抑制對(duì)照植物的濃度處，在它們的外部表型表現(xiàn)、萎蔫程度、以及達(dá)到成熟和產(chǎn)生后代的總體成功方面，將轉(zhuǎn)基因植物與對(duì)照植物相比較。所測(cè)量的耐受性的定量參數(shù)是平均濕重和干重、以及產(chǎn)生的種子重量、平均種子大小和每株植物產(chǎn)生的種子數(shù)目。進(jìn)行滲透脅迫測(cè)定法(包括NaCl和甘露醇測(cè)定法)，以確定滲透脅迫表型是否是NaCl特異性的，或者它是否是一般的滲透脅迫相關(guān)表型。對(duì)于滲透脅迫耐受的植物還可以對(duì)于干旱和/或冰凍具有更多的耐受性。對(duì)于鹽和滲透脅迫發(fā)芽實(shí)驗(yàn)，使培養(yǎng)基補(bǔ)充有例如50mM、100mM、200mM NaCl，或100mM、200mM NaCl，400mM甘露醇。
冷脅迫耐受性——為了分析冷脅迫，將成熟的(25天大)植物轉(zhuǎn)移至4℃小室1-2周，使用基本的光照。其后將植物移回到溫室。2周后在對(duì)照和轉(zhuǎn)基因植物之間比較導(dǎo)致生長(zhǎng)遲緩和其他表型的由冷卻期導(dǎo)致的損害，其通過測(cè)量植物重量(濕和干)，和通過比較作為到達(dá)開花所需時(shí)間進(jìn)行測(cè)量的生長(zhǎng)率、植物大小、產(chǎn)量等來進(jìn)行。
熱脅迫耐受性——通過使植物暴露于34℃以上的溫度一定時(shí)期來實(shí)現(xiàn)熱脅迫耐受性。在5天后將植物移回至22℃以進(jìn)行恢復(fù)和評(píng)估之后，相對(duì)于內(nèi)部對(duì)照(非轉(zhuǎn)基因植物)或未暴露于冷或熱脅迫的植物來檢查植物耐受性。
發(fā)芽測(cè)試比較了來自轉(zhuǎn)基因植物的可以完成發(fā)芽過程的種子百分比與來自以相同方式處理的對(duì)照植物的種子百分比。考慮了正常條件，例如于22℃在22小時(shí)光照-2小時(shí)黑暗的每日循環(huán)下進(jìn)行溫育。在種植后4-14天進(jìn)行發(fā)芽和幼苗活力的評(píng)估?；A(chǔ)培養(yǎng)基是50％Murashige-Skoog培養(yǎng)基(MS)+維生素。
還在不利條件下檢查了發(fā)芽，所述不利條件例如為冷(在低于10℃而不是22℃的溫度下溫育)或使用包含高濃度滲壓劑例如山梨糖醇的種子吸漲溶液(濃度為50mM、100mM、200mM、300mM、500mM、和直至1000mM)或施加濃度漸增的鹽(50mM、100mM、200mM、300mM、500mM NaCl)。
測(cè)定植物活力、產(chǎn)量和生物量的方法是本領(lǐng)域眾所周知的(參見實(shí)施例9和實(shí)施例10)。
本發(fā)明對(duì)于育種和觀賞目的也是有價(jià)值的。因此，設(shè)想與根構(gòu)造相關(guān)的本發(fā)明的多核苷酸和多肽序列(FUE_34_Evo，SEQ ID NO54，還參見實(shí)施例11和圖8)也可以用于控制植物分蘗，并且如此可以進(jìn)行上調(diào)或下調(diào)以控制分枝和分蘗。下調(diào)植物中的基因表達(dá)的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。
因此，本發(fā)明對(duì)于促進(jìn)農(nóng)作物植物中商業(yè)上所需的性狀具有高度的農(nóng)業(yè)價(jià)值。
如本文所使用的，術(shù)語“約”指±10％。
在檢查并不希望為限制性的下述實(shí)施例后，本發(fā)明的另外目的、優(yōu)點(diǎn)和新型特征對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將是顯而易見的。另外，如上文所描述的和如下文權(quán)利要求部分中所要求保護(hù)的本發(fā)明的各種實(shí)施方案和方面中的每一個(gè)可以在下述實(shí)施例中找到實(shí)驗(yàn)支持。
實(shí)施例 現(xiàn)在參考下述實(shí)施例，所述實(shí)施例連同上文說明書一起以非限制性方式舉例說明了本發(fā)明。
一般而言，本文使用的術(shù)語和本發(fā)明中使用的實(shí)驗(yàn)操作程序包括分子、生物化學(xué)、微生物學(xué)和重組DNA技術(shù)。此類技術(shù)在文獻(xiàn)中得到充分說明。參見，例如，“Molecular CloningA laboratory Manual”Sambrook等人，(1989)；“Current Protocols in Molecular Biology”第I-III卷，Ausubel，R.M.編輯(1994)；Ausubel等人，“CurrentProtocols in Molecular Biology”，John Wiley and Sons，Baltimore，Maryland(1989)；Perbal，＂A Practical Guide to MolecularCloning＂，John Wiley and Sons，New York(1988)；Watson等人，“Recombinant DNA”，Scientific American Books，New York；Birren等人(編輯)“Genome AnalysisA Laboratory Manual Series”，第1-4卷，Cold SpringH arbor Laboratory Press，New York(1998)；如美國(guó)專利號(hào)4,666,828；4,683,202；4,801,531；5,192,659和5,272,057中所述的方法；“Cell BiologyA Laboratory Handbook”，第I-III卷，Cellis，J.E.編輯(1994)；“Current Protocols inImmunology”第I-III卷，Coligan J.E.編輯(1994)；Stites等人(編輯)，“Basic and Clinical Immunology”(第8版)，Appleton和Lange，Norwalk，CT(1994)；Mishell和Shiigi(編輯)，“SelectedMethods in Cellular Immunology”，W.H.Freeman and Co.，NewYork(1980)；可用的免疫測(cè)定法在專利和科學(xué)文獻(xiàn)中得到詳盡描述，參見，例如美國(guó)專利號(hào)3,791,932；3,839,153；3,850,752；3,850,578；3,853,987；3,867,517；3,879,262；3,901,654；3,935,074；3,984,533；3,996,345；4,034,074；4,098,876；4,879,219；5,011,771和5,281,521；“Oligonucleotide Synthesis”Gait，M.J.編輯(1984)；“Nucleic Acid Hybridization＂Hames，B.D.和HigginsS.J.編輯(1985)；“Transcription and Translation”Hames，B.D.和Higgins S.J.編輯(1984)；“Animal Cell Culture”Freshney，R.I.編輯(1986)；“Immobilized Cells and Enzymes”IRL Press，(1986)；“A Practical Guide to Molecular Cloning”Perbal，B.，(1984)和“Methods in Enzymology”第1-317卷，Academic Press；“PCR ProtocolsA Guide To Methods AndApplications”，Academic Press，San Diego，CA(1990)；Marshak等人，“Strategies for Protein Purification and Characterization-A Laboratory Course Manual”CSHL Press(1996)；所有這些參考文獻(xiàn)通過提及而合并入本文，就如同在本文中完全闡述一樣。本文件自始至終提供了其他一般參考文獻(xiàn)。認(rèn)為其中的操作程序是本領(lǐng)域眾所周知的，并且為了讀者的方便而提供。其中包含的所有信息通過提及而合并入本文。
實(shí)施例1 使用生物信息學(xué)和分子工具來鑒定多核苷酸和預(yù)測(cè)基因作用 通過RNA表達(dá)譜、序列相似性、基因注釋、生物化學(xué)途徑、DNA、ESTs、蛋白質(zhì)和表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)的深入分析來鑒定適合于增加FUE和/或非生物或生物脅迫耐受性的多核苷酸，所述蛋白質(zhì)和表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)是公眾可獲得的，并用作對(duì)于允許實(shí)施數(shù)據(jù)挖掘的一系列專有的(proprietary)計(jì)算機(jī)算法的輸入數(shù)據(jù)。
使用準(zhǔn)確表達(dá)作圖借助于定量實(shí)時(shí)PCR進(jìn)行性狀關(guān)聯(lián)，以使不同組織中和在特異性生長(zhǎng)條件下的表達(dá)水平相關(guān)聯(lián)，用于闡明表達(dá)的多核苷酸的功能。
材料和方法 鑒定與增加的FUE相關(guān)的多核苷酸序列 本方法基于下文實(shí)施例中描述的3個(gè)階段，基本上為生物信息學(xué)過濾、分子分析和植物中(in planta)驗(yàn)證。下文是生物信息學(xué)算法的描述。
A.生物信息學(xué)過濾 將DNA序列聚類為基因聚簇——EST(表達(dá)序列標(biāo)簽)聚類的目的是將共有轉(zhuǎn)錄物或基因親本的所有ESTs合并成同一個(gè)聚簇。通常，將聚類的ESTs集合成反映轉(zhuǎn)錄物多樣性的一個(gè)或多個(gè)共有序列(重疊群)，提供這些重疊群從而使得它們所包含的信息最真實(shí)地反映所抽樣的生物學(xué)。使基因聚簇片段化，將EST數(shù)據(jù)和(如果已知的)基因mRNA序列數(shù)據(jù)合并，置于準(zhǔn)確的背景中，并通過基因編入索引，從而使得關(guān)于單個(gè)基因的所有表達(dá)數(shù)據(jù)在單個(gè)索引類別中，并且每個(gè)索引類別包含關(guān)于唯一一種基因的信息(Burke等人，1999，D2_clusterA Validated Method for Clustering EST and Full-length cDNASequences.Genome Research，9(11)，1135-1142)。對(duì)于匯編(assembly)使用Compugen LEADS平臺(tái)(http://www.cgen.com/research/Publications/LEADSwhitepaper.pdf)。
計(jì)算關(guān)于在幾個(gè)植物物種中的所有基因聚簇的數(shù)字化表達(dá)——數(shù)字化表達(dá)(也稱為電子Northern印跡法)比較來自非標(biāo)準(zhǔn)化的cDNA文庫(kù)的大量隨機(jī)ESTs的發(fā)生率。貯存于數(shù)據(jù)庫(kù)中的那些標(biāo)簽的相對(duì)頻率的變化隨后用于闡明相應(yīng)基因的差異表達(dá)。數(shù)字化Northern數(shù)據(jù)可以用于提供在植物中不同器官之間或在不同生理學(xué)狀態(tài)的差異表達(dá)的定量評(píng)估(脅迫對(duì)正常)。這種工具基于形成該聚簇的EST序列而展示出基因的實(shí)際表達(dá)譜。該工具可以提供在植物解剖學(xué)(即，基因在哪個(gè)組織/器官中表達(dá))、發(fā)育階段(即，可以發(fā)現(xiàn)基因的發(fā)育階段)和處理特性(即，提供基因得以表達(dá)的生理?xiàng)l件，例如干旱、冷、病原體感染等)方面的聚聚簇表達(dá)譜?？紤]到ESTs在不同聚簇中的隨機(jī)分布，數(shù)字化表達(dá)提供了概率值，其描述了具有總N ESTs的聚簇包含來自文庫(kù)的某一集合的X ESTs的概率。關(guān)于概率計(jì)算，考慮下述因素a)聚簇中的ESTs數(shù)目，b)源于特定文庫(kù)或相關(guān)文庫(kù)的組的ESTs數(shù)目，c)可用的代表所述物種的ESTs總數(shù)目。這樣，具有低概率值的聚簇高度富含來自顯示出特有表達(dá)的目的文庫(kù)組的ESTs。此外，使用專有詞匯表(有限的術(shù)語一覽表)，其考慮了每個(gè)EST文庫(kù)的注釋，并使用特定關(guān)鍵詞來描述關(guān)于組織類型、處理和發(fā)育階段的與序列相關(guān)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)?；诮o基因聚簇提供序列的文庫(kù)來源，將選自專有詞匯表的術(shù)語與計(jì)算的數(shù)字化表達(dá)相組合，以建立關(guān)于每種特定基因的表達(dá)譜。建立這種譜的統(tǒng)計(jì)和圖解表示法以用于數(shù)字化表達(dá)計(jì)算。因?yàn)樽⑨寔碜允芸氐脑~匯表，所以用描述特定組織、發(fā)育階段或處理的特定關(guān)鍵詞來仔細(xì)分析整個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)。
整合關(guān)于每種基因的所有相關(guān)數(shù)據(jù)，包括來自微陣列實(shí)驗(yàn)的表達(dá)數(shù)據(jù)、數(shù)字化表達(dá)、注釋、本體論(ontology)、基因家族、保守基序等——使用從來自多個(gè)植物物種的基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中形成直向同源基因的組的專有工具。為了給所鑒定的基因提供進(jìn)一步的支持，作為一個(gè)整體來測(cè)試直向同源基因或直向同源組，以根據(jù)在其所計(jì)算的數(shù)字化表達(dá)中最重要的關(guān)鍵詞來察看目的性狀的牽涉。
基因選擇——這根據(jù)幾種生物學(xué)上合理的假設(shè)來進(jìn)行，以查詢上述數(shù)據(jù)庫(kù)。基因選擇通過使用仔細(xì)選擇的標(biāo)準(zhǔn)過濾特定基因組來完成。最終的基因集應(yīng)包含有限數(shù)目的基因，所述基因可以在下述分子分析和轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)中進(jìn)行操作。本文使用的不同標(biāo)準(zhǔn)對(duì)于下述每種基因詳細(xì)地進(jìn)行描述。
用于本發(fā)明的基因選擇考慮了植物科學(xué)中廣泛接受的幾個(gè)概念。營(yíng)養(yǎng)物缺乏引起根構(gòu)造的適應(yīng)，特別顯著的例如是在富含營(yíng)養(yǎng)物的小塊地內(nèi)的根增殖，以增加營(yíng)養(yǎng)物攝取。營(yíng)養(yǎng)物缺乏還引起植物代謝途徑的活化，這最大化了吸收和同化過程。在這個(gè)過程中，基因被觸發(fā)并活化，引起構(gòu)造改變(Jose Lopez-Bucio等人，The role of nutrientavailability in regulating root architecture，Current Opinionin Plant Biology 2003，6280-287)。經(jīng)觸發(fā)的基因的表達(dá)改造可以引起植物還在其他條件下顯示出構(gòu)造改變和增強(qiáng)的代謝。其次，眾所周知的是，植物通常通過產(chǎn)生更深的根系來響應(yīng)干旱，所述更深的根系允許接近位于更深土壤層中的水分(Morgan，J.M.和A.G.Condon.1986.Water use，grain yield，and osmoregulation in wheat.Aust.J.Plant Physiol.13523 532和Yiwei Jiang和BingruHuang，2001，Crop Science 411168-1173)。觸發(fā)這種效應(yīng)將允許植物接近位于更深土層中的營(yíng)養(yǎng)物，特別是易于溶解于水中的那些營(yíng)養(yǎng)物(如硝酸鹽)。第三，不同的非生物脅迫(例如，干旱、滲壓劑、冷、熱、輻射、鹽度、營(yíng)養(yǎng)物缺乏等)使用脅迫特異的以及普通的脅迫途徑來引起其應(yīng)答(Gabriela M.Pastori和Christine H.Foyer，Common Components，Networks，and Pathways ofCross-Tolerance to Stress，Plant Physiol，June 2002，第129卷，第460-468頁(yè))。這提供了區(qū)分參與每種途徑的基因的可能性。
植物對(duì)脅迫的響應(yīng)就能量而言是昂貴的，如此影響了植物產(chǎn)量。特定基因的精確改造提供了僅部分活化脅迫應(yīng)答而不引起產(chǎn)量的相伴損失的能力。因此，進(jìn)行幾次查詢以區(qū)分在普通的和脅迫特異的應(yīng)答期間活化的基因。因?yàn)槟承┲参飸?yīng)答例如增強(qiáng)的根系或優(yōu)良的貯存能力在最佳生長(zhǎng)條件下也是高度優(yōu)選的，所以本發(fā)明設(shè)想形成具有改善的FUE的改良植物，所述改良植物此外還顯示出增強(qiáng)的對(duì)于對(duì)產(chǎn)量造成不利影響的其他非生物植物脅迫的響應(yīng)。
為了鑒定改善FUE的基因，從Genbank版本145(2004年12月)中提取來自玉米的416899 EST和23563 mRNA轉(zhuǎn)錄物序列，通過就載體、低復(fù)雜性序列和來自公共數(shù)據(jù)庫(kù)的已知重復(fù)序列所實(shí)施的篩選來進(jìn)行凈化，并且隨后使用Compugen’s LEADS平臺(tái)進(jìn)行聚類和匯編成重疊群。
使用描述了所使用的植物組織、為了培養(yǎng)植物所應(yīng)用的處理和在獲取組織時(shí)的植物發(fā)育階段的關(guān)鍵詞來檢查和注釋Genbank 146中關(guān)于玉米和其他物種的EST文庫(kù)，所述其他物種例如為大豆、番茄、大麥、高粱、稻、棉花、小麥和擬南芥。將顯著性值分配給在來自每個(gè)EST文庫(kù)或共享相同注釋的文庫(kù)組的每個(gè)重疊群中的ESTs頻率。顯著性值基于這樣的統(tǒng)計(jì)學(xué)測(cè)試，所述統(tǒng)計(jì)學(xué)測(cè)試考慮了來自重疊群中給定類別的ESTs數(shù)目、整個(gè)產(chǎn)出物(production)中這些ESTs的數(shù)目、重疊群的大小和產(chǎn)出物中的ESTs總數(shù)目。
另外，整合了在Nottingham Arabidopsis Stock Centre(NASC，http://affymetrix.arabidopsis.info/)處可免費(fèi)獲得的擬南芥微陣列實(shí)驗(yàn)，其包括描述了解剖學(xué)、發(fā)育和各種脅迫實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)。為了使LEADS玉米產(chǎn)出物的重疊群與來自其他物種的相應(yīng)聚簇相聯(lián)系，使用了直向同源物探測(cè)器算法，所述算法除了其他過濾器外尤其使用交互BLAST分析(reciprocal BLAST analysis)，以鑒定其他植物物種中最相似的基因。
下文描述了用于選擇每種基因的參數(shù)。下述表1將內(nèi)部標(biāo)識(shí)符(可互換使用的NUE_XXX或FUE_XXX)與SEQ ID NO相關(guān)聯(lián)。
表1 值得注意的是，過表達(dá)倍數(shù)(“倍數(shù)”)被計(jì)算為關(guān)于某一類別(“關(guān)鍵詞”)而在基因或直向同源組中發(fā)現(xiàn)的ESTs數(shù)目與根據(jù)正常分布預(yù)期的ESTs數(shù)目之間的比率。對(duì)于計(jì)算出的過表達(dá)倍數(shù)估計(jì)概率值(P-值)。基于本文呈現(xiàn)的結(jié)果和與如上所述的人工輔助處理相組合的其他計(jì)算過濾來選擇基因。
由于其在玉米中的強(qiáng)烈根表達(dá)(如表2以及圖2A和2B中所示)，以及其直向同源物的表達(dá)模式，例如在大豆和稻中的表達(dá)模式(如表3以及圖2C和2D中所示)，所以選擇出FUE_1。此外，F(xiàn)UE_1顯示出一些與RCc3蛋白(GENEBANK登記號(hào)L27208)的同源性，所述RCc3蛋白是推定與脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的已知根特異性蛋白質(zhì)。
表2FUE_1在玉米中的數(shù)字化表達(dá)解剖學(xué)
表3FUE_1直向同源物組的數(shù)字化表達(dá)解剖學(xué)
FUE_2是功能未知的蛋白質(zhì)，其顯示出使其與根，特別是在干旱脅迫下與根相關(guān)聯(lián)的數(shù)字化表達(dá)。
FUE_3是在玉米中(表4和表5)以及在大麥和稻中特別是于根中表達(dá)的推定的非特異性脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白。它在干旱情況下在根中的表達(dá)在高粱、玉米、稻和大麥中的整個(gè)進(jìn)化過程中是保守的(如表6和7中所示)。表明，該基因還在大麥和稻中在鹽度脅迫下表達(dá)以及在大麥中在氮缺乏下表達(dá)。
表4FUE_3在玉米中的數(shù)字化表達(dá)解剖學(xué)
表5FUE_3在玉米中的數(shù)字化表達(dá)處理
表6FUE_3直向同源物組的數(shù)字化表達(dá)解剖學(xué)
表7FUE_3直向同源物組的數(shù)字化表達(dá)處理
FUE_4也是在干旱脅迫下顯示出特異性的數(shù)字化表達(dá)(如表8和9中所示)的功能未知的蛋白質(zhì)。
表8FUE_4在玉米中的數(shù)字化表達(dá)解剖學(xué)
表9FUE_4在玉米中的數(shù)字化表達(dá)處理
FUE_5是泛醌醇-細(xì)胞色素C還原酶復(fù)合物樣蛋白，其在幾種脅迫下并且特別是在干旱和鹽度下在玉米(如表10中所示)和稻根中表達(dá)。
表10FUE_5在玉米中的數(shù)字化表達(dá)處理
FUE_6顯示出與多重脅迫相關(guān)鋅指蛋白的同源性，其在玉米中在籽粒發(fā)育期間，和在根中，特別是在干旱脅迫下表達(dá)(如分別在表11和12中顯示的)。本發(fā)明人揭示，F(xiàn)UE_6和FUE_40是相同轉(zhuǎn)錄物的部分。FUE_6代表該轉(zhuǎn)錄物的5′區(qū)，而FUE_40代表3′區(qū)。為了方便起見，這種轉(zhuǎn)錄物在本文中以名稱FUE_40出現(xiàn)。
表11FUE_6在玉米中的數(shù)字化表達(dá)解剖學(xué)
表12FUE_6在玉米中的數(shù)字化表達(dá)處理
FUE_7是顯示出與抗凍蛋白的相似性的假設(shè)蛋白質(zhì)，其在大麥和玉米中在根中占優(yōu)勢(shì)地表達(dá)并且在干旱脅迫期間具有更明顯的表達(dá)(如表13和14中所示)。
表13FUE_7直向同源物組的數(shù)字化表達(dá)解剖學(xué)
表14FUE_7直向同源物組的數(shù)字化表達(dá)處理
FUE_8顯示出與Acyl-ACP硫酯酶的同源性，并且在玉米根中在干旱脅迫下表達(dá)(如表15中所示)。高粱和稻直向同源物也顯示出與干旱的明確關(guān)聯(lián)，如通過構(gòu)成所述基因的序列的來源所揭示的。
表15FUE_8在玉米中的數(shù)字化表達(dá)解剖學(xué)
FUE_9是在玉米根中在干旱脅迫下表達(dá)的假設(shè)蛋白質(zhì)。
FUE_10顯示出與電子轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白的同源性，其顯示出在玉米中只與干旱相關(guān)的(如表16和17中所示)和與其他非生物脅迫相關(guān)的強(qiáng)烈根表達(dá)(如在大豆中發(fā)現(xiàn)其直向同源物的表達(dá))。
表16FUE_10在玉米中的數(shù)字化表達(dá)解剖學(xué)
表17FUE_10在玉米中的數(shù)字化表達(dá)處理
FUE_11顯示出與由物理阻抗誘導(dǎo)的蛋白(physical impedanceinduced protein)的同源性，并且在玉米中也在干旱脅迫期間在根中表達(dá)。
FUE_12是在水分脅迫(干旱)下在玉米根中，和在其他非生物脅迫(例如干旱)下在大麥中，和在氮缺乏和熱脅迫下在高粱中表達(dá)的未知蛋白質(zhì)。
FUE_13顯示出與致病相關(guān)蛋白10的同源性，并且在不同脅迫下在玉米中表達(dá)(干旱、病原體如鐮孢霉)。大麥和稻直向同源物特別是在非生物和生物脅迫下強(qiáng)烈地表達(dá)，使這種蛋白質(zhì)與普遍存在的對(duì)于脅迫的植物應(yīng)答相聯(lián)系。
FUE_14是顯示出與萌發(fā)蛋白樣蛋白6的同源性的玉米蛋白質(zhì)。其大麥直向同源物的數(shù)字化表達(dá)使這種蛋白質(zhì)與病原體應(yīng)答以及干旱和氮缺乏應(yīng)答相聯(lián)系。
FUE_15是也在玉米根中表達(dá)的推定的由生長(zhǎng)素調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)。來自大麥、稻的其直向同源物與干旱以及其他生物和非生物脅迫(例如病原體應(yīng)答)相關(guān)聯(lián)。在番茄和大豆中，該蛋白質(zhì)與對(duì)于病原體和營(yíng)養(yǎng)物缺乏的應(yīng)答相聯(lián)系。
FUE_16是在玉米根中在水分脅迫下強(qiáng)烈表達(dá)(如表18和19中所示)的Uclacyanin 3-樣蛋白。來自大麥、稻、大豆和番茄的其直向同源物也在根中表達(dá)，但參與對(duì)其他幾種生物和非生物脅迫的應(yīng)答，特別是對(duì)于光反應(yīng)(如表20和21中所示)。
表18FUE_16在玉米中的數(shù)字化表達(dá)解剖學(xué)
表19FUE_16在玉米中的數(shù)字化表達(dá)處理
表20FUE_16直向同源物組的數(shù)字化表達(dá)解剖學(xué)
表21FUE_16直向同源物組的數(shù)字化表達(dá)處理
FUE_17是在玉米和其他植物物種中顯示出數(shù)字化表達(dá)的假設(shè)蛋白質(zhì)，使其與對(duì)于干旱(玉米、大麥和高粱)、病原體(稻、大豆和番茄)的應(yīng)答以及在大麥中對(duì)于氮缺乏和水澇的應(yīng)答相聯(lián)系。
由于其注釋和來源于根的顯著EST含量(特別是在FUE_30的情況下)而選擇FUE_30和FUE_31。FUE_30和FUE_31具有預(yù)測(cè)的轉(zhuǎn)化酶活性，所述轉(zhuǎn)化酶是已知當(dāng)在衰老激活啟動(dòng)子下表達(dá)時(shí)延遲衰老的酶(Balibrea Lara等人，Plant Cell 161276-1287，2004)。FUE_30可以延長(zhǎng)植物的滯綠特征，并因此增加植物中貯存氮的總體能力以用于在籽粒灌漿期間的重新分布。
FUE_32被注釋為主要固有樣蛋白質(zhì)并且其小麥直向同源物包含從根中分離的幾種序列。此外，所選擇的玉米基因顯示出與BrevisRadix的同源性。Brevis Radix是細(xì)胞增殖和延伸的新型調(diào)節(jié)劑，當(dāng)使它失活時(shí)產(chǎn)生具有較短的根的植物(Mouchel等人，Genes和Development第18卷700714，2004)。
FUE_54顯示出與生長(zhǎng)素應(yīng)答性蛋白的同源性。所述基因包含來自根和受脅迫組織，以及其來自高粱和稻的最佳直向同源物的顯著EST注釋，所述最佳直向同源物在脅迫條件下特異性表達(dá)并且可能在根中富集。
FUE_33和FUE_100編碼腈水解酶。腈水解酶是生長(zhǎng)素生物合成途徑中重要的酶，其將3-吲哚乙腈轉(zhuǎn)變成3-吲哚乙酸(生長(zhǎng)素)。腈水解酶在根中的表達(dá)增加將放大總體生長(zhǎng)素水平，并誘導(dǎo)根延伸、次生根形成、增強(qiáng)的向重力性反應(yīng)等。
FUE_34和FUE_35以及FUE_46和FUE_47均為特別是在受脅迫的根中表達(dá)的可能轉(zhuǎn)錄因子，這通過提供基因序列的EST文庫(kù)來判斷。因?yàn)檫@些轉(zhuǎn)錄因子與水分脅迫文庫(kù)高度相關(guān)，所以修飾這些基因的表達(dá)可能將激活誘導(dǎo)與脅迫相關(guān)的結(jié)構(gòu)和代謝變化的基因。
FUE_36、FUE_37和FUE_38顯示出一定程度的與ABA-應(yīng)答性基因和/或脅迫注釋基因的相似性，并且具有源自根文庫(kù)的顯著含量的序列。FUE_36可能具有與SAPK8具有驚人的相似性的蛋白激酶活性，這證實(shí)了在脅迫應(yīng)答中的作用，所述SAPK8是其表達(dá)水平在ABA處理期間或在鹽度條件下增加的蛋白質(zhì)。FUE_37具有源自根并特別是在水分脅迫下的根的幾乎全部序列(如表22和23中所示)。來自大麥、小麥和甘蔗的直向同源物也支持該基因主要在根中表達(dá)的論點(diǎn)。表明，這種基因涉及對(duì)于水分脅迫剝奪、高滲鹽度反應(yīng)、冷和其他脅迫的應(yīng)答。
表22FUE_37直向同源物組的數(shù)字化表達(dá)解剖學(xué)
表23FUE_37直向同源物組的數(shù)字化表達(dá)處理
FUE_38源自各種受脅迫的根文庫(kù)(如表24和25中所示)并且顯示出與PKABA1的顯著的相似性。PKABA1轉(zhuǎn)錄物水平在正在生長(zhǎng)的幼苗中幾乎無法檢測(cè)，但在對(duì)植物實(shí)施脫水、冷和滲透脅迫時(shí)被急劇誘導(dǎo)(Holappa LD和Walker-Simmons MK Plant Physiol.第108卷1203-1210，1995)。這種基因的經(jīng)修飾的表達(dá)模式可以提供提高的非生物脅迫耐受性、提高的活力、增加的產(chǎn)量和更好的肥料使用效率。
表24FUE_38直向同源物組的數(shù)字化表達(dá)解剖學(xué)
表25FUE_38直向同源物組的數(shù)字化表達(dá)處理
使用在(http://affymetrix.arabidopsis.info/narrays/supersearch.p1？searchterms＝afgn)處可獲得的微陣列擬南芥表達(dá)數(shù)據(jù)而選擇出FUE_48。鑒定了具有在根中的富集的表達(dá)并且對(duì)于ABA和非生物脅迫(鹽度、滲壓劑和冷)具有高度應(yīng)答性的基因。所述基因之一在玉米中具有直向同源物(FUE_48)，其顯示出含量增加的源自根的序列?？赡艿母吡恢毕蛲次锸侵饕稍醋悦{迫的序列組成的基因，特別是來自水分脅迫和干旱條件(如表26中所示)。FUE_48顯示出與SIP(種子吸漲蛋白)的相似性。
表26FUE_48直向同源物組的數(shù)字化表達(dá)處理
FUE_39是根表達(dá)的鈣依賴磷酸酶B樣Ca++結(jié)合蛋白。鈣依賴磷酸酶是由脅迫條件差異調(diào)節(jié)的Ca++感知蛋白激酶，所述脅迫條件例如為鹽、干旱、冷和創(chuàng)傷脅迫。鈣參與根的幾種重要行為例如向重力性、向水性等，并且是用于各種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的重要的第二信使。與參照植物相比較，其中涉及FUE_39的蛋白質(zhì)級(jí)聯(lián)的連續(xù)活化可以提供有利的性質(zhì)或所需的性狀，包括改善的非生物脅迫耐受性、提高的活力和產(chǎn)量、改善的肥料使用等。
FUE_40和FUE_41是在根中(特別是在脅迫條件下)表達(dá)的基因。FUE_40的高粱直向同源物具有源自受脅迫的組織(包括根)的幾種序列。FUE_41和FUE_40顯示出與脅迫應(yīng)答性蛋白質(zhì)的相似性。
FUE_43、FUE_44和FUE_45具有疏遠(yuǎn)的與大腸桿菌通用脅迫蛋白的相似性，并且它們的組成序列包含很大部分的根受脅迫組織(關(guān)于FUE_43如表27中所示，和關(guān)于FUE_44如表28中所示)。FUE_43顯示出與乙烯應(yīng)答性蛋白質(zhì)的相似性。FUE_44和FUE_45顯示出弱的與早期結(jié)瘤蛋白樣蛋白質(zhì)的相似性。在不同的啟動(dòng)子下異位表達(dá)的那些蛋白質(zhì)可能在轉(zhuǎn)基因植物中產(chǎn)生有利的效應(yīng)，例如增強(qiáng)的脅迫耐受性、在最佳和不利條件下改善的生長(zhǎng)，這主要是由于根構(gòu)造中可能的修飾。
表27FUE_43直向同源物組的數(shù)字化表達(dá)處理
表28FUE_44直向同源物組的數(shù)字化表達(dá)處理
使用微陣列擬南芥表達(dá)數(shù)據(jù)選擇出FUE_50，在所述微陣列擬南芥表達(dá)數(shù)據(jù)中如果它們也是生長(zhǎng)素和乙烯應(yīng)答性的，那么選擇根特異性基因。根據(jù)計(jì)算的數(shù)字化表達(dá)，本發(fā)明中呈現(xiàn)的玉米直向同源物在根中在水分脅迫條件下和在致病相關(guān)組織中表達(dá)。玉米基因顯示出與結(jié)瘤蛋白的相似性，所述結(jié)瘤蛋白是已知在結(jié)節(jié)和側(cè)根發(fā)育期間所涉及的蛋白質(zhì)(Papadopoulou等人，Plant Mol Biol.1996；30403-17)。
FUE_501是推定的擬南芥(Arabidopsis thaliana)氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其在鹽度、滲壓劑下顯示出增加的表達(dá)，并且也是脫落酸應(yīng)答性的(ABA-非生物脅迫應(yīng)答激素)。FUE_51(FUE_501的玉米同源物)主要由衍生自受脅迫根序列的序列構(gòu)成，并且具有作為氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的暫時(shí)注釋。根據(jù)數(shù)字化表達(dá)，F(xiàn)UE_51的高粱直向同源物參與脅迫應(yīng)答。它的大麥直向同源物具有源自根和受脅迫根的序列。此外，小麥直向同源物顯示出幾種源自根的序列。
FUE_502是推定的氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其在鹽度脅迫和滲壓劑期間在根和枝條中顯示出增加的表達(dá)。FUE_52，它的最接近的玉米直向同源物，也具有與氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的相似性并且為源自根和受脅迫根的序列的重要代表。
FUE_503在種子中具有顯著表達(dá)，這暗示在將氨基酸攝取入正在發(fā)育的種子中方面的強(qiáng)烈作用。此外，該基因在鹽度下和響應(yīng)茉莉酮酸甲酯而強(qiáng)烈上調(diào)。由于其對(duì)于ABA、鹽度(特別是枝條)、滲壓劑和冷的強(qiáng)烈應(yīng)答而選擇出FUE_504。FUE_49在翻譯的氨基酸水平上顯示出與FUE_504的強(qiáng)相似性，但在編碼核苷酸水平上很低。它的高粱直向同源物具有明顯源自水分脅迫/干旱文庫(kù)的序列。
FUE_53是推定的氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其具有組成源自根并特別是受脅迫根的基因的幾乎所有序列。高粱、稻和小麥直向同源物包含幾種源自根和在脅迫文庫(kù)下的根的序列。
FUE_101和FUE_102顯示出與氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的相似性。FUE_102特別地由源自冷處理的幼苗和病原體感染的玉米穗尖的序列組成。
FUE_55是與tRNA異戊烯基轉(zhuǎn)移酶具有驚人的相似性的基因，所述tRNA異戊烯基轉(zhuǎn)移酶是細(xì)胞分裂素代謝途徑中重要的酶。FUE_55在根或枝條中增加的表達(dá)將增加細(xì)胞分裂素的水平，從而導(dǎo)致葉延展和細(xì)胞復(fù)制增強(qiáng)、衰老延遲、組織的儲(chǔ)庫(kù)強(qiáng)度增加、氮利用增強(qiáng)等。FUE_55特別是在胚乳中表達(dá)，所述胚乳是可能為植物中最強(qiáng)的儲(chǔ)庫(kù)的組織。
FUE_505是在2個(gè)重要的基因列表中存在的推定的含AP2結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子。一個(gè)列表包括玉米素應(yīng)答性的基因(玉米素是天然存在的細(xì)胞分裂素)，而第二個(gè)基因列表包括在向氮饑餓植物添加氮后被氮誘導(dǎo)的基因(Wang等人，Plant Physiology，June 2003，第132卷，第556-567頁(yè))。FUE_505在ARR(擬南芥應(yīng)答調(diào)節(jié)物)的聚簇中發(fā)現(xiàn)，所述ARR調(diào)節(jié)枝條對(duì)細(xì)胞分裂素的應(yīng)答。根細(xì)胞分裂素的產(chǎn)生根據(jù)氮可用性而增加(Yamada等人，F(xiàn)EBS Lett.第436卷，第76-80頁(yè)，1998)。它與ARRs一起的共調(diào)節(jié)表明了在細(xì)胞分裂素應(yīng)答中的可能作用。由于枝條的細(xì)胞分裂素應(yīng)答的連續(xù)活化，F(xiàn)UE_505的組成型表達(dá)非常可能將改善氮利用和植物生長(zhǎng)。
實(shí)施例2 在計(jì)算機(jī)上(in-silico)表達(dá)的多核苷酸的mRNA表達(dá) 使用逆轉(zhuǎn)錄測(cè)定法及隨后的定量實(shí)時(shí)PCR(qRT-PCR)分析來測(cè)定mRNA水平。在不同組織、發(fā)育階段、生長(zhǎng)條件和/或不同遺傳背景之間比較RNA水平。在不同實(shí)驗(yàn)條件/遺傳背景下mRNA水平之間的相關(guān)性分析作為關(guān)于基因在植物中的作用的證據(jù)。
方法 RT-PCR分析——從在裝滿3號(hào)蛭石(Vermiculite Size 3)的10升白色桶中生長(zhǎng)的玉米植物中新鮮切下根和葉。用自來水向桶內(nèi)加水直至來自商業(yè)雜種的種子發(fā)芽。在整個(gè)生長(zhǎng)期間(5周)，植物用包含2mM CaCl2、1mM MgSO4、1mM KH2PO4、7mM KCl和微量元素混合物的pH5.7-5.8的溶液以2升/桶/天進(jìn)行灌溉。硝酸銨以下述濃度添加5mM、0.5mM、0.05mM、0.005mM或根本無。對(duì)于使用硝酸鉀代替硝酸銨的實(shí)驗(yàn)，濃度如下2mM CaCl2、2mM MgSO4、1mM KH2PO4、5mM KCl，以及一種下述濃度的KNO35mM、1mM、0.1mM、0.01mM，用補(bǔ)充濃度的KCl以維持10mM的鉀終濃度。
定量實(shí)時(shí)RT-PCR(qRT-PCR)——為了檢驗(yàn)表達(dá)水平、特異性和性狀關(guān)聯(lián)，對(duì)從植物的幾個(gè)部分中提取的總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄及隨后的定量實(shí)時(shí)PCR(qRTPCR)，所述部分包括例如成熟的和年幼的葉、根和根分生組織、外殼、雄花穗、穗絲等，它們來自如上所述在土壤或罐上在最佳或營(yíng)養(yǎng)物缺乏條件下生長(zhǎng)的植物。對(duì)于先前通過生物信息學(xué)而預(yù)測(cè)與肥料使用效率相關(guān)的所有基因，測(cè)量信使RNA(mRNA)水平，并且分析表達(dá)水平和植物營(yíng)養(yǎng)物狀態(tài)之間的相關(guān)性。使用RNeasy植物小型試劑盒(Qiagen，Germany)并使用由制造商提供的方案從玉米的葉或根中提取總RNA。使用1.5μg總RNA，使用300 U SuperScript II Reverse Transcriptase酶(Invitrogen)、225ng隨機(jī)脫氧核苷酸六聚物(Invitrogen)、500μM dNTPs混合物(Takara，Japan)、0.2體積x5RT緩沖液(Invitrogen)、0.01M DTT、60U RNAsin(Promega)來進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，添加經(jīng)DEPC處理的DDW直至37.5μl。RT反應(yīng)體系于42℃溫育5分鐘，隨后為70℃15分鐘。cDNA在TrisEDTA(pH＝8)中進(jìn)行1:20稀釋。對(duì)于qRT-PCR使用5mL稀釋的cDNA。
對(duì)cDNA(5μL)進(jìn)行定量RT-PCR，使用x 1 SYBR GREEN PCR主(master)混合物(Applied Biosystems)，正向和反向引物各0.3μM，并添加DDM直至20μL。在Stratagene MX3000實(shí)時(shí)PCR儀中進(jìn)行qPCR反應(yīng)，使用下述條件50℃2分鐘，95℃10分鐘，40次的95℃15秒和60℃1分鐘，隨后為95℃15秒，60℃60秒，和70次的60℃10秒，在每次循環(huán)中增加+0.5℃。對(duì)于每種基因，從來自5個(gè)稀釋度(稀釋度-1:60、1:200、1:600、1:2000、1:10000)的所有樣品的RTs庫(kù)中制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線圖[ct(循環(huán)閾值)對(duì)log(濃度)]應(yīng)具有R>＝0.98，而效率為100％+/-5％。使用擴(kuò)增反應(yīng)的效率(E)和相應(yīng)的C.T.(樣品穿過閾值時(shí)的那個(gè)循環(huán))來計(jì)算在qPCR中測(cè)量的表達(dá)水平(Qty)，Qty＝E-C.T.。就非特異性PCR產(chǎn)物或引物二聚體的不存在來證明所獲得的解離曲線是否合格。反應(yīng)至少重復(fù)2次。該計(jì)算方法基于這樣的假設(shè)，即GOI(目的基因)和持家基因的反應(yīng)效率是相似的。
為了使玉米植物的不同組織和生長(zhǎng)條件之間的表達(dá)水平標(biāo)準(zhǔn)化，將每種基因的表達(dá)除以下述4種持家基因的表達(dá)的幾何平均值肌動(dòng)蛋白(GenBank登記號(hào)AY107106)、RPL19(GenBank登記號(hào)AY103679)、親環(huán)蛋白(GenBank登記號(hào)X68678)和延伸因子1α(EF1A，GenBank登記號(hào)AF136823)。
表29下述引物用于qRT-PCR分析 結(jié)果 實(shí)時(shí)RT-PCR分析提供了計(jì)算機(jī)選擇的多核苷酸序列與氮使用確實(shí)相關(guān)的證據(jù)。盡管大多數(shù)基因是由于其與干旱的關(guān)聯(lián)而被選擇出來，但發(fā)現(xiàn)基因?qū)χ参飪?nèi)的氮狀況有應(yīng)答，這暗示干旱和營(yíng)養(yǎng)物缺乏脅迫之間的串?dāng)_。關(guān)于在這個(gè)測(cè)定法中所使用的RNA小組確實(shí)反映與氮狀態(tài)相關(guān)的真實(shí)變化的證據(jù)可以在圖3A-D中找到，其中與氮攝取和同化相關(guān)的已知基因顯示出其表達(dá)水平根據(jù)灌溉溶液中所使用的氮肥水平而變化。所述曲線圖表示了對(duì)于每種基因所發(fā)現(xiàn)的標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá)水平除以在灌溉溶液中所使用的最高氮肥濃度下的表達(dá)水平。圖3A和3B顯示了分別對(duì)于2種高親和力的硝酸鹽和銨轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白而發(fā)現(xiàn)的結(jié)果。如所預(yù)期的，在較高濃度的底物下，高親和力轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)下調(diào)。相反地，在底物不足的條件下明顯必需的那些高親和力的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在低硝酸鹽和銨濃度時(shí)上調(diào)(參見圖3A和3B)。如對(duì)于氮同化途徑中的2種關(guān)鍵酶例如谷氨酰胺合酶1C和谷氨酰胺合酶2所預(yù)期的，它們的表達(dá)在高底物濃度下上調(diào)，如分別在圖3C和3D中所顯示的。通常，高N濃度上調(diào)低親和力的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。相反地，低N濃度上調(diào)高親和力的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。參與N同化(n至氨基酸的轉(zhuǎn)變)的酶在氮存在時(shí)被上調(diào)。實(shí)施例1中所鑒定的基因顯示出對(duì)于對(duì)照基因所發(fā)現(xiàn)的獨(dú)特的氮應(yīng)答行為(圖3A-D)。如對(duì)于關(guān)鍵對(duì)照同化酶所發(fā)現(xiàn)的，F(xiàn)UE_3(如圖4A中所示)顯示出在高底物濃度下上調(diào)，這表明這種基因與植物的氮狀況的明確關(guān)聯(lián)以及因此它與氮相關(guān)應(yīng)答的聯(lián)系。對(duì)于FUE_3所發(fā)現(xiàn)的相同上調(diào)在實(shí)施例1中所包括的幾種其他基因中被發(fā)現(xiàn)，例如FUE_12(如圖4B中所示)、FUE_30(如圖4C中所示)、FUE_33(如圖4D中所示)、FUE_34(如圖4E中所示)、FUE_38(如圖4F中所示)、FUE_43(如圖4G中所示)、FUE_47(如圖4H中所示)、FUE_48(如圖4I中所示)、FUE_49(如圖4J中所示)和FUE_52(如圖4K中所示)。
然后再次，在實(shí)施例1中包括在當(dāng)?shù)使?yīng)不足時(shí)顯示出緊密上調(diào)的基因。預(yù)期這種類型的基因與參與在氮缺乏條件下的氮同化、貯存和使用的途徑相關(guān)，如高親和力的硝酸鹽和銨轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的情況(圖2C和2D)。圖5A顯示了關(guān)于FUE_4的結(jié)果，所述FUE_4是在低氮肥可用性下經(jīng)歷強(qiáng)上調(diào)的基因，這表明這種基因在對(duì)氮缺乏條件的植物內(nèi)源性應(yīng)答中的明確作用。同樣地，實(shí)施例1中的其他基因展現(xiàn)出與FUE_4相似的氮應(yīng)答性曲線，例如FUE_10(如圖5B中所示)、FUE_37(如圖5C中所示)、FUE_46(如圖5D中所示)和FUE_50(如圖5E中所示)。
總之，本文呈現(xiàn)的結(jié)果清楚地暗示了計(jì)算機(jī)選擇的基因和氮相關(guān)途徑之間的緊密相關(guān)性。
實(shí)施例3 基因克隆和用于植物表達(dá)的雙元載體的制備 克隆策略 將在上文在實(shí)施例1中選擇并在實(shí)施例2中驗(yàn)證的50種基因中的28種基因克隆到雙元載體內(nèi)以用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物。對(duì)于克隆，首先鑒定全長(zhǎng)開放讀碼框(ORF)。通過將幾種翻譯算法的結(jié)果與來自其他植物物種的已知蛋白質(zhì)相比較，分析EST聚簇和在某些情況下分析mRNA序列以鑒定完整開放讀碼框。在未發(fā)現(xiàn)完整編碼序列的情況下，使用來自Ambion或Clontech的RACE試劑盒(RACE＝Rapid Accessto cDNA Ends)從在上文實(shí)施例2中描述的植物樣品中制備RNA，從而得以獲取基因的全cDNA轉(zhuǎn)錄物。
為了克隆全長(zhǎng)cDNAs，對(duì)于從葉、根或其他植物組織(在正?；驙I(yíng)養(yǎng)物缺乏條件下生長(zhǎng))中提取的總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄及隨后的PCR(RT-PCR)。使用其他地方描述的標(biāo)準(zhǔn)方案(Sambrook J.，E.F.Fritsch和T.Maniatis.1989.Molecular Cloning.A LaboratoryManual.，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York.)來進(jìn)行總RNA提取、cDNA產(chǎn)生和PCR擴(kuò)增，并且對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是基本的。使用PCR純化試劑盒(Qiagen)來純化PCR產(chǎn)物，并且使用ABI377測(cè)序儀(Applied Biosystems)進(jìn)行經(jīng)擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物的測(cè)序。
為了促進(jìn)cDNAs的克隆，給每種引物的5′原有末端添加8-12bp延長(zhǎng)部分。引物延長(zhǎng)部分包括核酸內(nèi)切酶限制位點(diǎn)。使用2種參數(shù)來選擇限制位點(diǎn)a.該位點(diǎn)不存在于cDNA序列中。b.正向和反向引物中的限制位點(diǎn)經(jīng)過設(shè)計(jì)，使得經(jīng)消化的cDNA以有義形式插入用于轉(zhuǎn)化的雙元載體內(nèi)。例如，通過將源于pGL3基本質(zhì)粒載體(Promega，登記號(hào)U47295；bp4658-4811)的合成poly-(A)信號(hào)序列插入雙元載體pBI101.3(Clontech，登記號(hào)U12640)的HindIII限制位點(diǎn)中來構(gòu)建pPI質(zhì)粒載體。
純化PCR產(chǎn)物(PCR Purification Kit，Qiagen，Germany)，并根據(jù)所使用的引物(Roche，Switzerland)用限制位點(diǎn)進(jìn)行消化。將經(jīng)消化的PCR產(chǎn)物克隆到用相同的限制酶進(jìn)行消化的雙元載體pPI中。將經(jīng)消化的PCR產(chǎn)物和線性化的質(zhì)粒載體使用T4DNA連接酶(Roche，Switzerland)進(jìn)行連接。使用下述引物從提取自上述組織的RNA中克隆下述基因 表30-從cDNA文庫(kù)中克隆的基因和用于克隆的引物

某些經(jīng)克隆的多核苷酸的合成序列從商業(yè)供應(yīng)商(GeneArt，GmbH)處定購(gòu)。基于在實(shí)施例1中描述的推定的所編碼的多肽序列，在計(jì)算機(jī)上設(shè)計(jì)合成的DNA。
為了優(yōu)化編碼序列，使用從植物轉(zhuǎn)錄組中計(jì)算出的密碼子使用表(此類表的例子可以在http://www.kazusa.or.jp/codon/處可在線獲得的Codon Usage Database中找到)。優(yōu)化的編碼序列以如下方式進(jìn)行設(shè)計(jì)在編碼的氨基酸序列中不引入變化，而同時(shí)使用對(duì)于在雙子葉植物主要是番茄和擬南芥；和單子葉植物例如玉米中的表達(dá)來說優(yōu)選的密碼子。此類優(yōu)化的序列促進(jìn)更好的翻譯速率和因此更高的蛋白質(zhì)表達(dá)水平。向該經(jīng)優(yōu)化的序列添加側(cè)翼的、另外的獨(dú)特限制酶位點(diǎn)——在5′末端處的SalI、Xba I、BamHI、SmaI，和在3′末端處的SacI。對(duì)于其制備了密碼子優(yōu)化的合成序列的基因是FUE_2(SEQ ID NO1317)、FUE_3(SEQ ID NO1319)、FUE_4(SEQ ID NO1320)、FUE_40(SEQ ID NO1321)、FUE_7(SEQ ID NO1322)、FUE_8(SEQID NO1324)、FUE_9(SEQ ID NO1325)、FUE_10(SEQ ID NO1326)、FUE_12(SEQ ID NO1327)、FUE_13(SEQ ID NO1328)、FUE_14(SEQ ID NO1329)、FUE_16(SEQ ID NO1330)、FUE_37(SEQ ID NO1331)、FUE_41(SEQ ID NO1332)、FUE_46(SEQ IDNO1333)、FUE_47(SEQ ID NO1334)、FUE_49(SEQ ID NO1335)、FUE_52(SEQ ID NO1336)。
合成兩種未優(yōu)化的序列并進(jìn)行克隆以用于在轉(zhuǎn)基因植物制備中過表達(dá)，所述兩種未優(yōu)化的序列被命名為“FUE_2_Original”(SEQ ID NO1318)和“FUE_7_Original”(SEQ ID NO1323)，等同于其內(nèi)源性的玉米序列。
包含F(xiàn)UE基因和用于驅(qū)動(dòng)其表達(dá)的植物功能性啟動(dòng)子的雙元載體的產(chǎn)生——通過將源于pGL3基本質(zhì)粒載體(Promega，登記號(hào)U47295；bp4658-4811)的合成poly-(A)信號(hào)序列插入雙元載體pBI101.3(Clontech，登記號(hào)U12640)的HindIII限制位點(diǎn)中來構(gòu)建質(zhì)粒pPI。在某些情況下，所使用的主鏈雙元質(zhì)粒是pGI，其類似于pPI但GUS基因被GUS-內(nèi)含子基因替換(Vancanneyt.G，等人，MGG 220，245-50，1990)。pGI用于克隆所有多核苷酸序列，其最初在35S啟動(dòng)子的控制下[Odell，JT，等人，Nature 313，810-812(28 February 1985)；SEQ ID NO1337]。
將一些多核苷酸序列克隆在如下所述的其他優(yōu)先啟動(dòng)子下。這些啟動(dòng)子之一由于其在根中的富集表達(dá)而在本文中被命名為“RootP”(SEQ ID NO1338)，使用下述引物通過直接PCR從分離自擬南芥的基因組DNA中擴(kuò)增和克隆出該啟動(dòng)子。
表31 該啟動(dòng)子是基因ATXTH19(AT4G30290，木葡聚糖內(nèi)轉(zhuǎn)葡糖基酶/水解酶19)的1110bp上游區(qū)。已顯示該經(jīng)克隆的序列驅(qū)動(dòng)根特異性表達(dá)(Vissenberg K等人，Plant Cell Physiol.2005 Jan；46(1)192-200)。將下述基因克隆入RootP啟動(dòng)子序列的下游FUE_3、FUE_4、FUE_8、FUE_9、FUE_13、FUE_14、FUE_16、FUE_33、FUE_34_Evo。由uid A基因(GENBANK登記號(hào)S69414)編碼的β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)作為對(duì)照。
TT105啟動(dòng)子(SEQ ID NO1339；2004/081173)用于以與由35S啟動(dòng)子介導(dǎo)的水平不同的水平介導(dǎo)組成型的普遍存在的表達(dá)。啟動(dòng)子TT105包含包括第一個(gè)外顯子和第一個(gè)內(nèi)含子的一部分的ELP基因(木質(zhì)素異位沉積，GENBANK登記號(hào)NM_100466，AT1G05850)上游區(qū)域?？寺≡赥T105啟動(dòng)子下的基因是FUE_502、FUE_504、FUE_39和FUE_52。此處再次將由uid A基因編碼的β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)克隆在TT105啟動(dòng)子下。
實(shí)施例4 表達(dá)FUE基因的轉(zhuǎn)基因植物的產(chǎn)生 材料和方法 擬南芥的轉(zhuǎn)化——根據(jù)下述參考文獻(xiàn)來完成Clough SJ，Bent AF.(1998)Floral dipa simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.Plant J.16(6)735-43；和Desfeux C，Clough SJ，Bent AF.(2000)Femalereproductive tissue sare the primary targets of Agrobacterium-mediated transformation by the Arabidopsis floral-dip method.Plant Physiol.123(3)895-904)。簡(jiǎn)而言之，使用由Clough SJ和Bent AF(10)以及由DesfeuxC等人(11)描述的Floral Dip程序(具有少量修改)來轉(zhuǎn)化擬南芥Columbia變種(T0植物)。簡(jiǎn)而言之，將擬南芥Columbia(Co10)T0植物播種在裝滿濕泥炭基生長(zhǎng)混合物的250ml罐中。罐用鋁箔和塑料圓蓋覆蓋，放置于4℃3-4天，隨后打開并在生長(zhǎng)室中于18-24℃以16/8小時(shí)的光/暗循環(huán)進(jìn)行溫育。T0植物在開花期前6天準(zhǔn)備用于轉(zhuǎn)化。攜帶具有FUE基因的雙元載體的土壤桿菌的單個(gè)菌落在補(bǔ)充有卡那霉素(50mg/L)和慶大霉素(50mg/L)的LB培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。該培養(yǎng)物于28℃在劇烈搖動(dòng)下溫育48小時(shí)，并在4000rpm下離心5分鐘。將包含土壤桿菌細(xì)胞的粒狀沉淀重懸浮于轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中，所述轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基包含半強(qiáng)度(2.15g/L)的Murashige-Skoog(Duchefa)；0.044μM芐氨基嘌呤(Sigma)；112μg/L B5 Gambourg維生素(Sigma)；5％蔗糖；和在雙蒸餾水中的0.2ml/L Silwet L-77(OSI Specialists，CT)，pH為5.7。
通過下列方式來進(jìn)行T0植物的轉(zhuǎn)化將每個(gè)植物倒置在土壤桿菌懸浮液中，從而使得花莖被淹沒3-5秒。將每個(gè)經(jīng)接種的T0植物立即置于塑料托盤中，隨后用干凈的塑料圓蓋覆蓋以維持濕度，并在黑暗中在室溫下放置18小時(shí)以促進(jìn)感染和轉(zhuǎn)化。隨后打開經(jīng)轉(zhuǎn)化的(轉(zhuǎn)基因)植物上的蓋子，并將植物轉(zhuǎn)移至溫室以進(jìn)行恢復(fù)和成熟。轉(zhuǎn)基因T0植物在溫室中生長(zhǎng)3-5周直至長(zhǎng)角果變成褐色且干燥的，隨后收獲來自植物的種子并置于室溫下直至播種。
為了產(chǎn)生具有所述基因的T1和T2轉(zhuǎn)基因植物，通過浸入70％乙醇中1分鐘，隨后浸入5％次氯酸鈉和0.05％ Triton X-100中5分鐘來對(duì)從轉(zhuǎn)基因T0植物收集的種子進(jìn)行表面滅菌。將經(jīng)表面滅菌的種子在無菌蒸餾水中充分洗滌，隨后置于培養(yǎng)平板上，所述培養(yǎng)平板包含半強(qiáng)度的Murashige-Skoog(Duchefa)；2％蔗糖；0.8％植物瓊脂；50mM卡那霉素；和200mM羧芐青霉素(carbenicylin)(Duchefa)。培養(yǎng)平板于4℃溫育48小時(shí)，隨后轉(zhuǎn)移至生長(zhǎng)室于25℃再溫育一周。將有生活力的T1擬南芥植物轉(zhuǎn)移至新鮮的培養(yǎng)平板上以進(jìn)行另外一周的溫育。溫育后，從培養(yǎng)平板中取出T1植物，并種植在包含于250ml罐中的生長(zhǎng)混合物之中。使轉(zhuǎn)基因植物在溫室中生長(zhǎng)至成熟。在與用于培養(yǎng)和生長(zhǎng)T1植物相同的條件下，培養(yǎng)從T1植物收獲的種子并生長(zhǎng)至成熟以作為T2植物。從每種構(gòu)建體制備至少10個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)化事件，關(guān)于其收集大量T2種子。
玉蜀黍的轉(zhuǎn)化——該程序根據(jù)(Bronwyn R.Frame等人，Agrobacterium tumefaciens-Mediated Transformation of MaizeEmbryos Using a Standard Binary Vector System，Plant Physiology，May 2002，第129卷，第13-22頁(yè))或在別處從Iowa State University的Plant Transformation Facility(http://www.agron.iastate.edu/ptf/Web/mainframe.htm)可獲得的幾種方案來完成。
實(shí)施例5 根據(jù)表達(dá)水平來選擇表達(dá)FUE基因的轉(zhuǎn)基因擬南芥植物 材料和方法 轉(zhuǎn)基因植物如上文實(shí)施例4中所述進(jìn)行生長(zhǎng)。如上文實(shí)施例2中所述的，從來自轉(zhuǎn)基因植物的10朵新鮮切離的花中提取總RNA。為了測(cè)定轉(zhuǎn)基因的相對(duì)表達(dá)水平，如上文實(shí)施例2中所述進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，并且針對(duì)在相同樣品中測(cè)量的2種持家基因的表達(dá)的幾何平均值對(duì)結(jié)果進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。
表31-用于選擇轉(zhuǎn)基因植物的引物 結(jié)果 對(duì)于每種構(gòu)建體篩選約12個(gè)轉(zhuǎn)基因事件。結(jié)果是高度重復(fù)性的，并且顯示出，在12個(gè)隨機(jī)轉(zhuǎn)化事件內(nèi)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因表達(dá)的約20-40倍差異。此類發(fā)現(xiàn)的代表性例子顯示于表32、33和34中?；谶@些發(fā)現(xiàn)，獲取顯示出比中值更高的表達(dá)水平的5個(gè)不同事件以用于進(jìn)一步的基因功能驗(yàn)證(參見實(shí)施例6-9)。
表32 表33 表34 實(shí)施例6 在組織培養(yǎng)測(cè)定法中的改善的肥料使用效率 材料和方法 測(cè)定法1使用小植物的氮使用效率測(cè)定法——該測(cè)定法根據(jù)Yanagisawa-S.等人(“Metabolic engineering with Dof1transcription factor in plantsImproved nitrogen assimilationand growth under low-nitrogen conditions”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101，7833-7838)(具有少量改動(dòng))來進(jìn)行。
將在補(bǔ)充有選擇試劑的0.5 x MS[Murashige-Skoog]中生長(zhǎng)7-10天的轉(zhuǎn)基因植物轉(zhuǎn)移至2種氮限制條件中其中結(jié)合氮濃度(NH4NO3和KNO3)是0.2mM或0.05mM的MS培養(yǎng)基。使植物再生長(zhǎng)30-40天，并且隨后進(jìn)行拍照，從瓊脂中逐個(gè)取出(沒有根的枝條)并立即稱重(鮮重)以用于隨后的統(tǒng)計(jì)分析。將對(duì)于其只能獲得T1種子的構(gòu)建體播種在選擇性培養(yǎng)基上并將至少25株幼苗(每一個(gè)代表獨(dú)立的轉(zhuǎn)化事件)小心地轉(zhuǎn)移至氮限制培養(yǎng)基。關(guān)于對(duì)于其可獲得T2種子的構(gòu)建體，分析不同的轉(zhuǎn)化事件。通常，將來自每個(gè)事件的25個(gè)隨機(jī)選擇的植物轉(zhuǎn)移至氮限制培養(yǎng)基，使之再生長(zhǎng)3-4周并在此階段結(jié)束時(shí)逐個(gè)稱重。將轉(zhuǎn)基因植物與在相同條件下平行生長(zhǎng)的對(duì)照植物相比較。在相同啟動(dòng)子下表達(dá)uidA報(bào)道基因(GUS)的模擬轉(zhuǎn)基因植物用作對(duì)照。
統(tǒng)計(jì)分析——為了鑒定賦予顯著改善的氮使用效率(或?qū)Ψ巧锩{迫的耐受性或擴(kuò)大的根構(gòu)造，參見下文)的基因，將從轉(zhuǎn)基因植物獲得的結(jié)果與從對(duì)照植物獲得的結(jié)果相比較。使用單向ANOVA來分析植物面積數(shù)據(jù)、種子重量數(shù)據(jù)和植物重量數(shù)據(jù)。為了鑒定具有優(yōu)越性能的基因和構(gòu)建體，分別分析來自所測(cè)試的獨(dú)立轉(zhuǎn)化事件的結(jié)果。此外，還在考慮了從所測(cè)試的所有獨(dú)立轉(zhuǎn)化事件和具體構(gòu)建體獲得的結(jié)果的情況下分析基因和構(gòu)建體。對(duì)于基因?qū)?duì)照的分析，應(yīng)用Student′s t檢驗(yàn)或Tukey HSD檢驗(yàn)，使用p<0.05的顯著性。使用JMP統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件包(版本5.2.1，SAS Institute Inc.，Cary，NC，USA)。在下文實(shí)施例6-9中使用相同的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
結(jié)果 就許多商業(yè)上所需的性狀來驗(yàn)定本發(fā)明的多核苷酸序列。
圖7顯示了FUE_504或FUE_39改善表達(dá)其的轉(zhuǎn)基因植物的NUE的能力。明顯地，生長(zhǎng)在氮上的轉(zhuǎn)基因植物比對(duì)照植物更大和更重，所述對(duì)照植物在用于表達(dá)轉(zhuǎn)基因的相同啟動(dòng)子下表達(dá)對(duì)照基因。為了驗(yàn)證由轉(zhuǎn)基因植物達(dá)到的重量增加是統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的，對(duì)植物逐個(gè)稱重并分析整個(gè)事件群體的結(jié)果。如下表35中所示，表達(dá)FUE_504的轉(zhuǎn)基因植物比對(duì)照相應(yīng)物明顯更重。該結(jié)果證實(shí)了NUE的改善，因?yàn)楸磉_(dá)FUE_504的轉(zhuǎn)基因植物能夠生產(chǎn)比從類似的貧氮培養(yǎng)基開始的對(duì)照植物明顯更多的生物量。
表35
值得注意的是，無論何時(shí)，將T1植物用于測(cè)定FUE_504的效應(yīng)；因此所測(cè)試的每個(gè)植物是不同轉(zhuǎn)化事件的結(jié)果。考慮到這點(diǎn)，顯而易見的是，對(duì)于T1植物發(fā)現(xiàn)的效應(yīng)是與轉(zhuǎn)基因整合位點(diǎn)不相關(guān)的轉(zhuǎn)基因的結(jié)果。當(dāng)驗(yàn)定T2植物時(shí)，所述結(jié)果是可重現(xiàn)的，由此在3個(gè)獨(dú)立轉(zhuǎn)化中在限制氮的條件下增加的鮮重是明顯的。對(duì)于FUE_39和FUE_52獲得了類似的結(jié)果。如下表36中所示，3個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因事件有助于在限制氮的條件下小植物生物量的增加。所述結(jié)果表明，F(xiàn)UE_39和FUE_502的表達(dá)也誘導(dǎo)了氮使用效率中的顯著改善。
表36從在0.05mM結(jié)合氮濃度(NH4NO3和KNO3)下生長(zhǎng)30天的～25個(gè)小植物中測(cè)量的鮮重的最小二乘平均值 (使用Student′s t檢驗(yàn)進(jìn)行分析的結(jié)果) 不由相同字母連接的水平是顯著不同的 當(dāng)在0.2mM組結(jié)合氮濃度下檢查相同事件時(shí)獲得相似的結(jié)果。當(dāng)與對(duì)照植物相比較時(shí)，用TT105::NUE_39轉(zhuǎn)化的4個(gè)事件產(chǎn)生統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著更高的生物量。如表37中所示，在用TT105::NUE_52轉(zhuǎn)化的3個(gè)事件和用TT105::NUE_504轉(zhuǎn)化的2個(gè)事件中獲得了相似的結(jié)果。
表37從在0.2mM結(jié)合氮濃度(NH4NO3和KNO3)下生長(zhǎng)30天的～25個(gè)小植物中測(cè)量的鮮重的最小二乘平均值 (使用Student′s t檢驗(yàn)進(jìn)行分析的結(jié)果) 不由相同字母連接的水平是顯著不同的 如下表38中所示，在使用在組成型的普遍存在的啟動(dòng)子(35S)下過表達(dá)FUE_8、FUE_14或FUE_40的轉(zhuǎn)基因植物的T1種子進(jìn)行的測(cè)定法之中也獲得陽性結(jié)果。
表38從在0.05和0.2mM結(jié)合氮濃度(NH4NO3和KNO3)下生長(zhǎng)27天的～25個(gè)小植物中測(cè)量的鮮重的最小二乘平均值 (使用Student′s t檢驗(yàn)MANOVA進(jìn)行分析的結(jié)果) 不由相同字母連接的水平是顯著不同的 對(duì)于表達(dá)FUE基因的其他構(gòu)建體的不同事件獲得了相似的結(jié)果。如下表39中所示，使用這種測(cè)定法檢查了具有在35S啟動(dòng)子下的FUE_39基因的另外構(gòu)建體。此外，如下表39中所示，過表達(dá)FUE_49基因的2個(gè)獨(dú)立轉(zhuǎn)化事件和用FUE_4、FUE_3或FUE_43轉(zhuǎn)化的另外事件顯示出在所測(cè)試的2種氮限制條件下產(chǎn)生明顯更高的生物量。
表38從在0.05和0.2mM結(jié)合氮濃度(NH4NO3和KNO3)下生長(zhǎng)27天的～25個(gè)小植物中測(cè)量的鮮重的最小二乘平均值 (使用Student′s t檢驗(yàn)MANOVA進(jìn)行分析的結(jié)果) 不由相同字母連接的水平是顯著不同的 考慮到使用這種測(cè)定法而獲得的結(jié)果，幾種FUE基因已顯示出它們誘導(dǎo)氮使用效率的顯著改善的能力。顯示出顯著結(jié)果的基因是FUE_504、FUE_39、FUE_52、FUE_502，以及下述基因的組FUE_14、FUE_8、FUE_40和FUE_49、FUE_3、FUE_4和FUE_43。
測(cè)定法2氮使用效率全植物測(cè)定法在受限制的氮濃度下的生長(zhǎng)速率——開發(fā)了被設(shè)計(jì)用于鑒定改善的氮使用效率的另外測(cè)定法。這種測(cè)定法跟蹤在溫室中在受限制的氮可用性下生長(zhǎng)的植物的蓮座型葉叢區(qū)域生長(zhǎng)。播種經(jīng)表面滅菌的種子，并使植物于25℃以23小時(shí)光-1小時(shí)暗的日循環(huán)下在存在有2％蔗糖的0.5 x Murashige-Skoog培養(yǎng)基中生長(zhǎng)7-10天。然后，將相似大小的幼苗小心地轉(zhuǎn)移至裝滿惰性生長(zhǎng)培養(yǎng)基支持物(精細(xì)的珍珠巖混合物)的100ml罐。使幼苗進(jìn)一步發(fā)育一周，其間用包含豐富供應(yīng)的微量和常量營(yíng)養(yǎng)物的溶液進(jìn)行灌溉。用至少2體積的低硝酸鹽自來水從罐中洗去過量的肥料。然后，逐個(gè)檢查植物，并且只選擇健康的植物用于生長(zhǎng)速率分析。將選擇的植物隨機(jī)分布在幾個(gè)托盤中，并用于關(guān)于在氮限制條件下的生長(zhǎng)率分析的測(cè)定法。通過用包含0.5mM無機(jī)氮(結(jié)合的KNO3和NH4NO3濃度)并補(bǔ)充有2mM CaCl2、1.25mM KH2PO4、1.50mM MgSO4、5mM KCl、0.01mM H3BO3和微量元素的溶液灌溉植物來達(dá)到恒定氮限制條件。為了跟蹤植物生長(zhǎng)，在氮限制條件開始當(dāng)天和隨后每2-3天給托盤拍照，進(jìn)行另外的～20天。然后，使用圖6中描述的方法從數(shù)碼照片中測(cè)定蓮座型葉叢植物面積。ImageJ軟件用于從數(shù)碼照片中定量植物大小(http://rsb.info.nih.gov/ij/)，其中使用被設(shè)計(jì)用于分析作為時(shí)間的函數(shù)的來自獨(dú)個(gè)植物的蓮座型葉叢區(qū)域大小的專有腳本。將生長(zhǎng)百分比計(jì)算為植物蓮座型葉叢面積除以在第1天時(shí)測(cè)量的起始植物面積之比。為了在該實(shí)驗(yàn)內(nèi)鑒定轉(zhuǎn)基因植物，使用PCR來檢查選擇標(biāo)記基因的存在。從植物獲取葉樣品，提取基因組DNA并作為用于PCR的模板，所述PCR使用對(duì)于所述選擇標(biāo)記基因來說特異的引物。給陽性植物加上標(biāo)簽，以便從該分析中排除非轉(zhuǎn)基因植物。
表40用于PCR分析的引物 結(jié)果 與在其中FUE_39顯示出改善的NUE的先前測(cè)定法之中獲得的結(jié)果相一致，此處呈現(xiàn)的結(jié)果顯示出，F(xiàn)UE_39顯著改善全植物中的NUE。如下表41中所示，發(fā)現(xiàn)當(dāng)與野生型植物或在用于表達(dá)FUE_39轉(zhuǎn)基因的相同啟動(dòng)子下表達(dá)GUS報(bào)道基因的轉(zhuǎn)基因植物相比較時(shí)，表達(dá)FUE_39的2個(gè)獨(dú)立轉(zhuǎn)基因事件顯示出增強(qiáng)的NUE。
表41FUE_39顯示出在限制氮的條件下的生長(zhǎng)速率測(cè)定法的結(jié)果。顯示了顯示出增強(qiáng)的NUE的2個(gè)事件。
不由相同字母連接的水平是顯著不同的 除了FUE_39外，還發(fā)現(xiàn)過表達(dá)FUE_7和FUE_41的事件在限制氮的條件下顯示出增加的生長(zhǎng)速率。如表42中所示，在35S啟動(dòng)子下的FUB_7、FUE_41、FUE_50、FUE_16表達(dá)明顯比對(duì)照植物(野生型或在35S啟動(dòng)子下表達(dá)報(bào)道基因)更好。
表42 不由相同字母連接的水平是顯著不同的 因此，本文描述的測(cè)定法跟蹤植物在限制氮的條件下生長(zhǎng)的能力。因?yàn)樯鲜鲛D(zhuǎn)基因植物明顯比對(duì)照植物發(fā)育得更快，所以可以假定突出的事件能夠使可用的氮同化并將其轉(zhuǎn)變成有機(jī)物質(zhì)。因?yàn)轭愃频靥幚碓谠搶?shí)驗(yàn)中的所有植物，所以該結(jié)果表明，突出的事件能夠更有效地利用可用的氮并因此顯示出增強(qiáng)的氮使用效率。
測(cè)定法3處于受限制的氮可用性情況下的種子產(chǎn)量測(cè)定法——玉米植物吸收并將大多數(shù)氮貯存在葉和桿中直至開花。貯存的營(yíng)養(yǎng)物隨后重新分布至正在發(fā)育中的谷粒之中。在本測(cè)定法中，植物在如上文測(cè)定法2中所述的受限制的氮條件下生長(zhǎng)約45天，隨后只使用自來水來進(jìn)行生長(zhǎng)直至完全成熟。因此，植物被迫將貯存的氮重新分布至正在發(fā)育中的種子。預(yù)期貯存更多的氮的植物具有更佳的產(chǎn)量。從獨(dú)個(gè)植物收集種子，并且將產(chǎn)量測(cè)量為種子重量。對(duì)于每個(gè)受試事件通常測(cè)量至少大約6個(gè)轉(zhuǎn)基因植物的產(chǎn)量。
結(jié)果 在這種測(cè)定法中，如表43中所示，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)FUE_43(在35S啟動(dòng)子下)的轉(zhuǎn)基因植物具有增加的種子產(chǎn)量。事件之一的結(jié)果在下面呈現(xiàn)。
表43 不由相同字母連接的水平是顯著不同的 如通過本文公開的不同測(cè)定法的結(jié)果所證實(shí)的，本文顯示的結(jié)果作為整體來看證實(shí)了，來自本發(fā)明的基因能夠改善氮使用效率的不同方面。
實(shí)施例7 評(píng)估在非生物脅迫條件下的轉(zhuǎn)基因植物生長(zhǎng) 對(duì)鹽度或滲透脅迫的耐受性旨在鑒定在高鹽、干旱或其組合或其他環(huán)境脅迫下賦予更好的發(fā)芽、幼苗活力或生長(zhǎng)的基因。在不同發(fā)育階段時(shí)，植物在其對(duì)鹽脅迫、高滲壓劑和干旱的耐受性方面不同。因此，在不同脅迫條件下獨(dú)立地評(píng)估種子發(fā)芽、植物發(fā)育和產(chǎn)量。
獲取處于不同發(fā)育階段的植物并用濃度漸增的NaCl(例如50mM、100mM、200mM、400mM)或濃度恒定的NaCl來灌溉它們，由此產(chǎn)生典型的鹽度耐受性測(cè)試。隨后在抑制對(duì)照植物的濃度下，在其外部表型表現(xiàn)、萎蔫程度以及達(dá)到成熟和產(chǎn)生后代的總體成功方面，將轉(zhuǎn)基因植物與對(duì)照植物進(jìn)行比較。所測(cè)量的耐受性的定量參數(shù)包括平均濕重和干重、以及產(chǎn)生的種子重量、平均種子大小和產(chǎn)生的種子數(shù)目/植物。進(jìn)行滲透脅迫測(cè)定法(包括NaCl和甘露醇測(cè)定法)，以確定滲透脅迫耐受表型是否是NaCl特異性的，或者它是否是一般的滲透脅迫相關(guān)表型。進(jìn)行干旱測(cè)定法，例如在長(zhǎng)時(shí)間段期間停止灌溉并測(cè)量萎蔫率、恢復(fù)和最終產(chǎn)量。一般而言，對(duì)滲透脅迫耐受的植物更耐受干旱、鹽度和冰凍條件，并因此就農(nóng)藝學(xué)性狀而言是高度有價(jià)值的。
材料和方法 用于就改善的非生物脅迫耐受性來測(cè)試植物的方法包括在不利條件(例如高鹽度和高滲壓劑)下測(cè)試發(fā)芽和幼苗生長(zhǎng)。
在非生物脅迫下的發(fā)芽測(cè)定法——發(fā)芽測(cè)試比較了來自轉(zhuǎn)基因植物的、可以完成發(fā)芽過程(從種皮中的胚根伸出和子葉的完全打開)的種子百分比和來自以相同方式處理的對(duì)照植物的種子百分比。在種植后持續(xù)3周進(jìn)行發(fā)芽和幼苗活力的評(píng)估。為了測(cè)量發(fā)芽和幼苗生長(zhǎng)，將來自T2植物的種子進(jìn)行表面滅菌并逐個(gè)播種在方形瓊脂平板上，所述瓊脂平板包含例如補(bǔ)充有高鹽度(150mM NaCl)或高滲壓劑(210mM甘露醇)的固化基礎(chǔ)培養(yǎng)基(補(bǔ)充有0.8％植物瓊脂的50％Murashige-Skoog培養(yǎng)基(MS)+維生素)。在播種后，將平板轉(zhuǎn)移至4℃ 2-3天以用于分層(stratification)，并隨后生長(zhǎng)3周。
為了跟蹤不利條件下的發(fā)芽和生長(zhǎng)，人工或自動(dòng)篩選植物并測(cè)定植物大小。從每種構(gòu)建體分析選自實(shí)施例5的各種獨(dú)立轉(zhuǎn)化事件。將表達(dá)來自本發(fā)明的基因的植物與在相同條件下在相同平板上播種的對(duì)照植物(野生型或用模擬物轉(zhuǎn)化的植物)進(jìn)行比較。
在非生物脅迫下的幼苗生長(zhǎng)——用幼苗進(jìn)行的補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)跟蹤植物對(duì)不利條件的耐受性。在卡那霉素存在(對(duì)于轉(zhuǎn)基因植物)或不存在(對(duì)于野生型對(duì)照植物)下，將經(jīng)表面滅菌的種子播種在基礎(chǔ)培養(yǎng)基[補(bǔ)充有0.8％植物瓊脂作為固化劑的50％ Murashige-Skoog培養(yǎng)基(MS)+維生素]中。在播種后，將平板轉(zhuǎn)移至4℃ 2-3天以用于分層，并隨后于25℃以23小時(shí)光-1小時(shí)暗的日循環(huán)生長(zhǎng)7-10天。在這個(gè)時(shí)間點(diǎn)時(shí)，將隨機(jī)選擇的幼苗小心地轉(zhuǎn)移至包含高鹽度條件(150mMNaCl)或類似于在干旱期間發(fā)現(xiàn)的高滲透性的條件(210mM甘露醇)的平板。使用數(shù)字成像，作為時(shí)間的函數(shù)來跟蹤植物生長(zhǎng)。為了跟蹤在不利條件下的植物生長(zhǎng)，在它們轉(zhuǎn)移至脅迫條件的當(dāng)天(第1天)給植物拍照。隨后在將植物轉(zhuǎn)移至脅迫條件后每數(shù)日獲取照片，并且直到轉(zhuǎn)移后12天。然后，根據(jù)數(shù)碼照片測(cè)定蓮座型葉叢植物面積。ImageJ軟件用于從數(shù)碼照片中定量植物大小(http://rsb.info.nih.gov/ij/)。設(shè)計(jì)專有腳本以分析作為時(shí)間的函數(shù)的獨(dú)個(gè)植物蓮座型葉叢區(qū)域的大小。圖6顯示了用于圖像面積定量的方法。在每個(gè)脅迫實(shí)驗(yàn)中，從每個(gè)構(gòu)建體分析5-10個(gè)獨(dú)立轉(zhuǎn)化事件，并且分析來自每個(gè)事件的至少6個(gè)隨機(jī)選擇的植物。使表達(dá)來自本發(fā)明的基因的植物與在相同的脅迫誘導(dǎo)平板上播種的對(duì)照植物(內(nèi)部對(duì)照)或與在相同實(shí)驗(yàn)中使用的所有對(duì)照植物的平均測(cè)量值(所有對(duì)照)進(jìn)行比較。
結(jié)果 通過跟蹤在脅迫期間的植物生長(zhǎng)測(cè)定了鹽度和滲壓劑耐受性，如由植物綠色面積所證明的。使用上述程序來檢查幾種基因和構(gòu)建體，并發(fā)現(xiàn)顯著的耐受性結(jié)果。例如，過表達(dá)下述基因的轉(zhuǎn)基因植物顯示出對(duì)高鹽度脅迫的統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著改善的耐受性FUE_7、FUE_10、FUE_14、FUE_16、FUE_33、FUE_37、FUE_39、FUE_40、FUE_41、FUE_47、FUE_50、FUE_502、FUE_503和FUE_504。
此外，下述基因在當(dāng)暴露于高滲透性脅迫時(shí)將非生物脅迫耐受性賦予過表達(dá)其的轉(zhuǎn)基因植物方面提供了統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的結(jié)果FUE_3、FUE_9、FUE_10、FUE_13、FUE_37、FUE_39、FUE_40、FUE_41、FUE_43、FUE_49、FUE_502、FUE_503和FUE_504。
此外，發(fā)現(xiàn)表達(dá)FUE_43和FUE_503的轉(zhuǎn)基因植物在高滲壓劑條件下具有增加的發(fā)芽能力(數(shù)據(jù)未顯示)。
另外，表達(dá)下述基因的轉(zhuǎn)基因植物顯示出顯著增加的對(duì)鹽度或高滲透性的非生物脅迫耐受性FUE_10、FUE_37、FUE_39、FUE_40、FUE_41、FUE_502和FUE_504。
應(yīng)當(dāng)指出，一般地，表達(dá)上述基因并且在某些情況下還在不同啟動(dòng)子下的幾個(gè)轉(zhuǎn)基因事件支持了所述結(jié)果的重要性。表44a-b概述了這些發(fā)現(xiàn)。結(jié)果表示為相對(duì)于當(dāng)轉(zhuǎn)移至脅迫條件(即，第1天)時(shí)的植物大小的生長(zhǎng)面積百分比。
表44a-在鹽度脅迫下顯示出改善的幼苗生長(zhǎng)的基因列表


表44b-在滲壓劑脅迫下顯示出改善的幼苗生長(zhǎng)的基因列表


實(shí)施例8 評(píng)估在轉(zhuǎn)基因植物中根構(gòu)造的改變 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)中的許多關(guān)鍵性狀可以通過根構(gòu)造方面的改變來加以解釋。根的大小和深度與干旱耐受性和肥料使用效率相關(guān)。較深的根系可以接近貯存于較深土層中的水。類似地，高度分枝的根系提供了更好的土壤覆蓋度，并因此可以有效地吸收可用的所有常量和微量營(yíng)養(yǎng)物，產(chǎn)生增強(qiáng)的肥料使用效率。為了測(cè)試轉(zhuǎn)基因植物是否產(chǎn)生不同的根結(jié)構(gòu)，使植物生長(zhǎng)在垂直放置的瓊脂平板中。每數(shù)日給平板拍照并且根據(jù)數(shù)碼照片評(píng)估被植物根覆蓋的最大深度和總面積。從制備的每種構(gòu)建體，重復(fù)檢查幾個(gè)獨(dú)立轉(zhuǎn)化事件。為了評(píng)估根特征之間的顯著差異，采用使用Student′s t檢驗(yàn)的單ANOVA，以便鑒定顯示出突出的根特征的事件并為所述發(fā)現(xiàn)提供統(tǒng)計(jì)學(xué)得分(統(tǒng)計(jì)學(xué)測(cè)定法如上所述)。
結(jié)果 當(dāng)分析根構(gòu)造的不同方面，例如覆蓋的根總面積和由根系達(dá)到的最大深度(長(zhǎng)度)時(shí)，發(fā)現(xiàn)表達(dá)FUE基因的轉(zhuǎn)基因植物具有顯著的特征。例如，基于在發(fā)芽后21天進(jìn)行的測(cè)量，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)FUE_10和FUE_49的轉(zhuǎn)基因植物具有更高的根區(qū)域覆蓋率(參見表45)。
表45在第21天時(shí)測(cè)量的根面積(cm2) 不由相同字母連接的水平是顯著不同的 類似地，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)原始FUE_16和FUE_7的植物產(chǎn)生最長(zhǎng)的根構(gòu)造(參見下表46)。發(fā)現(xiàn)FUE_16在測(cè)試的所有天(發(fā)芽后7、14和21天)時(shí)，從測(cè)試的所有構(gòu)建體中產(chǎn)生最快的穿透性根系。
在實(shí)踐中，這些發(fā)現(xiàn)暗示，在相同時(shí)間段內(nèi)，與其他植物相比較，過表達(dá)FUE_16和FUE_7_Original的植物達(dá)到更深的土層。預(yù)期這些植物最大限度地從土壤中獲取肥料和水并更好地經(jīng)得住更長(zhǎng)時(shí)期的干旱。
表46在第21天時(shí)測(cè)量的根長(zhǎng)度(cm)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 不由相同字母連接的水平是顯著不同的 增強(qiáng)的根構(gòu)造使得表達(dá)FUE基因的轉(zhuǎn)基因植物能夠更成功地吸收土壤中可用的營(yíng)養(yǎng)物(肥料)和水。增加的攝取和營(yíng)養(yǎng)物回收對(duì)于改善的肥料使用效率和非生物脅迫耐受性來說是關(guān)鍵特征。較深的根系使得植物接近較深土層中可用的水，增強(qiáng)了對(duì)延長(zhǎng)的干旱期的耐受性并因此在嚴(yán)苛條件下也確保高產(chǎn)量。
實(shí)施例9 表達(dá)FUE_40的植物的特征在于用于最大種子生產(chǎn)的植物構(gòu)造 多種產(chǎn)生種子的器官(莢果、水果等)和強(qiáng)壯的花莖的存在是產(chǎn)生高種子產(chǎn)量的關(guān)鍵特征。在使本發(fā)明變?yōu)閷?shí)際的同時(shí)，本發(fā)明人驚訝地發(fā)現(xiàn)，在組成型啟動(dòng)子下表達(dá)FUE_40的轉(zhuǎn)基因植物具有改善的生殖器官構(gòu)造?；ㄇo是異常堅(jiān)硬和強(qiáng)壯的，并且攜帶大量長(zhǎng)角果(參見圖9，顯示了不同的獨(dú)立轉(zhuǎn)化事件)。結(jié)果通過三盲測(cè)定法來證實(shí)，所述測(cè)定法鑒定出每株植物具有更多長(zhǎng)角果的植物，這可能是由于側(cè)生花序枝條的更快速生長(zhǎng)。有趣的是，所有植物是具有相同構(gòu)建體(在35S啟動(dòng)子下的NUE40)的不同轉(zhuǎn)化事件(參見圖9)。植物發(fā)育特征的這個(gè)變化可以用于顯著增加植物的種子產(chǎn)量。
實(shí)施例10 CT-9(SEQ ID NO1340、1341)和CT-71(SEQ ID NO1342、1343)賦予轉(zhuǎn)基因番茄以干旱耐受性和增加的產(chǎn)量 在進(jìn)一步使本發(fā)明變?yōu)閷?shí)際的同時(shí)，本發(fā)明人令人驚訝地揭示出，CT_9(SEQ ID NO.1340、1341，先前公開于PCT申請(qǐng)?zhí)朩O2005/121364中)和CT_71(SEQ ID NO.1342和1343，先前公開于PCT申請(qǐng)?zhí)朩O2005/121364中)在表達(dá)其的轉(zhuǎn)基因植物中賦予干旱耐受性和增加的產(chǎn)量。CT_9和CT_71公開在Evogene Ltd.的PCR申請(qǐng)?zhí)朩O2005/121364中和在US5,597,718(CT_71)中。
材料和實(shí)驗(yàn)操作程序 干旱測(cè)定法——本文描述的干旱測(cè)定法通過控制供水量和干旱間隔在模擬干旱脅迫的田間條件中實(shí)現(xiàn)。該測(cè)定法，單來源滴灌系統(tǒng)(onesource dripping irrigation system，OSDI)，類似于農(nóng)田，因?yàn)樗韵鄬?duì)統(tǒng)一的方式產(chǎn)生水分缺乏并使得能夠測(cè)量干旱對(duì)于小規(guī)模植物群體的影響。
因此，本灌溉方法可以如下實(shí)現(xiàn) (a)在土壤上或土壤中放置滴灌系統(tǒng)，以獲得在X和Y方向上彼此相隔20-40cm(例如，30cm)分布的灌溉孔；和 (b)以0.5-2升水/小時(shí)的灌溉速率通過每個(gè)所述灌溉孔進(jìn)行連續(xù)灌溉。
用于模擬干旱條件的灌溉系統(tǒng)的一種布置(10)可以依照本發(fā)明的教導(dǎo)來使用，所述灌溉系統(tǒng)的布置包含下述組分并在圖10中圖解說明 (i)具有在X和Y方向上彼此相隔20-40cm分布的多個(gè)灌溉孔(12)的滴灌系統(tǒng)；和 (ii)用于以0.5-2升水/小時(shí)通過每個(gè)所述灌溉孔進(jìn)行連續(xù)灌溉的水供應(yīng)和控制系統(tǒng)(14)。
所使用的優(yōu)選滴頭是具有抗虹吸和抗排干系統(tǒng)的壓力補(bǔ)償?shù)暮癖诘晤^線(來自Netafim Israel的UniRamTM CNL #16010，流速1.6l/小時(shí))?？购缥到y(tǒng)防止泥土回流到滴頭線內(nèi)，而抗排水(CNL)系統(tǒng)消除排水和再充填效應(yīng)，并改善脈沖式灌溉的效率。
OSDI法基于線來源噴灑灌溉系統(tǒng)(Hanks等人，1976 Soil Sci.SocAm.J.40，第426-429頁(yè))而開發(fā)出來，進(jìn)行了明顯的改動(dòng)。不用噴灑灌溉，而使用滴灌。為了產(chǎn)生均勻和深的濕潤(rùn)層(至少60cm深度)而不是通常由滴灌而產(chǎn)生的洋蔥形狀的層，使用允許在相對(duì)長(zhǎng)的時(shí)間段中提供少量水的低壓補(bǔ)償?shù)喂嘞到y(tǒng)。
在靠近Rehovot，Israel的開放田間網(wǎng)室(nethouse)中，在2006年夏季(從7月到9月)期間，在輕質(zhì)土壤中進(jìn)行該實(shí)驗(yàn)。
土壤的水容量通過從下述3個(gè)深度抽取土壤樣品并使用標(biāo)準(zhǔn)操作程序來進(jìn)行測(cè)量0-20cm、20-40cm和40-60cm。每周定期測(cè)量這些土層中的含水量。該土壤包含5％濕存水，而該土壤的最大水容量為20％。在播種之前將所有肥料施加到土壤內(nèi)。計(jì)算所有季節(jié)足夠的磷和鉀的量。通過灌溉系統(tǒng)，如所推薦的并對(duì)所有處理相等地來施加氮。
每行寬193cm，包含3條滴灌線，產(chǎn)生9個(gè)滴頭/1平方米的覆蓋率。對(duì)每種處理分開進(jìn)行水控制。在實(shí)驗(yàn)開始前使土壤完全干燥。
播種在苗圃條件下在規(guī)則的水灌溉下進(jìn)行。在進(jìn)入濕潤(rùn)土壤內(nèi)4周后移植幼苗。在移植前用于均勻地灌溉的水量在60cm深度處達(dá)到最大水容量(20％w/w)，然而不產(chǎn)生水超負(fù)荷。根據(jù)商業(yè)生長(zhǎng)方案將每株植物靠近滴頭移植，植物之間距離30cm，而總密度為2600株植物/1000平方米。該實(shí)驗(yàn)在包含用不同水分水平和間隔灌溉的3行(WLI-0、WLI-1、WLI-2)的4個(gè)地塊中組織。不同的水方案在移植后4周當(dāng)植物達(dá)到開花階段時(shí)才開始。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)生長(zhǎng)方案的建議，在每周開始時(shí)計(jì)算在測(cè)定法期間每周供應(yīng)的水量。
WLI-0處理接受推薦的總每周灌溉體積，但分成3次灌溉。另外2種其他處理(WLI-1和WLI-2)表示2種不同水平的水分缺乏。WLI-1也是一周灌溉3次，但供應(yīng)的水量是給WLI-0供應(yīng)的灌溉的一半。在每周結(jié)束時(shí)，WLI-1植物獲得達(dá)到最大土壤水容量所需的水量。WLI-2不是在一周期間而是在每周開始時(shí)進(jìn)行灌溉。供應(yīng)水以達(dá)到最大水容量。水分脅迫實(shí)驗(yàn)在整個(gè)開花期(23天)期間持續(xù)，相應(yīng)于4個(gè)循環(huán)的上述的脅迫。其后，所有處理獲得推薦的水量。
水量的計(jì)算等于干燥土壤和具有最大水容量的土壤中的含水量之間的差異。在每個(gè)脅迫循環(huán)結(jié)束時(shí)，根據(jù)土壤中的實(shí)際含水量來比較處理之間的水量(表47) 表47在第4個(gè)脅迫循環(huán)結(jié)束(23天)時(shí)土壤中的含水量(％)
值得注意的是，在脅迫期間，與對(duì)照(WLI-0)相比較，處理WLI-1和WLI-2獲得總共少75％的水。
基因克隆和表達(dá)——CT-9和CT-71的生物信息學(xué)鑒定、克隆和表型評(píng)估在專利號(hào)WO2005/121364中得到描述。
經(jīng)由根瘤土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)轉(zhuǎn)化，將與包含35S啟動(dòng)子的雙元構(gòu)建體連接的CT-9或CT-71轉(zhuǎn)化到番茄植物中。
60μL根瘤土壤桿菌LB4404感受態(tài)細(xì)胞(約109細(xì)胞/ml)用20ng雙元質(zhì)粒經(jīng)由電穿孔進(jìn)行轉(zhuǎn)化，使用MicroPulser電穿孔儀(Biorad)、0.2cm杯池(cuvette)(Biorad)和EC-2電穿孔程序(Biorad)。
土壤桿菌細(xì)胞在0.8mL LB液體培養(yǎng)基上于28℃生長(zhǎng)3小時(shí)，并將0.2mL細(xì)胞懸浮液鋪板在LB-瓊脂平板上，所述LB-瓊脂平板補(bǔ)充有抗生素鏈霉素300mg/L(對(duì)于土壤桿菌菌株LB4404)和卡那霉素50mg/L(Sigma)。隨后，平板于28℃溫育48小時(shí)。使土壤桿菌菌落進(jìn)行生長(zhǎng)，并對(duì)土壤桿菌細(xì)胞進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使用被設(shè)計(jì)成跨越雙元載體中的插入序列的引物。
PCR產(chǎn)物在1.5％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行分離，并且通過與DNA梯帶(MBI Fermentas)相比較來確定產(chǎn)物大小。使用用于PCR擴(kuò)增的引物來對(duì)具有預(yù)期大小的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。進(jìn)行插入序列的測(cè)序，以驗(yàn)證將正確克隆引入了土壤桿菌細(xì)胞中。
使用ABI 377測(cè)序儀(Amersham Biosciences Inc.)來進(jìn)行DNA測(cè)序。
用CT_9或CT-71轉(zhuǎn)化Micro-Tom番茄植物——番茄(西紅柿)(Lycopersicon esculentum，var MicroTom)的轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)基因植物的培養(yǎng)根據(jù)Curtis等人，1995 Methods Mol Biol.1995；4459-70，和Meissner等人，2000.Plant J.2000May；22(3)265-74來進(jìn)行。在轉(zhuǎn)化后，T1 MicroTom番茄植物在包含于1000ml罐中的混合物之中生長(zhǎng)，直至座果和T2種子收獲。將在35S啟動(dòng)子調(diào)節(jié)下過表達(dá)CT-9或CT-71基因的轉(zhuǎn)基因micro-tom番茄植物與M82商業(yè)品種植物進(jìn)行異花授粉。隨機(jī)獲取源于代表了位置效應(yīng)的4個(gè)不同插入事件的4株植物。包含轉(zhuǎn)基因的F1雜種用于進(jìn)一步評(píng)估。從相同轉(zhuǎn)基因群體中分離的非轉(zhuǎn)基因植物用作陰性對(duì)照。為了區(qū)分轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因植物，使用NPTII基因的引物來進(jìn)行PCR篩選，如實(shí)施例6中所述的。
結(jié)果 在約90％紅色果實(shí)的果實(shí)成熟階段時(shí)，評(píng)估植物并收獲果實(shí)。通過測(cè)量株冠的質(zhì)量、根長(zhǎng)度和質(zhì)量來評(píng)估植物性能。對(duì)于每個(gè)植物，通過獲取綠色和紅色全尺寸的(full size)果實(shí)來測(cè)量產(chǎn)量。結(jié)果使用單側(cè)Anova檢驗(yàn)進(jìn)行分析并概括于下表48中。
表48與對(duì)照植物相比較，表達(dá)CT-9基因的在嚴(yán)重水分脅迫(WLI-2)下生長(zhǎng)的植物品系的果實(shí)總產(chǎn)量 a，b，c-不由相同字母連接的水平是統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著不同的(P<0.05) 與對(duì)照植物相比較，過表達(dá)CT-9的轉(zhuǎn)基因品系在嚴(yán)重水分缺乏條件(WLI-2)下顯示出顯著更高的果實(shí)產(chǎn)量。
對(duì)于表達(dá)CT-9和CT-71的品系，在規(guī)則的水灌溉下還觀察到產(chǎn)量的改善(參見下表49)。
表49與在有利的水灌溉(WLI-0)下生長(zhǎng)的對(duì)照植物相比較，過表達(dá)CT-9的品系的果實(shí)總產(chǎn)量 a，b，c-不由相同字母連接的水平是統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著不同的(P<0.05) 實(shí)施例11 過表達(dá)FUE_34_Evo的植物的特征在于增強(qiáng)的側(cè)出分枝 側(cè)芽活化的控制在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)以及花卉和觀賞植物的培育中可以具有重要的作用。在現(xiàn)代玉米育種的情況下，多年來育種者致力于減少分蘗(側(cè)枝)的工作，以便產(chǎn)生同時(shí)達(dá)到成熟的單外皮(husk)植物。另一方面，稻育種中的分蘗控制同樣也具有重要性，因?yàn)槎嘀胤痔Y將允許在同一個(gè)植物上產(chǎn)生幾個(gè)圓錐花序，而過度分蘗對(duì)植物具有有害影響。類似地，側(cè)出分枝對(duì)于觀賞植物是重要的，例如以從同一個(gè)莖產(chǎn)生多個(gè)花朵，或從每個(gè)莖上產(chǎn)生單朵大花。
如圖8中所示，表達(dá)外源FUE_34_Evo的植物的特征在于枝條的多重分枝。FUE_34 Evo(SEQ ID NO54)在組成型的普遍存在的啟動(dòng)子下的表達(dá)引起異?；钴S的側(cè)出分枝表型。用這些構(gòu)建體獲得的所有轉(zhuǎn)基因事件在每個(gè)結(jié)節(jié)處顯示出這種特別的分枝表型。這種表型可以是植物頂端優(yōu)勢(shì)喪失的結(jié)果，或者更可能是由于FUE_34_Evo在普遍存在的組成型啟動(dòng)子下的連續(xù)表達(dá)。Evo_34是MADS盒轉(zhuǎn)錄因子，其另外還包含對(duì)于cAMP-和cGMP-依賴性蛋白激酶、酪蛋白激酶II和蛋白激酶C的推定的磷酸化位點(diǎn)。在根偏愛啟動(dòng)子(例如RootP)下的表達(dá)引起緊密的高度分枝的根表型的產(chǎn)生。因此，F(xiàn)UE_34_Evo可以用于例如改造出具有受控的分枝的植物，這通過添加在植物的某些解剖學(xué)部分處和/或在某一發(fā)展階段時(shí)具有活性的組成型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子來實(shí)現(xiàn)。類似地，該基因可以被沉默并且以此方式非?？赡鼙苊夥痔Y或側(cè)出分枝。該基因的另一個(gè)潛在用途是用于MSA(標(biāo)記輔助育種)。
實(shí)施例12 同源和直向同源序列 表50列出了本發(fā)明的多核苷酸序列和多肽序列的直向同源和同源序列的概括，所述直向同源和同源序列使用BLAST(TBLASTX程序)鑒定，在至少85％的整個(gè)蛋白質(zhì)長(zhǎng)度上具有至少85％的相似性。
表50 應(yīng)當(dāng)理解，為了清晰起見，在分開的實(shí)施方案情況下描述的本發(fā)明的某些特征也可以在單個(gè)實(shí)施方案中組合提供。相反地，為了簡(jiǎn)潔起見，在單個(gè)實(shí)施方案情況下描述的本發(fā)明的各種特征也可以分開地或以任何合適的亞組合進(jìn)行提供。
盡管已結(jié)合其具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了描述，但顯然許多備選方案、修飾和變化形式對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯而易見的。因此，意欲包括落入所附權(quán)利要求的精神和廣泛范圍內(nèi)的所有此類備選方案、修飾和變化形式。本說明書中提及的所有出版物、專利和專利申請(qǐng)以及GenBank登記號(hào)通過提及而整體并入本說明書中，其程度就好像特別地且獨(dú)個(gè)地指明每個(gè)單個(gè)出版物、專利或?qū)＠暾?qǐng)或者GenBank登記號(hào)通過提及而合并入本文一樣。此外，本申請(qǐng)中任何參考文獻(xiàn)的引用或鑒定不應(yīng)被解釋為承認(rèn)此類參考文獻(xiàn)可作為本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)。
CD-ROM內(nèi)容 下文列出了兩份CD-ROMs的文件內(nèi)容，所述CD-ROMs一并附上且與本申請(qǐng)一起提交。這些文件通過提及而并入本文，并因此構(gòu)成所提交的申請(qǐng)的一部分。文件信息提供為文件名/字節(jié)大小/創(chuàng)建日期/機(jī)器格式/操作系統(tǒng)。
序列表.txt/2,977,792字節(jié)/2006年10月24日/Notepad/PC
權(quán)利要求
1.核酸構(gòu)建體，其包含與選自SEQ ID NO68、68、1、4、5、8、9、11、13、16、19、20、23、24、27、30、32、37、42、49、50、51、53、54、55、56、57、58、64、69、70、73、77、78、79、80、84、86、87、93、94、98、101、102、103、104、105、106、107、108和109的核苷酸序列至少85％同一的核酸序列，和能夠指導(dǎo)所述核酸序列在宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子序列。
2.權(quán)利要求1的核酸構(gòu)建體，其中所述啟動(dòng)子是組成型啟動(dòng)子。
3.權(quán)利要求2的核酸構(gòu)建體，其中所述組成型啟動(dòng)子是CaMV35S啟動(dòng)子。
4.權(quán)利要求1的核酸構(gòu)建體，其中所述啟動(dòng)子是誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。
5.權(quán)利要求4的核酸構(gòu)建體，其中所述誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是非生物脅迫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。
6.權(quán)利要求5的核酸構(gòu)建體，其中所述啟動(dòng)子是組織特異性啟動(dòng)子。
7.權(quán)利要求6的核酸構(gòu)建體，其中所述組織是根組織。
8.權(quán)利要求1的核酸構(gòu)建體，其中所述宿主細(xì)胞是植物細(xì)胞。
9.權(quán)利要求8的核酸構(gòu)建體，其中所述植物細(xì)胞形成雙子葉植物細(xì)胞的部分。
10.權(quán)利要求8的核酸構(gòu)建體，其中所述植物細(xì)胞形成單子葉植物細(xì)胞的部分。
11.權(quán)利要求1的核酸構(gòu)建體，其中所述核酸序列如SEQ ID NO68、68、1、4、5、8、9、11、13、16、19、20、23、24、27、30、32、37、42、49、50、51、53、54、55、56、57、58、64、69、70、73、77、78、79、80、84、86、87、93、94、98、101、102、103、104、105、106、107、108、109、219-767、1317、1318、1319、1320、1321、1322、1323、1324、1325、1326、1327、1328、1329、1330、1331、1332、1333、1334、1335或1336中所示。
12.分離的多肽，其包含與SEQ ID NO177、110、113、114、117、118、120、122、125、128、129、132、133、136、139、141、146、151、158、159、160、162、163、164、165、166、167、173、178、179、182、186、187、188、189、193、195、196、202、203、207、210、211、212、213、214、215、216、217或218中所示氨基酸序列至少85％同源的氨基酸序列。
13.植物細(xì)胞，其包含外源多核苷酸，所述外源多核苷酸包含編碼多肽的核酸序列，所述多肽具有與SEQ ID NO177、110、113、114、117、118、120、122、125、128、129、132、133、136、139、141、146、151、158、159、160、162、163、164、165、166、167、173、178、179、182、186、187、188、189、193、195、196、202、203、207、210、211、212、213、214、215、216、217或218至少85％同源的氨基酸序列。
14.權(quán)利要求13的植物細(xì)胞，其中所述植物細(xì)胞形成植物的部分。
15.權(quán)利要求13或14的分離的多肽或植物細(xì)胞，其中所述氨基酸序列如SEQ ID NO177、110、113、114、117、118、120、122、125、128、129、132、133、136、139、141、146、151、158、159、160、162、163、164、165、166、167、173、178、179、182、186、187、188、189、193、195、196、202、203、207、210、211、212、213、214、215、216、217、218、768-1051、1053-1098、1100-1315或1316中所示。
16.增加植物對(duì)脅迫條件的耐受性的方法，其包括在所述植物中表達(dá)編碼多肽的外源多核苷酸，所述多肽具有與SEQ ID NO177、110、113、114、117、118、120、122、125、128、129、132、133、136、139、141、146、151、158、159、160、162、163、164、165、166、167、173、178、179、182、186、187、188、189、193、195、196、202、203、207、210、211、212、213、214、215、216、217、218、1341或1343至少85％同源的氨基酸序列，從而增加所述植物對(duì)所述脅迫條件的耐受性。
17.增加植物的生物量、活力和/或產(chǎn)量的方法，其包括在所述植物中表達(dá)編碼多肽的外源多核苷酸，所述多肽具有與SEQ ID NO177、110、113、114、117、118、120、122、125、128、129、132、133、136、139、141、146、151、158、159、160、162、163、164、165、166、167、173、178、179、182、186、187、188、189、193、195、196、202、203、207、210、211、212、213、214、215、216、217、218、1341或1343至少85％同源的氨基酸序列，從而增加所述植物的生物量、活力和/或產(chǎn)量。
18.增加植物的肥料使用效率和/或攝取的方法，其包括在所述植物中表達(dá)編碼多肽的外源多核苷酸，所述多肽具有與SEQ ID NO177、110、113、114、117、118、120、122、125、128、129、132、133、136、139、141、146、151、158、159、160、162、163、164、165、166、167、173、178、179、182、186、187、188、189、193、195、196、202、203、207、210、211、212、213、214、215、216、217、218、1341或1343至少85％同源的氨基酸序列，從而增加所述植物的肥料使用效率和/或攝取。
19.權(quán)利要求16、17或18的方法，其中所述表達(dá)通過下述來實(shí)現(xiàn)
(a)用所述外源多核苷酸轉(zhuǎn)化所述植物的細(xì)胞；
(b)從所述細(xì)胞產(chǎn)生成熟植物；和
(c)在適合于在所述成熟植物中表達(dá)所述外源多核苷酸的條件下培養(yǎng)所述成熟植物。
20.權(quán)利要求19的方法，其中所述轉(zhuǎn)化通過將核酸構(gòu)建體引入所述植物細(xì)胞中來實(shí)現(xiàn)，所述核酸構(gòu)建體包含所述外源多核苷酸和至少一種能夠指導(dǎo)所述外源多核苷酸在所述植物細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。
21.權(quán)利要求20的方法，其中所述至少一種啟動(dòng)子是組成型啟動(dòng)子。
22.權(quán)利要求20的方法，其中所述組成型啟動(dòng)子是CaMV35S啟動(dòng)子。
23.權(quán)利要求20的方法，其中所述至少一種啟動(dòng)子是誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。
24.權(quán)利要求23的方法，其中所述誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是非生物脅迫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。
25.權(quán)利要求20的方法，其中所述至少一種啟動(dòng)子是組織特異性啟動(dòng)子。
26.權(quán)利要求16、17或18的方法，其中所述脅迫條件是非生物脅迫。
27.權(quán)利要求26的方法，其中所述非生物脅迫選自鹽度、干旱、低溫、高溫、重金屬毒性、無氧生活、滲壓劑和營(yíng)養(yǎng)物缺乏。
28.權(quán)利要求26的方法，其中所述營(yíng)養(yǎng)物是氮。
29.權(quán)利要求16、17或18的方法，其中所述植物是雙子葉植物。
30.權(quán)利要求16、17或18的方法，其中所述植物是單子葉植物。
31.權(quán)利要求16、17或18的方法，其中所述多核苷酸包含選自SEQ ID NO68、1、4、5、8、9、11、13、16、19、20、23、24、27、30、32、37、42、49、50、51、53、54、55、56、57、58、64、69、70、73、77、78、79、80、84、86、87、93、94、98、101、102、103、104、105、106、107、108、109、219-767、1317、1318、1319、1320、1321、1322、1323、1324、1325、1326、1327、1328、1329、1330、1331、1332、1333、1334、1335、1336、1340或1342的核酸序列。
32.權(quán)利要求16、17或18的方法，其中所述氨基酸序列如SEQ IDNO177、110、113、114、117、118、120、122、125、128、129、132、133、136、139、141、146、151、158、159、160、162、163、164、165、166、167、173、178、179、182、186、187、188、189、193、195、196、202、203、207、210、211、212、213、214、215、216、217、218、768-1051、1053-1098、1100-1316、1341或1343中所示。
33.權(quán)利要求19的方法，其中所述條件是非生物脅迫條件。
34.權(quán)利要求19的方法，其中所述條件是肥料缺乏條件。
35.用于灌溉的方法，其包括
(a)在土壤上或土壤中放置滴灌系統(tǒng)，以獲得在X和Y方向上彼此相隔20-40cm分布的灌溉孔；和
(b)以0.5-2升水/小時(shí)的灌溉速率通過每個(gè)所述灌溉孔進(jìn)行連續(xù)灌溉。
36.用于模擬干旱條件的灌溉系統(tǒng)，其包含
(i)具有在X和Y方向上彼此相隔20-40cm分布的灌溉孔的滴灌系統(tǒng)；和
(ii)用于以0.5-2升水/小時(shí)通過每個(gè)所述灌溉孔進(jìn)行連續(xù)灌溉的水供應(yīng)和控制系統(tǒng)。
全文摘要
提供了核酸構(gòu)建體。這些構(gòu)建體包含與選自SEQ ID No68、1、4、5、8、9、11、13、16、19、20、23、24、27、30、32、37、42、49、50、51、53、54、55、56、57、58、64、69、70、73、77、78、79、80、84、86、87、93、94、98、101、102、103、104、105、106、107、108和109的核苷酸序列至少85％同一的核酸序列中的任何一種，和能夠指導(dǎo)所述核酸序列在宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子序列。還提供了表達(dá)這些核酸構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因植物和使用其的方法。
文檔編號(hào)C12N15/82GK101505587SQ200680047610
公開日2009年8月12日 申請(qǐng)日期2006年10月24日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月24日
發(fā)明者R·葉林, A·紹尚, E·果爾德, S·阿亞爾, H·卡爾奇 申請(qǐng)人:伊沃基因有限公司