專利名稱：用可逆2’-修飾的核苷酸進(jìn)行的序列測定和基因分型的制作方法
與相關(guān)申請交互參考本申請要求美國臨時(shí)專利申請序列號60/752827(2005年12月21日提交)、美國臨時(shí)專利申請序列號60/844041(2006年9月11日提交)的權(quán)益，上述所有公開申請?jiān)诖俗鳛閰⒖急煌暾?，用于所有目的?br> 背景技術(shù)：

目前的DNA序列分析技術(shù)已經(jīng)發(fā)展到可以有效地進(jìn)行大規(guī)模序列測定。然而，當(dāng)應(yīng)用于期望限制成本并保證速度的高通量篩選時(shí)，現(xiàn)有的技術(shù)顯示出它的局限性。例如，經(jīng)典的桑格雙脫氧測序法利用在凝膠上分離DNA片段的步驟。該步驟不適于非常大規(guī)模的多路測序或者說是平行測序，并且在電泳過程中還存在條帶壓縮的問題。也開發(fā)了其它一些增加測序速度并降低測序成本的方法，包括雜交測序法(見，例如，Bains和Smith，J.Theoret.Biol.135303-307，1988；Drmanac等.Genomics 4114-128，1989；Khrapko等.FEBS Lett.256118-122，1989；Southern，WO10977，1989)；基于連接和酶切的平行標(biāo)記測序法(例如，Brenner等.Proc.Natl.Acad.Sci.971665-1670，2000)；可逆鏈終止核苷酸測序法(見，例如，美國專利Nos.5,902,723和5,547,83；Canard和Arzumanov，Gene 111(1994)；和Dyatkina Arzumanov，Nucleic Acids Symp Ser 18117(1987))；DNA連接酶可逆鏈終止法(見，例如，美國專利.5,403,708)；時(shí)間分辨測序法(見，例如，Johnson等，Anal.Biochem.136192(1984))；以及焦磷酸測序法(例如，Ronaghi等.Anal.Biochem 24284-89，1996)。

焦磷酸測序法基于通過合成進(jìn)行序列測定的概念(例如，美國專利4,863,849)。該技術(shù)可進(jìn)行大規(guī)模的平行序列測定。例如，用自動(dòng)化平臺可以同時(shí)實(shí)現(xiàn)成千上萬個(gè)測定序列的反應(yīng)。通過合成測序與經(jīng)典的雙脫氧序列測定法的不同之處在于其可以實(shí)時(shí)監(jiān)測延伸的核酸鏈上摻入的堿基，而不是同時(shí)合成許多序列然后在之后的步驟中測定這些序列。雖然該方法對于單個(gè)的序列測定反應(yīng)較為緩慢，但當(dāng)數(shù)十萬至數(shù)百萬個(gè)反應(yīng)同時(shí)進(jìn)行時(shí)，該方法可在每一循環(huán)中產(chǎn)生大量的序列信息。盡管焦磷酸測序法有上述優(yōu)點(diǎn)，但也仍然存在一些缺陷。例如，由于多個(gè)相同分子的摻入會(huì)產(chǎn)生非線性信號相應(yīng)，所以用該方法確定同聚體區(qū)域中所摻入的核苷酸數(shù)量還有一定的困難。其他未使用可逆終止子的基于固相陣列合成的測序方法均有相似的缺陷。

最近報(bào)道了一種以3′-O-烯丙基修飾的核苷酸類似物為化學(xué)可逆終止子的序列測定方法(Ruparel等.，Proc.Natl.Acad.Sci.1025932-5937，2005)。在該方法中，核苷酸類似物包括一個(gè)加帽在3′-OH上的烯丙基部分以及一個(gè)通過可光裂解的接頭連接到尿嘧啶5′端的熒光基團(tuán)。這種核苷酸是DNA聚合酶的底物。待核苷酸摻入到DNA鏈上并將接頭光裂解后，用Pd-催化反應(yīng)脫除烯丙基，再次起始聚合酶反應(yīng)。因此，這些類似物在合成反應(yīng)的測序中可作為可逆終止子。對其它可逆終止子的描述見以下專利例如，美國專利5,872,244、6,232,465、6,214,987、5,808,045、5,763,594和5,302,509和美國專利公開申請書編號20030215862。3’-OH封閉型可逆終止子具有一些缺陷包括弱摻入、去封閉效率低以及去封閉條件繁瑣等。一種理想的基于可逆終止子的高通量測序方法可顯示出近乎完美的摻入、鏈終止、高效去封閉以最小化相反應(yīng)中的出現(xiàn)的問題和背景信號。

最近的研究表明，2′-修飾的(例如，2′-磷酸)核苷5′三磷酸在單個(gè)堿基摻入時(shí)可作為某些核酸聚合酶的底物(見，例如，美國專利公開申請書2005/00373898和2005/0037991)。本發(fā)明提供了一種在可逆終止測序反應(yīng)中利用2′-終止核苷酸進(jìn)行序列測定以及基因分型的新方法。
發(fā)明概述
本發(fā)明提供了，例如，一種將2′-修飾核苷酸作為可逆終止子測定核酸序列的方法。在某些實(shí)施方案中，將2′-修飾的可逆終止核苷酸摻入到一條正在延伸的核酸鏈中可得到可檢測的信號。檢測可檢測信號的示例方法包括，例如，通過可產(chǎn)生發(fā)光信號的酶聯(lián)放大檢測釋放的焦磷酸基、檢測摻入核苷酸的熒光標(biāo)記(對于多重添加可裂解)、檢測末端磷酸標(biāo)記的核苷酸、多聚磷酸/磷酸酶法檢測等。用脫除修飾或封閉基團(tuán)的活性物質(zhì)處理摻入核苷酸可使核酸鏈進(jìn)一步延伸。本發(fā)明還包括，例如，含有確定序列所需組分的試劑盒，例如，用于序列測定、基因分型等；使用本發(fā)明的可逆終止法；可進(jìn)行序列分析系統(tǒng)。

一方面，本發(fā)明提供了一種測定至少部分模板核酸序列的方法，該方法包括 (a)將至至少一種模板核酸與少一種聚合酶、至少一種2′-修飾的可逆終止核苷酸(例如，2′-一磷酸-3′-羥基核苷酸，等等)、至少一條與模板核酸至少一個(gè)亞序列互補(bǔ)的引物核酸溫育，其中聚合酶延伸引物核酸以產(chǎn)生至少一個(gè)引物延伸產(chǎn)物，其將2′-修飾的可逆終止核苷酸摻入引物延伸產(chǎn)物3′-末端； (b)脫除引物延伸產(chǎn)物3′-末端的2′修飾的可逆終止核苷酸2′位置上的封閉基(例如，磷酸基或其類似物)； (c)在(b)之前和/或過程中確定引物延伸產(chǎn)物上的2′-修飾的可逆終止子核苷酸，從已確定的2′-修飾的可逆終止子核苷酸可確定模板核酸的至少部分堿基序列，因此至少測定了部分模板核酸的序列。在某些實(shí)施方案中，(b)包括將引物延伸產(chǎn)物與一種可脫除2′-位置封閉基(例如，磷酸基等)的活性物質(zhì)溫育。該方法通常包括重復(fù)步驟(a)-(c)一次或多次。

在某些實(shí)施方案中，2′-位置的修飾為磷酸基或者是被修飾了的磷酸基，該修飾基團(tuán)可被除去，例如，用酶學(xué)方法脫除(例如磷酸酶、核酸外切酶III、核酸外切酶IV、多核苷酸激酶、磷酸二酯酶、或者磷酸二酯酶和磷酸酶聯(lián)用)。在使用磷酸二酯酶(例如蛇毒二酯酶)的某些實(shí)施方案中，被修飾的終止核苷酸含有，例如，α-硫代磷酸酯修飾。

在典型的實(shí)施方案中，2′修飾的可逆終止核苷酸選自含有

圖1A-1H所示結(jié)構(gòu)的基團(tuán)。

在某些實(shí)施方案中，用至少一個(gè)標(biāo)記部分標(biāo)記2′修飾的可逆終止核苷酸，例如，一種熒光染料，一個(gè)發(fā)光分子或者一種放射性同位素。在某些實(shí)施方案中，通過一個(gè)可裂解的接頭將標(biāo)記部分與2′修飾的可逆終止核苷酸的堿基連接，該方法進(jìn)一步包括斷裂連接的步驟。標(biāo)記可以與堿基的不同位置連接，例如，2′修飾的可逆終止核苷酸的糖殘基或2′修飾位點(diǎn)的磷酸基，或者，多聚磷酸部分的終止磷酸基。在某些實(shí)施方案中，該方法所使用的2′修飾的可逆終止核苷酸是未標(biāo)記的。

在某些實(shí)施方案中，2′修飾的可逆終止核苷酸與包括供體和受體的兩個(gè)標(biāo)記部分連接，例如熒光報(bào)告分子和猝滅劑對。在某些實(shí)施方案中，供體和受體都可進(jìn)行熒光共振能量轉(zhuǎn)移。

在本發(fā)明包括的某些實(shí)施方案中，猝滅部分與2′-修飾的可逆終止核苷酸的堿基相連接，報(bào)告部分與磷酸基相連接，前提是磷酸基不是2′-修飾的可逆終止核苷酸的α磷酸基。例如，磷酸基可以是多聚磷酸酯部分的末端δ或γ磷酸基、β磷酸基或在2′-可逆終止核苷酸2′位的磷酸基。

在某些實(shí)施方案中，一個(gè)標(biāo)記部分與2′-修飾的可逆終止核苷酸2′位的磷酸基相連接，第二個(gè)標(biāo)記部分與第二個(gè)磷酸基相連，例如，γ磷酸基等。在某些實(shí)施方案中，這些標(biāo)記部分包括，例如，報(bào)告分子部分和猝滅部分。

本發(fā)明方法的實(shí)施方案中反應(yīng)混合物包含四種不同的2′-修飾的可逆終止核苷酸，每種核苷酸具有不同的堿基并用不同的標(biāo)記部分標(biāo)記，這樣，對于每種核苷酸會(huì)產(chǎn)生不同的信號。在某些實(shí)施方案中，本方法所述2′-修飾的可逆終止核苷酸是未標(biāo)記的。替代實(shí)施方案包括一個(gè)檢測步驟，其包括檢測由摻入的2′-修飾的可逆終止核苷酸產(chǎn)生的焦磷酸。

另一方面，本發(fā)明包括測定序列的試劑盒，例如，用于重復(fù)序列測定，從頭序列測定，基因分型等，其中包括至少一個(gè)2′-修飾的可逆終止核苷酸，用于脫除2′-修飾的可逆終止核苷酸2′位修飾的試劑。也就是說，試劑盒包含的試劑可選自磷酸酶、核酸外切酶、磷酸二酯酶、核酸內(nèi)切酶IV以及多核苷酸激酶。該試劑盒也包含聚合酶。

在某些實(shí)施方案中，試劑盒中的2′-修飾的可逆終止核苷酸都與標(biāo)記相連。該試劑盒可任選地包括至少一種能夠延伸的核苷酸。

本發(fā)明也提供了一種基因分型的方法，包括 a)將模板核酸在反應(yīng)混合物中溫育，該混合物包括引物、聚合酶以及2′-修飾的可逆終止核苷酸，其中被修飾的可逆終止核苷酸包括四種天然堿基之一或其類似物，還包括2′位的修飾，其可在引物與模板核酸退火并被反應(yīng)中的聚合酶延伸形成延伸產(chǎn)物的條件下終止合成； b)確定是否存在可指示2′-修飾的可逆終止核苷酸已經(jīng)摻入到延伸產(chǎn)物中的信號， c)如果不存在該信號，用不同的2′-修飾的可逆終止核苷酸重復(fù)步驟a)和b)，該不同的2′-修飾的可逆終止核苷酸包括不同的四種天然堿基之一或其類似物， d)將一種能夠脫除可逆終止核苷酸2′端修飾的活性物質(zhì)與延伸產(chǎn)物溫育， e)多次重復(fù)步驟a)到步驟b)，以測定模板核酸的部分序列， f)將模板核酸的部分序列與多態(tài)位點(diǎn)的已知序列相比對。

另一方面，本發(fā)明提供了一個(gè)測定核苷酸序列的系統(tǒng)，包括一臺包含反應(yīng)池的熱循環(huán)儀，其中模板核酸與反應(yīng)混合物溫育，該反應(yīng)液包括引物、聚合酶以及2′-修飾的可逆終止核苷酸，所述被修飾的可逆終止核苷酸包括四種天然堿基之一或其類似物，還包括可終止合成2′位修飾，熱循環(huán)儀可有效地創(chuàng)造引物與模板核酸退火并被反應(yīng)中的聚合酶延伸形成延伸產(chǎn)物的條件；所述反應(yīng)池具有加入和移出試劑的入口和出口；以及一個(gè)檢測器，該檢測器能有效的檢測可知識2′-修飾的可逆終止核苷酸已摻入到延伸產(chǎn)物中的信號。

在進(jìn)一步方面，本發(fā)明提供了一種被標(biāo)記的2′-修飾的可逆終止核苷酸，選自
和
在某些實(shí)施方案中，這里所指的2′-修飾的可逆終止核苷酸是未標(biāo)記的。

本發(fā)明也提供了測定至少部分模板核酸序列的方法，包括 a)在引物與模板核酸退火并被反應(yīng)中的聚合酶延伸形成延伸產(chǎn)物的條件下，將模板核酸與反應(yīng)混合物溫育，該混合物包括引物、聚合酶以及2′-修飾的可逆終止核苷酸， b)確定可指示2′-修飾的可逆終止核苷酸已經(jīng)摻入至延伸產(chǎn)物中的信號， c)將延伸產(chǎn)物與可脫除可逆終止核苷酸2’位修飾的活性物質(zhì)溫育， d)重復(fù)步驟a)到c)數(shù)次以測定至少部分模板核酸的序列。

在某些實(shí)施方案中，步驟(a)是在單個(gè)反應(yīng)混合物中包含許多不同的2′-修飾的可逆終止核苷酸且每種不同的2′-修飾的可逆終止核苷酸都包含不同堿基的條件下進(jìn)行。例如，每種不同的2′-修飾的可逆終止核苷酸都可被連續(xù)摻入直至檢測到2′-修飾的可逆終止核苷酸摻入延伸產(chǎn)物的信號?；蛘?，在用不同的標(biāo)記部分標(biāo)記不同的2′-修飾的可逆終止核苷酸的實(shí)施方案中每種不同的2′-修飾的可逆終止核苷酸可被同時(shí)摻入。

另一方面，本發(fā)明提供了一種測定至少部分模板核酸序列的方法，包括 a)將模板核酸在反應(yīng)混合物中溫育，該混合物包括引物、聚合酶以及2′-修飾的可逆終止核苷酸，其中被修飾的可逆終止核苷酸包括四種天然堿基之一或其類似物，還包括2′位的修飾，其可在引物與模板核酸退火并被反應(yīng)中的聚合酶延伸形成延伸產(chǎn)物的條件下終止合成； b)確定是否存在可指示2′-修飾的可逆終止核苷酸已經(jīng)摻入到延伸產(chǎn)物中的信號， c)如果不存在該信號，用不同的2′-修飾的可逆終止核苷酸重復(fù)步驟a)和b)，該不同的2′-修飾的可逆終止核苷酸包括不同的四種天然堿基之一或其類似物， d)將一種能夠脫除可逆終止核苷酸2′端修飾的活性物質(zhì)與延伸產(chǎn)物溫育， e)多次重復(fù)步驟a)到步驟D)，以測定模板核酸的部分序列， 圖例簡述
圖1A-1H顯示了2′-修飾的可逆終止子的實(shí)例。

圖2顯示了根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案經(jīng)過四輪延伸和去封閉得到的FAM染料-標(biāo)記的引物延伸產(chǎn)物。

圖3顯示了根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案用染料-標(biāo)記2′-修飾的可逆終止核苷酸的循環(huán)引物延伸。
發(fā)明詳述
本發(fā)明提供了，例如，一種用修飾的核苷酸測定序列的方法，其具有可終止核酸鏈延伸的2′OH位修飾。通常2′OH位修飾在之后的步驟中被脫除，新添加的核苷酸可延伸，使核酸鏈進(jìn)一步延伸。修飾的2′-終止核苷酸的摻入最終可形成可被直接或間接檢測的信號。檢測信號可在終止子摻入時(shí)或移除修飾時(shí)產(chǎn)生。該方法可用于，例如，高通量序列測定法以測定所需核酸序列或用于例如基因分型。
定義
術(shù)語“2′-修飾的可逆終止核苷酸”(有時(shí)也稱做“2′-修飾的可逆終止子”)是指核苷酸中糖部分的2′-位含有一個(gè)可脫除的封閉基的核苷酸類似物?！翱擅摮姆忾]基”是指2′-修飾的可逆終止核苷酸摻入后可至少部分終止核酸延伸的化學(xué)基團(tuán)或部分，但該基團(tuán)可被脫除以恢復(fù)核酸分子的延伸。只要封閉基團(tuán)的存在可終止延伸，封閉基的性質(zhì)對本發(fā)明沒有決定性的作用，但是封閉基斷裂后延伸能夠恢復(fù)。示例性可脫除封閉基為磷酸基。本發(fā)明也描述了其它的代表性封閉基。示例性2′-終止核苷酸包括2′-一磷酸-3′-羥基-5′-三磷酸核苷以及2′-一磷酸-3′-羥基-5′-二磷酸核苷。本發(fā)明所使用的2′-終止核苷酸在例如美國專利公開申請書20050037991和20050037398中都有描述。

脫除封閉基的具體方法當(dāng)然取決于可脫除保護(hù)堿基的性質(zhì)，這一點(diǎn)對本發(fā)明來說也不是決定性的。通?？赏ㄟ^酶的、化學(xué)的或者光化學(xué)的方法脫除封閉基。

“核酸”是指核苷酸(例如，核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸、2′-終止核苷酸、雙脫氧核苷酸等)以及由這些核苷酸以線性或支鏈的形式通過共價(jià)鍵連接在一起的聚合物(例如，包括脫氧核糖核酸(DNAs)、核糖核酸(RNAs)、DNA-RNA雜合體、寡核苷酸、多聚核苷酸、基因、cDNAs、適體、反義核酸、干擾RNAs(RNAi)、分子信標(biāo)、核酸探針、肽核酸(PNAs)、PNA-DNA結(jié)合物、PNA-RNA結(jié)合物等)。典型的核苷酸是單鏈或雙鏈的，通常包括磷酸二酯鍵，盡管在一些情況下，正如這里所提到的，核苷酸類似物可能有其他的主鏈結(jié)構(gòu)，包括但不限于磷酰胺(Beaucage等.(1993)Tetrahedron49(10)1925)及其參考文獻(xiàn)；Letsinger(1970)J.Org.Chem.353800；Sprinzl等.(1977)Eur.J.Biochem.81579；Letsinger等.(1986)Nucl.Acids Res.143487；Sawai等.(1984)Chem.Lett.805；Letsinger等.(1988)J.Am.Chem.Soc.1104470；和Pauwels等.(1986)ChemicaScripta 261419)、硫代磷酸酯(Mag等.(1991)Nucleic Acids Res.191437；和美國專利5,644,048)、二硫代磷酸酯(Briu等.(1989)J.Am.Chem.Soc.1112321)、膦酸甲酯連接鍵(見Eckstein，Oligonucleotides和AnaloguesA Practical Approach，Oxford University Press(1992))、肽核酸主鏈及其連接鍵(見，Egholm(1992)J.Am.Chem.Soc.1141895；Meier等.(1992)Chem.Int.Ed.Engl.311008；Nielsen(1993)Nature 365566；Carlsson et al.(1996)Nature 380207)其參考文獻(xiàn)均并于本文作為參考。其它核酸類似物包括帶正電荷的主鏈(Denpcy等.(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 926097)、非離子主鏈(美國專利5,386,023、5,637,684、5,602,240、5,216,141和4,469,863；Angew(1991)Chem.Intl.Ed.English 30423；Letsinger等.(1988)J.Am.Chem.Soc.1104470；Letsinger等.(1994)Nucleoside&Nucleotide131597；第二和第三章，ASC學(xué)術(shù)討論會(huì)叢刊580，″反義研究中的碳水化合物修飾″，Ed.Y.S.Sanghvi和P.Dan Cook；Mesmaeker等.(1994)Bioorganic&Medicinal Chem.Lett.4395；Jeffs等.(1994)J.Biomolecular NMR 3417；Tetrahedron Lett.37743(1996))及非核糖主鏈，其包括在美國專利5,235033和5,034506以及ASC學(xué)術(shù)討論會(huì)叢刊580的第六和第七章、反義研究中的碳水化合物修飾(Ed.Y.S.Sanghvi和P.Dan Cook)所涉及到的結(jié)構(gòu)，其中的參考文獻(xiàn)均并于本文作為參考。包括一種或多種碳環(huán)糖的核酸包括在核酸的定義中(見Jenkins等.(1995)Chem.Soc.Rev.pp169-176，其以參考文獻(xiàn)形式并于本文)。本文也描述了數(shù)種核酸類似物，例如Rawls，C&E News Jun.2，1997，第35頁，其以參考文獻(xiàn)的形式并于本文。

除了核酸中這些典型的天然雜環(huán)堿基外(例如，腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和尿嘧啶)，核酸類似物也包括含有非天然雜環(huán)堿基的核酸，其中許多在本文中被描述或涉及。尤其是許多非天然堿基被進(jìn)一步描述于例如Seela等，(1991)Helv.Chim.Acta741790，Grein等(1994)Bioorg.Med.Chem.Lett.4971-976和Seela等.(1999)Helv.Chim.Acta 821640，均以參考文獻(xiàn)的形式并于本文。具體而言，可任選包括在核苷酸中作為解鏈溫度(Tm)調(diào)節(jié)子的一些堿基。例如，其中一些包括7-脫氮嘌呤(例如，7-脫氮鳥嘌呤、7-脫氮腺嘌呤等等)、吡唑[3，4-d]嘧啶、丙炔基-dN(例如，丙炔基-dU、丙炔基-dC等)等?？蓞⒖糞eela在1999年11月23日公開的美國專利“SYNTHESIS OF 7-DEAZA-2′-DEOXYGUANOSINENUCLEOTIDES，”專利號5,990,303，該文章以參考文獻(xiàn)的形式并于本文。其他代表性雜環(huán)堿基包括，例如，次黃嘌呤、次黃嘌呤核苷、黃嘌呤、2-氨嘌呤的8-氮雜衍生物、2，6-雙氨嘌呤、2-氨-6氯嘌呤、次黃嘌呤、次黃嘌呤核苷和黃嘌呤；7-脫氮-8-氮雜腺嘌呤衍生物、鳥嘌呤、2-氨嘌呤、2，6-二氨嘌呤、2-氨-6-氯嘌呤、次黃嘌呤、次黃嘌呤核苷和黃嘌呤；6-氮雜胞嘧啶；5-氟胞嘧啶；5-氯胞嘧啶；5-碘胞嘧啶；5-溴胞嘧啶；5-甲基胞嘧啶；5-丙炔胞嘧啶；5-溴乙烯尿嘧啶；5-氟尿嘧啶；5-氯尿嘧啶；5-碘尿嘧啶；5-溴尿嘧啶；5-三氟甲基尿嘧啶；5-甲氧甲基尿嘧啶；5-乙炔基尿嘧啶；5-丙炔尿嘧啶等。在某些情況下，術(shù)語“堿基”也包括環(huán)外胺被封閉基修飾的保護(hù)堿基。

“核苷”指一個(gè)核酸組成部分，其包含與一個(gè)糖部分(例如，核糖等)、一個(gè)糖部分衍生物或一個(gè)糖部分的功能等價(jià)物(例如，類似物，如碳環(huán))由共價(jià)鍵連接的堿基或堿性基團(tuán)(例如，包含至少一個(gè)同素環(huán)，至少一個(gè)雜環(huán)，至少一個(gè)芳基，和/或類似基團(tuán))。例如，當(dāng)核苷包括糖部分時(shí)，堿基一般與該糖部分的1′位相連。如上所述，堿基可以是天然堿基(例如，嘌呤堿，如腺嘌呤(A)或鳥嘌呤(G)，嘧啶堿，如胸腺嘧啶(T)，胞嘧啶(C)，或者尿嘧啶(U))或非天然堿基(例如，7-脫氮嘌呤堿、吡唑[3，4-d]嘧啶堿、丙炔基-dN堿等。)。示例性核苷一般包括核糖核苷、脫氧核糖核苷、雙脫氧核苷、碳環(huán)核苷等。

“核苷酸”指核苷酯，例如，核苷的磷酸酯。例如，一種核苷酸可包括1、2、3個(gè)或更多個(gè)與核苷糖部分的5′位共價(jià)連接的磷酸基(例如，核苷多磷酸酯)。

“寡核苷酸”指包括至少兩個(gè)，一般多于三個(gè)，更常見是多于十個(gè)核苷酸的核酸。寡核苷酸的精確大小取決于各種因素，包括寡核苷酸的最終功能或用途?？梢赃x擇任何適合的方法制備寡核苷酸，其中包括，例如，克隆和限制性消化適當(dāng)?shù)男蛄?，或者，通過化學(xué)方法直接合成，例如，Narang等(1979)Meth.Enzymol.6890-99中描述的磷酸三酯法、Brown等(1979)Meth.Enzymol.68109-151中描述的磷酸二酯法、Beaucage等(1981)Tetrahedron Lett.221859-1862中描述的二乙基亞磷酰胺法、Matteucci等(1981)J.Am.Chem.Soc.1033185-3191中描述的三酯法、自動(dòng)化合成法或美國專利No.4,458,066中描述的固體載體法，及該領(lǐng)域中其它已知方法，均以參考文獻(xiàn)的形式并于本文。

″引物″通常為一種能與模板核酸雜交并允許鏈延伸或延長的核酸，其方式是通過使用，例如，可摻入核苷酸的生物催化劑，如適當(dāng)反應(yīng)條件下的一種熱穩(wěn)定聚合酶。典型的引物核酸是天然或者合成的寡核苷酸(例如，單鏈寡脫氧核苷酸等)。雖然可以任意使用其它的引物核酸的長度，但它們的范圍通常在15到35個(gè)核苷酸之間。通常用較低的溫度使短引物核酸與模板核酸形成穩(wěn)定的雜交復(fù)合物。至少與模板核酸部分序列互補(bǔ)的引物核酸足以與模板核酸雜交使延伸發(fā)生。如果需要的話，可以通過引入由，例如，分光鏡的、光化學(xué)的、生物化學(xué)的、免疫化學(xué)的或者化學(xué)技術(shù)可檢測的標(biāo)記將引物核酸標(biāo)記。具體而言，可用的標(biāo)記包括放射性同位素、熒光染料、高電子密度試劑、酶(通常用于ELISAs中)、生物素、或半抗原以及抗血清蛋白或單克隆抗體。上述許多或其它標(biāo)記在本文中被進(jìn)一步描述和/或其它為本領(lǐng)域已知的標(biāo)記。此外，引物核酸可以很容易地以模板依賴的形式充當(dāng)核苷酸摻入的生物催化劑底物。

模板核酸指可與其引物核酸雜交并被延伸的核酸。因此，模板核酸包括至少與引物核酸部分互補(bǔ)的序列。實(shí)質(zhì)上模板核酸可衍生自任何來源。具體而言，模板核酸可任選衍生于或純化自，例如，培養(yǎng)的微生物，未培養(yǎng)的微生物，復(fù)雜生物學(xué)混合物，組織，血清，混合血清或組織，多物種聚生(multispecies consortia)，古代的、石化的或者其他無生命的生物學(xué)遺體，環(huán)境隔離群，土壤，地下水，廢棄設(shè)備，深水環(huán)境等等。更具體而言，模板核酸可任選包括或衍生于，例如，單個(gè)的cDNA分子，克隆的cDNAs組，cDNA文庫，提取的RNAs，天然RNAs，體外轉(zhuǎn)錄的RNAs，已被特征性描述或未被特征性描述的基因組DNAs，克隆的基因組DNAs，基因組DNA文庫，酶切后的DNAs或RNAs片段，化學(xué)方法處理后的DNAs或RNAs片段，物理方法處理后的DNAs或RNAs片段等。也可用該領(lǐng)域的已知技術(shù)化學(xué)合成模板核酸。此外，模板核酸可任選至少與部分基因?qū)?yīng)或互補(bǔ)。這里所使用的“基因”是指任何具有生物學(xué)功能的DNA片段。因此，基因包括編碼序列并任選包括表達(dá)基因所需的調(diào)控序列?；蛞策x擇性地包括非表達(dá)DNA片段，例如，其它蛋白的識別序列。

“可延伸的核苷酸”是指至少一種其它核苷酸可摻入或與之共價(jià)結(jié)合的核苷酸，例如，當(dāng)可延伸的核苷酸摻入核苷聚合體中時(shí)由核苷酸摻入生物催化劑催化的反應(yīng)?？裳由斓暮塑账岬膶?shí)例包括脫氧核糖核苷酸和核糖核苷酸及其帶有例如標(biāo)記的衍生物?？裳由旌塑账嵬ǔＪ峭ㄟ^在該可延伸核苷酸糖部分的3′位添加另一個(gè)核苷酸達(dá)到延伸的。

“非延伸的”或“終止子”核苷酸是一旦其摻入一種核酸可阻止或?qū)嵸|(zhì)上降低了該核酸的進(jìn)一步延伸速度的核苷酸，例如，通過至少一種核苷酸摻入生物催化劑。

“四磷酸核苷酸”是指含有四個(gè)磷酸基的核苷酸。典型的四磷酸核苷酸包括2′-磷酸-5′-三磷酸核苷和3′-磷酸-5′-三磷酸核苷。

“負(fù)電荷封閉基”是指至少含有一個(gè)負(fù)電荷的封閉基，該核苷酸可至少促成與其結(jié)合的該核苷酸的非延伸性質(zhì)，其方式是，例如，新?lián)饺牒塑账岬撵o電排斥。具體而言，本發(fā)明核苷酸的2′位的負(fù)電荷封閉基可任選包括磷酸基、羧基、或此處提到的在生理pH范圍內(nèi)至少能夠離子化為一個(gè)負(fù)電荷的其它基團(tuán)。在某些實(shí)施方案中，許多因素都可促成本發(fā)明核苷酸的非延伸性質(zhì)，例如，封閉基的電荷和封閉基的大小。

“全長序列”指至少含有與參比序列相同數(shù)目核苷酸的核酸序列或者至少與部分參比序列互補(bǔ)的核酸序列。在某些實(shí)施方案中，例如，被延伸的引物核酸與模板核酸或者其它參比序列的全長序列互補(bǔ)。

“亞序列”或“片段”是指核酸序列的一部分，其中這些序列或片段包括序列中連續(xù)的核苷酸。

“基因型”是指一個(gè)細(xì)胞或受試者，細(xì)胞簇或受試者群的全部或部分基因組成。例如，基因型包括存在于基因座上或分布于基因組中的個(gè)別突變和/或等位基因(例如，多態(tài)現(xiàn)象，如單核苷酸多態(tài)性(SNPs)等)。

“結(jié)合”或“連接”是指包括但不限于共價(jià)結(jié)合、離子鍵合、化學(xué)吸附、物理吸附及其組合的相互作用。

“接頭”或“間隔物”指將化合物或取代基共價(jià)或非共價(jià)(例如，離子結(jié)合等)結(jié)合到例如，固體載體、化合物或基團(tuán)等之上的化學(xué)部分。例如，接頭可任選地將標(biāo)記(例如，熒光染料、放射性同位素等)與2′-終止核苷酸等相連接。接頭是典型的雙功能化學(xué)部分，在某些實(shí)施方案中他們包括可裂解結(jié)合物，其可被例如，熱、酶、化學(xué)試劑、電磁輻射等斷裂以從例如，固體載體、另一個(gè)化合物等中釋放物質(zhì)或化合物。謹(jǐn)慎選擇的接頭能夠在與化合物的穩(wěn)定性和測定方法相容的適當(dāng)條件下裂解。一般來說，接頭沒有特定的生物活性，除了，例如，將化合物連接在一起或維持這些化合物之間的最小距離或其它空間關(guān)系。然而，可選擇接頭的組成以影響所連接化合物的性質(zhì)，例如，三維空間構(gòu)象、凈電荷、疏水性等。對接頭分子的更多描述可見Lyttle等.(1996)Nucleic Acids Res.24(14)2793，Shchepino等.(2001)Nucleosides，Nucleotides，&Nucleic Acids 20369，Doronina等.(2001)Nucleosides，Nucleotides，&Nucleic Acids 201007，Trawick等.(2001)Bioconjugate Chem.12900，Olejnik等.(1998)Methods inEnzymology 291135，Pljevaljcic等.(2003)J.Am.Chem.Soc.125(12)3486，Ward等申請的美國專利4,711,955，Stavrianopoulos等申請的美國專利4,707,352和Stavrianopoulos申請的美國專利4,707,440，這些文獻(xiàn)均以參考文獻(xiàn)的形式并于本文。

“標(biāo)記”是指與分子結(jié)合(共價(jià)或非共價(jià)連接)或可以被結(jié)合的部分，該部分能提供或具有提供分子信息的能力(例如，有關(guān)分子的描述信息或鑒定信息等)。示例性標(biāo)記包括熒光標(biāo)記、弱熒光標(biāo)記、非熒光標(biāo)記、比色標(biāo)記、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記、生物發(fā)光標(biāo)記、放射性標(biāo)記、多修飾基團(tuán)、抗原、抗體、生物素、半抗原和酶(包括過氧化酶、磷酸酶等)。具體而言，標(biāo)記也包括報(bào)告分子和猝滅劑部分。

“固體載體”是指可與一種化合部分(例如引物核酸、模板核酸等)衍生或結(jié)合的固體物質(zhì)。示例性固體載體包括平皿、小珠、微珠、纖維、觸須線、排管、雜交薄片、薄膜、單晶、陶瓷層、自裝配的單分子層等。

“在溶液中”是指至少反應(yīng)物不與固體載體結(jié)合的反應(yīng)條件。例如，本發(fā)明的某些延伸反包括將模板核酸、引物核酸、2′-終止核苷酸、延伸核苷酸和核苷酸摻入酶在溶液中溫育。

“裂解”是指從另一種化合物/物質(zhì)或從固體載體上釋放物質(zhì)或化合物的過程，例如，固相法分析化合物。參見，例如，Wells等.(1998)″Cleavage and Analysis of Material from Single ResinBeads，″J.Org.Chem.636430-6431，該文章被并于本文。
簡介
本發(fā)明提供了，例如，一種用2′-修飾核苷酸作為可逆終止子測定核苷酸序列的方法。在某些實(shí)施方案中，2′-修飾的可逆終止核苷酸摻入至正在延長的核酸鏈中產(chǎn)生可檢測信號。在某些示例性實(shí)施方案中，檢測信號在2′-修飾的可逆終止核苷酸摻入后產(chǎn)生，例如，當(dāng)脫除2′位的修飾時(shí)。而且，用一種活性物質(zhì)處理摻入的核苷酸以脫除修飾使得核酸鏈可進(jìn)一步延伸。
2′-修飾的可逆終止核苷酸
2′-修飾的可逆終止核苷酸在該技術(shù)領(lǐng)域是已知的。該種核苷酸在例如美國專利公開申請書20050037991和20050037398中均有描述。終止核苷酸中也可以含有天然堿基，或者天然堿基的類似物。另外，該術(shù)語還包括核苷酸類似物，例如，5’-三磷酸核苷類似物、5’-四磷酸核苷類似物和5’-五磷酸核苷類似物。

本發(fā)明中經(jīng)修飾的核苷酸的修飾在其糖基的2′位上，在本文中指封閉基，其可阻止核酸鏈的延伸。終止核苷酸2′糖位上的修飾可為任何數(shù)目的封閉基，例如，帶有負(fù)電荷的封閉基、大分子封閉基等，這些封閉基都結(jié)合在糖基的2′位上。本發(fā)明中使用的終止核苷酸的封閉基是可脫除的，因此，終止子是可逆終止子。可以通過酶法、化學(xué)方法將封閉基脫除。

可以通過例如，酶法、化學(xué)法或光化學(xué)方法脫除封閉基。示例性可裂解連接包括可被酶、光、還原劑、氧化劑、吸水劑等斷裂的接頭。

在某些實(shí)施方案中，2′修飾為磷酸化修飾。因此，2′磷酸化修飾可被一種去除磷酸的活性物質(zhì)輕易脫除。通常該活性物質(zhì)為酶活性物質(zhì)，例如，磷酸酶、核酸外切酶III、核酸內(nèi)切酶IV或多核苷酸激酶。在某些例子中，例如，當(dāng)標(biāo)記與2’-磷酸基連接時(shí)，可單獨(dú)使用磷酸二酯酶或與磷酸酶共同作用脫除該磷酸基。為了防止核苷酸骨架的降解，可摻入硫代磷酸酯鍵連接。

在其它實(shí)施方案中，也正如以上所提到的，封閉基通過可被酶法、化學(xué)法(例如還原劑、氧化劑、吸水劑等)裂解的連接可光裂解的連接與2’位結(jié)合。可使用的可光裂解部分包括2-硝基苯甲基部分、α取代的2-硝基苯甲基部分(例如，1-(2-硝基苯基)乙基部分)、3，5-二甲氧基芐基部分、硫代羥肟酸、7-硝基二氫吲哚部分、9-苯基氯蒽基部分、 苯甲酰苯甲醇部分、 羥基苯酰基部分、NHS-ASA部分等?？晒饬呀饨宇^的進(jìn)一步描述見，例如，美國專利2003/0099972。

也可使用化學(xué)裂解接頭將封閉基與2′位相連。裂解劑包括化學(xué)裂解劑，例如，可裂解接頭中二硫鍵的還原劑。該條件下任何對核酸無害的可逆化學(xué)修飾均可使用。因此可用弱酸或弱堿、還原劑、弱氧化劑、加熱、催化劑等逆轉(zhuǎn)該化學(xué)修飾。例如，經(jīng)適當(dāng)取代的酯類、烯丙醚、三苯甲醚、二苯甲醚都可以作為化學(xué)可逆修飾劑。

在某些實(shí)施方案中，封閉基選自圖1所列基團(tuán)之一。用已知的技術(shù)可將這些封閉基脫除。例如，圖1A所列出的封閉基可用例如，酶、弱酸或當(dāng)X＝NH時(shí)加熱等方法脫除。圖1B中所列出的封閉基可用例如氟化物離子處理脫除。圖1C中所列出的封閉基，例如，三苯甲基或經(jīng)取代的三苯甲基，可用例如弱酸或加熱的方法脫除。圖1D所列出的示例性修飾可用，例如還原劑斷裂二硫鍵的方法脫除。圖1E所列出的2′位修飾可用，例如鈀(見，例如，Turro等)脫除。圖1F所列出的2′封閉基可用例如，酯酶、蛋白酶、弱酸或堿處理等方法脫除。圖1G所列出的2′位修飾可用例如光化學(xué)方法脫除。圖1H所列出的封閉基可用例如催化還原反應(yīng)的方法脫除。

可用已知的技術(shù)合成2′修飾終止核苷酸。示例性合成方案可見，例如，美國專利No.20050037991。
標(biāo)記 標(biāo)記部分
在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的2′修飾終止核苷酸包含一個(gè)標(biāo)記或者一個(gè)標(biāo)記系統(tǒng)的組份以使得能夠檢測核苷酸是否摻入到核酸分子中。當(dāng)核苷酸摻入鏈中，或?qū)⒎忾]基從與核酸鏈連接的2′修飾核苷酸中脫除時(shí)，可基于該標(biāo)記方法產(chǎn)生信號。該標(biāo)記可產(chǎn)生指示核苷酸是否摻入核酸鏈中的信號。指示核苷酸是否摻入的信號產(chǎn)生這一概念包括直接或間接信號產(chǎn)生以及當(dāng)核苷酸摻入時(shí)產(chǎn)生的信號，例如，移除γ磷酸基產(chǎn)生的信號，或涉及到摻入后的附加步驟以檢測摻入的核苷酸的情況，例如，移除2′OH基團(tuán)的保護(hù)堿基的步驟，或者使用光-或化學(xué)方法裂解堿基上的接頭的實(shí)施方案。

任何產(chǎn)生信號的可檢測標(biāo)記都可以標(biāo)記2′-修飾終止核苷酸，包括放射性標(biāo)記、多修飾基團(tuán)(mass-modifying group)、熒光部分、發(fā)光部分、酶部分等。在典型的實(shí)施方案中，該標(biāo)記是熒光標(biāo)記。

在本發(fā)明背景下，標(biāo)記也指標(biāo)記系統(tǒng)，其中多個(gè)部分，例如一對部分，相互作用控制信號產(chǎn)生。例如，這些包括供體/受體對，其中當(dāng)分子相互靠近時(shí)供體發(fā)射的熒光可激活受體。因此，兩個(gè)分子相互分離時(shí)供體和/或受體產(chǎn)生的信號與兩個(gè)分子靠近時(shí)產(chǎn)生的信號是不同的。供體部分，通常位熒光基團(tuán)，在第一波長時(shí)吸收能量，在第二個(gè)較長波長時(shí)釋放能量。受體指另一個(gè)部分，例如熒光基、團(tuán)發(fā)色團(tuán)、或吸收光譜與供體發(fā)射光譜重疊的猝滅劑。供體和受體之間有效的能量傳遞依賴于，例如，供體發(fā)射光譜和受體吸收光譜的重疊區(qū)以及供體和受體間的距離。

可用作標(biāo)記的熒光部分是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。這些包括螢光素家族染料(Integrated DNA Technologies，Inc.，Coralville，IA)、多鹵素螢光素家族染料(ABI，F(xiàn)oster City，CA)、六氯化螢光素家族染料(ABI，F(xiàn)oster City，CA)，香豆素家族染料(Invitrogen-MolecularProbes，Inc.，Eugene，OR)、玫瑰紅家族染料(GE Healthcare)、花青家族染料、噁嗪家族染料、噻嗪族染料、方酸菁(squaraine)家族染料、螯合鑭系元素族染料和BODIPY

族染料(Molecular Probes，Inc.)。熒光部分的其它例子在美國專利6,406,297、6,221,604、5,994,06、5,808,044、5,880,287、5,556,959和5,135,717中都有介紹?？扇芜x使用的其它可檢測標(biāo)記包括，例如，二甲基吖啶酮(DDAO)0、4-甲基傘形酮、6，8-二氟代-4-甲基傘形酮等。正如上文所提到的，可做為標(biāo)記的熒光部分為商品化形式，例如，Invitrogen-分子探針(Eugene，OR)等。

在某些實(shí)施方案中，用熒光-猝滅對標(biāo)記2′修飾的可逆核苷酸(例如，供體-受體對)。猝滅劑部分包括，例如，螢光素家族染料、多加酸螢光素家族染料、六氯螢光素家族染料、香豆素家族染料、玫瑰紅家族染料、花青家族染料、噁嗪家族染料、噻嗪家族染料、方酸菁家族染料、螯合鑭系元素族染料、BODIPY

族染料、低熒光猝滅劑部分和非熒光猝滅劑部分。在某些實(shí)施方案中，非熒光猝滅劑部分可以是BHQ-族染料(包括專利WO 01/86001中描述的猝滅劑BHQ-1、BHQ-2和BHQ-3)(BioSearch Technologies，Novato，CA)或苯甲酸(Integrated DNA Technologies，Inc.)。猝滅劑部分的其它實(shí)例包括，例如，TAMRA(N，N，N’，N’-四甲基-6-羧基玫瑰紅)(Invitrogen-Molecular Probes，Inc.)、苯甲酸(4(4’二甲氨基苯偶氮)苯甲酸)，IowaBlackTM(Integrated DNA Technologies，Inc.)、Cy3TM、Cy3.5TM、Cy5TM或Cy5.5TM(GE Healthcare)等。

發(fā)明中所用的熒光部分和猝滅劑部分的組合實(shí)例包括，例如，6-羧基螢光素(FAM)熒光基團(tuán)部分和Cy5TM猝滅劑部分；選自FAM、TET、JOE、HEX、Oregon Green的熒光基團(tuán)部分和BHQ-1猝滅劑部分；選自FAM、TAMRA、ROX、Cy3、Cy3.5、CAL Red、Red 640的熒光基團(tuán)部分和BHQ-2猝滅劑部分；選自Cy5和Cy5.5的熒光基團(tuán)部分和BHQ-3猝滅劑部分。
標(biāo)記結(jié)合位點(diǎn)
標(biāo)記(或標(biāo)記組件)可結(jié)合至任何可供檢測摻入到核酸鏈中的2′-修飾的可逆終止核苷酸的合適位點(diǎn)。標(biāo)記與核苷酸的結(jié)合也提供了脫除信號，以便脫除來自摻入到核酸鏈上的標(biāo)記的信號。例如，在信號標(biāo)記與2′-修飾的可逆終止核苷酸結(jié)合的情況下，該標(biāo)記可通過可裂解接頭與堿基或糖基相連。當(dāng)檢測到來自摻入延伸核酸鏈標(biāo)記的信號時(shí)，可通過裂解接頭脫除標(biāo)記。在其它實(shí)施方案中，該標(biāo)記部分與2′修飾位的磷酸基結(jié)合。當(dāng)從2′-修飾的可逆終止核苷酸上移除2′-修飾時(shí)，可通過，例如，磷酸二酯酶和/或磷酸酶移除標(biāo)記。

若標(biāo)記體系含有多個(gè)組件，這些組件將連接到2′-修飾終止核苷酸的適當(dāng)位點(diǎn)。例如，標(biāo)記系統(tǒng)可能由一個(gè)供體-受體對組成，例如一個(gè)熒光染料報(bào)告分子和一個(gè)猝滅劑。本部分所討論的實(shí)例使用熒光報(bào)告分子和猝滅劑作為標(biāo)記組件。在該領(lǐng)域眾所周知相似的標(biāo)記構(gòu)型也可用在其它的多組分標(biāo)記系統(tǒng)中。

在某些實(shí)施方案中，2′-修飾的可逆終止核苷酸中的猝滅劑部分可與堿基或糖基連接，報(bào)告分子可與磷酸基連接。通常該磷酸基是核苷酸上除了α磷酸基以外的任何磷酸基。因此，報(bào)告分子可位于與2′磷酸修飾基團(tuán)連接的糖基的2′位。在其它實(shí)施方案中，報(bào)告分子優(yōu)選與γ磷酸基連接。報(bào)告分子也可與β磷酸基連接，在使用四磷酸或五磷酸2′-修飾終止核苷酸的實(shí)施方案中，報(bào)告分子也可與任一附加的磷酸基連接。

在某些具體應(yīng)用中，也希望使用替代構(gòu)型。例如，熒光報(bào)告分子可通過可裂解鍵與2′-修飾終止核苷酸的堿基連接，猝滅劑與磷酸連接。這樣的構(gòu)型可能是有用的，例如，當(dāng)本發(fā)明的測序反應(yīng)使用四種2′-修飾終止核苷酸時(shí)，用不同顏色的熒光報(bào)告分子標(biāo)記。猝滅劑連接在β或γ磷酸基上，因此存在四種類似物，只是產(chǎn)生的信號微弱或無信號產(chǎn)生。當(dāng)類似物之一摻入到核酸鏈中，就能檢測到摻入核苷酸的信號。通過裂解可裂解接頭脫除染料之后脫除2′-封閉基。

在其它實(shí)施方案中，一種標(biāo)記部分，例如，熒光報(bào)告分子或猝滅劑，與2′-修飾終止核苷酸的2′-磷酸基連接，第二個(gè)標(biāo)記部分及相應(yīng)的報(bào)告分子或猝滅劑，依賴于第一個(gè)標(biāo)記部分的化學(xué)組成，同α磷酸基以外的第二個(gè)磷酸基連接，例如，γ或β磷酸基，或四磷或五磷2′-修飾終止核苷酸的其它磷酸基上。

可用已知技術(shù)將標(biāo)記與2′-修飾的終止核苷酸連接。實(shí)例性可裂解連接包括可經(jīng)光、還原劑、氧化劑、吸水劑等斷裂的連接。實(shí)例描述見美國專利公開申請書No.20050037398。

例如，也可用非裂解的接頭將報(bào)告分子與γ或β磷酸基，或其它部分連接，例如，修飾核苷酸上的封閉基，其在合成過程中或修飾核苷酸摻入到核酸鏈上時(shí)脫除。該種連接為已知技術(shù)。

將標(biāo)記同核苷酸或其它有機(jī)分子連接的指導(dǎo)原則為本技術(shù)領(lǐng)域可用。(見，例如，Hermanson，Bioconjugate Techniques，(1996)Academic Press，San Diego，Calif.40-55，643-71頁；Garman，1997，Non-Radioactive LabellingA Practical Approach，Academic Press，London.；Beaucage等.，Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry，John Wiley&Sons，New York，N.Y.(2000)；Handbook of Fluorescent Probes andResearch Products，9th ed.，Molecular Probes，Inc.，Eugene，Oregon.(2002)；和Pierce Applications Handbook and Catalog 2003-2004，PierceBiotechnology，Rockford，Ill.(2003))。
用2′修飾終止核苷酸測序
發(fā)明中應(yīng)用2修飾的可逆終止核苷酸進(jìn)行的測序反應(yīng)包括脫除2′-修飾基團(tuán)使鏈延伸可逆終止的步驟。因此，本發(fā)明可對延伸反應(yīng)中正在延伸的核酸鏈進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測?？刹捎貌煌姆绞酵瓿稍摐y序反應(yīng)。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所有四種核苷酸(該術(shù)語也包括四種天然核苷酸dATP，dGTP，dCTP，dTTP的類似物)均作為2′修飾的可逆終止核苷酸存在，均用可區(qū)分的標(biāo)記標(biāo)記。例如，可用熒光報(bào)告分子/猝滅劑系統(tǒng)檢測特定核苷酸的摻入。一旦核苷酸摻入，信號即可被脫除。2′位的保護(hù)修飾也被脫除以使鏈延伸繼續(xù)。

在典型的實(shí)施方案中，一次使用一種2′修飾的可逆終止核苷酸連續(xù)進(jìn)行測序步驟。在該方法中，2′修飾終止核苷酸包含在反應(yīng)混合物中，該反應(yīng)混合物還包括核苷酸模板、適當(dāng)?shù)囊?、聚合酶及其它反?yīng)組分。該反應(yīng)在引物雜合到核苷酸模板上并被延伸的條件下進(jìn)行。監(jiān)測2′修飾終止子的摻入。如果該核苷酸已經(jīng)摻入，即可檢測到信號并脫除2′修飾以繼續(xù)延伸。在某些實(shí)施方案中，在2′修飾脫除之前或同時(shí)檢測到信號。如果該修飾終止子沒有摻入，就啟用另一2′-修飾終止子(對應(yīng)于不同堿基)。反復(fù)重復(fù)此步驟直到檢測到四種2′-修飾核苷酸之一已摻入。脫除修飾基團(tuán)后，用同樣的測序方法分析模板核酸的下一個(gè)位置。

在在四種核苷酸依次加入的實(shí)施方案中，可用相同或不同的標(biāo)記將這些核苷酸標(biāo)記。

可用許多方法中任一種檢測2′修飾終止核苷酸的摻入。在某些實(shí)施方案中，可通過檢測摻入核苷酸時(shí)釋放的焦磷酸基來測定核苷酸的摻入，如焦磷酸測序中，基于焦磷酸檢測的合成測序的描述見美國專利4,971,903和Hyman，Anal.Biochem.174423(1988)；Rosenthal，International Patent Application Publication 761107(1989)；Metzker等.，Nucl.Acids Res.224259(1994)；Jones，Biotechniques 22938(1997)；Ronaghi等.，Anal.Biochem.24284(1996)，Nyren等.，Anal.Biochem.151504(1985)等。ATP硫酸化酶活性檢測方法的描述見Karamohamed和Nyren，Anal.Biochem.27181(1999)。這些方法基于檢測DNA聚合反應(yīng)中釋放的焦磷酸(PPi)。焦磷酸隨著三磷酸核苷添加到核酸鏈中而釋放。硫酰轉(zhuǎn)移酶可將焦磷酸轉(zhuǎn)變?yōu)锳TP，之后螢火蟲熒光酶產(chǎn)生的可見光可實(shí)現(xiàn)定量檢測?；诖藱C(jī)理的幾種分析系統(tǒng)在以下文獻(xiàn)中均有描述(見，例如，WO93/23564、WO 98/28440和WO98/13523，及Ronaghi等，Science 281363(1998))。

在其它實(shí)施方案中，可通過例如檢測任何標(biāo)記(例如熒光標(biāo)記)的存在檢測摻入。根據(jù)標(biāo)記選擇采用的檢測方法。因此，該檢測步驟可檢測光發(fā)射、放射現(xiàn)象等。

在某些實(shí)施方案中，依據(jù)本發(fā)明中的序列分析技術(shù)可做各種應(yīng)用，其中希望測定核酸一個(gè)或多個(gè)部分的序列。這些應(yīng)用包括序列重新測定、單核苷酸多態(tài)性(SNP)基因分型、分子單體型分析、等位基因頻率確定、甲基化分析和混合基因型檢測。

例如，基因分型可通過將模板核酸在包含引物、聚合酶、2′修飾終止核苷酸的反應(yīng)混合物中溫育順序進(jìn)行。設(shè)計(jì)引物靶向核苷酸的特定區(qū)域。監(jiān)測反應(yīng)以確定是否存在指示2′修飾終止核苷酸摻入的信號。如果該信號不存在，在之后的步驟中使用不同的2′修飾核苷酸例如，含不同堿基的。一旦2′修飾核苷酸摻入，修飾基團(tuán)就被移除以使鏈延伸繼續(xù)。

眾所周知，在一些應(yīng)用中可能沒有必要使用與所有四種天然堿基對應(yīng)的2′修飾的可逆終止核苷酸測定模板序列。例如，在重測序應(yīng)用中需重復(fù)測定核苷酸的同聚物延伸以確定殘基的數(shù)目，可只使用一種2′修飾的可逆終止核苷酸進(jìn)行重復(fù)循環(huán)，其與同聚體的重復(fù)堿基互補(bǔ)。

測序反應(yīng)可以很多方式進(jìn)行。例如，反應(yīng)可以在溶液中進(jìn)行。在其它實(shí)施方案中，反應(yīng)在固相載體上進(jìn)行，例如，微陣列或者微球，其中DNA模板與固體載體連接?？捎玫墓腆w載體類型包括平皿、串珠、微珠、晶絲、纖維、排管、雜交芯片，薄膜、單晶、陶瓷和自裝配的單分子層。核苷酸可與固體載體共價(jià)連接，例如，與偶聯(lián)劑結(jié)合，或者非共價(jià)連接，例如，靜電作用、氫鍵或抗體抗原結(jié)合，或其組合。有許多已知方法可將核苷酸連接到固體載體上。實(shí)例可參見PCT申請US98/21193、PCT US99/14387和PCT US98/05025；及WO98/50782。

核苷酸模板可通過5′端或3′端直接連接到載體表面。也可通過寡核苷酸連接，例如，寡核苷酸引物。例如，在一些應(yīng)用中，可能希望在微陣列形式上進(jìn)行測序，其中與該微陣列表面連接的寡核苷酸引物與模板退火并與其交聯(lián)?；蛘?，模板與寡核苷酸的雜交也可發(fā)生在溶液中，然后再連接到固體載體之上，例如，通過寡核苷酸引物上的接頭。由于陣列是由不連續(xù)、可分解的部位組成，所以每種靶多聚核苷酸都將產(chǎn)生一系列不同的信號指示修飾的2′可逆終止核苷酸的摻入?？梢允褂煤芏嗖煌奈㈥嚵行问剑▎畏肿游㈥嚵行问?，例如美國專利6,787,308和美國專利公開申請20020164629所述。這些參考提供了將核苷酸連接到固體表面的其它示例性指導(dǎo)。

可通過摻入不同的2′修飾的可逆終止核苷酸測定序列，例如，同時(shí)或連續(xù)摻入與四種天然核苷酸的每一種相對應(yīng)的終止核苷酸。例如，當(dāng)同時(shí)摻入核苷酸時(shí)，摻入的與模板DNA上的核苷酸配對的終止核苷酸整合到鏈上并終止鏈延伸。脫除2′-封閉基可使核酸鏈進(jìn)一步延長。可在核苷酸摻入鏈時(shí)或后續(xù)步驟中檢測信息，例如，當(dāng)脫除封閉基時(shí)，或脫除通過接頭呈現(xiàn)在堿基上的標(biāo)記時(shí)。在一些實(shí)施方案中，可在緩沖液或洗滌液中脫除2′-封閉基，但后者也可脫除所有未摻入的核苷酸。

在一些實(shí)施方案中，核苷酸被連續(xù)摻入。
系統(tǒng)
本發(fā)明也提供了一種測定核苷酸序列的系統(tǒng)。該系統(tǒng)至少包括一個(gè)包含2′可逆終止核苷酸的容器。通常該系統(tǒng)包括很多容器，例如，用于平行進(jìn)行測序反應(yīng)的容器。該裝置也包括至少一個(gè)溫度調(diào)節(jié)系統(tǒng)(例如，熱循環(huán)裝置，等等)其可操作性地與容器相連以調(diào)節(jié)容器中的溫度，和/或(c)至少一種可將流體轉(zhuǎn)移至容器和/或轉(zhuǎn)移出容器的流體轉(zhuǎn)移裝置(例如，自動(dòng)移液器等)。熱循環(huán)裝置(其中一些的具體形式為微流裝置)和許多適于或可改造后用于該系統(tǒng)的許多流體轉(zhuǎn)移裝置在該領(lǐng)域中是眾所周知的。該系統(tǒng)可任選進(jìn)一步包括至少一個(gè)可操作性連接至容器中檢測容器中所產(chǎn)生信號的檢測器。該裝置通常進(jìn)一步包括至少一個(gè)與溫度調(diào)節(jié)器可操作性連接的控制器以調(diào)節(jié)容器中的溫度和/或與流體轉(zhuǎn)移裝置可操作性連接的控制器以調(diào)節(jié)流體從容器中的轉(zhuǎn)入和/或轉(zhuǎn)出。

本發(fā)明裝置包括多種信號檢測器。檢測器元件可檢測2′可逆終止核苷酸摻入的指示信號。例如，檢測器可任選地監(jiān)測與位置上“實(shí)時(shí)”結(jié)果相應(yīng)的多種光信號?？捎萌魏慰娠@示報(bào)告分子活性的方法檢測測序反應(yīng)過程中所產(chǎn)生的信號。用于這些系統(tǒng)中的信號檢測器可檢測，例如，熒光、磷光、放射性、質(zhì)量、濃度、pH、電荷、吸光度、折射率、發(fā)光、溫度、磁性等等。例如，可用檢測器或傳感器檢測熒光，例如，光電倍增管(PMTs)、電荷耦合器件(CCDs)、強(qiáng)電荷耦合器件、光電二級管、雪崩光電二級管、光學(xué)傳感器、掃描探測器等。示例性檢測系統(tǒng)的描述見Skoog等.，Principles of InstrumentalAnalysis，5.sup.th Ed.，Harcourt Brace College Publishers(1998)和Currell，Analytical InstrumentationPerformance Characteristics andQuality，John Wiley&Sons，Inc.(2000)。以上所提到的檢測器均可從多種商業(yè)途徑獲得，例如，Applied Biosystems(Foster City，Calif.)。

本發(fā)明系統(tǒng)也通常包括一些與系統(tǒng)的一個(gè)或多個(gè)元件(例如，分析元件、合成元件、加熱調(diào)節(jié)器、流體轉(zhuǎn)移元件、檢測器等。)可操作性相連以控制這些元件運(yùn)行的控制器?？刂破魍ǔ０ㄅc系統(tǒng)分離或與系統(tǒng)整合的元件，例如，從檢測器獲得數(shù)據(jù)、影響和/或調(diào)節(jié)容器中的溫度、影響和/或調(diào)節(jié)液體從所選容器中的流入或流出，等等?？刂破骱?或其它系統(tǒng)組件可任選地與合適的程序處理器、計(jì)算機(jī)、數(shù)字裝置或信息處理裝置(例如，模擬-數(shù)字轉(zhuǎn)換器，或者數(shù)字-模擬轉(zhuǎn)換器)相連接，這些裝置根據(jù)預(yù)先編好的程序或用戶輸入指令指示這些儀器的運(yùn)行、從這些儀器中獲得數(shù)據(jù)和信息并將這些信息翻譯、處理和報(bào)告給給用戶。適當(dāng)?shù)目刂破魇潜绢I(lǐng)域眾所周知的并可通過多種商業(yè)途徑獲得。

任一控制器或計(jì)算機(jī)可任選包括監(jiān)測器，其通常為陰極射線管(″CRT″)顯示器、平板顯示器(例如，主動(dòng)矩陣液晶顯示器、液晶顯示器等)或其它。計(jì)算機(jī)電路系統(tǒng)通常置于機(jī)箱中，其中包括很多集成電路，例如，微處理器‘內(nèi)存’接口電路等其它元件。機(jī)箱中也包括硬盤驅(qū)動(dòng)器、軟盤驅(qū)動(dòng)器、高容量移動(dòng)驅(qū)動(dòng)器(例如，可寫入CD-ROM)及其它外圍裝置。鍵盤或鼠標(biāo)等輸入裝置可提供用戶輸入。這些組件在下面會(huì)有詳細(xì)介紹。

計(jì)算機(jī)通常包括獲取用戶指令的適當(dāng)軟件，或以用戶輸入一系列參數(shù)字段的形式(例如GUI)，或以預(yù)編程指令的形式(例如，許多不同的特定操作的預(yù)編程序)。該軟件進(jìn)而將這些指令轉(zhuǎn)換為適當(dāng)?shù)恼Z言以指導(dǎo)一個(gè)或多個(gè)控制器實(shí)現(xiàn)所需要的操作。計(jì)算機(jī)隨后從例如裝置中的傳感器/檢測器中獲取數(shù)據(jù)、翻譯數(shù)據(jù)，或以用戶可理解的格式或使用數(shù)據(jù)引起進(jìn)一步的控制器指令，與程序設(shè)置一致，例如，從重量標(biāo)度獲得的流體重量數(shù)據(jù)控制流體流量調(diào)節(jié)器等。
試劑盒
該發(fā)明也提供了用于序列測定的試劑盒。該試劑盒可包括至少一種2′-修飾的可逆終止核苷酸。2′-終止核苷酸可任選包括至少一個(gè)標(biāo)記(例如，放射性同位素、熒光染料、多-修飾基團(tuán)等)。在一些實(shí)施方案中，該試劑盒可另外包含一種可脫除終止核苷酸上保護(hù)修飾的試劑。本發(fā)明的試劑盒也可包含附加組分，例如，可延伸的核苷酸、反應(yīng)所需的聚合酶、用于檢測信號的酶組份或試劑。

在一些實(shí)施方案中，試劑盒包括一種或更多種如下所示的標(biāo)記的2’-修飾的可逆終止核苷酸
實(shí)施例
可以理解本文所述的實(shí)施例和實(shí)施方案僅用于說明性目的，并不限制所要求保護(hù)的發(fā)明的范圍。同樣可以理解的是，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本文所述的實(shí)施例和實(shí)施方案的提示可以做出各種修改或變化，這些修改或變化也包括在本申請及所附權(quán)利要求的精神和范圍內(nèi)。
實(shí)施例1標(biāo)記四磷酸核苷酸的合成
合成2’-磷酸標(biāo)記(TAMRA)-尿嘧啶，四磷酸方法的預(yù)示例如下所示。如下所示，該方法利用固相合成技術(shù)和來源豐富的起始原料，但是該流程也可略作調(diào)整改用于液相合成技術(shù)。相似地，該流程略做調(diào)整也適用于其它的染料標(biāo)記核苷酸的合成。例如，流程第一步中的TAMRA-cpg可任選的地被一個(gè)經(jīng)適當(dāng)保護(hù)的并被修飾的含有反應(yīng)性羥基官能團(tuán)的染料部分取代。尿嘧啶3′-tBD甲硅烷基CED亞磷酰胺(ANP-5684，Chemgenes，Wilmington，MA)與3’-Tamra CPG(GlenResearch，Sterling，VA)偶聯(lián)。脫除5’-DMT封閉基后，5’-OH與水楊基亞磷酰氯(salicyl phosphorochloridite)和焦磷酸反應(yīng)，然后氧化(Ludwig and Eckstein，J.Org.Chem.1989，54，631-635)并從載體上斷裂產(chǎn)生所需要的化合物。

實(shí)施例2標(biāo)記四磷酸核苷的合成
以下顯示了一種合成2’-磷酸標(biāo)記以及2’-磷酸標(biāo)記末端磷酸標(biāo)記的核苷多磷酸更普遍的方法的預(yù)示例。如下所示，該方法利用固相合技術(shù)和來源豐富的起始原料，但是該流程也可略作調(diào)整改用于液相合成技術(shù)。例如，該流程中第一步的3’-氨基-修飾的C7 CPG可任選地由經(jīng)適當(dāng)保護(hù)的含有反應(yīng)性羥基官能團(tuán)的氨基-烷基-接頭取代。核苷3′-tBD甲硅烷基CED亞磷酰胺(例如，ANP-5684，Chemgenes，Wilmington，MA)與3’-氨基-修飾C7 CPG(Glen Research，Sterling，VA)偶聯(lián)。偶聯(lián)步驟之后，根據(jù)需要選擇本領(lǐng)域中合適的試劑將2’-磷修飾為P＝O，P＝S，P＝Se或P:BH3。在接下來的三個(gè)步驟，脫除5’-DMT封閉基，所得5’-OH基團(tuán)與水楊基亞磷酰氯反應(yīng)，焦磷酸替代水楊基(Ludwig and Eckstein，J.Org.Chem.1989，54，631-635)。或者，可將多聚磷酸(例如三聚磷酸)用于其它修飾。可再一次根據(jù)需要選擇本領(lǐng)域合適的試劑將α-磷修飾為P＝O，P＝S，P＝Se或P:BH3。在之后的步驟中，環(huán)狀多聚磷酸可被水解或與染料或其它含有用于末端磷酸標(biāo)記的親核基團(tuán)的標(biāo)記反應(yīng)。最后，將該分子從載體裂解、脫保護(hù)并與NHS酯等反應(yīng)性染料衍生物反應(yīng)。

實(shí)施例3標(biāo)記四磷酸核苷酸的合成
以下顯示了另一種合成可斷裂2’-磷酸標(biāo)記、和2’-磷酸標(biāo)記、末端磷酸標(biāo)記核苷多磷酸的一般方法的預(yù)示例。如下所示，該方法利用了固相合技術(shù)和來源豐富的起始原料，但是本流程也可略作調(diào)整改用于液相合成技術(shù)。例如，流程第一步中的3′-巰基-修飾物C3 S-SCPG可任選地由一個(gè)被適當(dāng)保護(hù)的含有反應(yīng)性羥基官能團(tuán)的烷基-巰基-接頭取代。核苷3′-tBD甲硅烷基CED亞磷酰胺(例如，ANP-5684，Chemgenes，Wilmington，MA)與3’-巰基-修飾物C3 S-S CPG(Glen Research，Sterling，VA)偶聯(lián)。偶聯(lián)步驟之后，根據(jù)需要選擇本領(lǐng)域合適的試劑將2’-磷修飾為P＝O，P＝S，P＝Se，或P:BH3。在接下來的三個(gè)步驟中，脫除5’-DMT封閉基，所得5’-OH與水楊基亞磷酰氯反應(yīng)，水楊基被焦磷酸替代(Ludwig and Eckstein，J.Org.Chem.1989，54，631-635)?；蛘撸嗑哿姿?例如三聚磷酸)也可用于其它修飾?？稍僖淮胃鶕?jù)需要選擇本領(lǐng)域合適的試劑將α-磷修飾為P＝O，P＝S，P＝Se或P:BH3。在之后的步驟中，環(huán)狀多聚磷酸可被水解或與染料或與其它含有用于末端磷酸標(biāo)記的親核基團(tuán)的標(biāo)記反應(yīng)。最后，將該分子從載體脫除，脫保護(hù)，還原二硫鍵產(chǎn)生反應(yīng)性巰基官能團(tuán)。該官能團(tuán)可與馬來酰亞胺衍生物等巰基反應(yīng)性染料衍生物反應(yīng)。

實(shí)施例4四色同時(shí)測序
描述了用所有四種堿基進(jìn)行4-色同時(shí)測序的一般方法的預(yù)示例。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了同時(shí)用所有四種核苷酸來進(jìn)行使引物沿著單鏈模板延伸的連續(xù)循環(huán)以測定核酸序列的方法。在某些實(shí)施方案中，測序反應(yīng)發(fā)生在與珠相連的模板上，該珠被固定于流動(dòng)池或固體載體上。循環(huán)包括延伸、檢測、標(biāo)記脫除、去封閉等連續(xù)步驟。在某些實(shí)施方案中，該方法利用在堿基部位通過可裂解接頭標(biāo)記的2’-終止核苷酸，其中每種堿基使用一種獨(dú)特的可區(qū)別的標(biāo)記(例如熒光基團(tuán))。在以下所示的示例性流程中，延伸伴隨著因摻入而產(chǎn)生的熒光信號，這對于所摻入的堿基是特異的。通過光化學(xué)或化學(xué)斷裂脫除標(biāo)記，隨后用磷酸酶處理脫除封閉基。

實(shí)施例5四色同時(shí)測序
描述了用所有四種堿基進(jìn)行4-色同時(shí)測序的一般方法的預(yù)示性實(shí)施例。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種同時(shí)使用四種核苷酸使引物來進(jìn)行沿著一個(gè)單鏈模板延伸以測定核酸序列的方法。在某些實(shí)施方案中，序列測定反應(yīng)發(fā)生在與珠相連的模板上，該珠被固定于流動(dòng)池或固體載體上。循環(huán)包括延伸、檢測、標(biāo)記脫除、去封閉等連續(xù)步驟。在某些實(shí)施方案中，該方法利用2’-磷酸被標(biāo)記的2’-終止核苷酸，其中每一種堿基使用一種獨(dú)特的可被區(qū)分的標(biāo)記(例如，熒光基團(tuán))。在以下的示例性流程中，延伸伴隨著因摻入而產(chǎn)生的熒光信號，這對于摻入的堿基是特異的。隨后用磷酸二酯酶和磷酸酶處理以脫除標(biāo)記和封閉基。如果需要的話，可用硫代磷酸酯鍵修飾磷酸骨架。

實(shí)施例6四色同時(shí)測序
描述了用所有四種堿基進(jìn)行4-色同時(shí)測序的一般方法的預(yù)示例。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種同時(shí)使用四種核苷酸來進(jìn)行使引物沿著單鏈模板延伸的連續(xù)循環(huán)以測定核酸序列的方法。在某些實(shí)施方案中，測序反應(yīng)發(fā)生在與珠相連的模板上，該珠被固定于流動(dòng)池或固體載體上。循環(huán)包括延伸、檢測、標(biāo)記脫除、去封閉等連續(xù)步驟。在某些實(shí)施方案中，本方法利用2’-磷酸基標(biāo)記的2’-終止核苷酸，其通過硫與2’-位連接，每種堿基使用一種獨(dú)特的可被區(qū)分的標(biāo)記(例如，熒光基團(tuán))。在以下所示的示例性流程中，延伸伴隨著因摻入而產(chǎn)生的熒光信號，這對于摻入的堿基是特異的。隨后，用金屬離子例如Ag+、Hg++、碘等處理以脫除標(biāo)記和封閉基。

實(shí)施例7用四磷酸核苷酸通過循環(huán)引物延伸測序
該實(shí)施例闡述了四磷酸核苷酸(即，2′-修飾的可逆終止核苷酸)在熱循環(huán)模板定向引物延伸以及序列測定反應(yīng)中的應(yīng)用。雖然這些反應(yīng)也可以使用其它經(jīng)修飾可快速摻入2′-修飾的可逆終止核苷酸的DNA聚合酶，但是這些反應(yīng)中使用的是G46E Q601R D640GS671F E678G(或“GQDSE”)CS6 DNA聚合酶。CS6嵌合體聚合酶的進(jìn)一步描述見在美國專利申請公布說明書2004/0005599。在組成為80mM Tricine(pH 7.75)、100mM KOAc和1.0mM Mn(OAc)2的緩沖液中進(jìn)行引物延伸反應(yīng)。各反應(yīng)體系(50μl)包括0.04μM GQDSE CS6DNA聚合酶、2單位/μl rTth耐熱焦磷酸酶(Roche MolecularSystems，Inc.，Branchburg NJ)、0.02μM 5’-FAM標(biāo)記的寡核糖核苷酸引物、0.04μM寡聚脫氧核苷酸模板以及0.2μM DNA聚合酶的優(yōu)化的適體。更具體地，引物和模板序列如下 引物5’-FAM-AGCAACAAGUUUAGUUCGUUCGAGCCGUGCGA-3’ 模板3’-ACGTTGTTCAAATCAAGCAAGCTCGGCACGCTACGTACGTACGT-5’，其中E＝3’磷酸基
在應(yīng)用生物系統(tǒng)GeneAmp

PCR系統(tǒng)9700中進(jìn)行熱循環(huán)反應(yīng)。在50℃取2μl等分試樣并加入38μl1mM EDTA。在50℃加入2μl的250μM各種四磷酸核苷酸(2’-PO4-NTP)混合物以起始延伸反應(yīng)，然后在64℃溫育5分鐘。將溫度降至15℃，取2μl延伸反應(yīng)等分試樣用于分析，隨后加入38μl 1mM EDTA以終止反應(yīng)。添加2μl1單位/μl CIAP(堿性磷酸酯酶，小牛腸，Promega目錄(2005)#M182A)去除2’-單磷酸封閉基團(tuán)，27℃溫育5分鐘。85℃溫育5分鐘滅活CIAP。按上述步驟將延伸和去封閉反應(yīng)再重復(fù)三輪。取2μl延伸反應(yīng)終止液，用18μl GeneScanTM-120LIZTM Size Standard(應(yīng)用生物系統(tǒng)，F(xiàn)oster City，CA，P/N 4322362)HiDiTM甲酰胺(應(yīng)用生物系統(tǒng)，F(xiàn)oster City，CA，P/N 311320)(1∶40)稀釋，然后在95℃溫育5分鐘。

用具有基礎(chǔ)數(shù)據(jù)收集軟件2.0版的應(yīng)用生物系統(tǒng)3100遺傳分析儀的毛細(xì)管電泳和應(yīng)用生物系統(tǒng)GeneScan TM軟件3.7版的最終分析來分析延伸反應(yīng)。圖2顯示了四輪循環(huán)延伸和去封閉后的FAM染料標(biāo)記的引物延伸產(chǎn)物。在添加核苷酸之前，循環(huán)1中的起始引物顯示為用CIAP脫磷酸之前和之后的延伸產(chǎn)物。循環(huán)2和3出現(xiàn)了脫磷酸前后的延伸產(chǎn)物，而循環(huán)4因?yàn)闆]有分析到CIAP后的產(chǎn)物，所以只顯示了脫磷酸前的延伸產(chǎn)物。相對于120LIZ尺寸標(biāo)準(zhǔn)，由于2’-PO4額外的負(fù)電荷，2’-PO4-NTP的摻入促使延伸產(chǎn)物比起始引物遷移更快。與CIAP溫育后，2’-PO4脫除，相對于尺寸標(biāo)準(zhǔn)，延伸產(chǎn)物比起始引物遷移更慢，與預(yù)料一致。圖2清楚地表明，起始引物遷移于大約30個(gè)堿基處(相對于尺寸標(biāo)準(zhǔn))，延伸產(chǎn)物遷移于大約26個(gè)堿基處，CIAP溫育后的延伸產(chǎn)物遷移于大約31個(gè)堿基處。在CIAP溫育前后，各循環(huán)延伸產(chǎn)物隨產(chǎn)物逐漸增大的遷移情況(相對于120LIZ尺寸標(biāo)準(zhǔn))，與對尺寸逐漸增大的引物延伸產(chǎn)物所做的預(yù)測一致。
實(shí)施例8用染料標(biāo)記的2’-終止核苷酸通過循環(huán)引物延伸測序
該實(shí)施例闡述了染料標(biāo)記的2’-PO4-NTPs在熱循環(huán)模板定向引物延伸和序列測定反應(yīng)中的應(yīng)用。最終延伸步驟中使用的染料標(biāo)記2’-PO4-NTPs只是用來顯示序列中特異摻入了正確的2’-PO4-NTP。例如，在三次循環(huán)延伸反應(yīng)中，前兩次循環(huán)使用未標(biāo)記的2’-PO4-NTPs，第三次延伸步驟中使用染料標(biāo)記2’-PO4-NTPs。雖然這些反應(yīng)也可以使用其它被修飾的DNA聚合酶快速摻入2′-修飾NTPs，但是這些反應(yīng)中使用的是GQDSE CS6 DNA聚合酶。在組成為80mMTricine(pH 7.75)、100mM KOAc和1.0mM Mn(OAc)2的緩沖液中進(jìn)行引物延伸反應(yīng)。各反應(yīng)體系(50μl)中含有0.1μM GQDSE CS6 DNA聚合酶、2單位/μl rTth耐熱焦磷酸酶(Roche Molecular Systems，Inc.，Branchburg NJ)、0.02μM 5’-FAM標(biāo)記的寡核苷酸引物、0.04μM寡聚脫氧核苷酸模板以及0.5μM DNA聚合酶的優(yōu)化適體。更具體地，引物和模板序列如下 引物5’-FAM-AGCAACAAGUUUAGUUCGUUCGAGCCGUGCGA-3’ 模板3’-ECGTTGTTCAAATCAAGCAAGCTCGGCACGCTACGTACGTACGT-5’，其中E＝反向dA
在應(yīng)用生物系統(tǒng)GeneAmp

PCR系統(tǒng)9700中進(jìn)行熱循環(huán)反應(yīng)。在27℃取2μl等分試樣并加入18μl 1mM EDTA。在27℃加入2μl(250μM)各種2’-PO4-NTPs，或者若是最終延伸步驟則加入2μl(25μM)各種染料標(biāo)記2’-PO4-NTPs起始延伸反應(yīng)，然后在64℃溫育5分鐘。將溫度降至15℃，取2μl延伸反應(yīng)等分試樣加入18μl1mM EDTA。加入2μl 1單位/μl CIAP(小牛腸堿性磷酸酯酶，目錄#M182A(這是舊的目錄號，新的目錄號為M1821))去除2’-PO4封閉基團(tuán)，27℃溫育5分鐘。85℃溫育5分鐘滅活CIAP。此后的延伸和去封閉均按上述方法進(jìn)行。將EDTA終止的反應(yīng)液用Sephadex

G-50(Sigma-Aldrich部件編號G5080)過濾以去除未摻入的染料標(biāo)記2’-PO4-NTPs。取2μl過濾的延伸反應(yīng)液，用18μl GeneScanTM-120LIZTM尺寸標(biāo)準(zhǔn)(應(yīng)用生物系統(tǒng)P/N 4322362)HiDiTM甲酰胺(應(yīng)用生物系統(tǒng)P/N 311320)(1∶40)稀釋，然后在95℃溫育3分鐘。

用具有基礎(chǔ)數(shù)據(jù)收集軟件2.0版的應(yīng)用生物系統(tǒng)3100遺傳分析儀的毛細(xì)管電泳和應(yīng)用生物系統(tǒng)GeneScan TM軟件3.7版的最終分析來分析延伸反應(yīng)。圖3顯示了染料標(biāo)記起始引物和SBS的1、2、3次循環(huán)的染料標(biāo)記延伸產(chǎn)物。該儀器收集五個(gè)通道或箱中的染料放射數(shù)據(jù)，在圖3中顯示為示蹤峰形。單個(gè)染料的放射光譜可落入一個(gè)或更多的箱中，并在圖中顯示為一個(gè)或更多個(gè)峰。在實(shí)施例中，R110和FAM落入同一箱中，因此只能看到一個(gè)峰。所有延伸產(chǎn)物均含有5’-FAM標(biāo)記以及3’染料標(biāo)記的2’PO4-NTP。對于單獨(dú)的堿基延伸，模板堿基為A則摻入了TAMRA-標(biāo)記的2’-PO4-UMP。相對于GeneScanTM-120LIZTM尺寸標(biāo)準(zhǔn)(應(yīng)用生物系統(tǒng)，F(xiàn)oster City CA)單個(gè)堿基延伸產(chǎn)物遷移于大約31個(gè)堿基處，而起始FAM-標(biāo)記引物遷移于30或31個(gè)堿基之間(相對于尺寸標(biāo)準(zhǔn))。對于2次循環(huán)延伸反應(yīng)，第二個(gè)模板堿基是C，則摻入了R110-標(biāo)記2’-PO4-GMP。兩堿基引物延伸產(chǎn)物遷移于大約33個(gè)堿基處(相對于尺寸標(biāo)準(zhǔn))。對于3次循環(huán)延伸反應(yīng)，第三個(gè)模板堿基是G，則摻入了ROX-標(biāo)記2’-PO4-CMP。三堿基延伸產(chǎn)物遷移于33或34個(gè)堿基之間(相對于尺寸標(biāo)記)。各延伸循環(huán)中逐漸增長的產(chǎn)物(相對于尺寸標(biāo)準(zhǔn))，結(jié)合各摻入的染料標(biāo)記2’-PO4-NTP的可辨別光譜，可以證明序列中特異摻入了染料標(biāo)記2’-PO4-NTPs。

眾所周知，本文所描述的實(shí)施例和實(shí)施方案僅用于說明目的，可提示本領(lǐng)域技術(shù)人員對其進(jìn)行的各種修改或改變，這些修改或改變也要包含于本申請的精神和范圍內(nèi)以及附加權(quán)利要求的范圍內(nèi)。 本文引用的所有出版物、專利和專利申請書均被完整引用作為參考，用于所有目的。
權(quán)利要求書(按照條約第19條的修改)
1.一種測定至少部分模板核酸序列的方法，該方法包括
(a)將至少一種模板核酸與至少一種DNA聚合酶、至少一種2′-修飾的可逆終止核苷酸、至少一個(gè)與至少一個(gè)模板核酸亞序列互補(bǔ)的引物核酸溫育，其中聚合酶延伸引物核酸產(chǎn)生至少一個(gè)將2′-修飾的可逆終止核苷酸摻入其3′-末端的引物延伸產(chǎn)物；
(b)脫除引物延伸產(chǎn)物3′-末端2′-修飾的可逆終止核苷酸的2′位上的封閉基；和
(c)在(b)之前和/或其過程中，確定引物延伸產(chǎn)物中的2′-修飾的可逆終止核苷酸，其中由已確定的2′-修飾的可逆終止核苷酸可確定至少一部分模板核酸堿基序列，從而測定至少一部分模板核酸序列。
2.權(quán)利要求1的方法，其中2′位的封閉基是磷酸基。
3.權(quán)利要求2的方法，其中(b)包括將引物延伸產(chǎn)物與可脫除2′位磷酸基的活性物質(zhì)溫育。
4.權(quán)利要求3的方法，其中可脫除2’位磷酸基的活性物質(zhì)為磷酸酶。
5.權(quán)利要求3的方法，其中可脫除2’位磷酸基的活性物質(zhì)為核酸外切酶III。
6.權(quán)利要求3的方法，其中可脫除2’位磷酸基的活性物質(zhì)為核酸外切酶IV。
7.權(quán)利要求3的方法，其中可脫除2’位磷酸基的活性物質(zhì)為多核苷磷酸激酶。
8.權(quán)利要求3的方法，其中可脫除2’位磷酸基的活性物質(zhì)為磷酸二酯酶或磷酸二酯酶與磷酸酶的組合物。
9.權(quán)利要求1的方法，其中2′修飾的可逆終止核苷酸選自
X＝O、NH、S
Y＝O、S、Se、BH3
Z＝H、染料
R1、R2＝獨(dú)立的OH、烷基、芳基、
烷氧基、烷氨基、硫代烷基、(OPO2)nOH、
染料、猝滅劑、接頭+標(biāo)記等，
Y＝O、S、Se、BH3
Z＝H、染料
R1、R2、R3＝獨(dú)立的烷基、芳基、
烷氧基、烷氨基、染料、猝滅劑、
接頭+標(biāo)記等，
n＝1-3
X＝O、S、NH
Z＝H、染料
R1、R2、R3＝獨(dú)立的烷基、芳基、烷氧基、
烷氨基、染料、猝滅劑、接頭+標(biāo)記等，
n＝1-3
Y＝O、S、Se、BH3
Z＝H、染料
R＝烷基、芳基、染料、猝滅劑、標(biāo)記等
n＝1-3
X＝O、S、NH
Y＝O、S、Se、BH3
Z＝H、染料
R1、R2、R3＝獨(dú)立的烷基、芳基、烷氧基、
烷氨基、染料、猝滅劑、接頭+標(biāo)記等，
n＝1-3
Y＝O、S、Se、BH3
Z＝H、染料
R＝烷基、芳基、染料、猝滅劑、標(biāo)記等
和
10.權(quán)利要求1的方法，其中用至少一個(gè)標(biāo)記部分標(biāo)記2′-修飾的可逆終止核苷酸。
11.權(quán)利要求10的方法，其中標(biāo)記部分包括熒光染料、發(fā)光分子或放射性同位素。
12.權(quán)利要求11的方法，其中的標(biāo)記部分為熒光染料。
13.權(quán)利要求10的方法，其中標(biāo)記部分通過一個(gè)可裂解的接頭與2′-修飾的可逆終止核苷酸的堿基相連接，該方法進(jìn)一步包括一個(gè)斷裂接頭的步驟。
14.權(quán)利要求10的方法，其中標(biāo)記部分與2′-修飾的可逆終止核苷酸的糖殘基連接。
15.權(quán)利要求10的方法，其中標(biāo)記部分與2′-修飾的可逆終止核苷酸2’位的磷酸基連接。
16.權(quán)利要求10的方法，其中與2′-修飾的可逆終止核苷酸與包含供體和受體的兩個(gè)標(biāo)記部分連接。
17.權(quán)利要求16的方法，其中供體和受體為報(bào)告分子和猝滅對。
18.權(quán)利要求16的方法，其中兩個(gè)標(biāo)記部分能夠進(jìn)行熒光共振能量傳遞。
19.權(quán)利要求17的方法，其中猝滅部分與2′-修飾的可逆終止核苷酸的堿基相連，報(bào)告分子部分與磷酸基相連，其前提為該磷酸基不是2′-修飾的可逆終止核苷酸的α-磷酸基。
20.權(quán)利要求19的方法，其中的磷酸基是γ-磷酸基。
21.權(quán)利要求19的方法，其中磷酸基是2′-修飾的可逆終止核苷酸2’位的磷酸基。
22.權(quán)利要求16的方法，其中一個(gè)標(biāo)記部分與2′-修飾的可逆終止核苷酸2’位的磷酸基相連，第二個(gè)標(biāo)記部分與第二個(gè)磷酸基相連。
23.權(quán)利要求22的方法，其中第二個(gè)磷酸基是γ-磷酸基。
24.權(quán)利要求1的方法，其中的反應(yīng)混合物包括四種不同的2′-修飾的可逆終止核苷酸，每種2′-修飾的可逆終止核苷酸具有不同的堿基，標(biāo)有不同的標(biāo)記部分。
25.權(quán)利要求1的方法，其中檢測步驟包括檢測2′-修飾的可逆終止核苷酸摻入時(shí)產(chǎn)生的焦磷酸基。
26.權(quán)利要求1的方法，其中2′-修飾的可逆終止核苷酸分子包括2′-單磷酸-3′-羥基核苷酸。
27.權(quán)利要求1的方法，包括重復(fù)(a)-(c)一次或多次。
28.一種通過合成測序的試劑盒，包括
至少一個(gè)2′-修飾的可逆終止核苷酸，DNA聚合酶和脫除2′-修飾的可逆終止核苷酸2′位修飾的試劑。
29.權(quán)利要求28的試劑盒，其中2′-修飾的可逆終止核苷酸用磷酸基作為2′位的修飾，所述試劑選自磷酸酶、核酸外切酶III、核酸內(nèi)切酶IV，以及多核苷酸激酶。
30.(刪除)
31.權(quán)利要求28的試劑盒，其中2′-修飾的可逆終止核苷酸與標(biāo)記物連接。
32.權(quán)利要求28的試劑盒，進(jìn)一步包括至少一種可延伸的核苷酸。
33.一種基因分型的方法，包括
a)將模板核酸與包含有引物、DNA聚合酶和2′-修飾的可逆終止核苷酸的反應(yīng)混合物溫育，所述修飾的可逆終止核苷酸包含四種天然堿基之一或其類似物，并進(jìn)一步包含2′位的修飾，該修飾可在引物與模板核酸退火并被反應(yīng)中的聚合酶延伸形成延伸產(chǎn)物的條件下終止合成；
b)檢測是否存在2′-修飾的可逆終止核苷酸摻入延伸產(chǎn)物的指示信號；
c)如果該信號不存在，用不同的2′-修飾的可逆終止核苷酸重復(fù)步驟a)和b)，所述不同的2′-修飾的可逆終止核苷酸包含不同的四種天然堿基之一或其類似物；
d)將可脫除可逆終止核苷酸2′位修飾的活性物質(zhì)與延伸產(chǎn)物溫育；
e)重復(fù)步驟a)到步驟b)所需次數(shù)以測定所述模板核酸的部分序列；
f)將模板核酸的部分序列與多態(tài)位點(diǎn)的已知序列比對。
34.一種測定核酸序列的系統(tǒng)，包括
一臺熱循環(huán)儀，包含反應(yīng)池，其中模板核酸在含有引物、DNA聚合酶和2′-修飾的可逆終止核苷酸的反應(yīng)混合物中溫育，所述修飾的可逆終止核苷酸包含四種天然堿基之一或其類似物，進(jìn)一步包含可以終止合成的2′位修飾；該熱循環(huán)儀可有效提供引物與模板核酸退火并被反應(yīng)中的聚合酶延伸形成延伸產(chǎn)物的條件；
所述反應(yīng)池含有供添加和移出試劑的入口和出口；以及
檢測器，該檢測器可有效檢測2′-修飾的可逆終止核苷酸摻入延伸產(chǎn)物中產(chǎn)生的指示信號。
35.一種標(biāo)記的2′-修飾的可逆終止核苷酸，選自
36.一種測定至少一部分模板核酸序列的方法，包括
a)在引物與模板核酸退火并被反應(yīng)中的聚合酶延伸形成延伸產(chǎn)物的條件下，將模板核酸與包含引物、DNA聚合酶和2′-修飾的可逆終止核苷酸的反應(yīng)混合物溫育；
b)檢測2′-修飾的可逆終止核苷酸摻入至延伸產(chǎn)物中的指示信號的存在；
c)將延伸產(chǎn)物與可脫除可逆終止核苷酸2′位修飾的活性物質(zhì)溫育；
d)重復(fù)步驟a)到c)所需次數(shù)以測定模板核酸的至少一部分序列。
37.權(quán)利要求36的方法，其中步驟(a)是在單獨(dú)的反應(yīng)混合物中用多種不同的2′-修飾的可逆終止核苷酸完成的，每種不同的2′-修飾的可逆終止核苷酸含有不同的堿基。
38.權(quán)利要求37的方法，其中依次摻入每種不同的2′-修飾的可逆終止核苷酸直至檢測到2′-修飾的可逆終止核苷酸摻入到延伸產(chǎn)物中的指示信號。
39.權(quán)利要求37的方法，其中同時(shí)摻入每種不同的2′-修飾的可逆終止核苷酸，而且每種不同的2′-修飾的可逆終止核苷酸均由不同的標(biāo)記部分標(biāo)記。
40.一種測定至少一部分模板核酸序列的方法，包括
a)將模板核酸與包含有引物、DNA聚合酶和2′-修飾的可逆終止核苷酸的反應(yīng)混合物溫育，所述被修飾的可逆終止核苷酸包含四種天然堿基之一或其類似物，并進(jìn)一步包含2′位修飾，該修飾可在引物與模板核酸退火并被反應(yīng)中的聚合酶延伸形成延伸產(chǎn)物的條件下終止合成；
b)檢測是否存在2′-修飾的可逆終止核苷酸摻入到延伸產(chǎn)物上的指示信號；
c)如果該信號不存在，用不同的2′-修飾的可逆終止核苷酸重復(fù)步驟a)和b)，所述不同的2′-修飾的可逆終止核苷酸包含不同的四種天然堿基之一或其類似物；
d)將可脫除可逆終止核苷酸2′位修飾的活性物質(zhì)與延伸產(chǎn)物溫育；
e)重復(fù)步驟a)到步驟b)所需次數(shù)以測定所述模板核酸的至少一部分序列。
權(quán)利要求
1.一種測定至少部分模板核酸序列的方法，該方法包括
(a)將至少一種模板核酸與至少一種聚合酶、至少一種2′-修飾的可逆終止核苷酸、至少一個(gè)與至少一個(gè)模板核酸亞序列互補(bǔ)的引物核酸溫育，其中聚合酶延伸引物核酸產(chǎn)生至少一個(gè)將2′-修飾的可逆終止核苷酸摻入其3′-末端的引物延伸產(chǎn)物；
(b)脫除引物延伸產(chǎn)物3′-末端2′-修飾的可逆終止核苷酸的2′位上的封閉基；和
(c)在(b)之前和/或其過程中，確定引物延伸產(chǎn)物中的2′-修飾的可逆終止核苷酸，其中由已確定的2′-修飾的可逆終止核苷酸可確定至少一部分模板核酸堿基序列，從而測定至少一部分模板核酸序列。
2.權(quán)利要求1的方法，其中2′位的封閉基是磷酸基。
3.權(quán)利要求2的方法，其中(b)包括將引物延伸產(chǎn)物與可脫除2′位磷酸基的活性物質(zhì)溫育。
4.權(quán)利要求3的方法，其中可脫除2’位磷酸基的活性物質(zhì)為磷酸酶。
5.權(quán)利要求3的方法，其中可脫除2’位磷酸基的活性物質(zhì)為核酸外切酶III。
6.權(quán)利要求3的方法，其中可脫除2’位磷酸基的活性物質(zhì)為核酸外切酶IV。
7.權(quán)利要求3的方法，其中可脫除2’位磷酸基的活性物質(zhì)為多核苷磷酸激酶。
8.權(quán)利要求3的方法，其中可脫除2’位磷酸基的活性物質(zhì)為磷酸二酯酶或磷酸二酯酶與磷酸酶的組合物。
9.權(quán)利要求1的方法，其中2′修飾的可逆終止核苷酸選自
X＝O、NH、S
Y＝O、S、Se、BH3
Z＝H、染料
R1、R2＝獨(dú)立的OH、烷基、芳基、
烷氧基、烷氨基、硫代烷基、(OPO2)nOH、染料、猝滅劑、接頭+標(biāo)記等，
X＝O、NH
Y＝O、S、Se、BH3
Z＝H、染料
R1、R2、R3＝獨(dú)立的烷基、芳基、
烷氧基、烷氨基、染料、猝滅劑、接頭+標(biāo)記等，
n＝1-3
X＝O、S、NH
Z＝H、染料
R1、R2、R3＝獨(dú)立的烷基、芳基、烷氧基、
烷氨基、染料、猝滅劑、接頭+標(biāo)記等，
n＝1-3
Y＝O、S、Se、BH3
Z＝H、染料
R＝烷基、芳基、染料、猝滅劑、標(biāo)記等
n＝1-3
X＝O、S、NH
Y＝O、S、Se、BH3
Z＝H、染料
R1、R2、R3＝獨(dú)立的烷基、芳基、烷氧基、
烷氨基、染料、猝滅劑、接頭+標(biāo)記等，
n＝1-3
Y＝O、S、Se、BH3
Z＝H、染料
R＝烷基、芳基、染料、猝滅劑、標(biāo)記等
和
10.權(quán)利要求1的方法，其中用至少一個(gè)標(biāo)記部分標(biāo)記2′-修飾的可逆終止核苷酸。
11.權(quán)利要求10的方法，其中標(biāo)記部分包括熒光染料、發(fā)光分子或放射性同位素。
12.權(quán)利要求11的方法，其中的標(biāo)記部分為熒光染料。
13.權(quán)利要求10的方法，其中標(biāo)記部分通過一個(gè)可裂解的接頭與2′-修飾的可逆終止核苷酸的堿基相連接，該方法進(jìn)一步包括一個(gè)斷裂接頭的步驟。
14.權(quán)利要求10的方法，其中標(biāo)記部分與2′-修飾的可逆終止核苷酸的糖殘基連接。
15.權(quán)利要求10的方法，其中標(biāo)記部分與2′-修飾的可逆終止核苷酸2’位的磷酸基連接。
16.權(quán)利要求10的方法，其中與2′-修飾的可逆終止核苷酸與包含供體和受體的兩個(gè)標(biāo)記部分連接。
17.權(quán)利要求16的方法，其中供體和受體為報(bào)告分子和猝滅對。
18.權(quán)利要求16的方法，其中兩個(gè)標(biāo)記部分能夠進(jìn)行熒光共振能量傳遞。
19.權(quán)利要求17的方法，其中猝滅部分與2′-修飾的可逆終止核苷酸的堿基相連，報(bào)告分子部分與磷酸基相連，其前提為該磷酸基不是2′-修飾的可逆終止核苷酸的α-磷酸基。
20.權(quán)利要求19的方法，其中的磷酸基是γ-磷酸基。
21.權(quán)利要求19的方法，其中磷酸基是2′-修飾的可逆終止核苷酸2’位的磷酸基。
22.權(quán)利要求16的方法，其中一個(gè)標(biāo)記部分與2′-修飾的可逆終止核苷酸2’位的磷酸基相連，第二個(gè)標(biāo)記部分與第二個(gè)磷酸基相連。
23.權(quán)利要求22的方法，其中第二個(gè)磷酸基是γ-磷酸基。
24.權(quán)利要求1的方法，其中的反應(yīng)混合物包括四種不同的2′-修飾的可逆終止核苷酸，每種2′-修飾的可逆終止核苷酸具有不同的堿基，標(biāo)有不同的標(biāo)記部分。
25.權(quán)利要求1的方法，其中檢測步驟包括檢測2′-修飾的可逆終止核苷酸摻入時(shí)產(chǎn)生的焦磷酸基。
26.權(quán)利要求1的方法，其中2′-修飾的可逆終止核苷酸分子包括2′-單磷酸-3′-羥基核苷酸。
27.權(quán)利要求1的方法，包括重復(fù)(a)-(c)一次或多次。
28.一種通過合成測序的試劑盒，包括
至少一個(gè)2′-修飾的可逆終止核苷酸，和
脫除2′-修飾的可逆終止核苷酸2′位修飾的試劑。
29.權(quán)利要求28的試劑盒，其中2′-修飾的可逆終止核苷酸用磷酸基作為2′位的修飾，所述試劑選自磷酸酶、核酸外切酶III、核酸內(nèi)切酶IV，以及多核苷酸激酶。
30.權(quán)利要求28的試劑盒，進(jìn)一步包括聚合酶。
31.權(quán)利要求28的試劑盒，其中2′-修飾的可逆終止核苷酸與標(biāo)記物連接。
32.權(quán)利要求28的試劑盒，進(jìn)一步包括至少一種可延伸的核苷酸。
33.一種基因分型的方法，包括
a)將模板核酸與包含有引物、聚合酶和2′-修飾的可逆終止核苷酸的反應(yīng)混合物溫育，所述修飾的可逆終止核苷酸包含四種天然堿基之一或其類似物，并進(jìn)一步包含2′位的修飾，該修飾可在引物與模板核酸退火并被反應(yīng)中的聚合酶延伸形成延伸產(chǎn)物的條件下終止合成；
b)檢測是否存在2′-修飾的可逆終止核苷酸摻入延伸產(chǎn)物的指示信號；
c)如果該信號不存在，用不同的2′-修飾的可逆終止核苷酸重復(fù)步驟a)和b)，所述不同的2′-修飾的可逆終止核苷酸包含不同的四種天然堿基之一或其類似物；
d)將可脫除可逆終止核苷酸2′位修飾的活性物質(zhì)與延伸產(chǎn)物溫育；
e)重復(fù)步驟a)到步驟b)所需次數(shù)以測定所述模板核酸的部分序列；
f)將模板核酸的部分序列與多態(tài)位點(diǎn)的已知序列比對。
34.一種測定核酸序列的系統(tǒng)，包括
一臺熱循環(huán)儀，包含反應(yīng)池，其中模板核酸在含有引物、聚合酶和2′-修飾的可逆終止核苷酸的反應(yīng)混合物中溫育，所述修飾的可逆終止核苷酸包含四種天然堿基之一或其類似物，進(jìn)一步包含可以終止合成的2′位修飾；該熱循環(huán)儀可有效提供引物與模板核酸退火并被反應(yīng)中的聚合酶延伸形成延伸產(chǎn)物的條件；
所述反應(yīng)池含有供添加和移出試劑的入口和出口；以及
檢測器，該檢測器可有效檢測2′-修飾的可逆終止核苷酸摻入延伸產(chǎn)物中產(chǎn)生的指示信號。
35.一種標(biāo)記的2′-修飾的可逆終止核苷酸，選自
和
36.一種測定至少一部分模板核酸序列的方法，包括
a)在引物與模板核酸退火并被反應(yīng)中的聚合酶延伸形成延伸產(chǎn)物的條件下，將模板核酸與包含引物、聚合酶和2′-修飾的可逆終止核苷酸的反應(yīng)混合物溫育；
b)檢測2′-修飾的可逆終止核苷酸摻入至延伸產(chǎn)物中的指示信號的存在；
c)將延伸產(chǎn)物與可脫除可逆終止核苷酸2′位修飾的活性物質(zhì)溫育；
d)重復(fù)步驟a)到c)所需次數(shù)以測定模板核酸的至少一部分序列。
37.權(quán)利要求36的方法，其中步驟(a)是在單獨(dú)的反應(yīng)混合物中用多種不同的2′-修飾的可逆終止核苷酸完成的，每種不同的2′-修飾的可逆終止核苷酸含有不同的堿基。
38.權(quán)利要求37的方法，其中依次摻入每種不同的2′-修飾的可逆終止核苷酸直至檢測到2′-修飾的可逆終止核苷酸摻入到延伸產(chǎn)物中的指示信號。
39.權(quán)利要求37的方法，其中同時(shí)摻入每種不同的2′-修飾的可逆終止核苷酸，而且每種不同的2′-修飾的可逆終止核苷酸均由不同的標(biāo)記部分標(biāo)記。
40.一種測定至少一部分模板核酸序列的方法，包括
a)將模板核酸與包含有引物、聚合酶和2′-修飾的可逆終止核苷酸的反應(yīng)混合物溫育，所述被修飾的可逆終止核苷酸包含四種天然堿基之一或其類似物，并進(jìn)一步包含2′位修飾，該修飾可在引物與模板核酸退火并被反應(yīng)中的聚合酶延伸形成延伸產(chǎn)物的條件下終止合成；
b)檢測是否存在2′-修飾的可逆終止核苷酸摻入到延伸產(chǎn)物上的指示信號；
c)如果該信號不存在，用不同的2′-修飾的可逆終止核苷酸重復(fù)步驟a)和b)，所述不同的2′-修飾的可逆終止核苷酸包含不同的四種天然堿基之一或其類似物；
d)將可脫除可逆終止核苷酸2′位修飾的活性物質(zhì)與延伸產(chǎn)物溫育；
e)重復(fù)步驟a)到步驟b)所需次數(shù)以測定所述模板核酸的至少一部分序列。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用2′修飾的可逆終止核苷酸測定目標(biāo)核酸的核苷酸序列的方法。
文檔編號C12Q1/68GK101346472SQ200680048841
公開日2009年1月14日 申請日期2006年12月20日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月21日
發(fā)明者D·H·格爾芬德, A·P·古普塔 申請人:霍夫曼—拉羅奇有限公司