專利名稱：活化的分裂多肽及其制備方法和用途的制作方法
活化的分裂多肽及其制備方法和用途 相關申請的交叉參者
本申請根據(jù)35U.S.C.119(e)要求于2005年10月27日遞交的第60/730,752 號美國臨時專利申請的優(yōu)先權，該申請的內(nèi)容在此全文引入作為參考。
領域
本發(fā)明提供新的活化的分裂多肽蛋白，用于快速生物分子蛋白互補，以 及該活化的分裂多肽蛋白的制備方法和用途。
背景
蛋白互補是一種相對較新的方法，在該方法中，蛋白分裂成兩個或兩個 以上的無活性片段，該無活性片段能夠重新組裝來形成活性蛋白。使用無活 性分裂多肽片段的 一個局限在于重組，它們需要進行再折疊和重新組裝,人而 形成活性蛋白。這些差的折疊性質(zhì)限制了無活性分裂多肽在以快速動力學實 時檢測生物分子相互作用的方法中蛋白互補中的使用。
目前，GFP及其眾多的相關熒光蛋白被廣泛地用作蛋白標記試劑(用于綜 述，參見Verkhusha等人，2003,第18章，第405-439頁)。此外，GFP已 經(jīng)被用作末端融合的測試蛋白的溶解性指示物(Waldo等人，1999, Nat Biotechnol.l7:691-695;美國專利No.US 6,448,087)。 GFP樣蛋白是同源的擴 展家族，是共同具有保守的11條卩鏈的"桶"結構的25-30kDa多肽。GFP 樣蛋白家族目前包括約100個成員，克隆自各種珊瑚蟲類和水螅綱類，并且 包括紅色的、黃色的和綠色的熒光蛋白以及多種無熒光的染色體蛋白 (Verkhusha等人，見上文)。廣泛的各種熒光蛋白標記分析方法和試劑盒可以 商業(yè)購買得到，其中包括廣譜的GFP光譜變體和GFP樣熒光蛋白，包括 DsRed和其它紅色熒光蛋白(Clontech, PaloAlto, Calif; Amersham， Piscataway, NJ,)。
用于改善GFP和相關蛋白的溶解性的多種策略已經(jīng)被記載，并由此導 致產(chǎn)生許多具有改進的折疊性能、溶解性和干擾耐受性的突變體?，F(xiàn)有的蛋 白標記和檢測平臺是十分有效的，但是存在缺點。分裂蛋白標記會干擾 (perturb )蛋白的溶解性(Ullmann， Jacob等人，1967; Nixon和Benkovic 2000; Fox， Kapust等人，2001; Wigley, Stidham等人，2001; Wehrman, Kleaveland 等人，2002)或者在活細胞中不起作用(Richards和Vithayathil 1959; Kim和 Raines 1993; Kelemen, Klink等人，1999)。綠色熒光蛋白融合物會發(fā)生錯 誤折疊(Waldo， Standish等人，1999)或者其加工會發(fā)生改變(Bertens, Heijne 等人，2003)。含砷熒光團FLaSH或ReASH (Adams, Campbell等人，2002) 基底能夠克服許多這些缺陷，但是它需要聚半胱氨酸標記基序，還原環(huán)境， 以及細胞轉(zhuǎn)染或滲透作用(Adams, Campbell等人，2002)。
GFP片段重組系統(tǒng)已經(jīng)被描述，主要是用于檢測蛋白與蛋白之間的相互 作用，但是沒有任何一個系統(tǒng)能夠無需輔助地自組裝成正確折疊的、可溶性 和熒光性的重組GFP。此外，在這些方法中還沒有產(chǎn)生通用的分裂GFP折 疊報道系統(tǒng)。例如，Ghosh等人在2000年報道了對應于所述GFP結構中的 氨基酸1-157和158-238的兩個片段，在體外或者在大腸桿菌中共表達，當 將這兩個單獨片段融合成能夠形成反向平行亮氨酸拉鏈結構的巻曲螺旋序 列時，上述兩個GFP片段能夠重組得到一種熒光性的產(chǎn)物(Ghosh等人,2000, J.Am.Chem.Soc. 122:5658-5659)。同樣地，美國專利No. US6,780,599描述了 能夠形成反向平行的亮氨酸拉鏈結構的巻曲螺旋用于將所述GFP分子的分 裂片段連接在一起的用途。但是，該方法需要花費兩天時間來獲得陽性信號， 因此在使用上太不切合實際。
類似地，Hu等人在2002年指出，當將相互作用的蛋白bZIP和Rel融 合到GFP的兩個片段上時，能夠通過它們的相互作用來介導GFP的重組(Hu 等人，2002， Mol. Cell 9: 789-798)。 2001年,Nagai等人指出,將黃色熒光 蛋白(YFP)的片段融合到鈣調(diào)蛋白和M13上，在鈣離子存在下能夠介導YFP 重組(Nagai等人，2001， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98: 3197-3202)。在該途徑 的各種變化形式中，Ozawa等人通過自剪接內(nèi)含肽的多肽序列，將鈣調(diào)蛋白 和M13融合到兩個GFP片段上，當存在鈣離子時從而能夠介導GFP片段 共價重組(Ozawa等人，2001, Anal.Chem.72:5151-5157; Ozawa等人，2002 Anal.Chem. 73:5866-5874)。 盡管前述GFP重組系統(tǒng)提供使用兩種光譜上不同的熒光蛋白標記的好 處，但是它們受限于所述片段的大小以及相應較差的折疊性能(Ghosh等人， Hu等人，同上文)，要求化學連接(chemical ligation )以及共表達或者共同 再折疊來生成可檢測的折疊和熒光性的GFP(Ghosh等人，2000; Hu等人， 2001，見上文)。
較差的折疊性能限制了這些片段和其它無活性分裂多肽片段的應用，這 是由于它們具有減少的熒光性或者在體內(nèi)花費太長時間來發(fā)出熒光以至于 不能被用于實時分析。此外，這種片段也不能用于要求各個片段在互補前具 有長期穩(wěn)定性和溶解性的體外分析中。
分裂熒光多肽的制備，將消除用于生成所述活性蛋白的滯后時間，并且 能夠用于實時的蛋白互補分析，所述多肽在形成活性蛋白的重組方面不需要 凈皮再4斤疊。
理想的分裂多肽片段是可以被遺傳編碼的，可以在體內(nèi)和體外進行，提 供了靈敏的可逆分析信號，并且立即生成活性蛋白并且由此生成針對靶點識 別的信號。然而，迄今還未描述有能夠有效地實現(xiàn)實時蛋白互補目的的已活 化分裂多肽片段。
發(fā)明概述
本發(fā)明涉及一種用于實時檢測靶核酸分子的新系統(tǒng)，所述靶核酸分子包 括DNA、 RNA耙點，以及核酸類似物和非核酸分4斤物。特別地，本發(fā)明包 括一種分子以及用于其制備的方法和用途。本發(fā)明的分子能夠i)通過活化的 分裂多肽的重組實時才全測核酸和非核酸分析物，并且在識別和4企測之間幾乎 沒有或是沒有滯后時間；和ii)在對其靶點分子如核酸或分析物的檢測進行響 應時，可逆地增加和減少其信號。在一個實施方案中，該分子基于活化分裂 多肽片段的由雜交引發(fā)的互補，該活化的分裂多肽片段在重組時立即形成活 性蛋白。在另一個實施方案中，該分子基于分裂多肽片段對靶點分析物的結 合。用于蛋白互補方法的蛋白可以是任何能夠分裂成片段并且能夠重組形成 活性蛋白的蛋白，特別是生成具有熒光性酶促活性的活性蛋白的標記蛋白， 所述熒光性是例如熒光活性或顯色活性。在一個實施方案中，所述分裂多肽 是熒光蛋白或多肽，其中一個所述的分裂熒光性片段含有預先形成的發(fā)色
團。在這樣的一個實施方案中，由于所述發(fā)色團已經(jīng)形成并處于其成熟構象 中，其不需要等待直至發(fā)色團形成來產(chǎn)生熒光信號。
斷、病原體監(jiān)測和生物計算。
本發(fā)明的所述活化分裂多肽包括任何能夠分裂并在重新組合時立即形成 活性蛋白的多肽。這種活化的分裂多肽包括，例如具有酶促活性或熒光活性 的蛋白，例如具有顯色活性的酶或者熒光蛋白。
本發(fā)明一方面包括含有成熟的預先形成的發(fā)色團的活化熒光多肽片^:的 制備，當與其相應的熒光多肽伴侶結合時能夠立即產(chǎn)生熒光，但是處于非結 合狀態(tài)時無熒光。在一個實施方案中，所述發(fā)色團在該片段中是非熒光性的， 這是由于該片段暴露于溶劑中并被溶劑淬滅，并且缺乏與其它片段的氨基酸 的必要接觸。當所述兩個蛋白片段通過核酸互補性的相互作用來接近時，所 述第二多肽作為屏蔽物將所述發(fā)色團與溶液分離并且Y吏得所有缺少的氨基 酸接觸得到恢復，這導致焚光立即產(chǎn)生。在一個所述片段中預先形成發(fā)色團 的存在，使得在與其互補蛋白片段結合下實際上立即產(chǎn)生熒光。立即產(chǎn)生熒 光是因為所述發(fā)色團已經(jīng)形成，由此消除了用于其正確折疊和形成所需要的 延遲時間。
在一個實施方案中，本發(fā)明提供用于制備分裂多肽分子的新方法，在本 文中也被稱作為生物分子的構建。該方法用于活化的分裂多肽片段的體外分 離，例如，所述發(fā)色團已經(jīng)存在于一個片段中的分裂熒光蛋白。特別地，所 述分裂多肽片段在大腸桿菌中作為融合蛋白被表達，該融合蛋白具有小的自 分裂SspDNAB內(nèi)含肽。將這些多肽在再折疊后從內(nèi)含體中分離，所述再折 疊使得例如在一個片段中的發(fā)色團成熟，但是不具有熒光性。由于在使得蛋 白純化而不會使蛋白變性的變性條件下，包含于內(nèi)含體中的大部分物質(zhì)容易 溶解，從宿主細胞多肽和其它宿主細胞衍生的雜質(zhì)中以高效方式來純化含有 活化分裂多肽蛋白的內(nèi)含體是可能的。內(nèi)含肽促進蛋白純化，并且不改變所 述分裂多肽蛋白片段的結構。除了內(nèi)含肽之外的肽是本領域技術人員已知 的，并且可用于本發(fā)明的純化方法中。
在某些實施方案中，所述分裂多肽片段是分裂熒光蛋白， 一個片段含有 活性但處于無熒光狀態(tài)的成熟的預先形成的發(fā)色團。對處于其成熟的但是無 活性狀態(tài)中的發(fā)色團的分離使得在與相應片段互補時能夠立即檢測熒光。
在一個實施方案中，所述熒光蛋白是綠色熒光蛋白(GFP)或者增強的綠色 熒光蛋白(EGFP)。在選擇性實施方案中，所述熒光蛋白是黃色熒光蛋白 (YFP)、增強的黃色熒光蛋白(EYFP)、藍色熒光蛋白(BFP)、增強的藍色熒光 蛋白(EBFP)、藍綠色熒光蛋白(CFP)、增強的藍綠色熒光蛋白(ECFP)或者紅 色熒光蛋白(dsRED)或者任何其它上面列舉的天然或遺傳工程化的熒光蛋 白。而在進一步的實施方案中，所述重組熒光蛋白包含片段的混合物，這些 片段來自相同的上述熒光蛋白或者或者上述熒光蛋白的任意組合。
在所述熒光蛋白是EGFP的實施方案中，EGFP蛋白分裂成a片段(大約 是氨基酸l-158)和卩片段(大約是氨基酸159-239)。 a片段含有成熟發(fā)色團， 其不能夠單獨地發(fā)出熒光，但是當與P片段配對時將會發(fā)出熒光。由于發(fā)色 團是預先形成的，其能夠立即發(fā)出熒光。重要的是，在缺乏便利的結合時， a片段和(3片段不會重新組合或發(fā)出熒光。此外，重新組裝的EGFP具有一 個激發(fā)/發(fā)射最大值，與EGFP的488/507 nm相比，該最大值紅移至4卯/524 nm。而且，在Mg^存在時，本文所述的重新組裝的EGFP是穩(wěn)定的。
在本發(fā)明選擇性的實施方案中，活化的分裂多肽片段包含活性酶的片 段，可用酶活性測定法來^r測。在這樣的實施方案中，所述酶活性是通過顯 色反應或熒光反應來檢測。在一個實施方案中，所述酶是二氬葉酸還原酶或 者P-內(nèi)酰胺酶。
本發(fā)明的另一個方面是活化的分裂多肽分子。在一個實施方案中，該分 子包含至少兩個活化的分裂多肽片段，所述片段各自偶聯(lián)到核酸結合部分或 者核酸結合基序上。核酸結合部分可以是例如但是不限于核酸如DNA、 RNA,以及核酸類似物例如PNA、 LNA和其它類似物和寡核苷酸，特異于 所期望的核酸靶點。在一個實施方案中，所述核酸結合部分是寡核苷酸。在 另一個實施方案中，所述核酸結合部分可以是核酸結合性蛋白、多肽或肽。 所述核酸結合部分被偶聯(lián)到至少兩個活化的分裂多肽片段上，并且它們與最 鄰近的把核酸結合，便于立即形成所述活性蛋白和立即產(chǎn)生信號。在活化的
分裂多肽分子包含活化的分裂焚光性片段處，所述活化的熒光性片段的緊密 結合導致立即產(chǎn)生熒光。所述核酸結合部分可以通過獨立發(fā)揮作用與乾核酸 結合或者協(xié)同結合到單個位點上。在一個實施方案中，所述耙核酸可以是例
如DNA、 RNA、 PNA或者核酸的類似物或者變體。
在本發(fā)明的一個實施方案中，核酸結合部分通過柔性接頭結合到所述活 化的分裂多肽片段上。在一個實施方案中，接頭是生物素-鏈霉抗生物素化 學(參見，例如

圖1)。在這樣的實施方案中，可以將所述的兩個熒光性片段 分別在C-末端和N-末端以額外的半胱氨酸殘基底來表達，用巰基反應性試 劑生物素-HPDP來進行生物素化。然后C-末端和N-末端生物素化的多肽 可以與生物素化的核酸結合部分偶聯(lián)，例如通過鏈霉抗生物素處理的寡核苦 酸。鏈霉抗生物素是一種作為接頭的高度親合性的生物素結合性蛋白。在選 擇性的實施方案中，對柔性接頭的修飾包括將每一多肽的N-末端氨基酸和/ 或C-末端的氨基酸變?yōu)榘腚装彼幔⑶宜龊怂峤Y合部分(或者寡核芬酸)3' 末端或5'末端的巰基基團使其偶聯(lián)至N-末端和/或C-末端的半胱氨酸。
在選擇性的實施方案中，偶聯(lián)到本發(fā)明的熒光蛋白片段上的核酸結合性 部分可以是其它核酸結合性分子，作為非限制性的例子，PNAs、適體、RNA 等等。在另一個實施方案中，所述核酸結合部分可以是RNA-或DNA-結合 性蛋白。所述熒光蛋白可以是兩個無活性片段，所述片段連接到核酸結合基 序上，其中所述核酸結合基序可以獨立起作用或者協(xié)同結合到單一位點上。 熒光蛋白重新組合成全長蛋白將僅僅發(fā)生于靶點結合位點存在時，例如， RNA-結合性蛋白相互作用到所述RNA上的同類結合位點上。該相互作用將 使熒光蛋白的兩個部分結合在一起，以便進行信號檢測。
本發(fā)明的另一個方面是活化的分裂多肽分子，其包含至少兩個活化的分 裂多肽片段，所述片段各自偶聯(lián)到非核酸分析物的結合基序上。這樣的非核 酸結合基序可以是例如但是不限于蛋白、多肽或肽。在其它實施方案中，用 于非核酸分析物的結合基序可以是例如生物分子、有^L分子或者無機分子。 在這樣的實施方案中，所述靶點分析物可以是例如生物分子、無機分子或有 機分子，或其變體。
當使用熒光蛋白時，所述熒光蛋白可以選自包含如下的組綠色熒光蛋 白(GFP)、 GFP樣熒光蛋白(GFP樣)、增強的綠色熒光蛋白(EGFP)、黃色熒 光蛋白(YFP)、增強的黃色熒光蛋白(EYFP)、藍色熒光蛋白(BFP)、增強的藍 色熒光蛋白(EBFP)、藍綠色熒光蛋白(CFP)、增強的藍綠色熒光蛋白(ECFP), 以及紅色熒光蛋白(dsRED)及其變體。
在一個實施方案中，所述活化的分裂多肽分子提供用于實時檢測核酸分 子的方法。靶核酸分子可以是DNA、 RNA以及核酸類似物。靶核酸可以是 單鏈或雙鏈的。在一些實施方案中，所述靶核酸可以在暴露于所述分裂焚 光分子之前被擴增。例如，可以使用滾環(huán)擴增(RCA)來生成具有多樣化相同 雜交位點的單鏈DNA靶點，其結合至所述互補復合物的探針上。
在一個實施方案中，所述結合部分結合到靶核酸上的兩個相鄰序列上， 這樣一個核酸結合部分結合至第一個靶序列，而第二個核酸結合部分結合至 第二個耙序列。在該實施方案中，相鄰序列相互足夠接近，使得當兩個結合 部分結合到靶點上時，第一多肽和第二多肽發(fā)生相互作用，使得所述熒光性 片段發(fā)生互補。該實施方案提供對單鏈和雙鏈靶核酸的檢測。為了檢測雙鏈 的核酸把點，所述單鏈探針與所述雙鏈靶點發(fā)生相互作用以形成三鏈體。
在選擇性的實施方案中，兩個核酸結合部分是核酸或寡核苷酸，并結合 到單鏈靶核酸的相同序列上，形成三鏈體。在該實施方案中，當兩個結合部 分與核酸靶點上的相同序列相互作用時，所述熒光性片段發(fā)生互補。
在提供三鏈體形成的實施方案中，所述探針可以是寡核苷酸或多肽。優(yōu) 選地，三鏈體形成性的寡核香酸富含GC。優(yōu)選地，三鏈體是嘌呤三鏈體， 由嘧咬-嘌呤-嘌呤組成。
在一個實施方案中，本發(fā)明提供用于實時檢測存在于樣品中的耙核酸的 存在和/或其數(shù)量的方法。在雜交條件下，將含有靶核酸的樣品與分裂的熒光 分子接觸，當所述核酸結合部分與靶核酸結合時，分裂的熒光性片段發(fā)生互 補并立即產(chǎn)生熒光。焚光的存在和/或熒光的大小指示靶核酸的存在和/或靶 核酸的數(shù)量。 本發(fā)明還提供用于分離樣品中的耙核酸的方法，甚至是在非乾序列存在 的情況下。
在另一個實施方案中，本發(fā)明方法可以進行實時的核酸診斷。尤其是樣 品中病原性核酸的凈企測。在一個實施方案中，將核酸"^斷學用于病毒核酸的 實時檢測。在這樣的實施方案中，對本發(fā)明的分子進行設計，從而將分裂的 熒光蛋白結合到核酸結合部分或寡核苷酸上，所述核酸結合部分或寡核苦酸 特異于特定的病毒核苷序列或者由病毒核苷序列引起的核苷序列異常。
在選擇性的實施方案中，本發(fā)明的分子可以進行核酸雜交中變化的立即 檢測。例如，在耙核酸存在下，活化的分裂多肽的兩部分結合，以立即形成 活性蛋白并因此實時產(chǎn)生信號。特別地，在分子分裂多肽片段包含活化的分 裂熒光性片段時，立即產(chǎn)生熒光信號，但是，如果難以獲得靶核酸，例如， 當存在過量的竟爭性抑制劑時，所述活性蛋白發(fā)生分解，信號消失并不再被 檢測到。通過信號和/或熒光的減少可以檢測到分解，并且這樣的檢測是立即 的。在本領域中，已有技術中目前還做不到分子水平上對分解進行立即檢測。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供用于實時立即;險測寡核苷酸雜交的方
法，該寡核苷酸作為偶聯(lián)到活化的分裂多肽片^a上的核苷酸結合部分。例如，
局部加熱(如Hamad-Schifferli等人，Nature, 415巻，2002年1月10曰中 所述，該文獻在此全文引入作為參考)可用于使被結合的寡核苷酸變性，從 而使熒光淬滅。本發(fā)明的蛋白片段是獨特的因為當其處于分離狀態(tài)時，所述 活性蛋白的信號立即猝滅或者得以改善。本發(fā)明的蛋白片段是獨特的還因為 如果寡核苷酸發(fā)生重新組合時，該信號立即重新產(chǎn)生。在該實施方案中，使 用本發(fā)明的分子可以有效地進行并記錄各種需要進行多次開關循環(huán)的分析 中的結果，并且可以實時從視覺上觀察核酸雜交事件。此外，本發(fā)明的方法 能夠篩選干擾或促進雜交和/或妨礙核酸雜交循環(huán)事件的試劑。
在另一個實施方案中，本發(fā)明可以實時檢測個體或受試者中的基因突變、 多態(tài)現(xiàn)象或者異常。從個體中分離生物學樣品，提取DNA和/或RNA。對 本發(fā)明的分子進行設計，使得活化的分裂多肽片段結合到寡核苷酸上，該寡 核苷酸特異于試圖被檢測的特定基因突變、多態(tài)現(xiàn)象或者異常。選擇性地， 可以使用一個分子群體，可以檢測其中的許多基因突變、多態(tài)現(xiàn)象或者異常。
在該實施方案中，連接到活化的分裂多肽片段上的寡核苦酸相互互補，因此
基線是來自活性蛋白的信號。來自樣品中的DNA和/或RNA然后與該分子 接觸。如果獲取樣品的個體具有特定的突變或多態(tài)現(xiàn)象，就會與分裂多肽分 子竟爭，并降低活性蛋白的信號。在與活化的分裂多肽分子接觸之前，對個 體的DNA和/或RNA進行擴增。這在檢測具有已知多態(tài)性的單個核苷多態(tài) 現(xiàn)象中是特別有用的。由于可以立即產(chǎn)生信號和/或熒光，本發(fā)明的分子使得 可以進4于靈l文4全測。
在類似的實施方案中，本發(fā)明可以實時;險測來自個體的生物學樣品中的 分析物，特別是非核酸分析物。生物學樣品分離自包含靶點分析物的受試者。 在一些實施方案中，靶點分析物可以被提取。對本發(fā)明分子進行設計，使得 活化的分裂多肽片段結合到特異于試圖檢測的分析物的結合基序上。選擇性 地，使用包含一個分子或分析物群體的樣品，該樣品中的一種或多種分析物 可被檢測。在該實施方案中，分析物的結合基序被連接到活化的分裂多肽片 段上，該片段特異于將被檢測的分析物，然后與含有分析物的生物學樣品接 觸。如果獲取樣品的受試者含有特定的分析物，分裂多肽片^^殳將會再聚集， 生成活化的分裂多肽分子。尤其當指示蛋白是熒光蛋白的片段，并且當該片 段來自熒光譜略有差別的不同焚光蛋白時，這對于檢測樣品中的單個和多個 分析物是特別有用的。由于可以立即產(chǎn)生信號和/或熒光，本發(fā)明的分子使得 可以進4于靈綴)險測。
在另 一個實施方案中，本發(fā)明提供適合檢測樣品中是否存在靶核酸或靶 點非核酸分析物和/或其含量的試劑盒。在一個實施方案中，試劑盒至少包含 活化的分裂熒光蛋白分子成分，也即第一個熒光性片段包含預先形成的發(fā)色 團，而第二個熒光蛋白片段與第一個片段互補而立即產(chǎn)生熒光。在選擇性的 實施方案中，試劑盒至少包含活化的分裂多肽分子成分，而活化的分裂多肽 重組形成具有顯色活性的酶。在一些實施方案中，分析物的核酸結合部分或 者結合基序已經(jīng)與活化的分裂多肽蛋白片段結合。在選擇性的實施方案中， 分裂多肽片段用巰基反應試劑生物素-HPDP進行生物素化。在這種試劑盒 中，該試劑盒包含將使用者自身重要的結合部分與分裂多肽片段結合的試 劑。在一些實施方案中，試劑盒還包含適合捕獲和/或檢測樣品中是否存在靶 核酸或靶點非核酸分析物或其含量的試劑。用于檢測靶核酸的存在和/或其含
量的試劑包括酶促活性試劑或者特異于組裝蛋白的抗體?？贵w可以是被標記 的。
附圖簡迷
圖1:由DNA雜交調(diào)控的基于熒光蛋白的光學納米開關的設計。熒光蛋 白(EGFP)分裂成兩個非熒光性片段，其中 一個片段含有預先形成的發(fā)色團， 該發(fā)色團能夠在完全大小的蛋白中產(chǎn)生明亮的焚光。兩個蛋白片段均通過生 物素-鏈霉抗生物素的相互作用連接到互補性寡核苦酸上；鏈霉抗生物素能 夠結合四個生物素分子，在我們的方案中確定得到了比例為1:1:1的蛋白/鏈 霉抗生物素/寡核苷酸復合體。在混合物中，這兩種核蛋白構建物通過形成序 列特異性雙重DNA發(fā)生兼并，其引發(fā)EGFP大片段和小片段發(fā)生互補，導 致熒光的迅速產(chǎn)生(打開狀態(tài))。加入過量的一種所述寡核苦酸，代替相應的 核蛋白成分，并且使得焚光淬滅(關閉狀態(tài))。
圖2A-2D:通過DMD模擬分析EGFP大片段(1-158 N-末端氨基酸)的結構。 圖2A.作為溫度的函數(shù)的EGFP大片段的勢能(由誤差欄顯示標準偏差)。在 接近轉(zhuǎn)變點TV約0.60的狹窄溫度范圍內(nèi)發(fā)生蛋白折疊。圖2B.在T-0.59 時作為模擬時間的函數(shù)的勢能曲線表明，當接近Tp時所述蛋白的結構在折 疊狀態(tài)(下線)和非折疊狀態(tài)(上線)之間快速變化。圖2C.從DMD模擬 中獲得的EGFP大片段的IO個折疊和排列結構的主鏈顯示。從62 70位氨 基酸的片段含有發(fā)色團形成性氨基酸(T66、 Y67和G68),涂上藍色。該多 肽的C-末端由于與該分子的其它部分接觸數(shù)目少而非常易變形，因此以忽略 其對應氨基酸的方式來進行排列。圖2D.DMD折疊的EGFP大片段(藍色)之 一和全長EGFP(黃色)的主鏈排列。在此，兩種多肽中發(fā)色團形成性殘基顯 示為紅色。圖2E.折疊的EGFP大片段的各個殘基的均方根偏離(RMSD)。發(fā) 色團形成性殘基在陰影區(qū)，它們的空間排列十分固定，偏離值小于2。
圖3A-3C:克隆的EGFP片段的光譜特征。圖3 A.含有EGFP大片段(泳道 l)和EGFP小片段(泳道2)的示例性蛋白樣品的SDS-PAGE分析(15 % PAGE),該蛋白在大腸桿菌中過表達，并用內(nèi)含肽自剪接技術進行分離。泳 道M對應于蛋白分子量梯度。EGFP大片段和EGFP小片段分別可見于約 15kD和約10kD條帶(用紅色星號標記)。EGFP小片段特別純，EGFP大片
段稍微受到內(nèi)含肽(約25 kD)和未分裂的融合物(約40 kD)污染。圖3B.具有 EGFP大片段(曲線l)和(曲線2)EGFP小片段的蛋白樣品的吸收光譜。所述 蛋白樣品用兩個典型光譜來表示(對應于pH 7.4的PBS緩沖液中40 )iM的 EGFP片段)，顯示在每一波長下的吸收范圍。曲線3:40一鏈霉抗生物素； 插圖:2pMEGFP。圖3C. EGFP大片段(PBS緩沖液中濃度為2 pM, pH 7.4) 的熒光激發(fā)光譜(曲線i)和發(fā)射光鐠(曲線2)。
圖4A-4B:DNA雜交驅(qū)動的光學納米開關的組裝和性能。圖4A:含量增 加的生物素化的EGFP片段與固定含量的鏈霉抗生物素(2嗎；60-kD條帶) 結合的凝膠移位分析(SDS-10。/。PAGE)。紅色箭頭指示所得到的比例為1:1 的復合物的蛋白量(70-75-kD條帶)，對應于生物素化的產(chǎn)量^70%。圖4B. 表明形成圖l描述的1:1:1三分子構建物的凝膠移位分析(10。/。PAGE),并且 所述三分子構建物包含EGFP大片段或小片段、鏈霉抗生物素和相應的寡核 苦酸。泳道1和2:結合到鏈霉抗生物素上的EGFP大片段缺乏(1)或存在(2) 時的生物素化寡核苷酸1;泳道3和4:結合到鏈霉抗生物素上的EGFP小片 段缺乏(1)或存在(2)時的生物素化寡核苷酸2; M:20-bp大小的標記物。紅色 箭頭標記出所需要的寡核苷酸-蛋白復合物的位置，如所預期，該復合物大 大上移。圖4C.完整的EGFP(1)和基于分裂EGFP的蛋白復合物(2)的熒光譜， 該復合物從三分子構建物中通過DNA雜交重組，每一光譜均是在pH 7.4的 PBS緩沖液中于約200 nM濃度下測定的(混合后20分鐘記錄光譜)。曲線3: 與樣品2相同，添加IOO倍過量的兩種互補性寡核苷酸之一(非生物素化寡 核苷酸1)。曲線4:含有偶聯(lián)到鏈霉抗生物素上但是無寡核苷酸的兩種EGFP 片段的對照。插圖顯示在524nm下記錄的樣品2中的熒光產(chǎn)生時程。圖4D. Mg+2陽離子對完整的EGFP (藍色)和對含有雙鏈體DNA的重新組裝的分裂 EGFP復合物(紫色)的作用。1欄:無Mg+2; 2和3欄:加入2 mM Mg"后的2 分鐘和3小時。
圖5:全長EGFP比其大片4殳更穩(wěn)定。該圖顯示EGFP大片段(aka a結構 域)與全長EGFP相比的折疊熱力學；全長EGFP明顯具有更高的轉(zhuǎn)變溫度 TF。顯然，穩(wěn)定性的提高是EGFP大片段和EGFP小片段相互作用的結果。 因此，EGFP較小結構域的存基本上穩(wěn)定了所述完全大小蛋白的折疊。折疊 EGFP的結構X-射線結構(PDB碼Ic4f; S65T GFP突變體/pH 4.6);我們認 為這種構象是EGFP的天然折疊，因為該結構與一些其它EGFP的X-射線結
構之間的差別較小。例如PDB Ic4f和PDB lemg (S65T GFP突變體/pH 8.0) 之間的rmsd僅為0.18A。
圖6:全長EGFP具有兩種折疊-未折疊的中間狀態(tài)。這兩個圖顯示EGFP 的準均衡未折疊，這是用Berendsen's自動調(diào)溫裝置31通過準均衡加熱DMD 模擬研究得出的。從折疊狀態(tài)開始，所述蛋白系統(tǒng)的溫度從T尸0.6〈IV開始 緩慢升高到Th-0.8〉TV。我們進行了 EGFP的IO個未折疊模擬。典型曲線 被顯示(上面)；在平均折疊路徑(下面)中觀察到兩種未折疊中間狀態(tài)， 和//。從10個準均衡EGFP未折疊模擬中獲得了類似結果。
圖7:未折疊中間狀態(tài)/,(左方快照)對應于未巻曲的N-末端卩鏈，并且 第二種未折疊中間狀態(tài)//(右方快照)對應于未折疊的幾乎整個EGFP較大 結構域(淺色)，其C-末端與EGFP的較小結構域(深色)相互作用。
發(fā)明的實施方式
本發(fā)明已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一種快速實時蛋白互補的新方法，包括體外活化的分裂 多肽片段的制備方法。該方法還涉及使用活化的分裂多肽片段的蛋白互補 (這也凈皮稱作為生物分子構建物)，實時檢測核酸分子和核酸雜交，或者非核 酸分析物。在本發(fā)明中，本發(fā)明人已經(jīng)公開制備處于就緒狀態(tài)度活化的分裂 多肽片段，其中如果與類似的活化的互補分裂多肽片段緊密接近時，立即形 成活性蛋白。還公開了將熒光蛋白分裂成活化的分裂熒光蛋白的方法。制備 處于就緒狀態(tài)和活性構象中的活化的分裂多肽片段，能夠?qū)崿F(xiàn)實時蛋白互 補，而用于以前的蛋白互補方法中的無活性分裂多肽片段需要發(fā)生結構變形 來形成活性蛋白。本發(fā)明的方法使用活化的分裂多肽片段，使得實時蛋白互 補是快速、靈敏和可逆的。
在一個實施方案中，本發(fā)明的方法包括在微生物宿主細胞中表達編碼第 一和第二多肽片段的核酸，形成內(nèi)含體。該內(nèi)含體能夠進行正確的蛋白折疊， 從而含有比傳統(tǒng)純化方法更接近于體內(nèi)狀態(tài)的折疊狀態(tài)的蛋白?；谝阎?術，可以使用其它手段，例如具有嚢泡的細胞。例如，內(nèi)含體能夠生成處于 已經(jīng)激活狀態(tài)的分裂多肽蛋白。收集內(nèi)含體，溶解并再溶解來獲得分裂多肽 蛋白片段。 活化的分裂多肽片段
活化的分裂多肽片段可以是任何多肽，它們緊密接近時發(fā)生結合，生成 一種蛋白，這可以用組裝的多肽片段而不是單個多肽片段識別的任何方法來 檢測。在本發(fā)明的一個實施方案中，該方法包括對分裂多肽片段進行設計， 使得它們重組時立即具有活性。
活化的分裂多肽片段可以是任何多肽，它們緊密接近時發(fā)生結合，生成 一種活性蛋白，這可以用組裝的活性蛋白而不是單個多肽片段識別的任何方 法來檢測。例如，兩個多肽再聚集生成具有酶促活性的蛋白，生成具有顯色 活性或者熒光活性，或者產(chǎn)生能夠被抗體識別的蛋白。此外，它們被設計成 處于活性狀態(tài)，并且準備好(即處于就緒狀態(tài))重組成活性蛋白，以使得任何 延遲時間最小化，這種延遲時間通常存在于體外和體內(nèi)的蛋白互補中。
在一個實施方案中，活化的分裂多肽片段是熒光蛋白或多肽。在這種實 施方案中，活化的分裂熒光蛋白片段之一含有成熟的預先形成的發(fā)色團，該 發(fā)色團準備好并處于就緒狀態(tài)，以在與其同類的活化的分裂熒光性片段互補 時立即產(chǎn)生熒光。例如，使用含有這種分裂熒光的片段的內(nèi)含體，該片段約 包括充分折疊的熒光蛋白的大約一半，具有正確折疊的成熟發(fā)色團，不單獨 發(fā)出熒光，但是準備好在與其同類配對結合時發(fā)出熒光。
在一個這種實施方案中，組裝的蛋白是綠色熒光蛋白(GFP)，經(jīng)修飾的 GFP,例如EGFP或者GFP樣熒光蛋白或者本領域技術人員知曉的任何其它 天然的或遺傳工程化的熒光蛋白，包括但是不限于CFP、 YFP和RFP。
在一些實施方案中，同類的非熒光多肽片段與含有成熟發(fā)色團的分裂熒 光性片段結合，包含一種以上的活性非熒光性片段。這種活化的非熒光多肽 通常通過在適當位置上分裂熒光蛋白的編碼核苷酸序列，并獨立地表達各個 核苷酸序列片段?；罨姆至褵晒獾鞍灼慰梢詥为毐磉_或者與一種或多種 蛋白融合伴侶融合表達。
在本發(fā)明的實施方案中，重組的活性蛋白包括活化的分裂EGFP片段， 其中第一個片段是EGFP的N-末端片段，包括從氨基酸編號1到大約氨基酸 編號158的連續(xù)氨基酸鏈。將C-末端半胱氨酸添加到該片段上，有助于在表
達后與各種核酸結合基序結合。第二種活化的分裂EGFP片段是從大約M 酸編號159到氨基酸編號239的連續(xù)氨基酸鏈。也可以添加N-末端半胱氨 酸。
氨基酸1是指EGFP的第一個氨基酸。氨基酸239是指GFP的最后一個 氨基酸。所有殘基按照野生型維多利亞水母(A.victoria) GFP(GenBank登 陸號M62653; SEQ ID NO 7)的編號進^f編號，該編號也應用于同源序列的 相應位置上。因此，當使用截斷的GFP(相比于野生型GFP)或者使用具有額 外氨基酸的GFP時，編號進行相應改變。
綠色熒光蛋白(GFP)是一種長238個氨基酸的蛋白，來自維多利亞水母 (Aequorea Victoria)(參見SEQ ID NO: 8的mRNA序列)。但是，也已經(jīng)從 腔腸動物門的其它成員中分離得到焚光蛋白，例如，乂人香菇珊瑚(Discosoma sp.)分離得到紅色熒光蛋白(Matz， M.V.等人，1999, Nature Biotechnology 17:969-973)，從海洋腔腸分離得到GFP,從RenillaMuelleri分離得到GFP 或者從其它動物、真菌或植物中分離得到熒光蛋白(美國專利No.US 7， 109,315)。 GFP以各種被修飾的形式存在，包括Heim等人公開的GFP的 藍色熒光變體(BFP)(Heim, R.等人，1994, Proc.Natl.Acad.Sci. 91 :26, 12501-12504)，它是野生型GFP的Y66H變體；具有S65G， S72A和T203Y 突變的GFP的黃色熒光變體(YFP)(WO98/06737);具有Y66W顏色突變和 任選的F64L， S65T， N1461, M153T, V163A折疊/溶解性突變的GFP的藍 色熒光變體(GFP)(Heim， R., Tsien, R.Y.(1996) Curr.Bio1.6, 178-182)。最 廣泛使用的GFP變體是EGFP,具有F64L和S65T突變(WO 97/11094和 WO96/23810),并在第一個Met后插入一個纈氨酸殘基。F64L突變是發(fā)色 團上游的位置1上的氨基酸。當GFP在高于約3(TC下在細胞中表達時，含 有這些折疊突變的GFP增強了熒光強度(WO 97/11094)。所有上面提及的熒 光蛋白及其功能性片段被包括來用于本發(fā)明中。還包括本領域技術人員知曉 的那些熒光蛋白及其片段。
在選擇性的實施方案中，重組的熒光蛋白包括活化的分裂熒光性片段， 該片段選自綠色熒光蛋白(GFP)、增強的綠色熒光蛋白(EGFP)、綠色熒光 樣蛋白、黃色熒光蛋白(YFP)、增強的黃色熒光蛋白(EYFP)、藍色熒光蛋白 (BFP)、增強的藍色熒光蛋白(EBFP)、藍綠色熒光蛋白(CFP)、增強的藍綠色 熒光蛋白(ECFP)或紅色熒光蛋白(dsRED)，其中重組熒光蛋白中的片段之一 含有成熟的預先形成的發(fā)色團。所有上面提及的熒光蛋白及其將生成發(fā)出熒 光的熒光蛋白的片段被用于本發(fā)明中。本發(fā)明還包括本領域技術人員知曉的 那些熒光蛋白及其片段和遺傳工程化的蛋白。
在選擇性的實施方案中，重新組裝的熒光蛋白包括來自光譜截然不同的 熒光蛋白的活化的分裂熒光性片段。重組的活性熒光蛋白具有截然不同的和 /或獨特的光譜特征，這取決于用于互補的活化的分裂熒光性片段。例如，將 來自用于多色生物分子熒光互補的不同熒光蛋白的片段，實現(xiàn)多色熒光互補 (multicolor BiFC)(參見Hu等人，Nature Biotechnology, 2003; 21: 539-545; Kerppola, 2006, 7: 449-456, Hu等人，Protein-Protein Interaction (P.Adams 和E.Golemis編津?qū)?，Cold Spring Harbor Laboratory Press.2005,在》匕全文引 入作為參考)。本發(fā)明中包括使用來自用于多色實時熒光的活化的分裂熒光 性片段，其中片段之一含有預先形成的成熟發(fā)色團。
在一個實施方案中，可用流式細胞J義、熒光平^1讀卡器、熒光計、顯《數(shù) 鏡、熒光能量共振轉(zhuǎn)移(FRET)，通過肉眼，或用本領域技術人員知曉得其它 方法檢測熒光蛋白。在選擇性的實施方案中，用焚光激活細胞篩選器(FACS) 或延時顯微鏡，通過流式細胞計數(shù)檢測熒光。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，活化的分裂多肽片段緊密接近結合，形 成一種組裝的活性酶，該酶用酶活性分析來4全測。優(yōu)選地，通過顯色反應或 焚光反應來4企測酶活性。在一個優(yōu)選的實施方案中，該酶是二氫葉酸還原酶 (DHFR)或p-內(nèi)酰胺酶。
在另一個實施方案中，該酶是二氳葉酸還原酶(DHFR)。例如，Michnick 等人開發(fā)出一種由DHFR的N-末端片段和C-末端片段組成的"蛋白互補分 析物"，該片段單獨不具有任何的酶促活性，但是緊密接近時形成一種功能 性酶。參見例如美國專利No.US6，428,951 ， US6，294,330和US 6,270,964， 在此引入作為參考。檢測DHFR活性的方法包括本領域公知的顯色方法和熒 光方法。
在選擇性的實施方案中，可以使用其它的分裂多肽。例如，催化基底轉(zhuǎn) 化為可檢測產(chǎn)物的酶。多個這種用于分裂多肽重新組裝的系統(tǒng)包括但是不限
于p-半乳糖香酶(Rossi等人，1997, PNAS， 94: 8405-8410); 二氯葉酸還原 酶(DHFR)(Pdletier等人，PNAS, 1998; 95: 12141-12146); TEM-l卩-內(nèi)酰 胺酶(LAC)(Galameau等人，Nat.Biotech.2002; 20: 619-622)以及螢火蟲焚 光素酶(Ray等人，PNAS, 2002， 99: 3105-3110和Paulmurugan等人，2002; PNAS, 99: 15608-15613)的重新組裝。例如，分裂的P-內(nèi)酰胺酶已經(jīng)用于 檢測雙鏈DNA(參見Ooi等人，Biochemistry, 2006; 45: 3620-3525)。本發(fā) 明包括使用活化的分裂多肽片段進行實時信號檢測，其中該片段處于充分折 疊的成熟構象中，互補時能夠進行快速的信號檢測。
在本發(fā)明的另 一個實施方案中，活化的分裂多肽片段結合可以 形成被組裝的蛋白，該蛋白含有一個不連續(xù)的抗原表位，可用特異性識別被 組裝蛋白上的該不連續(xù)抗原表位但是不識別位于任一個別多肽上的部分抗 原表位的抗體來檢測。不連續(xù)抗原表位的一個例子存在于HIV的gpl20中。 本領域技術人員基于公知技術能夠容易地制備這些抗原表位和其它衍生物， 篩選識別被組裝的蛋白的抗體，該抗體不是通過被組裝蛋白的任一蛋白片段 識別該蛋白。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，活化的分裂多肽可以是相互作用形成組 裝的蛋白的分子。例如，分子可以是蛋白片段，或二聚體或多聚體的亞單位。
對編碼感興趣的分裂多肽片段的核酸序列和密碼子進行優(yōu)化，例如將密 碼子轉(zhuǎn)化為優(yōu)先用于期望系統(tǒng)中的密碼子，例如用于哺乳動物細胞中。在非 哺乳動物細胞中表達蛋白的優(yōu)化密碼子在本領域中也是已知的，當宿主細胞 不是哺乳動物細胞(例如昆蟲細胞)時，可以使用這些密碼子。
本發(fā)明的活化的分裂多肽包括任何期望的額外修飾。例如，在一個實施 方案中，活化的分裂多肽還包括柔性接頭，該接頭偶聯(lián)到核酸結合部分上。
熒光性片段和內(nèi)含體的表達
已有大量出版物公開了通過內(nèi)含體途徑在微生物/原核生物中重組制備蛋 白。這種綜述資料的例子為Misawa， S.等人，Biopolymers 51 (1999) 297-307; Lilie， H.， Curr. Opin. Biotechno1.9(1998)497-501; Hockney， R.C., Trends Biotechnol. 12( 1994)456-463 。
在孩t生物和/或原核生物中過表達本發(fā)明的肽。過表達導致內(nèi)含體形成。 在宿主細胞中，起始密碼子編碼的曱硫氨酸主要是在表達/翻譯過程中被去 除。在現(xiàn)有技術中，在微生物/原核生物中過表達蛋白的一般方法已經(jīng)是公知
的了。本領域中的出版物的例子是Skelly， J.V.等人，Methods Mol.Biol.56(1996)23-53; Das， A., Methods Enzymol. 182(1990)93-112;和 Kopetzki, E.等人，Clin.Chem.40( 1994)688-704。
如在此所用，原核生物中的過表達是指用具有啟動子的優(yōu)化表達盒進行 表達(美國專利No.US 6,291,245)，啟動子如tac或lac啟動子(EP-B 0067 540)。 通常，這可以用含有化學誘導型啟動子或者溫度改變誘導型啟動子的載體來 實施。對于大腸桿菌有用的啟動子是溫度壽文感型X-PL啟動子(EP-B 0 041 767)。更有效的啟動子是tac啟動子(美國專利No. US4, 551， 433)。原核生 物例如大腸桿菌的這種強大的調(diào)控信號通常是由攻擊細菌的抗菌素產(chǎn)生的 (參見Lanzer, M.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85 (1988) 8973-8977; Knaus, R.和Bujard, H.， EMBO Journal 7(1988)2919-2923;涉及XT7啟動子Studier, F.W.等人，Methods Enzymol. 185(1990)60-89);涉及T5啟動子EP-A 0 186 069; Stuber, D.等人,System for high-level production in Escherichia coli and rapid application to epitope mapping, preparation of antibodies, and structure-flinction analysis; Immunological Methods IV(1990)121-152)。
通過使用這種過度生產(chǎn)的原核細胞表達系統(tǒng)，本發(fā)明的肽以至少占細胞 總表達蛋白的10%的水平被生產(chǎn)，通常為30-40%,而有時高達50%。
本文所使用的"內(nèi)含體"(IBs)是指編碼核酸在微生物/原核生物中過表達后 重組生成的不溶形式的多肽。
優(yōu)選用pH約9或更高的水溶液溶解內(nèi)含體。最優(yōu)選pH為10或更高。 溶解時添加去垢劑或變性劑不是必需的。優(yōu)化的pH容易確定。由于強堿性 條件可能會使多肽變性，顯然存在優(yōu)化的pH范圍。優(yōu)化的范圍在pH9到 pH12之間。
編碼熒光性肽的核酸(DNA)可以用現(xiàn)有技術中的已知方法來制備。更為 優(yōu)選的是用其它調(diào)控元件和轉(zhuǎn)錄元件來擴充該核酸序列，以優(yōu)化宿主細胞中 的表達。適合表達的核酸(DNA)優(yōu)選通過化學合成來制備。這種方法是本領
域技術人員熟悉的，在例如Beattie, K丄.和Fowler, R.F., Nature 352(1991)548-549; EP國B 0 424 9卯；Itakura， K.等人，Science 198(1977)1056-1063中有描述。對本發(fā)明的肽的核酸序列進行修飾也是有利 的。
這種修飾例如是，但是不限于；修飾核酸序列來導入限制性酶的不同識 別序列，為連接、克隆和誘變的步驟提供便利；修飾核酸序列來為宿主細胞 引入優(yōu)選密碼子；用其它調(diào)控元件和轉(zhuǎn)錄元件來延長核酸序列，以優(yōu)化宿主 細胞中的基因表達。
對合成感興趣的蛋白的密碼子進行優(yōu)化，將它們轉(zhuǎn)換成在期望系統(tǒng)中優(yōu) 選使用的密碼子，如在哺乳動物細胞中。在非哺乳動物細胞中表達蛋白的優(yōu) 化密碼子也是已知的，當宿主細胞不是哺乳動物細胞(如昆蟲細胞)時，使 用這些優(yōu)化密碼子。
分裂多肽分子
本發(fā)明還包括用本文描述的方法制備的活化的分裂多肽分子，也被稱作 為生物分子偶聯(lián)物。在一個實施方案中，活化的分裂多肽分子包含具有顯色 活性或熒光活性的酶的分裂多肽。在一個實施方案中，該酶是二氬葉酸還原 酶或者P-內(nèi)酰胺酶或熒光素酶。在一個實施方案中，熒光蛋白是GFP或GFP 才羊熒光蛋白。
在一些實施方案中，該分子的活化的分裂多肽還包含核酸結合基序或核 酸結合部分。當存在耙核酸時，核酸結合部分結合到核酸靼序列上，便于活 化的分裂多肽片段結合形成一種活性蛋白。
在選擇性的實施方案中，該分子的活化的分裂多肽還包含非核酸分析物 的結合基序。當存在靶點分析物時，通常是非核酸分析物，分析物結合基序 結合到靶點分析物上，便于活化的分裂多肽片段結合形成一種活性蛋白。
在另一個實施方案中，活化的分裂多肽分子是分裂的熒光分子。在這種 實施方案中，該分子至少包含兩個活化的分裂熒光性片段，其選自GFP、 GFP樣熒光蛋白、熒光蛋白及其變體。分裂熒光性片段之一包含成熟的預先形成的發(fā)色團，該發(fā)色團是有活性的，但是在分離片段中處于無熒光狀態(tài)。
當活化的熒光性片段，當它們相互結合時，包含了產(chǎn)生熒光所需的(3鏈的完 全補充，但它們自己本身不熒光。該分子的各個活化的分裂熒光性片段還包 括核酸結合基序。核酸結合基序結合到靶核酸上，便于至少兩個活性分裂熒 光性片^:結合，并且活性熒光蛋白重組和實時熒光顯性
核酸結合部分
各個分裂多肽分子的核酸結合部分是可以結合到靶核酸上的任何分子。 在一些實施方案中，核酸結合部分包括核酸、核酸類似物和多肽。在一個實 施方案中，核酸結合部分是寡核苷酸。 一對特定活化的分裂多肽片段的核酸 結合部分可以是相同種類的分子，例如寡核苦酸，或者它們可以是不同的， 例如活性蛋白包含的一對分裂多肽中的一個具有寡核苷酸核酸結合部分，而 其它成員具有多肽核酸結合部分。
核酸結合部分是可以偶聯(lián)到另 一個分子例如多肽上的任何分子，并且在 緊密接近時能夠結合到靶核酸上。在一個實施方案中，核酸結合部分是核酸 或核酸類似物，例如，寡核苦酸。在本發(fā)明的另一個實施方案中，核酸結合 部分是結合核酸的多肽或蛋白，其與具有高親合性靶核酸相互作用。核酸類 似物包括，例如^f旦是不限于，肽核酸(PNA)、假互補PNA(pcPNA)、鎖定核 酸、嗎啉DNA、硫代磷酸DNAs和2'-0-曱氧基曱基-RNAs，鎖定核酸(LNA) 是含有2'-0，4'-C亞甲基鍵的核酸類似物。
核酸結合部分能夠結合單鏈靶點上的相同雜交位置，在雜交位置上產(chǎn)生 三鏈體。選擇性地，核酸結合部分能夠接近地結合到單鏈或雙鏈耙核酸上的 緊密相鄰雜交位置，分別在各個雜交位置上生成二鏈體或三鏈體。
在實施方案中，核酸結合部分是核酸，核酸結合部分的長度應該足夠長， 以使其互補結合到核酸革巴點上，當兩個探針部分結合到靶核酸上時，應當使 得分裂多肽片段之一與相應的分裂多肽片段相互作用。例如，核酸結合部分 探針可以長5-30個石威基。更優(yōu)選為長5-15個堿基。
在形成三鏈體的實施方案中，核酸結合部分可以是允許形成三鏈體的任
何核酸。優(yōu)選形成三鏈體的寡核苷酸是富含GC的，優(yōu)選的三鏈體是噤呤三 鏈體，由嘧啶-噤呤-嘌呤組成。
一種優(yōu)選形成三鏈體的寡核香酸是富含GC的，優(yōu)選的三鏈體是噤呤三 鏈體，由嘧啶-噤呤-嘌呤組成。
核酸結合部分可以選自由寡核苷酸、單鏈RNA分子和肽核酸(PNA)、包 括假互補PNAs(pcPNA)的肽核酸(PNAs)、鎖定核酸(LNA)和其它核酸類 似物。
在一個實施方案中，核酸結合部分是寡核苷酸。設計和合成寡核苦酸的 方法在本領域是公知的。寡核苦酸有時被稱作為寡核苦酸引物。
用于本發(fā)明中有用的寡核苷酸可以用已經(jīng)建立的寡核苷酸合成方法來合 成。合成寡核苷酸的方法在本領域是公知的。這種方法的范圍從標準的酶消 化后核苷片段分離(參見例如，Sambrook等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual,第二版，Cold Spring Harbor, N.Y., (1989), Wu等人， Methods in Gene Biotechnology(CRC Press, New York, N.Y.， 1997), 以及 Recombinant Gene Expression Protocols, in Methods in Molecular Biology, 第 62巻，(Tuan編輯，Humana Press, Totowa, N丄，1997),它們的7>開內(nèi)容 在此引入作為參考)到純粹的合成方法，例如，使用Milligen or Beckman系 統(tǒng)lPlus DNA合成4義(例如，Milligen-Biosearch的8700型自動合成4義， Burlington, Mass.或者ABI Model 380B)通過氰乙基亞磷酰胺法合成。用于制 備寡核苦酸的合成方法在Ikuta等人，Ann.Rev.Biochem. 53:323-356 (1984)(磷 酸三酯及亞磷酸三酯法)和Namng等人，Methods Enzymol., 65:610-620 (1980) (磷酸三酯法)中也有描述。
對在此描述的許多寡核苷酸進行設計，與其它寡核苷酸或核酸的特定部 分互補，使得在它們之間形成穩(wěn)定的雜合物。這些雜合物的穩(wěn)定性用已知方 法計算，如Lesnick和Frder， Biochemistry 34:10807-10815(1995)， McGraw 等人，Biotechniques 8:674-678 (19卯)以及Rychlik等人，Nucleus Acid Res. 18:6409-6412( 1990)中描述的那些方法。
在一個實施方案中，核酸結合部分是單鏈RNA分子。用于設計和合成單 鏈RNA分子的方法在本領域是7>知的。
在一些實施方案中，核酸結合部分是肽核酸(PNAs)，包括假互補 PNAs(pcPNA)。用于設計和合成PNAs和pcPNAs的方法在本領域是公知的。 肽核酸(PNAs)是DNA的類似物，其中主鏈是假肽，而不是糖。因此，其行 為效仿DNA,并結合互補的核酸鏈。在肽核酸中，寡核苷酸的脫氧核糖磷 酸主鏈已經(jīng)被更類似于肽而非糖磷酸二酯的主鏈替代。每個亞單位具有連接 到該主鏈上的天然存在的或非天然存在的堿基。通過酰胺鍵連接的N-(2-氨 乙基)甘氨酸重復單位來構建這種主鏈。
PNA結合DNA和RNA。生成的PNA/DNA或者PNA/RNA 二鏈體比相 應的DNA/DNA或DNA/RNA二鏈體具有更高度親合性和特異性。此外，它
蛋白酶識別，因此與DNA和肽不同，PNA能夠抵抗酶的降解作用。PNA鏈 能夠以平行方向或反平行方向結合到DNA或RNA鏈上。PNA結合單鏈DNA 和雙鏈DNA。
為了解決傳統(tǒng)PNA的序列限制，開發(fā)了假互補PNAs(pcPNAs)。除了鳥 嘌呤和胞嘧。定外，pcPNA，s分別攜帶2， 6-二氨基嘌呤(D)和2-硫脲嘧啶，而 非腺嘌呤和胸腺嘧啶。pcPNAs具有迥然不同的結合模式，雙二鏈體入侵， 這是基于Watson-Crick識別原理，并補充了假互補的概念。pcPNAs識別并 與其天然的A、 T、 (U)或G、 C配對物結合。pcPNAs可以按照本領域知曉 的任何方法來制備。例如，化學組裝PNAs的方法是公知的(參見，美國專利 No.US5,539，082, US5，527，675, US 5，623，049， US5，714，331, US5,736，336， US5，773,571或US5，786，571,在此引入作為參考)。
本發(fā)明的其它實施方案提供核酸結合部分，該部分是多肽或肽。多肽可 以是對耙核酸具有高親合性的任何多肽。在該實施方案中，耙核酸可以是雙 鏈的、三鏈的或者單鏈的DNA或RNA。在一些實施方案中，多肽是肽,少于 100的氨基酸，或者全長的蛋白。多肽與靶核酸的親合性范圍從毫微摩爾到 高的微微摩爾。多肽包括含有鋅指的多肽，可以是天然的或者通過理性設計 或篩選獲得的。鋅指的例子包括Zif2g8、 Spl、 Gfi-1的鋅指5、 YY1的鋅指
3、CF2 II的鋅指4和6、以及TTK的鋅指2 (PNAS (2000) 97: 1495-1500; J Biol Chem (20010 276 (21): 29466-78; Nucl Acids Res (2001) 29 (24) :4920-9; Nucl Acid Res (2001) 29(11): 2427-36)。其它多肽包括體外選擇獲得的多肽，它們 結合特定的核酸序列。這種適體的例子包括血小板來源的生長因子 (PDGF)(Nat Biotech (2002) 20:473-77)和凝血酶(Nature(1992) 355: 564-6)。還 有其它多肽是體外結合DNA三鏈體的多肽。例子包括異核糖核酸顆粒 (hnRNP)蛋白的成員，例如，hnRNPK, L， El， A2/B1和I(Nucl Acids Res (2001)29(11): 2427-36)。
對于包含多肽作為核酸結合部分的分裂多肽片段來說，整個分裂多肽片 段以及核酸結合部分分子可以由單個構建物編碼，包括多肽部分、接頭和核 酸結合部分多肽。該構建物可以在細胞中表達，或者顯微注射到細胞中。這 些構建物還可用于體外檢測感興趣的核酸。
核酸耙點
通過產(chǎn)生與互補復合物形成相關的可斥全測信號，本發(fā)明的方法可用于枱r 測單鏈核酸靶點或雙鏈核酸的存在。
核酸靶點可以是含有雜交部位的任何核酸，該雜交部位用于核酸結合部 分結合活化的分裂多肽片段上。例如，靶核酸可以是DNA、 RNA或核酸類 似物。靶核酸可以是單鏈或雙鏈的。靶核酸可以在體內(nèi)或體外被)險測。在一 個實施方案中，本發(fā)明的方法用于體外檢測靶核酸，活化的分裂多肽相互作 用生成具有顯色活性和/或熒光活性的活性蛋白。在一些實施方案中，多肽編 碼GFP、被修飾的GFP,例如，GFP樣熒光蛋白的EGFP,或者任何其它天 然或遺傳工程化的熒光蛋白，包括CFP、 YFP和RFP。
在另一個實施方案中，核酸結合部分結合到靶核酸的兩個相鄰序列上， 使得一個核酸結合部分結合到一個耙序列上，而第二個核酸結合部分結合到 另一個耙序列上。在該實施方案中，相鄰序列相互之間足夠接近，使得當相 關核酸結合部分結合到靶點上時相關活化的分裂多肽片段發(fā)生相互作用，組 裝活性蛋白。該實施方案提供了對單鏈和雙鏈靶核酸進行檢測。為了檢測雙 鏈耙點，單鏈探針與雙鏈靶點相互作用而形成三鏈體。
任何來自樣品的核酸靶點可用于實施本發(fā)明，包括但是不限于真核生物
的、原核生物的和病毒的DNA或RNA。在一個實施方案中，輩巴核酸是分離 自患者的基因組DNA的樣品。該DNA可以從任何細胞來源或體液中獲得。 臨床實踐中可獲得到細胞來源的非限制性例子包括血細胞、口腔細胞、子宮 頸陰道細胞、來自尿液的上皮細胞、胎兒細胞或者任何存在于通過活檢獲得 的組織中的細胞。體液包括血液、尿液、腦脊髓液、4青液和感染部位或炎癥 部位的組織流出物。在另一個實施方案中，在樣品中直4妻;險測DNA，無需 任何額外的純化。在另一個實施方案中，用本領域眾多標準方法中的任何一 種，從細胞來源或體液中提取DNA。應當理解，用于提取DNA的特定方法 將取決于來源的性質(zhì)。在某些實施方案中，被提取用于本發(fā)明中的DNA的 含量至少為5pg(對應于約1個基因組大小為4xl0、咸基對的細胞等價物)。
在一個實施方案中，在暴露于互補復合物的成分之前，對靶核酸進行擴 增。可以使用擴增核酸靶點的任何方法，包括生成在同一雜交部位上具有多 樣性的單鏈核酸的方法。擴增反應可以是聚合酶鏈式反應(PCR)、連接^ 式反應(LCR)、鏈置換擴增(SDA)、轉(zhuǎn)錄介導擴增(TMA)、 Q卩-復制酶擴增 (Q-beta),或者滾環(huán)擴增(RCA)。
在一些實施方案中，使用PCR擴增核酸靶點。
可使用任何能夠合成所期望核酸的聚合酶。優(yōu)選聚合酶包括但是不限于 測序酶、Vent和Taq聚合酶。優(yōu)選地，使用高保真的聚合酶(例如，Clontech HF-2)，使得聚合酶導入的突變最小化。
在另 一個實施方案中，用滾環(huán)擴增(RCA)生成在相同雜交部位上具有多樣 性的單鏈DNA耙點。滾環(huán)擴增(RCA)是一種等溫處理方法，生成多拷貝序 列。在體內(nèi)滾環(huán)DNA復制中，DNA聚合酶在環(huán)狀模板上延伸引物(Romberg， A.和Baker， T.A.DNA Replication, W.H.Freeman， New York, 1991)。產(chǎn)物 由串聯(lián)的模板互補序列拷貝組成。RCA已經(jīng)是一種以適合體外DNA擴增的 方法(Fire， A.和Si-QunXu, Proc.Natl.Acad Sci.USA, 1995, 92:4641-4645; Lui， D.等人,J.Am.Chem. Soc， 1996, 118:1587-1594; Lizardi, P.M.等人， Nature Genetics, 1998， 19:225-232; Kool的美國專利No.US 5,714,320)。 在另 一個實施方案中，分裂多肽分子包含核酸結合基序，可用于免疫RCA (免疫滾環(huán)擴增)和免疫PCR中進行核酸^r測。在這種實施方案中，分裂多肽 分子的核酸結合基序成分^f更于在存在PCR產(chǎn)物時指示物蛋白分子的重新組 裝，用于實時體外免疫PCR方法中。此外，在另一個實施方案中，指示物 分子的核酸結合成分便于在免疫RCA(滾環(huán)擴增)方法中，存在核酸時，分裂 的指示物分子的重新組裝，從而產(chǎn)生信號，導致體外高度信號放大。
在RCA技術中，具有與擴增耙循環(huán)(ATC)互補區(qū)域的引物序列與ATC結 合。雜交后，酶、dNTP等使引物能夠沿著ATC模板延伸，DNA聚合酶轉(zhuǎn) 移較早的片段，生成單鏈的DNA產(chǎn)物，該產(chǎn)物由重復串聯(lián)的起始ATC序 列單位組成。
RCA技術是本領域中公知的，包括線性RCA(LRCA)。任何這種RCA技 術可用于本發(fā)明中。使用鏈置換因子，如解旋酶，有利于在RCA過程中發(fā) 生鏈置換。通常，任何在存在鏈置換因子時能夠進行滾環(huán)復制的DNA聚合 酶適合用于本發(fā)明的方法中，即使當不存在該因子時DNA聚合酶不能進行 滾環(huán)復制。用于RCA中的鏈置換因子包括BMRF1聚合酶附屬亞單位 (Tsurumi等人，J.Virology 67(12):7648誦7653 (1993))、腺病毒DNA-結合蛋白 (Zijderveld和van der Vliet, J.Virology 68(2):1158-1164 (1994))、單純皰滲病 毒蛋白ICP8 (Boehmer和Lehman, J. Virology 67(2):711-715 (1993); Skaliter 和Lehman, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91(22):10665-10669 (1994))、單鏈DNA 結合蛋白(SSB; Rigler和Romano, J.Biol.Chem. 270:8910-8919 (1995))以及 小牛胸腺解旋酶(Siegd等人，JBiol.Chem.267: 13629-13635 (1992))。在滾環(huán) 復制分析中使用一種聚合酶，可以確定該聚合酶進行滾環(huán)復制的能力，如 Fire和Xu, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:4641-4645(1995)以及Lizardi (美國專 利No.US 5,854,033,例如其中的實施例l)中描述的那些分析。
結合非核酸分析物的結合基序
在一些實施方案中，分裂多肽分子包含結合非核酸分析物的結合基序。 這種基序可以是，例如多肽或肽。在其它實施方案中，非核酸分析物的結合 基序是一種生物分子、有機分子或無機分子。在這種實施方案中，靶點分析
物可以是任何代謝產(chǎn)物、生物分子、有機分子或無機分子。對這些分子的鑒 定是人們已知的或是已有技術以及實施中的普通技術。
在本發(fā)明的實施方案中，本發(fā)明制備的分裂多肽分子和/或分裂焚光蛋白 分子可用于體外實時檢測分析和實時檢測生物分子的相互作用，例如，但是
不限于，病毒核酸和/或基因組的檢測，核酸檢測(RNA、 DNA等)；核酸雜 交，例如，形成核酸二鏈體和三鏈體，包括同型的核酸相互作用(DNA-DNA; RNA-RNA)和異型的核酸相互作用(DNA-RNA等)。在選擇性的實施方案中， 本發(fā)明的分裂多肽分子可用于體外實時檢測非核酸分析物，以及用于實時檢 測非核酸的相互作用，例如生物分子、有機分子無機分子。在一些實施方案 中，本發(fā)明的方法可用于檢測病原性和/或病毒性的生物分子、無機和有機的 病原性和/或病毒性分子。
在這種實施方案中，本發(fā)明涉及用于實時蛋白互補的方法。特別地，本 發(fā)明的方法涉及實時檢測耙核酸分子，包括DNA和RNA靶點，以及核酸類 似物。在這種方法中，通過與核酸結合部分相結合來4企測靶核酸，該核酸結 合部分與活化的分裂多肽結合，其中核酸結合部分與耙核酸結合，使得活化 的分裂多肽緊密接近，立即形成活性蛋白.
在一個實施方案中，與活化的分裂多肽片段結合的核酸結合部分結合到 靶核酸上的兩個相鄰序列上。在該實施方案中，相鄰序列相互足夠接近，使 得當各個關聯(lián)核酸結合部分結合到耙核酸上時，活化的分裂多肽片段相互結 合并組裝成活性蛋白。該實施方案提供對單鏈和雙鏈靶核酸的檢測。為了檢 測雙鏈耙點，單鏈探針與雙鏈耙點相互作用，形成一種三鏈體。
在另一個實施方案中，與活化的分裂多肽片段結合的核酸結合部分是核 酸或寡核苷酸，并結合到單鏈靶核酸上的相同序列上，形成一種三鏈體。在 該實施方案中，當與活化的分裂多肽片段關聯(lián)的核酸結合部分結合到靶點上 時，活化的分裂多肽片段之間相互作用，組裝成互補復合物。
例如，本發(fā)明涉及用于實時蛋白互補的方法。特別地，本發(fā)明的方法涉 及實時檢測把點分析物，包括生物分子、有機分子和無機分子，及其片段或 代謝產(chǎn)物。在這種方法中，靶點分析物通過其分析物結合基序來檢測，該分
析物結合基序與活化的分裂多肽關聯(lián)，其中該基序結合靶點分析物上，使得 活化的分裂多肽緊密接近，立即形成活性蛋白.
在特定的實施方案中，本發(fā)明的方法可用于體外檢測是否存在感興趣的 靶核酸。由于本發(fā)明的方法、試劑盒和組合物涉及特異性檢測靶核酸和靶點 分析物，即使存在非靶點分子，它們尤其適合開發(fā)靈敏而可靠的基于探針雜 交分析，該雜交分析用于分析點突變，或者可靠地檢測靶點分析物。本發(fā)明 的方法、試劑盒和組合物還可用于檢測、量化或分析生物體(微生物)、細 菌、真菌和感興趣的基于遺傳臨床條件。
在一個實施方案中，本發(fā)明提供分離樣品中的靶核酸的方法，即使存在 非把序列。在選擇性的實施方案中，本發(fā)明提供分離樣品中的靶點分析物的 方法。
本發(fā)明的另一個重要方面在于用活化的分裂多肽實時評估核酸雜交和分 析核酸相互作用的用途。在這種實施方案中，本發(fā)明提供實時立即檢測寡核 苷酸雜交的方法，該寡核苷酸作為核苷結合部分偶聯(lián)到活化的分裂多肽蛋白
片段上。例如，局部加熱(如Hamad-Schifferli等人，Nature,第415巻，2002 年1月10日中所述，在此完全引入作為參考)可用于使被結合的寡核苷酸 變性，從而使活化的分裂多肽片段分離并關閉信號和/或熒光。本發(fā)明的活化 的分裂多肽是獨一無二的，因為在于當寡核苷酸處于分離狀態(tài)時，活性蛋白 立即分解，并且信號得以改善。在實施方案中，分裂多肽片段是分裂的熒光 性片段，在核酸雜交時，熒光實時地立即淬滅或得以改善。此外，分裂多肽 也是獨一無二的，因為如果通過寡核苷酸雜交促進再結合時，活性蛋白的信 號(例如熒光)立即重新產(chǎn)生。
在該實施方案中，使用本發(fā)明的分子可以有效地實施和記錄各種需要進 行多次開關循環(huán)的分析中的結果，并且可以實時乂人視覺上觀察核酸雜交事 件。此外，本發(fā)明的方法能夠篩選干擾或促進雜交和/或妨礙核酸雜交循環(huán)事 件的試劑。例如，本發(fā)明的活化的分裂多肽蛋白分子和/或活化的分裂熒光蛋 白分子可用于快速實時篩選干擾雜交或雜交循環(huán)事件的試劑。作為非限制性 例子，本發(fā)明的方法可用于快速篩選特異的抑制性核酸序列，例如，反義核 酸、RNAi、 siRNA、 shRNA、 mRNAi等和/或篩選促進或妨礙這種抑制性核 酸的活性的試劑。在這樣的實施方案中，減少與活化的分裂熒光蛋白關聯(lián)的 結合部分之間雜交的試劑或分子，導致活性蛋白的信號消弱或減少，而促進 結合部分之間雜交的試劑，導致活性蛋白增加。
在另一個實施方案中，分子可用于核酸的實時量化。在相關的實施方案
中，本發(fā)明的方法可用于免疫RCA和免疫PCR方法中。本發(fā)明的另一個實 施方案提供應用實時蛋白互補在體外篩選耙核酸。例如，在其它非耙核酸群 體中鑒定感興趣的靶核酸。在該實施方案中，本發(fā)明的靶核酸或者分裂多肽 分子以被連接到某類固體支持物上的形式使用，無論何種方式都是便捷的。 可以通過某些分子種類連接到這種支持物上，例如某類聚合物生物學的或其 它的，它們將所述引物或ATC連接到固體支持物上，以便沖企測用本發(fā)明的 方法通過滾環(huán)擴增制備的串聯(lián)DNA序列。
用于本發(fā)明方法中的這種固態(tài)基底包括任何固體材料，寡核苷酸可以偶 聯(lián)到該固體材料上。包括材料，如丙烯酰胺、纖維素、硝化纖維、玻璃、聚 苯乙烯、聚乙烯乙酸乙烯酯、聚丙烯、聚曱基丙烯酸酯、聚乙烯、聚氧化乙 烯、玻璃、聚硅酸鹽、聚碳酸酯、聚四氟乙烯、碳氟化合物、尼龍、硅橡膠、 多聚酐、多聚乙醇酸、多聚乳酸、聚原酸酯、聚丙基富馬酸、月交原、粘多糖 和多聚氨基酸。固態(tài)基底具有任何有用形式，包括薄膜或膜、珠、瓶、培養(yǎng) 皿、纖維、編織物、成型多聚體、顆粒和微粒。固態(tài)基底的優(yōu)選形式是玻璃 片或者微量滴定盤(例如，標準的96-孔培養(yǎng)皿)。作為其它排列，參見美國專 利No.US5,854，033中描述的那些。
將寡核苦酸固定在固態(tài)基底上的方法已經(jīng)確立。采用確立的偶聯(lián)方法， 將寡核苷酸連接到基底上，包括尋址探針和檢測探針。例如，合適的連接方 法被描述在Pease等人，Proc.Natl. Acad. Sci. USA 91(11):5022-5026 (1994)中。 將寡核苷酸連接到固態(tài)基底上的優(yōu)選方法被描述在Guo等人，Nucleic Acids Res. 22:5456-5465 (1994)中。
在另一個實施方案中，本發(fā)明的分子可用于量化非核酸分析物。在本發(fā) 明的另一個實施方案中，提供實時蛋白互補用于體外篩選靶點分析物的用 途。例如，用于在其它非靶點分析物的群體中鑒定感興趣的靶點分析物。在 該實施方案中，結合到本發(fā)明的分裂多肽分子上的分析物的結合基序以連接
到某類固體支持物上的形式使用，無論何種方式都是便捷的?？梢酝ㄟ^某些 分子種類連接到這種支持物上，例如某類聚合物，生物學的或其它的，它們
將所述引物或ATC連接到固體支持物上，以便檢測用本發(fā)明的方法通過滾 環(huán)擴增制備的DNA分析物。
本發(fā)明的另 一個重要的實施方案是使用分裂多肽分子體外實時檢測特定 核酸序列的用途。特別的，本發(fā)明可以實時檢測個體中的基因突變、多態(tài)現(xiàn) 象或異常。生物學樣品分離自個體，并提取DNA和/或RNA。對本發(fā)明的 分子進行設計，使得分裂熒光蛋白是結合到寡核芬酸上，該寡核香酸特異于 將要檢測的特定突變、多態(tài)現(xiàn)象或者異常。選擇性地，^f吏用一群分子，其中 許多突變、多態(tài)現(xiàn)象或異常被檢測。在該實施方案中，連接到分裂熒光蛋白 上的寡核苷酸相互互補，因此基線是熒光。然后各個DNA和/或RNA與所 述分子接觸。如果該個體具有特定的突變或多態(tài)現(xiàn)象，DNA和/或RNA會 與分裂熒光分子竟爭，并使熒光降低。優(yōu)選地，在與熒光分子接觸之前對個 體的DNA和/或RNA進行擴增。這在檢測已知多態(tài)現(xiàn)象中的單一核苷多態(tài) 現(xiàn)象是特別有用的。由于熒光4企測的直接性，本發(fā)明分子可用于靈敏^r測。
在一個實施方案中，該分子可用于體外實時^r測病原體。在一個實施方
常，作為存在病原體和/或病原體核酸的結果。在選擇性的實施方案中，本發(fā) 明的分子可用于檢測非核酸分析物的存在，作為感染病原體的結果。病原體 可以是病毒感染、真菌感染、細菌感染、寄生蟲感染和其它感染疾病。病毒 可選自1型單純皰療病毒、2型單純皰滲病毒、細胞巨化病毒、EB病毒、水 痘帶狀皰滲病毒、6型人皰療病毒、7型人皰療病毒、8型人皰滲病毒、天花 病毒、水泡性口炎病毒、曱型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁 型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、鼻病毒、冠狀病毒、流感病毒A、流感病毒B、 麻滲病毒、多瘤病毒、人乳頭瘤病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、柯薩奇病 毒、登革熱病毒、腮腺炎病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、狂犬病病毒、勞氏肉瘤病 毒、黃熱病病毒、埃博拉病毒、馬爾堡病毒、拉沙熱病毒、東方馬腦炎病毒、 日本腦炎病毒、St. Louis腦炎病毒、墨累山谷腦炎病毒、西尼羅河病毒、裂 谷熱病毒、輪狀病毒A、輪狀病毒B、輪狀病毒C、辛德比斯病毒、猿猴 免疫缺陷病毒、I型人T細胞白血病病毒、漢坦病毒、風滲病毒、猿猴免疫 缺陷病毒、l型人免疫缺陷病毒、2型人免疫缺陷病毒。
對靶核酸或靶點分析物的檢測還可用于4企測食物、々大料、水、藥品、個 人護理品、日用品或環(huán)境樣品中的細菌和真核生物。優(yōu)選的飲料包括蘇打水、 瓶裝水、果汁、啤酒、紅酒或酒精飲料。所開發(fā)的分析方法對于原材料、設 備、產(chǎn)品或制造方法的分析是有用的，所述原材料、設備、產(chǎn)品或制造方法 是用于加工或存Y渚食物、飲料、水、藥品、個人護理品、日用品或環(huán)境樣品。
在本發(fā)明的另一個相關實施方案中，組裝活化的分裂熒光的多肽，形成 一個含有不連續(xù)抗原表位的組裝蛋白，該蛋白可用特異性識別組裝蛋白上的 不連續(xù)抗原表位但是不識別存在于任一各個多肽上的部分抗原表位的抗體
來檢測。不連續(xù)抗原表位的一個例子存在于HIV的gpl20中。這些抗原可以 作為指示蛋白用本領域知曉的方法進行后續(xù)檢測，例如免疫檢測。本領域技
術人員基于公知技術能夠容易地制備這些抗原和其它衍生物，篩選識別組裝 蛋白的抗體，該抗體不是通過組裝蛋白的任一蛋白片段識別該蛋白。
靶核酸可以是來自人的。耙核酸可以是DNA或RNA。靶核酸可以是游 離在溶液中或者固定到固體支持物上。
在一個實施方案中，靶核酸或靶點分析物是特異于一種遺傳疾病或者特 異于一種遺傳疾病的傾向。所述疾病可以是，例如，p-地中海貧血、鐮狀細 胞血癥或者Factor-VLeiden、遺傳疾病樣嚢腫性纖維化(CF)、癌相關靶點樣 p53和pl0,或者易感胸癌的BRC-I和BRC-2。而在另一個實施方案中，對 所分離的染色體DNA進行涉及親子關系、身份確定或者犯罪調(diào)查的研究。
革巴核酸或耙點分析物特異于病原體或微生物。選擇性地，把核酸或耙點 分析物可以來自病毒、細菌、真菌、寄生蟲或者酵母；其中互補分子雜交到 耙核酸上，指示樣品中存在所述病原體或微生物。
在另 一個實施方案中，本發(fā)明提供適合檢測樣品中是否存在靶核酸或靶 點分析物和/或其含量的試劑盒。試劑盒至少包含連接到第 一個分子上的第一 探針，和連接到第二個分子上的第二探針，其中探針能夠結合到把核酸中的 雜交序列上。優(yōu)選地，探針裝在小瓶中。試劑盒還包含適合捕獲和/或檢測樣 品中耙核酸或耙點分析物的存在或含量的試劑。用于檢測耙核酸和/或靶點分 析物的存在和/或含量的試劑可以包含酶活性試劑或者特異于組裝的蛋白的 抗體。該抗體可以是被標記的。這種試劑盒任選地包括實施RCA反應所需
的試劑，例如DNA聚合酶、DNA聚合酶輔助因子、脫氧核苷酸-5'-三磷酸。 可選擇地，該試劑盒還包括各種多核香酸分子、DNA或RNA連接酶、限制 性內(nèi)切酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、末端轉(zhuǎn)移酶，各種緩沖液和試劑，及抑制DNA聚合 酶活性的抗體。這些成分在容器中，例如小瓶。試劑盒還包括實施陽性對照 反應和陰性對照反應以及指示所需的試劑。在得益于當前公開內(nèi)容的情況 下，本領域技術人員能夠容易地確定用于特定反應中試劑的最佳含量。
在另 一個實施方案中，本發(fā)明的方法可用于多個核酸靶點或多個分析物 的同時蛋白互補。作為一個示例性而非限制性的例子，結合不同核酸結合基 序的互補性分裂多肽片段發(fā)生蛋白互補。例如， 一個耙核酸的存在將促進一 對活性分裂多肽片段發(fā)生蛋白互補，而另 一個靶點的存在將促進另 一對活化 的分裂多肽片段發(fā)生蛋白互補，生成不同的活性蛋白和可檢測信號。在這種 實施方案中，多個核酸靶點是可以同時檢測的。在選擇性的實施方案中，同 時沖企測耙核酸，例如，通過實時蛋白互補監(jiān)控RNA和DNA。在選擇性的實 施方案中，使用包含特定的分析物結合基序的分裂多肽片段，可以同時檢測 多個非核酸分析物。這種實施方案是特別有用的，例如評估一種以上的引起 癥狀的分析物的存在或含量，這可用于疾病、異?；蚬δ芪蓙y的診斷。
在相關的實施方案中，使用來自不同熒光蛋白的分裂熒光蛋白片段，進 行多個蛋白互補。在相關實施方案中，本發(fā)明的方法能夠?qū)崟r檢測和鑒定存 在于多種其它假定但是不同的核酸靶點中的特定靶核酸(參見Hu等人， Nature Biotechnology, 2003: 21: 539-545; Kerppola, 2006， 7: 449-456, Hu，等人,Protein-Protein Interactions(P. Adams和E.Golemis編輯)，Cold Spring Harbor Laboratory Press.2005，該文獻在此完全引入作為參考)。
定義
除非另外指出，本文所使用的以下術語和表述意在具有如下含義
術語"再折疊"是指在溶解過程中產(chǎn)生的解離蛋白分子折疊成它們的天然 三維構象。該過程受所述蛋白氨基,列的影響。眾所周知，當在蛋白中形 成二硫鍵之前進行再折疊時，將在正確的位置上形成二石危鍵，從而導致天然 構象的活性蛋白的形成。 本文使用的術語"預先形成的"是指已經(jīng)形成的構象和結構。術語"預先形 成的發(fā)色團"是指對于熒光產(chǎn)生是必要的所述發(fā)色團的成熟構象。預先形成 的發(fā)色團存在于所述活性構象中，并且不需要進行結構修飾來變?yōu)橛谢钚浴?br> 術語"多核苷酸"是指存在于核酸或構建體中的任何一種或多種核酸片
段，或是核酸分子，例如DNA或RNA片段。"編碼感興趣的基因的多核苷 酸，，是指包含這樣的多肽的編碼區(qū)域的多核苷酸。此外，多核苷酸可以編碼 一種調(diào)控元件，例如啟動子或者轉(zhuǎn)錄終止子，或者編碼多肽或蛋白的特定元 件，例如分泌性的信號肽或者功能性結構域。
"核苷"是聚合的核酸如DNA或RNA中的單體單元，并且由三個不同的 亞部分(subpart)或基序組成沖唐、磷酸和核i威基(nucleobase) (Blackburn, M., 1996)。當為二鏈體的部分時，核苷也被稱作為"堿基"或"堿基對"。最普 通的天然存在的核堿基，腺噪呤(A)、鳥嘌呤(G)、尿嘧啶(U)、胞嘧啶(C)和 胸腺嘧啶(T)帶有氫鍵結合功能，該功能以序列特異性方式將一條核酸鏈結合 到另一條核酸鏈上。"核苷"是指不含有磷酸的核苷。在DNA和RNA中，所 述核苷單體通過褲酸二酯鍵來連接，本文所使用的術語"磷酸二酯鍵"是指磷
酸二酯鍵或包括其磷酸鹽類似物的鍵，包括結合相反離子，例如IT，、 NW、 Na，等。
本文所使用的術語"寡核苷酸"和"？I物"具有其在標準核酸操作中相關的 傳統(tǒng)含義，即能夠雜交到多核苷酸模板上的寡核苷酸，并且作為與所述模板 鏈互補的？ 1物延伸產(chǎn)物的合成起始點。
"多核苷酸"或"寡核苦酸"是指天然核苷單體或其類似物的線性多聚物，包 括雙鏈的和單鏈的脫氧核糖核酸"DNA"、核糖核酸"RNA"等。換句話說，"寡 核苷酸"是脫氧核糖核酸鏈或核糖核酸鏈，它們分別是包含脫氧核糖核酸 (DNA)和核糖核酸(RNA)的結構單元。通常地，多核苷酸的大小范圍從少數(shù) 單體單元(例如8-40)到數(shù)千個單體單元。無論何時將DNA多核苷酸用字 符序列表示，例如"ATGCCTG，，，應當理解，除非另外指出，該核苷是以從 5'—3'的順序從左到右，而"A"表示脫氧腺苦，"C"表示脫氧胞香，"G"表示 脫氧鳥苷，而"T"表示胸苷。
"Watson/Crick堿基配對"和"Watson/Crick互補，，是指核苷及其類似物的 特定配對模式，所述核苷及其類似物是通過氬鍵結合在一起，例如T和U 配對，G與C配對。特定的堿基配對的行為是"雜交"。當兩條或多條核酸或 核酸類似物的互補鏈發(fā)生磁基配對時，形成雜交體。
本文所使用的術語"寡核苷酸"和"引物，，具有其在標準核酸4喿作中相關的 傳統(tǒng)含義，即能夠雜交到多核普酸模板上的寡核苷酸，并且作為與模板鏈互 補的引物延伸產(chǎn)物的合成起始點。
將許多本文所述的寡核苷酸設計為與其它寡核苷酸或核酸的特定部分互 補，從而在它們之間形成穩(wěn)定的雜交體。這些雜交體的穩(wěn)定性可用已知的方 法來計算，例如在Lesnick和Freier， Biochemistry 34:10807-10815 (1995), McGraw等人，Biotechniques 8:674-678(1990)和Rychlik等人，Nucleic Add Res. 18:6409-6412( 1990)中描述的那些方法。
"偶聯(lián)物"或"偶聯(lián)的"是指兩個或多個實體的連接。所述連接可以是兩種或 更多種多肽的融合，或是共價的、離子的或疏水的相互作用，其中分子的基 序結合在一起并保持在接近的狀態(tài)。所述實體的連接可以通過接頭、化學修 飾、肽接頭、化學接頭、共價鍵或非共價鍵，或者蛋白融合或者本領域技術 人員知曉的任何手段連接在一起。所述連接可以是永久性的或可逆的。在一 些實施方案中，可以包括若千接頭，以利用各個接頭和偶聯(lián)物中的各個蛋白 的所期望的性質(zhì)。本文包括預期單獨使用或者與其它接頭一起使用柔性接頭 和提高偶聯(lián)物的溶解性的接頭。通過表達編碼所述接頭的DNA，將肽接頭 連接到偶聯(lián)物中的一個或多個蛋白上。接頭是可用酸裂解、光裂解的和熱敏 感的接頭。
術語"部分"或"基序"在本文中互換使用，是指能夠?qū)崿F(xiàn)特定功能的分子、 核酸或蛋白或其它物質(zhì)。"核酸結合部分，，或"核酸結合基序，，是指能夠以特定 方式結合到所述核酸上的分子。
"檢測"是指基于檢測標記的性質(zhì)對構建物進行檢測、觀察或者測量。
術語"核堿基修飾的"是指在DNA和RNA中天然存在的核堿基AGC, T， U的堿基配對衍生物。
術語"啟動子"是指足以指導轉(zhuǎn)錄的最小核苷序列。本發(fā)明還包括那些足 以引起啟動子依賴性基因表達的啟動子元件，該表達可以受細胞類型特異
性、組織特異性的控制或者可由細胞外信號或試劑誘導；這樣的元件位于所 述天然基因的5'或3'區(qū)，或者在所述內(nèi)含子中。術語"誘導型啟動子"是指一 種啟動子，其與RNA聚合酶結合以及轉(zhuǎn)錄起始的速率受到細胞外刺激的調(diào) 控。術語"組成型啟動子"是指與RNA聚合酶結合以及轉(zhuǎn)錄起始的速率恒定 并且相對獨立于細胞外刺激的啟動子。"瞬時調(diào)控啟動子，，是與RNA聚合酶 結合以及轉(zhuǎn)錄起始的速率受發(fā)育過程中特定時間調(diào)控的啟動子。本發(fā)明包括 所有這些啟動子類型。
術語"多肽"或"肽"在本文中互換使用，是指蛋白。
本文所使用的術語"體外"意在包括所述生物體之外的任何溶液或任何細 胞。通常，體外是指在試管、小瓶或任何其它容器或支持物中發(fā)生的反應， 其中所述溶液和/或細胞分離自其通常出現(xiàn)的環(huán)境。
本文的非核酸分析物上下文中使用的術語"分析物"是指任何化學上、生 物上或結構上的實體，所述實體不是核酸或核苷或核酸類似物。這樣的分析 物包括但是不限于，有機分子、無機分子、生物分子、代謝產(chǎn)物等。
實施例
實施例1
方法
分子建4莫用串珠法18對EGFP及其片段進行建模。將多肽的每個氨基 酸分別用對應于C。和Cp位置上的兩個珠來表示。約束相鄰的珠來模擬主鏈 幾何學和柔性。氨基酸之間的相互作用基于G5樣結構的勢能"來模擬。在 這樣的模型中，兩個氨基酸被指定為相互吸引或相互排斥的勢能，取決于兩 個氨基酸在天然蛋白狀態(tài)中是否形成接觸。從蛋白數(shù)據(jù)庫銀行(X-射線結構； PDB代碼為Ic4f)獲取天然EGFP的構象。為了選擇EGFP片段中的氨基酸的 接觸勢能，我們使用完全大小的蛋白的天然結構。通過離散分子動力學(DMD) 方法18來分析蛋白折疊熱力學和動力學。
多肽的克隆、表達和純化:將含有EGFP-1基因的質(zhì)粒(Clontech)用作PCR 擴增編碼大(A)EGFP片段和小(B)EGFP片段的DNA序列的模板。所述大片 段含有158個N-末端氨基酸加上一個C-末端半胱氨酸，并且所述小片段含 有剩余的C-末端81個氨基酸加上一個N-末端半胱氨酸。將PCR產(chǎn)物克隆 到TWIN-I載體(New England Biolabs)中來獲得&p DNAB內(nèi)含肽的C-末端 融合物(利用內(nèi)含肽自分裂化學21'22純化所期望的蛋白片段)，并且在 BL21(DE3) pLys感受態(tài)大腸桿菌(Stratagene)中表達。通過測序驗證所有構建 物的結構。用于PCR擴增的引物為具有C-末端半胱氨酸的EGFP大片段: 引物a-正向(Primer ALPHA—dir):
5 '-AGTTTCTAGAATGGTGAGCAAGGGCG (SEQ ID NO.l);
引物a畫CYS-反向(PrimerALPHA陽CYS rev):
生物素化的寡核苷酸1:生物素-5'-CGACTGCGTTAGCATGTGTTG (SEQ IDN0.3)。
含有N-末端半胱氨酸的EGFP小片段:引物卩-CYS-正向(Primer BETA-CYS—dir) : 5'-ATCGGATATCATGTGCAAGAACGGCATCAAGGTG (SEQ ID N0.4);
引物卩-反向x ( Primer BETA—rev ): 5'-ATCGCTCGAGTTACTTGTACAGCTCGTCC(SEQ ID N0.5);
生物素化的寡核苷酸2: 5'-CAACACATGCTAACGCAGTCG-生物素(SEQ IDN0.6)。
將細胞生長過夜，達到OD6QQ=0.6， 25。C下用0.35mMIPTG誘導過夜。 通過離心來沉淀細胞，用緩沖液(含有50mMTris-HCl， pH8.5, 25%蔗糖， ImMEDTA, lOmMDTT)洗滌，并且冷凍(-70。C下10分鐘)和解凍(37。C下 5分鐘)3次。當將細胞保持于冰上，以3次30秒的裂解來超聲波溶解細胞， 每次間隔30秒(Sonifier細胞破裂儀W185c， Branson Sonic Power)。將得到 的混合物在4。C下以15000 rpm離心5分鐘，將所述沉淀懸浮在同樣的緩沖
液中，并再次超聲波處理進行另外3次30秒的裂解。將沉淀洗滌3次，并 且隨后懸浮在含有25 mM MES pH 8.5, 8M尿素，10 mM NaEDTA, 0.1 mM DTT的緩沖液中，在室溫下放置1小時。以15000 rpm對被溶解的蛋白離心 5分鐘，并且隨后通過以1:100的稀釋比例，逐滴加入再折疊緩沖液(50mM TrispH8.5, 500mMNaCl， lmMDTT)，使所述上清液再次折疊。按照生產(chǎn) 商的推薦使用殼多糖柱來純化再折疊的蛋白。全部蛋白的純度通過 SDS-PAGE來分析(圖3A)。在Hitachi U-3010分光光度計中記錄蛋白吸收光 譜。
蛋白與寡核苷酸的偶聯(lián)、蛋白的互補和熒光測量:首先，用G-25微量凝 膠過濾柱(Amersham Biosciences)將EGFP蛋白片段凝膠過濾進入 PBS-EDTA, pH7.5緩沖液中。然后，將這些溶液以10:1的體積比與10 mM 生物素-HPDP(Pierce)在二曱基曱酰胺中混合，并且在室溫下孵育2小時，達 到^70%生物素化。通過凝膠過濾，從生物素化的蛋白中除去未反應的生物 素-HPDP。接著，37。C下，在PBS-EDTA緩沖液中，將這些片段與等摩爾量 的鏈霉抗生物素(通過滴定試驗測定；參見圖4A)孵育15分鐘，獲得生物素 化EGFP片段與鏈霉抗生物素的1:1復合物。最后，將等摩爾量的相應生物 素化寡核苷酸加入到每一二元復合物中，得到1: 1: 1的三分子構建物。將如 此獲得的三分子構建物在PBS-EDTA緩沖液中以1:1的摩爾比例混合，得到 最終濃度約200 nM。在Hitachi F-2500分光光度計中監(jiān)測分裂EGFP已恢復 的熒光反應。為了解離由已恢復的寡核苷酸支持的蛋白構建物，加入100倍 過量的非生物素化寡核苷酸(具有與用于偶聯(lián)大EGFP段的生物素化低聚體 相同的序列)，記錄所產(chǎn)生的熒光變化。
結果
在我們的設計中(圖1A),熒光蛋白的兩個片段與互補性寡核苷酸偶聯(lián)。 一條多肽含有能夠在完全大小的蛋白中產(chǎn)生熒光的發(fā)色團。然而，該發(fā)色團 在蛋白片段中不發(fā)出熒光，這是因為該發(fā)色團暴露在溶液中并被溶液淬滅， 并且其還缺乏與其它片段氨基酸的必要接觸。當通過核酸的互補性相互作 用，這兩個蛋白片段相互接近，所述第二多肽作為所述發(fā)色團的屏蔽物，將 該發(fā)色團與溶液隔離開來，使所有缺少的氨基酸4妄觸得以恢復，導致熒光產(chǎn) 生。在本研究中，我們通過9個氨基酸的柔性環(huán)(EGFP殘基153-161)16,將
對應于大結構域和小結構域的兩個增強的綠色熒光蛋白的片段(EGFP)2連接 在一起。已知較大的N-末端EGFP結構域含有形成發(fā)色團的3個氨基酸， 該發(fā)色團在天然蛋白中發(fā)熒光，但是在變性蛋白中不發(fā)焚光2，17。而且，該 三肽在分離的EGFP大片段中不發(fā)熒光6-9。
所述EGFP發(fā)色團的形成是一個需要蛋白正確折疊的自催化過程17。我 們假設N-末端EGFP片段(約為完整EGFP的2/3)足夠大，從而能夠通過自 身形成一個壓縮的折疊結構。我們還假設該結構與完整EGFP的相應部分在 構象上非常接近，從而在折疊的大EGFP片段中自發(fā)地形成發(fā)色團，盡管該 發(fā)色團不發(fā)熒光。
使用離散分子動力學(DMD)模擬18,我們對所述EGFP及其大片段進行 分子建模分析。DMD模擬的結果是所述EGFP大片段事實上發(fā)生特征為勢 能大大降低的折疊的溫度(T0.6);在更高溫度下(TX).6)所述蛋白保持具有高 勢能的未折疊狀態(tài)。通常單個結構域蛋白而言，該多肽的折疊熱力學和動力 學經(jīng)過兩個狀態(tài)的、全部或無的模式(all-or-nonemode)。接近轉(zhuǎn)變溫度TV 約0.60時，所述EGFP大片段顯示折疊的和未折疊的兩種狀態(tài)，兩者的概率 相同，并且勢能發(fā)生大的波動(圖2B)。在所述的折疊和未折疊的事件中，未 觀察到EGFP大片段的中間狀態(tài)。
圖2C說明了折疊的EGFP大片段的壓縮結構，除了其搖擺的20個殘基 的長C-末端部分。此外，形成發(fā)色團的氨基酸在完全大小的EGFP中和在大 片段中的排列基本上是相同的(圖2D， E)，從而有可能形成發(fā)色團。而且， 圖2C顯示，在EGFP大片段中形成發(fā)色團的氨基酸暴露在溶劑中，而在完 全大小的EGFP中情況并不如此，其中這些氨基酸深深地隱藏在蛋白內(nèi)部(圖 2D)。此外，這些氨基酸缺乏許多與EGFP較小片段的其它殘基的重要接觸， 這些接觸存在于完全大小的蛋白中19。因此，即便形成發(fā)色團，該發(fā)色團可 能不足以在不完整的EGFP中發(fā)出強烈的熒光。
EGFP小片段由兩個(3-發(fā)夾結構組成，這兩個發(fā)夾結構不相互接觸，因此 該多肽自身不能形成^^為確定的壓縮結構。然而，我們的EGFP折疊DMD 模擬提示， 一旦EGFP小片段結合到其較大的配對物上時，其尋找正確位置
從而成為聯(lián)合的壓縮蛋白結構的一部分，并且EGFP大片段中的搖擺部分因 此也發(fā)生4斤疊。
我們隨后通過克隆和分離該蛋白的兩個分離片段，在柔性環(huán)中的氨基酸 158和159之間遺傳分割EGFP,這兩個片段對應于用于模擬DMD的大結構 域和小結構域。為了具有最佳功能，基于分裂EGFP的光學轉(zhuǎn)換應當能夠快 速應答DNA雜交-去雜交事件。已知核酸的互補性相互作用是迅速的(在幾 分鐘內(nèi))iw^G。相反，重新形成成熟的前熒光EGFP發(fā)色團需要幾小時17。 基于分子建模分析，我們猜想可以體外分離含有預先形成的發(fā)色團的EGFP 片段大。如果情況如此，那么兩個EGFP片段的熒光活性互補將快速發(fā)生， 僅需要幾分鐘，而不是幾小時。在所有先前報道中記載的，體外EGFP重新 組裝最可能用缺乏成熟發(fā)色團的蛋白來進行，所述成熟發(fā)色團的形成僅歸因 于重新組裝6—9。因此，在這些研究中，熒光的產(chǎn)生是非常緩慢的。
EGFP大片段和小片段作為與小的自分裂Ssp DNAB內(nèi)含肽21的融合物在 大腸桿菌中過表達，以便于蛋白的純化22。這些多肽再折疊后從內(nèi)含體中分 離(詳見方法)。已經(jīng)顯示出，與熒光蛋白融合的內(nèi)含肽不會影響其正確的折 疊22。圖3 A表明兩種EGFP片段均以足夠高的純度獲得再折疊的蛋白樣 品中含有^70%的EGFP大片段和約90%的EGFP小片4殳。
圖3B顯示這些多肽的吸收光譜?？梢钥闯觯瑑煞NEGFP片段均缺少在 490nm下的特征峰，該特征峰可見于天然EGFP中(圖3B的插圖)。然而， 與EGFP小片段和其它無熒光/發(fā)色團游離的蛋白(鏈霉抗生物素)相反， EGFP大片段的特征在于在300-400 rnn范圍內(nèi)有顯著吸收，這是變性EGFP17 發(fā)色團所期望的，并且這也在其它光活性分裂EGFP變體中觀察到23。在 EGFP大片段中發(fā)色團的存在熒光譜中變得更顯著(圖3C):該片段具有微弱 的熒光(與完整EGFP的峰值相比，熒光弱約100倍)，在360nm下具有明顯 的最大激發(fā)，在460nm下具有最大的發(fā)射光譜。這些光譜完全區(qū)別于全長 EGFP的光譜(參見圖4A中的EGFP發(fā)射光譜；EGFP激發(fā)光譜與圖3B插圖 中顯示的吸收光譜類似)。然而，它們對應于所述合成發(fā)色團的熒光i普，并 且對應于含有發(fā)色團的短肽的光譜，所述短肽通過部分蛋白水解從完整的熒 光蛋白中分離24。因此，這些數(shù)據(jù)表明從內(nèi)含體中分離和再折疊的EGFP大 片段含有預先形成的發(fā)色團。
針對DNA支持的EGFP互補，使用生物素-鏈霉抗生物素化學(圖1),將 蛋白片段與互補性寡核普酸偶聯(lián)。EGFP大片段和小片段分別用C-末端和 N-末端含有額外的半胱氨酸殘基來表達，以用于使用巰基反應性試劑、生物 素-HPDP的生物素化。然后，C-末端和N-末端生物素化的多肽可以通過鏈 霉抗生物素與生物素化的寡核香酸偶聯(lián)；這種高親合性的生物素結合性蛋白 25'26作為一種接頭。我們認為EGFP A片段中的末端Cys將是生物素化的主 要靶位點，而內(nèi)部的Cys49和Cys"在某種程度上隱藏在所述多肽內(nèi)部(如由 圖2c， e中的DMD結構所支持的)將是更低反應性的。
我們選擇這種非共價的偶聯(lián)，是由于其允許進行^t型設計27，28,這在制備 不同的EGFP光學轉(zhuǎn)換時是有利的。要注意，如果隨后的解離是必要的，在 所述蛋白和生物素-HPDP之間通過S-S鍵形成的連接可以容易地以還原劑來 分割。在計劃該設計時，我們認為其空間排列將同時允許寡核苷酸形成二鏈 體，并且所述EGFP片革殳之間相互接近。實際上，當兩個鏈霉抗生物素分子 并排時，它們的中心相距約60A25。如果所述生物素結合部位位于靠近每個 鏈霉抗生物素亞單位中間26,可以估計所述相接觸蛋白中的這兩個部位之間 的最小距離為約30A。生物素-HPDP試劑和寡核苷酸中的生物素接頭的長度 ^25A，因此對于所有相應的組裝部分的結合是足夠的。
將所述生物素化的EGFP片段以1:1的比例連接到鏈霉抗生物素上(圖 4a)，并且隨后在5'-或3'-端與帶有生物素的相應寡核苷酸偶聯(lián)(圖4b;參見 圖l的圖表)。當這些三分子構建物以等摩爾量組合時，沖企測到熒光的急劇 增強，具有類似于EGFP(圖4c)的激發(fā)/發(fā)射光譜。相反，對照實-驗使用無互 補性寡核苦酸的混合鏈霉抗生物素結合的蛋白片段，未顯示出任何可感知的 熒光。以DNA為模板的EGFP重新組裝的動力學是快速的，其t!,^lmin(圖 4a插圖)。這與EGFP從具有成熟發(fā)色團的變性蛋白中復性的動力學接近2'17， 并與DNA二鏈體基本上是立即的形成十分吻合2、重新組裝的復合物的熒 光強度隨實驗而變化，具有接近于完整EGFP的最高應答。
應當注意，完整的EGFP和重新組裝蛋白的熒光譜之間存在兩點區(qū)別。 首先，針對重新組裝的蛋白的激發(fā)/發(fā)射最大值與EGFP的488/507 nm相比 紅移至490/524 nm。所述光譜改變可以通過重新組裝蛋白中圍繞所述發(fā)色團 的氨基酸的多少有所不同的排列，以及通過鏈霉抗生物素和/或復合物中的負
電荷性的DNA的存在來解釋。第二個區(qū)別在Mg"離子增加時變得明顯。在 加入2 mM MgS04后，天然EGFP的焚光逐漸減少，在3小時后變?yōu)榧s起始 值的70 % ,這與已知的二價陽離子對EGFP熒光的淬滅效應是一致的2。相 反，在加入Mg^后的數(shù)分鐘內(nèi)，重新組裝的復合物的熒光增加約30%,并 且保持基本上不變的狀態(tài)(圖4d)。這種效果可以通過Mg"對雙鏈體DNA的 穩(wěn)定作用來解釋，其在DNA-蛋白復合物內(nèi)EGFP的重新組裝中起主要作用。
最后，我們檢測了解離被組裝的多組分復合物來關閉恢復的分裂EGFP 的熒光的可能性。為了這一目的，我們還使用了 DNA雜交(參見圖1的第二 部分)。當將兩種互補寡核苷酸之一過量加入到所述熒光復合物中時，已經(jīng) 檢測到熒光基本上的立即下降(圖4c)。顯然，未標記的寡核苷酸的竟爭性雜 交取代了其蛋白標記的的等價物，結果分裂了所述互補的蛋白復合物。選擇 性地，通過局部加熱"可以遠程控制DNA雜交-去雜交事件，使得進行多次 在系統(tǒng)中產(chǎn)生光學信號的開-關循環(huán)是可能的。我們將這種方法稱作為Swift & Winked Illumination Triggered& Controlled by Hybridization(SWITCH),才旨 明該方法的可能應用。
維多利亞水母(AequoreaVictoria)綠色熒光蛋白(ACCESSIONM62653): MSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTf
FKDDGNYKTRAEVKPEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSH
N0.7)。
維多利亞水母(AequoreaVictoria)綠色焚光蛋白的mRNA，完整的cds (ACCESSION M62653):
tacacacgaa taaaagataa caaagatgag taaaggagaa gaac加ca ctggagttgt cccaattctt gttgaattag atggtgatgt taatgggcac aaattttctg tcagtggaga gggtgaaggt gatgcaacat acggaaaact tacccttaaa tttatttgca ctactggaaa actacctgtt ccatggccaa cacttgtcac tactttctct tatggtgttc aatgctttto aagataccca gatcatatga aacagcatga ctttttcaag agtgccatgc ccgaaggtta tgtacaggaa agaactatat加caaaga tgacgggaac tacaagacac gtgctgaagt caagtttgaa ggtgataccc ttgttaatag aatcgagtta aaaggtattg a加aaaga agatggaaac attcttggac acaaattgga atacaactat aactcacaca atgtatacat catggcagac aaacaaaaga atggaatcaa agttaacttc aaaattagac acaacattga agatggaagc gttcaactag cagaccatta tcaacaaaat actccaattg gcgatggccc tgtcctttta ccagacaacc attacctgtc cacacaatct gccctttcga aagatcccaa cgaaaagaga gaccacatgg tccttcttga gtttgtaaca gctgctggga ttacacatgg catggatgaa ctatacaaat aaatgtccag acttccaatt gacactaaag tgtccgaaca attactaaaa tctcagggtt cctggttaaa ttcaggctga gatattattt atatatttat agattcatta aaattgtatg aataatttat tgatgttatt gatagaggtt attttcttat taaacaggct acttggagtg tattcttaat tctatattaa ttacaatttg atttgacttg ctcaaa (SEQ ID NO.8)。
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權利要求
1.一種用于檢測個體中的疾病或障礙的方法，所述方法包括 a.從個體中獲得待測生物學樣品； b.從所述生物學樣品中分離DNA或者RNA； c.將所述DNA或RNA與分裂熒光多肽分子接觸，其中將所述分裂熒光多肽片段結合到核酸結合基序上，并且其中至少一個所述的核酸結合基序是特異于與疾病或障礙相關的特定核酸的；和 d.檢測所述可檢測蛋白的信號改變，其中所述信號改變表明存在一種疾病或障礙。
2. —種用于檢測個體中的疾病或障礙的方法，所述方法包括a. 從個體中獲得待測生物學樣品；b. 從所述生物學樣品中分離出非核酸的分析物；c. 將所述非核酸的分析物與分裂熒光多肽分子接觸，其中所述分裂熒光多 肽片段結合到所述非核酸分析物的結合基序上，并且其中至少一個分析物結 合基序特異于與疾病或障礙相關的特定核酸；和d. 檢測可檢測蛋白的信號變化，其中信號改變指示存在一種疾病或障礙。
3. 權利要求1和2的方法，其中所述分裂熒光多肽包括a. EGFR肽的第一片段，包括從氨基酸1至約氨基酸158;和b. EGFR肽的第二片段，包括大約氨基酸159至氨基酸239;和c. 位于第一和第二EGFR片段之間的切割肽。
4. 權利要求1和2的方法，其中該疾病是病原體。
5. 權利要求1和2的方法，其中所述病原體選自病毒、流感病毒、細菌、 真菌、寄生蟲或酵母。
6. 權利要求4的方法，其中該病原體是病毒。
7. 權利要求1和2的方法，其中該疾病是疾病遺傳傾向的。
8. —種包含分裂熒光多肽的內(nèi)含體的制劑，其中所述分裂熒光多肽包括a. EGFR肽第一片段，包括從氨基酸1到約氨基酸158;和b. EGFR肽第二片段，包括大約氨基酸159到氨基酸239;和c. 位于第一和第二 EGFR片段之間的切割肽。
9. 一種分裂多肽蛋白片段分子，所述分裂多肽蛋白片段分子包含可檢測蛋 白的至少兩個多肽片段，其中該片段(a)處于活化形式；(b)本身無活性；(c) 還包含核酸結合基序；以及(d)在靶核酸的存在下迅速互補來實時地重新構建 所述的活性蛋白。
10. 權利要求7的分裂多肽蛋白片段分子，其中所述靶核酸選自DNA、 RNA、 PNA及其類似物。
11 .一種分裂多肽蛋白片段分子，所述分裂多肽蛋白片段分子包含可檢測 蛋白的至少兩條多肽片段，其中所述片段(a)處于活化形式；(b)本身無活性； (c)還包含非核酸分析物的結合基序；以及(d)在靶分析物分子的存在下迅速互 補來實時地重新構建所述活性蛋白。
12. 權利要求9的分裂多肽蛋白片段分子，其中所述靶分析物分子是生物 分子、有機分子或無機分子。
13. 權利要求9和11的分裂多肽蛋白片段分子，其中所述的可檢測蛋白 是熒光蛋白。
14. 權利要求9和11的分裂多肽蛋白片段分子，其中所述熒光蛋白選自 綠色熒光蛋白(GFP)、 GFP樣熒光蛋白(GFP樣)、增強的綠色熒光蛋白 (五G^尸)、黃色熒光蛋白(YFP)、增強的黃色熒光蛋白(EYFP)、藍色熒光蛋白 (BFP)、增強的藍色熒光蛋白(EBFP)、藍綠色熒光蛋白(CFP)、增強的藍綠色 熒光蛋白(ECFP)，和紅色熒光蛋白(dsRED)以及它們的變體。
15. 權利要求9和11的分裂多肽蛋白片段分子，其中該分子是分裂熒光 蛋白分子，并且其中一個多肽片段包含熒光蛋白的成熟的發(fā)色團，且其中該 分子的分裂熒光片段(a)共同含有在熒光蛋白的發(fā)色團屏蔽桶(chromophore-shielding barrel)中的完全互補的p鏈；(b)本身是非熒光性的； (c)還包含核酸結合基序；和(d)在靶核酸或靶分析物分子的存在下迅速互補以 實時地重新構建所述熒光蛋白和熒光表型。
16. 權利要求9的分裂多肽蛋白片段分子，其中所述的熒光蛋白是EGFP。
17. 權利要求9的分裂多肽蛋白片段分子，其中所述的核酸結合基序是選 自DNA、 RNA、 PNA、 LNA、 DNA結合蛋白或肽、RNA結合蛋白或肽。
18. 權利要求9的分裂多肽蛋白片段分子，其中 一個片段上的核酸結合基 序與其它片段上的核酸結合片段是相同類型的。
19. 權利要求9的分裂多肽蛋白片段分子，其中一個片段上的核酸結合基 序與其它片段上的核酸結合片段是不同類型的。
20. —種實時檢測核酸雜交過程中變化的方法，該方法包括(a)檢測如權 利要求2中所述分子的基線信號，其中以生物學樣品中的核酸將一個片段上 的核酸結合基序結合到第二個片段上的核酸結合基序上；(b)改變試驗條件， 從而可以改變所述樣品中兩個片段的結合；和(c)立即檢測來自于所述生物學 樣品的熒光信號的變化，其中信號減少表明所述試驗條件的改變降低所述分 離多肽片段對其原始核酸靶點的親和力。
21 .權利要求20的方法，其中 一個片段上的核酸結合基序與第二個片段上 的核酸結合基序是相同類型的。
22.權利要求20的方法，其中 一個片段上的核酸結合基序與第二個片段上 的核酸結合基序是不同類型的。
23. —種制備活化的分裂多肽蛋白片段的方法，所述方法包括a. 表達編碼第一多肽片段和至少一種其它多肽片段的核酸序列，其中在靶 核酸或靶非核酸分析物存在時，這兩個多肽片段結合以形成處于其活性狀態(tài) 的可檢測蛋白，其中當與野生型的活性蛋白相比較時，該多肽片段處于一種 活化的且構象正確的形式；和b. 收集所述多肽片段以獲得兩種處于正確構象和活化狀態(tài)下的分離蛋白 片段。
24. 權利要求21的方法，其中將編碼第一多肽片段和至少一種其它多肽 片段的核酸序列作為 一種核酸序列來編碼，其中所述核酸序列編碼位于第一 多肽片段和其它多肽片段之間的可分裂位點，其中所述的第一多肽片段和其 它多肽片段可以被分離，并且當與野生型的活性蛋白相比較時，該多肽片段 處于一種活化的且構象正確的形式。
25. 權利要求24的方法，其中所述可分裂位點能夠使得通過選自如下的裂 解方式將第一多肽片段與其它多肽片段分離開酶裂解、化學裂解、光裂解、 波長裂解、熱裂解、酸裂解。
26. 權利要求23的方法，所述方法包括a. 在微生物宿主細胞中表達核酸序列以形成內(nèi)含體，所述核酸序列編碼第 —多肽片段和至少一種其它多肽片段，其中該內(nèi)含體包含所述多肽片段；和b. 溶解所述宿主細胞，收集所述內(nèi)含體并且將包含在步驟(a)的所述內(nèi)含 體中的多肽片段再溶解和再折疊，從而獲得處于其活化構象中的所述第一多 肽片段和至少一種其它多肽片段。
27. 權利要求26的方法，所述方法還包括酶促或化學分裂包含第一多肽片 段和至少一個其它多肽片段的多肽，以獲得處于其活化狀態(tài)的第一多肽片段 和至少一種其它多肽片段。
28. 權利要求26的方法，所述方法還包括從所述宿主細胞的可溶部分中收 集所述多肽片段，以獲得處于其活化構象中的第一多肽和至少一種其它多肽 片段。
29. 權利要求23的方法，其中所述可檢測的蛋白是酶。
30. 權利要求25的方法，其中所述酶具有顯色活性。
31. 權利要求23的方法，其中所述可檢測的蛋白是熒光蛋白。
32. 權利要求23的方法，其中熒光蛋白的第一多肽片段包含成熟的預先形 成的發(fā)色團，所述發(fā)色團準備用于產(chǎn)生熒光。
33. 權利要求31的方法，其中所述熒光蛋白選自綠色熒光蛋白(G^尸)、 增強的綠色熒光蛋白(五GF尸)、黃色焚光蛋白(YFP)、增強的黃色熒光蛋白 (EYFP)、藍色熒光蛋白(BFP)、增強的藍色熒光蛋白(EBFP)、藍綠色熒光蛋 白(CFP)、增強的藍綠色焚光蛋白(ECFP)、紅色熒光蛋白(dsRED)及其變體。
34. 權利要求31的方法，其中所述熒光蛋白是EGFP熒光蛋白。
35. 權利要求34的方法，其中所述EGFP熒光蛋白包括第一多肽片段蛋白， 該第一多肽片段蛋白包括氨基酸l至約氨基酸158，且其中所述EGFP熒光 蛋白的第二多肽片段是約氨基酸159至氨基酸239。
36. 權利要求23的方法，其中所述第一多肽片段還包含C-末端的半胱氨 酸，且所述第二多肽片段還包含N-末端的半胱氨酸。
37. 權利要求23的方法，所述方法還包括以巰基反應性試劑將第一多肽片 段和至少一個其它多肽片段生物素化。
38. 權利要求37的方法，其中巰基反應性試劑是生物素-HPDP。
39. 權利要求23的方法，其中將所述第 一多肽片段和至少另 一個多肽片段 進一步結合到被鏈霉親和素結合的寡核苷酸上。
40.權利要求39的方法，其中所述寡核苷酸選自DNA、 RNA、 PNA、 LNA及其類似物。
41 .權利要求23的方法，其中編碼所述第一多肽片段和至少一種多肽片段 的核酸還編碼核酸結合部分。
42. 權利要求41的方法，其中所述核酸結合部分是核酸。
43. 權利要求42的方法，其中所述核酸結合部分結合到所述第一多肽片段 和至少一種其它多肽片段上。
44. 權利要求42的方法，其中所述核酸結合部分選自DNA結合性蛋白、 DNA結合性肽、RNA結合性蛋白、RNA結合性肽。
45. —種試劑盒，所述試劑盒包含a. 第一種和至少一種其它活化的分裂多肽片段，其中各個分裂多肽片段均 包含核酸結合結構域或用于非核酸分析物的結合基序；b. 用于互補和信號4僉測的試劑和說明書。
46. —種試劑盒，所述試劑盒包含a. 第一種和至少一種其它的活化分裂多肽片段；b. 用于連接感興趣的使用者自身的核酸結合基序或是非核酸分析物的結 合基序的試劑和說明書；c. 用于互補和信號沖企測的試劑和說明書。
47. 權利要求45和46的試劑盒，其中所述第一種和第二種活化的分裂多 肽片段重新構建形成可檢測的蛋白。
48. 權利要求47的試劑盒，其中所述可檢測的蛋白選自p-內(nèi)酰胺酶、 DFHR、熒光素酶、熒光蛋白。
49. 權利要求47的試劑盒，其中所述可檢測的蛋白是抗原。
50. 權利要求45和46的試劑盒，所述試劑盒還包含用于擴增所述樣品靶 核酸的試劑和iJL明書。
51. 權利要求1和2的方法，其中所述變化是信號的減少。
52. 權利要求1和2的方法，其中所述變化是信號的增加。
全文摘要
本發(fā)明涉及活化的分裂多肽片段的制備方法，該多肽片段在重新構建時立即形成一種活性蛋白。該方法涉及蛋白的實時互補。本發(fā)明還包括分裂和制備處于活化狀態(tài)的分裂熒光蛋白的方法，該分裂蛋白在重組時立即產(chǎn)生熒光信號。本申請還提供使用本發(fā)明的新的活化的分裂多肽片段來實時檢測核酸、非核酸分析物以及核酸雜交的方法。
文檔編號C12Q1/68GK101365804SQ200680049682
公開日2009年2月11日 申請日期2006年10月27日 優(yōu)先權日2005年10月27日
發(fā)明者C·R·坎托, N·布勞德, V·V·德米達夫 申請人:波士頓大學董事會