專利名稱：血液凝固異常的治療方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種血液凝固異常的治療方法。
背景技術(shù)：
血管受損傷會(huì)引起出血。而血液自身備有止血機(jī)制。止血主要是通過
血小板聚集于血管壁受損傷部位(初期止血；primary hemostasis)和纖維蛋白 填充到血小板間隙中(二期止血;Secondary Hemostasis )的步驟來完成。止 血的這些步驟被稱為血液凝固(blood coagulation)。血液凝固是多種物質(zhì)復(fù)合 參與的復(fù)雜的生理反應(yīng)。初期止血是填塞損傷部位的過程。受到損傷的內(nèi) 皮細(xì)胞下暴露的結(jié)締組織中，含有膠原等。血小板通過vonWillebrand因子 (VWF，血管性血友病因子)介導(dǎo)結(jié)合在該結(jié)締組織后，血小板形成凝集塊。 后者是以纖維蛋白的形成和蓄積為主的止血步驟，被稱為二期止血 (Secondary Hemostasis )。纖維蛋白是血液中的前體蛋白(纖維蛋白原)被凝 血酶等蛋白酶的活性激活后形成的纖維狀蛋白質(zhì)。初期止血形成的血小斗反 的集合構(gòu)造是纖維蛋白形成的凝血塊的附著處，同時(shí)，纖維蛋白也強(qiáng)化了 該構(gòu)造本身。在二期止血中起主要作用的與纖維蛋白形成相關(guān)的因子，已 知有從第I因子(Factor I)到第XIII因子(Factor XIII)的12種(缺乏第VI因
子)物質(zhì)。這些因子通過例如調(diào)節(jié)其他因子的活性或使纖維蛋白穩(wěn)定等作 用參與 一 系列的凝血反應(yīng)。
參與凝血的眾多因子，通常在血液中其活性被巧妙地調(diào)節(jié)。所以，正 常情況下血管中流動(dòng)的血液不會(huì)凝固。然而一旦出血，立即啟動(dòng)初期止血， 進(jìn)而負(fù)責(zé)二期止血的眾多因子也逐個(gè)被激活。正常情況下，這一系列的步 驟是在數(shù)秒之內(nèi)進(jìn)行的一種快速的生理反應(yīng)。
當(dāng)與凝血有關(guān)的因子群的量及活性出現(xiàn)異常時(shí)，會(huì)引起凝血機(jī)制的異 常。例如，凝血中的某一因子的表達(dá)及活性降低時(shí)，正常的止血機(jī)制就會(huì) 停止運(yùn)作。這種狀態(tài)稱做血液凝固異常。已知很多原因可以導(dǎo)致血液凝固 異常。血友病是血液凝固異常的代表性疾病。
血友病按照病因可分為血友病A和血友病B。血友病A是第VIII因子 的量或質(zhì)出現(xiàn)異常而導(dǎo)致的。而血友病B則是因?yàn)榈贗X因子缺陷。首先， 第VIII因子是被凝血酶激活的凝血因子?；罨说牡赩III因子(第Villa 因子)與活化了的第IX因子(第IXa因子)結(jié)合后激活第X因子。被活化了 的第X因子(第Xa因子)，通過激活凝血酶參與纖維蛋白的形成。此外， 第IX因子通過活化了的第XI因子(第XIa因子)被激活、與同樣被激活 的第VIIIa因子一起形成第X因子的活化因子。第VIII因子和第IX因子都 是二期止血的最終階段中使凝血酶活化的重要因子。因此，由于這些因子 的不足所導(dǎo)致的血友病，根據(jù)其程度有時(shí)可引起嚴(yán)重的血液凝固缺陷。
血友病一般為遺傳性疾病。目前，修復(fù)作為發(fā)病原因的遺傳病因是十 分困難的。因此，血友病多是通過補(bǔ)充缺陷的凝血因子來進(jìn)行治療(補(bǔ)充療 法)。補(bǔ)充療法使用人血純化的第VIII因子及第IX因子。然而，給藥以人 血為原料的血液制劑時(shí)出現(xiàn)了感染人免疫缺陷病毒及肝炎病毒等的傳染病 問題。為防止傳染病，人們?cè)谂ε懦腥狙杭巴ㄟ^建立病原性病毒的 滅活技術(shù)來減低感染的可能性。并且，隨著使用基因工程方法制備這些因 子的純化蛋白制劑的實(shí)用，由于凝血因子給藥引發(fā)的感染風(fēng)險(xiǎn)幾乎不存在 了。
然而，即使感染風(fēng)險(xiǎn)降低了，但是目前的補(bǔ)充療法還是會(huì)制約患者的 日常生活。 一般來說，補(bǔ)充療法的凝血因子的給藥劑量及給藥日程，要視 患者的凝血因子缺陷程度而定。凝血因子一般可維持給藥時(shí)的藥效半天左 右，之后隨著時(shí)間的推移藥效逐漸下降。因此，凝血因子須隔6-24小時(shí)給 藥一次。而蛋白制劑的凝血因子要通過靜脈給藥，如此頻繁的靜脈注射會(huì) 制約患者的正常生活。
更應(yīng)指出的是血友病的補(bǔ)充療法會(huì)導(dǎo)致自身抗體的產(chǎn)生。從接受補(bǔ)充 療法的血友病患者中，有時(shí)會(huì)檢測出對(duì)被給藥的凝血因子產(chǎn)生的中和抗體 (抑制劑)。患者產(chǎn)生的抗體中和被給藥的凝血因子并使其失活。其結(jié)果，產(chǎn) 生自身抗體的患者按正常劑量給藥不能收到良好的治療效果。
針對(duì)血友病的補(bǔ)充療法，有報(bào)告顯示正在嘗試一種作為不需要通過靜 脈注射給藥凝血因子的給藥方法——基因治療方法。例如，在導(dǎo)入了編碼 第VIII因子基因的轉(zhuǎn)基因小鼠的血小板中觀察到了第VIII因子的表達(dá)，表 明了基因治療可以治療血友病(Blood 2003,; 102: 4006-4013)的可能性。然而，在實(shí)際應(yīng)用到人體治療時(shí)，有必要采用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物以外的方法，誘導(dǎo)
外源性第VIII因子基因的表達(dá)。
除了轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，還進(jìn)行了由病毒載體誘導(dǎo)第VIII因子基因表達(dá)的嘗 試。如果是病毒載體，可臨床應(yīng)用于人體。即將組合有編碼第VIII因子的 DNA的慢病毒載體導(dǎo)入骨髓細(xì)胞等，并將該骨髓細(xì)胞移植到了血液凝固異 常的小鼠模型(敲除了第VIII因子的小鼠)體內(nèi)(Mol Ther, 2003, May口( 5 Pt 1):623-631)。然而，此報(bào)告中雖然在體外觀察到了第VIII因子的很強(qiáng)的表 達(dá)，但是未能在接受移植的小鼠的末梢血中檢測出足夠的第VIII因子活性。 我們估計(jì)，在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)出了對(duì)第VIII因子的中和抗體，而該抗體是造 成體內(nèi)第VIII因子活性下降的原因。
本發(fā)明者們將整合了第VIII因子的猴免疫缺陷病毒載體導(dǎo)入到了人臍 帶血CD34陽性細(xì)胞。并將該細(xì)胞移植到NOD/SCID小鼠體內(nèi)。然后觀察 了小鼠血中第VIII因子的表達(dá)。結(jié)果，確認(rèn)到了導(dǎo)入的第VIII因子至少可 以持續(xù)表達(dá)60天以上(J GeneMed. 2004 Oct.;6(10): 1049-1060)。但是用于試 驗(yàn)的NOD/SCID小鼠處于嚴(yán)重的免疫缺陷狀態(tài)，無法對(duì)其自身抗體的影響 進(jìn)4亍"^H介。同時(shí)，在Glanzmann血小4反片幾能不全癥(Glanzmann Thrombasthenia GT)小鼠模型中，通過GPIIb啟動(dòng)子使血小板的黏附因子即整聯(lián)蛋白得以表 達(dá)，從而增強(qiáng)了血小板的活性(FangJ. et al. Blood. 2005 Oct 15;106(8):2671-9. Epub2005 Jun21.)。
非專利文獻(xiàn)1Yarovoi HV. et al., Blood 2003; 102: 4006-401非專利文獻(xiàn)2Kootstm NA. et al.，Mol Ther. 2003, May;7( 5 Pt 1):623畫63非專利文獻(xiàn)3Kikuchi J. et al. J Gene Med. 2004 Oct.;6(10):1049-1060非專利文獻(xiàn)4Fang J. et al. Blood. 2005 Oct 15;106(8):2671-9. Epub 2005 Jun 21.
發(fā)明的公開
本發(fā)明要解決的課題
本發(fā)明以提供一種治療血液凝固異常疾病的基因治療技術(shù)為課題。具 體為，本發(fā)明的課題為不依賴轉(zhuǎn)基因動(dòng)物等技術(shù)，實(shí)現(xiàn)編碼凝血因子的基 因在活體內(nèi)的表達(dá)，提供一種通過基因治療攻克血液凝固異常疾病的治療
技術(shù)。
解決課題的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明者們考慮為解決上述課題，如果能在血小板中特異性誘導(dǎo)編碼 凝血因子基因的表達(dá)或許有效。將血小板中表達(dá)的凝血因子保留在血小板 內(nèi)，以防與機(jī)體免疫系統(tǒng)發(fā)生接觸。所以，我們認(rèn)為誘導(dǎo)中和抗體的可能 性很低。這正是以往技術(shù)存在的難題。此外，出血時(shí)，血小板迅速集合到 血管的受傷部位，同時(shí)，出血部位被激活的血小板將各種止血因子釋放到 細(xì)胞外。這時(shí)，我們期待細(xì)胞內(nèi)蓄積的凝血因子能釋放到細(xì)胞外。
本發(fā)明者們考慮血小板特異性凝血因子的誘導(dǎo)表達(dá)在血液凝固異常的 基因治療中是理想的基因表達(dá)系統(tǒng)。基于這一考慮，本發(fā)明者們嘗試構(gòu)建 了血小板特異性凝血因子的表達(dá)系統(tǒng)，使用可進(jìn)行血小板特異性基因表達(dá) 的啟動(dòng)子，成功地實(shí)現(xiàn)了血小板內(nèi)凝血因子的表達(dá)。
為達(dá)到治療血液凝固異常的目的，就需要不斷地供給凝血因子，于是 進(jìn)一 步探討了慢病毒載體的應(yīng)用。即構(gòu)建了 一種血液凝固異?；蛑委熡?慢病毒載體。該載體攜帶了在血小板特異性啟動(dòng)子控制下表達(dá)的凝血因子 基因。并且在導(dǎo)入了該基因治療用載體的細(xì)胞所移植了的動(dòng)物模型體內(nèi)確 認(rèn)到血液凝固功能得到改善后完成了本發(fā)明。即本發(fā)明提供了以下血液凝 固異常的治療劑、治療方法以及治療用試劑盒。
(1) 一種血液凝固異常的治療劑，該治療劑以慢病毒載體為有效成分。 所述的慢病毒載體包含編碼凝血因子的多核苷酸以及巨核細(xì)胞和/或其衍生 的血小板特異性的啟動(dòng)子。該編碼凝血因子的多核苷酸功能性地結(jié)合于該 啟動(dòng)子。
(2) (1)的治療劑，其中所述啟動(dòng)子是GPIb啟動(dòng)子或其變體。
(3) (2)的治療劑，其中所述編碼凝血因子的多核苷酸由5'UTR介導(dǎo)結(jié) 合于上述啟動(dòng)子。
(4) (l)的治療劑，其中所述血液凝固異常為血友病A，凝血因子為第
vm因子或是其突變體。
(5) (1)的治療劑，其中所述血液凝固異常為血友病B,凝血因子為第IX 因子或其突變體。
(6) (1)的治療劑，其中所述血液凝固異常為血友病A或者血友病B,凝 血因子為第VII因子或其突變體
(7) (1)的治療劑，其中所述慢病毒載體為猴免疫缺陷病毒載體。
(8) (1)的治療劑，其中所述慢病毒載體是選自馬傳染性貧血病毒載體， 人免疫缺陷病毒1載體，人免疫缺陷病毒2載體，貓免疫缺陷病毒載體， 牛發(fā)熱性疾病病毒載體以及山羊關(guān)節(jié)炎/腦炎病毒載體中的載體之一。
(9) 一種感染了慢病毒載體的造血干細(xì)胞。其中所述慢病毒載體包含編 碼凝血因子的多核苦酸，以及對(duì)于巨核細(xì)胞和/或其衍生的血小板特異性的 啟動(dòng)子。該編碼凝血因子的多核苷酸功能性地結(jié)合于該啟動(dòng)子。
(10) 是一種感染了慢病毒載體的巨核細(xì)胞和/或其衍生產(chǎn)物的血小板。 其中所述慢病毒載體包含編碼凝血因子的多核苦酸以及巨核細(xì)胞和/或其衍 生產(chǎn)物血小板特異性啟動(dòng)子。該編碼凝血因子的多核普酸功能性地結(jié)合于 該啟動(dòng)子。
(11) 提供了蓄積了凝血因子的巨核細(xì)胞和/或血小板的制備方法，該方 法包括下述步驟將慢病毒載體感染到造血干細(xì)胞的感染步驟，其中所述 慢病毒載體包含編碼凝血因子的多核苷酸以及對(duì)巨核細(xì)胞和/或其衍生的血 小板特異性的啟動(dòng)子，該編碼凝血因子的多核苷酸功能性地結(jié)合于該啟動(dòng) 子；和培養(yǎng)感染了慢病毒載體的造血干細(xì)胞直至其分化成包含巨核細(xì)胞和/
或其衍生的血小板的細(xì)胞群的步驟。
(12) 血液凝固異常的治療方法，包含以下步驟
(a) 將慢病毒載體感染到造血干細(xì)胞的步驟。其中所述慢病毒載體包含 編碼凝血因子的多核苷酸，以及對(duì)巨核細(xì)胞和/或其衍生的血小板特異性的 啟動(dòng)子。該編碼凝血因子的多核苷酸功能性地結(jié)合于該啟動(dòng)子。
(b) 將步驟(a)的造血干細(xì)胞給藥到血液凝固異常患者的步驟。
(13) (12)的方法，其中所述造血干細(xì)胞包含采集自患者的造血干細(xì)胞。
(14) (13)的方法，其中所述造血干細(xì)胞是包含骨髓干細(xì)胞和末梢血干細(xì) 胞的其中之 一 或以上兩種的細(xì)胞。
(15) (12)的方法，將步驟(a)的造血干細(xì)胞培養(yǎng)后給藥到人體。
(16) 治療血液凝固異常的試劑盒，包含以下組分
a:包含一種慢病毒載體，所述慢病毒載體包含編碼凝血因子的多核苷 酸以及對(duì)巨核細(xì)胞和/或其衍生的血小板特異性的啟動(dòng)子，該編碼凝血因子 的多核香酸功能性地結(jié)合于該啟動(dòng)子；以及
b:采集造血干細(xì)胞的試劑。
(17) (16)的治療血液凝固異常試劑盒，還包含以下c組分。 c:誘導(dǎo)造血干細(xì)胞分化成巨核細(xì)胞所用的培養(yǎng)基。
(18) (17)的血液凝固異常治療試劑盒，其中所述用以誘導(dǎo)造血干細(xì)胞分 化成巨核細(xì)胞的培養(yǎng)基至少包含以下成分
轉(zhuǎn)鐵蛋白； 胰島素；
干細(xì)月包因子(stem cell factor);
血小板生成素；
白細(xì)胞介素-6;
Flt-3配體；及
可溶性白細(xì)胞介素-6受體。
(19) 慢病毒載體用于制備血液凝固異常治療劑的用途，該慢病毒載體 包含有編碼凝血因子的多核苷酸以及對(duì)巨核細(xì)胞和/或其衍生的血小板特異 性的啟動(dòng)子。該編碼凝血因子的多核苷酸功能性的結(jié)合于該啟動(dòng)子。
本發(fā)明涉及慢病毒載體在制造血液凝固異常治療劑中的的用途。該慢 病毒載體包含編碼凝血因子的多核苷酸，以及巨核細(xì)胞和/或其衍生產(chǎn)物血 小板中的特異性啟動(dòng)子。該編碼凝血因子的多核苷酸功能性地結(jié)合于該啟 動(dòng)子。本發(fā)明還提供血液凝固異常治療用醫(yī)藥包裝，其包括包含編碼凝 血因子的多核苷酸以及對(duì)巨核細(xì)胞和/或其衍生的血小板特異性的啟動(dòng)子的 慢病毒載體，其中該編碼凝血因子的多核苷酸功能性地結(jié)合于該啟動(dòng)子； 以及關(guān)于血液凝固異常治療的說明書。
發(fā)明的效果
基于本發(fā)明開發(fā)了血液凝固異常的新療法。使用本發(fā)明的血液凝固異 常治療劑，可以使凝血因子在血小板中長期表達(dá)，維持對(duì)血液凝固功能的 改善效果。有望實(shí)現(xiàn)少次數(shù)，長療效的理想的治療效果。具體為，治療血 友病等慢性血液凝固異常，根據(jù)本發(fā)明，例如數(shù)月治療(給藥)一次，也可以 穩(wěn)定維持血液凝固功能。
在對(duì)血友病患者給藥治療用凝血因子時(shí)，經(jīng)?？梢杂^察到會(huì)產(chǎn)生中和 抗體，從而降低治療效果。所以4吏防止中和抗體產(chǎn)生的治療方法實(shí)用化， 在血友病的治療方法中尤為重要。本發(fā)明正是使在血小板中表達(dá)的凝血因
子在細(xì)胞內(nèi)部中能夠被保存，從而大大限制了患者的免疫系統(tǒng)與外來凝血 因子的接觸機(jī)會(huì)。即本發(fā)明可以防止對(duì)為治療而給藥的凝血因子產(chǎn)生中和 抗體。
即使對(duì)已有中和抗體的血友病患者，本發(fā)明的血液凝固異常治療也會(huì) 有效。 一般而言，對(duì)已產(chǎn)生中和抗體的患者，通過血液給藥的凝血因子與 體內(nèi)的中和抗體結(jié)合后會(huì)減低其活性。而本發(fā)明的血小板內(nèi)表達(dá)的凝血因 子只要保持在血小板內(nèi)部存在，就不會(huì)與血液中的中和抗體發(fā)生接觸，所 以其活性不被中和而仍得以維持。并且，在出血部位被激活的血小板釋放 出的凝血因子，可以在出血部位幫助血液凝固。本發(fā)明的從血液中和4元體
的保護(hù)和出血部位凝血因子的釋放如圖8所示。
本發(fā)明的防止對(duì)凝血因子產(chǎn)生中和抗體的效果，在正常情況下，對(duì)血 液中分泌的凝血因子尤其有利。這些體液因子通常將凝血因子封存在血液 中以達(dá)到治療效果。因此，在治療中不可避免地會(huì)使給藥的蛋白質(zhì)與患者 的免疫系統(tǒng)發(fā)生接觸。也就是說，防止產(chǎn)生中和抗體是極為困難的。而由 于本發(fā)明能夠使必要的凝血因子保持在血小板中，所以即使是體液因子也 可達(dá)到理想的治療效果。進(jìn)而，還可以避免保持在血小板中的凝血因子與 免疫系統(tǒng)發(fā)生接觸。即本發(fā)明提供了在給藥體液凝血因子的情況下治療效 果和防止中和抗體這兩大難題的解決方法。


血小板特異性啟動(dòng)子活性的比較示意圖。(A)實(shí)驗(yàn)中使用的血 小板特異性啟動(dòng)子的圖解。將各種構(gòu)建體與無啟動(dòng)子的載體(基本)以及對(duì)照 載體(SV40/增強(qiáng)子)共同轉(zhuǎn)染到了 UT-7/TPO ( B )、 CD34+來源的巨核細(xì)胞 (C)、及HUVEC(D)中。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后測定了螢光素酶活性，與被SV40 啟動(dòng)子(SV40/增強(qiáng)子)促進(jìn)產(chǎn)生的活性做了比較。各實(shí)驗(yàn)用相同的樣品重 復(fù)試驗(yàn)了 5次。柱形及誤差棒表示平均士SD。攜帶由CMV或GPIba啟動(dòng)子促進(jìn)的eGFP基因的SIV載體轉(zhuǎn) 導(dǎo)的UT-7/TPO細(xì)胞以及CD34+由來巨核細(xì)胞中的eGFP表達(dá)示意圖。(A) 為本研究中使用的SIV構(gòu)建體概略示意圖。用SIV-pCMV-eGFP或 SIV-pGPIba-eGFP以指定的MOI數(shù)感染UT-7/TPO ( B )及CD34+由來巨核 細(xì)胞(C )。采用流式細(xì)胞術(shù)分析了細(xì)胞內(nèi)的eGFP表達(dá)。柱形及誤差棒表示
平均士SD(n-3)。 (D)采用流式細(xì)胞術(shù)調(diào)查了當(dāng)天、第5天、第7天、第 12天、以及第15天的人CD34+細(xì)胞的巨核細(xì)胞分化期間的GPIIb及GPIb 的細(xì)胞表面表達(dá)情況。柱形及誤差棒表示平均士SD (n-3)。 (E)將分化開 始后的當(dāng)天、第3天、第7天、以及第14天的CD34+由來巨核細(xì)胞，用 SIV-pCMV-eGFP或SIV-pGPIba-eGFP，以MOI30進(jìn)行了轉(zhuǎn)導(dǎo)。柱形及誤差 棒表示平均士SD (n = 3)。
圖3由SIV-CMV-eGFP對(duì)KSL細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)的示意圖。培養(yǎng)KSL 細(xì)胞，以遞增的SIV-pCMV-eGFP濃度轉(zhuǎn)染24小時(shí)(A )、或以固定濃度(MOI =30)轉(zhuǎn)染經(jīng)過不同的溫育時(shí)間(B)。用流式細(xì)胞術(shù)分析了指定的溫育后 的KSL細(xì)胞內(nèi)的eGFP的表達(dá)。圖為表達(dá)eGFP的轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的百分比。柱形 及誤差棒表示平均士SD ( n = 3 )。
圖4 a活體內(nèi)血液細(xì)胞中eGFP表達(dá)啟動(dòng)子的不同效果的表示圖。 培養(yǎng)KSL細(xì)胞，并在MOI30下由SIV-pCMV-eGFP或SIV-pGPIba-eGFP進(jìn) 行轉(zhuǎn)導(dǎo)。將100, 000個(gè)轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞與5x105個(gè)的未分級(jí)全骨髓細(xì)胞一起給藥 到放射線照射了的小鼠體內(nèi)。(A) CD45+淋巴細(xì)胞中eGFP陽性細(xì)胞及末梢 血中的粒細(xì)胞、紅細(xì)胞(RBCs)以及血小板的具有代表性的流式細(xì)胞術(shù)分 析。
圖4 b(B)移植后第14天、第30天以及第60天的CD45+淋巴細(xì) 胞(左)及血小板(右)中的eGFP陽性細(xì)胞百分比。柱形及誤差棒表示平 均士SD (每組n = 5 )。
圖4 c(C )移植后第60天、為檢測B淋巴細(xì)胞(B220 )、 T淋巴 細(xì)胞(CD3 )、粒細(xì)胞(Grl )、巨噬細(xì)胞(CDllb )及成紅血細(xì)胞(TER119 ), 使用抗體對(duì)骨髓細(xì)胞進(jìn)行了染色。用流式細(xì)胞術(shù)分析測定了各系細(xì)胞中的 GFP陽性細(xì)胞。數(shù)據(jù)為3個(gè)實(shí)驗(yàn)的代表值。
圖5從接受了 hFVIII轉(zhuǎn)導(dǎo)的KSL細(xì)胞移植的小鼠采取的器官中的 hFVin表達(dá)示意圖和照片。(A)將未被轉(zhuǎn)導(dǎo)的KSL細(xì)胞(對(duì)照)，或用 SIV-pCMV-hFVin或SIV-pGPIba-hFVIII轉(zhuǎn)導(dǎo)的KSL細(xì)胞，如"材料及方法" 中所述，注射到受到致命性放射線照射的CL57/B6小鼠體內(nèi)。圖示為所示 器官中有關(guān)hFVIII基因由來的復(fù)制的RT-PCR分析。作為對(duì)照，同時(shí)就小 鼠GAPDH的RNA做了 RT-PCR。數(shù)據(jù)為4個(gè)實(shí)驗(yàn)的代表值。(B) SIV載 體由來的mRNA表達(dá)，如"材料及方法"所述,用實(shí)時(shí)定量RT-PCR進(jìn)行定量。
柱形及均值相關(guān)區(qū)間圖為平均士SD (每組11 = 4)。
圖6移植小鼠的骨髓及脾臟的hFVIII表達(dá)照片。(A)由 SIV-pCMV-hFVIII或SIV-pGPIba-hFVIII轉(zhuǎn)導(dǎo)的KSL細(xì)胞所移植的小鼠由來 的分離骨髓細(xì)胞，對(duì)小鼠GPIba (左)及hFVIII (中央)進(jìn)行了免疫染色。 將2個(gè)圖像用右側(cè)的柱圖重疊比較。在用SIV-pGPIba-hFVIII轉(zhuǎn)導(dǎo)的骨髓細(xì) 胞中，觀察到了存在表達(dá)GPIba及FVin的重復(fù)部位。(B )各移植小鼠(陽 性染色灰色)的脾臟中的hFVIII的免疫組織化學(xué)。作為對(duì)照，同時(shí)將移 植了未被載體感染的KSL細(xì)胞的小鼠脾臟切片，做了抗FVIII抗體處理。 原始放大倍率x400。
圖7血小板靶向性基因投遞的血友病A小鼠的表現(xiàn)型改善示意圖。 (A)將用SIV-pGPIba-hFVIII轉(zhuǎn)導(dǎo)或未轉(zhuǎn)導(dǎo)的KSL細(xì)胞移植的FVIII缺損 小鼠由來的血液，在50嗎/ml的膠原蛋白及l(fā)pM的PMA中刺激15分鐘或 不刺激。離心分離后，獲取除去血小板的血漿，并用ELISA法測定了 hFVIII 抗原水平。柱形及誤差棒表示平均士SD (每組n = 4)。 (B)將作為對(duì)照的 KSL細(xì)胞或用SIV-pGPIba-hFVIII轉(zhuǎn)導(dǎo)的KSL細(xì)胞(對(duì)照為n = 10、 GPIba 為n = 8)移植后的小鼠斷尾后24小時(shí)以內(nèi)的死亡率。死亡率用統(tǒng)計(jì)學(xué)的X2 檢驗(yàn)法進(jìn)行了評(píng)價(jià)。
圖8血流中血小板內(nèi)的導(dǎo)入基因產(chǎn)物(凝血因子)被保護(hù)免遭中 和抗體的作用，和出血部位導(dǎo)入基因產(chǎn)物(凝血因子)從被激活的血小板 釋放的模式圖。
本發(fā)明的最佳實(shí)施方式
本發(fā)明涉及一種以慢病毒載體為有效成分的血液凝固異常的治療劑。 所述的慢病毒載體包含編碼凝血因子的多核苷酸，以及血小板特異性啟動(dòng) 子，該編碼凝血因子的多核苷酸功能性地結(jié)合于該啟動(dòng)子。本發(fā)明者們確 認(rèn)了通過血小板特異性啟動(dòng)子可在血小板中誘導(dǎo)目的凝血因子的表達(dá)。進(jìn) 一步確認(rèn)了慢病毒載體將該基因?qū)氲皆煅杉?xì)胞后，可以長期穩(wěn)定地表 達(dá)凝血因子，使血液凝固功能得到實(shí)際改善。
本發(fā)明中的所謂"凝血因子"是參與血液凝固過程的各種蛋白質(zhì)組分。 例如，第I因子~第XIII因子(無第VI因子)，及其活化型都包含在本發(fā) 明所述的凝血因子范疇內(nèi)。VWF等參與初期止血的蛋白質(zhì)也包含在本發(fā)明
所述的凝血因子范疇內(nèi)。本發(fā)明的凝血因子優(yōu)選來源于應(yīng)接受治療患者的 動(dòng)物種。由此，以人為治療對(duì)象時(shí)優(yōu)選使用人體由來的凝血因子。
本發(fā)明的凝血因子包含人工蛋白質(zhì)。具體來說，以下蛋白質(zhì)包含在本 發(fā)明的凝血因子范疇內(nèi)。
(1 )與天然凝血因子具有同等活性的突變體
例如，眾所周知人第Vin因子，即使缺損構(gòu)成N末端的B區(qū)域，只要 保持有活性也可作為凝血因子(Blood Vo1.81， No.ll, 1993: pp 2925-2935, Blood Vol.84， No.l2， 1994: pp 4214-4225， Eur J Biochem 1995 Aug.; 232(1): ppl9-27)。因此，缺損B區(qū)域的第VIII因子的突變體也包含在本發(fā)明的凝 血因子內(nèi)。將缺損B區(qū)域的第VIII因子的氨基酸序列編為序列號(hào)1 0 , 編碼它的cDNA的編碼域的堿基序列編為序列號(hào)9 。
其它的凝血因子，包括氨基酸序列的一個(gè)或多個(gè)附加、缺失、置換、 及插入并與天然凝血因子保持有同等活性的突變體，均包含在本發(fā)明的凝 血因子內(nèi)。
第VIII因子，是由2332個(gè)氨基酸組成的巨大蛋白質(zhì)。編碼第VIII因 子的DNA約7kb。由于已知的載體有的不能表達(dá)如此巨大的蛋白質(zhì)，為解 決這個(gè)問題，有時(shí)利用缺損B區(qū)域的突變體(1457氨基酸殘基)，以便盡量 減小表達(dá)產(chǎn)物。然而，本發(fā)明中攜帶了凝血因子基因的慢病毒載體具有可 以攜帶較大外源性基因的特征。因此，它們不僅可以攜帶缺損有B區(qū)域的 突變體，還例如可以攜帶編碼第VIII因子全長的DNA，并保持其穩(wěn)定的表 達(dá)。
另外，本發(fā)明的凝血因子優(yōu)選在蛋白質(zhì)被翻譯后，不被分泌而保存在 血小板內(nèi)。凝血因子一被分泌到血流中后，會(huì)導(dǎo)致中和抗體的誘導(dǎo)或抑制 劑的中和。因此，本發(fā)明的凝血因子優(yōu)選具有無前導(dǎo)序列的構(gòu)造。 (2)比天然凝血因子更具活性的突變體
本發(fā)明的凝血因子，不僅可以利用與天然凝血因子具有同等活性的蛋 白質(zhì)，還可以利用比天然凝血因子具有更強(qiáng)活性或其性質(zhì)被改變的蛋白質(zhì)。 可以獲得作為凝血因子的活性或在活體內(nèi)的穩(wěn)定性或者對(duì)活體的免疫原性 等改變了的凝血因子。這些含有相對(duì)于天然凝血因子而言產(chǎn)生突變，附加
例如，第VIII因子的變體(EXPERIMENTAL and MOLECULARMEDICINE, Vol. 34， No. 3, 233-238, July 2002)，或第VII因子的變體(Biochem. J. (2004) 379 (497-503))等已有報(bào)道，這些變體均包含在本發(fā)明的凝血因子 中。
本發(fā)明，例如以下所示凝血因子可用于如下所示伴有血液凝固異常疾 病的治療。對(duì)于各種凝血因子，上述(1 )或(2 )中所述突變體也可作 為本發(fā)明的凝血因子使用。
血友病A (第VIII因子、第VIIa因子)
血友病B (第IX因子)
血管性血友病(Von Willebrand，s disease)(血管性血友病因子(von Willebrand factor) )■
第I因子缺乏癥、無纖維蛋白原血癥、低纖維蛋白原血癥(第I因子) 第II因子缺乏癥(凝血酶原) 第V因子缺乏癥、副血友病(第V因子) 第VII因子缺乏癥(第VII因子)
第x因子缺乏癥(第x因子)
第XI因子缺乏癥(第XI因子) 第XIII因子缺乏癥(第XIII因子)
在這些疾病中，患者人數(shù)居多的血友病A、血友病B、及血管性血友 病為重要的社會(huì)性疾病。因此，針對(duì)各種疾病的治療有用的因子，即第VIII 因子、第VIIa因子、第IX因子、及血管性血友病因子、以及與這些因子具 有同等活性的突變體，是本發(fā)明中優(yōu)選的凝血因子。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可制備編碼本發(fā)明凝血因子的多核苦酸。例如，已知 人源VWF及第I因子~第XIII因子的氨基酸序列，或cDNA的石咸基序列。 可以cDNA的堿基序列的一部分或全部作為探針，從肝臟的cDNA庫制備 目的多核苷酸?；蛘?，將已知的堿基序列的一部分作為引物，以肝臟等適 當(dāng)組織的mRNA作為模板，根據(jù)已知的核酸擴(kuò)增法合成為所需的多核苷酸。
本發(fā)明中編碼凝血因子的多核苷酸功能性地結(jié)合于血小板特異性啟動(dòng) 子。本發(fā)明中的所謂功能性的結(jié)合，指的是根據(jù)血小板特異性啟動(dòng)子的活 性，編碼凝血因子的基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，即在該啟動(dòng)子的下游連接有編碼凝血 因子的基因?；蛘邌?dòng)子與基因功能性的結(jié)合，意指在血小板特異性啟動(dòng) 子的調(diào)控下編碼凝血因子的基因得以表達(dá)。 本發(fā)明中所謂血小板特異性啟動(dòng)子，指的是在導(dǎo)入任意的宿主細(xì)胞時(shí)，
在血小板細(xì)胞中表現(xiàn)啟動(dòng)子活性的DNA。更具體地說，血小板特異性啟動(dòng) 子是指導(dǎo)入造血干細(xì)胞時(shí)，可以在血小板或其前體細(xì)胞即巨核細(xì)胞中檢測
的啟動(dòng)子。而對(duì)血小板無特異性的啟動(dòng)子，在血小板及巨核細(xì)胞以外的細(xì) 胞中可檢測出啟動(dòng)子的活性。
啟動(dòng)子在每種細(xì)胞中的活性可根據(jù)報(bào)告基因檢測的原理進(jìn)行評(píng)價(jià)。即 制備報(bào)告基因功能性地結(jié)合于應(yīng)評(píng)價(jià)其活性的啟動(dòng)子功能性地結(jié)合的構(gòu)建 物，然后將其導(dǎo)入到各種細(xì)胞中。在導(dǎo)入了該構(gòu)建物的細(xì)胞中如能檢測出 報(bào)告基因的信號(hào)，就可檢測出啟動(dòng)子的活性。作為報(bào)告基因，已知可具有 生成焚光活性及酶活性等的各種信號(hào)的基因。更具體為，GFP(熒光活性)、 LacZ或Luc (酶活性)等可以作為報(bào)告基因使用。
本發(fā)明的所謂血小板特異性啟動(dòng)子活性，是指在該啟動(dòng)子所導(dǎo)入的細(xì) 胞群中，只要對(duì)血小板具有特異性即可。例如導(dǎo)入造血干細(xì)胞及骨髓細(xì)胞 時(shí)，在所導(dǎo)入的細(xì)胞群中最終在血小板中確認(rèn)到啟動(dòng)子活性的血小板特異 性啟動(dòng)子，包含在本發(fā)明的血小板特異性啟動(dòng)子中。本發(fā)明的血小板特異 性啟動(dòng)子的種類不限。只要具備活性，可以來源于任意動(dòng)物?；虮蝗藶楦?變的啟動(dòng)子也可使用。
例如，血小板特異性膜糖蛋白質(zhì)GPIbcc的啟動(dòng)子，就是適合于凝血因 子基因在血小板或巨核細(xì)胞中進(jìn)行特異性表達(dá)的啟動(dòng)子。具體地，GPIba 啟動(dòng)子的活性，尤其可以在巨核細(xì)胞分化的后期被強(qiáng)化。即隨著向血小板 的分化進(jìn)程其活性也逐漸增強(qiáng)。所以，該啟動(dòng)子是在血小板中特異性較高 的啟動(dòng)子。并且，與同樣作為血小板特異性啟動(dòng)子的GPIIb相比，其啟動(dòng)子 活性要更強(qiáng)。
將本發(fā)明可利用的GPIba啟動(dòng)子的力成基序列標(biāo)為序列號(hào)7 。進(jìn)而， 在包含有序列號(hào)7的堿基序列的啟動(dòng)子與其所調(diào)控下表達(dá)的基因編碼區(qū)域 之間配置非翻譯區(qū)域(5'UTR),以此提高轉(zhuǎn)錄活性。所以，例如將第VIII因 子基因功能性地結(jié)合于該啟動(dòng)子時(shí)，可以使第VIII因子基因的5'UTR介入 在GPIba和第VIII因子基因之間。在GPIba (序列號(hào)7 )的下游附加有 第VIII因子基因5'UTR的堿基序列的序列號(hào)為8 。
本發(fā)明的GPIba啟動(dòng)子，包含與該啟動(dòng)子具有同等功能的啟動(dòng)子。所
謂同等功能的啟動(dòng)子，例如序列號(hào)7的堿基序列(人)為基礎(chǔ)，可根據(jù)同 源性檢索等檢出(例如BLAST; Altschul, S. F. et al., 1990, J. Mol. Biol. 215: 403-410)。或通過以序列號(hào)7的堿基序列為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)的引物，由基因組PC R獲得的序列?；蚴褂萌艘酝獾膭?dòng)物來源的基因組庫，使用含有序列號(hào)7 的堿基序列的探針，在嚴(yán)格條件下進(jìn)行雜交，以獲得的人以外動(dòng)物來源的 同源的啟動(dòng)子。具體為，從包含GPIba啟動(dòng)子的核酸、或者作為被雜交對(duì) 象的核酸中之一來制備探針，通過由該探針檢出的與其雜交的核酸來鑒定 目的啟動(dòng)子。
嚴(yán)格的雜交條件為，例如含5xSSC(lxSSC包含150mMNaCl， 15mM 檸檬酸鈉)、7%(W/V) SDS、 100嗎/ml變性鮭精DNA、 5xdenhardt，s溶液(1 xdenhardt，s溶液含0.2。/o聚維酮、0.2%牛血清白蛋白、及0.2%聚蔗糖)的溶 液中，在48。C，優(yōu)選50。C，更優(yōu)選52。C下進(jìn)行雜交，之后與雜交同樣的溫 度，優(yōu)選60。C,更優(yōu)選65。C,進(jìn)而更優(yōu)選68。C下在2xSSC中，優(yōu)選lxSSC 中，更優(yōu)選0.5xSSC中，更優(yōu)選O.lxSSC中震蕩清洗2小時(shí)。
如此獲得的啟動(dòng)子，包含與GPIba啟動(dòng)子具有較高同源性的序列。所 謂較高同源性，具有為70%或以上，優(yōu)選75%或以上，更優(yōu)選80%或以上, 更優(yōu)選85%或以上，更優(yōu)選90%或以上，更優(yōu)選95%或以上的同一性的序 列。序列的同源性可以根據(jù)，例如BLAST程序來決定(Altschul， S. F. et al., 19卯，J. Mol. Biol. 215: 403-410)。具體為，決定石威基序列同源性時(shí)使用blastn 程序，決定氨基酸序列同源性時(shí)使用blastp程序。例如NCBI( National Center for Biothchnology Information)的BLAST網(wǎng)頁中的"Low complexity"等的過 濾的設(shè)定全部為OFF,用缺省的參數(shù)進(jìn)行計(jì)算(Altschul, S.F. et al. (1993) Nature Genet. 3:266-272; Madden, T.L. et al. (1996) Meth. Enzymol, 266:131-141; Altschul, S.F. et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402; Zhang， J. & Madden, T丄.(1997) Genome Res. 7:649-656 )。參數(shù)可使用如下數(shù) 值。
缺口形成分值(open gap cost)是核苷酸為5 、 缺口延伸分值(extend gap cost)的是核香酸為2、 核芬酸錯(cuò)S己(nucleotide mismatch)的處罰為-3、 核苷酸錯(cuò)配的報(bào)酬為1、 期望^f直(expectvalue)為10、
字長(wordsize)是核苦酸為11、
blastn中blast延伸的減少(Dropoff,X)以比特?cái)?shù)計(jì)為20、 在blastn中帶缺口比對(duì)的最終X減少值(以比特?cái)?shù)計(jì))是50 比較2個(gè)序列時(shí)，使用blast2s叫uences程序(Tatiana A et al. (1999) FEMS Microbiol Lett. 174:247-250 ),作成2序列比對(duì)，以決定序列的同源性。 缺口與錯(cuò)配同樣處理，計(jì)算GPIba啟動(dòng)子全體(例如序列號(hào)7的全長)序 列的同源性的值。
另外，GPIba啟動(dòng)子中有可能存在多態(tài)及變體。而且,一般來說對(duì)部分 堿基序列的置換及缺失或插入，大多可以維持有啟動(dòng)子的活性。如此，GPIba 啟動(dòng)子的變體可以用于本發(fā)明中。GPIba啟動(dòng)子的變體，包含序列號(hào)7的堿 基序列中的1個(gè)或多個(gè)堿基的置換、缺失、和/或插入的序列。與堿基序列 號(hào)7的不同通常在30個(gè)堿基以內(nèi)、優(yōu)選20個(gè)堿基以內(nèi)、優(yōu)選10個(gè)堿基以 內(nèi)、更優(yōu)選5個(gè)堿基以內(nèi)、更優(yōu)選3個(gè)堿基以內(nèi)、更優(yōu)選2個(gè)堿基以內(nèi)。 變體啟動(dòng)子的活性，例如可以根據(jù)如上所述的報(bào)告基因測試等方法確認(rèn)。
其結(jié)果，確認(rèn)到與GPIba啟動(dòng)子具有相同或其以上活性的啟動(dòng)子，為本發(fā) 明優(yōu)選的GPIba啟動(dòng)子。
本發(fā)明的血液凝固異常治療劑中，編碼凝血因子的多核苷酸整合在慢 病毒載體中，且該編碼凝血因子的多核苷酸功能性地結(jié)合于血小板特異性 啟動(dòng)子。以下，對(duì)可在本發(fā)明中使用的慢病毒載體進(jìn)行闡述。
病毒的生命周期大體可分為感染和增殖兩個(gè)階段。 一般來說，病毒載 體是以利用病毒的感染系統(tǒng)，將基因有效地導(dǎo)入到宿主細(xì)胞內(nèi)為特征。為 確保安全，很多病毒載體須排除增殖系統(tǒng)以使其缺失自我復(fù)制能力，以防 止導(dǎo)入細(xì)胞后增殖。
簡要說明載體粒子的構(gòu)造。首先，載體粒子中有一種被稱為衣殼的蛋 白質(zhì)外殼。衣殼由gag基因產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)構(gòu)成。在衣殼的外側(cè)有一層叫 做包膜的膜結(jié)構(gòu)。包膜具有決定感染細(xì)胞種類的功能。衣殼中存在著2個(gè) 拷貝的載體基因組RNA、 pol基因產(chǎn)物的逆轉(zhuǎn)錄酶。病毒載體一旦感染宿主 細(xì)胞，載體基因組RNA便通過上述自身的逆轉(zhuǎn)錄酶被逆轉(zhuǎn)錄后、整合到宿 主染色體，成為前病毒DNA,以完成感染。
通常，病毒載體可以通過包裝載體和轉(zhuǎn)基因載體制備。包裝載體攜帶
有敲除了包裝信號(hào)的病毒DNA。病毒DNA中包含病毒蛋白質(zhì)序列。導(dǎo)入 了包裝載體的宿主細(xì)胞叫做包裝細(xì)胞。包裝載體導(dǎo)入宿主后，由于宿主細(xì) 胞中沒有包裝信號(hào)，便形成空的病毒粒子。
轉(zhuǎn)基因載體攜帶有整合進(jìn)宿主染色體DNA所必要的病毒來源的基因 序列和需導(dǎo)入的外源性基因。本發(fā)明中血小板特異性啟動(dòng)子和編碼凝血因 子的多核香酸連接形成的構(gòu)建體作為外源性基因被搭載在轉(zhuǎn)基因載體中。 將該轉(zhuǎn)基因載體導(dǎo)入包裝細(xì)胞時(shí)，由轉(zhuǎn)基因載體所供給的載體基因組DNA 整合到宿主染色體后，可通過轉(zhuǎn)錄來制備載體基因組RNA。該載體基因組 RNA被包含到包裝細(xì)胞制作的病毒粒子中，形成具有將核酸分子導(dǎo)入進(jìn)宿 主內(nèi)能力的病毒粒子。
一般來講，將缺失自我復(fù)制功能，具有將核酸分子導(dǎo)入到宿主內(nèi)能力 的病毒粒子稱為病毒載體。尤其是，通過基因重組技術(shù)構(gòu)建的病毒載體稱 為"重組，，病毒載體。使用編碼病毒基因組的DNA和包裝細(xì)胞構(gòu)建的病毒載 體包含在重組病毒載體內(nèi)。本發(fā)明中的慢病毒載體，是包含慢病毒來源的 病毒基因組，缺失自我復(fù)制能力，具有將核酸分子導(dǎo)入到宿主內(nèi)能力的病 毒粒子。
所謂的慢病毒指的是慢病毒亞科(Lentivims)的逆轉(zhuǎn)錄病毒。例如， 以下病毒包含在慢病毒中。
人免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus; HIV ); (例如HIV1或HIV2)、 猴免疫缺P各病毒(simian immunodeficiency virus; SIV )、 貓免疫缺陷病毒(FIV)、 梅迪-維斯纟內(nèi)病毒(maedi-visna virus)、 馬傳染性貧血病毒(EIAV)、 山羊關(guān)節(jié)炎腦炎病毒(CAEV)
本發(fā)明可以利用任意的病毒4朱以及亞型來源的慢病毒。例如，HIV-1 包括所有的主要(M)亞型(包含A到J )、 N以及outlier ( O ) ( Hu, D. J. et al., JAMA 1996; 275: 210-216; Zhu, T. et al" Nature 1998, 5; 391(6667): 594-7; Simon, F. et al" Nat. Med. 1998, 4(9): 1032-7)。 SIV分離抹可以例舉出， SIVagm、 SIVcpz、 SIVmac、 SIVmnd、 SIVsm、 SIVsnm、 SIVsyk等。這些慢 病毒中猴免疫缺陷病毒(SIV)載體為特別優(yōu)選的病毒載體。 作為本發(fā)明的SIV載體，可以利用序列號(hào)14的SIV基因組的堿基序列。 或可利用已知的SIV基因組的石咸基序列(Fukasawa et al.Nature Vol. 333, p457-461, 1988; GenBank Accession No. X07805)。
本發(fā)明中的所謂"猴免疫缺陷病毒(SIV)載體"，指的是病毒粒子里核 酸分子中的病毒載體功能所必須的序列是基于SIV基因組序列的載體。本 發(fā)明中所謂"病毒載體功能所必須的序列"，可以表示成從5，側(cè)逐次為以下區(qū) 域。
5'LTR的R區(qū)域； U5區(qū)域； 包裝信號(hào)(cp); RRE;
3'LTR的啟動(dòng)子區(qū)域以外的U3區(qū)域； R區(qū)域；
作為構(gòu)成本發(fā)明中的SIV載體的各區(qū)域的石成基序列，例如可以表示如下。
序列號(hào)1 /從5'LTR區(qū)域到包裝信號(hào)的堿基序列 序列號(hào)2 /RRE序列
序列號(hào)3 /從缺失有3'LTR啟動(dòng)子區(qū)域的U3區(qū)域到R區(qū)域的堿基序
列
以上堿基序列只是例舉的其中例子，如果是具有同樣功能的堿基序列， 都可以在本發(fā)明中使用。即只要符合上述定義，本發(fā)明的SIV載體還可以 包含其突變體。例如，"病毒載體功能所必須的序列"，只要是SIV來源，就 可以包含其他SIV來源的序列或SIV以外來源的序列。可包含的優(yōu)選序列， 例如可以例舉后述的cPPT ( central polypurine tract)、內(nèi)部啟動(dòng)子(CMV )、 WPRE ( woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element )。
猴免疫缺陷病毒(Simian Immunodeficiency Virus, SIV)是在lf吳子中表 達(dá)的類似于HIV的病毒，與HIV —起稱為靈長類慢病毒(Primates Lentivirus) 類群(井戶榮治，速水正憲，猴免疫缺陷病毒的基因和感染.病原性.蛋白 核酸酵素Vol,.39,No.8. 1994)。進(jìn)而,該群大致還可以分為4個(gè)組。
1)包含導(dǎo)致獲得性免疫缺陷綜合征(acquired immune deficiency syndrome, AIDS )原因的HIV-1和從黑猩猩分離出的SIVcpz在內(nèi)的HIV-l
組
2) 由從白頂白眉猴Cercocebus atys分離的SIVsmm和從獼猴Macaca mulatta分離的SIVmac，對(duì)人有較低致病性的HIV-2( Jaffar, S. et al.， J. Acquir. Immune Defic. Syndr. Hum. Retrovirol., 16(5), 327-32， 1997 )組成的HIV-2組
3) 從非洲綠猴Cercopithecus aethiops分離的以SIVagm為代表的 SIVagm組
4) 從山魈Papio sphinx分離的以SIVmnd為代表的SIVmnd組。
其中，沒有SIVagm及SIVmnd對(duì)其自然宿主具有病原性的報(bào)告(Ohta, Y- et al., Int. J. Cancer, 15, 41(1), 115-22， 1988; Miura， T. et al.， J. Med. Primatol.: 18(3-4), 255-9, 1989;速水正憲，日本臨床，47， 1, 1989 )。有報(bào)告說，尤其是本 實(shí)施例中使用的SIVagm中一種的TYO-1抹,即使對(duì)其自然宿主食蟹猴 (Macaca facicularis)、獼猴(Macaca mulatta)進(jìn)行的感染實(shí)驗(yàn)中也不顯示病原 性(Ali， M. et al, Gene Therapy, 1(6)， 367-84, 1994; Honjo, S. et al., J. Med. Primatol., 19(1), 9-20, 1990 )。
目前,還沒有關(guān)于SIVagm對(duì)人的感染和發(fā)病報(bào)告，對(duì)人是否有病原性 尚屬未知。 一般，對(duì)靈長類的慢病毒種屬特異性較高，很少有從其自然宿 主感染其他種類并發(fā)病的例子。即使感染其發(fā)病率也很低，或者具有即使 發(fā)病其發(fā)病進(jìn)程也4艮緩十曼的傾向(Novembre， F. J. et al.， J. Virol.， 71(5)， 4086-91,1997)。所以，SIVagm，尤其是以SIVagm TYO-1抹為骨架制備的 病毒載體，與以HIV-1及其他慢病毒為骨架的載體相比，其安全性較高。 也就是說，以SIVagm TYO-1抹為骨架制備的慢病毒載體是本發(fā)明的優(yōu)選載 體。SIVagm TYO-1抹的基因組堿基序列表示為序列號(hào)1 4。
本發(fā)明的猴免疫缺陷病毒載體，可包含其他的逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組RNA 序列的一部分。例如，如下所示含有利用SIV以外的慢病毒基因組序列的 一部分置換SIV基因組的 一部分的嵌合序列的載體，也包含在本發(fā)明的SIV 載體中。
人免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Vims; HIV); 3苗免疫缺陷病毒Feline Immunodeficiency Virus( FIV X Poeschla, E. M. et al.， Nature Medicine, 4(3)， 354-7， 1998 );
山羊關(guān)節(jié)炎腦炎病毒Caprine Arthritis Encephalitis Virus ( CAEV ) (Mselli國Lakhal, L. et al., Arch. Virol" 143(4)， 681-95, 1998 ) 本發(fā)明的慢病毒載體包含攜帶有編碼凝血因子的多核苷酸的重組siv 載體。其中所述編碼凝血因子的多核苷酸功能性地結(jié)合于血小板特異性啟
動(dòng)子。在本發(fā)明中，作為凝血因子使用第vm因子時(shí)，將攜帶有編碼第vni 因子的多核苷酸的siv載體表述為siv-Fvm載體。本發(fā)明的siv-Fvm載 體，只要符合上述定義，對(duì)其種類及構(gòu)造沒有特別限制。本發(fā)明優(yōu)選的 siv-Fvm載體，可舉例出用轉(zhuǎn)基因載體制備的siv載體。該載體包含有插 入了編碼第vm因子的多核苷酸的堿基序列。
本發(fā)明的SIV-FVIII載體也可以是VSV-G假型化載體。所謂VSV-G假 型化是指，載體的包膜中包含有水皰性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus; VSV)的表面糖蛋白~~"VSV-G蛋白。VSV-G蛋白可以來源于任意的VSV 病毒株。例如可以使用印地安納(Indiana)血清型抹(J. Virology 39: 519-528 (1981))來源的VSV-G蛋白，但不限于此。VSV-G蛋白也可以是從天然來 源的蛋白質(zhì)中通過置換、缺失、和/或附加等方法改變1個(gè)或多個(gè)氨基酸來 獲取。VSV-G假型化載體，可以在生產(chǎn)病毒時(shí)通過將其與VSV-G蛋白質(zhì)共 存來制備。
例如，通過VSV-G表達(dá)載體的轉(zhuǎn)染劑及整合到宿主染色體DNA中的 VSV-G基因的表達(dá)誘導(dǎo)、通過在包裝細(xì)胞內(nèi)表達(dá)VSV-G，從該細(xì)胞產(chǎn)生的 病毒粒子可以用VSV-G假型化。由于VSV-G蛋白質(zhì)是1種糖蛋白形成穩(wěn)定 的3聚體存在于膜上，所以在純化過程中很難破壞載體粒子。同時(shí)用VSV-G 假型化的病毒粒子可以離心分離高濃度濃縮(Yang, Y. et al.， Hum Gene Ther: Sep, 6(9)， 1203-13. 1995 )。
本發(fā)明的siv-FVin載體可包含附加的其他病毒來源的包膜蛋白質(zhì)?？?以附加在siv-Fvin載體的包膜蛋白質(zhì)，例如，適合來源于感染人細(xì)胞的病 毒的包膜蛋白質(zhì)。包膜蛋白質(zhì)尤其不受此限制。例如，逆轉(zhuǎn)錄病毒的包膜 蛋白質(zhì)等可附加在siv-FVin中。
具體為，逆轉(zhuǎn)錄病毒的雙嗜性包膜蛋白質(zhì)可使用例如，小鼠白血病病
毒(MuLV) 4070A林由來的包膜蛋白質(zhì)。也可用MuMLV 10A1由來的包 膜蛋白質(zhì)(例如pCL國10Al(Imgenex) (Naviaux, R. K. et al" J. Virol. 70: 5701-5705 (1996))。其他皰滲病毒科的蛋白質(zhì)，可例舉單純皰疹病毒的gB、 gD、 gH、 gp85蛋白質(zhì)、EB病毒的gp350、 gp^0蛋白質(zhì)等。肝炎病毒科的 蛋白質(zhì)，還可例舉乙型肝炎病毒的S蛋白質(zhì)等。
可以對(duì)本發(fā)明的重組猴免疫缺陷病毒載體的LTR (長末端重復(fù)long terminal repeat)進(jìn)行改變。LTR是逆轉(zhuǎn)錄病毒特異性的序列，存在于病毒 基因組的兩端。5'LTR作為啟動(dòng)子促進(jìn)原病毒的mRNA轉(zhuǎn)錄。所以、將包 被在病毒粒子內(nèi)的編碼病毒RNA基因組的轉(zhuǎn)基因載體5'LTR的啟動(dòng)子活性 部分與其他強(qiáng)力啟動(dòng)子置換的話，可增大轉(zhuǎn)基因載體的mRNA轉(zhuǎn)錄量，提 高包裝效率及載體效價(jià)。
進(jìn)而，例如慢病毒，已知5'LTR的轉(zhuǎn)錄活性因病毒蛋白tat的作用而增 強(qiáng)。所以通過將5'LTR置換為不依賴tat蛋白的啟動(dòng)子，可以從包裝載體中 去除tat。
侵入到感染細(xì)胞內(nèi)的病毒RNA被逆轉(zhuǎn)錄后，形成兩端的LTR相結(jié)合 的環(huán)狀構(gòu)造。接著LTR間的結(jié)合部位和病毒整合酶(Integrase)共同作用，將 病毒基因組整合進(jìn)細(xì)胞染色體內(nèi)。
原病毒轉(zhuǎn)錄的mRNA為從5'LTR內(nèi)轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)下游到3'LTR的polyA 序列。5'LTR啟動(dòng)子部分在病毒內(nèi)不被包裝。所以，即使置換啟動(dòng)子，插入 到靶細(xì)胞染色體的部分不會(huì)發(fā)生變化。綜上可知，置換5'LTR啟動(dòng)子，有 利于制作較高效價(jià)和安全性的載體。所以、置換轉(zhuǎn)基因載體的5'側(cè)啟動(dòng)子， 可提高被包裝載體的效價(jià)。
另外、可以去除3'LTR的部分序列，制作自我失活型載體(Self Inactivating Vector: SIN載體)以防全長的載體mRNA從靶細(xì)胞被轉(zhuǎn)錄，提 高安全性。侵入靶細(xì)胞染色體的慢病毒的原病毒形成將3'LTR的U3部分結(jié) 合到5'端的形狀。所以轉(zhuǎn)基因載體的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物被逆轉(zhuǎn)錄后，在整合到耙細(xì) 胞染色體的狀態(tài)下，U3配置在5'端，由此和轉(zhuǎn)基因載體轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的構(gòu)造相 同的RNA^皮轉(zhuǎn)錄。
假如靶細(xì)胞內(nèi)存在慢病毒或與其類似的蛋白，被轉(zhuǎn)錄的RNA再次被包 裝，有可能再次感染其它細(xì)胞。而且位于病毒基因組3'側(cè)的宿主由來基因 有可能通過3'LTR的啟動(dòng)子被表達(dá)(Rosenberg, N., Jolicoeur， P.， Retoroviral Pathogenesis. Retroviruses. Cold Spling Harbor Laboratory Press, 475-585， 1997)。這一現(xiàn)象已被視為逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的難題，作為回避的方法而開發(fā) 出了 SIN載體(Yu， S. F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U S A， 83(10)， 3194-8, 1986)。
通過去除轉(zhuǎn)基因載體3'LTR的U3部分，使得靶細(xì)胞內(nèi)失去了 5'LTR及
3'LTR的啟動(dòng)子，所以不會(huì)引起全長RNA及宿主基因的轉(zhuǎn)錄。并且，從內(nèi) 部啟動(dòng)子只轉(zhuǎn)錄目的基因，可望成為安全性高、表達(dá)水平高的載體。這種 載體正適合本發(fā)明。SIN載體的構(gòu)建可參照公開的方法或本發(fā)明者們的專利 申請(qǐng)國際
發(fā)明者坂田洋一, 大森司, 田畑壽晃, 見供克之, 長谷川護(hù) 申請(qǐng)人:生物載體株式會(huì)社