專(zhuān)利名稱(chēng)：：治療播散性癌癥的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及用于治療罹患播散性癌癥的患者的免疫治療方法，通過(guò)施用可以從一個(gè)或多個(gè)引流轉(zhuǎn)移瘤的轉(zhuǎn)移哨(metinel)淋巴結(jié)獲得的增殖的腫瘤反應(yīng)性CD4+輔助性細(xì)胞和/或CD8+T淋巴細(xì)胞，其中T淋巴細(xì)胞不是CD4+CD25+Hi淋巴細(xì)胞，即本發(fā)明不涵蓋調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞。
背景技術(shù)：
：淋巴系統(tǒng)含有脈管網(wǎng)絡(luò)，攜帶有源自組織間液的無(wú)色、水樣流體，淋巴。這些脈管將過(guò)量的流體運(yùn)出身體組織中的組織間隙，并將其返回到血流中，同時(shí)防止淋巴液的回流。三種主要類(lèi)型的淋巴管是毛細(xì)淋巴管、淋巴管和淋巴導(dǎo)管。毛細(xì)淋巴管連接形成更大的脈管，被稱(chēng)為淋巴管或淋巴靜脈。它們類(lèi)似引導(dǎo)血液的靜脈，但是壁較薄和管腔相對(duì)較大，并且它們具有更多的瓣膜。在皮膚中，淋巴管位于皮下組織中，與靜脈的路徑相同。在內(nèi)臟中，淋巴管一般隨著動(dòng)脈，并在它們周?chē)纬蓞?網(wǎng)絡(luò))。在某些位置，淋巴管進(jìn)入淋巴結(jié)。它們是淋巴組織構(gòu)成的小的、特化的器官。淋巴在進(jìn)入靜脈循環(huán)之前通過(guò)至少一個(gè)淋巴結(jié)過(guò)濾(Moore)。淋巴結(jié)作為濾器，具有內(nèi)部的蜂窩狀結(jié)締組織，其中充滿(mǎn)了收集和破壞例如細(xì)菌和病毒的淋巴細(xì)胞。在淋巴結(jié)中，淋巴與血液循環(huán)相接觸，并有大約一半的流體在通過(guò)傳出淋巴管離開(kāi)淋巴結(jié)之前被排入血液中(Renkin)。一種逐漸被接受的觀(guān)點(diǎn)認(rèn)為，實(shí)際上所有來(lái)自上皮腫瘤的惡性細(xì)胞的擴(kuò)散，在通過(guò)淋巴結(jié)中的淋巴-靜脈連接進(jìn)入總血液循環(huán)之前，都首先通過(guò)薄的有孔淋巴管發(fā)生(通過(guò)也被白細(xì)胞使用的活化機(jī)制)。在腋窩、腹股溝、頸部、胸部和腹部發(fā)現(xiàn)有成簇的淋巴結(jié)。原發(fā)腫瘤或原發(fā)腫瘤區(qū)流向一個(gè)或多個(gè)所謂的前哨淋巴結(jié)，前哨淋巴結(jié)被定義為第一個(gè)或第一批接受來(lái)自腫瘤的淋巴流出液的淋巴結(jié)，也被稱(chēng)為"前哨淋巴結(jié)概念(sentinelnodeconcept)"。這也是轉(zhuǎn)移的第一個(gè)站點(diǎn)，并且在幾種類(lèi)型的實(shí)體瘤中已經(jīng)顯示，如果前哨淋巴結(jié)不含腫瘤細(xì)胞，那么淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)幾乎可以忽略。前哨淋巴結(jié)可以在外科手術(shù)過(guò)程中通過(guò)在腫瘤周屈注射示蹤物或染料物質(zhì)來(lái)鑒定。這些物質(zhì)在毛細(xì)淋巴管中運(yùn)輸，通過(guò)巨噬細(xì)胞的吞噬作用被積累在前哨淋巴結(jié)中，從而鑒定了腫瘤引流淋巴結(jié)。本發(fā)明人最近顯示了引流原發(fā)腫瘤的前哨淋巴結(jié)是天然腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞體外增殖的潛在的豐富來(lái)源，因?yàn)榍吧诹馨徒Y(jié)可能含有顯著量的已經(jīng)對(duì)腫瘤抗原致敏并在淋巴結(jié)中經(jīng)歷了體內(nèi)增殖的T淋巴細(xì)胞(Marits等，手稿；Karlsson等，EurJUrol，已接受)。但是，迄今為止，還不知道涉及某個(gè)單獨(dú)的淋巴結(jié)的連續(xù)淋巴引流也可應(yīng)用于轉(zhuǎn)移，即，對(duì)于轉(zhuǎn)移來(lái)說(shuō)，可以檢測(cè)流向轉(zhuǎn)移區(qū)的一個(gè)或多個(gè)淋巴結(jié)。發(fā)明公開(kāi)原發(fā)腫瘤的轉(zhuǎn)移被定義為由于原發(fā)腫瘤的擴(kuò)散導(dǎo)致的癌癥。轉(zhuǎn)移依賴(lài)于獲得了兩種分開(kāi)的能力的癌細(xì)胞一一的活動(dòng)性和浸潤(rùn)性增加。轉(zhuǎn)移的細(xì)胞基本上與原始的腫瘤中的細(xì)胞是同樣的類(lèi)型。如果癌癥發(fā)生于例如結(jié)腸并轉(zhuǎn)移到例如肝臟，肝臟中的癌細(xì)胞是結(jié)腸癌細(xì)胞。但是，細(xì)胞已經(jīng)獲得了增加的活動(dòng)性和侵入另一個(gè)器官的能力。理論上原發(fā)腫瘤源自發(fā)生腫瘤的器官或組織中存在的細(xì)胞。因?yàn)樵谶@些器官或組織中的細(xì)胞已經(jīng)與先前存在的淋巴引流系統(tǒng)相連接，淋巴將通過(guò)現(xiàn)有的淋巴管從原發(fā)腫瘤排出。到目前為止，還沒(méi)有人顯示出原發(fā)腫瘤的"前哨淋巴結(jié)概念也同樣適用于轉(zhuǎn)移瘤，即對(duì)于腫瘤轉(zhuǎn)移來(lái)說(shuō)可以鑒定出一個(gè)或多個(gè)接受轉(zhuǎn)移瘤的引流液的第一淋巴結(jié)。還沒(méi)有任何人顯示出轉(zhuǎn)移瘤誘導(dǎo)了淋巴管生成，此外，也不明確轉(zhuǎn)移瘤將發(fā)展出與淋巴系統(tǒng)的連接。本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在例如淋巴結(jié)或器官例如肝臟或組織如腸系膜脂肪組織中的轉(zhuǎn)移瘤，已經(jīng)發(fā)展出了與淋巴系統(tǒng)的連接并向淋巴結(jié)引流，并且可以鑒定一個(gè)或多個(gè)所謂的"轉(zhuǎn)移哨"淋巴結(jié)，即第一個(gè)(批)接受來(lái)自轉(zhuǎn)移瘤的淋巴引流的淋巴結(jié)。理論上說(shuō)，腫瘤細(xì)胞從轉(zhuǎn)移瘤的擴(kuò)散可以通過(guò)由腫瘤引發(fā)的血管形成活性所形成的血管而發(fā)生。據(jù)信自胚胎發(fā)育起，淋巴系統(tǒng)得到了相當(dāng)好的保存，并且它是獨(dú)立于血管血液系統(tǒng)而發(fā)育的。因此，本發(fā)明人沒(méi)有預(yù)料到能夠發(fā)現(xiàn)可以使用與己經(jīng)開(kāi)發(fā)用于各種不同的原發(fā)實(shí)體瘤的相同的技術(shù)來(lái)研究上皮實(shí)體瘤的轉(zhuǎn)移瘤進(jìn)行淋巴引流作圖。在研究位于皮下組織、淋巴組織、腹內(nèi)和內(nèi)部器官中的不同類(lèi)型的轉(zhuǎn)移瘤的淋巴引流時(shí)，本發(fā)明人鑒定了轉(zhuǎn)移瘤引流淋巴結(jié)(轉(zhuǎn)移哨淋巴結(jié))。轉(zhuǎn)移哨淋巴結(jié)是獨(dú)立定位的，并且轉(zhuǎn)移哨淋巴結(jié)、即從轉(zhuǎn)移瘤接受淋巴引流的第一批淋巴結(jié)，通常不是與轉(zhuǎn)移瘤的解剖距離最短的淋巴結(jié)。本發(fā)明人對(duì)這種轉(zhuǎn)移哨淋巴結(jié)的進(jìn)一步分析顯示出它們含有對(duì)相應(yīng)的轉(zhuǎn)移瘤中的腫瘤細(xì)胞具有特異性活性的T淋巴細(xì)胞。本發(fā)明人還顯示出從轉(zhuǎn)移哨淋巴結(jié)獲得的T淋巴細(xì)胞可以被增殖并用于播散性癌癥疾病的治療。因此，本發(fā)明涉及治療患有播散性癌癥的患者的方法，該方法包括i)在患者中鑒定一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)移哨淋巴結(jié)，ii)切除一個(gè)或多個(gè)淋巴結(jié)，并任選全部或部分的轉(zhuǎn)移瘤，iii)從所述淋巴結(jié)中分離轉(zhuǎn)移瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞，iv)體外增殖所述轉(zhuǎn)移腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞，v)將這樣獲得的T淋巴細(xì)胞施用于患者，其中T淋巴細(xì)胞是CD4+輔助細(xì)胞和/或CD8+T淋巴細(xì)胞，而不是CD4+CD25+H'淋巴細(xì)胞，即本發(fā)明不涵蓋調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞。在繼續(xù)進(jìn)行本發(fā)明方法的步驟的詳細(xì)描述之前，定義了下列的術(shù)語(yǔ)術(shù)語(yǔ)"腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞"是指帶有特異性針對(duì)和識(shí)別腫瘤抗原的T細(xì)胞受體(TCR)的T淋巴細(xì)胞。在這里的術(shù)語(yǔ)腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞也傾向于涵蓋帶有特異性針對(duì)和識(shí)別轉(zhuǎn)移瘤抗原的TCR的T淋巴細(xì)胞。即術(shù)語(yǔ)腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞與轉(zhuǎn)移瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞可以互換使用。術(shù)語(yǔ)"輔助性T細(xì)胞"是指在激活時(shí)促進(jìn)適應(yīng)性免疫反應(yīng)的T淋巴細(xì)胞。術(shù)語(yǔ)"Thl細(xì)胞"是指在激活時(shí)促進(jìn)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)的輔助性T細(xì)胞，使用細(xì)胞因子例如IFN-7。術(shù)語(yǔ)"Th2細(xì)胞"是指在激活時(shí)促進(jìn)體液免疫反應(yīng)的輔助性T細(xì)胞，使用細(xì)胞因子例如IL-4。術(shù)語(yǔ)"CD4+輔助性T淋巴細(xì)胞"是指表達(dá)CD4但不表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子FoxP3的T淋巴細(xì)胞。術(shù)語(yǔ)"CD8+T淋巴細(xì)胞"是指表達(dá)CD8的T淋巴細(xì)胞。術(shù)語(yǔ)"調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞"是指抑制適應(yīng)性免疫反應(yīng)、表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子FoxP3的T淋巴細(xì)胞。術(shù)語(yǔ)T淋巴細(xì)胞的"特異性激活"是指抗原特異性和MHC限制性的T細(xì)胞受體介導(dǎo)的激活。相反，術(shù)語(yǔ)T淋巴細(xì)胞的"非特異性激活"是指所有T細(xì)胞的一般性激活，不論T細(xì)胞受體的特異性。術(shù)語(yǔ)"腫瘤來(lái)源的抗原"旨在涵蓋腫瘤細(xì)胞、腫瘤的勻漿液(其中勻漿液可以變性)、或腫瘤蛋白、多肽或肽，例如純化的、天然的、合成的和/或重組的蛋白、多肽或肽形式。請(qǐng)注意本文的術(shù)語(yǔ)腫瘤也傾向于涵蓋原發(fā)腫瘤的轉(zhuǎn)移瘤。腫瘤來(lái)源的抗原可以是完整的分子、其片段或完整的分子和/或片段的多聚體或聚集物。適合的多肽和肽的例子是包括從大約5到大約30個(gè)氨基酸、例如從大約10到25個(gè)氨基酸、從大約10到20個(gè)氨基酸或從大約12到18個(gè)氨基酸的多肽和肽。如果使用肽，可以使用在培養(yǎng)物中的終摩爾濃度從大約0.1到大約5.0/zM，例如，從大約0.1到大約4.0岸、從大約0.2到大約3.0岸、從大約0.31到大約2.0/iM或從大約0.3到大約1.0/iM。腫瘤來(lái)源的抗原可以是自體的也可以是異源的，即可以來(lái)自待治療的患者、或從患有癌癥的另一個(gè)對(duì)象獲得。在本文的實(shí)施例中，本發(fā)明人使用了自體的變性腫瘤提取物，但是，正如上面所述，其它來(lái)源的腫瘤來(lái)源的抗原用于本發(fā)明的方法可能也是可行的。術(shù)語(yǔ)"第一階段的第1天"或例如"第二階段的第5天"應(yīng)該做如下理解收獲淋巴細(xì)胞的天被定義為第0天(零時(shí))。第一階段的第1天被定義為通過(guò)加入至少一種對(duì)IL-2受體具有激動(dòng)活性的物質(zhì)、以及可能的培養(yǎng)基和/或腫瘤來(lái)源的抗原來(lái)啟動(dòng)增殖的當(dāng)天。增殖階段i)可以在收獲淋巴細(xì)胞之后第O天(零時(shí))或最高直到2天起始。在全文中，通過(guò)加入腫瘤來(lái)源的抗原而起始第二階段的當(dāng)天被描述為"第二階段的第l天"。術(shù)語(yǔ)"前哨淋巴結(jié)"是指從腫瘤接受淋巴引流的第一個(gè)(批)淋巴結(jié)。原發(fā)腫瘤或原發(fā)腫瘤區(qū)被引流到一個(gè)或多個(gè)所謂的前哨淋巴結(jié)。前哨淋巴結(jié)也是轉(zhuǎn)移的第一個(gè)站點(diǎn)，并且在數(shù)種類(lèi)型的實(shí)體瘤中已經(jīng)顯示出如果前哨淋巴結(jié)不含有腫瘤細(xì)胞，那么淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)幾乎是可以忽略的。術(shù)語(yǔ)"轉(zhuǎn)移哨淋巴結(jié)"是指從轉(zhuǎn)移的腫瘤或轉(zhuǎn)移瘤區(qū)接受淋巴引流的第一個(gè)(批)淋巴結(jié)。本方法的第一步是鑒定一個(gè)或多個(gè)引流轉(zhuǎn)移瘤的轉(zhuǎn)移哨淋巴結(jié)。正如上面提到的那樣，定位轉(zhuǎn)移哨淋巴結(jié)不一定是容易的工作，因?yàn)榈谝粋€(gè)接受轉(zhuǎn)移瘤的引流液通常不是解剖距離最短的淋巴結(jié)。但是，因?yàn)楸景l(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)移哨淋巴結(jié)與淋巴系統(tǒng)中距轉(zhuǎn)移瘤更遠(yuǎn)的淋巴結(jié)、或腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞含量基本上為零的無(wú)關(guān)淋巴結(jié)相比，含有更高量的腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞，因此鑒定一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)移哨淋巴結(jié)的步驟i)對(duì)于本發(fā)明的方法來(lái)說(shuō)是非常重要的。鑒定轉(zhuǎn)移哨淋巴結(jié)的一種方法是通過(guò)將一種或多種淋巴結(jié)定位劑注射到患者中，即任何適合于定位淋巴結(jié)的物質(zhì)。這樣的定位劑優(yōu)選為可藥用的和/或生物相容的。定位劑可以是基于親和性的也可以是基于非親和性的?；谟H和性的淋巴結(jié)定位劑的例子是完整抗體或其片段、納米抗體、核酸例如RNA、DNA和PNA，它們都使用各種不同的檢測(cè)方式再行標(biāo)記?；谟H和性的淋巴結(jié)定位劑的檢測(cè)可以通過(guò)用示蹤劑和染料標(biāo)記來(lái)進(jìn)行，例如下面提到的那些。然后可以通過(guò)下列來(lái)顯示i)在用產(chǎn)生對(duì)比的物質(zhì)例如含有碘的物質(zhì)或放射性物質(zhì)例如锝-99111標(biāo)記后，放射性方法例如X-射線(xiàn)、計(jì)算機(jī)斷層成像、閃爍造影法、正電子發(fā)射技術(shù)；ii)用磁性或順磁性物質(zhì)例如釓、含有顆粒的磁性樹(shù)狀聚合物(magnetodendromers)或氧化鐵標(biāo)記后的磁共振成像；iii)通過(guò)用供肉眼或光子檢測(cè)裝置例如CCD或CMOS傳感器檢測(cè)用的染料、熒光染料或化學(xué)發(fā)光染料標(biāo)記，在紅外-可見(jiàn)-紫外光譜范圍中的光?；诜怯H和性的淋巴結(jié)定位劑的例子包括示蹤劑和染料。這些物質(zhì)在毛細(xì)淋巴管中運(yùn)輸，并被巨噬細(xì)胞通過(guò)吞噬作用積累在前哨或轉(zhuǎn)移哨淋巴結(jié)中，從而鑒定了腫瘤或轉(zhuǎn)移瘤引流淋巴結(jié)。示蹤劑的例子是放射性物質(zhì)例如锝-99m，使用光子敏感的底片或傳感器例如PET檢測(cè)器進(jìn)行基于放射性衰減的檢測(cè)。此外，可以使用磁性、順磁性或超順磁性物質(zhì)，例如含有對(duì)比劑的釓、氧化鐵顆粒、磁性氧化物顆粒、用于基于磁共振檢測(cè)的磁性樹(shù)狀聚合物、對(duì)比劑例如碘用于基于放射性檢測(cè)如計(jì)算機(jī)斷層成像或常規(guī)的X-射線(xiàn)。染料的例子包括通過(guò)發(fā)光、近紅外、熒光、紫外或可見(jiàn)光下可見(jiàn)的例如偶氮染料、雙偶氮染料、三偶氮染料、二芳基甲垸染料、三芳基甲烷染料、蒽醌染料、多環(huán)芳香族羰基染料、靛藍(lán)染料。此外，染料還包括用于基于化學(xué)發(fā)光檢測(cè)的發(fā)光物質(zhì)和熒光物質(zhì)，例如用于基于熒光檢測(cè)的picogreen、sybrgreen、redOoil、德克薩斯紅。依賴(lài)于所選的波長(zhǎng)，檢測(cè)可以通過(guò)肉眼或光子檢測(cè)裝置例如CCD或CMOS傳感器來(lái)進(jìn)行。在一個(gè)實(shí)施方案中，染料具有的最大發(fā)射使得在正常光線(xiàn)下通過(guò)肉眼可見(jiàn)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，染料具有的最大發(fā)射使得可以在紫外光下通過(guò)肉眼可見(jiàn)。適合的染料或示蹤劑的其它的例子出現(xiàn)在WO04/045650中，在此合并引為參考。另一種但是更耗時(shí)的鑒定轉(zhuǎn)移哨淋巴結(jié)的方法是切除和研究推測(cè)的轉(zhuǎn)移瘤引流區(qū)中選擇的淋巴結(jié)。然后可以使用來(lái)自實(shí)際患者的轉(zhuǎn)移瘤的腫瘤提取物，通過(guò)增殖分析來(lái)鑒定含有腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞的淋巴結(jié)。淋巴結(jié)定位劑被注射到患者的轉(zhuǎn)移瘤之中、之上、周?chē)?、鄰近?或之下。然后定位劑將通過(guò)淋巴管擴(kuò)散到轉(zhuǎn)移哨淋巴結(jié)中，一個(gè)或多個(gè)淋巴結(jié)在一定的時(shí)間內(nèi)將開(kāi)始獲得染色，例如在注射了定位劑物質(zhì)之后5分鐘到30分鐘內(nèi)，例如5分鐘到15分鐘內(nèi)，，然后定位劑物質(zhì)成像。正如上面描述的那樣，定位劑的成像當(dāng)然依賴(lài)于所用的定位劑物質(zhì)。如果使用的染料具有的發(fā)射最大值允許在正常光線(xiàn)下通過(guò)肉眼可見(jiàn)，例如專(zhuān)利藍(lán)(PatentBlue)，則一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)移哨淋巴結(jié)被簡(jiǎn)單鑒定為首先積累有色染料的淋巴結(jié)，即，如果使用專(zhuān)利藍(lán)，外科醫(yī)生將尋找首先積累藍(lán)色的淋巴結(jié)。定位劑可以通過(guò)單次注射或多次注射來(lái)注射，例如2次以上注射、3次以上注射、4次以上注射、5次以上注射或6次以上注射。如何進(jìn)行淋巴結(jié)定位劑的注射依賴(lài)于轉(zhuǎn)移瘤的位置。淋巴結(jié)定位劑可以通過(guò)非外科程序注射，即不涉及外科手術(shù)步驟的程序，其中外科步驟被定義為包括外科手術(shù)操作程序的步驟，即涉及用器械切割。在本文內(nèi)容中，注射，即用針頭刺入皮膚，不被認(rèn)為是外科步驟。因此，通過(guò)說(shuō)明淋巴結(jié)定位劑可以通過(guò)非外科程序注射，其目的是表示淋巴結(jié)定位劑可以直接或通過(guò)皮膚注射到轉(zhuǎn)移瘤之中、之上、周?chē)?、鄰近?或之下。其中淋巴結(jié)定位劑可以被注射到皮膚中或通過(guò)皮膚的情況的例子是例如轉(zhuǎn)移瘤位于患者皮膚中的情況。在這種情況下，淋巴結(jié)定位劑優(yōu)選應(yīng)該被注射到轉(zhuǎn)移瘤上方的皮膚中、或透過(guò)皮膚注射到轉(zhuǎn)移瘤之中、周?chē)?、鄰近、?或之下。如果轉(zhuǎn)移瘤位于患者的皮下組織中，淋巴結(jié)定位劑優(yōu)選應(yīng)該被注射到轉(zhuǎn)移瘤上方的皮膚中、或透過(guò)皮膚注射到轉(zhuǎn)移瘤之中、周?chē)?、鄰近、?或之下。正如上面提到的那樣，轉(zhuǎn)移哨淋巴結(jié)可能不總是位于距轉(zhuǎn)移瘤最短或最符合邏輯的解剖距離上。這種情況的例子是本發(fā)明人在本文的實(shí)施例中描述的、吃驚地鑒定到在腹股溝淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移瘤遠(yuǎn)端和中位的轉(zhuǎn)移哨淋巴結(jié)。根據(jù)淋巴系統(tǒng)的解剖學(xué)，腹股溝中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移瘤的轉(zhuǎn)移哨淋巴結(jié)的疑似位置應(yīng)該在皮膚中或皮下脂肪中的近端或在沿著髂骨管的骨盆的深處。因此，因?yàn)檗D(zhuǎn)移哨淋巴結(jié)可以位于遠(yuǎn)離轉(zhuǎn)移瘤的地方，在某些情況下不需要外科手術(shù)就注射淋巴結(jié)定位劑可能是很有好處的，因?yàn)轭A(yù)測(cè)這種轉(zhuǎn)移哨淋巴結(jié)的位置可能非常困難。理論上，腹股溝中的轉(zhuǎn)移瘤可能在腋窩處具有轉(zhuǎn)移哨淋巴結(jié)，即預(yù)測(cè)在身體中進(jìn)行切除轉(zhuǎn)移哨淋巴結(jié)的外科手術(shù)的位置可能是非常困難的。在本發(fā)明的特定實(shí)施方案中，淋巴結(jié)定位劑是放射性物質(zhì)例如锝-99m，其可以通過(guò)非外科程序注射，然后通過(guò)進(jìn)行淋巴閃爍造影來(lái)成像。前哨淋巴結(jié)引流原發(fā)腫瘤，它們通常源于該特定個(gè)體自從胚胎發(fā)育以來(lái)就早已具有(priori)的組織好的淋巴引流系統(tǒng)的器官。引流的形式在個(gè)體之間可以是不同的。本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，位于不同位置(肝臟、腸系膜脂肪、淋巴結(jié)、皮下組織、肌肉等)的轉(zhuǎn)移瘤與第一批引流淋巴結(jié)也具有淋巴引流。本發(fā)明人稱(chēng)這些淋巴結(jié)為"轉(zhuǎn)移哨淋巴結(jié)"。它們更可能通過(guò)轉(zhuǎn)移瘤自身的產(chǎn)生淋巴管生成因子(例如VEGF-C)的能力而與淋巴相連。我們已經(jīng)在這些轉(zhuǎn)移哨淋巴結(jié)中鑒定到了腫瘤反應(yīng)性淋巴細(xì)胞(它們已經(jīng)經(jīng)歷了朝著轉(zhuǎn)移瘤的克隆增殖)，并且我們顯示了它們可以保留免疫學(xué)性質(zhì)被增殖并用于細(xì)胞免疫治療。淋巴結(jié)定位劑也可以涉及外科程序、即包括了切開(kāi)的程序下被注射?？梢园ㄍ饪瞥绦虻那闆r的例子是腫瘤的位置使得它不能用針頭透過(guò)皮膚來(lái)達(dá)到的情況，或者不可能透過(guò)皮膚和組織對(duì)定位劑進(jìn)行成像的情況。在這些情況下，外科醫(yī)生將在轉(zhuǎn)移瘤區(qū)域中進(jìn)行切開(kāi)，然后可以將淋巴結(jié)定位劑直接注射到轉(zhuǎn)移瘤之中、之上、周?chē)?、鄰近?或之下，以便鑒定一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)移哨淋巴結(jié)。淋巴結(jié)定位劑的注射可以包含外科程序的情況的例子是例如如果轉(zhuǎn)移瘤位于腹內(nèi)區(qū)域中、實(shí)質(zhì)性器官中或位于患者的較深部位置的淋巴結(jié)中。有時(shí)轉(zhuǎn)移哨淋巴結(jié)的鑒定可以包括通過(guò)非外科的和外科的步驟相結(jié)合來(lái)注射淋巴結(jié)定位劑。這樣的例子是放射性淋巴結(jié)定位劑，例如锝-99m，可以使用針頭注射，即不需要外科手術(shù)，而定位劑的積累，即轉(zhuǎn)移哨淋巴結(jié)的鑒定可以使用7檢測(cè)器來(lái)進(jìn)行。這給了外科醫(yī)生關(guān)于轉(zhuǎn)移哨淋巴結(jié)的位置的指示。此后，當(dāng)患者經(jīng)歷外科手術(shù)切除轉(zhuǎn)移哨淋巴結(jié)和至少一部分轉(zhuǎn)移瘤時(shí)，可以注射有色的染料例如專(zhuān)利藍(lán)染料。此外，如果在第一次注射后過(guò)去超過(guò)大約18到24小時(shí)的時(shí)間，根據(jù)放射性示蹤劑的半衰期(通常為大約6小時(shí))追加一次或多次放射性示蹤劑的額外注射以在外科手術(shù)過(guò)程中鑒定轉(zhuǎn)移哨淋巴結(jié)，可能是有利的。在通過(guò)一種或另一種方法定位了一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)移哨淋巴結(jié)后，外科醫(yī)生將切除它們以便研究轉(zhuǎn)移哨淋巴結(jié)是否含有任何腫瘤細(xì)胞，并為了獲得轉(zhuǎn)移瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)物。從一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)移哨淋巴結(jié)收獲淋巴細(xì)胞可以通過(guò)將轉(zhuǎn)移哨淋巴結(jié)材料勻漿來(lái)進(jìn)行，以便獲得淋巴細(xì)胞的單細(xì)胞懸浮液。然后可以將單細(xì)胞懸浮液用于體外增殖，以便獲得轉(zhuǎn)移瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞。體外增殖本發(fā)明的方法的體外增殖步驟iii)包括i)第一階段，用腫瘤來(lái)源的抗原與至少一種對(duì)IL-2受體具有激動(dòng)活性的物質(zhì)一起刺激腫瘤反應(yīng)性CD4+輔助性細(xì)胞和/或CD8+T淋巴細(xì)胞，以促進(jìn)腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞的存活，以及ii)第二階段，激活和促進(jìn)腫瘤反應(yīng)性CD4+輔助性細(xì)胞和/或CD8+T淋巴細(xì)胞的生長(zhǎng)，其中當(dāng)T淋巴細(xì)胞上的CD25細(xì)胞表面標(biāo)記(IL-2R標(biāo)記)被下調(diào)時(shí)，開(kāi)始第二個(gè)階段ii)。i)階段第一階段i)的目的是獲得含有顯著高比例的腫瘤反應(yīng)性CD4+輔助性細(xì)胞和/或CD8+T淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)物。第一階段被認(rèn)為是"護(hù)理階段"，其中腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞得到存活和分裂。依賴(lài)于T淋巴細(xì)胞的來(lái)源(用于體外增殖法的起始材料)，它們可能經(jīng)歷的相對(duì)嚴(yán)酷的階段條件，例如被癌細(xì)胞分泌的因子阻遏或抑制。用于增殖方法的起始材料是從引流轉(zhuǎn)移瘤的淋巴結(jié)獲得的淋巴細(xì)胞的混合物。在培養(yǎng)中要增殖的T淋巴細(xì)胞可以從待治療的對(duì)象獲得，即獲得的用于施用的特定腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞可以是自體的。但是，T淋巴細(xì)胞也可以從不同于待治療的對(duì)象的來(lái)源獲得，例如另一個(gè)患有癌癥的對(duì)象。在這種情況下，接受者與被增殖的腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞優(yōu)選為免疫相容的(或使接受者對(duì)于增殖的腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞免疫耐受)。起始材料將最可能包含各種不同的淋巴細(xì)胞的混合物，例如T淋巴細(xì)胞、B-淋巴細(xì)胞、抗原呈遞細(xì)胞、腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞和未被激活的/無(wú)反應(yīng)性的T淋巴細(xì)胞。為了促進(jìn)腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞的特異性存活，加入了腫瘤來(lái)源的抗原和一種或多種對(duì)IL-2受體具有激動(dòng)活性的物質(zhì)。正如上面提到的那樣，第一階段i)通過(guò)加入至少一種對(duì)IL-2受體具有激動(dòng)活性的物質(zhì)而起始。這樣的物質(zhì)的功能是通過(guò)IL-2受體刺激T淋巴細(xì)胞以促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的細(xì)胞分裂，從而防止細(xì)胞死亡。T淋巴細(xì)胞的抗原特異的MHC限制的活化促進(jìn)了特異性識(shí)別腫瘤細(xì)胞的有用的T淋巴細(xì)胞種群的克隆增殖。相反，T淋巴細(xì)胞的非特異性活化將導(dǎo)致識(shí)別不相關(guān)肽的T淋巴細(xì)胞的克隆的增殖，而與腫瘤細(xì)胞的識(shí)別沒(méi)有任何關(guān)系，因此大部分非特異性增殖的T淋巴細(xì)胞將不識(shí)別腫瘤。本發(fā)明的目的是促進(jìn)腫瘤反應(yīng)性CD4+輔助性細(xì)胞和CD8+T淋巴細(xì)胞的特異性活化和生長(zhǎng)。針對(duì)某個(gè)腫瘤抗原的特異性活化，使得當(dāng)將T淋巴細(xì)胞用于患有與T淋巴細(xì)胞的活化所針對(duì)的腫瘤類(lèi)型相同的癌癥患者時(shí)，T淋巴細(xì)胞具有治療效果。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，激動(dòng)劑是對(duì)IL-2受體具有激動(dòng)活性的物質(zhì)。這樣的物質(zhì)的例子包括蛋白、多肽、肽、抗體、親和體(affibodies)、及其片段、融合蛋白、合成的和/或有機(jī)的分子例如小分子、以及天然配體。在優(yōu)選實(shí)施方案中，物質(zhì)是IL-2受體的天然配體，即IL-2。如果使用IL-2，它優(yōu)選以低劑量加入，以便減少淋巴細(xì)胞的凋亡和增加CD4陽(yáng)性腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞的種群。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，低劑量IL-2從大約100IU/ml培養(yǎng)基到大約700IU/ml培養(yǎng)基，例如從大約100IU/ml培養(yǎng)基到大約600IU/ml培養(yǎng)基、從大約100IU/ml培養(yǎng)基到大約500IU/ml培養(yǎng)基、從大約100IU/ml培養(yǎng)基到大約400IU/ml培養(yǎng)基、從大約100IU/ml培養(yǎng)基到大約300IU/ml培養(yǎng)基和從大約100IU/ml培養(yǎng)基到大約200IU/ml培養(yǎng)基。在具體的實(shí)施方案中，加入的IL-2的量是240IU/ml。在使用IL-2之外的、具有針對(duì)IL-2受體激動(dòng)活性的物質(zhì)的情況下，它們的具體的劑量應(yīng)該使得產(chǎn)生與通過(guò)上面提到的劑量的IL-2獲得的效果相應(yīng)的效果。在階段i)的整個(gè)過(guò)程中，可以定期加入其他量的對(duì)IL-2受體具有激動(dòng)活性的至少一種物質(zhì)，例如階段i)的每2天、每3天或每4天，以維持促進(jìn)細(xì)胞分裂的最適條件。術(shù)語(yǔ)每2天、每3天或每4天是指階段i)的整個(gè)過(guò)程中，在第一次加入對(duì)IL-2受體具有激動(dòng)活性的至少一種物質(zhì)后，即階段i)開(kāi)始后，從第2天、第3天或第4天開(kāi)始，每個(gè)第2天、第3天或第4天加入對(duì)IL-2受體具有激動(dòng)活性的至少一種物質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方案中，在階段i)的整個(gè)過(guò)程中定期加入的物質(zhì)是IL-2受體的激動(dòng)劑。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該物質(zhì)是IL-2。被定期、例如每2天、每3天或每4天加入的對(duì)IL-2受體具有激動(dòng)活性的物質(zhì)、例如IL-2的其他劑量在上面提到的范圍內(nèi)。在增殖的第一階段i)中的另一個(gè)重要步驟是加入腫瘤來(lái)源的抗原，以促進(jìn)表達(dá)識(shí)別腫瘤抗原的T淋巴細(xì)胞受體的T淋巴細(xì)胞、即腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞的細(xì)胞分裂。加入腫瘤抗原的最適時(shí)間點(diǎn)依賴(lài)于淋巴細(xì)胞的來(lái)源。當(dāng)淋巴細(xì)胞發(fā)源于淋巴結(jié)時(shí)，淋巴細(xì)胞可能已經(jīng)經(jīng)歷了腫瘤細(xì)胞的緊密接近并被腫瘤細(xì)胞所免疫抑制，因此需要用對(duì)IL-2受體具有激動(dòng)活性的物質(zhì)例如IL-2孵育一些天，以便促進(jìn)T淋巴細(xì)胞在腫瘤抗原呈遞后增殖反應(yīng)的能力。因此，在這樣的情況下，腫瘤來(lái)源的抗原優(yōu)選在第一階段i)從第2天到第5天(含)加入，例如在第2天、第3天、第4天或第5天。腫瘤來(lái)源的抗原，例如腫瘤勻漿液，可能被起始材料中存在的抗原呈遞細(xì)胞例如B淋巴細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞所內(nèi)吞和處理。在大多數(shù)情況下，腫瘤來(lái)源的抗原將被II類(lèi)MHC分子所呈遞，導(dǎo)致CD4+腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞的細(xì)胞分裂。但是，通過(guò)交叉呈遞，通過(guò)內(nèi)吞作用被攝入的抗體可以被處理并呈遞在I類(lèi)袋中，導(dǎo)致CD8+T淋巴細(xì)胞的活化。正如上面描述的那樣，增殖方法的一個(gè)目的是為了在某些方面起動(dòng)患者自身免疫系統(tǒng)的天然途徑，以及為了在一定程度上讓患者免疫系統(tǒng)的成分根據(jù)抗原是被MHCI還是MHCII所呈遞來(lái)決定產(chǎn)生CD4+還是CD8+淋巴細(xì)胞。在大多數(shù)情況下，抗原將被II類(lèi)MHC分子呈遞，引起CD4+T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生，但是在某些情況下產(chǎn)生CD8+T淋巴細(xì)胞.階段ii)第二階段ii)的目的是活化和增殖通過(guò)第一階段i)獲得的腫瘤反應(yīng)性〔04+輔助性細(xì)胞和/或008+T淋巴細(xì)胞，并通過(guò)將它們導(dǎo)入所需的途徑獲得特定的腫瘤反應(yīng)性€04+輔助性細(xì)胞和/或。08+T淋巴細(xì)胞的亞群。本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，確定起動(dòng)階段ii)的最適時(shí)間點(diǎn)的一種方法是通過(guò)監(jiān)測(cè)CD25細(xì)胞表面標(biāo)記在T淋巴細(xì)胞上的表達(dá)，從而特異性地確定T淋巴細(xì)胞何時(shí)對(duì)重新刺激易感。本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)第二階段ii)優(yōu)選應(yīng)該在CD25在T淋巴細(xì)胞上的表達(dá)被下調(diào)時(shí)起動(dòng)。CD25是一種活化標(biāo)記，表明淋巴細(xì)胞已經(jīng)接收到了活化信號(hào)。如果第二階段在在淋巴細(xì)胞上CD25的表達(dá)高的時(shí)候起動(dòng)，意味著淋巴細(xì)胞已經(jīng)收到了信號(hào)，將會(huì)發(fā)生細(xì)胞死亡。CD25的下調(diào)被定義為相當(dāng)部分的T淋巴細(xì)胞種群僅表達(dá)非常少的或基本上不表達(dá)CD25標(biāo)記。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，CD25的下調(diào)被定義為少于5%的T淋巴細(xì)胞種群表達(dá)CD25，即培養(yǎng)物中95%以上的T淋巴細(xì)胞完全不表達(dá)CD25。5%以下的表達(dá)CD25的T淋巴細(xì)胞更可能是調(diào)節(jié)性CD4+T淋巴細(xì)胞，它們具有高的、永久性的CD25表達(dá)。此外，T淋巴細(xì)胞種群優(yōu)選應(yīng)該僅表達(dá)非常少的或基本上不表達(dá)FoxP3標(biāo)記，這是調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞的特異性標(biāo)記。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，F(xiàn)oxP3的下調(diào)被定義為少于5%的T淋巴細(xì)胞種群表達(dá)FoxP3，即培養(yǎng)物中95%以上的T淋巴細(xì)胞完全不表達(dá)FoxP3。除了CD25之外，還有其它的標(biāo)記，它們的表達(dá)與為了確定起動(dòng)第二階段的最適時(shí)間點(diǎn)的監(jiān)控有關(guān)。這樣的標(biāo)記的例子是早期活化標(biāo)記CD69，以及T淋巴細(xì)胞的活化標(biāo)記MCHII。因?yàn)镃D69和MCHI1的表達(dá)表明T淋巴細(xì)胞的"活化程序"已經(jīng)打開(kāi)，這意味著細(xì)胞不能對(duì)其它的刺激作出反應(yīng)，因此在第二階段起動(dòng)之前這兩種標(biāo)記優(yōu)選都應(yīng)該被下調(diào)。術(shù)語(yǔ)下調(diào)可以被定義為少于5-10%的T淋巴細(xì)胞種群表達(dá)CD69禾口/或MCHII。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，抗CD4抗體被用來(lái)在增殖方法的階段ii)的增殖中，將輔助性T細(xì)胞與培養(yǎng)物中可能的腫瘤細(xì)胞分開(kāi)。在本發(fā)明的其他或另一個(gè)實(shí)施方案中，產(chǎn)品例如帶有抗CD3和抗CD28抗體的Dynabeads⑧被用于促進(jìn)增殖方法的階段ii)中的增殖。使用DynabeadsCD3/CD28將為淋巴細(xì)胞提供活化信號(hào)，并也可以用于與培養(yǎng)物中的可能的腫瘤細(xì)胞的分離。DynabeadsCD3/CD28在階段i)期間將與T淋巴細(xì)胞增殖抗原特異性結(jié)合，這樣這些細(xì)胞現(xiàn)在可以磁性富集。因?yàn)樽畛醯目乖禺愋曰罨航?jīng)起動(dòng)并導(dǎo)致了T淋巴細(xì)胞的克隆增殖，因此DynabeadsCD3/CD28的再刺激將進(jìn)一步促進(jìn)克隆增殖，因?yàn)殡A段i)不支持非特異性的T淋巴細(xì)胞克隆的活化。盡管階段ii)的精確的起始點(diǎn)將依賴(lài)于淋巴細(xì)胞何時(shí)獲得優(yōu)選表達(dá)的特定標(biāo)記而變化，但階段H)最通常從第一階段i)的第17天到(含)第23天起動(dòng)，例如在第17天、第18天、第19天、第20天、第21天、第22天或第23天。換句話(huà)說(shuō)，淋巴細(xì)胞表達(dá)優(yōu)選的標(biāo)記的量和組合的時(shí)間點(diǎn)，最通常被發(fā)現(xiàn)是在第一階段i)的第17天到第23天。T淋巴細(xì)胞的增殖，即階段i)和ii)最通常發(fā)生在適合的培養(yǎng)基中。優(yōu)選使用無(wú)血清的培養(yǎng)基或自體培養(yǎng)基以避免傳播疾病給患者的風(fēng)險(xiǎn)。適合的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基的例子包括AIMV培養(yǎng)基、RPMI1640、DMEM和MEM。但是，其它的含有適當(dāng)混合的氨基酸、類(lèi)固醇、維生素、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子和礦物質(zhì)的培養(yǎng)基也可以使用。在增殖的兩個(gè)階段中，細(xì)胞可以被分到幾個(gè)培養(yǎng)管中以便在培養(yǎng)物中維持適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度。在增殖階段中T淋巴細(xì)胞的密度優(yōu)選應(yīng)該為每毫升培養(yǎng)基大約3百萬(wàn)到大約6百萬(wàn)個(gè)細(xì)胞。在增殖過(guò)程中，可能還需要用新鮮的培養(yǎng)基更換培養(yǎng)物的步驟，這個(gè)步驟被命名為培養(yǎng)基的調(diào)制。培養(yǎng)物分份和調(diào)制培養(yǎng)基的時(shí)間點(diǎn)可以根據(jù)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)和細(xì)胞培養(yǎng)物的密度(不應(yīng)該超過(guò)每毫升大約6百萬(wàn)個(gè)細(xì)胞)來(lái)確定，或者培養(yǎng)基中可以含有適當(dāng)?shù)闹甘緞?，例如苯酚指示劑。在培養(yǎng)基中含有指示劑的情況下，分份培養(yǎng)物和調(diào)制培養(yǎng)基的時(shí)間點(diǎn)可以根據(jù)培養(yǎng)基的顏色來(lái)確定。如果使用酚紅指示劑，當(dāng)培養(yǎng)基變黃時(shí)，表明培養(yǎng)物的pH正在變?yōu)樗嵝?，?yīng)該對(duì)細(xì)胞分份或調(diào)制。適合用在本發(fā)明中的調(diào)制培養(yǎng)基的安排可以是每3-9天，例如一星期一次，替換四分之一到二分之一的培養(yǎng)基，例如三分之一的培養(yǎng)基除了這里描述的具體的條件之外，對(duì)于其它的參數(shù)將使用用于淋巴細(xì)胞培養(yǎng)物生長(zhǎng)的標(biāo)準(zhǔn)條件，例如溫度為37。C和5%的C02。正如上面提到的那樣，第二階段ii)通過(guò)在T淋巴細(xì)胞中加入上面定義的腫瘤來(lái)源的抗原，用于活化腫瘤反應(yīng)性的CD25陰性的T淋巴細(xì)胞，以促進(jìn)腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞的克隆增殖。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，抗原呈遞細(xì)胞(APC)與腫瘤來(lái)源的抗原一起被加入到T淋巴細(xì)胞中。抗原呈遞細(xì)胞(APC)包括白細(xì)胞，例如單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，例如B細(xì)胞。這些不同的細(xì)胞類(lèi)型都具有共同的能力，以被特異性T淋巴細(xì)胞受體識(shí)別的形式呈遞抗原。白細(xì)胞制備物從例如從待治療的患者獲得的血液、淋巴液、骨髓、淋巴器官組織或組織培養(yǎng)液中分離。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，APC細(xì)胞是被輻射的含有抗原呈遞B細(xì)胞和/或單核細(xì)胞的外周血白細(xì)胞。加入的APC的量在每毫升淋巴細(xì)胞培養(yǎng)物大約50萬(wàn)個(gè)APC到每毫升淋巴細(xì)胞培養(yǎng)物大約5百萬(wàn)個(gè)APC的范圍內(nèi)，例如從每毫升淋巴細(xì)胞培養(yǎng)物大約1百萬(wàn)個(gè)APC到每毫升淋巴細(xì)胞培養(yǎng)物大約4百萬(wàn)個(gè)APC、從每毫升淋巴細(xì)胞培養(yǎng)物大約1百萬(wàn)個(gè)APC到每毫升淋巴細(xì)胞培養(yǎng)物大約3百萬(wàn)個(gè)APC、或從每毫升淋巴細(xì)胞培養(yǎng)物大約1百萬(wàn)個(gè)APC到每毫升淋巴細(xì)胞培養(yǎng)物大約2百萬(wàn)個(gè)APC。除了在T淋巴細(xì)胞中添加腫瘤來(lái)源的抗原以促進(jìn)腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞的克隆增殖之外，第二階段ii)還包括了向所需的亞種群中添加其功能是引導(dǎo)腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞的增殖的特定成分。正如上面提到的那樣，本發(fā)明提供了產(chǎn)生腫瘤反應(yīng)性CD4+輔助性T淋巴細(xì)胞的方法。當(dāng)腫瘤抗原與主要組織相容性復(fù)合物II類(lèi)分子連接時(shí)，CD4+輔助性T淋巴細(xì)胞能夠識(shí)別和結(jié)合抗原。活化的CD4+輔助性T淋巴細(xì)胞分泌刺激免疫系統(tǒng)的其它細(xì)胞例如其它淋巴細(xì)胞的細(xì)胞因子、蛋白和/或肽。分泌的最常見(jiàn)的細(xì)胞因子是白介素-2(IL-2)，它是有效的T淋巴細(xì)胞生長(zhǎng)因子?；罨脑鲋矯D4+輔助性T淋巴細(xì)胞可以分化成兩種主要的細(xì)胞亞型，Thl和Th2細(xì)胞，它們是在產(chǎn)生的特定的細(xì)胞因子的基礎(chǔ)上定義的。Thl細(xì)胞產(chǎn)生7-干擾素和白介素-12(IL-12)，而Th2細(xì)胞產(chǎn)生白介素-4、白介素-5和白介素-13。ThlT淋巴細(xì)胞據(jù)信促進(jìn)了細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(Tc)、自然殺傷細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞的活化，這些細(xì)胞都能攻擊癌細(xì)胞并針對(duì)腫瘤起普遍防御作用。Thl和Th2類(lèi)型的輔助性T淋巴細(xì)胞(CD4+)可以分化成記憶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞。記憶性輔助性T淋巴細(xì)胞(CD4+)對(duì)于它們第一次遇到的抗原具有特異性，并在第二次免疫反應(yīng)中可以被招起，產(chǎn)生對(duì)腫瘤抗原的更快速和更大的反應(yīng)。在人類(lèi)中有證據(jù)表明淋巴細(xì)胞存活至少20年，也許是終身。效應(yīng)性CD4+T淋巴細(xì)胞是產(chǎn)生細(xì)胞因子和INF-7的活性細(xì)胞。為了有效地治療癌癥，施用Thl型的腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞是特別有益的，因?yàn)檫@種類(lèi)型據(jù)信促進(jìn)了細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(Tc)、自然殺傷細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞的活化，所有這些細(xì)胞都能攻擊癌細(xì)胞并針對(duì)腫瘤起普遍防御作用。即，在特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及產(chǎn)生腫瘤反應(yīng)性CD4+輔助性T淋巴細(xì)胞的方法，在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)本方法產(chǎn)生的Th2型T淋巴細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)是30。/。以下，例如25%以下、20%以下、15%以下、10%以下、5%以下或0%，即至少70。/。的腫瘤反應(yīng)性CD4+T淋巴細(xì)胞是Thl型的，例如至少75%、至少80%、至少85%、至少卯％、至少95%或100%。因此，第二階段可以包括添加能夠上調(diào)T淋巴細(xì)胞上IL-12R的物質(zhì)。IL-12R的上調(diào)將增加T細(xì)胞接受和優(yōu)化IL-12細(xì)胞因子活化的就緒性，產(chǎn)生最大的STAT-4信號(hào)，從而使淋巴細(xì)胞偏向于Thl細(xì)胞和INF-7產(chǎn)生。能夠上調(diào)T淋巴細(xì)胞上的IL-12R的物質(zhì)可以是對(duì)干擾素受體具有激動(dòng)活性的物質(zhì)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)干擾素受體具有激動(dòng)活性的物質(zhì)是激動(dòng)劑。這樣的物質(zhì)的例子包括蛋白、多肽、肽、抗體、親和體、及其片段、融合蛋白、合成的和/或有機(jī)的分子例如小分子、以及天然配體。在特定的實(shí)施方案中，該物質(zhì)是干擾素受體的天然配體，即干擾素，例如干擾素-a。加入能夠上調(diào)T淋巴細(xì)胞上的IL-12R的物質(zhì)的最適時(shí)間點(diǎn)，例如對(duì)干擾素受體具有激動(dòng)活性的物質(zhì)，可以通過(guò)測(cè)量培養(yǎng)基中的IL-12水平來(lái)確定。物質(zhì)應(yīng)該優(yōu)選在IL-12的水平與階段ii)的第1天的IL-12水平相比至少增加1倍、例如至少2倍、至少3倍、至少4倍或至少5倍的時(shí)候被加入。在大多數(shù)情況下，IL-12的水平的這種增加將在第二階段ii)起動(dòng)后的第2天到(含)第4天看到，例如在第2天、第3天或第4天。為了基本上避免產(chǎn)生Th2型的腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞，第二階段還可以包括加入一種或多種能夠?qū)筎h2型T淋巴細(xì)胞的發(fā)育的物質(zhì)。這樣的物質(zhì)的例子是能夠中和白介素IL-4、IL-5、IL-10和/或TGF-Z(后者不是白介素)的物質(zhì)，所有這4種物質(zhì)都是建立Th2細(xì)胞因子分布形式和下調(diào)Thl細(xì)胞因子產(chǎn)生所需要的。這樣的物質(zhì)的例子包括蛋白、多肽、肽、可溶性受體、抗體、親和體、及其片段、融合蛋白、合成的和/或有機(jī)的分子例如小分子、以及天然配體。在具體的實(shí)施方案中，物質(zhì)選自結(jié)合白介素從而中和它們的抗體，例如抗IL-4抗體、抗IL-5抗體和/或抗IL-10抗體，以及可溶性受體(例如TGF-Z3受體I和II)和TGF-Z3的結(jié)合蛋白(例如LAP禾口/或LTBP)。一種或多種能夠?qū)筎h2型T淋巴細(xì)胞的發(fā)育的物質(zhì)，例如一種或多種能夠中和IL-4、IL-5、IL-10和/或TGF-]3的物質(zhì)，可以在第二階段ii)的第l天加入。但是，因?yàn)?，因?yàn)榭贵w是昂貴的，因此抗體的加入也可以在加入能夠上調(diào)T淋巴細(xì)胞上IL-12R的物質(zhì)之后，例如在加入能夠上調(diào)T淋巴細(xì)胞上IL-12R的物質(zhì)之后1天、2天或3天的后續(xù)步驟中進(jìn)行。中和性物質(zhì)應(yīng)該以足夠中和白介素的量被加入，例如超過(guò)要中和的白介素的量的10-100倍(摩爾的)。當(dāng)使用抗體時(shí)，一般需要終濃度為每毫升培養(yǎng)基大約2到大約4ng。對(duì)于其它類(lèi)型的中和物質(zhì)來(lái)說(shuō)，應(yīng)該使用與上述濃度的抗體產(chǎn)生同樣效果的終濃度。為了維持對(duì)Th2型T淋巴細(xì)胞發(fā)育的抑制，在階段ii)的整個(gè)過(guò)程中，可以定期、例如階段ii)的每2天、每3天或每4天加入補(bǔ)充量的一種或多種能夠?qū)筎h2型T淋巴細(xì)胞發(fā)育的物質(zhì)，例如一種或多種能夠中和IL-4、IL-5、IL-10和/或TGF-/3的物質(zhì)。術(shù)語(yǔ)每2天、每3天或每4天應(yīng)該被理解為是指階段i)的整個(gè)過(guò)程中，在第一次加入至少一種能夠?qū)筎h2型T淋巴細(xì)胞發(fā)育的物質(zhì)之后的第2天、第3天或第4天開(kāi)始，每2天、每3天或每4天加入至少一種能夠?qū)筎h2型T淋巴細(xì)胞發(fā)育的物質(zhì)。此外，與階段i)一樣，在階段ii)的整個(gè)過(guò)程中，可以定期、例如階段ii)的每2天到4天、即第2天、第3天或第4天加入補(bǔ)充量的對(duì)IL-2受體具有激動(dòng)活性的物質(zhì)，例如激動(dòng)劑，以便維持促進(jìn)細(xì)胞分裂的最適條件。被定期加入的物質(zhì)的劑量在階段i)中加入對(duì)IL-2受體具有激動(dòng)活性的物質(zhì)、例如IL-2時(shí)提到的最適范圍之內(nèi)。為了有利于Thl型腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞的產(chǎn)生，第二階段ii)可以包括加入一種或多種促進(jìn)Thl型T淋巴細(xì)胞發(fā)育的物質(zhì)。這樣的物質(zhì)的例子是對(duì)IL-7、IL-12、IL-15和/或IL-21受體具有激動(dòng)活性的物質(zhì)。更具體來(lái)說(shuō)，物質(zhì)可以是IL-7、IL-12、IL-15和/或IL-21受體的激動(dòng)劑。這樣的激動(dòng)劑的例子包括蛋白、多肽、肽、抗體、親和體、及其片段、融合蛋白、合成的和/或有機(jī)的分子例如小分子、以及天然配體。在具體的實(shí)施方案中，物質(zhì)分別是IL-7、IL-12、IL-15和/或IL-21受體的天然配體，例如IL-7、IL-12、IL-15和/或IL-21。IL-12的效應(yīng)是通過(guò)刺激IL-12R進(jìn)而促進(jìn)Thl淋巴細(xì)胞的活化來(lái)活化IFN-7誘導(dǎo)的STAT途徑。IL-21的功能是增強(qiáng)Thl型T淋巴細(xì)胞的增殖、活化和發(fā)育。IL-7和IL-15通過(guò)促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)增殖，增強(qiáng)被活化的Thl程序化T淋巴細(xì)胞的計(jì)數(shù)起作用。加入一種或多種促進(jìn)Thl型T淋巴細(xì)胞發(fā)育的物質(zhì)的最適時(shí)間點(diǎn)是在T淋巴細(xì)胞對(duì)修飾易感的時(shí)候。如果在T淋巴細(xì)胞對(duì)修飾不易感的時(shí)候加入物質(zhì)，加入是無(wú)效的，即Thl型T淋巴細(xì)胞的發(fā)育將不會(huì)有利。為了確定促進(jìn)Thl型T淋巴細(xì)胞發(fā)育的物質(zhì)、例如對(duì)IL-7、IL-12、IL-15和/或IL-21受體具有激動(dòng)活性的物質(zhì)加入的最適時(shí)間點(diǎn)，可以監(jiān)測(cè)T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的INF-7。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，一種或多種促進(jìn)Thl型T淋巴細(xì)胞發(fā)育的物質(zhì)，例如對(duì)IL-7、IL-12、IL-15和/或IL-21受體具有激動(dòng)活性的物質(zhì)，應(yīng)該在lNF-7的水平與第二階段ii)起動(dòng)時(shí)的INF-7水平相比增加的時(shí)候被加入。在具體的實(shí)施方案中，INF-7水平增加可以被確定為與第二階段ii)起動(dòng)時(shí)的INF-7水平相比，INF-7的水平增加了至少1倍，例如至少2倍、至少3倍、至少4倍。通常這樣的增加可以與下述情況相關(guān)培養(yǎng)基中IFN-7的含量應(yīng)該為每毫升培養(yǎng)基至少100pg，例如每毫升培養(yǎng)基至少150pg、每毫升培養(yǎng)基至少200pg或每毫升培養(yǎng)基至少250pg。在確定促進(jìn)Thl型T淋巴細(xì)胞發(fā)育的物質(zhì)、例如對(duì)IL-7、IL-12、IL-15和/或IL-21受體具有激動(dòng)活性的物質(zhì)加入的最適時(shí)間點(diǎn)時(shí)，人們可以進(jìn)一步觀(guān)察CD4+T淋巴細(xì)胞上的活化標(biāo)記CD25和CD69的表達(dá)，這些標(biāo)記應(yīng)該優(yōu)選被上調(diào)。上調(diào)被理解為與階段ii)的第1天時(shí)T淋巴細(xì)胞上的CD25和CD69的表達(dá)相比，至少大約40%到大約60%以上的CD4+T淋巴細(xì)胞將表達(dá)CD25和CD69，這表明T淋巴細(xì)胞已經(jīng)接受了活化信號(hào)。正常情況下，加入促進(jìn)Thl型T淋巴細(xì)胞發(fā)育的物質(zhì)的最適時(shí)間點(diǎn)將在加入能夠上調(diào)T淋巴細(xì)胞上的IL-12R的物質(zhì)和能夠?qū)筎h2型T淋巴細(xì)胞發(fā)育的物質(zhì)的步驟之后。更具體來(lái)說(shuō)，加入促進(jìn)Thl型T淋巴細(xì)胞發(fā)育的物質(zhì)的最適時(shí)間點(diǎn)將在第二階段ii)起動(dòng)后的第5天到第8天之間，例如在第5天、第6天、第7天或第8天。在加入IL-7、IL-12、IL-15和/或IL-21的情況下，培養(yǎng)基中每種這些物質(zhì)的濃度應(yīng)該在每毫升培養(yǎng)物大約150IU到每毫升培養(yǎng)物大約300IU的范圍內(nèi)，例如每毫升培養(yǎng)物250IU。當(dāng)使用上面提到的具體物質(zhì)之外的物質(zhì)時(shí)，它們應(yīng)該以產(chǎn)生的效果與加入上面提到的具體范圍之內(nèi)的IL-7、IL-12、IL-15和/或IL-21時(shí)相同的終濃度被添加到培養(yǎng)物中。正如上面提到的那樣，本方法優(yōu)選用于增殖T淋巴細(xì)胞，以便獲得Thl型CD4+腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞。本發(fā)明的另一個(gè)方面是通過(guò)使用本文描述的用于增殖腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞的方法，獲得相對(duì)高含量的記憶型T淋巴細(xì)胞。在癌癥的治療中，待治療的患者接受高含量的效應(yīng)性腫瘤反應(yīng)性CD4+T淋巴細(xì)胞當(dāng)然是重要的，因?yàn)檎缟厦嫣岬降哪菢?，這促進(jìn)了細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(Tc)、NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞的活化，所有這些細(xì)胞都能攻擊癌細(xì)胞并針對(duì)腫瘤起普遍防御作用。但是，通過(guò)在同時(shí)施用大量的記憶性腫瘤反應(yīng)性CD4+T淋巴細(xì)胞，患者獲得了針對(duì)腫瘤復(fù)發(fā)或原發(fā)腫瘤轉(zhuǎn)移的終生保護(hù)。因此，本發(fā)明涉及制備記憶性T淋巴細(xì)胞的方法。一般情況下，當(dāng)按照本發(fā)明增殖腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)物時(shí)，將會(huì)獲得大約35%到大約90%的記憶型腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞，例如大約40%到大約90%、大約50%到大約80%或大約60%到大約70%。本發(fā)明人推測(cè)，階段i)中在加入腫瘤抗原之前使淋巴細(xì)胞再生的事實(shí)，以及相對(duì)緩慢的增殖階段，導(dǎo)致了形成記憶性淋巴細(xì)胞與效應(yīng)性淋巴細(xì)胞的高比例。正如上面提到的那樣，T淋巴細(xì)胞上的細(xì)胞表面活化標(biāo)記CD25和CD69的表達(dá)可以被用于確定何時(shí)起動(dòng)本方法的重要步驟，例如，何時(shí)起動(dòng)第二階段ii)。因此，在階段i)和階段ii)的整個(gè)過(guò)程中，連續(xù)地監(jiān)測(cè)CD25和CD69的表達(dá)可能是有益的，例如每2天、每3天或每4天。因?yàn)楸景l(fā)明方法的一個(gè)目的是為了獲得大量的可以施用于患者的特異性CD4+腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞，腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞可以在某些點(diǎn)收獲，導(dǎo)致增殖步驟的終止。收獲腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞的最適時(shí)間點(diǎn)是在T淋巴細(xì)胞上的CD25的表達(dá)被下調(diào)的時(shí)候，其中下調(diào)被定義為5%以下的CD4+T淋巴細(xì)胞種群表達(dá)CD25。收獲的最適時(shí)間點(diǎn)也可以根據(jù)測(cè)量IFN々產(chǎn)生的量來(lái)確定。與初始的IFN-7產(chǎn)生相比，IFN-7的產(chǎn)生應(yīng)該增加至少2倍，例如增加至少3倍、至少4倍或至少5倍，這一般相當(dāng)于IFN-7的水平為至少每毫升培養(yǎng)基100pg。一般情況下，該事件將在第二階段ii)起動(dòng)后的第10天到(含)第14天發(fā)生，即一般情況下細(xì)胞將在第二階段ii)起動(dòng)后的第10天到(含)第14天之間收獲。因此，本發(fā)明的腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞增殖的整個(gè)過(guò)程一般將花費(fèi)從大約25天到(含)大約45天，例如大約26天到(含)大約44天、大約27天到(含)43天、大約27天到(含)42天、大約27天到(含)41天以及大約27天到(含)大約40天。當(dāng)CD25標(biāo)記被下調(diào)時(shí)，除了收獲腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞之外，還可以將它們進(jìn)行另外一輪或多輪的階段ii)。如果通過(guò)表達(dá)方法獲得的腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞的量被認(rèn)為不是施用給患有癌癥的患者的有效量，或者如果患者在進(jìn)行化療治療方案中、而推遲施用T淋巴細(xì)胞直到化療治療完成后被認(rèn)為是有益的，則這樣做被認(rèn)為是有好處的。為了確定腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞是否應(yīng)該進(jìn)行另外一輪或多輪的階段ii)，人們可以觀(guān)察產(chǎn)生的IFN-7的水平、和/或獲得的腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞的總數(shù)和/或CD25的表達(dá)。在IFN-7的水平是每毫升培養(yǎng)基30pg以下，例如每毫升培養(yǎng)基20pg以下、和/或T細(xì)胞的總數(shù)不令人滿(mǎn)意的情況下，從大多數(shù)T細(xì)胞是CD25陰性(即少于5。/。的T淋巴細(xì)胞種群表達(dá)CD25)并從而對(duì)于再刺激易感的時(shí)候開(kāi)始，可以起動(dòng)其它輪的第二階段ii)。收獲后，腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞可以通過(guò)任何常規(guī)的方法進(jìn)行純化，例如通過(guò)使用密度梯度，例如Ficoll培養(yǎng)基。在腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞的收獲和純化之后，一部分腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞可以通過(guò)冷凍在適合的冷凍培養(yǎng)基中儲(chǔ)存。治療方法通過(guò)改進(jìn)的增殖方法獲得的腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞在這里被用于治療患有播散性癌癥的患者。施用的腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞的有效量的定義依賴(lài)于淋巴細(xì)胞的具體類(lèi)型、記憶性與效應(yīng)性T淋巴細(xì)胞的比率以及疾病的嚴(yán)重性。但是，可以施用的平均最少值為至少1千萬(wàn)，例如至少2千萬(wàn)、至少3千萬(wàn)、至少4千萬(wàn)、至少5千萬(wàn)、至少6千萬(wàn)、至少7千萬(wàn)、或至少8千萬(wàn)個(gè)腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞。本發(fā)明人對(duì)于在單劑中施用的腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞的量沒(méi)有鑒定出任何上限。在優(yōu)選實(shí)施方案中，用于給藥的腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞含有效應(yīng)性T淋巴細(xì)胞和記憶性T淋巴細(xì)胞的組合。更具體來(lái)說(shuō)，記憶型腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞的量可以為大約35%到大約90%，例如大約40%到大約90%、大約50%到大約80%或大約60%到大約70%,效應(yīng)性T淋巴細(xì)胞的百分率為大約10%到大約65%，例如大約20%到大約50%或大約30%到大約40%。腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞可以被配制成適合于患者腸胃外給藥的藥物組合物，例如靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、鞘內(nèi)或腹膜內(nèi)施用。當(dāng)腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞腸胃外施用時(shí)，它們可以配制在等滲培養(yǎng)基中，即在與血液具有相同的滲透壓的培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基中含有一種或多種防止細(xì)胞聚集的物質(zhì)。適合的培養(yǎng)基的具體例子是含有最多3%人血清白蛋白、例如最多2%人血清白蛋白或最多1%人血清白蛋白的0.9y。NaCl溶液。對(duì)于靜脈給藥來(lái)說(shuō)，要給藥的組合物中的腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞的濃度通常在每毫升培養(yǎng)基大約50萬(wàn)個(gè)淋巴細(xì)胞到每毫升培養(yǎng)基大約4百萬(wàn)個(gè)淋巴細(xì)胞的范圍之內(nèi)，例如每毫升培養(yǎng)基大約50萬(wàn)個(gè)淋巴細(xì)胞到每毫升培養(yǎng)基大約3百萬(wàn)個(gè)淋巴細(xì)胞、每毫升培養(yǎng)基大約50萬(wàn)個(gè)淋巴細(xì)胞到每毫升培養(yǎng)基大約2百萬(wàn)個(gè)淋巴細(xì)胞、或每毫升培養(yǎng)基大約1百萬(wàn)個(gè)淋巴細(xì)胞到每毫升培養(yǎng)基大約2百萬(wàn)個(gè)淋巴細(xì)胞。含有腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞的組合物可以單劑也可以多劑給藥。它可以用1到2小時(shí)輸注。依賴(lài)于疾病的嚴(yán)重性，治療方法可以進(jìn)行1次或重復(fù)進(jìn)行。此外，疾病復(fù)發(fā)后，治療可以重復(fù)進(jìn)行。本發(fā)明的治療可以用播散性癌癥的任何其它相關(guān)的治療方法來(lái)補(bǔ)充。這樣的補(bǔ)充治療可以在施用淋巴細(xì)胞之前、同時(shí)或之后進(jìn)行，并可以以這種治療通常使用的頻率來(lái)進(jìn)行。補(bǔ)充治療的適合的例子是化療等。試劑盒本發(fā)明還涉及了用于本發(fā)明的方法的試劑盒，試劑盒含有用于培養(yǎng)T淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)基。培養(yǎng)基可以是任何適合的無(wú)血清培養(yǎng)基，例如AIMV、RPMI1640、DMEM或MEM。試劑盒還含有一種或多種用于刺激、活化和引導(dǎo)腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞的物質(zhì)。這樣的物質(zhì)的例子可以是腫瘤來(lái)源的抗原、對(duì)IL-2受體具有激動(dòng)活性的物質(zhì)、能夠上調(diào)T淋巴細(xì)胞上的IL-12R的物質(zhì)、能夠?qū)筎h2型T淋巴細(xì)胞的發(fā)育的物質(zhì)和/或促進(jìn)Thl型T淋巴細(xì)胞的發(fā)育的物質(zhì)。更具體來(lái)說(shuō)，這樣的物質(zhì)可以是IL-2、a-干擾素、抗IL-4抗體、抗IL-5抗體、抗IL-10抗體、IL-7、IL-12、IL-15和/或IL-21。試劑盒還可以含有適合于靜脈給藥的藥物組合物。藥物組合物可以在給藥前與腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞的種群混合。試劑盒還可以含有一個(gè)或多個(gè)注射器和淋巴結(jié)定位劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，注射器中預(yù)先裝有淋巴結(jié)定位劑。試劑盒還可以含有使用說(shuō)明書(shū)，例如計(jì)算機(jī)軟件形式的說(shuō)明書(shū)。圖1是顯示了腹股溝淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移瘤遠(yuǎn)端和中部的轉(zhuǎn)移哨淋巴結(jié)的淋巴閃爍造影。圖2是顯示了頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移瘤遠(yuǎn)端和中部的轉(zhuǎn)移哨淋巴結(jié)的淋巴閃爍造影。圖3說(shuō)明了腫瘤引流淋巴結(jié)的鑒定。圖3A顯示了藍(lán)色染料如何被注射到腫瘤周?chē)约叭玖先绾卧诿?xì)淋巴管中運(yùn)輸，從而指示了淋巴引流(用白色箭頭標(biāo)明)。圖3B顯示了在注射染料后幾分鐘腫瘤引流淋巴結(jié)如何變藍(lán)。白色箭頭標(biāo)明腫瘤引流淋巴結(jié)。圖4顯示了最初的前哨淋巴結(jié)淋巴細(xì)胞被腫瘤抗原和低劑量的IL-2活化，導(dǎo)致了活化標(biāo)記CD25的活化和表達(dá)(上圖)。階段I活化期的結(jié)束由表達(dá)CD25的CD4+T細(xì)胞的數(shù)量的減少來(lái)確定(下圖)。當(dāng)少于5%的CD4+T細(xì)胞表達(dá)CD25時(shí)，用抗原再次刺激來(lái)起動(dòng)階段II。圖5說(shuō)明了階段I和階段II的活化導(dǎo)致了CD4+輔助性T細(xì)胞的增殖和富集。圖6說(shuō)明了在階段I中大部分的細(xì)胞是未接觸抗原的CD62L+細(xì)胞或活化的CD69+CD62L+細(xì)胞。在階段II后，大部分的細(xì)胞是CD62L-，并由記憶性和效應(yīng)性CD4+輔助性T細(xì)胞組成。CD62L-T細(xì)胞不表達(dá)優(yōu)選的淋巴結(jié)歸巢分子，因此它們?cè)诜橇馨推鞴僦袑ふ已仔詤^(qū)域。圖7顯示了來(lái)自腫瘤(腫瘤濾過(guò)性淋巴細(xì)胞)、轉(zhuǎn)移哨淋巴結(jié)(SN)和無(wú)關(guān)的淋巴結(jié)(LN)的在階段I被刺激的原代細(xì)胞，不產(chǎn)生或僅產(chǎn)生很少的IFN-7。圖8顯示了在階段ii)后的增殖后，抗原依賴(lài)性IFN-7產(chǎn)生存在劑量依賴(lài)性增加。圖9顯示通過(guò)TCR表達(dá)的選擇性富集研究，增殖和活化方案3促進(jìn)了抗原特異性T細(xì)胞克隆的增殖。下面的實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不以任何形式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行限制。實(shí)施例實(shí)施例1鑒定轉(zhuǎn)移瘤的轉(zhuǎn)移哨淋巴結(jié)研究包括8名患者(4名男性和4名女性)(參見(jiàn)表l);平均年齡為61.4歲。他們中的一個(gè)經(jīng)歷了兩次手術(shù)，在兩次過(guò)程中都定位了轉(zhuǎn)移哨淋巴結(jié)。轉(zhuǎn)移哨淋巴結(jié)通過(guò)三種原理不同的方法定位。淋巴結(jié)定位劑被注射到腹部復(fù)發(fā)腫瘤、實(shí)質(zhì)性肝臟轉(zhuǎn)移瘤或腹股溝淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移瘤的周?chē)⑴c之接近。表1、研究中患者的概述<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>第一名患者是48歲的男性，以前因?yàn)槊つc癌進(jìn)行了右側(cè)結(jié)腸部分切除手術(shù)。l年后，他在吻合術(shù)區(qū)域旁邊的腸系膜脂肪中發(fā)展出了5cm大的腹腔復(fù)發(fā)腫瘤。吻合區(qū)與復(fù)發(fā)腫瘤進(jìn)行全部切除。將專(zhuān)利藍(lán)染料注射到轉(zhuǎn)移瘤周?chē)?，并鑒定了沿著中結(jié)腸動(dòng)脈的3個(gè)轉(zhuǎn)移哨淋巴結(jié)，包括一個(gè)在腸系膜根部的尖淋巴結(jié)。第二名患者是54歲的男性，因?yàn)橹蹦c癌進(jìn)行了腹腔會(huì)陰直腸切除手術(shù)，盡管在手術(shù)前沒(méi)有發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)距離的轉(zhuǎn)移，但本發(fā)明人在其左肝葉中發(fā)現(xiàn)了肝臟轉(zhuǎn)移瘤。手術(shù)后進(jìn)行了腹部CT掃描，轉(zhuǎn)移瘤外徑3厘米，位于第二和第三肝段之間。兩個(gè)月后，他進(jìn)行了部分左側(cè)肝臟切除手術(shù)，將專(zhuān)利藍(lán)染料注射到肝實(shí)質(zhì)中轉(zhuǎn)移瘤周?chē)透浇?。大約5分鐘后，在肝十二指腸系帶中發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)轉(zhuǎn)移哨淋巴結(jié)。術(shù)中的超聲沒(méi)有能夠證實(shí)肝臟中的任何其它轉(zhuǎn)移瘤。在轉(zhuǎn)移哨淋巴結(jié)中沒(méi)有出現(xiàn)腫瘤細(xì)胞；但是轉(zhuǎn)移哨淋巴結(jié)中的淋巴細(xì)胞顯示出對(duì)轉(zhuǎn)移瘤的特異性活性。盡管開(kāi)始用腫瘤反應(yīng)性淋巴細(xì)胞進(jìn)行治療并且總體情況良好，但是他在右側(cè)肝葉中發(fā)展出了新的肝臟轉(zhuǎn)移瘤，并進(jìn)行了第二次肝切除手術(shù)。在這次手術(shù)中，在2厘米大的轉(zhuǎn)移瘤的周?chē)⑸鋵?zhuān)利藍(lán)染料，鑒定出了位于肝門(mén)中的2個(gè)轉(zhuǎn)移哨淋巴結(jié)。第三名患者是77歲的女性，兩年前因?yàn)橐覡罱Y(jié)腸癌進(jìn)行了乙狀結(jié)腸切除手術(shù)。在隨訪(fǎng)時(shí)發(fā)現(xiàn)了CEA升高，并且用PET掃描和CT掃描進(jìn)一步調(diào)査顯示出在右側(cè)肝葉的VI和VII段之間有4厘米的轉(zhuǎn)移瘤。進(jìn)行了右側(cè)肝臟次全切除術(shù)，在注射專(zhuān)利藍(lán)染料后在肝門(mén)發(fā)現(xiàn)了3個(gè)轉(zhuǎn)移哨淋巴結(jié)。4號(hào)患者是73歲的男性，因?yàn)橐覡罱Y(jié)腸中的腫瘤進(jìn)行了乙狀結(jié)腸切除手術(shù)。l年多以后，他發(fā)展出了2厘米大小的孤立性肝臟轉(zhuǎn)移瘤，手術(shù)部分切除V和VI段。在轉(zhuǎn)移瘤的周?chē)透浇?個(gè)不同的位置注射了總共l.Oml專(zhuān)利藍(lán)染料后，在肝門(mén)中鑒定了l個(gè)轉(zhuǎn)移哨淋巴結(jié)。對(duì)淋巴結(jié)的分析表明它不具有轉(zhuǎn)移疾病的跡象，但是它含有腫瘤反應(yīng)性淋巴細(xì)胞。5號(hào)患者是66歲的男性，以前因?yàn)樯Y(jié)腸癌進(jìn)行了右側(cè)結(jié)腸部分切除手術(shù)。在常規(guī)的結(jié)腸癌術(shù)后隨訪(fǎng)中，CT掃描顯示出在右側(cè)肝葉的VII段中的2.5厘米孤立性轉(zhuǎn)移瘤。在手術(shù)中，在轉(zhuǎn)移瘤附近的肝組織中注射了1.0ml專(zhuān)利藍(lán)染料，在肝十二指腸系帶中定位了兩個(gè)以及在肝門(mén)中定位了兩個(gè)轉(zhuǎn)移哨淋巴結(jié)。在摘除轉(zhuǎn)移哨淋巴結(jié)的同時(shí)一起切除了VI-VIII段。6號(hào)病例是51歲的女性，6年前由于卵巢癌進(jìn)行了子宮切除手術(shù)和雙側(cè)輸卵管卵巢切除手術(shù)。隨后，癌癥播散到腹部和腹膜，僅進(jìn)行了姑息治療。她具有大的、部分壞死的肝臟轉(zhuǎn)移瘤。手術(shù)時(shí)，在向肝臟轉(zhuǎn)移瘤附近注射了專(zhuān)利藍(lán)染料后，在腹部中央鑒定了3個(gè)轉(zhuǎn)移哨淋巴結(jié)。轉(zhuǎn)移哨淋巴結(jié)中都含有腫瘤細(xì)胞和腫瘤反應(yīng)性淋巴細(xì)胞。7號(hào)患者是63歲的女性，因?yàn)槁殉舶┻M(jìn)行了雙側(cè)卵巢切除手術(shù)。在手術(shù)中發(fā)現(xiàn)她的病擴(kuò)散到了網(wǎng)膜，在此后經(jīng)歷了幾次消瘤手術(shù)，包括由于腫瘤轉(zhuǎn)移切除了右結(jié)腸。l年后她在左腹股溝發(fā)展出了抗性，細(xì)針活組織檢査證實(shí)了來(lái)自卵巢癌的轉(zhuǎn)移瘤，在可觸知的轉(zhuǎn)移瘤附近的4個(gè)位置皮下注射了示蹤劑锝99(4x0.25ml，50MB叫/ml)之后，淋巴閃爍造影驚奇地證實(shí)了兩個(gè)靠近在一起的位于腹股溝淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移腫瘤的遠(yuǎn)端和中部的轉(zhuǎn)移哨淋巴結(jié)(參見(jiàn)圖1)。在淋巴閃爍造影幾小時(shí)后的外科手術(shù)過(guò)程中，通過(guò)在示蹤劑的同樣位點(diǎn)注射專(zhuān)利藍(lán)染料，該淋巴結(jié)被進(jìn)一步鑒定為引流轉(zhuǎn)移瘤的藍(lán)色轉(zhuǎn)移哨淋巴結(jié)。8號(hào)患者是59歲的女性，由于胰腺癌進(jìn)行了Whipples手術(shù)。兩年后診斷出局部復(fù)發(fā)腫瘤，進(jìn)行了消瘤手術(shù)，在原位復(fù)發(fā)腫瘤附近和上方注射了專(zhuān)利藍(lán)染料之后，其中發(fā)現(xiàn)了4個(gè)轉(zhuǎn)移哨淋巴結(jié)。細(xì)胞角蛋白抗體被用于檢測(cè)惡性細(xì)胞。沒(méi)有轉(zhuǎn)移瘤的淋巴結(jié)中的淋巴細(xì)胞被自發(fā)活化，正如在增殖分析中用腫瘤勻漿液刺激后它們分泌7-干擾素的能力所顯示的那樣。來(lái)自轉(zhuǎn)移瘤的轉(zhuǎn)移哨淋巴結(jié)的淋巴細(xì)胞起初對(duì)這種刺激反應(yīng)弱，表明它們被轉(zhuǎn)移瘤免疫抑制了。但是，來(lái)自非轉(zhuǎn)移瘤和轉(zhuǎn)移瘤淋巴結(jié)的細(xì)胞都能在體外被增殖到很高的數(shù)量，如實(shí)施例2顯示。實(shí)施例2腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞的增殖使用本文描述的方法進(jìn)行了轉(zhuǎn)移哨淋巴結(jié)的鑒定。轉(zhuǎn)移哨和非轉(zhuǎn)移哨淋巴結(jié)被切成兩半，一部分淋巴結(jié)被送去按照常規(guī)程序進(jìn)行組織病理學(xué)檢驗(yàn)。一部分包括浸潤(rùn)邊緣的樣品的轉(zhuǎn)移瘤被取下用作其他程序中的抗原來(lái)源。細(xì)胞培養(yǎng)階段I，初始活化將轉(zhuǎn)移哨淋巴結(jié)材料放在冰上，立即使用AIMV⑧培養(yǎng)基(Invitrogen)在所有時(shí)間對(duì)其進(jìn)行護(hù)理。通過(guò)在松散安裝的玻璃勻漿器中輕柔勻漿，然后將勻漿細(xì)胞在培養(yǎng)基中洗兩次，獲得轉(zhuǎn)移哨淋巴結(jié)淋巴細(xì)胞的單細(xì)胞懸浮液。轉(zhuǎn)移哨淋巴結(jié)淋巴細(xì)胞以每毫升4百萬(wàn)個(gè)細(xì)胞放置在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，加入白介素-2(IL-2)(Proleukin⑧，Chiron)到濃度為240IU/ml培養(yǎng)基。自體轉(zhuǎn)移瘤提取物通過(guò)用UltraTurrax在5倍體積(w/v)的2xPBS中勻漿、然后在97°C變性5分鐘來(lái)制備。在開(kāi)始細(xì)胞培養(yǎng)后3到4天，以1/100的濃度加入自體腫瘤提取物。對(duì)于長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)來(lái)說(shuō)，細(xì)胞被保持在37°C和5%C02的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，每3-4天加入240IUIL-2/ml培養(yǎng)基。階段II，活化和增殖18-22天后，監(jiān)測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)物中CD25的表達(dá)。當(dāng)表達(dá)CD25的細(xì)胞的數(shù)量降低到5%以下時(shí)，通過(guò)加入濃度為1/100的自身轉(zhuǎn)移瘤提取物，在階段II中重新刺激細(xì)胞(圖4)。為了有效的抗原呈遞，使用Ficoll-PaquePLUS(AmershamBiosciences,GEHealthcare)收集自體的PBMC，用2500rad進(jìn)行輻射，并加入到細(xì)胞培養(yǎng)物中。在重新刺激3天后，加入濃度為100-500IU/ml的a-干擾素(Introna)以及抗IL-4抗體，使?jié)舛葹?/ig/ml。5到8天后，在增殖物中加入IL-12(4ng/ml)，以便促進(jìn)對(duì)產(chǎn)生IFN-7的Thl細(xì)胞的誘導(dǎo)。在注入患者的前一天，將細(xì)胞培養(yǎng)物用Ficoll-PaquePLUS(AmershamBiosciences,GEHealthcare)進(jìn)行純化，以便回收培養(yǎng)物中的活細(xì)胞。在注入當(dāng)天，將細(xì)胞在鹽水溶液(NatriumkloridBaxterViaflo9mg/ml，Baxter)中洗兩次，然后轉(zhuǎn)移到含有100-200ml鹽水溶液和1%人血清白蛋白(Baxter)的轉(zhuǎn)移包中。在注入前檢測(cè)微生物的存在。細(xì)胞的輸注在專(zhuān)業(yè)醫(yī)務(wù)人員的監(jiān)督下在l-2小時(shí)過(guò)程中進(jìn)行。免疫學(xué)評(píng)估使用氚標(biāo)記的胸腺嘧啶摻入增殖分析進(jìn)行了進(jìn)一步的免疫學(xué)評(píng)估。設(shè)置了轉(zhuǎn)移哨結(jié)淋巴細(xì)胞的等份試樣用于該目的，非轉(zhuǎn)移哨結(jié)淋巴細(xì)胞的單細(xì)胞懸浮液通過(guò)在松散安裝的玻璃勻漿器中溫和加壓獲得，外周血白細(xì)胞通過(guò)Ficoll-PaquePLUS(AmershamBiosciences,GEHealthcare)進(jìn)行純化。細(xì)胞在含有2.5%胎牛血清(FCS)(Lifetechnologies)的RPMI1640(Lifetechnologies)中重新懸浮并清洗兩次。最后，將細(xì)胞重新懸浮在含有10%人類(lèi)AB血清(Sigma)、1%青霉素-鏈霉素(Sigma)和1%谷氨酰胺(Sigma)的RPMI1640增殖培養(yǎng)基中。淋巴結(jié)細(xì)胞和純化的PBL以3乂105個(gè)細(xì)胞/孔用在96孔板中，使用三份平行的1/100、1/10稀釋的轉(zhuǎn)移瘤勻漿液或10pig/ml的ConA(Sigma)進(jìn)行刺激。在收獲前18小時(shí)通過(guò)在每個(gè)孔中加入lMCi的SH-胸腺嘧啶，在第5、第6和第7天測(cè)量增殖。對(duì)樣品進(jìn)行閃爍計(jì)數(shù)。在細(xì)胞培養(yǎng)開(kāi)始時(shí)，為了測(cè)量IFN-7的分泌，淋巴結(jié)細(xì)胞和PBL的刺激以3xl()S個(gè)細(xì)胞/孔在96孔板中一式三份進(jìn)行，使用了1/10、1/100稀釋的腫瘤勻漿液、或10/xg/ml的ConA(Sigma)。在三份的合并樣品中，培養(yǎng)上清液中分泌的IFN-7的量用ELISA(HumanIFN-7Du0set，R&DSystems)進(jìn)行測(cè)量(圖7)。在細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，上清液樣品被取出，IFN-y和IL-4的分泌用ELISA(人類(lèi)IFN々Duoset和人類(lèi)IL-4Duoset,R&DSystems)進(jìn)行三份平行測(cè)量(圖8A和8B)。流式細(xì)胞儀分析首先使用流式細(xì)胞儀對(duì)來(lái)自轉(zhuǎn)移哨淋巴結(jié)、非轉(zhuǎn)移哨淋巴結(jié)、PBMC和來(lái)自轉(zhuǎn)移瘤的細(xì)胞進(jìn)行了細(xì)胞的表征。培養(yǎng)樣品中從轉(zhuǎn)移哨淋巴結(jié)獲得的淋巴細(xì)胞每2到3個(gè)星期被取出用于流式細(xì)胞儀分析。細(xì)胞在補(bǔ)充了2%FCS和0.05%NaN3的PBS中(FACS緩沖液)，與針對(duì)用于免疫細(xì)胞亞種群和用于淋巴細(xì)胞活化的標(biāo)記物的抗體孵育30分鐘(圖5、6和7)。使用針對(duì)下列標(biāo)記物的與熒光素異硫氰酸酯(FITC)偶聯(lián)的抗體CD69、HLA-DR、CD45RA、CD25，與藻紅蛋白(PE)偶聯(lián)的抗體CD62L、CD19、CD45RO、CD56，與多甲藻素-葉綠素-蛋白(PerCP)偶聯(lián)的抗體CD8、CD3，與別藻藍(lán)蛋白(APC)偶聯(lián)的抗體CD4、CD14、CD8。使用Betamark試劑盒(BeckmanCoulter)檢測(cè)了V/3-所有組成成分，每管5xl()S個(gè)細(xì)胞在含有FITC、PE和雙色FITC-PE偶聯(lián)的TCRV/3抗體的混合物的8個(gè)不同的10/d小管中被染色，每個(gè)管中加入CD8PerCP禾卩CD4APC(圖9)。實(shí)施例3通過(guò)施用增殖的轉(zhuǎn)移瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞治療轉(zhuǎn)移瘤下列三個(gè)病例用于表明從metinal淋巴結(jié)獲得并增殖的T淋巴細(xì)胞可以用于治療播散性癌癥。47歲的男性，以前因?yàn)槊つc中的結(jié)腸癌進(jìn)行過(guò)右側(cè)結(jié)腸部分切除手術(shù)。l年后，他在吻合區(qū)域外部的腸系膜脂肪中發(fā)展出了5cm大的腹腔復(fù)發(fā)腫瘤。在外科手術(shù)中，將專(zhuān)利藍(lán)染料注射到轉(zhuǎn)移瘤周?chē)闹靖浇?，沿著中結(jié)腸動(dòng)脈鑒定了3個(gè)轉(zhuǎn)移哨淋巴結(jié)，包括一個(gè)在腸系膜根部的尖淋巴結(jié)。吻合區(qū)與復(fù)發(fā)腫瘤被全部切除。轉(zhuǎn)移哨淋巴結(jié)和轉(zhuǎn)移瘤的浸潤(rùn)部分在手術(shù)后按照本文的描述被解剖并處理。轉(zhuǎn)移瘤反應(yīng)性淋巴細(xì)胞被增殖到高的數(shù)量?；颊咴谑中g(shù)后大約4周被注入了這些自體的CD4+T細(xì)胞。自從手術(shù)后他的健康狀況良好，胸部和腹部CT掃描正常，沒(méi)有轉(zhuǎn)移瘤的跡象，CEA水平(腫瘤標(biāo)記物)正常。到目前為止注入后隨訪(fǎng)了36個(gè)月。63歲的女性，因?yàn)槁殉舶┮呀?jīng)進(jìn)行過(guò)雙側(cè)卵巢切除手術(shù)。在手術(shù)中發(fā)現(xiàn)她有向網(wǎng)膜的播散性疾病，并經(jīng)歷了幾次消瘤手術(shù)，包括由于腫瘤轉(zhuǎn)移切除了右側(cè)結(jié)腸。l年后她在左腹股溝發(fā)展出了抗性，細(xì)針活組織檢査證實(shí)了來(lái)自卵巢癌的轉(zhuǎn)移瘤。淋巴閃爍造影證實(shí)了兩個(gè)靠近一起的腹股溝淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移瘤的遠(yuǎn)端和中部的轉(zhuǎn)移哨淋巴結(jié)(參見(jiàn)圖1)。使用锝99和7射線(xiàn)檢測(cè)管聯(lián)合專(zhuān)利藍(lán)染料定位了淋巴結(jié)。按照與上面相同的原理對(duì)淋巴結(jié)和轉(zhuǎn)移瘤進(jìn)行了處理。治療后7個(gè)月，患者健康狀況良好，全時(shí)工作。腫瘤標(biāo)記物CA135的數(shù)量已經(jīng)從高降到了低。第三個(gè)例子是54歲的男性，他因?yàn)榈臀恢蹦c癌已經(jīng)進(jìn)行了腹腔會(huì)陰直腸切除手術(shù)。在外科手術(shù)中在肝臟左肝葉中鑒定到了轉(zhuǎn)移瘤(盡管手術(shù)前肝臟掃描為陰性)。再過(guò)6周后，他進(jìn)行了左側(cè)肝臟切除手術(shù)。將專(zhuān)利藍(lán)染料注射到轉(zhuǎn)移瘤周?chē)膶?shí)質(zhì)中，幾分鐘后在肝十二指腸系帶中的兩個(gè)轉(zhuǎn)移哨淋巴結(jié)變藍(lán)。在轉(zhuǎn)移哨淋巴結(jié)中沒(méi)有檢測(cè)到轉(zhuǎn)移瘤，但是它們都顯示出對(duì)腫瘤的活性?；颊哂脕?lái)源于轉(zhuǎn)移哨淋巴結(jié)的增殖的腫瘤反應(yīng)性淋巴細(xì)胞進(jìn)行治療。盡管開(kāi)始用腫瘤反應(yīng)性淋巴細(xì)胞進(jìn)行治療并且總體情況良好，但是他在右側(cè)肝葉發(fā)展出了新的肝臟轉(zhuǎn)移瘤，并進(jìn)行了第二次肝臟切除手術(shù)。在這次手術(shù)中，在2厘米大的轉(zhuǎn)移瘤周?chē)⑸涞膶?zhuān)利藍(lán)染料鑒定出了位于肝門(mén)中的2個(gè)轉(zhuǎn)移哨淋巴結(jié)。他再次以注入來(lái)自新的轉(zhuǎn)移哨淋巴結(jié)的腫瘤反應(yīng)性淋巴細(xì)胞進(jìn)行治療?；颊咄耆祻?fù)，已經(jīng)全時(shí)工作。根據(jù)CT照片，他在肝臟中還有一些殘留的疾病以及略微高的腫瘤標(biāo)記物(CEA)。自從第一次注入淋巴細(xì)胞開(kāi)總體隨訪(fǎng)已經(jīng)36個(gè)月。參考文獻(xiàn)MaritsP等Detectionofimmuneresponsesagainsturinarybladdercancerinsentinellymphnodes.(在前哨淋巴結(jié)中檢測(cè)針對(duì)膀胱癌的免疫反應(yīng))EurUrol已接受。MooreKL.Clinicallyorientedanatomy.《臨床角軍咅!]學(xué)》Baltimore:Williams禾卩Wilkins.1985.p42-p45.RenkinsEM.Someconsequencesofcapillarypermaebilitytomacromolecules:Starling'shypothesisreconsidered.(毛細(xì)血管對(duì)大分子滲透性的一些結(jié)果Starling's假說(shuō)的重新思考)AmJPhysiology.1986;250:H706-H710.權(quán)利要求1.治療患有播散性癌癥的患者的方法，該方法包括i)在患者中鑒定一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)移哨淋巴結(jié)，ii)切除一個(gè)或多個(gè)淋巴結(jié)以及任選全部或部分轉(zhuǎn)移瘤，iii)從所述淋巴結(jié)中分離轉(zhuǎn)移瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞，iv)體外增殖所述轉(zhuǎn)移瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞，v)將這樣獲得的T淋巴細(xì)胞施用于患者，其中T淋巴細(xì)胞是CD4+輔助性和/或CD8+T淋巴細(xì)胞。2.權(quán)利要求l中的方法，其中癌癥是任何解剖學(xué)位置中上皮、間質(zhì)或胚胎學(xué)來(lái)源的任何實(shí)體腫瘤，例如對(duì)于上皮瘤來(lái)說(shuō)，例如乳腺、結(jié)腸、胰腺、膀胱、小腸、前列腺、子宮頸、外陰、卵巢中的腺癌；對(duì)于間質(zhì)腫瘤來(lái)說(shuō)，例如關(guān)節(jié)、骨骼、肌肉和腱中的肉瘤以及一些血液腫瘤例如淋巴瘤；對(duì)于胚胎學(xué)腫瘤來(lái)說(shuō)，例如畸胎瘤。3.權(quán)利要求1或2中的方法，其中轉(zhuǎn)移哨淋巴結(jié)在步驟i)中通過(guò)將一種或多種淋巴結(jié)定位劑注射到患者中來(lái)鑒定。4.前述權(quán)利要求任何一項(xiàng)中的方法，其中一種或多種淋巴結(jié)定位劑是基于親和性的。5.權(quán)利要求l-4任何一項(xiàng)中的方法，其中一種或多種淋巴結(jié)定位劑是基于非親和性的。6.前述權(quán)利要求任何一項(xiàng)中的方法，其中一種或多種淋巴結(jié)定位劑被注射到轉(zhuǎn)移腫瘤之中、之上、周?chē)?、附近?或之下。7.前述權(quán)利要求任何一項(xiàng)中的方法，其中一種或多種淋巴結(jié)定位劑通過(guò)單次注射進(jìn)行注射。8.權(quán)利要求l-6任何一項(xiàng)中的方法，其中一種或多種淋巴結(jié)定位劑通過(guò)多次注射進(jìn)行注射。9.前述權(quán)利要求任何一項(xiàng)中的方法，其中一種或多種淋巴結(jié)定位劑通過(guò)通過(guò)非外科程序進(jìn)行注射。10.權(quán)利要求l-9任何一項(xiàng)中的方法，其中一種或多種淋巴結(jié)定位劑作為外科程序的一部分進(jìn)行注射。11.前述權(quán)利要求任何一項(xiàng)中的方法，其中體外增殖步驟iv)包括i)第一階段，用腫瘤來(lái)源的抗原與至少一種對(duì)IL-2受體具有激動(dòng)活性的物質(zhì)一起刺激腫瘤反應(yīng)性CD4+輔助性細(xì)胞和/或CD8+T淋巴細(xì)胞，以促進(jìn)腫瘤反應(yīng)性CD4+輔助性細(xì)胞和/或CD8+T淋巴細(xì)胞的存活，以及ii)第二階段，激活和促進(jìn)腫瘤反應(yīng)性CD4+輔助性細(xì)胞和/或CD8+T淋巴細(xì)胞的生長(zhǎng)，其中當(dāng)CD25細(xì)胞表面標(biāo)記(或IL-2R標(biāo)記)在T淋巴細(xì)胞上被下調(diào)時(shí)起動(dòng)第二階段ii)。12.權(quán)利要求11中的方法，其中下調(diào)被定義為5。/。以下的T淋巴細(xì)胞種群表達(dá)CD25。13.權(quán)利要求11或12中的方法，其中T淋巴細(xì)胞存在于培養(yǎng)基中。14.權(quán)利要求13中的方法，其中培養(yǎng)基是無(wú)血清培養(yǎng)基，例如AIMV培養(yǎng)基。15.前述權(quán)利要求任何一項(xiàng)中的方法，其中第一階段i)通過(guò)加入至少一種對(duì)IL-2受體具有激動(dòng)活性的物質(zhì)來(lái)起動(dòng)。16.權(quán)利要求15中的方法，其中對(duì)IL-2受體具有激動(dòng)活性的物質(zhì)是IL隱2。17.權(quán)利要求16中的方法，其中IL-2以低劑量被加入，例如從大約100IU/ml培養(yǎng)基到大約700IU/ml培養(yǎng)基，從大約100IU/ml培養(yǎng)基到大約600IU/ml培養(yǎng)基、從大約100IU/ml培養(yǎng)基到大約500IU/ml培養(yǎng)基、從大約100IU/ml培養(yǎng)基到大約400IU/ml培養(yǎng)基、從大約100IU/ml培養(yǎng)基到大約300IU/ml培養(yǎng)基和從大約100IU/ml培養(yǎng)基到大約200IU/ml培養(yǎng)基。18.前述權(quán)利要求任何一項(xiàng)中的方法，其中在整個(gè)階段i)，定期加入額外量的至少一種對(duì)IL-2受體具有激動(dòng)活性的物質(zhì)，例如階段i)的每2天、每3天或每4天。19.權(quán)利要求18中的方法，其中對(duì)IL-2受體具有激動(dòng)活性的物質(zhì)是IL隱2。20.權(quán)利要求19中的方法，其中加入的IL-2的濃度是從大約100IU/ml培養(yǎng)基到大約700IU/ml培養(yǎng)基，從大約100IU/ml培養(yǎng)基到大約600IU/ml培養(yǎng)基、從大約100IU/ml培養(yǎng)基到大約500IU/ml培養(yǎng)基、從大約100IU/ml培養(yǎng)基到大約400IU/ml培養(yǎng)基、從大約100IU/ml培養(yǎng)基到大約300IU/ml培養(yǎng)基和從大約100IU/ml培養(yǎng)基到大約200IU/ml培養(yǎng)基。21.前述權(quán)利要求任何一項(xiàng)中的方法，其中在第一階段i)第2天到(含)第5天，例如在第2天、第3天、第4天或第5天，加入腫瘤來(lái)源的抗原。22.權(quán)利要求11-20任何一項(xiàng)中的方法，其中腫瘤來(lái)源的抗原基本上在階段i)起動(dòng)的同時(shí)或最多直到其后的3天加入。23.前述權(quán)利要求任何一項(xiàng)中的方法，其中腫瘤來(lái)源的抗原是腫瘤的變性勻漿。24.前述權(quán)利要求任何一項(xiàng)中的方法，其中腫瘤來(lái)源的抗原是蛋白、多肽或肽。25.前述權(quán)利要求任何一項(xiàng)中的方法，其中第二階段ii)從第一階段i)的第17天到(含)第23天起動(dòng)，例如第17天、第18天、第19天、第20天、第21天、第22天或第23天。26.前述權(quán)利要求任何一項(xiàng)中的方法，其中第二階段通過(guò)向T淋巴細(xì)胞中加入腫瘤來(lái)源的抗原以活化腫瘤反應(yīng)性CD25-陰性T淋巴細(xì)胞來(lái)起動(dòng)。27.權(quán)利要求26中的方法，其中腫瘤來(lái)源的抗原是腫瘤的變性勻漿。28.權(quán)利要求26中的方法，其中腫瘤來(lái)源的抗原是腫瘤蛋白、多肽或肽。29.權(quán)利要求26-28任何一項(xiàng)中的方法，還包括向T淋巴細(xì)胞中與腫瘤來(lái)源的抗原一起加入抗原呈遞細(xì)胞。30.權(quán)利要求20中的方法，其中抗原呈遞細(xì)胞是輻射過(guò)的含有抗原呈遞B細(xì)胞和/或單核細(xì)胞的外周血白細(xì)胞。31.前述權(quán)利要求任何一項(xiàng)中的方法，其中第二階段ii)包括加入至少一種能夠上調(diào)T淋巴細(xì)胞上的IL-12R的物質(zhì)。32.權(quán)利要求31中的方法，其中能夠上調(diào)T淋巴細(xì)胞上的IL-12R的物質(zhì)是對(duì)干擾素受體具有激動(dòng)活性的物質(zhì)。33.權(quán)利要求32中的方法，其中對(duì)干擾素受體具有激動(dòng)活性的物質(zhì)是干擾素。34.權(quán)利要求33中的方法，其中對(duì)干擾素受體具有激動(dòng)活性的物質(zhì)是a-干擾素。35.權(quán)利要求31-34中任一項(xiàng)的方法，其中能夠上調(diào)T淋巴細(xì)胞上的IL-12R的物質(zhì)，例如對(duì)干擾素受體具有激動(dòng)活性的物質(zhì)，在IL-12的水平與階段ii)的第1天的IL-12水平相比至少增加1倍、例如至少2倍、至少3倍、至少4倍或至少5倍時(shí)被加入。36.權(quán)利要求31-35中任一項(xiàng)的方法，其中能夠上調(diào)T淋巴細(xì)胞上的IL-12R的物質(zhì)，例如對(duì)干擾素受體具有激動(dòng)活性的物質(zhì)，在第二階段ii)起動(dòng)后的第2天到(含)第4天被加入，例如在第2天、第3天或第4天。37.前述權(quán)利要求任何一項(xiàng)中的方法，其中第二階段ii)包括加入一種或多種能夠?qū)筎h2型T淋巴細(xì)胞發(fā)育的物質(zhì)。38.權(quán)利要求37中的方法，其中一種或多種能夠?qū)筎h2型T淋巴細(xì)胞發(fā)育的物質(zhì)是一種或多種能夠中和IL-4、IL-5、IL-10和/或TGF-/3的物質(zhì)。39.權(quán)利要求38中的方法，其中一種或多種能夠中和IL-4、IL-5、IL-10和/或TGF-/3的物質(zhì)是抗IL-4抗體、抗IL-5抗體和/或抗IL-10抗體。40.權(quán)利要求37到39任何一項(xiàng)中的方法，其中一種或多種能夠?qū)筎h2型T淋巴細(xì)胞發(fā)育的物質(zhì)，例如一種或多種能夠中和IL-4、IL-5、IL-10和/或TGF-^的物質(zhì)，在第二階段ii)的第1天加入。41.權(quán)利要求37到39任何一項(xiàng)中的方法，其中一種或多種能夠?qū)筎h2型T淋巴細(xì)胞發(fā)育的物質(zhì)，例如一種或多種能夠中和IL-4、IL-5、IL-10和/或TGF-/3的物質(zhì)，是在加入了能夠上調(diào)T淋巴細(xì)胞上的IL-12R的物質(zhì)之后的后續(xù)步驟中加入的。42.權(quán)利要求41中的方法，其中一種或多種能夠?qū)筎h2型T淋巴細(xì)胞發(fā)育的物質(zhì)，例如一種或多種能夠中和IL-4、IL-5和/或IL-10的物質(zhì)，是在加入能夠上調(diào)T淋巴細(xì)胞上的IL-12R的物質(zhì)后1天加入的。43.前述權(quán)利要求任何一項(xiàng)中的方法，其中在整個(gè)階段ii)，定期加入額外量的一種或多種能夠?qū)筎h2型T淋巴細(xì)胞發(fā)育的物質(zhì)，例如一種或多種能夠中和IL-4、IL-5、IL-10和/或TGF-i8的物質(zhì)。44.權(quán)利要求43中的方法，其中額外量的一種或多種能夠?qū)筎h2型T淋巴細(xì)胞發(fā)育的物質(zhì)，例如一種或多種能夠中和IL-4、IL-5、IL-10和/或TGF-Z3的物質(zhì)，在階段ii)的每2天、每3天或每4天被加入。45.前述權(quán)利要求任何一項(xiàng)中的方法，其中在整個(gè)階段ii)定期加入額外量的對(duì)IL-2受體具有激動(dòng)活性的物質(zhì)。46.權(quán)利要求45中的方法，其中對(duì)IL-2受體具有激動(dòng)活性的物質(zhì)在階段ii)的每2天、每3天或每4天被加入，例如每3天。47.權(quán)利要求45或46中的方法，其中對(duì)IL-2受體具有激動(dòng)活性的物質(zhì)是IL-2。48.前述權(quán)利要求任何一項(xiàng)中的方法，其中第二階段ii)包括加入一種或多種促進(jìn)Thl型T淋巴細(xì)胞發(fā)育的物質(zhì)。49.權(quán)利要求48中的方法，其中一種或多種促進(jìn)Thl型T淋巴細(xì)胞發(fā)育的物質(zhì)是對(duì)IL-7、IL-12、IL-15和/或IL-21受體具有激動(dòng)活性的物質(zhì)。50.權(quán)利要求49中的方法，其中一種或多種物質(zhì)選自IL-7、IL-12、IL-15和IL-21。51.權(quán)利要求48-50任何一項(xiàng)中的方法，其中一種或多種促進(jìn)Thl型T淋巴細(xì)胞發(fā)育的物質(zhì)，例如對(duì)IL-7、IL-12、IL-15和/或IL-21受體具有激動(dòng)活性的物質(zhì)，在IFN-7的水平與第二階段ii)起動(dòng)時(shí)IFN-7的水平相比增加時(shí)被加入。52.權(quán)利要求51中的方法，其中IFN-7的水平增加被定義為與第二階段ii)起動(dòng)時(shí)IFN-7的水平相比，IFN-7的水平增加了至少1倍，例如增加了至少2倍、至少3倍、至少4倍。53.權(quán)利要求48-52任何一項(xiàng)中的方法，其中一種或多種促進(jìn)Thl型T淋巴細(xì)胞發(fā)育的物質(zhì)，例如對(duì)IL-12、IL-15和/或IL-21受體具有激動(dòng)活性的物質(zhì)，在CD25和/或CD69下調(diào)時(shí)被加入。54.權(quán)利要求48-53任何一項(xiàng)中的方法，其中加入的一種或多種促進(jìn)Thl型T淋巴細(xì)胞發(fā)育的物質(zhì)，例如對(duì)IL-7、IL-12、IL-15和/或IL-21受體具有激動(dòng)活性的物質(zhì)中的每種的濃度，從每毫升培養(yǎng)基大約150IU到每毫升培養(yǎng)基大約300IU，例如每毫升培養(yǎng)基250IU。55.權(quán)利要求48-54任何一項(xiàng)中的方法，其中一種或多種促進(jìn)Thl型T淋巴細(xì)胞發(fā)育的物質(zhì)，例如對(duì)IL-12、IL-15和/或IL-21受體具有激動(dòng)活性的物質(zhì)，在第二階段ii)起動(dòng)后的第5天到(含)第8天被加入，例如在第5天、第6天、第7天或第8天。56.前述權(quán)利要求任何一項(xiàng)中的方法，用于制備CD4+輔助性T淋巴細(xì)胞。57.前述權(quán)利要求任何一項(xiàng)中的方法，用于制備效應(yīng)性T淋巴細(xì)胞。58.前述權(quán)利要求任何一項(xiàng)中的方法，用于制備記憶性T淋巴細(xì)胞。59.前述權(quán)利要求任何一項(xiàng)中的方法，用于制備Thl型T淋巴細(xì)胞。60.前述權(quán)利要求任何一項(xiàng)中的方法，還包括在第一階段i)和第二階段ii)期間連續(xù)地監(jiān)控T淋巴細(xì)胞上細(xì)胞表面標(biāo)記例如CD25和/或CD69的表達(dá)。61.權(quán)利要求60中的方法，其中T淋巴細(xì)胞在第二階段ii)中T淋巴細(xì)胞上的CD25下調(diào)時(shí)被收獲。62.權(quán)利要求61中的方法，其中在T淋巴細(xì)胞上的CD25下調(diào)時(shí)，T淋巴細(xì)胞進(jìn)行至少一輪額外的階段ii)。63.權(quán)利要求61或62中的方法，其中下調(diào)被定義為5%以下的CD4陽(yáng)性T淋巴細(xì)胞種群表達(dá)CD25。64.前述權(quán)利要求任何一項(xiàng)中的方法，其中腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞在第二階段ii)起動(dòng)后的第10天到(含)第14天被收獲。65.權(quán)利要求64中的方法，其中腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞在收獲后被純化。66.前述權(quán)利要求任何一項(xiàng)中的方法，還包括將在第二階段ii)中獲得的腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞進(jìn)行冷凍的步驟。67.前述權(quán)利要求任何一項(xiàng)中的方法，其中T淋巴細(xì)胞來(lái)源于引流原發(fā)性腫瘤和/或轉(zhuǎn)移瘤的淋巴結(jié)，或它們來(lái)源于血液。68.前述權(quán)利要求任何一項(xiàng)中的方法，其中在步驟iv)中腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞被靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)或鞘內(nèi)、腹膜內(nèi)施用。69.前述權(quán)利要求任何一項(xiàng)中的方法，其中施用的腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞的量為至少1千萬(wàn)，例如至少2千萬(wàn)、至少3千萬(wàn)、至少4千萬(wàn)、至少5千萬(wàn)、至少6千萬(wàn)、至少7千萬(wàn)、或至少8千萬(wàn)。70.前述權(quán)利要求任何一項(xiàng)中的方法，其中施用的腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞是效應(yīng)性T淋巴細(xì)胞和記憶性T淋巴細(xì)胞的組合。71.權(quán)利要求70中的方法，其中效應(yīng)性T淋巴細(xì)胞的百分率從大約10%到大約65%，例如從大約20%到大約50%或從大約30%到大約40%。72.前述權(quán)利要求任何一項(xiàng)中的方法，其中腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞是自體的。73.前述權(quán)利要求任何一項(xiàng)中的方法，其中腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞是非自體的。T細(xì)胞74.按照權(quán)利要求1-73任何一項(xiàng)中定義的方法制備的腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞。75.權(quán)利要求74中的腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞，其是CD4+T淋巴細(xì)胞。76.權(quán)利要求74或75中的腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞，其是效應(yīng)性T淋巴細(xì)胞。77.權(quán)利要求74-76任何一項(xiàng)中的腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞，其是記憶性T淋巴細(xì)胞。78.權(quán)利要求74-77任何一項(xiàng)中的腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞，其是Thl型T淋巴細(xì)胞。79.權(quán)利要求74-78任何一項(xiàng)中的腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞的應(yīng)用，用于制備治療播散性癌癥的藥物。試劑盒80.用于權(quán)利要求1-73任何一項(xiàng)中的方法的試劑盒，所述試劑盒包含培養(yǎng)T淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)基。81.權(quán)利要求80中的試劑盒，還包含一種或多種刺激、活化和引導(dǎo)腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞的物質(zhì)。82.權(quán)利要求80或81中的試劑盒，其中培養(yǎng)基是無(wú)血清培養(yǎng)基，例如AIMV、RPMI1640、DMEM或MEM。83.權(quán)利要求80-82任何一項(xiàng)中的試劑盒，其中一種或多種用于刺激、活化和引導(dǎo)腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞的物質(zhì)選自腫瘤來(lái)源的抗原、對(duì)IL-2受體具有激動(dòng)活性的物質(zhì)、能夠上調(diào)T淋巴細(xì)胞上的IL-12R的物質(zhì)、能夠?qū)筎h2型T淋巴細(xì)胞發(fā)育的物質(zhì)和促進(jìn)Thl型T淋巴細(xì)胞發(fā)育的物質(zhì)。84.權(quán)利要求80-83任何一項(xiàng)中的試劑盒，其中一種或多種用于刺激、活化和引導(dǎo)腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞的物質(zhì)選自IL-2、a-干擾素、抗IL-4抗體、抗IL隱5抗體、抗IL-10抗體、IL-7、IL-12、IL-15和IL-21。85.權(quán)利要求80-84任何一項(xiàng)中的試劑盒，含有適合靜脈內(nèi)給藥的藥物組合物。86.用于檢測(cè)轉(zhuǎn)移哨淋巴結(jié)的試劑盒，所述試劑盒包含注射器和淋巴結(jié)定位劑。87.用于檢測(cè)轉(zhuǎn)移哨淋巴結(jié)的試劑盒，所述試劑盒包含預(yù)先裝有淋巴結(jié)定位劑的注射器。88.權(quán)利要求80-87任何一項(xiàng)中的試劑盒，還包括使用說(shuō)明書(shū)。89.權(quán)利要求88中的試劑盒，其中所述說(shuō)明書(shū)是計(jì)算機(jī)軟件的形式。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了通過(guò)施用可以從一個(gè)或多個(gè)引流轉(zhuǎn)移腫瘤的轉(zhuǎn)移瘤引流淋巴結(jié)(轉(zhuǎn)移哨淋巴結(jié))獲得的被增殖的腫瘤反應(yīng)性CD4+輔助性細(xì)胞和/或CD8+T淋巴細(xì)胞，來(lái)治療患有播散性癌癥的患者的免疫治療方法。該方法包括在患者中鑒定一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)移哨淋巴結(jié)、切除一個(gè)或多個(gè)淋巴結(jié)和任選全部或部分的轉(zhuǎn)移瘤、從所述淋巴結(jié)中分離轉(zhuǎn)移腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞、體外增殖該轉(zhuǎn)移瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞、以及將這樣獲得的T淋巴細(xì)胞施用于患者，其中T淋巴細(xì)胞是CD4+輔助性細(xì)胞和/或CD8+T淋巴細(xì)胞。文檔編號(hào)C12N5/078GK101351546SQ200680048763公開(kāi)日2009年1月21日申請(qǐng)日期2006年12月20日優(yōu)先權(quán)日2005年12月21日發(fā)明者奧拉·溫克維斯特,馬格納斯·索恩申請(qǐng)人:森托科隆股份公司