專利名稱：治療慢性纖維化疾病的材料與方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及治療慢性纖維化疾病的方法和組合物.本發(fā)明更具體涉及慢性纖 維化疾病的免疫治療干預(yù).
背景技術(shù)：
炎癥是對(duì)組織損傷或感染的協(xié)調(diào)反應(yīng).炎癥發(fā)生時(shí)首先是趨化罔子的局部釋 放、血小板活化、凝血和補(bǔ)體旁路的起動(dòng)，從而對(duì)局部?jī)?nèi)皮產(chǎn)生剌激，引起嗜中性 粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的外滲.炎癥的第二個(gè)階段以自適應(yīng)免疫細(xì)胞(包括淋巴細(xì)胞) 進(jìn)入組織為標(biāo)志.接下來(lái)是溶解階段，以基質(zhì)細(xì)胞(如成纖維細(xì)胞)對(duì)組織損傷的 修補(bǔ)為標(biāo)志.在溶解階段，過(guò)量的白細(xì)胞凋亡，然后被組織中的巨噬細(xì)胞呑噬.
在修補(bǔ)機(jī)制中，局部的靜止成纖維細(xì)胞遷移至損傷區(qū)域，分泌細(xì)胞外基質(zhì)蛋 白，促進(jìn)創(chuàng)口收斂或纖維化，也有人提出是循環(huán)中的纖維原前體細(xì)胞即纖維細(xì)胞 隨血液遷移至創(chuàng)傷處或纖維化部位，然后發(fā)生分化并介導(dǎo)組織修補(bǔ)和其他纖維化 反應(yīng)，纖維細(xì)胞由外周血單核細(xì)胞前體CD14+分化而來(lái)，表達(dá)造血干細(xì)胞標(biāo)記物 (CD45、 II型MHC、 CD34)和基質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物(I型和HI型膠原蛋白及纖維 粘連蛋白).成熟的纖維細(xì)胞迅速進(jìn)入組織損傷部位，分泌炎性細(xì)胞因子和細(xì)胞 外基質(zhì)蛋白、其他細(xì)胞罔子和促血管生成素，從而發(fā)生纖維化，
纖維細(xì)胞的分化與許多纖維化疾病有關(guān)，包括但不限于硬皮病、瘢痕疙瘩、 風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、狼瘡、腎源性纖維化硬皮病和特發(fā)性肺纖維化.纖維細(xì)胞在小鼠 感染日本血吸蟲(chóng)后纖維化病灶的形成中起重要作用，也參與自身免疫疾病的纖維 化.纖維細(xì)胞還與放射損傷、萊姆病和肺纖維化的致病性纖維化有關(guān).纖維細(xì)胞 也參與胰腺炎中的基質(zhì)重塑和基質(zhì)纖維化，而這種纖維細(xì)胞的缺乏導(dǎo)致胰腺癌及 腺癌.當(dāng)纖維細(xì)胞進(jìn)一步分化為肌纖維母細(xì)胞時(shí)，哮喘病人和其他肺病如慢性阻
塞性肺病患者還會(huì)發(fā)生纖維化.
我們知道有一些特殊的疾病發(fā)生無(wú)休止的纖維化反應(yīng)，如特發(fā)性間質(zhì)性肺炎， 是一組以不同程度的肺纖維化為特征的多種多樣慢性肺病.與特發(fā)性間質(zhì)性肺炎 (IIP)中各種獨(dú)特的組織結(jié)構(gòu)有關(guān)的嚴(yán)重肺纖維反應(yīng)的主要誘因尚不明確，罔此
這些疾病目前尚無(wú)有效的臨床治療手段(Green, Overview of pulmonary fibrosis. Chest2002;l22(suppl. 6):334S-9S).盡管其中的許多疾病表現(xiàn)為導(dǎo)致呼吸系統(tǒng) 損傷的肺泡微環(huán)境纖維增生反應(yīng)，但是他們的纖維化病變程度差異相當(dāng)大
(Nicholason Am. J. Resp. Crit. Car Med/ 2000:162:2213-7; Chapman J. Clin" Invest., 2004; 113:148-57).同樣復(fù)雜的是如何清楚證明抗炎藥物對(duì)不太嚴(yán)重的 IIP (如非特異性間質(zhì)性肺炎(NSIP)和呼吸性細(xì)支氣管間質(zhì)性肺病(RBILD)) 具有治療作用，但是常常卻不能防止最嚴(yán)重的致命性IIP--普通型間質(zhì)性肺炎
(U1P)病人的呼吸襲竭(Flaherty et al" Am. J. Med. 110:278-282 (2001); Lynch et al.， Curr. Opin. Pulm. Med.， 7:298-308 (2001); Flaherty et a，.， Thorax, 58:143-148(2003)).
獨(dú)特的纖維母細(xì)胞灶的存在是特發(fā)性間質(zhì)性肺炎的重要病理特征，顯示不良 預(yù)后和致命的結(jié)果(King et al" Am. J. Respir. Crit. Care Med.， 164:1025-1032 (2001)).關(guān)于IIP發(fā)生和維持過(guò)程中的肺纖維化病變有一些分歧，在闞明這些 問(wèn)題之后可以采用新的治療方法(van den. BHnk et a，.， Arch. Immunol. Ther. Exp (Warsz)， 48:539-545 (2000)) . CC趨化因子受體7 ( CCR7，與MLP-3b/CCL19 和6-Ckine/CCL21結(jié)合(Nagira et al.， J. Biol. Chem.， 272:19518-19524 (1997)) 和CX趨化因子受體4 (CXCR4,與SDF-1/CXCL12結(jié)合(Forster et al.， J. Immunol" 160:1522-1531 (1998))被普遍認(rèn)為是僅由造血干細(xì)胞來(lái)源的細(xì)胞表達(dá) 的趨化因子受體(Kim et al.， J. Leukoc. Biol" 66:455-461(1999); Kim et al.， J. Clin Invest., 108:1331-1339 (2001)).在免疫反應(yīng)過(guò)程中，CCR7的表達(dá)促進(jìn)成熟樹(shù)突 細(xì)胞向淋巴組織的運(yùn)動(dòng)(Sa，lusto et al" Eur. J. Immunol" 29:1617-1625 (1999))， 調(diào)控1型和2型T輔助細(xì)胞在脾臟中的定位(Randolph et a，.， Science, 286:2159-2162 (1999))，指引2型T輔助細(xì)胞向過(guò)敏的肺部轉(zhuǎn)移(Hammad et al.， J. Immunol" 169:1524-1534(2002)) . CXCR4的表達(dá)和作用主要限于來(lái)源于骨鍵 的免疫細(xì)胞(Ward et al" Biochem, J.， 333:457-470 (1998》Gonzalo et al" J. Immunol" 165:499-508 (2000)).最近有證據(jù)表明乳腺癌細(xì)胞表達(dá)CCR7和
CXCR4使其能夠向肺部轉(zhuǎn)移，因此改變了免疫中心的模式(Muller et al.， Nature, 410:50-56(2001)).乳腺細(xì)胞不表達(dá)這些趨化因子受體，對(duì)與之結(jié)合的配體也不 產(chǎn)生反應(yīng)(Mulleretal.， Nature, 410:50-56 (2001)) 這一觀察結(jié)果已被引伸至多 種轉(zhuǎn)移性腫瘤，包括黑色素病(Murakami et al.， J. Dermatol. Sci.， 36:71-78 (2004))和各種類型的白血病(Tavor et al.， Cancer Res" 64:2817-2824 (2004); GhobHal et al" Mayo Clin, Proc.， 79:318-325 (2004))
慢性肺纖維化來(lái)源于全肺創(chuàng)傷，可由多種原因產(chǎn)生，包括慢性炎癥(結(jié)節(jié)、 韋格納肉芽腫)、環(huán)境閎素的感染(石棉、硅土、 ^露于某些氣體)、電離放射 瀑露(如對(duì)乳腺胂瘤的放射治療)、慢性病(狼掩、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)甚至某些藥 物治療.罹患過(guò)敏性肺炎時(shí)，人體對(duì)吸入的有機(jī)粉塵或職業(yè)性化學(xué)物質(zhì)的免疫反 應(yīng)增強(qiáng)，肺部纖維化隨后發(fā)生.這種疾病大多數(shù)由吸入的被細(xì)菌、真菌或畜產(chǎn)品 污染的粉塵所致.某些類型的肺纖維化，如非特異性間質(zhì)性肺炎(NSIP)，受試 者可能對(duì)免疫抑制治療有反應(yīng).慢性肺部炎癥和纖維化常常在不明原罔的情況下 發(fā)展，這種疾病的患者往往對(duì)藥物治療沒(méi)有反應(yīng)，特別是那些特發(fā)性肺纖維化 (IPF)患者.特發(fā)性肺纖維化的治療手段很有限.目前還沒(méi)有任何藥物對(duì)這種 疾病有效，罔為結(jié)痂一旦開(kāi)始就會(huì)一直持續(xù)下去.肺移植是唯一可用的治療方法. 在一些仍在進(jìn)行的研究性試驗(yàn)中使用不同的藥物延緩纖維性結(jié)痂，有一些肺纖維 化對(duì)皮質(zhì)激素(如強(qiáng)的松)和/或其他能夠抑制身體免疫系統(tǒng)的藥物有反應(yīng)，這些 藥物有時(shí)被醫(yī)生用來(lái)延緩纖維化進(jìn)程，然而，眾所周知的是，目前還沒(méi)有對(duì)纖維 化疾病有效的治療方法.在臨床實(shí)踐中，標(biāo)準(zhǔn)方案是給病人開(kāi)處強(qiáng)的松和砥唑嘌 呤，但是沒(méi)有數(shù)據(jù)表明這些藥物具有治療作用.實(shí)際上，這些藥物的副作用可能 提高UIP患者的死亡率.
在肺纖維化中，趨化因子參與成纖維細(xì)胞灶的形成和纖維化反應(yīng)的放大.在 慢性肺纖維化過(guò)程中，促纖維化介質(zhì)環(huán)境的具體作用尚不明確，本發(fā)明詳細(xì)闡述 了各趨化因子及其受體的作用，從而為藥物治療無(wú)效的特發(fā)性疾病提供了新的治 療方法和處方，
發(fā)明概迷
本發(fā)明涉及用于治療所述纖維化疾病的方法和組合物.更具體地，本發(fā)明論 述了對(duì)單獨(dú)的CCL21活性或其與CCL19結(jié)合的活性的抑制或其它形式的降低，
能有效減少纖維化損害，并改善纖維化疾病的癥狀.
因此，在具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供治療哺乳動(dòng)物的慢性纖維化疾病的方
法，其包括降低纖維細(xì)胞和/或成纖維細(xì)胞中的CCL21的存在量(presence)或 活性，所迷纖維細(xì)胞和/或成纖維細(xì)胞位于所述纖維化疾病的纖維化損害處.某些 實(shí)施方案中，本方法可進(jìn)一步包括降低與所述纖維化疾病有關(guān)的成纖維細(xì)胞中 CCL19的存在量或活性.例如，降低CCL21的存在量或活性可包括使所述哺乳 動(dòng)物與有效重的藥劑(agent)接觸，以減輕所迷慢性纖維化疾病的一種或多種 癥狀，所述藥刑從成纖維細(xì)胞去除CCL21.這種藥刑的示例可以是與CCL21發(fā) 生特異性免疫反應(yīng)的抗體，例如相比于其他趨化因子，優(yōu)先識(shí)別CCL21上的表 位的抗體，
其它實(shí)施方案中，所述降低CCL21的存在量或活性包括使所述哺乳動(dòng)物與 有效量的藥刑接觸，以減輕所述慢性纖維化疾病的一種或多種癥狀，所述藥刑減 少所述成纖維細(xì)胞中的CCL21表達(dá).用于此類實(shí)施方案的示例性藥刑可以是定 向抗(directed against) CCL21的siRNA分子.
本發(fā)明可治療的纖維化疾病可以是任何纖維化疾病，包括但不限于選自以下 疾病中的一種肺纖維化、慢性阻塞性肺病、肝纖維化、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、充血性 心力衰竭、慢性腎病、過(guò)敏性肺炎、呼吸性細(xì)支氣管炎/間質(zhì)性肺病、更氏血吸蟲(chóng) 感染、原發(fā)性肺動(dòng)脈高壓(防止叢狀損害形成)、皰疹病毒相關(guān)疾病(包括肺表 現(xiàn)和皮膚表現(xiàn))、瘢痕疙瘩(keloid scarring)、狼瘡、腎源性纖維化皮膚病、曰 本血吸蟲(chóng)感染相關(guān)的纖維化損害、自身免疫性疾病、致病性纖維化、萊姆病、胰 腺炎中的基質(zhì)重塑和基質(zhì)纖維化、子宮肌瘤、卵巢纖維化、角膜纖維化、充血性 心力衰竭和其他缺血后遣癥、術(shù)后結(jié)疤(scarring)(包括腹部粘連)、開(kāi)角型 (wide angle)青光眼小梁切除術(shù)后結(jié)疤，及其任意組合，
按照本發(fā)明治療的典型肺動(dòng)脈高血壓包括原發(fā)性肺動(dòng)脈高壓(PPH)、繼發(fā)性 肺動(dòng)脈高壓(SPH)、家族性PPH、偶發(fā)性PPH、毛細(xì)血管前肺動(dòng)脈高壓、肺動(dòng) 脈高血壓(PAH)、特發(fā)性肺動(dòng)脈高壓、血栓性肺動(dòng)脈病(TPA)、致叢性肺動(dòng) 脈病、功能類別(functional classes) 1~IV的肺動(dòng)脈高壓，以及與以下疾病相關(guān)、 由以下疾病引起或繼發(fā)的肺動(dòng)脈高血壓左心室功能不良、二尖瓣病變、縮窄扭 心包炎、主動(dòng)脈瓣狹窄、心肌病、縱膈纖維化、肺靜脈異位引流、肺靜脈閉塞病、 膠原血管病、先天性心臟病、HIV病毒感染、藥物和毒素(如氟苯丙胺)、先夭
性心臟病、肺靜脈高血壓、慢性阻塞性肺病、間質(zhì)性肺病、睡眠呼吸障礙、肺泡 通氣不足、高海拔慢性啄露、新生兒肺病、肺泡毛細(xì)血管發(fā)育不良、鐮狀細(xì)胞疾
病、其它凝血障礙、慢性血栓栓塞(thromboemboH)、結(jié)締組織疾病、狼疳、 血吸蟲(chóng)病、結(jié)節(jié)病或肺毛細(xì)血管瘤.
按照本發(fā)明治療的肺動(dòng)脈高血壓最特別的是與呼吸系統(tǒng)疾病和/或低氧血癥 有關(guān)的肺動(dòng)脈高血壓，包括慢性阻塞性肺病、間質(zhì)性肺病、睡眠呼吸障礙、肺泡 通氣不足、高海拔慢性曝露、新生兒肺病和肺泡毛細(xì)血管發(fā)育不良，尤其是慢性 阻塞性肺病.優(yōu)選實(shí)施方案中，纖維化疾病為慢性肺纖維化.
在治療方法中，可將化合物局部施用于纖維化損害(fibrosing lesion )位點(diǎn)， 更具體的實(shí)施方案中，纖維化損害在肺中，使組合物與所述摘害局部接觸.某些 實(shí)施方案中，預(yù)期藥刑包含將所述藥刑特異性定位于纖維化損害位點(diǎn)的靶向部分.
具體實(shí)施方案中，使用選自以下的給藥方式施用所述抗體或抗CCL21或抗 CCL19組合物局部給藥、注射、吸入、儲(chǔ)庫(kù)式或泉式持續(xù)釋放(continuous release by depot or pump)，或其任意組合，
本發(fā)明的另一方面是抑制成纖維細(xì)胞和/或纖維細(xì)胞增殖的方法，包括使所述 成纖維細(xì)胞和/或纖維細(xì)胞與組合物接觸，所述組合物包含抗CCL21抗體或設(shè)計(jì) 為抗(deigned against) CCL21的siRNA分子. 一些實(shí)施方案中，本方法進(jìn)一步 包括使所述成纖維細(xì)胞與組合物接觸，所述組合物包含抗CCL19抗體或設(shè)計(jì)為 抗CCL19的siRNA分子.其他實(shí)施方案中，本方法進(jìn)一步包括使所述成纖維細(xì) 胞與組合物接觸，所迷組合物包含抗CCR7抗體或設(shè)計(jì)為抗CCR7受體的siRNA 分子.受治的纖維細(xì)胞和/或成纖維細(xì)胞可位于體外或體內(nèi).它們優(yōu)選位于體內(nèi)， 更優(yōu)選位于體內(nèi)肺組織中.
還包括抑制纖維細(xì)胞遷移和/或成纖維細(xì)胞活化的方法，其包括對(duì)使所述纖維 細(xì)胞和/或成纖維細(xì)胞與抑制CCL21活性的組合物接觸.此類方法中，纖維細(xì)胞 位于哺乳動(dòng)物體內(nèi)，所迷方法抑制纖維細(xì)胞向所述哺乳動(dòng)物的肺組織遷移，由此 防止細(xì)胞外基質(zhì)的過(guò)度產(chǎn)生.在這些方法中，成纖維細(xì)胞優(yōu)選為位于所述哺乳動(dòng) 物肺組織中的固有(resident)肺成纖維細(xì)胞，且所述方法抑制所述哺乳動(dòng)物肺組 織中所述成纖維細(xì)胞的活化，由此防止細(xì)胞外基質(zhì)的過(guò)度產(chǎn)生.
本文還教導(dǎo)治療肺纖維化的方法，其包括通過(guò)抑制所述纖維細(xì)胞和/或所迷成 纖維細(xì)胞中CCL21的活性或表達(dá)來(lái)抑制罹患纖維化肺病的哺乳動(dòng)物的纖維細(xì)胞
的遷移和/或位于肺組織中的固有肺成纖維細(xì)胞的活化，由此防止細(xì)胞外基質(zhì)的過(guò) 度產(chǎn)生并改善肺纖維化癥狀.
展，改善其一種或多種癥狀，逆轉(zhuǎn)病情，或達(dá)到治療效果的方法，其包括對(duì)所述
受試者施用降低所述受試者肺組織中纖維細(xì)胞和/或成纖維細(xì)胞中CCL21的存在 重或活性的藥刑，其中所述藥刑可在放射治療之前、和/或期間、和/或之后施用. 這種治療方法可進(jìn)一步包括施用降低所迷被試者的肺組織中CCL19的存在量或 活性的藥刑.
本發(fā)明的另一方面預(yù)期對(duì)受試者治療或抑制藥物誘發(fā)的肺纖維化的發(fā)展，玫 善其一種或多種癥狀，逆轉(zhuǎn)病情，或達(dá)到治療效果的方法，其包括對(duì)所述受試者 施用降低所述受試者肺組織中纖維細(xì)胞和/或成纖維細(xì)胞中CCL21的存在量或活 性的藥劑，其中所述藥劑可在給藥、和/或期間、和/或之后施用.還希望，這種 方法進(jìn)一步施用降低所述被試者的肺組織中CCL19的存在量或活性的藥刑.有 許多藥物可導(dǎo)致纖維化，這樣的藥劑包括但不限于細(xì)胞毒素劑、抗生素、抗心摔 失常藥、消炎藥和違禁藥.可導(dǎo)致肺纖維化的示例性藥物包括但不限于兩性審素 B、博來(lái)霉素、溴麥角隱亭、白消安、卡馬西平、苯丁酸氮芥、可卡因、環(huán)磷狹 胺、苯妥英、麥角胺、氟卡尼、海洛因、美法侖、美沙稱、甲氨蝶呤、哌甲睇、 美西麥角(methylsergide)、礦物油、呋喃妥因、亞硝基脲類、丙卡巴肼、硅酮 (silicone)、柳氮磺吡啶、妥卡尼和長(zhǎng)春花生物械類藥刑(vinca alkaloid class of agents )
本文描述的治療方法中，提供輔助治療方案是合意的，其中將影響CCL21 和CCL19的治療劑與皮質(zhì)類固醇和/或免疫抑制刑聯(lián)合.在其他方法中，聯(lián)合治 療可包括給予抗凝劑、利尿劑、強(qiáng)心甙、鈣通道阻斷刑、血管擴(kuò)張劑、前列環(huán)素 類似物、內(nèi)皮素拮抗劑、磷酸二酯酶抑制劑、p2激動(dòng)刑、抗毒萆堿劑、內(nèi)肽醉抑 制劑、降血脂藥和血栓素抑制劑，或其組合.
此外，本發(fā)明進(jìn)一步預(yù)期降低纖維化損害處的纖維細(xì)胞和/或成纖維細(xì)胞中 CCL21和/或CCL19的存在重或活性的藥劑在制備治療慢性纖維化疾病的藥物中 的用途
示例性實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于降低纖維化損害處的纖維細(xì)胞和/或成 纖維細(xì)胞中CCL21的存在量或活性的藥劑以及任選的降低纖維化損害處的纖維
CCL19的存在量或活性的藥劑在制備治療哺乳動(dòng)物慢性 纖維化疾病的藥物中的用途.某些實(shí)施方案中，所術(shù)藥劑是與CCL21產(chǎn)生特異 性免疫反應(yīng)的抗體，該抗體優(yōu)選為相比于其他趨化罔子，優(yōu)先識(shí)別CCL21上的 表位的一種抗體.在其他實(shí)施方案中，該藥刑是定向抗CCL21的siRNA分子. 制備所述藥物用于治療選自以下的纖維化疾病肺纖維化、慢性阻塞性肺病、肝 纖維化、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、充血性心力襲竭、慢性腎病、過(guò)敏性肺炎、呼吸性細(xì)支 氣管炎/間質(zhì)性肺病、更氏血吸蟲(chóng)感染、由叢狀損害引起的原發(fā)性肺動(dòng)脈高血壓、 皰滲病毒相關(guān)疾病的肺表現(xiàn)、皰疹病毒相關(guān)疾病的皮膚表現(xiàn)、瘢痕疙瘩、狼瘡、 腎源性纖維化皮膚病、日本血吸蟲(chóng)感染相關(guān)的纖維化損害、自身免疫性疾病、致 病性纖維化、萊姆病、胰腺炎中的基質(zhì)重塑和基質(zhì)纖維化、子宮肌瘤、卵巢纖維 化、角膜纖維化、充血性心力衰竭和其他缺血后遣癥、術(shù)后腹部結(jié)疤、開(kāi)角型音 光眼小梁切除術(shù)后結(jié)疤，及其任意組合.優(yōu)選地纖維化疾病為慢性肺纖維化.
優(yōu)選將藥物配制用于選自以下的給藥方式局部給藥、注射、吸入、儲(chǔ)庫(kù)式 或泵式持續(xù)釋放，或其任意組合.
還預(yù)期的是，包含抗CCL21抗體或設(shè)計(jì)為抗CCL21的siRNA分子，以及任 選的抗CCL19抗體或設(shè)計(jì)為抗CCL19的siRNA分子的組合物在制備抑制成纖維 細(xì)胞和/或纖維細(xì)胞增殖的藥物中的用途.該用途可進(jìn)一步包括包含抗CCR7抗體 或設(shè)計(jì)為抗CCR7受體的siRNA分子的組合物在制備抑制成纖維細(xì)胞和/或纖維 細(xì)胞增殖的藥物中的用途.
另一方面預(yù)期了抑制CCL21活性的組合物在制備抑制纖維細(xì)胞遷移和/或成 纖維細(xì)胞活化的藥物中的用途.還提供了抑制纖維細(xì)胞中CCL21的活性或表達(dá)， 和/或抑制固有肺成纖維細(xì)胞活化的組合物在制備藥物中的用途，所述藥物通過(guò)防 止細(xì)胞外基質(zhì)的過(guò)度產(chǎn)生并改善肺纖維化癥狀來(lái)治療肺纖維化.
另外，本本還預(yù)期了降低肺組織中纖維細(xì)胞和/或成纖維細(xì)胞中CCL21的存 在量或活性的藥劑或任選的降低肺組織中纖維細(xì)胞和/或成纖維細(xì)胞中CCL19的
物中的用途.
的藥劑或任選的降低肺組織中纖維細(xì)胞和/或成纖維細(xì)胞中CCL19的存在量或活 性的藥劑在制備治療藥物誘發(fā)的肺纖維化的藥物中的用途.在這樣的用途中，制
備的藥物用于治療藥物誘發(fā)的非特發(fā)性肺纖維化，所述藥物選自細(xì)胞毒素刑、拔
生素、抗心律失常藥、消炎藥和違禁藥，例如所述藥物可選自兩性審素B、博來(lái) 霉素、溴麥角隱亭、白消安、卡馬西平、苯丁酸氣芥、可卡因、環(huán)磷觥胺、苯妥 英、麥角胺、氟卡尼、海洛罔、美法侖、美沙稱、甲氨蝶呤、哌甲醋、美西麥角、 礦物油、呋喃妥罔、亞砩基脲類、丙卡巴肼、硅頃、柳氮橫吡啶、妥卡尼和長(zhǎng)春 花生物堿類藥劑. 一些實(shí)施方案中，考慮聯(lián)合使用藥劑來(lái)制備藥物，其中將基于 CCL19或CCL21的藥物與皮質(zhì)類固醇、免疫抑制、抗凝劑、利尿劑、強(qiáng)心甙、 鈣通道阻斷刑、血管擴(kuò)張刑、前列環(huán)素類似物、內(nèi)皮素拮抗刑、褲酸二SS醉抑制 劑、P2激動(dòng)劑、抗毒覃減刑、內(nèi)肽酶抑制劑、降血脂藥和血栓素抑制刑，或其紐 合聯(lián)合.
附圖簡(jiǎn)迷
圖l.外科肺活檢的上肺葉(lobe)和下肺葉中的(A) CCR7及(B) CXCR4 基因表達(dá)的SuperArray基因分析，所述肺葉來(lái)自UIP病人(n-7)組、NSIP病 人(n=6)組、RBILD病人(n=6)組以及正常邊緣(normal margin)腫瘤病人 (n=5)組，顯示的數(shù)據(jù)為平均值(SEM).未檢測(cè)到顯著差異.CCR7為CC 趨化因子受體7, CXCR4為CX趨化因子受體4， GAPDH為3-磷酸甘油醛脫象 醉，NSIP為非特異性間質(zhì)性肺炎，RBILD為呼吸性細(xì)支氣管炎/間質(zhì)性肺病，UH 為普通型間質(zhì)性肺炎.
圖2.外科肺活檢的上肺葉和下肺葉中的(A) CCL19、 (B) CCL21及(C〕 CXCL12基因表達(dá)的SuperArray基因分析，所迷肺葉來(lái)自UlP病人(n-7)組、 NSIP病人(n=6)組、RBILD病人(n=6 )組以及正常邊緣腫瘤病人(n=5 )組. 顯示的數(shù)據(jù)為平均值(SEM).未檢測(cè)到顯著差異.CCL為cc趨化罔子受體fie 體，CXCL為CX趨化罔子受體配體，GAPDH為3-磷酸甘油眵脫氬酶，NSIP為 非特異性間質(zhì)性肺炎，RBILD為呼吸性細(xì)支氣管炎/間質(zhì)性肺病，UIP為普通型 間質(zhì)性肺炎.
困3.外科肺活檢的上肺葉和下肺葉中的CCR7及CCL21基因表達(dá)的定i Taqman聚合酶鏈反應(yīng)分析，所述肺葉來(lái)自UIP病人(n=18 ) 、 NSIP病人(n-8 )、 RBILD病人(n=6)和正常邊緣病人(n=6).顯示的數(shù)據(jù)為平均值(SEM) "為與來(lái)自正常邊緣的腫瘤病人組的適當(dāng)肺葉相比，P<0.01. CCR7為CC趁化 因子受體7， CCL21為CC趨化目子受體4配體，NSIP為非特異性間質(zhì)性肺炎，
RBILD為呼吸性細(xì)支氣管炎/間質(zhì)性肺病，UIP為普通型間質(zhì)性肺炎.
圖4.外科肺活檢的上肺葉和下肺葉中的CCL19、 CCL21和CCL12的酶聯(lián)免 疫吸附法分析，所迷肺葉來(lái)自UIP病人(n=18) 、 NS1P病人(n-6) 、 RBILD 病人(n-6)和正常邊緣病人(n-6).顯示的數(shù)據(jù)為平均值(SEM ) , CCL為 CC趁化罔子受體陪體，CXCL為CX趨化因子受體配體，NSIP為非特異性間質(zhì) 性肺炎，RBILD為呼吸性細(xì)支氣管炎/間質(zhì)性肺病，UIP為普通型間質(zhì)性肺炎.
圖5. SLBs中CCR7的代表性免疫組化分析，所述SLBs來(lái)自UIP病人組(A、 B) 、 NSIP病人組(C、 D) 、 RBILD病人組(E、 F)和正常邊緣的腫病病人組
(G、H).組(A)、 (C)、 (E)和(G)顯示對(duì)照染色.來(lái)自UIP (B)、 NSIP ( D )和RBILD ( F )的SLBs中的病灶區(qū)(focus area )見(jiàn)到CCR7免疫反 應(yīng)性(紅色染色)，但在正常邊緣組(H)則未發(fā)現(xiàn).放大倍數(shù)6200. CCR7為 CC趨化罔子受體7， NSIP為非特異性間質(zhì)性肺炎，RBILD為呼吸性細(xì)支氣管炎 /間質(zhì)性肺病，SLB為外科肺活檢樣，UIP為普通型間質(zhì)性肺炎.
困6. SLBs中CXCR4的代表性免疫組化分析，所述SLBs來(lái)自UIP病人組
(A、 B) 、 NSIP病人組(C、 D) 、 RBILD病人組(E、 F)和正常邊緣的腫瘤 病人組(G、 H).組(A) 、 (C)、 (E)和(G)顯示對(duì)照染色.HP和正常 邊緣組SLBs的單核細(xì)胞可見(jiàn)CXCR4免疫反應(yīng)性(紅色染色).放大倍數(shù)6200. CXCR4為CX趨化因子受體4， NSIP為非特異性間質(zhì)性肺炎，RBILD為呼吸性 細(xì)支氣管炎/間質(zhì)性肺病，SLB為外科肺活檢樣，UIP為普通型間質(zhì)性肺炎.
困7.來(lái)自UIP病人組(A-C)和NSIP病人組(D-F)的序列組織切片中CCR7
(B、 E)和CD45 (C、 F)的代表性免疫組化分析.組(A)和(D)顯示對(duì)照 染色.UIPSLBs中，CCR7免疫反應(yīng)性(B中紅色染色)與CD45的免疫反應(yīng)性
(C)部分重疊，雙重染色的大部分與單核細(xì)胞(C)有關(guān).在序列組織切片中(A、 F) ， CCR7和CD45似乎未在NSIP SLBs中共定位.放大倍數(shù)6200. CCR7為 CC趨化因子受體7， NSIP為非特異性間質(zhì)性肺炎，SLB為外科肺活檢樣，Ulf 為普通型間質(zhì)性肺炎.
圖8. SLBs中CD34的代表性免疫組化分析，所述SLBs來(lái)自UIP病人組(A、 B) 、 NSIP病人組(C、 D) 、 RBILD病人組(E、 F)和正常邊緣的腫瘤病人紐
(G、 H).組(A) 、 (C) 、 (E)和(G)顯示對(duì)照染色.所有病人的SLBs 中，間質(zhì)區(qū)見(jiàn)到CD34免疫反應(yīng)性(紅色染色).發(fā)現(xiàn)CD34在來(lái)自NSIP病入 組(D)的SLBs中表達(dá)最高.放大倍數(shù)6200.NSIP為非特異性間質(zhì)性肺炎，RBILD 為呼吸性細(xì)支氣管炎/間質(zhì)性肺病，SLB為外科肺活檢樣，UIP為普通型間質(zhì)性肺 炎.
困9. SLBs中1型膠原的代表性免疫組化分析，所述SLBs來(lái)自UIP病人組 (A、 B) 、 NSIP病人組(C、 D) 、 RB1LD病人組(E、 F)和正常邊緣的腫癌 病人組(G、 H).組(A) 、 (C)、 (E)和(G)顯示對(duì)照染色.膠原免疫反 應(yīng)性(紅色染色)彌散遍布于來(lái)自U1P病人組(B) 、 NSIP病人組(D) 、 RBILD 病人組(F)和正常邊緣的腫瘤病人組(H)的SLBs.放大倍數(shù)6200. NSIP為 非特異性間質(zhì)性肺炎，RBILD為呼吸性細(xì)支氣管炎/間質(zhì)性肺病，SLB為為外科 肺活檢樣，UIP為普通型間質(zhì)性肺炎.


圖10.來(lái)自UIP病人組(A-C )和RBILD病人組(D-F)的SLBs中1型膠 原(B、 E)和CCR7 (C、 F)的代表性免疫組化分析.組(A)和(D)為對(duì)照 染色.膠原免疫反應(yīng)性(紅色染色)存在于UIP病人組(B )和RB1LD病人組(E). 但是，在序列組織切片中，1型膠原發(fā)生免疫反應(yīng)的區(qū)域沒(méi)有CCR7表達(dá)(C， UIP; F， RBILD).放大倍數(shù)6200。 CCR7為CC趨化因子受體7， RBILD為 呼吸性細(xì)支氣管炎/間質(zhì)性肺病，SLB為為外科肺活檢樣，U1P為普通型間質(zhì)性肺 炎.
困11.來(lái)自UIP病人組(A-C) 、 NS1P病人組(D-F )和RBILD病人組(G-l 〕 的SLBs中平滑肌肌動(dòng)蛋白(aSMA)的代表性免疫組化分析.組(A) 、 (D) 和(G)顯示對(duì)照染色.來(lái)自UIP病人(B) 、 NSIP病人(E)和RBILD病人(H) 的SLBs的病灶區(qū)中見(jiàn)到CCR7免疫反應(yīng)性(紅色染色).在序列組織切片中， 在UIP病人組(C) 、 NSIP病人組(F )和RBILD病人組(I)中還見(jiàn)到aSMA 表達(dá)(紅色染色).但是，未見(jiàn)CCR7和aSMA表達(dá)的重疊.放大倍數(shù)6200. CCR7為CC趨化因子受體7， NSIP為非特異性間質(zhì)性肺炎，RBILD為呼吸性細(xì) 支氣管炎/間質(zhì)性肺病，SLB為為外科肺活檢樣，aSMA為平滑肌肌動(dòng)蛋白，DIP 為普通型間質(zhì)性肺炎.
圖12.與其它類型的非纖維化疾病患者相比，來(lái)自各種類型的慢性肺纖維化 病人外科肺活檢中CCL21的轉(zhuǎn)錄物表達(dá).不同病人組的CCL21基因表達(dá)(用 TAQMANPCR測(cè)定)有差異.在普通型間質(zhì)性肺炎(UIP )病人SLBs的上肺葉 和下肺葉中觀察到CCL21的最高表達(dá)，但是在下肺葉SLBs檢查中，UIP組與
其它組SLBs之間的差異最為顯著.綜合起來(lái)，這些數(shù)據(jù)表明，在UIP期間，CCR7 和CCL21的表達(dá)得到明顯増強(qiáng).NSIP為非特異性間質(zhì)性肺炎，RBILD為呼吸性 細(xì)支氣管炎/間質(zhì)性肺病.
困13.與其它類型的非纖維化疾病患者相比，來(lái)自各種類型的慢性肺纖維化 病人外科肺活檢中CCL21的蛋白質(zhì)表達(dá)，這里顯示了 HP和非IIP活檢樣本的 ELISA分析結(jié)果.在上肺葉活檢中，UIP、 NSIP和非IIP組的CCL21蛋白質(zhì)表 達(dá)水平相似.但是，在下肺葉樣本中(其中IIP病人中的肺纖維化更激進(jìn))，IIP 組的CCL21水平更高(即UIP、 NSIP和RBILD組與非IIP組相比).
圖14.CCL21的存在顯著增強(qiáng)了 UIP成纖維細(xì)胞的遷移，但不增強(qiáng)非IIP成 纖維細(xì)胞.這些實(shí)驗(yàn)包括將人成纖維細(xì)胞加到Transwell多孔培養(yǎng)平板系統(tǒng)中， 對(duì)在24小時(shí)孵育期間遷移通過(guò)(migrated through)的成纖維細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù).UIP 成纖維細(xì)胞遷移通過(guò)transweH至底孔(bottom well),如果在底孔中加入CCL21, 或用TNF處理成纖維細(xì)胞并在底孔中加入CCL21,則該反應(yīng)顯著增強(qiáng).抗CCL21 抗體的存在顯著減弱了后兩組中成纖維細(xì)胞的遷移，但是對(duì)笫一組沒(méi)有影響.
困15.這里顯示了外源性CCL19和CCL21 (均為10 ng/ml)對(duì)來(lái)源于正常 SLBs、過(guò)敏性肺炎SLBs、類肉痛SLBs和UIP SLBs的原代成纖維細(xì)胞系的増殖 反應(yīng)的影響測(cè)定，顯然，UIP成纖維細(xì)胞對(duì)CCL19和CCL21配體的存在呈現(xiàn)增 殖反應(yīng).
圖16.已經(jīng)觀察到，將IIP成纖維細(xì)胞引入SCID小鼠促進(jìn)了間質(zhì)纖維化的 發(fā)展，將接下來(lái)的研究設(shè)計(jì)為評(píng)價(jià)抗CCL21在這一模型中的抗纖維化作用.從 第35天開(kāi)始給各組(五只小鼠一組)腹腔注射純化的IgG或抗CCL21抗體，每 隔一天注射直至第63天.在第63天，摘除肺組織，取代表性切片.IgG處理的 小鼠明顯顯示出間質(zhì)纖維化和重塑.相反，基于組織學(xué)分析，抗CCL21抗體治 療組很少顯示出肺纖維化.
本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案詳述
纖維化涉及纖維細(xì)胞的不受抑制的增殖以及分化.纖維細(xì)胞是一群獨(dú)特的成 纖維細(xì)胞樣細(xì)胞，其源自外周血單核細(xì)胞，外周血單核細(xì)胞通常進(jìn)入組織損傷但 點(diǎn)，促進(jìn)血管生成和傷口痊愈.本發(fā)明顯示，降低纖維細(xì)胞和/或成纖維細(xì)胞(存 在于纖維化病變的纖維化損害處)中CCL21的存在量或活性將減少纖維化病" 的存在量，和/或抑制纖維化病灶的形成和/或改善纖維化疾病的一種或多種癥狀， 從而獲得有益的治療結(jié)果，
已知的特發(fā)性慢性肺纖維化具有非常大的臨床挑戰(zhàn)性，各種治療選擇顯示出
效力有限或有毒性(Flaherty et al.， Am. J. Med.， 110:278-282 (2001); (Hampton et al.， Am. J. Respir. CHt. Care Med.， 149:A878 (1994))，診斷后的中位存活率幾乎 無(wú)變化(Ryu et al.， Mayo Clin. Proc.， 73:1085-1101 (1998); Lasky et al" Environ, Health Perspect.， 108 Suppl 4:751-762 (2000)),已知的促纖維化剌激因素包括放 射、吸入的礦物質(zhì)及有機(jī)粒子、氣態(tài)氧化刑、藥物和感染性微生物，然而對(duì)于引 發(fā)特發(fā)性間質(zhì)性肺炎(HP)的臨床病理實(shí)體的致病因素的確認(rèn)一直存在著爭(zhēng)議. IIP是一組多種形式的疾病，與遠(yuǎn)端肺實(shí)質(zhì)有關(guān)，其有許多共同的特征，但是很 難為命名為單獨(dú)的疾病(Travis et al.， Am. J. Surg. Path" 24:19-33 (2000)) 不 清楚它們的發(fā)病機(jī)理，但集中認(rèn)為是與肺部受到創(chuàng)傷(或多重?fù)p傷)后試?yán)е斡?該創(chuàng)傷有關(guān).成纖維細(xì)胞灶是活躍增殖的成纖維細(xì)胞的小聚集體，被認(rèn)為是創(chuàng)傷 的優(yōu)先細(xì)胞灶(prior foci)的組織化，顯示纖維化處于活動(dòng)和進(jìn)行狀態(tài).
首先，以IIP為例說(shuō)明慢性纖維化疾病，本文表述的數(shù)據(jù)表明，CCR7和/或 CXCR4在纖維化病癥(此處為IIP外科肺活檢(SLBs))高度表達(dá)，而在正常 邊緣的SLBs中表達(dá)不高.對(duì)來(lái)自IIP病人組和正常邊緣的腫瘤病人組的SLBs 進(jìn)行了詳細(xì)的基因轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)分析.趨化罔子和趨化罔子受體轉(zhuǎn)錄分析結(jié)果表 明，CCR7 (而非CXCR4)在HP (特別是所有UIP活檢分析樣)的間質(zhì)病灶區(qū) 中高度表達(dá)，但是在正常邊緣的活檢樣中沒(méi)有這樣，IIP活檢中的CCR7陽(yáng)性區(qū) 域含有纖維細(xì)胞，但是假設(shè)存在于CCR7陽(yáng)性區(qū)域內(nèi)的細(xì)胞不共表達(dá)纖維細(xì)胞標(biāo) 記物(如CD34和膠原)，CCR7陽(yáng)性細(xì)胞不一定是來(lái)源于骨號(hào)的細(xì)胞.最后表 明，IIP活檢中的CCR7陽(yáng)性細(xì)胞是活化的閨有組織成纖維細(xì)胞.因此，這里描 述的例子證明了在嚴(yán)重IIP中增加了 CCR7的表達(dá)，這種表達(dá)定位于缺乏纖維細(xì) 胞和肌成纖維細(xì)胞的纖維化病灶區(qū).
進(jìn)一步研究表明，CCR7受體的CCL21和/或CCL19配體的靶向性有良好的 干預(yù)作用，用于慢性纖維化疾病的治療.更具體地，臨床和動(dòng)物模型數(shù)據(jù)顯示， 在UIP期間CCR7和CCL21的表達(dá)得到明顯加強(qiáng).進(jìn)一步表明了 CCLM的存在 增強(qiáng)了 UIP成纖維細(xì)胞的遷移.另一方面，抗CCL21抗體制刑大大減弱了 U1F 中成纖維細(xì)胞的遷移，另外，當(dāng)CCL21或CCL19配體存在時(shí)，U1P成纖維細(xì)胞
呈現(xiàn)明顯的增殖反應(yīng).
將IIP成纖維細(xì)胞引入SCID小鼠，小鼠的發(fā)育引起間質(zhì)性纖維化的發(fā)展. 此模型用作IIP的人源化SCID模型.與未經(jīng)抗CCL21抗體處理的IIP人源化 SCID小鼠模型相比，用抗CCL21抗體治療這些模型小鼠時(shí)，該小鼠很少或不顯 示肺纖維化的組織學(xué)證據(jù).
從本文顯示的數(shù)據(jù)可以預(yù)期，涉及降低和/或抑制CCL21和/或CCL19活扭 的方法和組合物，對(duì)于治療肺部和其他組織的纖維化疾病是特別有用.人成纖絲 細(xì)胞對(duì)CCL19和CCL21的反應(yīng)性(由于其對(duì)CCR7的正調(diào)節(jié)作用)導(dǎo)致這些細(xì) 胞的不當(dāng)活化，從而造成IIP中觀察到的極度纖維化反應(yīng).有趣的是，肺纖維化 病人的細(xì)胞因子環(huán)境可能有利于CCL19和CCL21的異常反應(yīng)，因?yàn)橐呀?jīng)有其傳 研究者文獻(xiàn)記栽了 TNF-a蛋白水平升高(Sallusto et al.， Eur. J. Immunol. 29:1617-1625 (1999); Randolph et al" Science, 286:2159-2162 (1999))和IL-10減 少(Hammad et al.， J. Immunol., 169:1524-1534 (2002))，這兩種細(xì)胞罔子均調(diào) 控與這些配體結(jié)合的受體.來(lái)自嚴(yán)重肺纖維化病人的人成纖維細(xì)胞明顯對(duì)CCL" 和CCL21起反應(yīng)，罔此使這些配體成為治療肺部(可能還有其他組織)的纖雄 化疾病的吸引性靶點(diǎn).
鑒于以上討論，應(yīng)理解，在某些實(shí)施方案中可以預(yù)期，靶向CCL21和/或 CCL19的組合物特異性地抑制趨化罔子與CCR7受體的相互作用.此類組合物可 以定向抗CCL21和/或CCL19本身(例如抗這些趨化因子的抗體、設(shè)計(jì)為抗這些 趨化因子反義分子或設(shè)計(jì)為抗這些分子的siRNA分子).或者，此類組合物可定 向抗CCR7受體(例如抗該受體的抗體、設(shè)計(jì)為抗該受體的反義分子或設(shè)計(jì)為抗 該受體的siRNA分子)，其它選擇中，此類組合物可包含趨化閎子與CCR7受偉 相互作用的小分子抑制劑.這些同樣用于治療和/或改善受試者疾病征狀的組合敎 和方法將在后面進(jìn)行更為詳細(xì)的討論.
任何纖維化疾病都是可以治療的.例如，這些疾病可包括肺纖維化、慢性fi 塞性肺病、肝纖維化、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、充血性心力衰竭、慢性腎病、過(guò)敏性肺炎、 呼吸性細(xì)支氣管炎/間質(zhì)性肺病、更氏血吸蟲(chóng)感染、原發(fā)性肺動(dòng)脈高壓(防止叢批 損害形成)、皰疹病毒相關(guān)疾病(包括肺表現(xiàn)和皮膚表現(xiàn))、瘢痕疙瘩、狼瘡、 腎源性纖維化皮膚病、日本血吸蟲(chóng)感染相關(guān)的纖維化損害、自身免疫性疾病、效 病性纖維化、萊姆病、胰腺炎中的基質(zhì)重塑和基質(zhì)纖維化、子宮肌瘤、卵巢纖維
化、角膜纖維化、克血性心力衰竭和其他缺血后遣癥、術(shù)后結(jié)疤(包括腹部粘連)、 開(kāi)角型青光眼小梁切除術(shù)后結(jié)疤，及其任意組合，所述方法適用的其它領(lǐng)域是抑
制上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化(EMT).這是一種現(xiàn)象，其中各種器官(特別是 腎)中的上皮細(xì)胞"退化"成更"原始"的細(xì)胞表型(類似成纖維細(xì)胞).這種 過(guò)程有助于組織機(jī)體發(fā)育布局的形成，EMT在胚胎發(fā)育方面得到了很好的研究， 在成人組織的器官纖維化過(guò)程中，其對(duì)成纖維細(xì)胞的發(fā)生也發(fā)揮著作用.腎纖維 化研究的最新證據(jù)表明，全部疾病相關(guān)成纖維細(xì)胞中超過(guò)三分之一來(lái)源于損傷位 點(diǎn)處的管狀上皮細(xì)胞，這種過(guò)程可被KaHuri和Nielsen發(fā)明的組合物抑制(J. Clin. Invest. 112:1776-1784(2003)).
充血性心力衰竭、非典型性肺炎(包括肺孢子蟲(chóng)類)和腫瘤淋巴彌散的病人 可出現(xiàn)肺纖維化，環(huán)堍性或職業(yè)性瀑露(包括吸入接觸無(wú)機(jī)粉塵，例如硅稱、石 棉、鈹(bery出os)，黑肺)也被認(rèn)為是引起這些肺疾病的原罔.接觸蛋白質(zhì)抗 原(如農(nóng)民肺、飼鵒者肺、熱浴肺(hot-tub lung))以及接觸有毒氣體、煙霧、 浮塵和蒸氣(如地窖裝填者病(silo-fiHer，s disease))也會(huì)引起纖維化.瀑露于 放射(電離放射，頻繁使用于醫(yī)學(xué)治療)也是眾所周知的肺纖維化起罔，其還是 風(fēng)濕病/結(jié)締組織病(例如硬皮病、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、混合性結(jié)締組織病、系統(tǒng)性紅 斑狼瘡)的有關(guān)原罔.在以下疾病中也可見(jiàn)到纖維化肺腎綜合征(即Wegner 或Goodpasture病癥)；結(jié)節(jié)病和其他肉芽胂性疾病(例如鈹中毒)；系統(tǒng)性疾 病，如丙型肝炎；炎癥性腸道疾病；獲得性免疫缺陷綜合征；特發(fā)性或罕見(jiàn)性 DPLDs，如COP(特發(fā)性)、肺郎格漢斯細(xì)胞組織細(xì)胞增生癥(罕見(jiàn))、嗜酸細(xì) 胞性肺炎.另外，纖維化可見(jiàn)于家族性IPF或結(jié)節(jié)病、結(jié)節(jié)性硬化癥、神經(jīng)纖維 瘤、Niemann-Pick病、Gaucher病和Hermansky-Pudlak綜合癥*
可使用本發(fā)明的治療性干預(yù)的另一領(lǐng)域?yàn)楦鞣N腫瘤治療引起的纖維化.例如， 本發(fā)明的治療方法可成為放射腫瘤治療方案的輔助治療方法.放射誘發(fā)的肺炎和 隨后的肺纖維化;lii射治療的副作用，其影響了放射治療的效果，典型的例子是, 在腫瘤治療中，放療的施用刑量為20-85gray.但是，對(duì)病人的研究已表明，當(dāng)放 射劑量增加時(shí)，肺葉炎形式的肺毒性幾乎與之呈線性關(guān)系.隨后還見(jiàn)到纖維化損
和/或活性的藥刑，將改善放療誘發(fā)的肺葉炎和/或放療誘發(fā)的肺纖維化的發(fā)展或 進(jìn)展.在某些實(shí)施方案中，預(yù)期本發(fā)明降低CCL19和/或CCL21的存在量或活性
的治療法可在放射治療之前和/或之后施用，以及/或與放療同時(shí)施用.在某些實(shí)
例中，優(yōu)選在實(shí)施放療后的l、 2、 3、 4或5天內(nèi)施用這樣的藥刑.
已被證明導(dǎo)致明顯的肺纖維化的另一種癌癥治療是在施用砥酸博來(lái)審素時(shí) 出現(xiàn)藥物誘發(fā)的纖維化.博來(lái)審素沉積在皮膚和肺部而引起纖維化.雖然有人建 議停止用藥并給予皮質(zhì)類固醇，但是對(duì)博來(lái)莓素引起的肺損傷的治療未見(jiàn)說(shuō)明. 預(yù)期本發(fā)明降低CCL19和/或CCL21的存在量或活性的治療法可在給與砥酸博來(lái) 莓素之前、和/或之后，和/或同時(shí)施用.施用降低CCL19和/或CCL21的存在量 或活性的藥刑將有效降低接受疏酸博來(lái)霧素的病人的肺纖維化發(fā)生或發(fā)展.
雖然將疏酸博萊霧素描迷為導(dǎo)致肺纖維化的示例性藥刑，但是其他藥物也可 誘發(fā)肺病，近年來(lái)這已經(jīng)成為大家關(guān)注的一個(gè)領(lǐng)域.1972年公認(rèn)可引起肺病的藥 物只有19種.2001年的一篇文獻(xiàn)綜述指出，至少有150種藥物已被顯示能導(dǎo)致 肺病，這一名單還在增加中.這其中，已知纖維化可由以下藥物引起細(xì)胞毒刑， 如博來(lái)審素、白消安、甲氦蝶呤；抗生素，如呋喃妥因、柳氮磺吡啶；抗心律不 齊藥，如胺碘S^、妥卡尼；消炎藥，如黃金、青審胺；違禁藥，如快克可卡因、 海洛因.具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法和組合物可用于治療以下藥物引起的纖 維化兩性審素B、博來(lái)審素、溴麥角隱亭、白消安、卡馬西平、苯丁酸氮芥、 可卡因、環(huán)褲酰胺、苯妥英、麥角胺、象卡尼、海洛因、美法侖、美沙頃、甲承 蝶呤、哌甲酯、美西麥角、礦物油、呋喃妥罔、亞硝基脲類、丙卡巴肼、硅頃、 柳氮磺吡啶、妥卡尼和長(zhǎng)春花生物堿類藥刑，包括絲裂審素和抗微生物刑.已這 意到亞硝基脲類(如卡莫司汀、洛莫司汀和司莫司汀)，尤其卡莫司汀的使用， 高達(dá)25%的接受卡莫司汀的病人發(fā)生早發(fā)型(在卡莫司汀治療開(kāi)始后36個(gè)月內(nèi)) 肺纖維化.
術(shù)語(yǔ)"受試者"和"病人"是指哺乳動(dòng)物或非哺乳動(dòng)物物種的一個(gè)或多個(gè)威 員，其可對(duì)本文所述的制藥方法、組合物和治療存在需要.罔此，受試者和病入 包括但不限于靈長(zhǎng)類(包括人)、犬科、貓科、有蹄類(如馬科、?？啤⒇i科(例 如豬))、禽類，以及其受試者.特別感興趣的是人和具有商業(yè)重要性的非人勁 物(例如家畜和馴養(yǎng)動(dòng)物)."哺乳動(dòng)物"是指任何哺乳物種的一個(gè)或多個(gè)成員， 舉例來(lái)說(shuō)，包括犬科、貓科、馬科、?？?、綿羊科、嚙齒目等，以及靈長(zhǎng)類(尤 其是人類).非人動(dòng)物棋型，尤其哺乳動(dòng)物(例如靈長(zhǎng)類、鼠科、兔類等)可用 于實(shí)驗(yàn)性研究.含有一種或多種抑制CCL21和/或CCL19的活性、表達(dá)和數(shù)量的藥劑的組會(huì) 物可用于抑制不恰當(dāng)位置、纖維化病癥、慢性炎癥等中的纖維化.這樣的組合啦 可局部施用于纖維化損害位點(diǎn)，或者可全身施用.此外，這種旨在減少、抑止、 抑制或其它方式消除CCL21和/或CCL19的活性/效果的組合物可以單獨(dú)施用或 者與其他可用于治療纖維化疾病的藥劑聯(lián)合施用.這些其他組合物可例如包括皮 質(zhì)類固醇和其他抗炎藥，強(qiáng)的松、疏唑噪呤以及IFN"Y細(xì)胞因子治療也是有益的. 特別預(yù)期這些組合物與抗CCL21/抗CCL19組合物的組合.以前提出單獨(dú)使用免 疫抑制劑和皮質(zhì)類固醇足以治療肺纖維化，但是現(xiàn)在公認(rèn)聯(lián)合皮質(zhì)類閨醇的免疾 抑制治療對(duì)于治療該疾病是無(wú)效的，罔為這種干預(yù)不僅對(duì)于改變疾病的m無(wú)效， 其也沒(méi)有使存活預(yù)后有任何提高.肺纖維化受試者的預(yù)后為，當(dāng)缺少手術(shù)干預(yù)時(shí)， 該疾病是致命的.這樣，這些病人唯一的選擇就是肺移植.因此，第一項(xiàng)發(fā)明的 組合物和方法與現(xiàn)有治療方法相比是一項(xiàng)重大的進(jìn)步，因?yàn)樗鼈兲峁┝四軌蜃柚?或減緩該疾病的發(fā)展/進(jìn)展的治療方案.
具體實(shí)施方案中，含有抗CCL21抗體的組合物可用來(lái)降低靶位置中CCL21 的濃度.降低人體中CCL21和CCL19所需的刑量推測(cè)在較低的微克范閨.例如， 可以使用5-40 pg/kg大約刑量范閨的抗體.理想的是，這些抗體將在5-10 pg/kg 的較低劑量范閨內(nèi)發(fā)揮作用.
IL-12、層粘連蛋白-1、交聯(lián)IgG和IgG聚集體已經(jīng)顯示出抑制單核細(xì)胞分化 成纖維細(xì)胞(美國(guó)專利申請(qǐng)No. 20050238620).這些組合物可用于本文所討論的 組合中.
在本治療方法中，可施用于靶位置的所述組合物可來(lái)自外源性來(lái)源，或者它 們由靶位置中的細(xì)胞或與靶位置相同的器官(organism)中的細(xì)胞在體內(nèi)產(chǎn)生. 這些組合物可從捐贈(zèng)的人體組織(包括體液)中分離.也可以在細(xì)菌、組織培養(yǎng)
蛋白，它們也可以合成制備，或通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何其他方法來(lái)制備.如果這 些組合物在體內(nèi)制備，則它們可以是轉(zhuǎn)基因的表達(dá)產(chǎn)物，或者它們可得自存在于 體內(nèi)的來(lái)源的生產(chǎn)增強(qiáng)，如果這些組合物正常存在于靶位置，則也可以通過(guò)降仳 其正常的降解速率來(lái)提高其濃度.另外，例如通過(guò)供應(yīng)輔助因子，也可能增強(qiáng)這 些組分對(duì)纖維細(xì)胞分化的抑制能力.
雖然以IIP作為纖維化疾病的例子來(lái)說(shuō)明本發(fā)明方法，但是應(yīng)理解，這種疾
病是用作其他纖維化疾病的范例.根據(jù)本文的教導(dǎo)，本領(lǐng)域技術(shù)人員將意識(shí)到， 可被治療的其它疾病包括其中希望抑制纖維化的任何疾病，從而，本發(fā)明的方法
涉及由這樣的病癥引起的纖維化，其包括但不限于硬皮病；瘢痕疙瘩；風(fēng)濕性關(guān) 節(jié)炎；狼瘡；腎源性纖維化皮膚??；纖維化損害，例如日本血吸蟲(chóng)感染后形成的 損害；自身免疫疾病；致病性纖維化；萊姆病；胰腺炎中的基質(zhì)重塑和基質(zhì)纖維 化；哮喘；特發(fā)性肺纖維化；慢性阻塞性肺?。环卫w維化；子宮肌瘤；印巢纖維 化；其他纖維囊性形成物；角膜纖維化或其他眼部纖維化，例如角膜屈光手術(shù)引 起的纖維化；以及充血性心力襲竭和其他缺血后遣癥引起的纖維化；術(shù)后結(jié)疙， 包括腹部粘連；開(kāi)角型青光眼小梁切除.某些這樣的纖維化疾病中，纖維細(xì)胞可 能不代表纖維化的最后階段，例如，在津喘中，纖維細(xì)胞進(jìn)一步分化為成肌纖維 細(xì)胞，后者持續(xù)存在于變厚的氣道壁中.對(duì)于治療，應(yīng)了解纖維化疾病癥狀的任 何改善都是有益效果，并應(yīng)視為治療的證據(jù).罔此，病癥或疾病的"治療(treating or treatment)"包括(1 )預(yù)防所述病癥的至少一種癥狀，即使哺乳動(dòng)物的臨 床癥狀沒(méi)有明顯發(fā)展，所述哺乳動(dòng)物可能暴露于疾病或有疾病先兆，但是尚未經(jīng) 歷疾病或表現(xiàn)疾病的癥狀；(2)抑制疾病，即阻滯或減援疾病或其征狀的發(fā)展； 或(3)減輕疾病，即使疾病或其臨床癥狀好轉(zhuǎn).這里所說(shuō)的治療、預(yù)防和改善病 癥例如包括減輕或根除與纖維化疾病有關(guān)的有毒或有害狀況.這類治療的例子包 括減輕細(xì)菌感染、增強(qiáng)肺功能、對(duì)促炎細(xì)胞因子進(jìn)行降調(diào)節(jié)，以及對(duì)單核細(xì)胞 聚集的升調(diào)節(jié).
具體實(shí)施方案中，可通過(guò)施用抑制或其它形式降低CCL21和/或CCL19的作 用的藥劑來(lái)治療肺纖維化或其他肺纖維化疾病.治療可減慢與纖維化有關(guān)的細(xì)胞 生長(zhǎng)，也減少膠原沉積，治療可防止進(jìn)一步纖維化，或咸小現(xiàn)有纖維化的影響. 藥刑可以任何刑量給予，且為任何刑型，只要能夠減輕病人的疾病的至少一種癥 狀.可以每隔一天靜脈給藥，并且持續(xù)選定的時(shí)期.這種刑量、給藥方法和給藥 時(shí)間表對(duì)于治療其他纖維化疾病也是有用的.劑量、刑型和給藥方式可以用疾病 的動(dòng)物模型加以優(yōu)化.
下面提供的例子中給出用于肺纖維化的示例性模型.但是，本領(lǐng)域技術(shù)人員 會(huì)意識(shí)到這種纖維化疾病的其他模型.例如，在美國(guó)專利No. 20050238620中， 通過(guò)向其肺中注射博來(lái)審素，誘發(fā)大鼠(Sprague Dawley，含手術(shù)植入頸靜脈導(dǎo) 管，Charles River Laboratories, Wilmington, Mass)肺纖維化，博來(lái)莓素是一
種抗腫瘤藥，注入動(dòng)物氣道時(shí)導(dǎo)致肺部纖維化.這是研究肺纖維化的標(biāo)準(zhǔn)方法
(Crouch, E. 1990. Pathobiology of pulmonary fibrosis. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 259:L159-L184).在此類方法中，為了誘發(fā)纖維化，對(duì)大鼠進(jìn)行麻 醉和監(jiān)控，以保證獲得并維持合適的麻醉手術(shù)平面.翔部腹側(cè)剃毛、消毒，準(zhǔn)備 進(jìn)行切口手術(shù).在頸部腹側(cè)做一個(gè)垂直中線切口，縮回頸部肌肉，暴露氣管.取 300 pi 3.3 U/ml (1個(gè)單位)博來(lái)審素(Calbiochem/EMD Biosciences. San Diego， Calif.)的0.9%生理鹽水無(wú)菌溶液，用注射器和26號(hào)針頭注入氣管腔內(nèi).對(duì)照組 大鼠注入生理鹽水.縫合2-3針閉合切口，該操作按照Underwood等人的方法進(jìn) 行(2000, SB 239063， a p38 MAPK inhibitor, reduces neutrophilia, inflammatory cytokines, MMP-9, and fibrosis in lung. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 279:L895-L902.).在該搮作期間以及手術(shù)后，動(dòng)物被安置于加熱燈下， 一旦其 完全恢復(fù)就放回籠內(nèi).在該搮作過(guò)程中，對(duì)動(dòng)物進(jìn)行檢查，以保證其i)呼吸規(guī) 律，ii)耳朵和粘膜呈粉紅色，Hi)捏其腳趾不縮腳，iv)眼睛或眼瞼受觸碰不眨 眼.
為了試驗(yàn)抗CCL21組合物的效果，經(jīng)由銷售者植入的頸靜脈導(dǎo)管對(duì)纖維化 模型靜脈注射抗CCL21組合物.該組合物可以有利地用生理鹽水(0.9%NaCl) 配制，使用前通過(guò)0.2pm過(guò)濾器.
用于本發(fā)明方法的特別優(yōu)選的抗CCL21組合物是與CCL21產(chǎn)生免疫反應(yīng)的 抗體.優(yōu)選地，此類抗體是只與CCL21及其變異體產(chǎn)生免疫反應(yīng)而對(duì)不與其它 趨化罔子反應(yīng)的單克隆抗體.優(yōu)選該抗CCL21抗體為配制用于對(duì)人被試者施用 的人源化抗體.本領(lǐng)域技術(shù)人員對(duì)用于研究目的的抗CCL21抗體非常了解.例 如，R&D Systems ( Minneapolis, MN )有一種可得商品制劑BAF457,這是一種 小鼠重組抗CCL21抗體，由大腸桿菌產(chǎn)生，可以用于本發(fā)明.P印roTech.( Rocky 訓(xùn)l， NJ )也有抗CCL21單克隆抗體，Abeam ( Cambridge, U.K., and Cambridge MA， USA)有與CCL21產(chǎn)生免疫反應(yīng)的多克隆抗體(例如山羊抗CCL21多克隆 產(chǎn)品abl0350和abl0364),其可以很容易地用于再現(xiàn)實(shí)驗(yàn)，以顯示在模型動(dòng)物 中抑制CCL21的作用可改善纖維化.
由于本領(lǐng)域中很容易獲得鼠科和山羊抗CCL21單克隆抗體，預(yù)期此類抗體 可以容易地作為"模板"用于制備相同單抗的人版本(human version)，用于人 體治療，例如，預(yù)期可使用噬菌體呈現(xiàn)法來(lái)構(gòu)建(device)能用于本發(fā)明治療方
法的全長(zhǎng)抗體或抗體片段.其它實(shí)施方案中，有可能制備全長(zhǎng)人源化小鼠或山羊
重鏈或輕鏈免疫球蛋白，其含有人恒定區(qū)、小鼠或山羊CDRs以及具有許多"人 源化"改造氨基酸的實(shí)質(zhì)小鼠或山羊構(gòu)架，由此將降低此類種抗體對(duì)人類受試者 施用時(shí)發(fā)生不良反應(yīng)的可能性，許多實(shí)施方案中，"人源化抗體"是含有人源化 可變輕鏈和/或人源化可變重鏈的抗體，通過(guò)"人源化"過(guò)程已經(jīng)被"人源化"了 的修飾抗體與抗原(與提供CDRs的母抗體所結(jié)合的抗原相同)結(jié)合，且與母抗 體相比，其通常對(duì)人體的免疫原性較小.當(dāng)然，以上關(guān)于抗CCL21抗體的描述 也適用于CCL19,后者的抗體在本領(lǐng)域也是可得的.
應(yīng)理解，這里所使用的抗體可以含有Fc域，也可以不含F(xiàn)c域.在一些實(shí)施 方案中，多價(jià)抗體可用作治療性組合物."多價(jià)抗體"是指含有針對(duì)多個(gè)表位的 結(jié)合域的重組抗體樣分子，例如，同時(shí)與CCL21和CCL19結(jié)合的多價(jià)抗體可被 認(rèn)為對(duì)于治療纖維化特別有用.在其他治療性組合物中，抗體衍生蛋白包括其中 抗體Fab鏈已與結(jié)合域融合的分子，例如Fab-scFv 二體(bibodies )或三體 (tribodies).這些分子是有用的中等重量的不含F(xiàn)c部分的重組雙特異性抗體. 產(chǎn)生缺乏Fc域的抗體是有利的，因?yàn)楫?dāng)抗體相關(guān)的治療分子上存在該域時(shí)，該分 子趨于延長(zhǎng)其在血清中的保留時(shí)間，以防止其在肝臟中代謝，該分子還可能通過(guò) 其與Fc受體的相互作用而與其它細(xì)胞發(fā)生交聯(lián)，從而因全身觸發(fā)(systemic triggering)免疫效應(yīng)細(xì)胞而產(chǎn)生毒性副作用.因此，某些抗體相關(guān)的治療性分子 缺乏Fc域.本領(lǐng)域技術(shù)人員知道構(gòu)建這類抗體相關(guān)分子的方法.例如，為了有效 產(chǎn)生多特異性抗體，可以由抗體衍生的結(jié)構(gòu)單元(例如Fc、 (Fab，)2、 Fab、 scFv 和雙體(diabody))與異源二聚模體的組合來(lái)制備重組抗體，
除抗體之外，預(yù)期設(shè)計(jì)為抗CCL21和/或CCL19的siRNA分子也將是治療 纖維化疾病的有用組合物，本領(lǐng)域技術(shù)人貝熟知，通過(guò)稱為RNA干擾(RNAi ) 的過(guò)程，雙鏈RNA(dsRNA)可在許多有機(jī)體中引起序列特異性轉(zhuǎn)錄后基因沉默. 最近的研究表明，RNA片段是RNAi的序列特異性介質(zhì)(Elbashir et al.， Nature, 411,494,2001),通過(guò)這些小干擾RNA (siRNA)對(duì)基罔表達(dá)的干擾現(xiàn)在被認(rèn)為 是使線蟲(chóng)、果蠅、植物以及小鼠的胚胎干細(xì)胞、卵母細(xì)胞和早期胚胎中的基因沉 默的天然策略(Cogoni et al.， Antonie Van Leeuwetihoek， 65， 205， 1994; Bau，combe， Plant Mol. Biol" 32， 79， 1996; Kennerde，l， CeH， 95， 1017 1998; Timmons， Nature, 395， 854， 1998; Waterhouse et al" Proc. Na". Acad. Sci. U.S.A.
95， 13959, 1998; Wia呵and Zemicka-Goetz， Nat. Cell Biol" 2， 70， 2000; Yang et al*， Mol， Cell Biol" 21， 7807， 2001j Svoboda et al" Development, 127， 4147 2000 ) 在哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物中，通過(guò)用合成RNA寡核苷酸轉(zhuǎn)染細(xì)胞，已實(shí)現(xiàn)siRNA 介導(dǎo)降低基因表達(dá)(Caplan et al" Proc. Na". Acad. Sci. U.S.A., 98， 9742， 2001; Elbashir et al.， Nature, 411， 494， 2001 ).
典型地，為了實(shí)現(xiàn)治療性siRNA的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，構(gòu)建含有發(fā)夾序列(例如 21-bp發(fā)夾)的RNA分子，所述發(fā)夾序列代表定向?qū)垢信d趣基因的序列(本案 中為CCL21基因和/或CCL19基罔.將SiRNA或編碼該siRNA的DNA序列導(dǎo) 入把細(xì)胞中，例如在纖維化損害位點(diǎn)產(chǎn)生CCL21的細(xì)胞.siRNA降低目標(biāo)inRNA 和該試刑的基因蛋白表達(dá).使用組織特異性啟動(dòng)子將獲得治療性siRNA分子的有 益的組織特異性靶標(biāo).編碼治療性siRNA的構(gòu)建物具有這樣的構(gòu)型，以致啟動(dòng)子 與發(fā)夾緊密相鄰.根據(jù)是否需要可誘導(dǎo)的，組織或細(xì)胞特異性表達(dá)siRNA,從本 領(lǐng)城已知的容易得到的啟動(dòng)子中選擇用于具體構(gòu)建物的啟動(dòng)子.例如通過(guò)注射將 該構(gòu)建物導(dǎo)入靶細(xì)胞，使細(xì)胞中靶基因表達(dá)減小.
因此，在示例性實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含表達(dá)盒的栽體(即在重組基 因表達(dá)和/或送遞中通常使用的病毒栽體，例如腺病毒栽體、慢病毒栽體、腺伴隨 病毒(AAV)栽體、逆轉(zhuǎn)錄病毒栽體、脊鏈灰質(zhì)炎病毒栽體、單純皰務(wù)病毒(HSV) 栽體或鼠Maloney-based病毒栽體等)，其中表達(dá)盒包含分離的編碼靶向抗CCL21 的小干擾RNA分子(siRNA)的核酸序列.CCL21的核酸結(jié)構(gòu)為本領(lǐng)域技術(shù)人 員所熟知，CCL19的結(jié)構(gòu)也一樣，參見(jiàn)例如Genbank Accession No. AB002409, 其記栽了人CCL21的mRNA序列；Genbank Accession No. NM_006274，其記栽 了人CCL21的mRNA序列，恒河猴的CCL21記栽于Genbank Accession No. NM_001032855，在提出本申請(qǐng)時(shí)，豬、小鼠和狗的序列也可在Genbank得到. 這些序列都可以制備，且可將siRNA設(shè)計(jì)為對(duì)抗確定為CCL21的功能表達(dá)重要 的那些分子區(qū)域(注意相關(guān)蛋白質(zhì)的序列公開(kāi)可用于制備相同蛋白質(zhì)的重組抗 體及產(chǎn)生其抗體).該siRNA可靶向于沿該核酸序列的任意10-30個(gè)相鄰核酸片 段，特別有用的是對(duì)趨化因子的功能表達(dá)有重要的那個(gè)序列.siRNA可形成含有 雙鏈體結(jié)構(gòu)和環(huán)(loop)結(jié)構(gòu)的發(fā)夾結(jié)構(gòu).環(huán)結(jié)構(gòu)可含有4-10個(gè)核苷酸，例如4 個(gè)、5個(gè)或6個(gè)核普酸.雙鏈體的長(zhǎng)度優(yōu)選小于30個(gè)核苷酸，例如19-25個(gè)核普 酸.siRNA可進(jìn)一步包含突出區(qū)(overhang region ).這種突出可以是3，突出區(qū)、
5，突出區(qū)或3，和5，同時(shí)突出區(qū)，突出區(qū)可以是例如長(zhǎng)度為1-6個(gè)核苷酸.表達(dá)盒 可進(jìn)一步包含啟動(dòng)子.啟動(dòng)子的例子包括可調(diào)控啟動(dòng)子(regulataWe promoters 〕 和組成型啟動(dòng)子.例如，啟動(dòng)子可以為CMV、 RSV或polIH啟動(dòng)子.表達(dá)盒可 進(jìn)一步含有聚腺苷酸化信號(hào)，例如合成的最小聚腺苷酸化信號(hào).核酸序列可進(jìn)一 步含有標(biāo)記基因.
當(dāng)然，除了定向抗CCL21和/或CCL19的組合物外，所述組合物還可以定向 抗CCR7 (這些趁化因子的受體)的組合物.此外，特別預(yù)期聯(lián)合治療，其中注
法聯(lián)合使用.特別預(yù)期的其他具體聯(lián)合治療為其中基于降低纖維化疾病中CCL21 活性的治療方法與已有的纖維化治療的聯(lián)合的那些治療.例如，目前已經(jīng)證明單
用可有效改善肺纖維化.臨床項(xiàng)目在波生坦(bosentan) ( Tracker )對(duì)于特發(fā)
果.疏唑噪呤在纖維化疾病中對(duì)于穩(wěn)定肺功能和改善癥狀也發(fā)揮作用.細(xì)胞閎子
(IFN-Y)治療對(duì)于纖維化疾病也是一種有用的治療方法.為了減輕、消除或其它 形式中止纖維化癥狀，可將任何此類組合物與基于抗CCL21的治療和/或基于抗 CCL19的治療聯(lián)合使用(注意"基于抗CCL21"或"基于抗CCL19"的治療既 指抗體治療，又指使用siRNA分子的治療).
不管抗體是在動(dòng)物體內(nèi)對(duì)抗具體的抗原而產(chǎn)生的，或是通過(guò)噬菌體呈現(xiàn)法和 抗體工程技術(shù)制備的嵌合抗體，此類抗體將最終被配制成用于治療纖維化疾病的 藥物制刑.同樣，siRNA組合物最終也將被配制成用于治療纖維化疾病的組合物. 局部遞送這些組合物是優(yōu)選的，但是預(yù)期全身遞送也是可能的，
按照本發(fā)明，用于施用的藥物組合物可以包含前面討論的任何基于抗CCL21 和/或抗CCL19的組合物.該藥物組合物還包括另一種用于治療表面活性物質(zhì)代 謝紊亂的藥劑，例如支氣管擴(kuò)張藥，特別是當(dāng)病人表現(xiàn)出氣道反應(yīng)性跡象時(shí)；以 及溶軲液劑，如乙酰半胱氨酸、胰蛋白醉和氨溴索和/或GM-CSF;皮質(zhì)類閨醉和 其他抗炎藥物，在某些方面，這些制刑中的每一種以藥學(xué)上可接受的形式提供， 任選與藥學(xué)上可接受的栽體組合.可通過(guò)達(dá)到其預(yù)期目的的任何方法施用這些組 合物.使用本發(fā)明方法施用用于抑制、消除等纖維化損害處的CCL21或CCL19 的作用的組合物的個(gè)體化劑量和方案可以很容易地由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通過(guò)試
驗(yàn)來(lái)確定，所述試驗(yàn)用于疾病的診斷以及測(cè)定給定治療性干擾產(chǎn)生的效果水平.
在IIP的治療中，可以很容易地對(duì)先前用于治療肺病的任何規(guī)程、刑型、紿 藥途徑等等進(jìn)行修改，用于本發(fā)明.在一些實(shí)施方案中，當(dāng)呼吸短促特別嚴(yán)重時(shí)，
可進(jìn)行機(jī)械通氣.這種通氣包括高頻振蕩通氣(HFOV)或其他非常規(guī)形式的枳 械通氣.
本發(fā)明范圍內(nèi)的組合物包括包含至少一種用于降低CCL21效應(yīng)或活性的藥 刑的所有組合物，所迷藥刑的用量為有效達(dá)到其降低、抑制、預(yù)防或減少CCL2
活性目的(例如減少或降低纖維化病變損害位點(diǎn)處的成纖維細(xì)胞的數(shù)量)的量. 在某些方面，這種治療將緩解IIP的一種或多種癥狀.
其它方面中，通過(guò)吸入或口服給與本發(fā)明使用的組合物.
應(yīng)理解，按照本發(fā)明的組合物的適當(dāng)劑量將取決于接受者的年齡、健康狀況 和體重，以及同時(shí)進(jìn)行的治療(如果有的話)類型、治療頻率和想要的效果性質(zhì). 但是，如本領(lǐng)域技術(shù)人員無(wú)需進(jìn)行過(guò)度的試驗(yàn)，就能夠理解并能確定的，針對(duì)各 別受試者對(duì)刑量進(jìn)行調(diào)整.這一般包括對(duì)標(biāo)準(zhǔn)劑量的調(diào)整，例如如果病人是低侔 重，則減小劑量，
治療劑的總刑量可以多刑量或單刑量形式給與，在某些實(shí)施方案中，單獨(dú)施 用所述組合物，在其它實(shí)施方案中，所迷組合物與其它針對(duì)該疾病或針對(duì)它的其 他癥狀的治療結(jié)合施用.
在某些方面，將本發(fā)明的組合物配制成適當(dāng)?shù)乃幬锝M合物，即，適合在纖維 化疾病的治療性干預(yù)中進(jìn)行體內(nèi)施用的劑型. 一般地，這需要制備基本不含熱原 以及可對(duì)人體或動(dòng)物有害的其他雜質(zhì)的組合物.在某些方面，制備這些組合物用 于直接對(duì)肺施用.這些制刑借助吸入器進(jìn)行口服，但是，預(yù)期其他的給藥途徑(例 如注射等)，從CCL21在IIP成纖維細(xì)胞中高度表達(dá)但在正常成纖維細(xì)胞或其他 組織中并非如此的發(fā)現(xiàn)可以得出結(jié)論，這種趨化罔子的主要位點(diǎn)整體涉及于纖維 化損害的形成，這在HP中似乎特別真實(shí).這樣，預(yù)期促使這些組合物容易施用 于肺組織的制刑和給藥途徑將特別有用.
人們通常希望使用適當(dāng)?shù)柠}和緩沖液以使所述組合物保持穩(wěn)定，且允許在靶 位點(diǎn)被攝入.通常本發(fā)明的蛋白質(zhì)組合物以凍干形式提供，施用前進(jìn)行重構(gòu).或 者，可能將這些組合物配制成片刑或其他口服遞藥的刑型.用于重構(gòu)治療刑的鍵 沖液或溶液可與藥物制刑一起提供，以產(chǎn)生本發(fā)明的水性組合物，用于施用.A
類水性組合物將包含有效量的被使用、溶解或分散于藥學(xué)上可接受的栽體或水性
介質(zhì)中的各種治療刑.此類組合物也稱為接種體(inocula).本文所用的"藥學(xué) 上可接受的"指對(duì)人體或動(dòng)物施用時(shí)不產(chǎn)生不良反應(yīng)、過(guò)敏反應(yīng)或其他不利反應(yīng) 的分子實(shí)體和組合物.本文所用的"藥學(xué)上可接受的栽體"包括任意和所有的容 劑、分散介質(zhì)、包衣、抗菌劑和抗真菌劑、等滲刑和吸收延遲劑等等.對(duì)藥物活 性物質(zhì)使用此類介質(zhì)和藥刑為本領(lǐng)域所熟知.除了與這些治療性組合物不相容的 常規(guī)介質(zhì)或藥劑之外，預(yù)期其在治療性組合物中的使用，補(bǔ)充活性組合物也并入 這些組合物.
配制蛋白質(zhì)和核酸用于治療給藥的方法也為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知.可通過(guò)任 何常用途徑施用按照本發(fā)明的這些組合物，只要通過(guò)該途徑能夠到達(dá)靶組織.最 常用的是，將這些組合物配制成口服給藥的制劑，例如由吸入器吸入.但是，也 可使用其他常規(guī)給藥途徑(尤其當(dāng)口服給藥有問(wèn)題時(shí))，例如通過(guò)皮下、靜脈內(nèi)、 皮內(nèi)、肌肉內(nèi)、乳內(nèi)、腹腔內(nèi)、鞘內(nèi)、眼內(nèi)、眼球后、肺內(nèi)(例如定期釋放)、 氣霧劑、舌下、鼻腔、肛門、陰道或透皮給藥，或通過(guò)在特定位點(diǎn)的手術(shù)植入. 治療可為單劑量，也可為一段時(shí)間內(nèi)的多次給藥.
在某些實(shí)施方案中，將用于施用的活性化合物制備成游離減或藥學(xué)上可接受 的鹽的水溶液，與表面活性劑(如羥丙基纖維素)適當(dāng)混合.也可在甘油、液體 聚乙二醇及其混合物和油中制備分散體(dispersion),在普通的儲(chǔ)存和使用條件 下，這些制劑含有防腐刑以防止微生物的生長(zhǎng).
適合于注射使用的藥物刑型包括無(wú)菌水溶液或分散體，以及可即時(shí)配制成無(wú) 菌注射溶液或分散體的無(wú)菌粉末.在所有情況下，刑型都必須無(wú)菌，且必須有良 好的流動(dòng)性，易于注射.其在生產(chǎn)和儲(chǔ)存條件下必須穩(wěn)定，并必須不受到微生物 (例如細(xì)菌和真菌)的污染影響，在某些方面，栽體為溶劑或含有諸如水、乙醇、 多元醇(例如甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等)、其適當(dāng)?shù)幕旌衔镆约爸参镉偷?分散介質(zhì).通過(guò)以下方法保持適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性例如使用包衣(例如卵磷脂)；對(duì) 于分散體，保持所需的粒度；以及使用表面活性刑.通過(guò)各種抗菌刑和抗真菌刑 來(lái)防止微生物的作用，所述抗菌刑和抗真菌劑例如為對(duì)輕基苯甲酸酯、氟丁醇、 苯酚、山梨酸、硫柳汞等.在許多情況下，優(yōu)選包含等滲劑，例如糖或氯化鈉. 在藥刑組合物中使用延遲吸收刑(例如硬脂酸鋁和明膠)，延長(zhǎng)注射組合物的吸 收， 通過(guò)以下方法制備無(wú)菌注射溶液:將所需量的活性化合物混入的適當(dāng)溶劑(按 需要含有以上列舉的各種其他成分)中，然后過(guò)濾滅菌.通常，通過(guò)在無(wú)菌賦形 刑中混入各種經(jīng)過(guò)滅菌的活性成分制備分散體，所迷無(wú)菌賦形劑中含有基礎(chǔ)分散 介質(zhì)和以上列舉的其他需要的成分，就用于制備無(wú)菌注射溶液的無(wú)菌粉末而言， 其制備方法是真空干燥和冷凍干燥技術(shù)，由預(yù)先經(jīng)過(guò)無(wú)菌過(guò)濾的溶液得到活性成 分加上任何附加的所需成分的粉末.
本文所用的"藥學(xué)上可接受的栽體"包括任意和所有的容劑、分散介質(zhì)、包 衣、抗菌刑和抗真菌刑、等滲刑和吸收延遲刑等.對(duì)藥物活性物質(zhì)使用此類介質(zhì) 和藥刑為本領(lǐng)域所熟知.除了與這些活性成分不相容的常規(guī)介質(zhì)或藥刑之外，預(yù) 期其在治療性組合物中的使用.補(bǔ)充活性成分也并入這些組合物.
在某些方面，對(duì)中性或鹽形式的本發(fā)明組合物進(jìn)行配制.制藥學(xué)上可接受的 鹽包括酸加成鹽(與蛋白質(zhì)的游離氨基形成)以及與無(wú)機(jī)酸(例如鹽酸或鱗酸) 或有機(jī)酸(例如醋酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等)形成的鹽.與游離羧基形成的 鹽也可以來(lái)源于無(wú)機(jī)減(例如氨氣化鈉、氬氧化鐘、氬氣化銨、氳氧化鈣或氬氧 化鐵)以及有機(jī)械(例如異丙胺、三甲胺、組氨酸、普香卡因等).
對(duì)于制刑，溶液將以與劑量制刑(dosage formulation )相容的方式，并以治 療有效的量施用.各種劑型(例如注射溶液、釋藥膠囊等)的制刑容易施用.例 如，對(duì)于腸胃外給藥的水溶液，需要時(shí)對(duì)該溶液進(jìn)行適當(dāng)緩沖，并且首先用足量 的生理鹽水或葡萄糖使液體稀釋刑保持等滲，這些特殊的水溶液特別適于靜脈內(nèi)、 肌肉內(nèi)、皮下和腹腔內(nèi)給藥.
"單位劑量"定義為散于適當(dāng)栽體中的治療組合物的不連續(xù)量.在某些實(shí)施 方案中，治療性化合物的腸胃外給藥由推注開(kāi)始，然后進(jìn)行連續(xù)輸注，以維持藥 物產(chǎn)品的治療循環(huán)水平.本領(lǐng)域普通技術(shù)人員根據(jù)良好的醫(yī)療規(guī)范和病人的個(gè)體 情況將容易地優(yōu)化有效刑量和給藥方案.
給藥頻率將取決于藥劑的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)和給藥途徑.本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù) 給藥途徑和所需的劑量確定最佳的藥物制刑.此類制刑可能影響被施用藥物的物 理狀態(tài)、穩(wěn)定性、體內(nèi)釋放速率和體內(nèi)清除速率.根據(jù)給藥途徑，按體重、體表 面積或器官大小計(jì)算合適的刑量.動(dòng)物模型的有效性對(duì)于確定給定治療劑的合適 治療刑量特別有用.本領(lǐng)域普通技術(shù)人員無(wú)需經(jīng)過(guò)過(guò)度試驗(yàn)，可常規(guī)地對(duì)確定適 當(dāng)治療劑量所必需的計(jì)算進(jìn)行改進(jìn)，特別是根據(jù)劑量信息和本文揭示的分析方法， 以及在動(dòng)物或人體臨床試驗(yàn)中觀察到的藥代動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行改進(jìn)，
一般地，通過(guò)使用已經(jīng)建立的用于測(cè)定血藥濃度的分析方法結(jié)合相關(guān)的刑量 反應(yīng)數(shù)據(jù)來(lái)確定合適的劑量.最終的刑量方案由主治醫(yī)師考慮改變藥物作用的罔 素來(lái)確定，所述因素例如為藥物的比活度，損傷的嚴(yán)重程度以及病人的反應(yīng)性， 病人的年齡、身體狀況、體重、性別和飲食，任何感染的嚴(yán)重程度，給藥時(shí)間和 其他臨床因素.隨著研究的進(jìn)行，將披露有關(guān)具體疾病和病癥的合適刑量水平和 療程的進(jìn)一步信息.使用疾病模型(例如本文描述的那些嚙齒類動(dòng)物模型)可以 容易地優(yōu)化任何這樣的刑量.
應(yīng)了解，本發(fā)明的藥物組合物和治療方法有用于人藥和善藥領(lǐng)域.因此，被 治療的受試者是哺乳動(dòng)物，例如人或其他哺乳動(dòng)物.就善醫(yī)學(xué)而言，受試者的例
子包括農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物，包括母牛、綿羊、豬、馬和山羊；伴侶動(dòng)物，例如狗和貓；珍 奇動(dòng)物和/或動(dòng)物園動(dòng)物；實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物，包括小鼠、大鼠、兔、豚鼠、倉(cāng)鼠；以及 家禽，如雞、火雞、鴨子和鵝.
本發(fā)明還預(yù)期用于治療纖維化疾病的試刑盒.此類試劑盒包含至少一種笫一 組合物，其含有位于藥學(xué)上可接受的栽體中的上述基于抗CCL21和/或抗CCL19 的治療劑.另一種組分是用于治療該疾病的笫二治療刑連同適當(dāng)?shù)娜萜饕约坝糜?施用所述治療組合物的工具(vehicle).這種試劑盒可另外包含影響第一組合物 和笫二組合物遞送的溶液或援沖劑.這種試刑盒可進(jìn)一步包含導(dǎo)管、注射器或其 他遞藥裝置，用于遞送在本發(fā)明方法中使用的一種或多種組合物.這種試劑盒可 進(jìn)一步包含治療方法的施用方案的說(shuō)明書(shū).
實(shí)施例
以下實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的某些實(shí)施方案進(jìn)行說(shuō)明.本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解，在 實(shí)施例中揭示的技術(shù)遵循發(fā)明者發(fā)現(xiàn)的代表技術(shù)，以在本發(fā)明實(shí)踐中發(fā)揮良好作 用，因此被認(rèn)為構(gòu)成本發(fā)明實(shí)踐的某些方面，但是，根據(jù)本公開(kāi)內(nèi)容，本領(lǐng)城扭 術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識(shí)到，對(duì)所公開(kāi)的具體實(shí)施方案可做# 多變化，并仍能獲得相似的結(jié) 果，而不脫離本發(fā)明的精神和范囤.
實(shí)施例1:用于顯示CCR7在特發(fā)性間質(zhì)性肺炎中的作用的方法和材料 病人為疑患IIP者，根據(jù)臨床、生理學(xué)、放射影像學(xué)和病理學(xué)發(fā)現(xiàn)的匯編來(lái) 確定(Flaherty et al" Am, J, Med.， 110:278-282 (2001》Flaherty et al" Curr, Opir Pulm, Med.， 6:404-410 (2000》Kazerooni et al" AJR Am, J, Roentgenol.
169:977-983 (1997); American Thoracic Society, European Respiratory Society (ATS/ERS)， Am. J. Respir. Crit. Care Med.， 165:277-304 (2002)).之前，招入本 研究的病人沒(méi)人經(jīng)歷過(guò)活檢手術(shù)或接受過(guò)IIP治療.2000年5月至2004年8月， 進(jìn)行SLBs,作為密執(zhí)安大學(xué)專科研究中心(University of Michigan Specialized Center of Research )評(píng)價(jià)纖維化肺病病理生物學(xué)的一部分.從因肺癌而經(jīng)受過(guò)胸 切除術(shù)的病人的切除樣本遠(yuǎn)端邊緣(distant margins)獲得組織學(xué)正常的肺活檢， 無(wú)疾病的病理學(xué)跡象.在層流通風(fēng)櫥中用無(wú)菌技術(shù)單獨(dú)處理各個(gè)SLB，進(jìn)行分子、 蛋白質(zhì)和免疫組化分析(見(jiàn)下文).
由SLBs制備RNA和cDNA.將每份SLB中用于分子分析的部分速凍于液 氮中，并儲(chǔ)存于-280lC.對(duì)于RNA分離，將這些樣本在冰上解凍，在TRIzoIH 試刑(Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, California, USA )中進(jìn)行機(jī)械勻漿， 然后按生產(chǎn)商的說(shuō)明制備總RNA.隨后使用BRL逆轉(zhuǎn)錄試刑盒和oligo (dT) 12-18 引物將得自SLBs的純化RNA逆轉(zhuǎn)錄至cDNA中.擴(kuò)增緩沖液含有50mMKC,、 10 mM Tris/HCI (pH 8.3)和2.5 mM MgCI2,
基因陣列分析，如在先描述的，使用Super Array Inc (Bethesda， Maryland, USA)的Non-Rad GEArray基因陣列膜分析的人趨化罔子以及趁化罔子受體的 基因概況(profile)的變化(Choi et al" Am. J. Respir. Crit. Care Med.， 170:508-515 (2004)).由于3-褲酸甘油搭脫氬酶(GAPDH)在本研究分析的所 有SuperArrays中一致表達(dá)，罔此將其用作內(nèi)部陽(yáng)性對(duì)照.
實(shí)時(shí)TaqmanPCR分析，如在先描述的，通過(guò)實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄聚合醉鏈反應(yīng) (PCR)程序，使用ABI PRISM 7700序列檢測(cè)系統(tǒng)(Applied Biosystems， Foster City，CaH化rnia，USA)分析人CCR7、 CXCR4、 CCL19、 CCL21和CXCL12基 因在HP及正常邊緣SLBs中的表達(dá)(J(akubzick et al.， Am. J. Pathol" 162:1475-1486 (2003)).對(duì)來(lái)源于上、下肺葉SLBs的cDNAs分析趨化因子受體、 趨化因子和GAPDH (內(nèi)部對(duì)照)的表達(dá)，所用的所有引物和探針均購(gòu)自Applied Biosystems.在計(jì)算趨化罔子表達(dá)中的倍數(shù)變化之前，將趨化因子基因的表達(dá)歸 一化至GAPDH.通過(guò)將所有病人的基罔表達(dá)與正常邊緣腫瘤病人組的上肺葉或
下肺葉中所測(cè)定的基因表達(dá)進(jìn)行比較，計(jì)算細(xì)胞罔子基因表達(dá)中的倍數(shù)增加.
ELISA分析.使用標(biāo)準(zhǔn)的夾心酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA敗術(shù)(R&D Systems Minneapolis, Minnesota, USA )測(cè)定50 ml來(lái)自勻漿化IIP和正常邊緣SLBs的不
含細(xì)胞的上清液樣本中人CCL19、 CCL21和CXCL12的濃度.用重組人細(xì)胞因 子來(lái)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，由此推知樣本中的存在濃度.CCL19的檢測(cè)限制，如在先描 述的，用免疫組織化學(xué)的常規(guī)免疫化學(xué)技術(shù)測(cè)定SLBs中CCR7、 CXCR4、 CD45、 CD34和aSMA ( Jakubzick et al" J. Clin. Pathol" 57:477-486 (2004)) 使用下列 目標(biāo)抗體及其合適的同種型對(duì)照購(gòu)自BD Biosciences PharMingen ( San Diego: California, USA )的小鼠抗人CCR7抗體和小鼠IgMk;購(gòu)自R&D Systems的小 鼠抗人CXCR4和小鼠IgG2B;購(gòu)自Abeam ( Cambridge, Massachusetts, USA) 的小鼠抗人CD45、 CD34和1型膠原抗體；購(gòu)自R&D Systems的小鼠IgGl.使 用這些免疫組化技術(shù)對(duì)10名UIP病人、6名NSIP病人和5名RBILD病人的上 肺葉和下肺葉SLBs進(jìn)行分析.對(duì)5名病人的切除胂病的正常邊緣進(jìn)行分析.對(duì) 每份SLB的連續(xù)切片(5mm厚)進(jìn)行分析，在緊鄰的連續(xù)切片上實(shí)施CCR7與 其他抗原的共定位.
實(shí)施例2:顯示CCR7在特發(fā)性間質(zhì)性肺炎中的作用的結(jié)果 SuperArray分析在IIP和正常邊緣SLBs中的CCR7、 CXCR4、 CCL19、 CCL21和CXCL12轉(zhuǎn)錄物.用特異性SuperArray GEArray分析IIP和正常邊縴 SLBs中CCR7和CXCR4的存在，雖然這是一種定性而非定量技術(shù)，可將CCR7 (圖IA)和CXCR4 (困IB)的表達(dá)歸一化為GAPGH的表達(dá)，該兩種受體的數(shù) 值得到顯示.CCR7和CXCR4的最高相對(duì)表達(dá)見(jiàn)于來(lái)自UlP病人組(n-7)的上 肺葉和下肺葉活檢樣.對(duì)來(lái)自NSIP病人組(n=6) 、 RBILD病人組(n=6)和正 常邊緣(n=5)腫瘤病人組的下肺葉和上肺葉活檢樣進(jìn)行了類似的分析.雖然沒(méi) 有檢測(cè)到顯著的差異，總體上，兩種趁化因子受體的相對(duì)表達(dá)遵循以下疾病嚴(yán)重 性模式(disease severity pattern ) : UIP、 NSIP、 RBILD、正常邊緣.至今確定 的兩種CCR7配體為CCL19 (Yoshida et a，., J. Biol. Chern" 272:13803-13209
(1997) )和CCL21 ( Campbell et al"丄Cell Bio," 141:1053-1059 (1998)) CCL19 (或ELC、 exodus-3和CKb-U34)組成型表達(dá)于傳入淋巴內(nèi)皮以及淋巴結(jié)的T
細(xì)胞區(qū)域，由此說(shuō)明其在樹(shù)突狀細(xì)胞和T細(xì)胞向這些免疫位點(diǎn)的運(yùn)動(dòng)中起主要作 用(Sal，usto et al.， Eur. J. Immunol" 29:1617-1625 (1999)).同時(shí)進(jìn)行的研究表 明，CCL21 (或SLC、 exodus-2、 TCA-4和CKb-99)具有類似的功能和類似的 表達(dá)模式，但是，已經(jīng)在肺(Gunn et al" Proc, Natl. Acad, Sci. USA， 95:258-263
(1998) )和腎臟(Banas et al" J. Immunol" 168:4301-4307 (2002))中檢測(cè)到該兩
種趨化因子，說(shuō)明它們可能具有除免疫監(jiān)視之外的作用.CCL19的相對(duì)轉(zhuǎn)錄物表 達(dá)的分析揭示，這種CCR7配體在UIP上肺葉和下肺葉活檢樣中的量較高(困 2A).在NSIP和RBILD活檢樣中檢測(cè)到相似量的CCL19轉(zhuǎn)錄物，在正常邊緣 活檢樣中見(jiàn)到的量最低.但是，在IIP和正常邊緣活檢樣中沒(méi)有看到CCL21 (圖 2B)和CXCL12 (困2C)轉(zhuǎn)錄物表達(dá)的明確模式.
IIP和正常邊緣SLBs中的CCR7、 CXCR4、 CCX19、 CCL21和CXCL12轉(zhuǎn) 錄物表達(dá)的定量實(shí)時(shí)PCR分析，對(duì)四個(gè)病人組的上肺葉和下肺葉活檢樣的 Taqman實(shí)時(shí)PCR分析揭示，與正常邊緣肺瘤病人組(n-5 )的適當(dāng)活檢樣相比， UlP病人組(n-18)上肺葉和下肺葉SLBs中CCR7的轉(zhuǎn)錄物表達(dá)均明顯增加(困 3A ).與正常邊緣病人組的適當(dāng)肺葉相比，UIP上肺葉和下肺葉SLBs中平均CCR7 轉(zhuǎn)錄物值(transcript values)分別大約高146倍(SEM， 58)和675倍(SEM， 300).相比于UIP上肺葉活檢樣，UIP下肺葉活檢樣中檢測(cè)到的CCR7轉(zhuǎn)錄物 表達(dá)大約高5倍.與正常邊緣SLBs相比，NSIP上肺葉和下肺葉SLBs中平均CCR7 轉(zhuǎn)錄物值均增加4倍(SEM， 1).相對(duì)于正常邊緣SLBs，在RBILDSLBs中也 提高了平均CCR7轉(zhuǎn)錄物值上肺葉SLBs中增加36倍(SEM, 28)，下肺葉活 檢樣中增加4.4倍(SEM， 3.2). NSIP和RBILD的SLBs中CCR7轉(zhuǎn)錄物表達(dá) 相對(duì)于正常邊緣SLBs的增加不顯著.
這些發(fā)現(xiàn)是CCR7所特有的，罔為對(duì)CXCR4的Taqman PCR分析發(fā)現(xiàn)，IIP SLBs中的CXCR4轉(zhuǎn)錄物表達(dá)相對(duì)于正常邊緣SLBs沒(méi)有顯著增加(數(shù)據(jù)未顯示). 最后，在所檢查的IIP和正常邊緣腫瘤病人組中間，CCL19(數(shù)據(jù)未顯示)、CCL21 (困3B)和CXCL12 (數(shù)據(jù)未顯示)轉(zhuǎn)錄物表達(dá)未表現(xiàn)出或被檢測(cè)到清楚的模式 或顯著的差異.但是發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于正常邊緣腫瘤病人組，UIP病人組的上肺葉和 下肺葉活檢樣中CCL21轉(zhuǎn)錄物表達(dá)的増加最大(比正常邊緣SLB值高40倍以 上)，與NSIP的SLBs相比，RBILD上肺葉和下肺葉SLBs中的CCL21轉(zhuǎn)錄物 表達(dá)有較大增加.這些數(shù)據(jù)合起來(lái)表明CCR7轉(zhuǎn)錄物表達(dá)在DIP中大量增加， CCR7轉(zhuǎn)錄物表達(dá)的增加存在于稍輕度的HP.
IIP和正常邊緣SLBs中CCL19、 CCL21和CXCL12蛋白的ELISA分析， 圖4顯示了得自SLBs勻漿的不含細(xì)胞的上清液中CCL19 (圖4A ) 、 CCL21 (困 4B)和CXCL12 (困4C)蛋白的濃度，未發(fā)現(xiàn)CCL表達(dá)的明確棋式，所分析的 各組病人之間未檢測(cè)到顯著的差異，罔此，這些數(shù)據(jù)表明IIP的纖維化病變與肺中增加產(chǎn)生CCR7和CXCR4配體無(wú)關(guān).
IIP SLBs中的灶性間質(zhì)性的(focal interskial) CCR7蛋白表達(dá)，SuperArray 和實(shí)時(shí)PCR轉(zhuǎn)錄物分析顯示，CCR7在IIP SLBs中的表達(dá)比在正常邊緣SLBs 中的表達(dá)高得多，因此，對(duì)IIP和正常邊緣SLBs的全肺切片進(jìn)行免疫組化分析 以證實(shí)這些觀測(cè)結(jié)果.如困5所示，在UIP、 NSIP和RBILD病人組的SLBs中 見(jiàn)到灶性間質(zhì)性的CCR7表達(dá)，雖然在RBILD病人的巨噬細(xì)胞中看見(jiàn)CCR7表 達(dá)(困5F)，灶性間質(zhì)性模式的CCR7表達(dá)并不唯一地與UIP (圖5B )和NSIP (困5D)活檢樣中的免疫細(xì)胞相關(guān).在UIP病人組(n-10)的所有上肺葉和下 肺葉SLBs的間質(zhì)區(qū)域中存在著多個(gè)CCR7蛋白灶性表達(dá)區(qū)域.注意到，CCR7 表達(dá)的細(xì)胞灶并不唯一地包含成纖維細(xì)胞，其它細(xì)胞(包括單核細(xì)胞和上皮細(xì)胞) 似乎也表達(dá)這種趨化因子受體.相比于更嚴(yán)重的亞型UIP， NSIP和RBILD亞 型表達(dá)的CCR7均更少.雖然這些活檢樣中的50。/o呈現(xiàn)CCR7染色，NSIP病人 組(n-6)上肺葉和下肺葉SLBs中所見(jiàn)到的表達(dá)CCR7的細(xì)胞灶區(qū)域要少得多. 在四分之三的RBILD (n=5) SLBs中，CCR7常常局限于血管和單核細(xì)胞，但是 在該IIP組的活檢樣的間質(zhì)區(qū)域中很少觀察到CCR7染色，與UIP SLBs中見(jiàn)到 的明顯染色相反，對(duì)正常邊緣病人組(n-5)的上肺葉和下肺葉SLBs進(jìn)行的免疫 組化分析中，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)CCR7表達(dá)(圖5H ).
用于CCR7測(cè)定的相同IIP和正常邊緣SLBs中，CXCR4染色看來(lái)局限于免 疫細(xì)胞，更為重要的是，這一趨化罔子受體的表達(dá)不是灶性的，在被試驗(yàn)的4組 病人之間沒(méi)有差異.所測(cè)定的所有HP和正常邊緣活檢樣顯示與單核細(xì)胞相關(guān)的 CXCR4高度表達(dá)，這在閨6中體現(xiàn)，困6顯示了 UIP(困6B) 、 NSIP (困6D)、 RBILD (圖6F)和正常邊緣(圖5D) SLBs中的代表性CXCR4染色，因此，免 疫組化調(diào)查揭示了與CXCR4不同，CCR7主要在IIPSLBs中表達(dá)，但并不在正 常邊緣SLBs中表達(dá)，并且CCR7的表達(dá)似乎定位于IIP中的灶性間質(zhì)區(qū)。
為了闡述構(gòu)成IIP SLBs中CCR7陽(yáng)性區(qū)域的細(xì)胞的身份，對(duì)連續(xù)切片進(jìn)行針 對(duì)CD45和CCR7表達(dá)的另外染色試驗(yàn)(圖7),在檢查UIP SLBs時(shí)，發(fā)現(xiàn)CCR7 的免疫組化表達(dá)(圖7B)與CD45(困7C)的部分重疊.同時(shí)表達(dá)CCR7和CD45 的細(xì)胞看起來(lái)是單核細(xì)胞，相反，雖然CCR7在NSIP活檢樣中高度表達(dá)(困7E )， 這種趨化因子受體的免疫定位與CD45不一致.對(duì)RBILD SLBs的類似免疫組化 研究揭示同樣缺乏CCR7與CD45的共定位(未顯示).因此，單核細(xì)胞上的CD45與CCR7的雙重表達(dá)存在于UIP中，但并不存在于非其他形式的IIP.如上所述， CD34是造血干細(xì)胞抗原，其已經(jīng)在外周血纖維細(xì)胞上得到鑒定(Abe et al.， J. Immunol., 166:7556-7562 (2001)).發(fā)明者接下來(lái)檢查了能否在IIP和正常邊緣活 檢樣的組織學(xué)切片中鑒定這種標(biāo)記物(困8).令人感興趣的是，在UIP活檢樣 (困8B)中CD34表達(dá)很少，并且當(dāng)該抗原被檢測(cè)到時(shí)，其主要定位于活檢樣的 間質(zhì)區(qū)域.發(fā)現(xiàn)CD34在NSIP活檢樣中表達(dá)最高，其中這種標(biāo)記物在間質(zhì)區(qū)域 中的單核細(xì)胞上高度表達(dá)(困8D).在RBILD (固8F)和正常邊緣(困8H) SLBs的間質(zhì)區(qū)域中也檢測(cè)到強(qiáng)的CD34表達(dá).對(duì)CD34和CCR7共定位的進(jìn)一步 檢查沒(méi)有揭示在HP或正常邊緣SLBs中顯示這些蛋白質(zhì)的雙重表達(dá)(未顯示) 的區(qū)域.因此，CD34突出表達(dá)于較不嚴(yán)重的IIP形式以及正常邊緣的SLBs中.
1型膠原主要由纖維細(xì)胞表達(dá)，這些細(xì)胞在組織損傷位點(diǎn)聚集并產(chǎn)生膠原 (Abe etal" J. Immunol., 166:7556-7562 (2001)).困9總結(jié)了 l型膠原蛋白在IIP 和正常邊緣SLBs中表達(dá)的免疫組化分析.在UIP (困9B) 、 NSIP (困9D)、 RBILD (圖9F)和正常邊緣(圖9H)腫瘤病人活檢樣中，1型膠原免疫定位于 的間質(zhì)區(qū)域.l型膠原的最高表達(dá)見(jiàn)于UIP SLBs,但是在正常邊緣SLBs中也可 發(fā)現(xiàn)1型膠原蛋白的高度表達(dá).為了確定1型膠原和CCR7是否在IIP活檢樣中 共定位，還對(duì)連續(xù)切片進(jìn)行染色，以測(cè)定這兩種蛋白質(zhì)的表達(dá)(困10).雖然l 型膠原在所有UIP SLBs (困10B )中高度表達(dá)，但是CCR7在1型膠原高度表達(dá) 的區(qū)域(圖IOC)沒(méi)有表達(dá).類似的情況見(jiàn)于NSIP (未顯示)和RBILD (困IOE， F) SLBs,其中1型膠原(圖10E)與CCR7表達(dá)(圖10F)看來(lái)并未呈現(xiàn)共定 位.罔此，IIP SLBs中的CCR7陽(yáng)性區(qū)域并不也是1型膠原的陽(yáng)性區(qū)域.
IIP SLBs中的CCR7陽(yáng)性區(qū)域沒(méi)有aSMA表達(dá)，困ll顯示了肺組織切片中 CCR7和aSMA的代表性免疫組化染色，所迷切片得自診斷患有UIP(困IIA-C)、 NSIP (困11D-F)和RBILD (困11G-I)的病人.如上所述，全部三組病人中， 在肺間質(zhì)區(qū)發(fā)現(xiàn)表達(dá)CCR7(困IIB,E，H)的細(xì)胞灶.但是，在連續(xù)切片中CCR7 陽(yáng)性區(qū)與aSMA陽(yáng)性區(qū)沒(méi)有重疊(困IIC，F(xiàn)，I).
本研究的總體目的是調(diào)查CCR7、 CXCR4、 CCL19、 CCL21和CXCL12在 IIP和正常邊緣腫瘤病人組的肺活檢樣本中的表達(dá)模式，定量轉(zhuǎn)錄物分析和定性 蛋白質(zhì)分析表明，相對(duì)于正常邊緣SLBs, CCR7 (但非CXCR4)在UIP中的表 達(dá)顯著增加，UIP SLBs以及NSIP SLBs (程度較小)顯示強(qiáng)表達(dá)CCR7蛋白的
灶性間質(zhì)區(qū)域(focal interstitial aeras)，但其不同時(shí)對(duì)CD34、 1型膠原或aSMA 呈陽(yáng)性，在所有UIP SLBs以及較少部分的NSIP和RBILD活檢樣中見(jiàn)到CCR7 蛋白的灶性表達(dá)(focal expressio) 在UIP SLBs中，CCR7蛋白在間質(zhì)中的灶 性表達(dá)看來(lái)包括一些CD45陽(yáng)性細(xì)胞(Salhisto et al.， Eur. J. Immunol" 28:2760-2769 (1998)),但是在NSIP和RBILD病人的活檢樣中，絕大部分CCR7 陽(yáng)性細(xì)胞不表達(dá)CD45，并且CCR7與CD45的表達(dá)不重疊.雖然CCR7在UIP
al.， Mol. Med.， 1:71-81 (1994))，但是沒(méi)有證據(jù)表明這些活檢樣中的CCR7活性 區(qū)域也對(duì)纖維細(xì)胞標(biāo)記物(如CD34和1型膠原)呈現(xiàn)陽(yáng)性.另外，這些CCR7 陽(yáng)性細(xì)胞缺乏成肌纖維細(xì)胞標(biāo)記物aSMA.這些數(shù)據(jù)引發(fā)一種思考，即CCR7蛋 白的灶性表達(dá)可指示特發(fā)性損傷的位點(diǎn)，以及固有成纖維細(xì)胞的不當(dāng)活化，而不 表示表達(dá)CCR7的纖維細(xì)胞的補(bǔ)充.雖然它們?cè)谌祟惣膊≈械淖饔蒙写_定，也 沒(méi)有鑒定出纖維細(xì)胞的特異性細(xì)胞表面標(biāo)記物，但是幾種實(shí)驗(yàn)性纖維化模型指出 了來(lái)源于骨號(hào)的循環(huán)細(xì)胞在皮膚(Fathke et al.， Stem CeHs, 22:812-822 (2004))及 肺(Hashimoto et al.， J. Clin. Invest" 113:243-252 (2004); Phillips et al.， J. Clin. Invest" 114:438-446 (2004); Epper，y et al" Am. J. Respir. Cell Mol. Biol" 29:213-224 (2003); Schmidt et a，.， J. Immunol" 171:380-389 (2003))纖維化病變中 的作用.這些實(shí)驗(yàn)性研究中大部分使用骨號(hào)嵌合體模型，其通過(guò)將轉(zhuǎn)基罔表達(dá)嵌 合綠色熒光蛋白的鼠骨髄過(guò)繼轉(zhuǎn)移入受放射的小鼠而建立.來(lái)源于綠色熒光蛋白 陽(yáng)性骨鍵的細(xì)胞在形態(tài)上表現(xiàn)為巨噬細(xì)胞狀(Epperly et al.， Am. J. Respir. Cell Mol" Biol" 29:213-224 (2003))和/或成纖維細(xì)胞狀(Hashimoto et al.， J. CHn. Invest" 113:243-252 (2004); Phillips et al., J, Clin. Invest" 114:438-446 (2004)), 其被顯示為組織纖維化的主要貢獻(xiàn)罔素.另外，這些來(lái)源于骨拔的細(xì)胞對(duì)錳超氣 化物歧化醉敏感(Epperly et al.， Am. J. Respir. Cell Mol. Bio，., 29:213-224(2003)),表達(dá)1型膠原(Hashimoto et ah, J. Clin. Invest" 113:243-252 (2004); Phillips et a，" J. Clin. Invest" 114:438-446 (2004); Schmidt et al.， J. Immunol" 171:380-389 (2003)) 、 CD34 ( Schmidt et al" J, Immunol" 171:380-389 (2003)) 、 CD45 ( Phillips et al. J, Clin. Invest" 144:438-446 (2004))、端粒酶逆 轉(zhuǎn)錄醉(Hashimoto et a，" J. C，in, Invest" 113:243- 252 (2004) )、CCR7( Hashimoto et al" J. Clin. Invest" 113:243-252 (2004))和CXCR4 ( Hashimoio et al" J. Clin. Invest., 113:243-252 (2004); PhH,ips et al" J. Clin. Invest" 144:438-446 (2004)) 然而，關(guān)于纖維細(xì)胞一旦定位于肺中，它們最終是否分化為成肌纖維細(xì)胞仍 有爭(zhēng)議.目前的假設(shè)是，在啄露于過(guò)敏源后補(bǔ)充進(jìn)入支氣管組織(Schmidt etal., J. Immunol" 171:380-389 (2003))或皮膚受損部位(Abe et al" J. Immunol" 166:7556-7562 (2001))的纖維細(xì)胞分化為成肌纖維細(xì)胞，但是在博來(lái)霉素引起的 特發(fā)性纖維化期間移向肺的纖維細(xì)胞不表達(dá)aSMA,且不會(huì)被誘導(dǎo)表達(dá)這種成肌 纖維細(xì)胞標(biāo)記物(Hashimoto et al， J. CHn. Invest" 113:243-252 (2004)),關(guān)于這 些細(xì)胞的另外爭(zhēng)論是這樣一個(gè)觀察結(jié)果，即在組織修復(fù)過(guò)程中并非所有來(lái)源于骨 鍵的細(xì)胞都有害.罔此，Ortiz和他的同亊們(Ortiz et al.， Proc. Na", Acad. Sci. USA, 100:8407-8411 (2003))展示了鼠間質(zhì)干細(xì)胞向受損的肺遷移，呈現(xiàn)上皮樣 表型，減少受博來(lái)審素攻擊的小鼠體內(nèi)的炎癥和膠原沉積.很明顯，需要進(jìn)行進(jìn) 一步研究來(lái)闡明來(lái)源于骨拔的細(xì)胞在臨床纖維化反應(yīng)中的作用，
HP病人的SLBs中CCR7和CXCR4進(jìn)行檢測(cè)的動(dòng)力來(lái)自這樣的在先研究， 其表明COL21 (CCR7趨化因子受體的配體)在體外和體內(nèi)是纖維細(xì)胞趨化性的 有效剌激物(Abe et al.， J. Immunol" 166:7556-7562 (2001));來(lái)源于CXCR4陽(yáng) 性骨號(hào)的細(xì)胞有助于實(shí)驗(yàn)性誘發(fā)纖維化(Hashimoto et al., J. Clin. Invest., 113:243-252 (2004); Phillips et a " J. Clin. Invest" 114:438-446 (2004)) 假定纖 維細(xì)胞能夠通過(guò)依賴于CCR7、CXCR4或者可能其它的趨化罔子受體的趨化活動(dòng) 迅速進(jìn)入組織損傷位點(diǎn)，并在肺纖維化的發(fā)病機(jī)理中發(fā)揮作用(Phillips et al.， J. Clin. Invest., 114:438-446 (2004)).在本研究中，檢查表達(dá)CCR7的病灶區(qū)是否 存在假定的纖維細(xì)胞標(biāo)記物，包括CD45、CD34和1型膠原(Abe et a，， J. Immunol., 166:7556-7562 (2001); Hartlapp et al.， FASEB J.， 15:2215-2224 (2001)) . CD45 是存在于表達(dá)CCR7的病灶區(qū)的唯一標(biāo)記物，CD45和CCR7的共定位僅見(jiàn)于UIP 內(nèi)存在的單核細(xì)胞中，在其它IIP活檢樣中沒(méi)有看到，另外，所有這些標(biāo)記物均 在正常邊緣SLBs中檢測(cè)到，但是免疫組化技術(shù)在這些活檢樣中沒(méi)有檢測(cè)到 CCR7,雖然這些發(fā)現(xiàn)沒(méi)有排除在病人活檢樣中看到的CCR陽(yáng)性細(xì)胞為纖維細(xì)胞 的可能性，但是有可能當(dāng)纖維細(xì)胞從循環(huán)系統(tǒng)遷移入肺時(shí)，這些標(biāo)記物的表達(dá)被 快速降調(diào)節(jié).
CXCR4不存在于IIP SLBs的病灶區(qū)的觀察也不排除這種趨化罔子受體對(duì)于 向肺補(bǔ)充纖維細(xì)胞和/或制備骨拔來(lái)源細(xì)胞的膠原的重要性.在所有分析的SLBs
中看到了彌散模式(difuse pattern)的CXCR4表達(dá)，表達(dá)這種趨化因子受體的
鑒于UIP成纖維細(xì)胞的異常合成和增殖特性(組織學(xué)上突出表現(xiàn)為明顯的成 纖維細(xì)胞灶)(King et al" Am. J. Respir. Crit. Care Med" 164:1025-1032 (2001))， 發(fā)明者假設(shè)這些細(xì)胞還可以對(duì)通常調(diào)控免疫細(xì)胞功能的趨化因子配體產(chǎn)生不當(dāng)反 應(yīng).組織固有的成纖維細(xì)胞包含肺結(jié)構(gòu)的主要成分，許多研究者提出這些細(xì)胞的 不當(dāng)活化是UIP (可能還有其它類型的IIP)中見(jiàn)到的病理性纖維化反應(yīng)的基礎(chǔ) (Suganuma et al" Thorax, 50:984-989 (1995》Hogaboarn et al" Proc. Assoc, Am. Physicians, 110:313-320 (1998); Ramos et al" Am. J. Respir. Cell Mol. BioL， 24:591-598 (2001); Selman et al" Respir. Res.， 3:3 (2002)),引起這種不當(dāng)活化的 因素還有待闡明，但是幾家實(shí)驗(yàn)室的數(shù)據(jù)表明趨化因子可能在這一過(guò)程中發(fā)揮作 用(van den Blink et al" Arch. Immunol. Ther. Exp. (Warsz)， 48:539-545 (2000); Selman， Am. J. Respir. CHt. Care Med" 168:730-731 (2003)),例如，現(xiàn)在普遍 認(rèn)為來(lái)自纖維化肺的UIP成纖維細(xì)胞的遷移快于來(lái)自對(duì)照肺的那些細(xì)胞 (Suganuma et al.， Thorax, 50:984-989 (1995))，小鼠試驗(yàn)存在一些有關(guān)趨化因 子在這方面起主要作用的提示(Moore et aL， J. Immunol., 167:4368-4377 (2001)).
對(duì)CCR7和CXCR4在IIP中的細(xì)胞異常遷移活動(dòng)中起作用的可能性進(jìn)行檢 驗(yàn)的另 一個(gè)動(dòng)力來(lái)自腫瘤生物學(xué)領(lǐng)域的最新發(fā)現(xiàn)，已文獻(xiàn)記栽了乳腺癌細(xì)胞上獨(dú) 特的一套趨化罔子受體的表達(dá)，這部分解釋了乳腺癌的轉(zhuǎn)移特性(Muller et al.， Nature, 410:50-56 (2001)).
因此，本研究說(shuō)明了 CCR7在IIP中的灶性間質(zhì)性表達(dá).表達(dá)這種受體的細(xì) 胞的身份有待進(jìn)行全面闡明，但是含有CCR7灶性表達(dá)的區(qū)域?qū)D34和1型膠 原不呈陽(yáng)性，IIP活檢樣的間質(zhì)區(qū)域中表達(dá)CCR7的細(xì)胞不表達(dá)aSMA，因此排 除了這些細(xì)胞是成肌纖維細(xì)胞的可能性.
在以下實(shí)施例3中，提供了數(shù)據(jù)以顯示IIP成纖維細(xì)胞(但不是正常邊緣成 纖維細(xì)胞)的合成和增殖特征受外源性CCL19和CCL21的不同影響.這些研究 具有潛在的治療價(jià)值，如果有可能抑制纖維細(xì)胞的遷移和/或固有肺成纖維細(xì)胞響 應(yīng)CCR7特異性趨化罔子的活化，則可防止細(xì)胞外基質(zhì)的過(guò)度生成，以利于適當(dāng) 的肺修復(fù).
實(shí)施例3:靶向(targeting) CCL19或CCL21用于治療慢性纖維化疾病本實(shí)施例具體說(shuō)明了在肺的慢性纖維化過(guò)程中靶向CCL19和/或CCLM的新 穎潛在方法，已知的特發(fā)性慢性肺纖維化具有非常大的臨床挑戰(zhàn)性，各種治療選 擇顯示出效力有限或有毒性(Flaherty et al" Am. J. Med" 110:278-282 (2001); (Hampton et al.， Am. J. Respir. Crit. Care Med" 149:A878 (1994)),診斷后的中 位存活率幾乎沒(méi)有變化(Ryu et al" Mayo Clin. Proc.， 73:1085-1101 (1998); Lasky et al" Environ. Health Perspect" 108 Suppl 4:751-762 (2000)) 已知的促纖維化 刺激罔素包括放射、吸入的礦物質(zhì)及有機(jī)粒子、氣態(tài)氣化刑、藥物和感染性微生 物，然而對(duì)于引發(fā)特發(fā)性間質(zhì)性肺炎(IIP)的臨床病理實(shí)體的致病因素的確認(rèn)一 直存在著爭(zhēng)議.HP是一組多種形式的疾病，與遠(yuǎn)端肺實(shí)質(zhì)有關(guān)，其有許多共同 的特征，但是很難為命名為單獨(dú)的疾病(Travis et al.， Am. J. Surg. Path., 24:19-33 (2000)).它們的發(fā)病機(jī)理仍不清楚，但集中認(rèn)為是與肺部受到創(chuàng)傷(或多重?fù)p 傷)后試?yán)е斡搫?chuàng)傷有關(guān).成纖維細(xì)胞灶是活躍增殖的成纖維細(xì)胞的小聚集體， 被認(rèn)為是創(chuàng)傷的優(yōu)先細(xì)胞灶(prior foci)的組織化，顯示纖維化處于活動(dòng)和進(jìn)行 狀態(tài).現(xiàn)在的假設(shè)是，人成纖維細(xì)胞對(duì)CCL19和CCL21的響應(yīng)(由于它們對(duì) CCR7的升調(diào)節(jié))引起這些細(xì)胞的不當(dāng)活化，從而導(dǎo)致IIP中所見(jiàn)的極度纖維化 反應(yīng)，
令人感興趣的是，纖維化病人肺中的細(xì)胞罔子環(huán)境可能有利于CCL19和 CCL21的異常反應(yīng)，罔為已經(jīng)有其他研究者文獻(xiàn)記栽了 TNF-a蛋白水平的升高 (Ziegenhagen et al" J, Investig, Med.， 46:223-231 (1998》Kapanci et al" Am, J. Respir. Crit. Care Med" 152:2163-2169 (1995))和IL-10的降低(Martinez et al.， Am. J. Physiol., 273:L676-683 (1997)),這兩種細(xì)胞因子均調(diào)控與這些配體結(jié)合 的受體.來(lái)自嚴(yán)重肺纖維化病人的成纖維細(xì)胞明顯對(duì)CCL19和CCL21有反應(yīng)，
發(fā)明者已致力于研究在將人成纖維細(xì)胞系經(jīng)靜脈引入免疫缺陷小鼠后是否有 可能引起肺纖維化.利用這一模型，發(fā)明者檢驗(yàn)了靜脈內(nèi)注射的人成纖維細(xì)胞能 否在無(wú)炎癥反應(yīng)能力的體內(nèi)系統(tǒng)中引發(fā)纖維化反應(yīng)，
數(shù)據(jù)還顯示，在肺纖維化起始時(shí)期或其發(fā)展之后可對(duì)該模型實(shí)施靶向CCR7 或其配體的效力試驗(yàn).看起來(lái)C.B-17-bg SCID小鼠對(duì)于人成纖維細(xì)胞的過(guò)繼轉(zhuǎn)移 研究是理想的，罔為C.B-17-bg小鼠缺乏T細(xì)胞和B細(xì)胞(與C.B-17和ICR SCIDs 相似)并且?guī)в忻咨?beige)突變，這種突變可引起細(xì)胞毒性T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞
和NK細(xì)胞功能的損傷.
將生長(zhǎng)自人纖維化活檢樣的成纖維細(xì)胞經(jīng)靜脈引入C.B-17-bg，基于Masson 三色染色，看到組織學(xué)表現(xiàn)和明顯的肺纖維化.
在其他研究中，在注射成纖維細(xì)胞后第35天，使用羥脯氨酸測(cè)定法對(duì)SCID 小鼠的肺組織進(jìn)行檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)與接受正常的人成纖維細(xì)胞的小鼠相比，接受生長(zhǎng) 自人纖維化活檢樣的成纖維細(xì)胞的小鼠的肺部樣本中羥脯氛酸的水平顯著升高. 因此，來(lái)自人源化SCID模型的數(shù)據(jù)表明，通過(guò)人IIP成纖維細(xì)胞有可能"轉(zhuǎn)移" 纖維化疾病，這種人源化SCID模型應(yīng)允許對(duì)在維持肺纖維化中起作用的閎素進(jìn) 行檢查，
人體研究顯示，與患有其他類型的非纖維化疾病的那些人相比，患有各種慢 性肺纖維化的病人的外科肺活檢樣中CCL21轉(zhuǎn)錄物(圖12)和蛋白質(zhì)(圖13) 表達(dá)顯著增加.數(shù)據(jù)表明，得自具有肺纖維化跡象的病人(但非得自無(wú)異常纖維 化跡象的病人)的肺成纖維細(xì)胞對(duì)外源性CCL19或CCL21表現(xiàn)遷移反應(yīng)(困14) 和增殖(困15)反應(yīng).CCL19和CCL21引起肺成纖維細(xì)胞遷移(困14)的發(fā)現(xiàn) 令人興奮，因?yàn)檫@一反應(yīng)在增殖性成纖維細(xì)胞灶(UIP的主要組織病理學(xué)特征之 一)的發(fā)展中起作用.
最后，使用以間質(zhì)性纖維化和成纖維細(xì)胞灶為特征的纖維化鼠SCID模型證 實(shí)了把向CCL21在肺纖維化的起始中的作用已經(jīng)通過(guò)加以
實(shí)施例4:靶向CCL21或CCR7有效消除通過(guò)在免疫缺陷小鼠中過(guò)繼轉(zhuǎn)移人 肺成纖維細(xì)胞而引起的肺纖維化
如上所討論的，CC趨化因子受體7 (CCR7)在HP活檢樣本和原代成纖維 細(xì)胞系中表達(dá)。在本實(shí)施例中提供了用肺纖維化模型研究CCR7的體內(nèi)作用的細(xì) 節(jié).簡(jiǎn)而言之，將1.0 x 106個(gè)生長(zhǎng)自特發(fā)性肺纖維化/普通型間質(zhì)性肺炎(IPF/UIP) 活檢樣、非特異性間質(zhì)性肺炎(NSIP)活檢樣或組織學(xué)上正常的活檢樣的原代成 纖維細(xì)胞靜脈注射入C.B.-17 SCID/米色(bg)小鼠.在注射IPF/UIP成纖維細(xì)胞后 第35天和第63天，免疫缺陷小鼠的肺中出現(xiàn)補(bǔ)丁型間質(zhì)性纖維化(patchy interstitial fibrosis)和羥脯氨酸含量升高.在所述兩時(shí)間處，過(guò)繼轉(zhuǎn)移的NSIP 成纖維細(xì)胞均引起更彌散的間質(zhì)性纖維化并提高羥脯氨酸水平，但是注入的正常 人的成纖維細(xì)胞不在C.B.-17 SCID/bg小鼠中引起問(wèn)質(zhì)重塑變化，人CCR7或 CCL21及其配體的全身治療性免疫中和可顯著緩解接受任一種IIP成纖維細(xì)胞的C.B.-17SCID/bg小鼠的肺纖維化.因此，本研究表明，經(jīng)靜脈向免疫缺陷小鼠注 入原代人成纖維細(xì)胞系引發(fā)肺纖維化，且這種纖維化反應(yīng)取決于CCL21和CCR7 之間的相互作用.
肺纖維化小鼠模型已經(jīng)提供了的實(shí)驗(yàn)性范例，用于研究呼吸系統(tǒng)中異常組織 的重塑和結(jié)疤(Gharee-Kermani et al" Meths. Mol. Med" 2005， 117:251-259) 已采用許多途徑來(lái)誘發(fā)肺纖維化，其包括轉(zhuǎn)基因和基閎轉(zhuǎn)移、放射、無(wú)機(jī)剌激物 (例如二氧化硅)以及促進(jìn)氣化刑引起的炎性損傷的藥物(例如博來(lái)審素)(Chua et al.， Am. J. Resp. Cell Mol. Bio，.， 2005， 33:9-13 ).在這些模型中，博來(lái)審素模 型的應(yīng)用最為廣泛，因?yàn)槠渚吡己玫脑佻F(xiàn)性以及與人肺纖維化的病理學(xué)相似性 (Chua et al" Am. J. Resp. Cell Mol. Biol" 2005， 33:9-13 ),因此，博來(lái)審素模型 已被用于評(píng)價(jià)許多在IPF/UIP中感興趣的靶標(biāo)(Kaminski et al.， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 200, 97:1778-1783; Pardo et al.， PLoS Med 2005， 2e251 ).
不幸的是，尚不存在完全重現(xiàn)IPF/IJIP的臨床病理學(xué)特征的動(dòng)物模型，關(guān)于 正在進(jìn)行中的炎性損傷(用于誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)性纖維化的主要模式)對(duì)于末期UIP的相 對(duì)重要性仍然存在爭(zhēng)議(Gauldie， Am. J. Resp. Crit. Care Med. 2002， 165:1205-1206; Sorter Am. J. Resp. Crit. Care Med. 2002， 165:1207-1208 ),
本實(shí)驗(yàn)通過(guò)使用另一種誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)性肺纖維化的策略來(lái)解決這個(gè)領(lǐng)域內(nèi)問(wèn)趙. 由于重度聯(lián)合免疫缺損基因突變(scid)或重組嗥激活基因1 (rag-1)敲除，基 因免疫缺陷小鼠已經(jīng)被廣泛用作過(guò)繼轉(zhuǎn)移正?；蚧疾〉娜思?xì)胞的宿主.本實(shí)施例 中顯示，經(jīng)靜脈(i.v.)將IPF/UIP或非特異性間質(zhì)性肺炎(NSIP;另一種較不 嚴(yán)重的HP)而非正常的成纖維細(xì)胞過(guò)繼轉(zhuǎn)移入具有scid-米色(C.B-17SCID/bg) 突變的C.B-17小鼠，引發(fā)并維持肺纖維化.在注入成纖維細(xì)胞后笫35天，兩個(gè) IIP成纖維細(xì)胞組的C.B-17SClD/bg小鼠均首次表現(xiàn)出纖維化的組織學(xué)和生物化 學(xué)跡象，在第63天達(dá)到顯著.看起來(lái)細(xì)胞因子和趨化因子在IIP的發(fā)病機(jī)理中都 發(fā)揮主要作用，對(duì)接受IPF/UIP或NSIP成纖維細(xì)胞的C.B-17SCID/bg小鼠全肺 樣本的ELISA分析表明，與較早時(shí)間點(diǎn)所測(cè)定的全肺水平或未接受成纖維細(xì)胞的 小鼠肺組織中測(cè)定的全肺水平相比，鼠的IL-13、 CCL6和CCL21水平在第63 天顯著升高.
IL-13和CCL6是肺纖維化的介質(zhì)，但是CCL21在肺重塑亊件(events)中 的作用尚不知曉.對(duì)CCL21和CCR7在由人IIP成纖維細(xì)胞引起(precipitated) 的肺重塑事件中的作用進(jìn)行檢驗(yàn)的動(dòng)力來(lái)自以上報(bào)道的發(fā)現(xiàn)，即在IIP活檢樣中
提高了 CCR7表達(dá)，以及CCL21顯著增強(qiáng)HP成纖維細(xì)胞的遷移、合成及增殖 性質(zhì)(EMP和CMH，未發(fā)表的發(fā)現(xiàn)).在單獨(dú)的免疫中和研究中，在將IIP成 纖維細(xì)胞注射入C.B-17SClD/bg小鼠后笫35天至63天，對(duì)人CCL21或CCR7
(CCL21的受體)進(jìn)行靶向，相比于接受IIP成纖維細(xì)胞和IgG的C.B^17SCID/bg 小鼠組，顯著降低了肺纖維化的所有參數(shù).這些數(shù)據(jù)合起來(lái)強(qiáng)調(diào)了通過(guò)對(duì) C.B-17SCID/bg小鼠靜脈注入IIP成纖維細(xì)胞引發(fā)并維持肺纖維化的新的鼠棋型 的創(chuàng)造性，并證明了在此模型中，CCL21和CCR7在維持纖維化中的新穎作用.
小鼠雌性，lCR-scid( ICRSCID)、 C.B-17-scid( C.B-17SCID )和C.B-17-scid-米色(C.B-17SCID/bg )小鼠(6-8周齡)，購(gòu)自Taconic Farms( Germantown， NY), 所有SCID小鼠被安置在密執(zhí)安大學(xué)醫(yī)學(xué)院(University of Michigan Medial School)的悉生屏陣(gnotobiotic barrier facility )設(shè)施內(nèi).開(kāi)始兩組小鼠有重度 聯(lián)合免疫缺損(scid)突變，由于V(D)J重組缺陷導(dǎo)致同時(shí)缺乏T淋巴細(xì)胞和B 淋巴細(xì)胞，而C.B-17SCID/bg小鼠有兩種突變第一種是scid突變，第二種是米 色突變，主要引起細(xì)胞毒性T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞功能的缺陷以及NK細(xì)胞功能的選 擇性損傷.所有小鼠隨意采食高壓滅菌水和小鼠顆粒鉤料.下面所迷的所有步錄 均在無(wú)菌的層流環(huán)境中進(jìn)行，并得到密執(zhí)安大學(xué)醫(yī)學(xué)院的動(dòng)物護(hù)理與使用委員會(huì)
(animal care and use committee)批準(zhǔn)，
人成纖維細(xì)胞培養(yǎng)從機(jī)械解離的IPF/UIP和NSIP外科肺活檢樣獲得混合 的細(xì)胞群，按先前在其它文獻(xiàn)(Jakubzick et al.， Am. J. Pathol., 2004 164:1989-2001)所述的詳細(xì)方法得到純凈的人成纖維細(xì)胞培養(yǎng)物，用同樣的方法
究中，在本文所描述的起始、模型表征以及治療發(fā)明研究的第四傳代(passage) 之后，總共使用10個(gè)IPF/UIP成纖維細(xì)胞系，6個(gè)NS1P成纖維細(xì)胞系和4個(gè)正 常的成纖維細(xì)胞系.
將人肺成纖維細(xì)胞靜脈引入SCID小鼠對(duì)150 cn^燒瓶中的組織培養(yǎng)物進(jìn) 行胰酶消化，得到IPF/UIP、 NSIP和正常成纖維細(xì)胞的單細(xì)胞制刑，按生產(chǎn)商 (Sigma Co.， St. Louis, MO)的說(shuō)明用PKH26染料標(biāo)記.將每種標(biāo)記的成纖維細(xì) 胞系稀釋至1 x 1os細(xì)胞/m，PBS，取lml這種懸浮液，經(jīng)尾靜脈注射入每組5只 的SCID小鼠.其它每組5只SCID小鼠只靜脈注射PKH26和PBS標(biāo)記溶液(即
為對(duì)照組).靜脈注射人肺成纖維細(xì)胞后第7天、21天、35天、49天和63天用 過(guò)量麻醉劑對(duì)小鼠施行安樂(lè)死，并在這些時(shí)間切除全肺組織，用于分子分析、組 織學(xué)分析、生物化學(xué)分析和/或蛋白質(zhì)組學(xué)分析(見(jiàn)下文).
人肺成纖維細(xì)胞過(guò)繼轉(zhuǎn)移后，評(píng)價(jià)C.B-17SCID/bg小鼠中CCL21和CCR7 的作用為了說(shuō)明靜脈過(guò)繼轉(zhuǎn)移人成纖維細(xì)胞后，CCL21及其受體CCR7在肺重 塑反應(yīng)中的作用，各C.B-17SCID/bg小鼠組接受IPF/UIP ( n-35只小鼠)、NSIP (n-20只小鼠)、正常成纖維細(xì)胞(n=15只小鼠)或單獨(dú)的栽體(即PBS) ( n=15 只小鼠).35天后，所有C.B-17SCID/bg小鼠組(5只/組)從笫35天至笫63 天每隔一天接受鼠IgG或鼠抗人CCL21單克隆抗體或鼠抗人CCR7單克隆抗體 (全部為10pg/ml， R&D Systems, Minneapolis, MN)，在笫63天，所有動(dòng)物 用過(guò)量麻醉劑施行安樂(lè)死，并切除全肺組織，用于分子分析、組織學(xué)分析、生物 化學(xué)分析和蛋白質(zhì)組學(xué)分析(見(jiàn)下文)
分子分析如先前(Jak由ick et al" J. Immunol. 2003， 171:2684- 2693)所 詳細(xì)描述的，從全肺樣品中分離總RNA,并生成cDNA.根據(jù)生產(chǎn)商(SuperArray， Inc.， Bethesda， MD )的說(shuō)明書(shū)，用非放射性GEArray基因分析膜分析合并樣 (n-5)中人及鼠趨化因子和趨化因子受體的基因概況變化，并如先前(Jakubzick etal.， Am. J. Pathol.， 162:1475-1486(2003))詳細(xì)描述的，測(cè)定信號(hào)強(qiáng)度.如先前 所述(Jakubzick et al.， J. Immunol. 2003, 171:2684-2693 )，通過(guò)實(shí)時(shí)定量RT-PCR 程序，使用7500實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)(Applied Biosystems， Foster City, CA )對(duì)各個(gè) 全肺cDNA樣品(n>5)分析人CCR7、 1型膠原、組織蛋白酶E、基質(zhì)金屬蛋 白酶(MMP)-2、 MMP-9、 MMP-19、纖維粘連蛋白、金屬蛋白酶的組織抑制刑 (TIMP) -1和GAPDH的表達(dá).
組織學(xué)分析用麻醉劑施行安樂(lè)死之后，切取每只小鼠的右肺葉，用10%福 爾馬林溶液完全充脹，在新鮮福爾馬林中放置24小時(shí)，利用標(biāo)準(zhǔn)的組織學(xué)技術(shù)， 用石蠟包埋每個(gè)肺葉，制作5nm切片，用H&E和Mason三色染色，進(jìn)行組織 學(xué)分析.借助熒光顯微鏡對(duì)其它的未染色的全肺組織切片進(jìn)行分析，
生化分析使整個(gè)左肺樣品在lxPBS中勻漿，并離心沉淀，取不含細(xì)胞的 上清液進(jìn)行ELISA分析，真空干燥沉淀，并重懸浮于0.5M冰醋酸中.然后按先 前所述的方法(Zhang et al.， J. Immunol. 1994， 153:4733-4741 )對(duì)組織進(jìn)行羥脯 氨酸濃度測(cè)定.
蛋白質(zhì)組學(xué)分析從全肺樣品勻漿中取50 pl不含細(xì)胞的上清液，用標(biāo)準(zhǔn)的 夾心酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)技術(shù)(R&D Systems, Miimeapolis， MN)分析 鼠IL-13、 CCL6、 CCL21、 IFN個(gè)IL>12、 IL-4、 CCL2、 CCL7、 CCL17、 CCL3、 CXCL13、 TNF-a、 CXCLIO、 CXCL9和CXCL2蛋白，所述分析方法如先前所 詳述的(JakubzicketaL， 3. Immunol. 2003， 171:2684-2693),
統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有結(jié)果用平均值土SEM表示.用單因素方差(one-way ANOVA )分析和Tukey-Kramer或Dunnett，s多重比較試驗(yàn)來(lái)確定UIP、 NSIP、 正常和對(duì)照組SC1D小鼠之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異.顯著性設(shè)定為p<0.05.
靜脈過(guò)繼轉(zhuǎn)移IPF/UIP或NSIP(但非正常)肺成纖維細(xì)胞引起C.B-17SCID/bg 小鼠的肺組織病理學(xué)和重塑.起初進(jìn)行研究，以評(píng)價(jià)過(guò)繼轉(zhuǎn)移的正常成纖維細(xì)胞 和IIP成纖維細(xì)胞對(duì)各種品系的SCID小鼠肺部結(jié)構(gòu)的影響，包括ICRSCID、 C.B-17SCID和C.B-17SCID/bg (每個(gè)時(shí)間點(diǎn)n=5).使用3個(gè)IPF/UIP成纖維細(xì) 胞系和2個(gè)正常人成纖維細(xì)胞系開(kāi)展這些最初的研究.用PKH2G標(biāo)記所有的人 成纖維細(xì)胞系，然后注射入各SCID小鼠組，這樣可以在組織切片中檢測(cè)標(biāo)記的 細(xì)胞.注射后笫7天和21天，對(duì)每個(gè)SCID組肺血管中的人成纖維細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè). 但是，21天后這一標(biāo)記物的強(qiáng)度減弱(來(lái)源于Sigma提供的信息表)，因此，在 注射成纖維細(xì)胞后第35天我們未能在各組織切片中檢測(cè)到PKH16熒光(未顯 示).其它器官(即肝臟、脾臟和腎臟)可能含有人肺成纖維細(xì)胞，但是我們?cè)?這些器官中未觀察到肉眼可見(jiàn)的變化.由于IIP是一種肺特異性疾病，不在任何 其它器官中表現(xiàn)纖維化，在本研究中未對(duì)其它器官進(jìn)行詳細(xì)的組織學(xué)分析，
在后面的時(shí)間點(diǎn)對(duì)各組SCID小鼠的全肺切片進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明標(biāo)記的肺 重塑只存在于C.B-17SClD/bg小鼠中.特別是，在將IPF/UIP成纖維細(xì)胞注入 ICRSCID小鼠(n-5只小鼠，未顯示)后笫49天未見(jiàn)纖維增生.同樣地，將IPF/UIP
細(xì)胞后第7天(n-5只小鼠)、21天(n-10只小鼠)、35天(n-5只小鼠)或
假設(shè)C，B-17SCID/bg組中存在標(biāo)記的肺組織病理跡象，下面所述的后續(xù)研究 涉及正常成纖維細(xì)胞和HP成纖維細(xì)胞過(guò)繼轉(zhuǎn)移入C.B-17SCID/bg小鼠.在模型 表征研究中，將4個(gè)1PF/U1P成纖維細(xì)胞系、4個(gè)NSIP成纖維細(xì)胞系和1個(gè)正 常成纖維細(xì)胞系過(guò)繼轉(zhuǎn)移入各別的C.B-17SCID/bg小鼠組，在轉(zhuǎn)移成纖維細(xì)胞后
C.B-17SCID小鼠，未能在靜脈注射IPF/UIP成纖維第35天和63天進(jìn)行肺組織病理學(xué)、基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)變化分析.
接受正常肺成纖維細(xì)胞的C.B-17SCID/bg小鼠中少見(jiàn)或未見(jiàn)肺組織病理學(xué). 但是，靜脈注射NSIP或IPF/UIP成纖維細(xì)胞系的C.B-17SCID/bg小鼠在其后笫 35天表現(xiàn)明顯的肺組織病理學(xué)跡象.注入NSIP或IPF/UIP肺成纖維細(xì)胞的 C.B-17SCID/bg小鼠的肺組織病理學(xué)表征為肺泡腔破裂、纖維增生明顯和存在嗜 酸性粒細(xì)胞.
過(guò)繼轉(zhuǎn)移正常的、NS1P或IPF/UIP人肺成纖維細(xì)胞后第35天， C.B-17SCID/bg小鼠的肺組織切片的Mason三色染色顯示，接受IIP (但非正常 的)成纖維細(xì)胞的C.B-17SCID/bg組的重塑區(qū)域內(nèi)存在細(xì)胞外基質(zhì)(淡藍(lán)色染色).
后來(lái)對(duì)各C.B-17SCID/bg組的組織切片的分析揭示了通過(guò)引入IPF/UIP或 NSIP成纖維細(xì)胞而引起的肺部重塑的程度和外觀的主要差異.63天前接受 IPF/UIP成纖維細(xì)胞的CB-17SCID/bg小鼠肺部呈現(xiàn)異質(zhì)外觀，外觀相對(duì)正常的 肺組織區(qū)域與發(fā)生嚴(yán)重的間質(zhì)破裂與重塑的區(qū)域相鄰.另外，接受IPF/UIP成纖 維細(xì)胞的C.B-17SCID/bg小鼠有明顯的人成纖維細(xì)胞病灶，但是這些病灶是在血 管中檢測(cè)到的，而不像臨床UIP那樣在間質(zhì)區(qū)域(Am. J. Resp. Crit. Care Med 2002， 165:277-304) , 63天前接受NSIP成纖維細(xì)胞的C.B-17SCID/bg小鼠的全 肺組織切片的組織學(xué)格局表征為間質(zhì)增厚和明顯的病灶區(qū)，這些小鼠中的重塑看 來(lái)涉及大部分肺.這些數(shù)據(jù)合起來(lái)表明將人IIP成纖維細(xì)胞引入C.B-17SCID/bg 小鼠可導(dǎo)致這些小鼠中的纖維化損害.
將IIP成纖維細(xì)胞引入C.B-17SCID/bg小鼠后，雍脯氨酸水平以時(shí)間依賴方 式發(fā)生顯著變化在涉及肺重塑的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭?，羥脯氨酸是膠原從頭合成的常用 標(biāo)記物(Jakubzick et al.， Am. J. Pathol" 2004， 165:1222-1221 ) 在本研究中， 在之后笫35天或63天，對(duì)沒(méi)有接受人肺成纖維細(xì)胞、或者接受正常的人肺成纖 維細(xì)胞、NSIP或IPF/UIP人肺成纖維細(xì)胞的C.B-17SCID/bg小鼠的全肺樣品中 的祭脯氨酸水平進(jìn)行測(cè)定.引入正常成纖維細(xì)胞后，在這些時(shí)間點(diǎn)的羥脯氨酸水 平?jīng)]有變化.這些C.B-17SCID/bg組的幾脯氨酸水平在第35天和第63天分別為 4.7 ± 0.3 ng/mg蛋白質(zhì)和5.6 ± 0.5 ng/mg蛋白質(zhì)，與未接受人成纖維細(xì)胞的 C.B-17SCID/bg小組中測(cè)到的水平(4.5 ± 1.3 pg/mg蛋白質(zhì))相似.但是，與正 常成纖維細(xì)胞組相比，在靜脈轉(zhuǎn)移NSIP ( 11.4 ± 3.7 pg/mg蛋白質(zhì))或IPF/UIF (8.2士2fig/mg蛋白質(zhì))成纖維細(xì)胞后第35天，小鼠肺部的羥脯氨酸含量更高.
同樣，在靜脈過(guò)繼轉(zhuǎn)移后第63天，NSIP和IPF/UIP成纖維細(xì)胞組的羥脯氨酸水 平分別進(jìn)一步提高3倍(M ± 11 fig/mg蛋白質(zhì))和2.5倍(22 ± 4 pg/mg蛋白質(zhì)) 在第63天的時(shí)間點(diǎn)，與接受正常成纖維細(xì)胞的CB-17SCID/bg組相比，接受NSIP 或IPF/UIP人成纖維細(xì)胞的CB-17SCID/bg組中幾脯氨酸水平的提高達(dá)到統(tǒng)計(jì)顯 著.因此，靜脈注射人IIP成纖維細(xì)胞，在過(guò)繼轉(zhuǎn)移后第35天提高了幾脯氨酸水 平，在第63天，顯著提高羥脯氛酸水平.
全肺細(xì)胞因子分析表明，接受HP成纖維細(xì)胞的C.B-17SCID/bg小鼠肺中的 鼠1L-13、 CCL6和CCL21水平明顯升高在i.v.過(guò)繼轉(zhuǎn)移人正?；騃IP成纖維細(xì) 胞后第35天和63天，用EL1SA對(duì)全肺分析數(shù)種細(xì)胞因子、CC配體和CXC配 體趨化因子進(jìn)行分析，結(jié)果表明在鼠1L-13、 CCL6和CCL21發(fā)生許多統(tǒng)計(jì)顯著 的變化.雖然接受正常成纖維細(xì)胞的C.B-17SCID/bg組的全肺IL-13水平低于 ELISA檢測(cè)水平，但是與注射正常成纖維細(xì)胞的C.B-17SCID/bg組相比，注射 NSIP或IPF/UIP成纖維細(xì)胞的C.B-17SCID/bg組在之后笫35天和/或63天的全 肺IL13水平顯著更高.另外，對(duì)于接受IPF/UIP成纖維細(xì)胞的C.B-17SClD/bg 小鼠，成纖維細(xì)胞過(guò)繼轉(zhuǎn)移后第63天在其肺中檢測(cè)到的IL-13水平顯著高于笫 35天的水平.注射成纖維細(xì)胞后笫63天，接受1PF/U1P或NS1P成纖維細(xì)胞的 C.B-17SCID/bg組的全肺CCL6水平顯著高于接受正常成纖維細(xì)胞的 C.B-17SCID/bg組，對(duì)于接受IPF/UIP或NSIP成纖維細(xì)胞的C.B-17SCID/bg小 鼠，成纖維細(xì)胞過(guò)繼轉(zhuǎn)移后第63天在其肺中檢測(cè)到的CCL6水平顯著高于第35 天的水平.通過(guò)將人成纖維細(xì)胞引入C.B-17SCID/bg小鼠而發(fā)生變化的其他鼠 CC配體只有CCL21.在第63天，這種趨化因子在NSIP和IPF/UIP成纖維細(xì)胞 C.B-17SCID/bg組中的水平明顯高于正常成纖維細(xì)胞C.B-17SCID/bg組，另外， 在成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)移后笫63天，IPFAHP成纖維細(xì)胞組的全肺鼠CCL21水平明顯 高于NSIP成纖維細(xì)胞組.最后，對(duì)于HP成纖維細(xì)胞C.B-r7SCID/bg組，過(guò)繼 轉(zhuǎn)移后第63天其全肺樣品中的CCL21存在水平的的顯著高于過(guò)繼轉(zhuǎn)移后第35 天的水平.因此，綜合以上數(shù)據(jù)可知，在C.B-17SCID/bg小鼠中存在IIP成纖維 細(xì)胞(但非正常成纖維細(xì)胞)，顯著改變了鼠細(xì)胞因子以及在肺中具有確定的促 纖維化作用的趨化因子(即IL-13和CCL6)和假定的促纖維化作用(即CCL21 ) 的全肺水平.
35天前接受人肺成纖維細(xì)胞的C.B-17SCID/bg小鼠肺中存在人CCR7和
CCL21基因轉(zhuǎn)錄物對(duì)接受NSIP或IPF/UIP成纖維細(xì)胞的C.B-17SCID/bg小鼠 中鼠CCL21的全肺水平變化的興趣來(lái)自在先研究，其說(shuō)明這些CC配體在腎臟 (Barias et al" 3, ImmunoL， 2002 168:430 1- 4307)和肝臟(Bonacogi et al. Gastroenterology, 2003， 125:1060-1076)中的重要重塑作用.這促使進(jìn)一步分析 人IIP成纖維細(xì)胞引起的肺重塑反應(yīng)過(guò)程中的這種CC配體及其受體CCR7.用 SuperArray基因分析檢測(cè)CCR7和CCL21的人轉(zhuǎn)錄物，在三個(gè)C.B-17SCID/bg 組中，CCR7和CCL21的最高轉(zhuǎn)錄物表達(dá)存在于IPF/UIP成纖維細(xì)胞組的肺樣本 中.另外，TAQMAN分析證實(shí)了 CCR7的存在，并在各C.B-17SCID/bg組中， IPF/UIP組再次顯示出最高的CCR7轉(zhuǎn)錄物表達(dá)，對(duì)鼠CCR7和CCL21的 SuperArray和TAQMAN分析也證實(shí)了在接受人成纖維細(xì)胞的全部三個(gè) C.B-17SClD/bg組中均存在這些轉(zhuǎn)錄物產(chǎn)品，且兩種轉(zhuǎn)錄物的最高水平存在于接 受IPF/UIP成纖維細(xì)胞的C.B-17SClD/bg組中.因此，靜脈內(nèi)過(guò)繼轉(zhuǎn)移正?；騃IP 成纖維細(xì)胞導(dǎo)致存在CCR7和CCL21的人基罔轉(zhuǎn)錄物.
人成纖維細(xì)胞過(guò)繼轉(zhuǎn)移入C.B-17SCID/bg小鼠后，對(duì)鼠細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)基因 進(jìn)行定量TAQMAN PCR分析使用定量PCR法分析肺部鼠細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)基 罔的變化.63天前接受正常人成纖維細(xì)胞、NSIP和IPF/UIP人成纖維細(xì)胞的 C.B-17SCID/bg小鼠中存在1型膠原、組織蛋白醉E、 MMP-19和TIMP-1的表 達(dá).更為重要的是，將成纖維細(xì)胞攻擊的小鼠中這些基因的轉(zhuǎn)錄物水平與對(duì)照 C.B-17SCID/bg小鼠中的轉(zhuǎn)錄物水平進(jìn)行比較，接受任一類型IIP成纖維細(xì)胞的 C.B-17SCID/bg小鼠中1型膠原和組織蛋白酶的轉(zhuǎn)錄物表達(dá)的增加，以及接受 IPF/UIP成纖維細(xì)胞的小鼠中MMP-19和TIMP-1的轉(zhuǎn)錄物表達(dá)的増加相比于接 受正常人成纖維細(xì)胞的C.B-17SClD/bg小鼠中這些基因轉(zhuǎn)錄物的增加達(dá)到統(tǒng)計(jì)顯 著.用TAQMAN分析其他細(xì)胞外基質(zhì)基因，并證實(shí)存在MMP-2、 MMP-9和 纖維粘連蛋白.各組C.B-17SCID/bg小鼠的這些轉(zhuǎn)錄物的水平之間未見(jiàn)顯著差異， 但I(xiàn)PF/UIP C.B-17SCID/bg組中觀察到MMP-2和纖維粘連蛋白的增加最大，而 MMP-9在該相同C.B-17SClD/bg組中的增加最小.因此，這些數(shù)據(jù)說(shuō)明在 C.B-17SCID/bg小鼠中因存在人成纖維細(xì)胞而使鼠細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄物 水平發(fā)生變化.
人CCR7或人CCL21免疫中和消除接受人HP成纖維細(xì)胞的C.B-17SClD/bg 小鼠的肺重塑在后面的一系列實(shí)驗(yàn)中，評(píng)價(jià)了人CCR7和CCL21在接受人正
常成纖維細(xì)胞(n-l個(gè)細(xì)胞系)或IIP成纖維細(xì)胞(n-3個(gè)IPF/UIP細(xì)胞系，n=2 個(gè)NSIP細(xì)胞系)的C.B-17SCID/bg小鼠中的作用.雖然測(cè)定全肺樣本中人CCL21 的嘗試沒(méi)有成功(大概罔為該CC配體的存在水平低于ELISA檢測(cè)限)，但是先 前的研究已經(jīng)說(shuō)明鼠CCL21和人CCL21都能通過(guò)人CCR7促進(jìn)細(xì)胞鈣流動(dòng) (Jenh et al.， J. Immunol" 1999 ，62:3765-3769 ).另外，已經(jīng)證明使用多克隆抗 體免疫中和鼠CCL21可消除塵螨誘發(fā)的過(guò)敏性氣道疾病(house dust mite-induced allergic airway disease )的人源化模型中人樹(shù)突狀細(xì)胞的遷移和人T 細(xì)胞的啟動(dòng)(Hammad et al. J. Immunol. 2002, 169:1524-1534) 基于報(bào)道的鼠 CCL21和人CCL21的交叉反應(yīng)性，實(shí)施這樣的治療方案其中在過(guò)繼轉(zhuǎn)移成纖 維細(xì)胞后第35-63天，施用單克隆抗體對(duì)人CCL21或人CCR7進(jìn)行靶向治療.在 第63天，對(duì)采用試驗(yàn)的三種治療方式的三個(gè)C.B-17SCID/bg組進(jìn)行全肺組織學(xué) 調(diào)查，結(jié)果表明，正常成纖維細(xì)胞C.B-17SCID/bg組中，任何治療組(IgG治療、 抗CCL21抗體治療、抗CCR7抗體治療)均未見(jiàn)間質(zhì)性肺重塑跡象.但是這些 C.B-17SCID/bg組中，出現(xiàn)組織學(xué)明顯的正常成纖維細(xì)胞的血管積累.沒(méi)有一種 治療能改變接受正常成纖維細(xì)胞的C.B-17SCID/bg小鼠的這一特征.接受IgG的 NSIP成纖維細(xì)胞C.B-17SCID/bg組中間質(zhì)重塑明顯，但是通過(guò)在過(guò)繼轉(zhuǎn)移后第 35-63天施用抗CCL21抗體或抗CCR7抗體可消除這種重塑反應(yīng).同樣，接受 IPF/UIP成纖維細(xì)胞的IgG C.B-17SCID/bg組出現(xiàn)明顯間質(zhì)重塑，在過(guò)繼轉(zhuǎn)移 IPF/UIP成纖維細(xì)胞后笫35-63天施用抗CCL21抗體或抗CCR7抗體的 C.B-17SCID/bg組小鼠中則消失了 .罔此，CCL21或CCR7靶向治療(therapeutic targeting)可消除接受IIP成纖維細(xì)胞的C.B-17SCID/bg小鼠的間質(zhì)重塑的組織 學(xué)跡象.
接受人正常成纖維細(xì)胞或HP成纖維細(xì)胞的C.B-17SCID/bg小鼠進(jìn)行人 CCL21或CCR7靶向治療后，對(duì)鼠細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)基因進(jìn)行定量TAQMAN PCR 分析對(duì)抗體治療組的定量TAQMAN分析也證明抗CCL21和抗CCR7治療可 明顯改變MMP-2和MMP-19的轉(zhuǎn)錄物水平.將抗體治療的對(duì)照C.B-17SClD/bg 小鼠中這些MMPs的轉(zhuǎn)錄物水平與抗體治療的成纖維細(xì)胞攻擊的C.B-17SCID/bg 小鼠中的這些轉(zhuǎn)錄物水平進(jìn)行比較.與接受IgG的C.B-17SCID/bg組中的轉(zhuǎn)錄物 水平的倍數(shù)増加相比，抗CCL21抗體治療顯著降低了接受正常成纖維細(xì)胞的 C.B-17SCID/bg組中MMP-2轉(zhuǎn)錄物水平的倍數(shù)增加.與適當(dāng)?shù)腎gG組相比，抗
CCR7抗體治療顯著降低了 MMP-2轉(zhuǎn)錄物水平的倍數(shù)增加.對(duì)MMP-19的定量 TAQMAN分析表明，抗CCR-7顯著增加了接受正常成纖維細(xì)胞的 C.B-17SCID/bg組中的倍數(shù)變化，但是與適當(dāng)?shù)腎gG組相比，兩種抗體治療都顯 著增加這種轉(zhuǎn)錄物的倍數(shù)變化.因此，對(duì)抗體治療顯著改變了用人成纖維細(xì)胞攻 擊的C.B-17SCID/bg小鼠的細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄物表達(dá).
人CCR7或CCL21的免疫中和顯著降低接受人IIP成纖維細(xì)胞的 C.B-17SCID/bg小鼠的全肺幾脯氨酸水平對(duì)來(lái)自IgG治療、抗CCL21治療或 CCR7治療的對(duì)照CB-17SCID/bg小鼠(即未接受人成纖維細(xì)胞的小鼠)以及接 受正常成纖維細(xì)胞、NSIP或IPF/UIP成纖維細(xì)胞的各組治療小鼠的全肺樣本進(jìn) 行羥脯氦酸水平測(cè)定.接受正常成纖維細(xì)胞和IgG的C.B-17SCID/bg小鼠全肺樣 本中的羥脯氨酸水平升高，但是兩種抗體治療均沒(méi)有改變這些水平.NSIP成纖維 細(xì)胞C.B-17SCID/bg組中，輕脯氨酸水平顯著高于對(duì)照C.B-17SCID/bg組中測(cè)定 的水平，并且與IgG治療組相比，抗CCL21抗體和抗CCR7抗體治療分別使羥 脯氨酸水平顯著降低了 52 ± 6.7%和51 ± 5.6%.在接受IgG的IPF/UIP成纖維細(xì) 胞C.B-17SCID/bg組中，羥脯氨酸水平顯著高于對(duì)照C.B-17SCID/bg組中測(cè)定的 水平.另外，與IgG治療的C.B-17SCID/bg IPF/U1P成纖維細(xì)胞組相比，抗CCL21 抗體和抗CCR7抗體治療組中，IPF/UIP成纖維細(xì)胞攻擊小鼠的羥脯氨酸水平分 別顯著降低了 66 ± 7.2%和59 ± 7.1%,因此，這些數(shù)據(jù)證明CCL21或CCR7把 向治療顯著降低C.B-17SCID/bg小鼠中過(guò)繼轉(zhuǎn)移NS1P或IPF/UIP成纖維細(xì)胞所 引起的肺重塑.
全肺細(xì)胞因子分析表明，接受IPF/UIP成纖維細(xì)胞和抗CCR7抗體治療的 C.B-17SCID/bg小鼠的肺中鼠CCL21水平顯著降低NSIP和IPF/UIP成纖維細(xì) 胞在C.B-17SCID/bg小鼠中的存在改變和/或升高了鼠IL-13、 CCL6和CCL21 的全肺水平，因此在第63天評(píng)價(jià)IgG和單克隆抗體治療對(duì)這些介質(zhì)的效果.抗 CCR7抗體和抗CCL21抗體治療對(duì)任何C.B-17SCID/bg成纖維細(xì)胞組的IL-13 或CCL6全肺水平都沒(méi)有影響.但是，與接受IPF/UIP成纖維細(xì)胞+lgG的 C.B-17SClD/bg組相比，抗CCR7抗體治療顯著降低接受IPF/UIP成纖維細(xì)胞 C.B-17SCID/bg組中鼠CCL21的全肺水平.因此，CCR7靶向治療降低鼠CCL21 水平，但是對(duì)其他兩種在IIP成纖維細(xì)胞模型中升高的介質(zhì)沒(méi)有影響.
討論本研究致力于以下兩個(gè)問(wèn)題l)過(guò)繼轉(zhuǎn)移的人肺成纖維細(xì)胞是否重塑
SCID小鼠的肺結(jié)構(gòu)？ 2) CCL21和CCR7在過(guò)繼轉(zhuǎn)移人成纖維細(xì)胞引起的重塑 反應(yīng)中發(fā)揮什么作用？第一個(gè)問(wèn)題的答案是肯定的，因?yàn)閷xio6 IPF/UIP或 NSIP成纖維細(xì)胞靜脈內(nèi)過(guò)繼轉(zhuǎn)移入缺乏適應(yīng)性及先天性免疫特征的 C.B-17SClD/bg小鼠可引起纖維化，所述纖維化經(jīng)組織學(xué)分析、分子分析和生物 化學(xué)分析證實(shí).通過(guò)治療性施用定向抗人CCL21或CCR7的單克隆抗體消除這 種纖維化，由此證明這種配體及其受體在肺纖維化中起主要作用，這與它們?cè)谀I 纖維化(Banas et al.， J. Immonul.， 2002， 168:4301-4307 )和肝纖維化(Bonacchi at a，.， Gastroenterology 2003， 125:1060-1076 )中的作用相似，
雖然已知和假設(shè)的促纖維化介質(zhì)的鼠的等價(jià)物在接受IPF/UIP或NSIP成纖 維細(xì)胞的C.B-17SCID/bg小鼠中水平提高，但是這些介質(zhì)在纖維化過(guò)程中的作用 仍有疑問(wèn)，因?yàn)轱@示顯著降低肺重塑的多組C.B-17SCID/bg小鼠中，其水平?jīng)]有 變化.因此，本研究在過(guò)繼轉(zhuǎn)移IIP成纖維細(xì)胞促進(jìn)C.B-17SCID/bg小鼠的纖維 化方面提供了證據(jù)，并確立了新的IIP治療靶標(biāo).
臨床肺纖維化的建模一直是實(shí)驗(yàn)室的重大挑戰(zhàn)(Chua et al.， Am J. Resp. Cell M"Biol.， 2005 33:9-13).雖然疏酸博來(lái)審素是誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)性纖維化中選擇的一種 藥刑，但是博來(lái)霉素誘導(dǎo)的肺纖維化已經(jīng)被批評(píng)為不理想的IPF/UIP模型(Chua et al., Am J. Resp. Cell Mol. Biol.， 2005 33:9-13 ).我們意識(shí)到更新的肺纖維化棋 型應(yīng)體現(xiàn)盡可能多的臨床IIP特征，本研究利用這樣的觀察在這些疾病中成纖 維細(xì)胞主要負(fù)責(zé)嚴(yán)重且常常是致命的重塑(Zisman et al.， Meth. Mol. Med. 2005， 117:3-44). IPF/UIP或NSIP成纖維細(xì)胞的過(guò)繼轉(zhuǎn)移引發(fā)間質(zhì)重塑，并在靜脈內(nèi) 過(guò)繼轉(zhuǎn)移這些細(xì)胞系后第35天(但是不會(huì)更早)觀察到組織學(xué)明顯的纖維化.不 容易解釋纖維化的延遲顯現(xiàn)，但是這些發(fā)現(xiàn)與先前的研究是一致的，在先前的研 究中，將人上皮細(xì)胞過(guò)繼轉(zhuǎn)移入(:.8-178€: )/&經(jīng)小鼠，需要大約30-40天才能顯 現(xiàn)清晰的血管(Skovsethetal.， Am. J. Pathol.， 2002， 160:1629-1637 ).因此，本 研究強(qiáng)調(diào)通過(guò)過(guò)繼轉(zhuǎn)移人肺成纖維細(xì)胞在免疫缺陷小鼠中建立臨床相關(guān)的肺纖維 化模型.
本文所述的IPF/UIP和NSIP成纖維細(xì)胞C.B-17SCID/bg模型的明顯好處在 于其在試驗(yàn)這些疾病的新療法中的實(shí)用性.本研究致力于人CCL21和CCR7的 作用，我們已經(jīng)觀察到兩者在IIP活檢樣本(Choi et al" J. C,in. Pathol. 2006， 59:28-39 )和培養(yǎng)的IIP成纖維細(xì)胞中有顯著表達(dá).我們現(xiàn)在的假設(shè)是，抗人CCL21抗體和抗人CCR7抗體治療的療效與其否定CCL21對(duì)IPF/UIP和NSIP成纖維 細(xì)胞的促增殖效果有關(guān).但是這里所用的單克隆抗體不可能對(duì)靜脈注射的成纖維 細(xì)胞的遷移產(chǎn)生影響，因?yàn)榭贵w治療被延遲到C.B-17SCID/bg小鼠出現(xiàn)組織學(xué)明 顯的纖維化的時(shí)間點(diǎn).可以想象，如果用于其它肺纖維化模型，這種治療手段可 能影響對(duì)肺的纖維細(xì)胞補(bǔ)充.CCR7在纖維細(xì)胞上顯著表達(dá)(Abe et al.， J. Immunol" 2001， 166:7556-7563; Hashimoto et al" <! Clin. Invest., 2004 113:243-252 ) , CCL21促進(jìn)纖維細(xì)胞向各種組織位點(diǎn)的補(bǔ)充(Abe et al.， J. Immunol" 2001， 166:7556-7563 ).目前正在進(jìn)行的研究使用CCR7野生型和基罔 缺陷小鼠來(lái)閑明CCR7陽(yáng)性纖維細(xì)胞在博來(lái)莓素誘發(fā)的肺纖維化中的作用.
過(guò)繼轉(zhuǎn)移的人IIP成纖維細(xì)胞和與小鼠相關(guān)的纖維化成分(即細(xì)胞和介質(zhì)) 對(duì)C.B-17SCID/bg小鼠中觀察到的整體肺重塑反應(yīng)的確切作用尚待確定.在本研 究中，轉(zhuǎn)移的人成纖維細(xì)胞和小鼠成分之間看起來(lái)具有相互作用，其證振是在 C.B-17SCID/bg小鼠(最顯著的是接受了兩種IIP成纖維細(xì)胞中的任一種)的肺 中，鼠細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄物以及鼠可溶性促纖維化蛋白質(zhì)發(fā)生了動(dòng)力學(xué)變化. 雖然在這點(diǎn)上，對(duì)C.B-17SCID/bg小鼠的纖維化反應(yīng)中檢測(cè)到的可溶性鼠蛋白質(zhì) 的相對(duì)重要性仍有疑問(wèn)，但是相對(duì)于正常成纖維細(xì)胞C.B-17SClD/bg組的IIP成 纖維細(xì)胞C.B-17SCID/bg組中的組織蛋白醉E、 MMPs、細(xì)胞外基質(zhì)成分(即膠 原和纖維粘連蛋白)和MMPs抑制劑的變化可能說(shuō)明小鼠相關(guān)的纖維化成分積極 參與重塑反應(yīng).定量TAQMAN PCR證實(shí)了，相對(duì)于在接受正常成纖維細(xì)胞的 C.B-17SCID/bg小鼠中的這些基因的轉(zhuǎn)錄物水平變化，在接受HP成纖維細(xì)胞的 C.B-17SCID/bg組中的1型膠原、組織蛋白酶E、 MMP-19和TIMP-1轉(zhuǎn)錄物水 平顯著增加.這些轉(zhuǎn)錄物變化與臨床肺纖維化相關(guān)，因?yàn)榻M織蛋白醉(Kimuraet al.， J. Med. Invest 2005， 52:93-100; Wattiez et al" Electrophoresis 2000， 21:2703-2712 )、MMPs和TIMPs(綜述于Pardo et al. Proc, Am, Thorac Soc.， 2006， 3:383-388)、以及細(xì)胞外基質(zhì)(Kuhii and Mason, Am, J, Pathol. 1995j Adachi Am J. Pathol 1988， 133: 193-203 )在較嚴(yán)重的IIP類型(例如IPF/UIP和NSIP )中得 到增多，MMP-19在接受IPF/UIP成纖維細(xì)胞的C.B-17SCID/bg小鼠中增加最顯 著，雖然這種蛋白酶看起來(lái)在皮膚損傷康復(fù)反應(yīng)中起主要作用(Mauch J. Invest. Dermatol. 2003， 121注釋)，但是其在肺纖維化中的作用仍不知曉.幾乎沒(méi)有例 外地，使用定量TAQMAN PCR分析下，抗CCL21抗體和抗CCR7抗體治療減
少了所有上述鼠細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)的基罔產(chǎn)物.MMP-19是一個(gè)例外，對(duì)MMP-19 在過(guò)繼轉(zhuǎn)移人IIP成纖維細(xì)胞后引起的肺纖維化反應(yīng)中的相對(duì)重要性的深入研究 證明了這一點(diǎn)以及我們的其它發(fā)現(xiàn).
總之，本實(shí)例證明，通過(guò)靜脈過(guò)繼轉(zhuǎn)移IPF/UIP或NSIP原代成纖維細(xì)胞系 可將肺纖維化轉(zhuǎn)移至C.B-17SCID/bg小鼠.該模型在試驗(yàn)新型治療策略中的實(shí)用 性已得到證明，所述發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步支持CCL21-CCR7相互作用可能為臨床NSIP和 IPF/U1P的重要把標(biāo).
實(shí)施例5:特發(fā)性肺纖維化成纖維細(xì)胞的遷移以及CC趨化因子配體-21的增殖
本實(shí)施例的目的是檢驗(yàn)生長(zhǎng)自IPF/UIP和正常外科肺活檢樣的原代成纖維細(xì) 胞表達(dá)CCR7的功能和信號(hào)顯著性，從IPF/UIP和正常病人的外科肺活檢樣本培 養(yǎng)原代成纖維細(xì)胞.使用免疫細(xì)胞化學(xué)分析、基罔陣列、T叫man實(shí)時(shí)PCR、遷 移、增殖和蛋白質(zhì)印跡分析對(duì)經(jīng)過(guò)或未經(jīng)CC趨化罔子配體(CCL) 21治療的成 纖維細(xì)胞進(jìn)行功能、轉(zhuǎn)錄物和蛋白質(zhì)組學(xué)差異分析.
CCR7由IPF/UIP成纖維細(xì)胞(但非正常成纖維細(xì)胞)表達(dá).當(dāng)漆露于CCL21 時(shí)，IPF/UIP成纖維細(xì)胞(但非正常成纖維細(xì)胞)表現(xiàn)出明顯的遷移和增殖反應(yīng)， 其受百日咳毒素或CCR7的中和抗體的抑制.將IPF/UIP成纖維細(xì)胞曝露于 CCL21，改變了這些細(xì)胞中MEK1/2、 ERK 1/2和p90RSK的磷酸化狀態(tài)，該改 變被百日咳毒素或CCR7特異性小干擾RNA消除.這些數(shù)據(jù)合起來(lái)證明CCL21 調(diào)控IPF/UIP成纖維細(xì)胞的功能特性，但不調(diào)控非常成纖維細(xì)胞，
假設(shè)CCR7在HP SLBs的間質(zhì)中表達(dá)，發(fā)明者相信這種趨化因子受體可在來(lái) 源于SLB的原代成纖維細(xì)胞中表達(dá)并具有活躍的功能.在本研究中，當(dāng)曝露于 CCL21時(shí)，1PF/U1P成纖維細(xì)胞(但非正常成纖維細(xì)胞)中觀察到遷移和增殖活 動(dòng).IPF/UIP成纖維細(xì)胞膝露于CCL21引起IPF/UIP成纖維細(xì)胞中與胞外信號(hào)調(diào) 節(jié)激酶(ERK 1/2)信號(hào)傳導(dǎo)途徑有關(guān)的蛋白質(zhì)的磷酸化發(fā)生改變，這種改變可 被百日咳毒素或CCR7 siRNA阻滯.因此，這些數(shù)據(jù)說(shuō)明IPF/UIP成纖維細(xì)胞與 CCR7依賴型活化有關(guān)，由此CCR7成為IPF/1JIP中有吸引力的靶標(biāo).
病人所有病人在進(jìn)行纖維支氣管鏡檢之前接受臨床評(píng)價(jià)，包括胸片、肺功 能測(cè)試和薄切片電腦斷層掃描(thin-section computed tomography),在這些病 人中，綜合癥狀、生理癥狀和放射影像結(jié)果來(lái)確定疑患IIP者，招入本研究的病 人之前沒(méi)人經(jīng)歷過(guò)活檢手術(shù)或接受過(guò)HP治療.由密執(zhí)安大學(xué)醫(yī)學(xué)院IIP?？蒲?br> 究中心(IIP Specialized Center of Research)附屬的臨床中心(Clinical Core) 自2000年5月至2003年5月從疑患UIP或NSIP的病人獲得SLBs. SLBs得自 進(jìn)行SLB用于診斷IIP(如前所詳述)的所有病人的至少兩片肺葉(通常在左側(cè)). 組織學(xué)正常的肺得自經(jīng)受胸切除的病人的切除樣本獲得.在層流通風(fēng)櫥中用無(wú)菌 技術(shù)單獨(dú)處理每份活檢樣本，進(jìn)行原代成纖維細(xì)胞系的培養(yǎng)(見(jiàn)下文).
分離和培養(yǎng)成纖維細(xì)胞如先前所迷(Hogaboam et al.， Meths. Mol. Med.， 2005， 117:209-221 ),對(duì)來(lái)源于IPF/UIP或組織學(xué)正常的SLBs的成纖維細(xì)胞進(jìn)行 機(jī)械解離和培養(yǎng).
收集蛋白質(zhì)和提取RNA:以2.5M()S細(xì)胞/ml將原代成纖維細(xì)胞接種于12 孔組織培養(yǎng)板中，并允許貼壁過(guò)夜.用PBS洗滌成纖維細(xì)胞一次.在孔中加入500 pi含0.5% FBS的Dulbecco，s改進(jìn)的Eagle培養(yǎng)基(DMEM-0.5)，或加入500 p， 含有10 ng/ml CCL19或CCL21重組蛋白的DMEM-0.5 —式四份，培養(yǎng)24小時(shí). 收集不含細(xì)胞的上清液，儲(chǔ)存于-80lC直至進(jìn)行可溶性蛋白質(zhì)含量檢測(cè).除去上清 液后，每孔加入250 pi Trizol，根據(jù)生產(chǎn)商(Invitrogen， Carlsbad, CA)的說(shuō)明 提取RNA.
抗體Western抗體包括抗人CCR7單克隆抗體(R&D systems. Minneapolis, MN ) 、 Phospo-p44/42 Map激酶(Thr202/Tyr204 ) 、 Phospho-MEKl/2 (Ser217/221 ) 、 Phospho畫(huà)p90RSK ( Thr573 ) 、 Phospho畫(huà)SEKl/MKK4 (Ser257/Thr261 ) 、 Phospho-SAPK/JNK ( Thrl83/Tyr185 ) 、 Phospho-c-Jun (Ser63 ) II、 Phospho-p38 MAP激醉(Thrl80/Tyr182 ) 、 Phospho-MKK3/MKK6 (serl89/207)(全部來(lái)自Cell Signaling, Danvers， MA);抗P肌動(dòng)蛋白、抗 -GAPDH、兔抗a平滑肌肌動(dòng)蛋白多克隆抗體(Abcam， Cambridge, MA ) 所用 的其他抗體有Anti-rabbit， HRP conjugated, Anti-mouse, HRP conjugated, anti-biotin， HRP conjugated (Cell Signaling, Danvers， MA),
基罔陣列用購(gòu)自SuperArray (Carlsbad, CA)的特異性趨化因子和趨化因 子受體基因陣列分析人CCR7、 CCL19和CCL21基因的表達(dá).
TAQMan分析如前所述(19)，通過(guò)實(shí)時(shí)定量RT-PCR程序，使用7500 實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)(Applied Biosystems， Foster City, CA)對(duì)IPF/UIP和正常成纖 維細(xì)胞中的CCR7和GAPDH表達(dá)進(jìn)行分析.所有抗體和探針均購(gòu)自Applied Biosystems (Foster City, CA),在計(jì)算表達(dá)變化之前用GAPDH對(duì)CCR7的表
達(dá)進(jìn)行標(biāo)化，在計(jì)算表達(dá)的倍數(shù)變化之前，將CCR7的表達(dá)歸一化至GAPDH.
免疫細(xì)胞組織化學(xué)(Imiminocytohistochemistry):按生產(chǎn)商(R & D Systems, Minneapolis, MN )的說(shuō)明，使用HRP-AEC細(xì)胞和組織染色試刑盒，通過(guò)免疫細(xì) 胞化學(xué)方法對(duì)人CCR7蛋白的表達(dá)進(jìn)行分析.
成纖維細(xì)胞遷移測(cè)定在存在或沒(méi)有10ng/ml CCL19或CCL21的條件下， 將原代IPF/UIP和正常成纖維細(xì)胞加到6孔培養(yǎng)板中的8 pm transwell inserts中， 培養(yǎng)24小時(shí)，將遷移至底孔中的成纖維細(xì)胞固定、蘇木精染色并計(jì)數(shù).為了測(cè)試 受體或配體的特異性，每孔加入5時(shí)/m，抗人CCR7、 CCL19或CCL21抗體. 加入5pg/m，IgG或10plPBS，作為對(duì)照.
增殖分析如前所述(9)，在24孔培養(yǎng)板中用卩H1胸腺嘧啶脫氣核苷摻入 法分析成纖維細(xì)胞的增殖能力.
Sircol膠原分析用Biocolor Sircol膠原分析(Accurate Chemical & Scientific Corp， Westbury， NY )測(cè)定可溶性膠原的含量.分析時(shí)，將100 pl不含細(xì)胞的上 清液樣品加到1 ml Sircol染料中，室溫振搖30分鐘，然充后以10,000 x g離心 試管10分鐘.除去染料，在每個(gè)試管中加入l m，堿溶液，分混勻.分析讀數(shù) 每份溶液取200 pl，連同200 pl標(biāo)準(zhǔn)品轉(zhuǎn)移至96孔光學(xué)平底板(optical flat-bottom plate).用讀板儀在540nm處讀板，將濃度歸一化至Bradford分析確定的總蛋 白含量.
Bioplex蛋白測(cè)定用細(xì)胞外抗體試劑盒(Invitrogen BioSource， Carlsbad, CA)和Bio-Rad Luminex Bio-Plex 200 System ( Hercules, CA)分析不含細(xì)胞的 上清液樣品中的人RANTES/CCL5.簡(jiǎn)而言之，50 pi不含細(xì)胞的上清液樣品和標(biāo) 準(zhǔn)品與50 pi multiplex珠子在振蕩器中辨育30分鐘.用洗滌緩沖液洗滌珠子3次， 每次100 pi.然后與25nl檢測(cè)抗體溶液在振蕩器中孵育30分鐘.再洗滌3次后， 加入鏈審親和素-PE ( str印tavidin-PE)，珠子在振蕩器中孵育10分鐘，再洗滌 3次.將珠子重懸浮于分析緩沖液中，用上述系統(tǒng)讀數(shù).
Western Blot分析以5><105細(xì)胞/孔，將成纖維細(xì)胞接種于6孔板中，并允 許貼壁過(guò)夜.然后使成纖維細(xì)胞在不含血清的DMEM中饑俄M小時(shí).成纖維細(xì) 胞用0.5%小牛血清DMEM或摻加10 ng/ml CCL19或CCL21重組蛋白的相同培 養(yǎng)基處理0.5、 2、 5、 30分鐘. 一些成纖維細(xì)胞在處理前舉露于200nM百曰咳毒 素(Sigma，St. Louis，MO) 2小時(shí).然后用水冷的磷酸鹽緩沖鹽水洗滌成纖維細(xì)胞，用500 pl冰冷的裂解緩沖液裂解，所述裂解緩沖液的由1% Triton X-IOO、 50mMNaF、 2 mM EDTA、 (U5MNaCI、 0.01 M褲酸鈉、200pM原釩酸鈉、5 pg/ml胃蛋白酶、5 pg/m，亮抑酵肽和100 nM花萼海綿誘癌素組成.在冰上醉育 5分鐘后，刮下成纖維細(xì)胞裂解物，轉(zhuǎn)移至試管中.用Bradford分析測(cè)定總蛋白 含量，將含有20 pg總蛋白質(zhì)的樣品與4 pl 4xLDS樣品緩沖液(Invitrogen， Carlsbad, CA)和雙重去離子水(ddH20)混合，90X:煮沐5分鐘，然后在4-12% NuPage Bis-Tris凝膠(Invitrogen， Caiisbad， CA)中通過(guò)SDS-PAGE分離.將 蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(Invitrogen, Carlsbad， CA)上.用含5% NFDM的1 x TBS/T封閉后，用原發(fā)性phospho-抗體印跡膜、經(jīng)去除(RestoreTM Western Blot Stripping Buffer, Pierce, Rockford， IL )、洗滌和GAPDH (加樣對(duì)照)再印跡.
siRNA的轉(zhuǎn)染為了阻斷CCR7的表達(dá)，用Qiagen custom synthesis site制 備小干擾RNA (siRNA),用Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) 將兩個(gè)候選siRNA轉(zhuǎn)染至lPF/UlP肺成纖維細(xì)胞中，用Taqman分析CCR7，以 測(cè)試其有效性.將更有效的 siRNA (約 70%敲減， AGCGGACATCAGCTGGTCAA )用于Erk 1/2途徑磷酸化的Western蛋白質(zhì)印 跡分析，
生長(zhǎng)自正常及IPF/UIP SLBs的成纖維細(xì)胞中存在CCR7、 CCL19和CCL21 基因表達(dá).用特異性人趨化因子和趨化閎子受體SuperArray對(duì)3個(gè)正常SLB來(lái) 源的成纖維細(xì)胞系和3個(gè)IPF/UIP來(lái)源的成纖維細(xì)胞細(xì)進(jìn)行RNA分析.該分析 表明，在兩組細(xì)胞中都存在CCR7、 CCL19和CCL21，但是CCR7在IPF/UIP 成纖維細(xì)胞系中的表達(dá)明顯高于在正常成纖維細(xì)胞系中的表達(dá).用TAQMAN實(shí) 時(shí)PCR對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行進(jìn)一步分析，證實(shí)了在用于本研究的所有成纖維細(xì)胞系中 均存在CCR7、 CCL19和CCL21的轉(zhuǎn)錄物.因此，這些數(shù)據(jù)證明CCR7、 CCL19 和CCL21基因轉(zhuǎn)錄物存在于正常成纖維細(xì)胞和IPF/UIP成纖維細(xì)胞中.
標(biāo)記的CCR7蛋白表達(dá)存在于IPF/UIP成纖維細(xì)胞中，但在正常成纖維細(xì)胞 中不存在.發(fā)明者已經(jīng)表明接近100%的UIP SLBs在間質(zhì)區(qū)既有灶性CCR7蛋 白表達(dá)又有彌散性CCR7蛋白表達(dá).而且，CCR7局灶區(qū)似乎與組織學(xué)明顯的成 纖維細(xì)胞灶一致，為了測(cè)定生長(zhǎng)自正常SLBs和IPF/UIP SLBs的原代成纖維細(xì)胞 是否表達(dá)CCR7，對(duì)CCR7進(jìn)行了免疫細(xì)胞化學(xué)染色.IPF/UIP成纖維細(xì)胞呈現(xiàn) 強(qiáng)的CCR7陽(yáng)性，然而正常成纖維細(xì)胞很少表達(dá)或不表達(dá)CCR7. CCL21定向IPF/UIP成纖維細(xì)胞的遷移，但不定向正常成纖維細(xì)胞，CCR7 的表達(dá)在成熟樹(shù)突狀細(xì)胞上受到升調(diào)節(jié)，從而使這些細(xì)胞遷移至淋巴結(jié)，用于免 疫激活(Sozzani et al.， J. ImmunoL， 1998， 161(3):1083-1086)),在某些乳腺癌細(xì) 胞(Muller et al" Nature, 2001， 410(6824):50-56 )和黑素瘤細(xì)胞(Murakam et al" J. Dermatol. Sci" 2004， 36(2):71-78 )上，已證明CCR7和CCL21的相互作用對(duì) 于轉(zhuǎn)移有重要作用，在本研究中，CCL19和CCL21都促進(jìn)IPF/UIP成纖維細(xì)胞 的遷移，但對(duì)正常成纖維細(xì)胞不促進(jìn).但是，CCL21是IPF/UIP成纖維細(xì)胞遷移 的更有效的誘導(dǎo)劑，將這些細(xì)胞的遷移增強(qiáng)到比只接觸單獨(dú)的DMEM的IPF/UIP 成纖維細(xì)胞培養(yǎng)物高約7倍，為了檢驗(yàn)這種遷移是否依賴于CCR7，在三份孔中 分別加入IgG、抗人CCR7抗體或抗人CCL21抗體(全部為5 pg/ml).雖然IgG 的存在不改變IPF/UIP成纖維細(xì)胞的遷移，但是抗CCR7抗體或抗CCL21抗體 顯著抑制了 IPFAJIP成纖維細(xì)胞的遷移反應(yīng).用200 ng/ml百日咳毒素預(yù)處理成 纖維細(xì)胞也抑制了由CCL21誘導(dǎo)的IPF/UIP成纖維細(xì)胞的遷移反應(yīng)，閎此，這 些數(shù)據(jù)表明CCR7活化促進(jìn)IPF/UIP成纖維細(xì)胞(但非正常成纖維細(xì)胞)的遷移.
CCR7活化刺激原代IPF/UIP成纖維細(xì)胞的增殖.IPF/UIP表征為肺泡和肺 間質(zhì)的嚴(yán)重結(jié)疤，這部分由極度纖維増生所致.在本研究中觀察到了增強(qiáng)的 IPF/UIP成纖維細(xì)胞系增殖反應(yīng)，其中所有三個(gè)IPF/UIP細(xì)胞系顯示約3倍高于 所研究的正常成纖維細(xì)胞系的基線(即單獨(dú)DMEM)增殖速度.另外，加入10 ng/ml CCL21 (但非CCL19)顯著提高了所有三個(gè)原代IPF/UIP成纖維細(xì)胞系的 增殖特性，高于只暴露于DMEM的培養(yǎng)物.CCL19或CCL21的存在不改變正 常成纖維細(xì)胞的増殖特性.
CCR7活化促進(jìn)原代IPF/UIP成纖維細(xì)胞產(chǎn)生CCL5 (但非從頭產(chǎn)生膠原). 先前的研究已經(jīng)表明，趨化因子可驅(qū)動(dòng)各種細(xì)胞中其它趨化因子的表達(dá).例如， 在IPF/UIP成纖維細(xì)胞培養(yǎng)物中加入CCL5顯著增強(qiáng)CCL7的表達(dá)，CCL7為公 認(rèn)的IPF/UIP生物標(biāo)記物.為了測(cè)定經(jīng)由CCL21的CCR7活化是否改變IPF/UIP 和正常成纖維細(xì)胞產(chǎn)生趨化閎子的特性，在進(jìn)行多重可溶性蛋白質(zhì)分析之前，將
胞的培養(yǎng)物中，CCL21顯著提高了 IPF/UIP (但非正常成纖維細(xì)胞)中的CCL5 水平.令人驚訝的是，如用Sircol膠原分析法所測(cè)定的，CCL21在IPFAJIF成纖 維細(xì)胞培養(yǎng)物中存在24小時(shí)，并未改變其對(duì)可溶性膠原的合成.該數(shù)據(jù)連同先前
CCL21 24小時(shí).CCL5存在于IPF/U1P和正常成纖維細(xì) 研究的數(shù)據(jù)表明，CCR7活化增強(qiáng)了 IPF/UIP成纖維細(xì)胞合成趨化因子的能力.
a平滑肌肌動(dòng)蛋白(aSMA)在原代IPF/UIP成纖維細(xì)胞和原代正常成纖維 細(xì)胞中的表達(dá)不受CCL21的影響.
aSMA是用于高合成性成纖維細(xì)胞亞型(稱為成肌纖維細(xì)胞)的蛋白質(zhì)標(biāo)記 物(White et al" Am. J. Respir. Crit. Care Med" 2006， 173(l):112-1121 ) 假設(shè) CCL21對(duì)IPF/UIP成纖維細(xì)胞合成趨化罔子有重大的影響，我們接下來(lái)研究 CCR7配體是否改變aSMA在這些細(xì)胞中的表達(dá).蛋白質(zhì)印跡分析表明，IPF/UIP 成纖維細(xì)胞培養(yǎng)物中表達(dá)的aSMA水平比正常成纖維細(xì)胞培養(yǎng)物高，這與 IPF/UIP細(xì)胞更高的合成特性是吻合的.但是，CCL21的存在不影響aSMA的表 達(dá).雖然aSMA陽(yáng)性IPF/UIP成纖維細(xì)胞表達(dá)CCR7 (基于免疫細(xì)胞化學(xué)分析)， 但是在這些細(xì)胞中加入CCL21看起來(lái)并沒(méi)有進(jìn)一步提高這種蛋白的水平，說(shuō)明 CCR7活化不是成纖維細(xì)胞分化為成肌纖維細(xì)胞的主要剌激因素，
CCL21激活CCR7后，IPF/UIP成纖維細(xì)胞的P44/p42胞外信號(hào)相關(guān)激蘇 (ERK 1/2)信號(hào)傳導(dǎo)途徑被激活.許多重要的細(xì)胞功能受到合稱為促分裂原活 化蛋白激酶(MAPK)途徑的一組信號(hào)蛋白的調(diào)控.每種途徑對(duì)細(xì)胞周期、生長(zhǎng) 和遷移有獨(dú)特的影響，這部分因?yàn)槊糠N途徑由獨(dú)特的剌激物激活，包括生長(zhǎng)因子、 應(yīng)激和炎性細(xì)胞因子.這些刺激物引發(fā)的級(jí)聯(lián)激活涉及MAPKK激蘇、MAPK激 酶和MAPK的順序磷酸化.最后一步使MAPK進(jìn)入細(xì)胞核，激活一種或數(shù)種下 游轉(zhuǎn)錄因子，從而引起生物學(xué)反應(yīng)，例如細(xì)胞的增殖、遷移和存活.為了確定活 化的CCR7對(duì)MAPK途徑的影響，分別在30秒以及2、 5和30分鐘收集未經(jīng)處 理且經(jīng)CCL21激活的成纖維細(xì)胞相關(guān)蛋白質(zhì)，對(duì)ERK 1/2、 p38和c-Jun N-末 端激酶(JNK) MAPK途徑進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析.在IPF/UIP成纖維細(xì)胞培養(yǎng)物 中加入CCL21后，雖然與p38和JNK途徑相關(guān)的信號(hào)蛋白的褲酸化沒(méi)有變化， 但是ERK 1/2途徑顯示出罅酸化變化的跡象.另外，該途徑?jīng)]有c-RAF和 MAPKKK轔酸化的跡象.
暴露于CCL21后，IPF/UIP成纖維細(xì)胞中的促分裂原活化蛋白激酶激醉 (MEK 1/2)發(fā)生褲酸化.未經(jīng)處理(即血清饑俄)的原代正常成纖維細(xì)胞系和 原代IPF/UIP成纖維細(xì)胞系未顯示組成性激活的MEK 1/2.正常成纖維細(xì)胞中單 獨(dú)加入DMEM-0.5,導(dǎo)致MEK1/2的褲酸化呈時(shí)間依賴性增加，5分鐘時(shí)達(dá)到最 離.但是，存在10 ng/ml的CCL21不改變這種磷酸化概況.雖然單獨(dú)加入
DMEM-0,5促進(jìn)IPF/UIP成纖維細(xì)胞中MEK 1/2的時(shí)間依賴性活化，5分鐘達(dá)到 峰值，但是加入CCL21 (10 ng/ml)在2分鐘和5分鐘引起褲酸化的增加，MEK 1/2磷酸化水平在30分鐘終點(diǎn)回到培養(yǎng)基水平.這些數(shù)據(jù)合起來(lái)說(shuō)明IPF/UIP成 纖維細(xì)胞漆露于CCL21時(shí)加快MEK 1/2的活化.
CCL21加速IPF/UIP成纖維細(xì)胞中ERK 1/2的活化.未經(jīng)處理的原代正常 成纖維細(xì)胞和原代IPF/UIP成纖維細(xì)胞顯示組成性ERK 1/2轔酸化，但是該 MAPK在正常成纖維細(xì)胞中的基線活性看來(lái)比在IPF/UIP成纖維細(xì)胞中高，這說(shuō) 明組成性ERKl/2褲酸化很少。正常成纖維細(xì)胞中單獨(dú)加入DMEM-0.5，在5分 鐘時(shí)ERK 1/2活化達(dá)到頂峰.在暴露于摻加10 ng/ml CCL21的DMEM-0.5的正 常成纖維細(xì)胞中觀察到類似的ERK 1/2活化模式，但是這些培養(yǎng)物中的總體ERK 1/2褲酸化水平較低.在IPF/UIP成纖維細(xì)胞培養(yǎng)物中單獨(dú)加入DMEM-0.5所產(chǎn) 生的ERK 1/2磷酸化模式與正常成纖維細(xì)胞培養(yǎng)物中觀察到的相似，但是， IPF/UIP成纖維細(xì)胞中的活化程度比正常成纖維細(xì)胞中的高得多.相比于只啄露 于DMEM-0.5的那些成纖維細(xì)胞培養(yǎng)物中的ERK 1/2褲酸化，舉霧于CCL21和 DMEM-0.5的IPF/UIP成纖維細(xì)胞培養(yǎng)物中的ERK 1/2褲酸化在2分鐘時(shí)顯著増 加.由于IPF/UIP成纖維細(xì)胞中的低組成性ERK 1/2鱗酸化，這些細(xì)胞啄露于 DMEM-0.5或DMEM-0.5+10 ng/ml CCL21后的磷酸化水平比含有未經(jīng)處理的 IPF/UIP成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)物高60-125倍.
CCL21促進(jìn)IPF/UIP成纖維細(xì)胞中的核糖體56激醉(p90RSK)磷酸化.已 經(jīng)顯示，在拔細(xì)胞生成方面，p90RSK被趨化因子CXCL12激活(Lee et a，.， 2002， Blood 99(12):4307-4317 ).本研究對(duì)p90RSK的分析顯示，這種轉(zhuǎn)錄罔子(位于 ERK 1/2的下游)以褲酸化狀態(tài)存在于未處理的正常和IPF/UIP成纖維細(xì)胞中. 正常成纖維細(xì)胞培養(yǎng)物中p90RSK活化的變化相似，與CCL21是否存在無(wú)關(guān)， 相反，CCL21在IPF/UIP成纖維細(xì)胞培養(yǎng)物中的存在，在各測(cè)試時(shí)間點(diǎn)都加強(qiáng)了 這種轉(zhuǎn)錄罔子的褲酸化，大約比未處理的培養(yǎng)物中見(jiàn)到的高2.5倍.這些數(shù)據(jù)合 起來(lái)表明CCR7是IPF/UIP成纖維細(xì)胞中的一種活性受體，該受體看來(lái)至,部分 通過(guò)ERK 1/2途徑進(jìn)行信號(hào)傳導(dǎo).雖然正常成纖維細(xì)胞表現(xiàn)出ERK 1/2途徑的活 化，這種活化看起來(lái)與CCL21的存在無(wú)關(guān).
百曰咳毒素抑制G-蛋白或小干擾RNA靜默CCR7基罔削弱CCL21介導(dǎo)的 ERKl/2活化.為了驗(yàn)證CCR7在IPF/U1P成纖維細(xì)胞活化中的作用，進(jìn)行其它
研究來(lái)檢驗(yàn)百日咳毒素(Gi和Go蛋白抑制劑)或siRNA介導(dǎo)的CCR7基因沉默 是否消除CCL21對(duì)ERKl/2活化的作用.轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，特異性CCR7 siRNA 的加入將該受體的蛋白質(zhì)表達(dá)減少約70%.在這些研究期間，這種對(duì)CCR7蛋白 表達(dá)的抑制持續(xù)30分鐘.Lamin A/C特異性siRNA和隨機(jī)siRNA對(duì)IPF/UIP成 纖維細(xì)胞的CCR7蛋白表達(dá)都沒(méi)有任何影響.因此，這些數(shù)據(jù)表明使用特異性 siRNA在體外成功定向CCR7.在IPF/UIP成纖維細(xì)胞培養(yǎng)物中存在百日咳毒素 或CCR7siRNA，將MEK1/2、 ERK 1/2和p90RSK褲酸化水平降低至與暴露于 單獨(dú)的DMEM-0.5的培養(yǎng)物相同的水平.幾項(xiàng)研究已經(jīng)表明，原代人肺成纖維細(xì) 胞對(duì)趨化因子產(chǎn)生促纖維化活化反應(yīng)(Atamas et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol" 2003， 29(6):743-9; Keane et al.， J. Immunol" 1997, 159(3):1437-1443; Prasse et al" Am. J. Respir. Crit. Care Med" 2006， 173(7)781-792; Puxeddu et a，" J. AHergy CHn. Immunol., 2006， 117(1): 103-110),并且是趨化因子的穩(wěn)固來(lái)源 (Keane et al" J* Immunol" 1997， 159(3): 1437-14化Prasse et al" Am, J, Respir, Crit. Care Med.， 2006， 173(7)781-79).
本研究致力于來(lái)自疾病診斷時(shí)取得的SLBs的原代IPF/UIP成纖維細(xì)胞表達(dá) CCR7的作用.與來(lái)源于切除的肺部腫癌的正常邊緣的原代正常成纖維細(xì)胞不同， IPF/UIP成纖維細(xì)胞和aSMA陽(yáng)性成肌纖維細(xì)胞表達(dá)CCR7 (被認(rèn)為是局限于造 血源細(xì)胞的一種受體).通過(guò)CCL21 (CCL19較少)的CCR7活化促進(jìn)和/或顯 著加強(qiáng)IPF/UIP成纖維細(xì)胞的遷移、增殖和趨化罔子合成特征.外源性CCL21 通過(guò)CCR7依賴的方式激活Erk 1/2 MAPK途徑.罔此，本研究提示IPF/UIP成 纖維細(xì)胞具有響應(yīng)CCR7配體的能力，CCR7配體在肺中有豐富表達(dá)，不管病情 如何(Choi et a，., J. C，in. Pathol" 2006 59(l):28-39)，這種反應(yīng)性可能在表征 IPF/UIP的過(guò)度纖維増生中發(fā)揮主要作用.
總之，本實(shí)施例說(shuō)明來(lái)源于IPF/UIP SLBs的原代人成纖維細(xì)胞表達(dá)功能性 CCR7.由其配體(特別是CCL21)活化CCR7，誘導(dǎo)IPF/UIP成纖維細(xì)胞的遷 移、增殖和趨化因子合成.通過(guò)CCR7的CCL21誘導(dǎo)活化是G-蛋白依賴性的， 與ERK1/2MAPK途徑的激活有關(guān).根據(jù)該數(shù)據(jù)和其他證據(jù)，對(duì)CCL21定向抑 制實(shí)驗(yàn)性腎小球(Banas et al" J. Immunol" 2002， 168(9):4301-4307 )和肝 (Bonacchi et a，. Gastroenterology, 2003， 125(4): 1060-1076)結(jié)疤，認(rèn)為CCR7 代表IPF/UIP的新靶標(biāo).此外，數(shù)據(jù)表明CCL21誘導(dǎo)的MEK 1/2、 ERK 1/2和
p90RSK褲酸化依賴于功能性G-蛋白偶聯(lián)的信號(hào)傳導(dǎo)和CCR7.
貫穿本說(shuō)明書(shū)中以及在隨附的權(quán)利要求書(shū)中，除非上下文另有要求，詞語(yǔ)"包 含"或其變化，如"comprises"或"comprising"應(yīng)被理解為暗示包括聲明的整 數(shù)或步樣，或一組整數(shù)或步驟，但是不排除其它整數(shù)或步騍，或整數(shù)或步驟組.
根據(jù)本公開(kāi)內(nèi)容，無(wú)需進(jìn)行過(guò)度實(shí)驗(yàn)，能夠制備和實(shí)施本文所公開(kāi)或要求保 護(hù)的所有組合物和/或方法.雖然已經(jīng)以具體實(shí)施方案的形式描述了本發(fā)明的組合 物和方法，本領(lǐng)域技術(shù)人貝顯然能夠在不脫離本發(fā)明的概念、精神和范閨的條件 下，n對(duì)本文描述的組合物和/或方法以及方法的步錄或步錄的順序加以變化.更 具體地，顯然，可以使用某些化學(xué)或生理學(xué)上均相關(guān)的藥劑來(lái)替代本文描述的藥 刑而獲得相同或相似的結(jié)果.所有這些相似的替代或修改對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是 明顯的，且被認(rèn)為包含在所附權(quán)利要求所定義的發(fā)明精神、范困和概念之內(nèi).
在其對(duì)本文提出的那些內(nèi)容提供示例程序或其他細(xì)節(jié)補(bǔ)充的程度上，貫穿本
文引用的參考文獻(xiàn)，均通過(guò)引用具體并入本文.
權(quán)利要求
1.一種治療哺乳動(dòng)物慢性纖維化疾病的方法，其包括降低纖維細(xì)胞和/或成纖維細(xì)胞中CCL21的存在量或活性，所述纖維細(xì)胞和/或成纖維細(xì)胞存在于所述纖維化疾病的纖維化損害處。
2. 權(quán)利要求l所述的方法，其中所述方法進(jìn)一步包括降低與所述纖維化疾病 有關(guān)的成纖維細(xì)胞中CCL19的存在量或活性.
3. 權(quán)利要求l所述的方法，其中所述降低CCL21的存在量或活性包括使所 述哺乳動(dòng)物與從成纖維細(xì)胞去除CCL21的藥劑接觸，所述藥刑的量為有效減輕 所述慢性纖維化疾病的一種或多種癥狀的量.
4. 權(quán)利要求3所述的方法，其中所述藥劑是與CCL21發(fā)生特異性免疫反應(yīng) 的抗體，
5. 權(quán)利要求4所述的方法，其中與其它趨化因子相比，所述抗體優(yōu)先識(shí)別 CCL21上的表位.
6. 權(quán)利要求l所述的方法，其中所述降低CCL21的存在量或活性包括使所 述哺乳動(dòng)物與咸少CCL21在成纖維細(xì)胞中的表達(dá)的藥刑接觸，所述藥刑的量為 有效減輕所迷慢性纖維化疾病的一種或多種癥狀的量.
7. 權(quán)利要求6所述的方法，其中所述藥劑是定向抗CCL21的siRNA分子.
8. 權(quán)利要求l所述的方法，其中所述纖維化疾病選自肺纖雉化、慢性阻塞性 肺病、肝纖維化、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、充血性心力表竭、慢性腎病、過(guò)敏性肺炎、呼 吸性細(xì)支氣管炎/間質(zhì)性肺病、曼氏血吸蟲(chóng)感染、由叢狀損害引起的原發(fā)性肺動(dòng)脈 高壓、皰疹病毒相關(guān)疾病的肺表現(xiàn)、皰疹病毒相關(guān)疾病的皮膚表現(xiàn)、瘢痕疙瘩、 狼瘡、腎源性纖維化皮膚病、日本血吸蟲(chóng)感染相關(guān)的纖維化損害、自身免疫性疾 病、致病性纖維化、萊姆病、胰腺炎中的基質(zhì)重塑和基質(zhì)纖維化、子宮肌瘤、卵 巢纖維化、角膜纖維化、充血性心力衰竭和其他缺血后遣癥、術(shù)后腹部結(jié)疤、開(kāi) 角型青光眼小梁切除術(shù)后結(jié)疤，及其任意組合.
9. 權(quán)利要求8所述的方法，其中所述纖維化疾病為慢性肺纖維化.
10. 權(quán)利要求3或6所迷的方法，其包括在纖維化損害位點(diǎn)局部施用所述藥劑.
11. 權(quán)利要求10所述的方法，其中所述纖維化損害在肺內(nèi)，且所述組合物與 所述損害局部接觸.
12. 權(quán)利要求3或6所迷的方法，其中所述藥刑包含將所述藥刑特異性定但 于纖維化損害位點(diǎn)的靶向部分.
13. 權(quán)利要求12所述的方法，其中所述纖維化損害在肺內(nèi)，且所述組合物與 所述損害局部接觸.
14. 權(quán)利要求3所述的方法，其中使用選自以下的給藥方式施用所述抗體， 包括局部給藥、注射、吸入、儲(chǔ)庫(kù)式或泵式持續(xù)釋放，或其任意組合.
15. 抑制成纖維細(xì)胞和/或纖維細(xì)胞増殖的方法，其包括使所迷成纖維細(xì)胞和 /或纖維細(xì)胞與組合物接觸，所述組合物包含抗CCL21抗體或設(shè)計(jì)為抗CCL21 的siRNA分子，
16. 權(quán)利要求15所述的方法，其進(jìn)一步包括使所述成纖維細(xì)胞與組合物接觸， 所述組合物包含抗CCL19抗體或設(shè)計(jì)為抗CCL19的siRNA分子.
17. 權(quán)利要求15或16所述的方法，其進(jìn)一步包括使所述成纖維細(xì)胞與組合 物接觸，所述組合物包含抗CCR7抗體或設(shè)計(jì)為抗CCR7受體的siRNA分子.
18. 權(quán)利要求15所述的方法，其中所迷纖維細(xì)胞和/或成纖維細(xì)胞位于體外.
19. 權(quán)利要求15所述的方法，其中所述纖維細(xì)胞和/或成纖維細(xì)胞位于體內(nèi).
20. 權(quán)利要求15所述的方法，其中所述纖維細(xì)胞和/或成纖維細(xì)胞位于體內(nèi) 肺組織中.
21. 抑制纖維細(xì)胞遷移和/或成纖維細(xì)胞活化的方法，其包括使所述纖維細(xì)胞 和/或成纖維細(xì)胞與抑制CCL21活性的組合物接觸.
22. 權(quán)利要求21所述的方法，其中所述纖維細(xì)胞位于哺乳動(dòng)物體內(nèi)，且所述 方法抑制纖維細(xì)胞向所述哺乳動(dòng)物的肺組織遷移，由此防止細(xì)胞外基質(zhì)的過(guò)度產(chǎn) 生.
23. 權(quán)利要求21所述的方法，其中所述成纖維細(xì)胞為位于哺乳動(dòng)物肺組織中 的固有肺成纖維細(xì)胞，且所述方法抑制所述哺乳動(dòng)物肺組織中的所述成纖維細(xì)胞 的活化，由此防止細(xì)胞外基質(zhì)的過(guò)度產(chǎn)生.
24. 治療肺纖維化的方法，其包括通過(guò)抑制所述纖維細(xì)胞和/或所述成纖維細(xì) 胞中CCL21的活性或表達(dá)來(lái)抑制罹患纖維化肺病的哺乳動(dòng)物的纖維細(xì)胞的遷移 和/或位于肺組織中的固有肺成纖維細(xì)胞的活化，由此防止細(xì)胞外基質(zhì)的過(guò)度產(chǎn)生 并改善肺纖維化癥狀，
25.權(quán)利要求24所述的方法，其中CCL21的存在量或活性的藥刑，其中所述藥刑可在放射治療之前、和/或期間、 和/或之后施用.
26. 權(quán)利要求25所述的方法，其中所述方法進(jìn)一步包括施用降低與所述纖維 化疾病有關(guān)的成纖維細(xì)胞中CCL19的存在量或活性的藥刑，
27. 對(duì)受試者治療或抑制藥物誘發(fā)的肺纖維化發(fā)展的方法，其包括對(duì)所述受 試者施用降低所述受試者肺組織中纖維細(xì)胞和/或成纖維細(xì)胞中CCL21的存在量 或活性的藥刑，其中所述藥刑可在給藥之前、和/或期間、和/或之后施用.
28. 權(quán)利要求27所述的方法，其中所述方法進(jìn)一步包括施用降低與所述纖維 化疾病有關(guān)的成纖維細(xì)胞中CCL19的存在量或活性的藥劑.
29. 權(quán)利要求27所述的方法，其中所述藥物選自細(xì)胞毒素刑、抗生素、抗心 律失常藥、消炎藥和違禁藥.
30. 權(quán)利要求27所述的方法，其中所述藥物選自兩性霉素B、博來(lái)審素、溴 麥角隱亭、白消安、卡馬西平、苯丁酸氮芥、可卡因、環(huán)磷跣胺、苯妥英、麥角 胺、象卡尼、海洛罔、美法侖、美沙新、甲氛蝶呤、哌甲醋、美西麥角、礦物油、 呋喃妥因、亞硝基脲類、丙卡巴肼、硅稱、柳氳磺吡啶、妥卡尼和長(zhǎng)春花生物堿 類藥刑.
31. 權(quán)利要求24~30中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述藥刑與皮質(zhì)類閨醇、免 疫抑制劑、抗凝刑、利尿劑、強(qiáng)心式、鈣通道阻斷劑、血管擴(kuò)張劑、前列環(huán)素類 似物、內(nèi)皮素拮抗劑、褲酸二酯酶抑制刑、p2激動(dòng)劑、抗毒革械劑、內(nèi)肽酶抑制 刑、降血脂藥和血栓素抑制劑，或其組合聯(lián)合施用.
32. 用于降低纖維化損害處的纖維細(xì)胞和/或成纖維細(xì)胞中CCL21的存在量 或活性的藥劑以及任選的降低纖維化損害處的纖維細(xì)胞和/或成纖維細(xì)胞中 CCL19的存在量或活性的藥刑在制備治療哺乳動(dòng)物慢性纖維化疾病的藥物中的 用途.
33. 權(quán)利要求32所迷的用途，其中所述藥劑是與CCL21發(fā)生特異性免疫反 應(yīng)的抗體.
34. 權(quán)利要求33所述的用途，其中所述抗體與其它趨化罔子相比優(yōu)先識(shí)別 CCL21上的表位.
35. 權(quán)利要求32所述的用途，其中所述的藥刑是定向抗CCL21的siRNA分子.
36. 權(quán)利要求32所述的用途，其中所述纖維化疾病選自肺纖維化、慢性阻塞 性肺病、肝纖維化、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、充血性心力衰竭、慢性腎病、過(guò)敏性肺炎、 呼吸性細(xì)支氣管炎/間質(zhì)性肺病、曼氏血吸蟲(chóng)感染、由叢狀損害引起的原發(fā)性肺動(dòng) 脈高血壓、皰疹病毒相關(guān)疾病的肺表現(xiàn)、皰滲病毒相關(guān)疾病的皮膚表現(xiàn)、瘢痕疙 瘩、狼瘡、腎源性纖維化皮膚病、日本血吸蟲(chóng)感染相關(guān)的纖維化損害、自身免疫 性疾病、致病性纖維化、萊姆病、胰腺炎中的基質(zhì)重塑和基質(zhì)纖維化、子宮肌瘤、 卵巢纖維化、角膜纖維化、充血性心力衰竭和其他缺血后遣癥、術(shù)后腹部結(jié)疤、 開(kāi)角型青光眼小梁切除術(shù)后結(jié)疤，及其任意組合.
37. 權(quán)利要求36所述的用途，其中所述纖維化疾病為慢性肺纖維化.
38. 權(quán)利要求l所述的用途，其中使用選自以下的給藥方式施用所迷藥刑包 括局部給藥、注射、吸入、儲(chǔ)庫(kù)式或泵式持續(xù)釋放，或其任意組合，
39. 包含抗CCL21抗體或設(shè)計(jì)為抗CCL21的siRNA分子，以及任選的抗 CCL19抗體或設(shè)計(jì)為抗CCL19的siRNA分子的組合物在制備抑制成纖維細(xì)胞和 /或纖維細(xì)胞增殖的藥物中的用途，
40. 權(quán)利要求39所述的用途，其中所述用途進(jìn)一步包括包含抗CCR7抗體 或設(shè)計(jì)為抗CCR7受體的siRNA分子的組合物在制備抑制成纖維細(xì)胞和/或纖維 細(xì)胞增殖的藥物中的用途.
41. 抑制CCL21活性的組合物在制備抑制纖維細(xì)胞遷移和/或成纖維細(xì)胞活 化的藥物中的用途.
42. 抑制纖維細(xì)胞中CCL21的活性或表達(dá)，和/或抑制國(guó)有肺成纖維細(xì)胞活 化的組合物在制備藥物中的用途，所述藥物通過(guò)防止細(xì)胞外基質(zhì)的過(guò)度產(chǎn)生并改 善肺纖維化癥狀來(lái)治療肺纖維化.
43. 降低肺組織中纖維細(xì)胞和/或成纖維細(xì)胞中CCL21的存在量或活性的藥 刑或任選的降低肺組織中纖維細(xì)胞和/或成纖維細(xì)胞中CCL19的存在量或活性的
44.降4氐肺組織中纖維細(xì)胞和/或成纖維細(xì)胞中CCL21的存在量或活性的藥 刑或任選的降低肺組織中纖維細(xì)胞和/或成纖維細(xì)胞中CCL19的存在量或活性的 藥刑在制備治療藥物誘發(fā)的肺纖維化的藥物中的用途.
45. 權(quán)利要求43或44所述的用途，其中所述藥物選自細(xì)胞毒素刑、抗生素、 抗心律失常藥、消炎藥和違禁藥.
46. 權(quán)利要求43或44所述的用途，其中所迷藥物選自兩性審素B、博來(lái)審 素、溴麥角隱亭、白消安、卡馬西平、苯丁酸氮芥、可卡罔、環(huán)磷酰胺、苯妥英、 麥角胺、氟卡尼、海洛因、美法侖、美沙嗣、甲氨蝶呤、哌甲酯、美西麥角、礦 物油、呋喃妥因、亞硝基脲類、丙卡巴肼、硅嗣、柳氣磺吡啶、妥卡尼和長(zhǎng)春花 生物堿類藥刑.
47. 權(quán)利要求32~46中任一項(xiàng)所述的用途，其中所述藥物與皮質(zhì)類閨醇、免 疫抑制劑、抗凝刑、利尿刑、強(qiáng)心式、鈣通道阻斷刑、血管擴(kuò)張刑、前列環(huán)素類 似物、內(nèi)皮素拮抗刑、褲酸二醋酶抑制刑、P2激動(dòng)劑、抗毒覃堿刑、內(nèi)肽醉抑制 刑、降血藥和血栓素抑制刑，或其組合聯(lián)合.
48. 權(quán)利要求2所迷的方法，其中所述降低所述纖維細(xì)胞和/或成纖維細(xì)胞中 CCL21和CCL19的存在量或活性包括使所述哺乳動(dòng)物與從所述成纖維細(xì)胞去除 CCL21和CCL19的藥劑接觸，所述藥劑的重為有效減輕所述慢性纖維化疾病的 一種或多種癥狀的量.
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了用于治療纖維化疾病的方法和組合物。更具體地，本發(fā)明論證了對(duì)單獨(dú)的CCL21活性或其與CCL19結(jié)合的活性的抑制或其它形式的降低，能有效減少纖維化損害，并改善纖維化疾病的癥狀。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101351545SQ200680048342
公開(kāi)日2009年1月21日 申請(qǐng)日期2006年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月23日
發(fā)明者C·M·霍加博亞姆, S·L·昆克爾 申請(qǐng)人:密執(zhí)安大學(xué)評(píng)議會(huì)