專利名稱：：病原體的多元定量檢測(cè)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及用于同時(shí)定量測(cè)試樣品中兩種或更多種病毒、細(xì)菌或原生動(dòng)物病原體的方法和組合物.更具體地，本發(fā)明涉及用于定量測(cè)試來(lái)自個(gè)體的樣品以定量檢測(cè)和/或監(jiān)測(cè)病原體感染的方法和組合物。
背景技術(shù)：
：免疫缺陷可由多種不同的病因引起，包括由于遺傳性基因異常(例如，Chediak-Higashi綜合征、重度聯(lián)合免疫缺損、慢性肉芽腫病、DiGeorge綜合征)、接觸輻射、化學(xué)療法、重金屬或殺蟲(chóng)劑，或者由于細(xì)菌、病毒(HIV)、寄生生物或真菌感染而獲得。在器官移植手術(shù)中，尤其是在腎、肝、心、肺和骨髄移植手術(shù)中，必須抑制移植物受者的免疫系統(tǒng)，以使手術(shù)后移植排斥的可能性最小化.使用了多種免疫抑制療法，并已提出用于這一目的。然而，免疫抑制療法需要小心地進(jìn)行監(jiān)測(cè)，因?yàn)樗鼈兛蓪?dǎo)致受者對(duì)在其他情況下可被正常免疫系統(tǒng)控制的細(xì)菌和病毒的感染特別敏感。已成功應(yīng)用于臨床實(shí)踐中的免疫抑制劑包括類固醇、硫唑噤呤和環(huán)孢菌素A。在臨床實(shí)踐中必須嘗試對(duì)預(yù)防或治療移植排斥與保持一定量的受者免疫系統(tǒng)以對(duì)抗其它傳染原所需的免疫抑制程度進(jìn)行平衡。
發(fā)明內(nèi)容本文公開(kāi)了用于鑒定和測(cè)定個(gè)體患者中兩種或更多種病原體的量從而監(jiān)測(cè)疾病的出現(xiàn)和/或疾病的iu艮的方法，所述患者包括無(wú)癥狀的患者以及免疫受損并且就目的病原性疾病而言無(wú)癥狀的患者。在一方面，本文公開(kāi)的方法允許鑒定兩種或更多種靶標(biāo)多核苷酸(例如DNA或RNA)的存在和/或量，所述耙標(biāo)多核苷酸是兩種或更多種病原體特異性的并且是從該兩種或更多種病原體中制備或分離的，所述病原體特別地是可存在于給定生物樣品中的病毒、細(xì)菌和原生動(dòng)物病原體以及真菌病原體。所述方法允許單個(gè)進(jìn)行以及以多元模式進(jìn)行地檢測(cè)和定量核酸樣品中的病原體特異性耙標(biāo)核酸(例如，DNA或RNA)，這可進(jìn)一步允許在單個(gè)反應(yīng)中測(cè)定兩種或更多種靶標(biāo)核酸的水平(例如，表達(dá)水平或拷貝數(shù))。鑒定和定量臨床樣品中的病原體特異性乾標(biāo)具有多種臨床用途，其包括密切監(jiān)測(cè)免疫系統(tǒng)受損的患者。在一方面，本文所述方法^使用內(nèi)標(biāo)，其通過(guò)使用多種已知濃度的外部添加竟?fàn)巹┖怂岫玫?，所述竟?fàn)巹┖怂岙a(chǎn)生已知大小的擴(kuò)增產(chǎn)物，其大小彼此不同并與靶標(biāo)核酸的大小不同。將尺寸分離(例如通過(guò)毛細(xì)管電泳)與檢測(cè)(例如通過(guò)熒光檢測(cè))聯(lián)用，產(chǎn)生所述竟?fàn)巹┖怂岬南鄳?yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物豐度的標(biāo)準(zhǔn)曲線.所述標(biāo)準(zhǔn)曲線可用于測(cè)定原始樣品中的把標(biāo)核酸濃度。在一方面，本文所述方法涉及估計(jì)或測(cè)定核酸樣品中的病原體特異性靶標(biāo)核酸(例如，DNA或RNA)水平的方法，該方法包括對(duì)于給定的病原體特異性靶標(biāo)核酸，選擇將在擴(kuò)增所述靶標(biāo)(例如，通過(guò)PCR或RT-PCR)后產(chǎn)生長(zhǎng)度已知的靶標(biāo)擴(kuò)增子的擴(kuò)增引物對(duì)。產(chǎn)生一組至少兩種竟?fàn)巹┖怂?例如，DNA或RNA分子)，其中當(dāng)使用相同的擴(kuò)增引物對(duì)進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，所述竟?fàn)巹┊a(chǎn)生相對(duì)于把標(biāo)核酸來(lái)說(shuō)長(zhǎng)度不同但擴(kuò)增效率相似的產(chǎn)物。進(jìn)行擴(kuò)增>^應(yīng)，其中將待分析乾標(biāo)核酸水平的樣品與已知不同濃度的至少兩種竟?fàn)巹┖怂峄旌?，然后分離和檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。竟?fàn)巹┖薧^且提供了用于測(cè)定原始樣品中耙標(biāo)核酸量的內(nèi)參。該方法適用于在單次操作中測(cè)量單個(gè)樣品中多種病原體特異性靶標(biāo)核酸，這允許得到給定樣品中選定病原體扭基因序列的擴(kuò)增譜。該鐠允許精確定量給定樣品中病原體特異性核酸的水平。在一方面，本文所述方法涉及檢測(cè)免疫受損的癥狀發(fā)生前患者中的選定病原體。因?yàn)槊庖呤軗p患者(尤其是接受免疫抑制劑治療的移植物受者)中臨床癥狀的發(fā)生推遲，所以定量檢測(cè)病毒、細(xì)菌和原生動(dòng)物病原,供了一種在感染早期階段指導(dǎo)抗感染治療的方式，這通過(guò)在治療可能最有效時(shí)調(diào)整免疫抑制治療(旨在免疫抑制的以及具有免疫抑制副作用的治療)的施用和抗病原體劑(例如，抗病毒劑、抗生素、抗真菌劑)的施用來(lái)實(shí)現(xiàn)。另一方面，所述方法用于分析懷疑^^有多種預(yù)定病原體中任意種的樣品，這通過(guò)篩選樣品中用于核酸擴(kuò)增反應(yīng)的多種病原體特異性靶標(biāo)從而從每種病原體特異性把標(biāo)產(chǎn)生擴(kuò)增子來(lái)實(shí)現(xiàn)。該方法包括選擇一系列病原體特異性的引物對(duì)，其中每對(duì)引物對(duì)應(yīng)于并靶向相應(yīng)病原體的特異性核^列。這一系列病原體特異性引物在同時(shí)使用時(shí)產(chǎn)生樣品中所存在特異性病原體的不同大小的擴(kuò)增子。通過(guò)拆M分?jǐn)U增混合物iM^測(cè)擴(kuò)增子，從而測(cè)定擴(kuò)增子是否存在，如果存在的話則測(cè)定其大小?？梢栽跀U(kuò)增反應(yīng)全程中收集樣品部分以確定擴(kuò)增子何時(shí)首先出現(xiàn)，或者在擴(kuò)增^JI結(jié)束時(shí)收集樣品。另一方面，所述方法用于定量測(cè)定樣品中的多種預(yù)定病原體，所述樣品被懷疑包含至少一種病原體。該方法包括獲得被懷疑包含至少一種預(yù)定病原體的樣品。可以從環(huán)境(例如，土壤、水、動(dòng)物或人的廢物)或者從植物、動(dòng)物、冷凍組織庫(kù)或人類來(lái)源(例如，病原體攜帶者或宿主)獲得所述樣品。從樣品中分離核酸用作擴(kuò)增反應(yīng)中的模板。選擇病原體特異性引物使其對(duì)應(yīng)于樣品中懷疑存在的多種病原體之每一種。擴(kuò)增反應(yīng)中還包括對(duì)照多核苷酸，優(yōu)選竟?fàn)巹┒嗪塑账?。竟?fàn)巹┒嗪塑账崾怯糜谕ㄟ^(guò)病原體特異性引物進(jìn):行擴(kuò)增的^^L，然而所產(chǎn)生的擴(kuò)增子的大小明顯不同于佳:用相同的或任何其它病原體特異性引物與樣品或?qū)φ漳０鍟r(shí)從樣品核酸中擴(kuò)增的產(chǎn)物。竟?fàn)巹┒嗪塑账嵋蕴囟ǖ臐舛?即拷貝數(shù))加入，以允許測(cè)定病原體特異性核酸的量(即拷貝數(shù))。樣品中病原體的量可以低于該方法的檢出P艮或者不存在。在一方面，所述方法包括對(duì)相同來(lái)源的一系列樣品監(jiān)測(cè)多種預(yù)定病原體中任意種。該方法包括以規(guī)律的間隔(例如，約每周一次，約每月一次，約每季度一次)從來(lái)源獲得樣品，并使用竟?fàn)巹┒嗪塑账釘U(kuò)增法定量樣品中多種病原體的量。來(lái)源可以是免疫受損的個(gè)體，他們常常盡管被感染但卻無(wú)癥狀。通過(guò)以規(guī)律的間隔定量測(cè)定多種病原體的量，在無(wú)癥狀個(gè)體中可以檢測(cè)病原體并且可采用合適的措施，如修改導(dǎo)致個(gè)體免疫抑制的組合物施用或者采用某種治療方式從而改善和/或治療該病原體感染。定義當(dāng)提及"制備或分離自"病原體的核酸時(shí)，本文使用的術(shù)語(yǔ)"制備或分離自"是指分離自病毒或其它病原體的核酸以及復(fù)制自病毒的核酸，例如使用病毒核酸作為模板通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄或DNA聚合的過(guò)程來(lái)實(shí)現(xiàn)。所述病原體核酸可以與宿主核酸一起分離自樣品。本文使用的術(shù)語(yǔ)"病原體"是指生物體(包括微生物)，其通過(guò)直接感染另一生物或者通過(guò)產(chǎn)生在另一生物中致病的物質(zhì)(例如，產(chǎn)生病原性毒素的細(xì)菌等)而導(dǎo)致另一生物(例如，動(dòng)物和植物)發(fā)病。本文使用的病原體包括但不限于細(xì)菌、原生動(dòng)物、真菌、線蟲(chóng)、類病毒和病毒或其任意組合，其中每種病原體能夠獨(dú)立地或與另一病原體一起導(dǎo)致脊推動(dòng)物發(fā)病，所述脊推動(dòng)物包括但不限于哺乳動(dòng)物，包括但不限于人。本文使用的術(shù)語(yǔ)"病原體"還包括在非免疫受損宿主中通?？赡懿痪哂胁≡缘奈⑸?。病毒病原體的非限制性的特定實(shí)例包括HSV1、HSV2、EBV、CMV、HHV6、HHV7、HHV8、VZV、丙型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、腺病毒、EEEV、WNE、JCV和BKV。本文使用的術(shù)語(yǔ)"微生物"包括原核的和真核的微生物物種，其來(lái)自古生菌(Archaea)域、細(xì)菌域和真核生物域，后者包括酵母和絲狀真菌、原生動(dòng)物、藻類或高等原生生物。術(shù)語(yǔ)"微生物細(xì)胞"與術(shù)語(yǔ)"微生物"可交換使用。"細(xì)菌"或"真細(xì)菌"是指原核生物域。細(xì)菌包括至少以下ll個(gè)不同的群(1)革蘭氏陽(yáng)性(gram+)菌，其中存在兩個(gè)主要的分支(i)高G+C群(放線菌、分枝桿菌、微球菌等)(ii)低G+C群(芽孢桿菌、梭菌屬、乳桿菌、葡萄球菌、鏈球菌、支原體)；(2)變形菌(proteobacteria)，例如紫色光合+非光合的革蘭氏陰性菌(包括最"常見(jiàn)"的革蘭氏陰性菌)；(3)藍(lán)細(xì)菌，例如生氧型光養(yǎng)生物；U)螺旋菌和相關(guān)物種；(5)浮霉?fàn)罹鷮伲?6)類菌體，黃桿菌；(7)衣原體；(8)綠色硫黃菌；(9)綠色非硫黃菌(也叫M氧型光自養(yǎng)生物)；(10)抗輻射的微球菌及其親緣菌;(11)棲熱袍菌屬和棲熱腔菌屬的嗜熱生物。"革蘭氏陰性菌"包括球菌、非腸桿菌和腸桿菌。革蘭氏陰性菌的屬包括，例如奈瑟氏球菌屬(Neisseria)、螺菌屬(Spirillum)、巴斯德氏菌屬(Pasteurella)、布魯氏菌屬(Brucella)、耶爾森氏菌屬(Yersinia)、弗朗西絲氏菌屬(Francisella)、嗜血菌屬(Haemophilus)、博德特氏菌屬(Bordetella)、埃希氏菌屬(Escherichia)、沙門(mén)氏菌屬(Salmonella)、志賀氏菌屬(Shigella)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、變形菌屬(Proteus)、弧菌屬(Vibrio)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、擬桿菌屬(Bacteroides)、醋桿菌屬(Acetobacter)、氣桿菌屬(Aerobacter)、土壤桿菌屬(Agrobacteri腿)、固氮菌屬(Azotobacter)、螺菌屬(Spirilla)、沙雷氏菌屬(Serratia)、弧菌屬(Vibrio)、恨瘤菌屬(Rhizobium)、衣原體屬(Chlamydia)、立克次氏體屬(Rickettsia)、密螺旋體屬(Treponema)和梭桿菌屬(Fusobacterium)。"革蘭氏陽(yáng)性菌"包括球菌、非芽孢型桿菌和芽孢型桿菌。革蘭氏陽(yáng)性菌的屬包括，例如放線菌屬(Actinomyces),芽孢桿菌屬(Bacillus)、梭菌屬(Clostridium)、棒桿茵屬(Corynebacterium)、丹毒絲菌屬(Erysipelothrix)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、利斯特氏菌屬(Listeria)、分枝桿菌屬(Mycobacterium)、粘球菌屬(Myxococcus)、諾卡氏菌屬(Nocardia)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、鏈球菌屬(Streptococcus)和鏈霉菌屬(Streptomyces)。本文使用的術(shù)語(yǔ)"檢測(cè)"是指定性測(cè)定樣品中是否存在微生物。術(shù)語(yǔ)"檢測(cè)"還包括"鑒定"微生物，即根據(jù)本領(lǐng)域公認(rèn)的以及本說(shuō)明書(shū)所述的分類法來(lái)確定微生物的屬、種或林系。術(shù)語(yǔ)"檢測(cè)"還包括定量測(cè)定樣品中的微生物，例如l微升(或l毫升或l升)或l微克(或l亳克或l克或1千克)樣品中微生物的拷貝數(shù)。本文使用的術(shù)語(yǔ)"免疫受損的患者或個(gè)體"是指由于該個(gè)體的免疫系統(tǒng)不以最佳能力工作而具有發(fā)生感染性疾病風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體。在一方面，該個(gè)體是由于設(shè)計(jì)用于例如預(yù)防炎癥或預(yù)防移植物排斥的治療方案而免疫受損。本文使用的術(shù)語(yǔ)"樣品"是指分離自其天然環(huán)境并包含多核苷酸的生物材料。本文所述方法的樣品可由純化或分離的多核苷酸組成，或者它可以包含含有多核普酸的生物樣品，如組織樣品、生物流體樣品或細(xì)胞樣品。生物流體包括但不限于例如血、血漿、唾液、尿、腦脊液、灌洗液和白細(xì)胞泳動(dòng)(leukophoresis)樣品。樣品還可以是環(huán)境樣品，如土壤、水或者動(dòng)物或人的排泄物，從而檢測(cè)已發(fā)生特定病原體相關(guān)疾病暴發(fā)的區(qū)域中病原體的存在情況。樣品還可以從組織庫(kù)或其它來(lái)源獲得，用于分析存檔樣品或者在移植前測(cè)試組織?？捎糜诒疚乃龇椒ㄖ械臉悠房梢允前嗪塑账岬娜魏沃参?、動(dòng)物、細(xì)菌或病毒材料，或者來(lái)源于它們的任何材料。樣品由于任意多種原因而"被懷疑包含多種預(yù)定病原體中的至少一種"。例如，如果生活在土壤樣品收集位置附近的人或動(dòng)物表現(xiàn)出與土壤病原體相關(guān)的病癥或疾病癥狀，則該土壤樣品可被懷疑包含病原體?；蛘?，可懷疑免疫抑制個(gè)體或由于其它原因而對(duì)感染敏感的個(gè)體是病原體的宿主或攜帶者，而^現(xiàn)出明顯的感染征兆。即使不存在感染，也可懷疑取自所述個(gè)體的樣品包含多種病原體中的至少一種。本文使用的術(shù)語(yǔ)"擴(kuò)增子"是指來(lái)自核酸擴(kuò)增反應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物。該術(shù)語(yǔ)泛指已知大小的特異性預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物，其由使用給定的擴(kuò)增引物組產(chǎn)生。本文使用的術(shù)語(yǔ)"逆轉(zhuǎn)錄物"是指RNA鏈的DNA互補(bǔ)體，其通過(guò)RNA依賴性DNA聚合酶活性而產(chǎn)生。本文使用的術(shù)語(yǔ)"竟?fàn)巹┒嗪塑账?或"核酸竟?fàn)巹?是指長(zhǎng)度和組成已知的核酸模板，其可使用選擇用于擴(kuò)增靶標(biāo)核酸的寡核苷酸引物對(duì)進(jìn)行擴(kuò)增。在某些實(shí)施方案中，所述竟?fàn)巹┖怂峥梢允荝NA分子，在這種情況下它可以叫作"竟?fàn)巹㏑NA"或"RNA竟?fàn)巹?。在另一些實(shí)施方案中，所述竟?fàn)巹┖怂峥梢允荄NA分子，在這種情況下它可以叫作"竟?fàn)巹〥NA"或"DNA竟?fàn)巹?。"竟?fàn)巹┖怂?(無(wú)論DNA或RNA)將產(chǎn)生比由乾標(biāo)核酸所產(chǎn)生的擴(kuò)增子更長(zhǎng)或更短的擴(kuò)增子，例如已知的可區(qū)分長(zhǎng)度，例如分別為靶標(biāo)核酸中內(nèi)部插入或缺失的長(zhǎng)度。所述內(nèi)部插入或缺失應(yīng)該為1至20個(gè)核香酸或威基，優(yōu)選5至20個(gè)核苷酸或威基，或者5至10個(gè)核苷酸或威基。耙標(biāo)與竟?fàn)巹U(kuò)增子的長(zhǎng)度差異為1至20個(gè)核苷酸長(zhǎng)度，優(yōu)選5至20或者5至10個(gè)核苷酸長(zhǎng)度。優(yōu)選地，插入序列不會(huì)引入形成靶標(biāo)序列中不存在的穩(wěn)定二級(jí)結(jié)構(gòu)的能力。預(yù)測(cè)核酸二級(jí)結(jié)構(gòu)的軟件在本領(lǐng)域是乂^的。當(dāng)使用選定的擴(kuò)增引物對(duì)時(shí)，"竟?fàn)巹┒嗪似账?將具有與靶標(biāo)核酸相似的擴(kuò)增效率。用于核酸擴(kuò)增時(shí)，本文使用的術(shù)語(yǔ)"相似的效率"是指使用相同組引物以及等量的耙標(biāo)和竟?fàn)巹┠０瀹a(chǎn)生的檢測(cè)靶標(biāo)和竟?fàn)巹┖怂釘U(kuò)增產(chǎn)物的循環(huán)閾值(thresholdcycle,Ct)是相同的?？梢杂?jì)算部分循環(huán)的Ct。然而，當(dāng)循環(huán)數(shù)的整數(shù)部分相同時(shí)，一種擴(kuò)增子的Ct與另一擴(kuò)增子的Ct"相同"，即，在本文使用的術(shù)語(yǔ)中，2.0、2.3和2.6的Ct是"相同"的。本文使用的"Ct"是PCR循環(huán)數(shù)，在該循環(huán)數(shù)時(shí)PCR產(chǎn)物的信號(hào)強(qiáng)度達(dá)到擴(kuò)增產(chǎn)物信號(hào)強(qiáng)度背景值IO倍標(biāo)準(zhǔn)差的閾值。本文中，信號(hào)強(qiáng)度是指來(lái)自已摻入熒光標(biāo)記(通過(guò)標(biāo)記引物或者摻入標(biāo)記的核苷酸)的擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)，是對(duì)樣品中的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行毛細(xì)管電泳之后測(cè)量的，所述樣品來(lái)自循環(huán)反應(yīng)的多個(gè)循環(huán)點(diǎn)。擴(kuò)增效率的另一個(gè)度量是在連續(xù)的循環(huán)中測(cè)量擴(kuò)增產(chǎn)物的量(例如，通過(guò)熒光整合或標(biāo)簽摻入)，使用公式E=(Pn+1-Pn)/(Pn-P^)計(jì)算效率，其中P-循環(huán)n時(shí)的擴(kuò)增產(chǎn)物量。如果靶標(biāo)與竟?fàn)巹┖怂嶂g效率差異的絕對(duì)值小于0.2，則擴(kuò)增效率是"相似的"。在本文所述的方法中，如果靶標(biāo)與竟?fàn)巹┖怂岬臄U(kuò)增效率以任一這些標(biāo)準(zhǔn)(優(yōu)選以所述兩種標(biāo)準(zhǔn))而言是"相似的"，則效率是"相似的"。"能介導(dǎo)擴(kuò)增"的引物對(duì)應(yīng)理解為特異性針對(duì)靶標(biāo)、具有適當(dāng)?shù)慕怄湝囟炔⑶也话^(guò)多的二級(jí)結(jié)構(gòu)的引物對(duì)。本文提供了設(shè)計(jì)能介導(dǎo)擴(kuò)增的引物對(duì)的指導(dǎo)方針。本文使用的"促進(jìn)擴(kuò)增的條件"是制造商針對(duì)擴(kuò)增用酶提供的擴(kuò)增條件。應(yīng)當(dāng)理解的是，酶可以在一定范圍的^(例如，離子濃度、溫度、酶濃度)下起作用。還應(yīng)當(dāng)理解的是，擴(kuò)增可能需要多種溫度(例如，在PCR中)。促進(jìn)擴(kuò)增的條件不需J^對(duì)反應(yīng)中所有引物和靶標(biāo)而言都是一致的，并且反應(yīng)可在仍可能發(fā)生擴(kuò)增的次優(yōu)^Ht下進(jìn)行。本文使用的術(shù)語(yǔ)"等分試樣"是指取自擴(kuò)增反應(yīng)混合物的樣品體積。等分試樣的量可以變化，但通常會(huì)在給定的實(shí)驗(yàn)操作中恒定。等分試樣小于整個(gè)反應(yīng)混合物的體積。當(dāng)在擴(kuò)增期間取出X個(gè)等分試樣時(shí)，等分試樣的體積將小于或等于所述>^應(yīng)體積的1/X。本文使用的術(shù)語(yǔ)"分配"是指分配、轉(zhuǎn)移、取出、擠出或除去。本文使用的短語(yǔ)"在多個(gè)階段從Jl應(yīng)混合物分配等分試樣"是指在擴(kuò)增反應(yīng)期間取出等分試樣至少兩次，并優(yōu)選至少約3、4、5、10、15、20、30或更多次。"階段"是指在給定循環(huán)數(shù)時(shí)或之后的點(diǎn)，或者當(dāng)擴(kuò)增為非循環(huán)時(shí)它是指在反應(yīng)起始時(shí)或之后的選定時(shí)間。本文使用的"分離"樣品中的核^A指通過(guò)大小對(duì)核酸片段進(jìn)行分離的過(guò)程。所述分離的方法應(yīng)該能夠分離大小差異為10個(gè)核苷酸或更少(或者，10個(gè)4^對(duì)或更少，例如使用非變性條件時(shí))的核酸片段。本文所述方法中所使用分離技術(shù)的優(yōu)選分辨率包括相差5個(gè)核苷酸或更少(或者，5個(gè)>^^或更少)的核酸分辨率，高至(并包括)僅相差一個(gè)核苷酸(或一個(gè)>^^)的核酸分辨率。本文使用的"可通過(guò)毛細(xì)管電泳區(qū)分的大小"的提法是指至少一個(gè)核苷酸(或4^J")的差異，但優(yōu)選至少5個(gè)核苷酸(或4^對(duì))或更多、高至(并包括)10個(gè)核苷酸(或>5^對(duì))或更多的差異。當(dāng)涉及多核苷酸長(zhǎng)度使用時(shí)，本文使用的術(shù)語(yǔ)"明顯不同于"是指該多核苷酸的長(zhǎng)度可通過(guò)毛細(xì)管電泳與另一多核苷酸區(qū)分開(kāi)的長(zhǎng)度。本文使用的術(shù)語(yǔ)"擴(kuò)增產(chǎn)物"是指多核苷酸，它是擴(kuò)增反應(yīng)中產(chǎn)生的特定多核苷酸的拷貝。本發(fā)明的"擴(kuò)增產(chǎn)物"可以是DNA或RNA，并可以是雙鏈或單鏈。擴(kuò)增產(chǎn)物在本文中也稱為"擴(kuò)增子"。本文4吏用的術(shù)語(yǔ)"擴(kuò)增"或"擴(kuò)增>^應(yīng)"是指產(chǎn)生特定多核苷酸序列的拷貝或者增加特定多核苷^列的拷貝數(shù)或量的反應(yīng)。例如，多核苷酸擴(kuò)增可以是使用聚合酶和寡核苷酸引物對(duì)來(lái)產(chǎn)生多于初始存在量的任何特定多核苷酸序列(即完整或部分的靶標(biāo)多核苷酸序列)的過(guò)程。可通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的體外方法進(jìn)行擴(kuò)增。通常參見(jiàn)PCRTechnology:PrinciplesandApplicationsforDNAAmplification(H.A.Erlich編輯)FreemanPress,NY，NY(1992);PCRProtocols:AGuidetoMethodsandApplications(Innis等編輯)AcademicPress,SanDiego,CA(1990);Mattila等，NucleicAcidsRes.19:4967(1991);Eckert等，PCRMethodsandApplications1:17(1991);PCR(McPherson等編輯)，IRLPress,Oxford;以及美國(guó)專利號(hào)4,683,202和4,683,195,其中每篇文獻(xiàn)均通過(guò)參考整體并入本文。另一些擴(kuò)增方法包括但不限于(a)連接酴漣式反應(yīng)(LCR)(參見(jiàn)Wu和Wallace,Genomics4:560(1989)和Landegren等,Science241:1077(1988));(b)轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增(Kwoh等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:1173(1989));(c)自持續(xù)序列擴(kuò)增(GuatelH等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:1874(1990));和(d)基于核酸的序列擴(kuò)增(NABSA)(參見(jiàn)Sooknanan，R.和Malek,L.，BioTechnology13:563-65(1995))，其中每篇文獻(xiàn)均通過(guò)參考整體并入本文。本文使用的"靶標(biāo)多核苷酸"(例如包括耙標(biāo)RNA或靶標(biāo)DNA)是待分析的多核苷酸?？稍谑褂帽景l(fā)明的方法進(jìn)行分析前分離或擴(kuò)增靶標(biāo)多核苷酸。例如，所述耙標(biāo)多核苷酸可以;l位于寡核苷酸引物對(duì)兩個(gè)成員的雜交區(qū)域之間的序列，所述引物用于擴(kuò)增所述乾標(biāo)多核苷酸。乾標(biāo)多核苷酸可以是RNA或DNA(例如包括cDNA)。靶標(biāo)多核苷酸序列通常作為較大"模板"序列的一部分存在；然而，在某些情形中，乾序列和模板是相同的。本文4吏用的"病原體特異性靶標(biāo)多核苷酸"是如上定義的耙標(biāo)多核苷酸，其中所述乾標(biāo)多核苷^A制備或分離自目的病原體、并且僅在所分析的一組不同病原體的一個(gè)成員中存在的多核苷酸。本文使用的"寡核苷酸引物"是指能與多核苷酸模板退火并提供3，末端以產(chǎn)生與所述多核香酸互補(bǔ)的延伸產(chǎn)物的多核苷酸分子(即DNA或RNA)。起始和延伸的條件通常包括在適當(dāng)?shù)木彌_液("緩沖液"包括作為輔因子或者影響pH、離子強(qiáng)度等的替代物)中以及合適的溫度下存在4種不同的脫氧核苷三磷酸(dNTP)和聚合誘導(dǎo)劑(如DNA聚合酶或逆轉(zhuǎn)錄酶活性)。本文所述的引物可以是單鏈或雙鏈。所述引物優(yōu)選為單鏈以實(shí)現(xiàn)最高擴(kuò)增效率?？捎糜诒疚乃龇椒ㄖ械?引物"小于或等于100個(gè)核普酸的長(zhǎng)度，例如小于或等于90、80、70、60、50、40、30、20、15個(gè)，但優(yōu)選長(zhǎng)于10個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度。本文使用的"標(biāo)記"或"可檢測(cè)標(biāo)記"是指可用于提供可檢測(cè)(優(yōu)選可定量)信號(hào)的任何部分或分子。"標(biāo)記核苷酸"(例如，dNTP)或"標(biāo)記多核苷酸"是與可檢測(cè)標(biāo)記連接的核苷酸。術(shù)語(yǔ)"連接"包括共價(jià)和非共價(jià)健合，例如通過(guò)氳鍵、離子鍵或范德華鍵鍵合。這些鍵合可以在至少兩個(gè)相同或不同的原子或離子間由于所述原子或離子的電子密度重新分配而形成。標(biāo)記可提供可通過(guò)熒光、放射性、比色分析、重量分析、X射線衍射或吸收、磁性、酶活性、質(zhì)鐠分析、結(jié)合親和力、雜交射頻、納米晶體等進(jìn)行檢測(cè)的信號(hào)。本文所述方法中可使用的核苷酸可以是標(biāo)記的，從而擴(kuò)增產(chǎn)物中可摻入該標(biāo)記核苷酸，并變?yōu)榭蓹z測(cè)的。根據(jù)本發(fā)明，熒光染料4_優(yōu)選的標(biāo)記。合適的熒光染料包括熒光色素如Cy5、Cy3、羅丹明及衍生物(如得克薩斯紅)、熒光素及衍生物(如5-溴甲基熒光素)、螢光黃、IAEDANS、7-Me2N-香豆素畫(huà)4-乙酸酯、7-OH-4-CH3-香豆素-3畫(huà)乙酸酯、7-NH2-4-CH3-香豆素-3-乙酸酯(AMCA)、monobromobimane、三磺酸芘(pyrenetrisulfonate)，如Cascade藍(lán)和單溴甲基-ammoniobimane(實(shí)施參見(jiàn)DeLuca,ImmunofluorescenceAnalysis,AntibodyAsaTool,Marchalonis，等編輯，JohnWiley&Sons,Ltd.,(1982)，其通過(guò)參考并入本文中)。本文使用的術(shù)語(yǔ)"標(biāo)記核苷酸，，還旨在包括固有地發(fā)出熒光的合成或生物化學(xué)衍生的核苷酸類似物，例如美國(guó)專利號(hào)6,268,132和5,763,167所述，Hawkins等(1995,NucleicAcidsResearch,232872-2880)、Seela等(2000，HelveticaChimicaActa,83:910-927)、Wierzchowski等(1996，BiochimicaetBiophysicaActa,1290:9誦17)、Virta等(2003,Nucleosides,Nucleotides&NucleicAcids,22:85-98)，其通過(guò)參考整體并入本文中。"固有地發(fā)出熒光"；l指核苷酸類似物具有獨(dú)特的光鐠，并在其生理M下選擇性激發(fā)和發(fā)射的能力方面不同于通常存在的常規(guī)核苷。對(duì)于固有地發(fā)出熒光的核苷酸來(lái)i兌，熒光通常發(fā)生在近紫外波長(zhǎng)至可見(jiàn)波長(zhǎng)。優(yōu)選地，熒尤t生在250nm至700nm的波長(zhǎng)，最優(yōu)選在250nm至500nm的可見(jiàn)波長(zhǎng)。術(shù)語(yǔ)"可檢測(cè)標(biāo)記"或"標(biāo)記"包括自身或者通過(guò)與另一標(biāo)記相互作用能產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)的分子或部分。所述"標(biāo)記"可以^1信號(hào)產(chǎn)生系統(tǒng)的成員，并因此可與該信號(hào)產(chǎn)生系統(tǒng)的另一些成員一起產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)，例如，生物素-抗生物素蛋白信號(hào)產(chǎn)生系統(tǒng)，或用于熒光共振能傳遞(fluorescentresonanceenergytransfer,FRET)的^#>-受體對(duì)(Stryer等，1978，Ann.Rev.Biochem.，47:819;Selvin，1995，MethodsEnzymol"246:300)或者結(jié)合核酸(DNA或RNA分子)后產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)的核酸結(jié)合染料。本文使用的術(shù)語(yǔ)"核苷酸"或"核酸"是指核苷的磷酸酯，例如單、雙、三和四磷酸酯，其中最常見(jiàn)的酯化位點(diǎn)是附著于戊糖(或非戊糖的"糖部分"的等價(jià)位置)C-5位的羥基。術(shù)語(yǔ)"核苷酸"包括常規(guī)核苷酸和非常規(guī)核苷酸，其包括但不限于硫代磷酸酯、亞磷酸酯、成環(huán)原子(ringatom)改性的衍生物等，例如固有地發(fā)出熒光的核苷酸。本文使用的術(shù)語(yǔ)"常規(guī)核苷酸"是指天然存在的脫氧核苷酸(dNTP)之一，包括dATP、dTTP、dCTP、dGTP、dUTP和dITP。本文使用的術(shù)語(yǔ)"非常規(guī)核苷酸"是指不是天然存在核苷酸的核苷酸。術(shù)語(yǔ)"天然存在的，，是指無(wú)人類介入地存在于自然界中的核苷酸。相反，術(shù)語(yǔ)"非常規(guī)核普酸"是指僅在人類介入下存在的核苷酸。"非常規(guī)核苷酸"可包括其中戊糖和/或一個(gè)或多個(gè)磷酸酯替換為各自類似物的核苷酸。示例性戊糖類似物為先前就核苷類似物所描述的類似物。示例性磷酸酯類似物包括但不限于烷基膦酸酯、甲基膦酸酯、M磷酸酯、磷酸三酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯(phosphoroselenoate)、二硒代磷酸西旨(phosphorodiselenoate)、phosphoroanilothioate、phosphoroanilidate、磷跣胺(phosphoroamidate)、磷酸硼等，包括任何相關(guān)的平衡離子(如果存在的話)。非常規(guī)核苷酸可顯示與另一人工核普酸的堿基配對(duì)偏好性超過(guò)常規(guī)核香酸(例如，如Ohtsuki等2001，Proc.Natl.Acad.Sci.,98:4922-4925所述，其因此通過(guò)參考并入本文)。可通過(guò)如Ohtsuki等(如上)所述的T7轉(zhuǎn)錄測(cè)定來(lái)測(cè)量堿基配對(duì)能力。另一些非限制性"人工核苷酸"實(shí)例可見(jiàn)于Lutz等(1998)Bioorg.Med.Chem.Lett"8:1149-1152;Voegel和Benner(1996)Helv.Chim.Acta76,1863-1880;Horlacher等(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.，92:6329-6333;Switzer等(1993)，Biochemistry32:10489-10496;Tor和Dervan(1993)J.Am.Chem.Soc.115:4461-4467;Piccirilli等(1991)Biochemistry30:10350-10356;Switzer等(1989)J.Am.Chem.Soc.Ill:8322-8323，所有文獻(xiàn)均通過(guò)參考并入本文。"非常規(guī)核苷酸"還可以是簡(jiǎn)并核普酸或固有地發(fā)出熒光的核苷酸。本文使用的術(shù)語(yǔ)"簡(jiǎn)并核苷酸"表示可以為dA、dG、dC和dT中任一種的核普酸，或者可與dA、dG、dC和dT中至少兩種進(jìn)^ft威基配對(duì)的核普酸。與dA、dG、dC和dT中至少兩種進(jìn)^ft威基配對(duì)的簡(jiǎn)并核苷酸的非限制性列表包括肌苷、5-硝基吡咯(5-nitropyrole)、5-硝基吲哚、次黃嘌呤、6H，8H,4-二氫嘧啶并[4，5c[1,2沙星-7-酮(P)、2-^J^-6-甲氧氨基嘌呤、dPTP和8-氧-dGTP。提及引物時(shí)，本文使用的術(shù)語(yǔ)"相反方向"指一種引物包含與靶標(biāo)多核普酸模板的有義鏈互補(bǔ)的核苷酸序列，另一引物包含與同一乾標(biāo)多核苷酸模板的反義鏈互補(bǔ)的核苷酸序列。相反方向的引物可由與其互補(bǔ)的匹配多核苷酸模板產(chǎn)生PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。相反方向的兩種引物可叫作反向引物和正向引物。本文使用的術(shù)語(yǔ)"相同方向"指引物包含與靶標(biāo)多核苷酸模板的同一條逸互補(bǔ)的核苷酸序列。相同方向的引物不會(huì)由與其互補(bǔ)的匹配多核苷酸^^L產(chǎn)生PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。本文使用的"多核苷酸"或"核酸"通常指任何多核糖核苷酸或多脫氧核糖核苷酸，其可以是未經(jīng)修飾的RNA或DNA或者經(jīng)修飾的RNA或DNA。"多核苷酸"非限制地包括單鏈和雙鏈多核苷酸。本文使用的術(shù)語(yǔ)"多核苷酸"包括多核苷酸的化學(xué)、Sl^l或代謝修飾形式，以及病毒及細(xì)胞(包括例如簡(jiǎn)單細(xì)胞和復(fù)雜細(xì)胞)特征性的DNA和RNA化學(xué)形式。用于本發(fā)明的多核苷酸可以是分離的或純化的多核苷酸，或者它可以是在擴(kuò)增反應(yīng)中擴(kuò)增的多核苷酸。本文使用的術(shù)語(yǔ)"組"是指至少兩成員的一個(gè)組。因此，寡核苷酸引物"組"包括至少兩種寡核苷酸引物。一方面，寡核苷酸引物"組"是指足以從多種靶標(biāo)病原體中的每個(gè)成員特異性擴(kuò)增核酸擴(kuò)增子的一組引物——通常，所述多種靶標(biāo)病原體的每個(gè)成員需要一對(duì)寡核苷酸引物，(應(yīng)注意，在某些方面，這些引物對(duì)還用于擴(kuò)增一種或多種竟?fàn)巹┗騼?nèi)標(biāo)模板)。本文使用的術(shù)語(yǔ)"對(duì)"是指兩個(gè)(種)。因此，寡核苷酸引物"對(duì)"是兩種寡核苷酸引物。當(dāng)使用寡核苷酸引物"對(duì)"從雙^^^SL(例如，基因組DNA或cDNA)產(chǎn)生延伸產(chǎn)物時(shí)，優(yōu)選該寡核香酸引物對(duì)與雙，板的不同鏈雜交，即它們具有相反的方向。提及多核苷酸時(shí)，本文使用的"分離的"或"純化的"是指天然存在的序列已從其正常細(xì)胞環(huán)境取出或者在非天然環(huán)境中合成(例如，人工合成)。因此，"分離的"或"純化的"序列可以在無(wú)細(xì)胞溶液中或置于不同的細(xì)胞環(huán)境中。術(shù)語(yǔ)"純化的"并不意味著所M列是惟一存在的核苷酸，而是它基本上不含(純度約卯-95%，高至99-100%)與其天然相關(guān)的非核苷酸或非多核苷酸物質(zhì)。本文使用的術(shù)語(yǔ)"cDNA"是指通過(guò)RNA依賴性DNA聚合酶活性(例如，逆轉(zhuǎn)錄酶)的作用由RNA;^板產(chǎn)生的互補(bǔ)或復(fù)制多核苷酸。本文使用的"互補(bǔ)"是指多核苷酸單鏈(或其一部分)與反向平行的多核普酸鏈(或其一部分)雜交、從而在互補(bǔ)鏈之間形成雙鏈多核苷酸的能力，所述雜交通過(guò)反向平行多核苷酸單鏈中核苷酸之間連續(xù)的堿基配對(duì)(即，不被任何未配對(duì)核苷酸打斷)來(lái)實(shí)現(xiàn)。如果第一多核苷酸中的每一個(gè)核苷酸均與第二多核苷酸的互補(bǔ)區(qū)內(nèi)的核苷酸形成堿基配對(duì)，則稱所述第一多核苷酸與所述第二多核苷酸鏈"完全互補(bǔ)"。如果第一多核苷酸中的一個(gè)核普酸不與第二多核苷酸中對(duì)應(yīng)的核苷酸堿基配對(duì)，則稱所述第一多核苷酸與所述第二多核苷酸鏈不完全互補(bǔ)(即部分互補(bǔ))。多核苷酸鏈之間的互補(bǔ)性程度對(duì)于多核苷酸鏈之間退火或雜交的效率和強(qiáng)度有顯著影響。il^依賴于多核苷酸鏈之間結(jié)合的擴(kuò)增反應(yīng)中尤其重要。如果引物中至少50%(優(yōu)選60%，更優(yōu)選70%、80%,更優(yōu)選90%或更多)的核苷酸與靶標(biāo)多核苷酸上的核苷酸形成>^^，則該寡核苷酸引物與該靶標(biāo)多核苷酸"互補(bǔ)"。在擴(kuò)增反應(yīng)的情形中使用時(shí)，本文使用的術(shù)語(yǔ)"分析"是指對(duì)乾標(biāo)多核普酸進(jìn)行定性的(即，存在與否、大小檢測(cè)或同一性等)或定量的(即量)測(cè)定，這可以是基于標(biāo)記所產(chǎn)生信號(hào)的大小(強(qiáng)度)或數(shù)目的可見(jiàn)的或自動(dòng)化的評(píng)估。所述多核苷酸的"量"(例如，以嗎、pmol或拷貝數(shù)衡量)可通過(guò)本領(lǐng)域公知的方法(例如，通過(guò)UV吸收或熒光強(qiáng)度，通過(guò)將^上的條帶強(qiáng)度與長(zhǎng)度和量已知的參照進(jìn)行比較)來(lái)測(cè)量，例如，如BasicMethodsinMolecularBiology,(1986,Davis等,Elsevier,NY)和CurrentProtocolsinMolecularBiology(1997,Ausubel等，JohnWeley&Sons,Inc.)所述。本發(fā)明中一種測(cè)量多核苷酸量的方式是測(cè)量該多核苷^L射的熒光強(qiáng)度，并將其與參照多核苷酸(即已知量的多核苷酸)發(fā)射的熒光強(qiáng)度進(jìn)行比較。本文使用的"癌癥治療"是指目標(biāo)為降低癌癥的嚴(yán)重程度或至少部分消除癌癥的任何治療?；蛘?，"癌癥治療"是指目標(biāo)為降低或至少部分地消除癌癥轉(zhuǎn)移的任何治療。再或者，癌癥治療是指目標(biāo)為降低或至少部分地消除轉(zhuǎn)移性結(jié)節(jié)生長(zhǎng)(例如，在手術(shù)除去原發(fā)瘤之后)的任何治療。換言之，癌癥治療是指目標(biāo)為減緩、控制、降低對(duì)象中癌癥的可能性或概率或者推遲癌癥發(fā)病的任何治療。本文使用的術(shù)語(yǔ)"癌癥，，具有其在本領(lǐng)域中的含義，例如，不受控制的組織和/或細(xì)胞生長(zhǎng)，其具有擴(kuò)散至身體遠(yuǎn)端部位的潛力(即，轉(zhuǎn)移)。示例性癌癥包括但不限于白血病、淋巴瘤、結(jié)腸癌、腎癌、肝癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、卵巢癌、黑色素瘤等。本文使用的術(shù)語(yǔ)"移植物"是從一個(gè)個(gè)體移植到另一個(gè)體的身體部分、器官、組織、細(xì)胞或其部分。所述移植物可以是例如異種的、同種異體的、同基因遺傳^it的或者遺傳改造的自體移植物。本文使用的術(shù)語(yǔ)"毛細(xì)管電泳，，指來(lái)自擴(kuò)增^^應(yīng)的等分試樣中核酸分子的電泳分離，其中所述分離在毛細(xì)管中進(jìn)行?？捎玫拿?xì)管內(nèi)徑約10至300nm，并且長(zhǎng)度可為約0.211~約3111，但優(yōu)選0.5cm至20cm,更優(yōu)選0.5cm至10cm。另外，"毛細(xì)管電泳"的定義特別地包括4吏用^^見(jiàn)流體的微毛細(xì)管(例如可從Caliper或AgilentTechnologies獲得)。本文使用的"免疫抑制藥物"是指降低免疫系統(tǒng)啟動(dòng)針對(duì)病原體的有效應(yīng)答t能力的藥劑。例如在以合適劑量施用時(shí)導(dǎo)致胸腺或淋巴結(jié)的T細(xì)胞失活的藥物。這樣的藥劑非限制性實(shí)例為皮質(zhì)類固醇、環(huán)孢菌素、FK-506和雷帕霉素。本文使用的術(shù)語(yǔ)"無(wú)癥狀的"是指不顯示被給定病原體或給定的病原體組合感染的特征性身體癥狀的個(gè)體。本文使用的"多種"或"組"是指多于兩種，例如3種或更多、4種或更多、5種或更多、6種或更多、7種或更多、8種或更多、9種或更多、10種或更多等。圖1顯示本文所述方法中包括的代表性病毒Genbank登記號(hào)的表。圖2是同時(shí)檢測(cè)6種病毒病原體的電泳圖的代表性實(shí)例。對(duì)應(yīng)于所標(biāo)出的病毒CMV(巨細(xì)胞病毒)、BK(BK病毒，人多瘤病毒)、JC(JC病毒，人多瘤病毒)、HHV6(人皰疹病毒6)、HHV7(人皰疹病毒7)和EBV(EB病毒)的擴(kuò)增DNA片段(即擴(kuò)增子)在36cm毛細(xì)管陣列上使用ABI3730遺傳分析儀系統(tǒng)進(jìn)行分離。圖3是檢測(cè)與圖2相同的6種病毒病原體的擴(kuò)增曲線的代表性實(shí)例。將標(biāo)明拷貝數(shù)的每種病毒引入含有熒光標(biāo)記引物的反應(yīng)混合物中，從而進(jìn)行實(shí)時(shí)分析。在所標(biāo)明的循環(huán)結(jié)束時(shí)取出一部分?jǐn)U增混合物，并通過(guò)毛細(xì)管電泳進(jìn)行分離。以對(duì)數(shù)標(biāo)度將相對(duì)熒光單位(峰面積的對(duì)數(shù))對(duì)循環(huán)數(shù)作圖。圖4是一系列校準(zhǔn)曲線的代表性實(shí)例，其顯示檢測(cè)給定拷貝數(shù)的每種病毒耙標(biāo)的循環(huán)閾值(Ct)。閾值循環(huán)數(shù)定義為對(duì)應(yīng)于通過(guò)GeneMapper數(shù)據(jù)分析軟件(AppliedBiosystems,FosterCity，CA)計(jì)算為35000^光單位的循環(huán)數(shù)。圖5是所列靶標(biāo)的靶標(biāo)特異性寡核苷酸表。發(fā)明詳述由于基因組學(xué)的出現(xiàn)，微生物(包括病原體)現(xiàn)在可以基于微生物特異性基因或轉(zhuǎn)錄物的存在進(jìn)行鑒定。轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)水平的表ii^式均已引起對(duì)致病性和潛在診斷工具的其他構(gòu)想。本文所述方法涉及用于診斷和定量多種類型病原體感染的精確、靈敏并且同時(shí)進(jìn)行的方法，其中使用特異性針對(duì)每種待測(cè)病原體的寡核苷酸組作為引物，從而擴(kuò)增臨床樣品中試圖檢測(cè)的每種特定病原體的病原體轉(zhuǎn)錄物或基因組的特定區(qū)域。所述病原體選自病毒、細(xì)菌、原生動(dòng)物和真菌?；蛘撸霾≡w選自病毒、細(xì)菌和原生動(dòng)物?；蛘?，所述病原體選自病毒和細(xì)菌。本文所述方法涉及用于診斷和定量多種類型病毒感染的精確、靈敏并且同時(shí)進(jìn)行的方法，其中使用特異性針對(duì)每種待測(cè)病毒的寡核苷酸組作為引物，從而擴(kuò)增臨床樣品中試圖檢測(cè)的每種特定病毒的病毒轉(zhuǎn)錄物或基因組的特定區(qū)域。本文所述的方法可用于檢測(cè)來(lái)自任何個(gè)體的樣品中的病原體。然而，因?yàn)槊庖吖δ芟陆祵?dǎo)致免疫受損狀態(tài)，所述免疫受損狀態(tài)可使宿主易患來(lái)源于病原體(包括病毒病原體)的嚴(yán)重的和危及生命的疾病，所以對(duì)處于或懷疑處于免疫受損狀態(tài)的個(gè)體監(jiān)測(cè)可能對(duì)該個(gè)體的健康有害的病原體(包括病毒病原體)是有益的。對(duì)來(lái)自患者(特別^fe疫抑制患者)樣品中病原體(病毒病原體)的早期檢測(cè)為先行治療提供了機(jī)會(huì)，所述治療包括例如改變向患者施用的l壬何免疫抑制劑的劑量。通常，在以下群體中進(jìn)行針對(duì)導(dǎo)致感染性疾病的病原體的診斷性檢測(cè)顯示一種或多種病原性感染的特征性癥狀的患者，或者與患有一種或多種病原性感染的個(gè)體有接觸的人，或者由于其他原因而懷疑已發(fā)生由一種或多種病原體引起的感染性疾病的人。對(duì)免疫受損的患者(特別是在移植物或組織的移植后接受免疫抑制治療的患者或者接受導(dǎo)致免疫系統(tǒng)嚴(yán)重抑制的治療(例如癌癥化療治療)的患者)的處置向傳統(tǒng)的診斷模式提出了挑戰(zhàn)。首先，與免疫活性個(gè)體相比，在免疫缺陷患者中感染性疾病特征性的臨床癥狀的發(fā)生被推遲，并一般伴隨著感染性疾病的較晚期階段和更高的病原體效價(jià)。這種效應(yīng)使抗感染治療復(fù)雜化，并可導(dǎo)致患者的結(jié)局較差。其次，免疫抑制治療常常導(dǎo)致先前被M免疫系統(tǒng)有效控制的潛伏性感染再次活躍。在這些情況下，簡(jiǎn)單地檢測(cè)病原體存在是不夠的，相反，定量監(jiān)測(cè)病原體效價(jià)及其變化對(duì)于患者和醫(yī)生將更有價(jià)值。另外，在感染發(fā)作時(shí)或其早期階段檢測(cè)疾病U可有助于盡早施用有效的治療，從而增加成功的機(jī)會(huì)。同樣，在對(duì)移植患者進(jìn)行免疫抑制治療的具體實(shí)例中，監(jiān)測(cè)感染性疾病的^JL可用于調(diào)整免疫抑制藥物的方案，從而幫助免疫系統(tǒng)對(duì)抗病原體，而同時(shí)平衡移植排斥的可能性。雖然定量監(jiān)測(cè)無(wú)癥狀個(gè)體中的病原體通常是不實(shí)際的，然而對(duì)于接受免疫抑制治療的患者來(lái)說(shuō)卻可能是非常有益的。特別地，對(duì)移植后患者監(jiān)測(cè)病原體感染可改善移植后存活，并使移植排斥最小化。如果不是作為針對(duì)每種特定目的感染的單個(gè)測(cè)試，而^1作為對(duì)來(lái)自患者的單個(gè)樣品進(jìn)行的平行測(cè)定組，或者優(yōu)選地作為對(duì)免疫受損患者顯示最高風(fēng)險(xiǎn)的病原體的多元測(cè)定組，那么定量監(jiān)測(cè)患者中的病原體是特別實(shí)用的。所述故膾測(cè)的病原體可基于許多因素進(jìn)行選擇，所述因素包括但不限于患者中免疫抑制的原因、個(gè)體所接觸的環(huán)境因素和個(gè)體表現(xiàn)出的癥狀。這些考慮因素是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這樣的多元測(cè)定可使用分子診斷方法來(lái)開(kāi)發(fā)，特別是使用對(duì)病原體特異性核酸進(jìn)行PCR擴(kuò)增的方法。使用PCR來(lái)檢測(cè)和/或定量測(cè)定樣品中病毒的方法包括如KimuraH，等QuantitativeanalysisofEpstein-Barrvirusloadbyusingareal-timePCRassay.J.ClinMicrobiol.37:132，1999;MartellM，等High-throughputreal-timereversetranscription-PCRquantitationofhepatitisCvirusRNAJClinMicrobiol.February1999;37(2):327濕32;MercierB，等SimultaneousscreeningforHBVDNAandHCVRNAgenomesinblooddonationsusinganovelTaqManPCRassay.JVirolMethods.January1999;77(1):1-9。PCR方法可包括外源對(duì)照，如使用在提取步驟、逆轉(zhuǎn)錄步驟或PCR步驟中加入的人工引入的已知濃度核酸分子。加入已知濃度的外源核酸作為定量?jī)?nèi)標(biāo)的概念由Chelly等(1988)Nature333:858-860(其通過(guò)參考并入本文中)引入。在PCR中使用外源核酸作為內(nèi)標(biāo)描述于以下文獻(xiàn)中，例如WO93/02215;WO92/11273.;美國(guó)專利號(hào)5,213,961和5,219,727，所有文獻(xiàn)均通過(guò)參考并入本文中。已證明類似的策略在使用等溫?cái)U(kuò)增>^應(yīng)定量測(cè)量核酸中有效，所述等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)如NASBA(Kievits等，1991，J.Virol.Methods35:273-86)或者SDA(Walker,1994，NucleicAcidsRes.22:2670-7)。毛細(xì)管電泳已用于定量檢測(cè)基因表達(dá)。Rajevic等(2001，PflugersArch.442(6Suppll):R190-2)7>開(kāi)了用于檢測(cè)癌基因差異表達(dá)的方法，其通過(guò)使用7對(duì)引物同時(shí)檢測(cè)多種癌基因表達(dá)的差異來(lái)實(shí)現(xiàn)。用熒光染料標(biāo)記有義引物的5，端。多元熒光RT-PCR的結(jié)果通過(guò)毛細(xì)管電泳利用ABI-PRISM310遺傳分析儀進(jìn)行分析。Borson等(1998,Biotechniques25:130-7)描述了用于定量低豐度mRNA轉(zhuǎn)錄物的策略，其基于將定量竟?fàn)幮阅孓D(zhuǎn)錄PCR(QC-RT-PCR)與毛細(xì)管電泳(CE)聯(lián)用，用于快速分離和檢測(cè)產(chǎn)物。George等(1997,JChromatogrBBiomedSciAppl695:93-102)描述了將毛細(xì)管電泳系統(tǒng)(ABI310)用于鑒定熒光差異顯示生成的EST模式。Odin等(1999,JChromatogrBBiomedSciAppl734:47-53)描述了具有多色檢測(cè)的自動(dòng)化毛細(xì)管^電泳，用于分離和定量PCR擴(kuò)增的cDNA。除了基于核酸的檢測(cè)以外，還可使用病毒、細(xì)菌和/或原生動(dòng)物特異性標(biāo)志物實(shí)現(xiàn)病毒、細(xì)菌和/或原生動(dòng)物的多元檢測(cè)。這些標(biāo)志物包括特異性針對(duì)每種待檢測(cè)病毒、細(xì)菌和/或原生動(dòng)物的蛋白質(zhì)、碳水化合物或脂質(zhì)。盡管所述方法對(duì)于檢測(cè)病原體存在是有用的，但是它們對(duì)于多元測(cè)定(例如本文所教導(dǎo)的方法)來(lái)說(shuō)不夠靈敏，并且常常由于它們通常不如本發(fā)明的方法靈敏而需要更多的樣品。多種方法可用于檢測(cè)一種或多種生物標(biāo)志物，包括使用特異性結(jié)合所述生物標(biāo)志物的一種或多種抗體的方法。提及抗體或其他結(jié)合部分時(shí)，短語(yǔ)"特異性結(jié)合"是指靶標(biāo)標(biāo)志物的存在(即使是所述乾標(biāo)標(biāo)志物存在于蛋白質(zhì)和其它生物材料的異質(zhì)群中時(shí))所決定的結(jié)合反應(yīng)。因此，在指定的測(cè)定條件下，特異性結(jié)^P分優(yōu)先與特定的靶標(biāo)標(biāo)志物結(jié)合，并且不大量結(jié)合測(cè)試樣品中存在的其它組分。多種免疫測(cè)定形式可用于選擇與特定病原體發(fā)生特異性免^應(yīng)的抗體。例如，常規(guī)地將固相ELISA免疫測(cè)定用于選擇與分析物發(fā)生特異性免疫反應(yīng)的單克隆抗體。參見(jiàn)Harlow和Lane(1988)Antibodies,ALaboratoryManual,ColdSpringHarborPublications,NewYork,其描述了可用于測(cè)定特定免^應(yīng)的免疫測(cè)定形式和條件。通常，對(duì)特定靶標(biāo)具有特異性的抗體將結(jié)合數(shù)量至少為背景兩倍的靶標(biāo)，更通常超過(guò)背景的10至100倍?？舍槍?duì)任意數(shù)目的病原體特異性生物分子來(lái)產(chǎn)生抗體，所述生物分子包括蛋白質(zhì)、碳水化合物或脂質(zhì)。優(yōu)選地，所述標(biāo)志物分子在病原體增殖期間產(chǎn)生，并位于病原體顆粒表面上或被病原體感染的細(xì)胞表面上。另夕卜，標(biāo)記可從病原體或被病原體感染的細(xì)胞中分泌出來(lái)，或者可在病原體或被病原體感染的細(xì)胞裂解期間釋放至溶液中。一種CMV病毒特異性的病毒標(biāo)記是卯65基質(zhì)蛋白。特異性結(jié)合卯65基質(zhì)蛋白的抗體可在基于抗體的方法中用于定量檢測(cè)活躍復(fù)制的CMV，定(如ELISA)(ClinDiagnVirol.1996May5(2-3):81-卯GrandienM.)。可使用特異性結(jié)合主要衣殼蛋白VP1的抗體來(lái)檢測(cè)人多瘤JC病毒(JVirolMethods.1996May;59(l-2):177-87;ChangD，LiouZM，OuWC，WangKZ，WangM,FungCY，TsaiRT.)。可通過(guò)使用特異性結(jié)合基質(zhì)蛋白G的抗體的免疫測(cè)定來(lái)測(cè)量人單純皰滲病毒。而且，可通過(guò)特異性結(jié)合G蛋白兩種變體(gGl和gG2)之一的抗體來(lái)區(qū)分HSV的兩種主要類型(HSV1和HSV2)，(JVirolMethods.1999Dec;83(l-2):75-82.CoylePV，DesaiA，WyattD,McCaugheyC，O，NeilIHJ.)?？墒褂锰禺愋越Y(jié)合脂多糖(LPS)(細(xì)菌膜外部的主要組分)的抗體來(lái)檢測(cè)病原性革蘭氏陰性菌(JImmunolMethods.2005Mar;298(1-2):73-81.ThirumalapuraNR,MortonRJ,RamachandranA,MalayerJR.)?？墒褂锰禺愋越Y(jié)合60kDa蛋白質(zhì)(統(tǒng)稱為p60)的抗體來(lái)險(xiǎn)測(cè)單核細(xì)胞增生利斯特氏菌(Lysteriamonocytogenes)，p60由iapU曼襲相關(guān)蛋白)基因編碼并由單核細(xì)胞增生利斯特氏菌大量分泌至培養(yǎng)基中(ClinDiagnLabImmunol.2004May;11(3):446-51.YuKY，NohY,ChungM,ParkHJ,LeeN，YounM,JungBY,YounBS.)?？梢杂锰禺愋越Y(jié)合脂阿拉伯甘露聚糖(lipoarabinomannan,LAM)(分枝桿菌的細(xì)胞壁外部主要的特異性糖脂組分)的抗體來(lái)測(cè)量結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)(JMicrobiolMethods.2001May;45(1):41誦52.HamasurB，BruchfeldJ,HaileM,PawlowskiA，BjorvatnB，KalleniusGSvensonSB.)。可通過(guò)多種不同的測(cè)定平臺(tái)來(lái)進(jìn)行使用免疫測(cè)定的多元檢測(cè)，所述測(cè)定平臺(tái)檢測(cè)用熒光染料標(biāo)記的抗體或者與能產(chǎn)生可測(cè)量信號(hào)(有色染料、熒光或發(fā)光染料)的酶化學(xué)連接的抗體。這樣的測(cè)定平臺(tái)的實(shí)例包括病原體感染細(xì)胞的免疫熒光或免疫酶染色(ImmunocytochemicalMethodsandProtocols(MethodsinMolecularBiology),LoretteC.Javois(Editor),HumanaPress,1999)、i^:^疫測(cè)定(ELISA)(TheELISAGuidebook(MethodsinMolecularBiology),J.R.Crowther(Editor),HumanaPress,2000)、由LuminexInc商品化的有色小珠(如美國(guó)專利6,524,793所述)、多元ELISA微陣列(例如由Endogen(FisherScientificCo的一個(gè)分支)商品化的SearchLight平臺(tái))。發(fā)生的機(jī)會(huì)性感染(細(xì)菌的、病毒的、真菌的或原生動(dòng)物/寄生生物的)的確切類型取決于免疫學(xué)改變的類型和程度(其為細(xì)胞的、體液的、呑噬細(xì)胞的還是聯(lián)合的缺陷)；還取決于存在于內(nèi)部和外部環(huán)境中的生物。向移植受者施用皮質(zhì)類固醇和其他免疫毒性藥物可導(dǎo)致大量抑制宿主防御的所有階段，包括皮膚和粘膜屏障的破壞。腸道需氧型微生物(主要為細(xì)菌和念珠菌)是導(dǎo)致肝移植受者中發(fā)生感染的潛在原因，所述感染發(fā)生在移植后的第一和第二個(gè)月。通常的部位為腹部、血流、肺和手術(shù)傷口。腸道營(yíng)養(yǎng)常常是在移植后時(shí)期向虛弱的患者提供充足養(yǎng)分所必需的，并且這對(duì)于避免真菌性膿毒癥來(lái)說(shuō)可能優(yōu)于腸外營(yíng)養(yǎng)。然而，腸配方也是極好的微生物培養(yǎng)基并容易被污染，并可導(dǎo)致胃腸炎和膿毒癥。經(jīng)常污染腸配方的生物包括陰溝腸桿菌(五"te6"Cterc/OflCflC)、肺炎克雷伯氏菌)、鏈球菌、銅綠假單胞菌(/^ei/^/M卵flSflerwgf'"o湖)、沙雷氏菌屬物種(5Wrflft'"spp.)、檸檬酸桿菌屬物種(OWfl"^*spp.)和芽^&^t菌屬物種(5""7/"sspp.)。有幾種病原體可能對(duì)處于免疫受損狀態(tài)的個(gè)體是危險(xiǎn)的，其包括但不限于細(xì)菌，所述細(xì)菌包括但不限于B組鏈球菌、大腸桿菌、單核細(xì)胞增生利斯特氏菌(Z/sten'"/fio/itfc^toge"es)、腦膜炎奈瑟氏球菌(iVe/s^fnVi附e"iVigiY/flfc)、肺炎鏈球菌(5^e/;toacc"s/we"附o"iVie)、流感嗜血菌(^Tfl纖o;p緒"s,7|/7"^潔)、肺炎鏈球菌(5"./meM附做)或腦膜炎奈瑟氏球菌(TV./we"/"g/ftVfc)、單核細(xì)胞增生利斯特氏菌(1.附ortoqvtoge"es)、銅綠假單胞菌、腦膜炎球菌性腦膜炎(附e/iiVigococc"/附e附Vig/ft's)、肺炎球菌'性肺炎(/wei/附oc0ccfl//wei/附wi/fl)、諾卡氏菌屬物種(7V(9Cfln/iVispp.)、軍團(tuán)菌屬物種Ug/ofie//"spp.)、革蘭氏陰性芽孢桿菌、炭疽芽孢桿菌(5fl"7/wsfl/i^mc/s)、鼠疫耶爾森氏菌(Ferw7i/fl/eW/s)、肉毒桿菌(C7o對(duì)nW/"附紐"http://""附)、土拉熱弗朗西絲氏菌(似/flmisis)、大腸桿菌、弧菌屬物種(v幼nVspp.)、志賀氏菌屬物種(57^ge//flspp.)、單核細(xì)胞增生利斯特氏菌、空腸舌曲桿菌(Cfl附外，toto^勿'M"i')、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌(P^r>i/flewte/Yco/f7/cfl)、霍亂弧菌(v幼n'oc/^/eme)、沙門(mén)氏菌、單核細(xì)胞增生利斯特氏菌、腸侵襲性大腸桿菌和結(jié)核分枝桿菌(Afyco6fl"eW"w似6wcw/仍/s)，并包括但不限于原生動(dòng)物包括微小隱孢子蟲(chóng)(Oj/7tos/wnVZ/"附/flrvM附)、人環(huán)抱子蟲(chóng)(Q;c/仍/wmcfl聲flwe/isis)、藍(lán)氏賈第鞭毛蟲(chóng)((7/fln/,'")、溶組織內(nèi)阿米巴(五""附^6"/r/s/o(v"Cfl)、人剛地弓形蟲(chóng)(toxo/;/flswiflgowrf//)和微孢子蟲(chóng)有幾種病毒可能對(duì)處于免疫受損狀態(tài)的個(gè)體是危險(xiǎn)的，所述病毒包括但不限于HSV1、HSV2、EBV、CMV、HHV6、HHV7、HHV8、VZV、丙型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、腺病毒、EEEV、WNE、JCV和BKV。在免疫受損患者中感染有害病原體(包括病毒病原體)的威脅需要監(jiān)測(cè)外周血的病毒7jC平以及其它病原體的水平?？墒褂锰禺愋葬槍?duì)每種皿測(cè)病毒的個(gè)體血清學(xué)技術(shù)來(lái)險(xiǎn)測(cè)病原體。然而，個(gè)體血清測(cè)試是昂貴并且低效的。核酸擴(kuò)增方法(如PCR)可能允許在疾病ib艮的早期階段進(jìn)行病原體檢測(cè)，而不用等待產(chǎn)生免疫應(yīng)答(如果事實(shí)上產(chǎn)生任何免疫應(yīng)答的話)。由于PCR相關(guān)方法的靈敏度以及PCR檢測(cè)樣品中病原體基因組存在情況的能力，樣品中病原體的存在和數(shù)量均可在早期階段使用PCR技術(shù)與血清學(xué)技^M目比更靈敏地測(cè)定。一方面，本發(fā)明涉及用于在單個(gè)測(cè)定中檢測(cè)來(lái)自免疫受損個(gè)體的生物樣品中多種病原體之任意種的存在情況的方法。所述多種病原體包括病毒、細(xì)菌、原生動(dòng)物、真菌及其任意組合。所述方法包括以下4個(gè)步驟。第一步包括對(duì)多種病原體中的每種病原體選擇寡核苷酸引物對(duì)，所述引物對(duì)在一組擴(kuò)增條件下介導(dǎo)從制備或分離自目的病原體的核酸中擴(kuò)增長(zhǎng)度已知并選定的多核苷酸擴(kuò)增子。將來(lái)自目的病原體的擴(kuò)增子的長(zhǎng)度設(shè)計(jì)成不同于任何其它擴(kuò)增子的長(zhǎng)度，所述其它擴(kuò)增子來(lái)自制備或分離自患者樣品中所分析多種病原體中其余每個(gè)成員的每種病原體核酸耙標(biāo)。為多種病原體的每個(gè)成員選擇一對(duì)引物建立了用于同時(shí)擴(kuò)增一組擴(kuò)增子的寡核苷酸引物組，每種擴(kuò)增子對(duì)應(yīng)于多種病原體中的一種病原體。第二步包括在允許多核苷酸擴(kuò)增的條件下將來(lái)自生物樣品的核酸或通過(guò)如逆轉(zhuǎn)錄的方法制備或分離自生物樣品的核酸與所述寡核苷酸引物組接觸。當(dāng)所述多種病原體的一個(gè)或多個(gè)成員存在于生物樣品中時(shí)，通過(guò)擴(kuò)增^JL產(chǎn)生了指示每個(gè)存在成員的存在情況的已知長(zhǎng)度擴(kuò)增子。第三步包括通過(guò)大小來(lái)分離擴(kuò)增的核酸分子。第四步包括檢測(cè)分離的核酸。在實(shí)踐中，可以將分離和檢測(cè)步驟聯(lián)用，例如，通過(guò)例如毛細(xì)管電泳分離標(biāo)記核酸，并通過(guò)如毛細(xì)管尾部或其附近的熒光進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)所分離擴(kuò)增子的檢測(cè)是基于每種擴(kuò)增子的已知長(zhǎng)度。將每種擴(kuò)增子的長(zhǎng)度設(shè)計(jì)成明顯不同于來(lái)自其它靶標(biāo)核酸的其余擴(kuò)增子的長(zhǎng)度。因此，每種所檢測(cè)擴(kuò)增子的大小^f吏得能夠測(cè)定多種目的病原體中的哪種(如果有的話)存在于生物樣品中。該方法的變化包括但不限于，在擴(kuò)增期間的一個(gè)或多個(gè)間隔時(shí)從擴(kuò)增反應(yīng)物中取樣(例如從反應(yīng)混合物取出等分試樣)。這可以允許得到可精確測(cè)定每種病原體;^板原始量的擴(kuò)增鐠。該方法的另一些變化包括在擴(kuò)增步驟前對(duì)從生物樣品中純化的核酸分子進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。這可以允許檢測(cè)例如RNA病毒的病毒基因組，或者檢測(cè)病毒轉(zhuǎn)錄物以及來(lái)自其它類型病原體的轉(zhuǎn)錄物的存在。另外，本方法能夠在單個(gè)測(cè)定中檢測(cè)生物樣品中至少兩種病原體的存在，或者檢測(cè)生物樣品中至少3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、11種、12種、13種、或14種、或15種或者至少多達(dá)16種的不同病原體的存在。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述病原體的檢測(cè)來(lái)自擴(kuò)增多種病原體來(lái)源的靶標(biāo)分子的單個(gè)擴(kuò)增>^應(yīng)。在另一實(shí)施方案中，待檢測(cè)的病毒病原體選自HSV1、HSV2、EBV、CMV、HHV6、HHV7、HHV8、VZV、丙型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、腺病毒、EEEV、WNE、JCV和BKV。另外，本方法能夠同時(shí)檢測(cè)制備或分離自生物樣品的核酸樣品中至少兩種病毒特異性靶標(biāo)分子的存在，或者檢測(cè)制備或分離自生物樣品的測(cè)試核酸中至少3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、11種、12種、13種、或14種、或15種或者至少多達(dá)16種病毒特異性乾標(biāo)分子，并且可包括檢測(cè)選自以下的至少兩種或者至少3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、ll種、12種、13種、或14種、或15種或者至少多達(dá)16種不同特異性病毒乾標(biāo)的存在HSV1、HSV2、EBV、CMV、HHV6、HHV7、HHV8、VZV、丙型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、腺病毒、EEEV、WNE、JCV和BKV。本文所述方法的另一方面是樣品可得自已施用治療過(guò)程的個(gè)體，所述治療過(guò)程導(dǎo)致個(gè)體免疫受損。這些治療包括但不限于對(duì)移植患者和癌癥患者開(kāi)出的免疫抑制治療。本文所述的方法可用于監(jiān)測(cè)免疫抑制治療或?qū)е旅庖咭种频闹委煹倪^(guò)程。本文所述的方法還可包括定量樣品中待測(cè)定的多種病原體中每一種病原體的步驟。一方面，通it^測(cè)試核酸樣品中加入至少兩種核酸竟?fàn)巹┓肿觼?lái)增強(qiáng)定量，所述核酸竟?fàn)巹┓肿訒?huì)與制備或分離自病原體的病原體特異性耙標(biāo)核酸^吏用相同的引物以相似的效率擴(kuò)增。加入測(cè)試核酸樣品中的每組竟?fàn)巹┌袠?biāo)的濃度是已知的，并可以彼此相差至少一個(gè)數(shù)量級(jí)。所述竟?fàn)巹┖怂峥砂琑NA和/或DNA。本文所述方法提供了用于在來(lái)自免疫受損患者的樣品中檢測(cè)和定量多種目的病原體的方法，所述方法包括對(duì)每種給定病原體選擇對(duì)該病原體具有特異性的病原體特異性靶標(biāo)多核苷酸。在此方法中，對(duì)每種給定的病原體特異性把標(biāo)多核苷酸選擇一對(duì)寡核苷酸擴(kuò)增引物，從而該引物對(duì)將產(chǎn)生對(duì)給定病原體特異性靶標(biāo)多核苷酸的至少一部分具有特異性并由其產(chǎn)生的已知長(zhǎng)度擴(kuò)增子，其中所述擴(kuò)增子的長(zhǎng)度不同于產(chǎn)生自任何其它選定病原體特異性靶標(biāo)多核苷酸或產(chǎn)生自竟?fàn)巹┒嗪塑账岬臄U(kuò)增子的長(zhǎng)度。此方法還包括合成一種或多種竟?fàn)巹┒嗪塑账?，從而?dāng)使用前面段落所述的寡核苷酸擴(kuò)增引物對(duì)時(shí)，每種竟?fàn)巹┒嗪塑账釋a(chǎn)生已知長(zhǎng)度的擴(kuò)增子，其中所述擴(kuò)增子的長(zhǎng)度不同于產(chǎn)生自任何病原體特異性靶標(biāo)多核苷酸或任何其它竟?fàn)巹┒嗪塑账岬臄U(kuò)增子的長(zhǎng)度。此方法還包括從患者樣品中純化多核普酸，所述多核普酸為RNA、DNA或二者均有。對(duì)于RNA的情況，4吏用逆轉(zhuǎn)錄酶形成cDNA。此方法還包括向純化和/或制備自個(gè)體樣品的多核苷酸中添加預(yù)定量的所述一種或多種竟?fàn)巹┒嗪塑账?，從而形成多核苷酸測(cè)試混合物。每一種竟?fàn)巹┒嗪塑账嵋员舜瞬煌?例如一個(gè)對(duì)數(shù)的級(jí)別)的已知濃度添加。然后，在允許從每種病原體特異性耙標(biāo)多核苷酸以及竟?fàn)巹┖塑账岙a(chǎn)生擴(kuò)增子的條件下，使用第一和第二寡核苷酸擴(kuò)增引物對(duì)，在單個(gè)多元測(cè)定中擴(kuò)增存在于多核苷酸測(cè)試混合物中的每種靶標(biāo)多核苷酸，每對(duì)引物特異性針對(duì)每種測(cè)定病原體。該方法還包括分離前面段落中所述PCR反應(yīng)中產(chǎn)生的擴(kuò)增子，并檢測(cè)這些擴(kuò)增子的每一種。所產(chǎn)生擴(kuò)增子的長(zhǎng)度可用于鑒定擴(kuò)增子來(lái)自哪些靼標(biāo)多核苷酸，并因此能夠鑒定從樣品檢測(cè)到哪些病原體。此方法還可包括定量前面段落中所鑒定的每種病原體特異性靶標(biāo)多核苷酸，其通過(guò)將產(chǎn)生自每種病原體特異性靶標(biāo)多核苷酸的擴(kuò)增子量與產(chǎn)生自一種或多種各自的竟?fàn)巹┒嗪塑账釘U(kuò)增子量進(jìn)行比較來(lái)實(shí)現(xiàn)，因?yàn)樵诩磳⑦M(jìn)行擴(kuò)增前，每種竟?fàn)巹┒嗪塑账嵋灶A(yù)定量存在于測(cè)試多核苷酸測(cè)試混合物中。每種病原體特異性耙標(biāo)多核苷酸的數(shù)量對(duì)應(yīng)于個(gè)體樣品中存在的各個(gè)目的病原體的量?？衫妹?xì)管電泳(CE)分離擴(kuò)增子，并且一種或多種寡核苷酸擴(kuò)增引物可以與可檢測(cè)標(biāo)記連接。所述可檢測(cè)標(biāo)記可包括但不限于熒光標(biāo)記、放射性標(biāo)記、比色標(biāo)記、磁性標(biāo)記和酶標(biāo)記。從擴(kuò)增測(cè)定中檢測(cè)到的每種擴(kuò)增子的量可通過(guò)測(cè)量標(biāo)記信號(hào)(例如通過(guò)測(cè)量熒光)來(lái)測(cè)定。在每種病原體特異性靶標(biāo)多核苷酸包括RNA的情形中，提供了在擴(kuò)增前進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄病原體特異性靶標(biāo)多核普酸和竟?fàn)巹㏑NA多核苷酸的步驟。因此，在對(duì)RNA和DNA均獨(dú)立進(jìn)行純化的方法中，在獨(dú)立的擴(kuò)增反應(yīng)中分析純化的RNA和純化的DNA?；蛘撸灰辽僖环N靶標(biāo)為RNA病毒或者試圖檢測(cè)病毒轉(zhuǎn)錄物或病原體轉(zhuǎn)錄物時(shí)，就可使用逆轉(zhuǎn)錄步驟?？赏ㄟ^(guò)PCR或使用轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增(如TMA和NASBA)來(lái)產(chǎn)生擴(kuò)增子。實(shí)時(shí)PCR可用于本文所述的方法中。已應(yīng)用"實(shí)時(shí)"定量PCR分牙斤來(lái)測(cè)定病毒DNA水平(NiestersH等Developmentofareal-timequantitativeassayfordetectionofEpstein-Barrvirus.JClinMicrobiol.February2000;38(2):712-5)。動(dòng)態(tài)PCR是用于測(cè)定初始的模板拷貝數(shù)的方法。在該方法中，PCR反應(yīng)中的定量信息來(lái)自DNA量從剛剛超過(guò)背景對(duì)數(shù)生長(zhǎng)至平臺(tái)的幾個(gè)循環(huán)。通常，40個(gè)循環(huán)中只有6至8個(gè)循環(huán)會(huì)落在曲線的對(duì)數(shù)線性部分。在本文所述的方法中，所述病原體可以是病毒，包括但不限于HSVI、HSV2、EBV、CMV、HHV6、HHV7、HHV8、VZV、丙型肝病毒、乙型肝炎病毒、腺病毒、EEEV、WNE、JCV和BKV。在本文所述的方法中，所述病原體可以是細(xì)菌，包括但不限于B組鏈球菌、大腸桿菌、單核細(xì)胞增生利斯特氏菌、腦膜炎奈瑟氏球菌、肺炎鏈球菌、流感嗜血菌、肺炎鏈球菌或腦膜炎奈瑟氏球菌、單核細(xì)胞增生利斯特氏菌、銅綠假單胞菌、腦膜炎球菌性腦膜炎、肺炎球菌性肺炎、諾卡氏菌屬物種、軍團(tuán)菌屬物種、革蘭氏陰性芽抱fr菌、炭疽芽孢桿菌、鼠疫耶爾森氏菌、肉毒桿菌、土拉熱弗朗西絲氏菌、大腸桿菌、弧菌屬物種、志賀氏菌屬物種、單核細(xì)胞增生利斯特氏菌、空腸彎曲桿菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌、霍亂弧菌、沙門(mén)氏菌、單核細(xì)胞增生利斯特氏菌、腸侵襲性大腸桿菌和結(jié)核分枝桿菌。一方面，在允許進(jìn)行多元檢測(cè)的單個(gè)測(cè)定中包括特異性針對(duì)兩種或更多(例如多達(dá)15種或更多)不同病毒的引物。病毒乾標(biāo)本文所述的方法可有效鑒定多種病毒中任一種的存在和/或量。與臨床特別相關(guān)尤其是與免疫受損患者相關(guān)的病毒描述如下。HSV誦1和HSV曙2如美國(guó)專利5,558,863所述，已知超過(guò)50種皰疹病毒感染超過(guò)30個(gè)不同的物種。A.J.Nahmias和B.Roizman,NewEngl.J.Med.289，pp.667-674(1973)。單純皰滲病毒1(HSV-l)和單純皰瘆病毒-2(HSV-2)是最具臨床意義的天然存在的單純皰滲病毒(HSV)的變體。人類是該病毒的唯一]ii主。HSV首先在1920年被分離出來(lái)。B.Lipschutz，Arch.Derm.Syph.(Berl)136，428-482頁(yè)(1921)。在1961年區(qū)分出兩種血清型。通常，HSV-l感染非生殖器部位，而HSV-2感染生殖器部位。然而，有可能在生殖器皰滲病例中分離出HSV-l。傳染是直接的。感染后通常發(fā)生口腔、眼、皮膚或生殖道中的局部潰瘍或損傷。傳播可在新生兒和免疫抑制者中引起腦炎。該病毒可維持潛伏(推測(cè)可維持?jǐn)?shù)年)，直至壓力、環(huán)境因素、其它藥物、食品添加劑或食品觸發(fā)其復(fù)發(fā)(參見(jiàn)A.J.Nahmias和B.Roizman,NewEngl.J.Med.13，667-674頁(yè)(1973);W.E.Rawls，E.H.Lennette(eds.),LaboratoryDiagnosisofViralInfections,MarcelDekker，Inc.,NewYork,313-328頁(yè)(1985))。EBVEB病毒(EBV)是來(lái)自皰滲病毒組的另一種病原體。發(fā)現(xiàn)于20世紀(jì)60年代，它是傳染性單核細(xì)胞增多癥的主要病原體，并與伯基特淋巴瘤和鼻咽癌惡性病有關(guān)(參見(jiàn)W.Henle和GHenle,M.A.Epstein和B.GAchong(編輯)，TheEpstein-BarrVirus,Springer-Verlag，Berlin,297頁(yè)(1979))。傳染性單核細(xì)胞增多癥的特征為淋巴結(jié)病、發(fā)熱和咽炎。如同HSV變體一樣，EB病毒可建立潛伏性感染，當(dāng)宿主M疫抑制時(shí)其可被再次激活(參見(jiàn)E.T.Lennette,E.H.Lennette(編輯),LaboratoryDiagnosisofViralInfection,MarcelDekker，Inc.,NewYork,257-271頁(yè)(1985))。同樣，在重度免疫受損患者中EBV還可導(dǎo)致急性和迅iUL艮的B淋巴增生性疾病。移植患者都具有發(fā)生EBV感染的風(fēng)險(xiǎn)，因此有發(fā)生移^Ut淋巴增生性疾病(posttransplantlymphoproliferativedisorder,PTLD)的風(fēng)險(xiǎn)。然而，發(fā)生該并發(fā)癥風(fēng)險(xiǎn)最高的A^^Of移^LA群。這是因?yàn)檫@些患者通常非常年輕(常小于5歲)，因此他們通常未接觸過(guò)EBV,所以不具有對(duì)該病毒的天然免疫。vzv水痘帶狀皰療病毒(vzv)也是皰滲病毒，并且是水痘(禽痘)和帶狀皰滲二者的病原體。水痘主要發(fā)生在兒童中，而更具局限性的帶狀皰滲發(fā)生在老年人和免疫受損者中。實(shí)際上，帶狀皰療是由于潛伏vz感染的再次激活所致?；颊咴馐芴弁吹摹⑴轄钇つw損傷(參見(jiàn)A.Gershon,E.H.Lennette(編輯)，LaboratoryDiagnosisofViralInfections,MarcelDekker，Inc.,NewYork,329-340頁(yè)(1985))。當(dāng)前，鎮(zhèn)痛劑提供帶狀皰滲的惟一治療(參見(jiàn)R.Boyd,等,BasicMedicalMicrobiology,第二版，Little,BrownandCompany,Boston,527頁(yè)，(1981))。CMV巨細(xì)胞病毒(CMV)也是人皰滲病毒家族的成員，其感染4Ht界范圍所有個(gè)體的50-100%,如美國(guó)專利6,936,251所述。CMV通過(guò)唾液、尿或母乳天然傳播，但也可以從其它機(jī)體分泌物中回收。另外，CMV可通過(guò)生育或性交期間的生殖泌尿接觸、通過(guò)輸血(特別是白細(xì)胞)以及骨髓或器官移植經(jīng)胎盤(pán)向胎兒傳播。在初次感染后，CMV以動(dòng)態(tài)潛伏狀態(tài)在宿主一生中維持在身體內(nèi)，受宿主免疫系統(tǒng)的良好控制，并可定期從不同的部位和身體分泌物中回收。盡管通常是良性的，在免疫缺陷個(gè)體中CMV感染可以是破壞性的和致命的，所述免疫缺陷個(gè)體如移植受者、AIDS患者、患有遺傳決定的免疫缺陷的患者以及具有不成熟免疫系統(tǒng)的新生兒。HHV6人皰滲病毒-6(HHV6)病毒也是人皰滲病毒家族的成員，并包含雙鏈DNA。HHV6毒林已分離自患有AIDS或患有淋巴增生性疾病的患者的淋巴細(xì)胞。這些病毒還被認(rèn)為是幼兒急滲的病原體，如美國(guó)專利5,545,520所述。HHV6是首先由Salahuddin和同事在1986年描述的P皰疹病毒，其在約百分之九十的人群中以潛伏狀態(tài)存在。然而在活躍感染期中，該病毒與多種臨床疾病有關(guān)。如美國(guó)專利5,756,302所述，HHV-6是兒童中幼兒急滲和幼兒玫瑰滲的臨床病原體，并且與初次感染HHV-6的嬰兒中臨床顯著的骨髄抑制普遍相關(guān)。在成人中，HHV-6與多種在有風(fēng)險(xiǎn)的免疫受損或免疫抑制人群中可能致命的臨床疾病的成因有關(guān)。值得注意的是，HHV-6在患有肺炎和腦炎的患者中以及在同種異體骨髄移植(allogeneicbonemarrowtranplant，A1BMT)或?qū)嶓w器官移植后的免疫抑制患者中很突出。在A1BMT患者中，HHV-6相關(guān)骨髓抑制(HHV-6associatedbonemarrowsuppression,HBMS)與骨髄的直接病毒感染相關(guān)。HHV-6持續(xù)感染骨髓可引起慢性骨髄抑制。HHV畫(huà)7如美國(guó)專利乂〉布20040091852所述，人皰滲病毒7(HHV-7)^JC現(xiàn)于19卯年的P-皰滲病毒。HHV-7在一^A群中廣泛傳播，在年輕時(shí)產(chǎn)生原發(fā)階段感染，并且像其它皰滲病毒一樣，以潛伏形式在受感染生物中無(wú)限期維持。HHV-7在遺傳上接近巨細(xì)胞病毒(CMV)和人皰滲病毒6(HHV-6)，CMV和HHV-6(尤其是CMV)是重要的病原性病毒。HHV-7在人類疾病中的作用仍在探索中。人們認(rèn)為在免疫抑制期間它的致病能力加強(qiáng)，并導(dǎo)致嚴(yán)重的機(jī)會(huì)性感染，1象其它皰滲病毒那樣。特別地，這可能是器官移植后的情況。HHV誦8基于序列同源性，HHV-8屬于y皰疹病毒亞家族，并且與EBV和松鼠猴皰滲病毒(Herpesvirussaimiri)密切相關(guān)，如美國(guó)專利^>布20030013077所述。HHV-8基因組的大小為140kb，側(cè)翼為長(zhǎng)度約為800bp的若干重M列(Russo等，1996)。HHV-8編碼約80種蛋白質(zhì)，其+IO種表現(xiàn)出與細(xì)胞基因產(chǎn)物的同源性(Neipel等，1997)。類似于所有其它的皰瘆病毒，HHV-8能夠?qū)е铝呀庑愿腥?，然后變?yōu)闈摲愿腥尽Ｔ跐摲?，表達(dá)至少兩種病毒轉(zhuǎn)錄物編碼v-細(xì)胞周期蛋白、v-flip和LANA蛋白的差異剪接mRNA，以及T0.7(長(zhǎng)度為0.7kb的短RNA，功能迄今未知)(Zhong等，1996)。病毒轉(zhuǎn)錄物T0.7是潛伏期表達(dá)最多的RNA，并具有對(duì)應(yīng)于60、35和47個(gè)氨基酸的3個(gè)開(kāi)放讀碼框。已在所有形式的卡波西肉瘤、原發(fā)性滲出性淋巴瘤(primaryeffusionlymphoma,PEL)、卡斯?fàn)柭?、血管肉瘤、接受移植的患者的皮膚損傷、漿細(xì)胞瘤、結(jié)節(jié)病中以及健康的對(duì)照個(gè)體中檢測(cè)到了人皰疹病毒8(Chang等，1994;Boshoff和Weiss，1997)。丙型肝炎病毒丙型肝炎病毒(HCV)是90%的所有非曱型、非乙型肝炎病例中的主要病原體(Dymock,B.W.EmergingDrugs6:13-42(2001))。HCV感染的發(fā)生率已經(jīng)成為越來(lái)越嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題，4Mt界范圍有2-15%個(gè)體受到感染。盡管HCV的初次感染通常是無(wú)癥狀的，但多數(shù)HCV感染;OL至可持續(xù)幾十年的慢性狀態(tài)。在具有慢性HCV感染的人中，相信約20-50%最后將l艮為慢性肝病(例如肝硬化)，并且這些病例的20-30%將導(dǎo)致肝衰竭或肝癌。HCV是已良好^E的正(+)鏈RNA病毒，長(zhǎng)度約為9.6kb，并且具有編碼約3000個(gè)氨基酸的多蛋白的單個(gè)長(zhǎng)開(kāi)放讀碼框(ORF)(Lohman等，Science285:110-113(1999)，明確地通過(guò)參考IH^并入本文)，如美國(guó)專利公布20040121975所述。該ORF的側(cè)翼為5'末端的用作內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)的非翻譯區(qū)以及3，末端的基因組復(fù)制必需的高度保守序列(Lohman,如上引用)。結(jié)構(gòu)蛋白在多蛋白的N端區(qū)域中，非結(jié)構(gòu)蛋白(nonstructralprotein,NS)在其余的2至5B中。乙型肝炎病毒乙型肝炎病毒(HBV)是致密的包膜DNA病毒，屬于肝DNA病毒家族。該病毒是4^界范圍內(nèi)慢性肝病和肝細(xì)胞癌的主要起因(Hoomagle(19卯)N.Eng.J.Med.323:337-339)。HBV與急性和慢性肝炎以及肝細(xì)胞癌有關(guān)，并還可能是獲得性免疫缺陷綜合征iL艮中的輔因子(Dienstag等inHarrison'sPrinciplesofInternalMedicine,第十三版(Isselbacher等編輯)McGraw-Hill,NY，N.Y.(1993)1458-1483頁(yè))。HBV是致密的包膜DNA病毒，屬于肝DNA病毒家族。它具有環(huán)狀的部分單鏈部分雙鏈的3.2kb基因組，其包括4個(gè)重疊基因(l)pre-S和S基因，其編碼多種包膜或表面抗原(HBsAg);(2)preC和C基因，其編碼抗原HBcAg和HBeAg;(3)P基因，其編碼病毒聚合酶；以及(4)X基因，其編碼反式激活蛋白HBx。已獲得許多肝DNA病毒的全長(zhǎng)克隆以及它們的核苷酸序列(參見(jiàn)，例如Raney等MolecularBiologyoftheHepatitisBVirus(McLachlan編輯)CRCPress,Boston,Mass.,(1991)1-38頁(yè))。復(fù)制在肝細(xì)胞中發(fā)生，并包括HBV基因組的單鏈區(qū)轉(zhuǎn)變成雙鏈環(huán)狀DNA，得到共價(jià)閉合的環(huán)狀DNA(covalentlyclosedcircularDNA，CCCDNA)。該DNA通過(guò)宿主RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生正鏈極性的RNA模板(前基因組RNA)，其作為模板用于翻譯病毒蛋白質(zhì)，并且還包裝到病毒核心中。在所述病毒核心中，RNA作為模板用于逆轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生DNA負(fù)鏈。然后，病毒聚合S^吏用病毒RNA寡聚體作為引物從而產(chǎn)生DNA正鏈。病毒核心中新合成的雙鏈DNA與病毒的包膜蛋白裝配在一起，產(chǎn)生新的感染性病4^5粒。AAV糾目關(guān)病毒(adeno-associatedvirus,AAV)，一種依賴腺病毒或皰滲病毒進(jìn)行完整"溶胞"感染的細(xì)小病毒(Buller等，J.Virol.40:241-47(1981))。如美國(guó)專利6593123所述，AAV需要與無(wú)關(guān)的輔助病毒(例如腺病毒、皰滲病毒或痘苗病毒)共感染來(lái)發(fā)生生產(chǎn)性感染。不存在輔助病毒時(shí)，AAV通過(guò)使其基因組進(jìn)入宿主細(xì)胞染色體來(lái)建立潛伏狀態(tài)。輔助病毒的后續(xù)感染使已整合的病毒基因組復(fù)蘇，然后其能夠復(fù)制從而產(chǎn)生感染性的病毒后代。有關(guān)AAV的綜述，參見(jiàn)例如Berns和Bohenzky(1987)AdvancesinVirusResearch(AcademicPress,Inc.)32:243-307。AAV基因組由線性單鏈DNA分子組成，其包含4681個(gè)堿基(Berns和Bohenzky,如上引用)。該基因組在每個(gè)末端包含反向末端重復(fù)(invertedterminalr印eat，ITR)，其以順式發(fā)揮DNA復(fù)制起點(diǎn)和病毒包裝信號(hào)的功能。ITR的長(zhǎng)度約為145bp。基因組的內(nèi)部非重復(fù)部分包括兩個(gè)大的開(kāi)放讀碼框，分別稱為AAV的rep和cap區(qū)域。這些區(qū)域編碼提供AAV輔助蛋白功能的病毒蛋白，即參與病毒體的復(fù)制和包裝的蛋白質(zhì)。具體地，從AAVrep區(qū)域合成至少由4種病毒蛋白質(zhì)組成的家族——Rep78、Rep68、Rep52和Rep40，才艮據(jù)其^JC分子量命^名。AAVcap區(qū)域編碼至少3種蛋白質(zhì)——VP1、VP2和VP3。有關(guān)AAV基因組的^"細(xì)描述，參見(jiàn)例如Muzyczka，N.(1992)CurrentTopicsinMicrobiol,andImmunol.158:97-129。EEEV東方馬腦脊髓炎病毒(EasternEquineEncephalitisVirus,EEEV)是披膜病毒科甲病毒屬的成員，該科由可見(jiàn)于4Hfr界大部地區(qū)的蚊媒RNA病毒組成。該病毒通常通過(guò)多種蚊的攝食活動(dòng)而在嚙齒動(dòng)物或鳥(niǎo)類宿主之間循環(huán)。EEE首先于1933年在弗吉尼亞和新澤西分離出來(lái)(TenBroeck,C.等[1935J.Exp.Med.62:677)。WNE西尼羅病毒(WNE)是黃病毒科黃病毒屬的成員，屬于日本腦炎病毒抗原性復(fù)合體，如美國(guó)專利>^布20040197769所述。該血清復(fù)^^包括JEV、SLEV、Alfuy、Koutango、Kunjin、Cacipacore、Yaounde和墨累山谷腦炎病毒。WNE感染通常具有輕微的癥狀，然而在老年人和免疫受損的患者中感染可能是致命的。輕微WNE感染的典型癥狀包括發(fā)熱、頭痛、身體疼痛、滲和淋巴腺腫脹。腦炎的重度疾病通常發(fā)現(xiàn)在老年患者中(D.S.Asnis等，如上引用)。大多數(shù)情況下，對(duì)黃病毒感染的患者采用對(duì)癥療法，即治療黃病毒感染的一般性癥狀，因此對(duì)于初步治療來(lái)i兌，僅了解該感染是黃病毒感染可能就已足夠。然而，在某些其它病例中，對(duì)特定的黃病毒(尤其是WNE)進(jìn)行快速和精確的診斷是很重要的，從而可開(kāi)始進(jìn):行正確的治療。JCVJC病毒(JCV)屬于人多瘤病毒組。JCV可通過(guò)對(duì)形成髄鞘質(zhì)的少突膠質(zhì)細(xì)胞的裂解性感染和對(duì)星形細(xì)胞的頓挫型感染而導(dǎo)致亞急性脫髓鞘性腦病，如美國(guó)專利6，238，859所述。這種感染(在臨床上稱作"進(jìn)行性多灶性腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良(progressivemultifocalleukoencephalopathy,PML)")導(dǎo)致在大腦、小腦和腦干中形成脫髄鞘病灶，并通常在幾個(gè)月內(nèi)導(dǎo)致死亡。盡管JCV似乎存在于約80%的成年人群中，但是PML通常僅與免疫系統(tǒng)的削弱相關(guān)發(fā)生。越來(lái)越多地使用免疫抑制性藥物以及日益增多的HIV感染患者數(shù)已導(dǎo)致近年來(lái)PML疾病的大幅增加。根據(jù)目前的估計(jì)，PML發(fā)生在約2-5%的AIDS患者中。BKVBK病毒(BKV)是人多瘤病毒，最初從免疫受損患者的尿液分離出來(lái)，如美國(guó)專利6,605,602所述。其后，已分離出許多BKV變體(亞型)。BKV在多數(shù)IO歲以下的一^A群中導(dǎo)致亞臨床(無(wú)癥狀)感染。感染后，該病毒通常在腎臟中保持潛伏。然而，該病毒可由于免疫抑制而在之后的時(shí)間點(diǎn)(例如在腎移植后)再次激活。BKV包含雙鏈DNA(dsDNA)基因組。BKV的完整DNA序列約為5,100個(gè)4^JJ^t，然而這在BKV變體之間不盡相同。例如，BKV的Dunlop毒林包含5，153個(gè)>5^&對(duì)(參見(jiàn)例如Self等(1979),Cell18:963-77)。BKV基因組包含編碼區(qū)和非編碼控制區(qū)，但在功能上分為3個(gè)區(qū)域。編碼區(qū)可進(jìn)一步分為早期區(qū)和晚期區(qū)。早期區(qū)包含兩種非結(jié)構(gòu)蛋白(T-抗原蛋白和t-抗原蛋白)的編碼序列。晚期區(qū)包含編碼4種結(jié)構(gòu)蛋白(VP-1、VP-2和VP-3)的序列。非編碼控制區(qū)包含用于早期和晚期基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄控制元件，并包含病毒的復(fù)制起點(diǎn)。天花由大天花(variolamajor)病毒引起的天花(smallpox)被認(rèn)為是最具危險(xiǎn)性的潛在生物武器之一，因?yàn)樗子谠谌伺c人之間傳播，還沒(méi)有有效的療法，并且?guī)缀鯖](méi)有人具有針對(duì)該病毒的完全免疫力。盡管在1977年世界范圍的免疫計(jì)劃消滅了天花病，然而少量的天花病毒仍存在于美國(guó)和俄羅斯的兩個(gè)安全機(jī)構(gòu)中。然而，有可能在于世界的其它地方存在不為人知的天花病毒庫(kù)。天花感染的癥狀似乎在接觸后大約12天(范圍從7至17天)出現(xiàn)。最初的癥狀包括高燒、疲勞、頭痛和背痛。在2至3天后出現(xiàn)特征性的療，主要是在臉、臂和腿上。滲從扁平的紅色損傷(斑丘疹)開(kāi)始;5UL成小泡。與禽痘不同，與天花有關(guān)的損傷以同樣的速率j^!L在接觸后的第二周前期，天花損傷充滿膿并開(kāi)始結(jié)痂。結(jié)痂在大約3周后發(fā)生、分離并脫落。從即將發(fā)生斑丘滲之前直至痂脫落的時(shí)間內(nèi)，個(gè)體通常對(duì)其他人是具有傳染性的。天花主要通過(guò)被感染的人排出的唾液飛沫直接在人與人之間傳播。污染的衣物或床上用品也可以傳播該病毒。天花感染的死亡率大約為30%，復(fù)原的患者常具有影響外表的瘢痕。由于可能的接觸導(dǎo)致的危險(xiǎn)性，因此對(duì)于天花病毒尚未研究清楚。然而，對(duì)用作天花疫苗并與天花密切相關(guān)的痘苗病毒進(jìn)行了深入研究。對(duì)兩種病毒進(jìn)行的少數(shù)比較研究已顯示，主要的差異在于宿主范圍牛痘感染幾,宿主，而天花僅天然地感染人類以及在人工實(shí)驗(yàn)室條件下感染短尾區(qū)分這兩種病毒。所述病毒共享抗原并產(chǎn)生交叉中和抗體，這種特征已經(jīng)在使用牛痘疫苗預(yù)防天花時(shí)利用過(guò)。這兩種病毒可通過(guò)PCR、ELISA、放射免疫測(cè)定和單克隆抗體進(jìn)行區(qū)分。牛痘作為遞送其它疫苗基因的載體現(xiàn)已得到廣泛研究。被感染的細(xì)胞中產(chǎn)生兩種形式的感染性正痘病毒停留在被感染細(xì)胞中的胞內(nèi)成熟病毒(intracellularmaturevirus,IMV)以;5Lfc感染晚期從細(xì)胞中釋放的胞外包膜病毒(extracellularenvelopedvirus,EEV)。EEV形式的病毒包含另外的脂質(zhì)包膜以及細(xì)胞和病毒蛋白質(zhì)，因此使得EEV在免疫學(xué)上異于IMV。另夕卜，EEV和IMV形式通過(guò)不同的機(jī)制進(jìn)入細(xì)胞、使用不同的細(xì)胞受體，并對(duì)抗體和補(bǔ)體具有不同的敏感性。痘病毒的免疫逃避通過(guò)與以下有關(guān)的機(jī)制實(shí)現(xiàn)釋放結(jié)M化因子的蛋白質(zhì)、EEV對(duì)中和抗體的抗性，以及通過(guò)獲得宿主補(bǔ)體控制蛋白而實(shí)現(xiàn)的EEV對(duì)補(bǔ)體破壞的抗性。天花和牛痘屬于正痘病毒屬的痘病毒。這些雙鏈DNA病毒在胞質(zhì)中復(fù)制，這與依賴宿主細(xì)胞核DNA復(fù)制酶的其它DNA病毒是不同的。已對(duì)天花和牛痘的幾種毒林進(jìn)行了基因組測(cè)序。結(jié)構(gòu)蛋白、膜蛋白和核心蛋白的基因似乎在正痘病毒中高度保守。還鑒定了負(fù)責(zé)在人類細(xì)胞中生長(zhǎng)的基因。NIAID將在這些領(lǐng)域中積極地進(jìn)行進(jìn)一步研究。節(jié)肢動(dòng)物傳播病毒B類和C類節(jié)肢動(dòng)物傳播病毒(蟲(chóng)媒病毒)是病毒性腦炎和出血熱的重要病原體，并包括許多類型。甲病毒與委內(nèi)瑞拉馬腦炎(Venezuelanequineencephalitis,VEE)病毒、東方馬腦炎(easternequineencephalitis,EEE)病毒和西方馬腦炎(westernequineencephalitis,WEE)病毒有關(guān)。黃病毒包括西尼羅病毒(WNV)、日本腦炎(JE)病毒、夸賽納森林病(Kyasanurforestdisease,KFD)病毒、*^#腦炎(tick-borneencephalitis,TBE)病毒復(fù)合體和黃熱病(YF)病毒。布尼亞病毒與加利福尼亞腦炎(CE)病毒、拉克羅斯(LaCrosse,LAC)病毒、克里米亞-剛果出血熱(Crimean-Congohemorrhagicfever,CCHF)病毒有關(guān)。盡管節(jié)肢動(dòng)物栽體(如蚊、蜱或白蛉)負(fù)責(zé)多數(shù)病毒性腦炎和出血熱病毒向人類的天然傳播，但這些病毒作為潛在生物恐怖武器的威脅主要源自它們?cè)陟F化接觸所具有的極端感染性。另外，僅對(duì)這些病毒中的極少數(shù)有可使用的疫苗或有效的特異性療法。許多蟲(chóng)媒病毒在北美洲(EEE、WEE、WNV、CE、LAC)、南美洲(VEE、WEE)、亞洲(JE、CCHF)和非洲(WNV、CCHF)是地方性的，其包括沒(méi)有列出的病毒。目前在美國(guó)最主要的是WNV，其在1999年在北美洲紐約市首先鑒定出來(lái)。該病毒已在整個(gè)美國(guó)大陸傳播，截至2002年夏天其導(dǎo)致數(shù)千病例以;5L^過(guò)一百人死亡。通過(guò)被感染的蚊、蜱或白蛉(取決于病毒)叮咬使得蟲(chóng)媒病毒獲得對(duì)人和其它動(dòng)物的天然感染。通常，潛伏期為3至21天不等，這反映了病毒在局部進(jìn)行復(fù)制并在侵入腦或其它靶器官前隨血液擴(kuò)散至外周部位的時(shí)間。在腦中，這些病毒中的某些在細(xì)胞間擴(kuò)散，導(dǎo)致腦炎。其它病毒如YF和CCHF乾向肝和其它器官，導(dǎo)致出血和發(fā)熱。對(duì)于這些腦炎和出血熱病毒的發(fā)病機(jī)制了解相對(duì)很少。然而在小鼠接觸霧化VEE的研究中，在感染后48小時(shí)內(nèi)在腦部檢測(cè)到病毒。在人中，蟲(chóng)媒病毒感染通常是無(wú)癥狀的或者導(dǎo)致非特異性流感樣癥狀如發(fā)熱、疼痛和疲勞。少數(shù)被感染的人可t艮為腦炎，并且盡管大多數(shù)會(huì)復(fù)原，但某些可遺留嚴(yán)重的殘留神經(jīng)性癥狀如失明、麻痹或癲癇發(fā)作。臨床的疾病和死亡隨特定的感染病毒而變化。例如，感染VEE的成人中少于1%發(fā)展為腦炎；另一方面，在感染JE(25%)或EEE(50%)病毒的人中的死亡率較高。對(duì)于LAC感染，疾病在兒童中更嚴(yán)重并且更普遍。然而對(duì)于WNV,特別是在美國(guó)，老年人和免疫抑制個(gè)體發(fā)生嚴(yán)重或危及生命的疾病的風(fēng)險(xiǎn)極高。這些病毒中的幾種如VEE、EEE、WNV和JE還導(dǎo)致重要的獸醫(yī)疾病，在馬、禽類和其它動(dòng)物中造成高致命性(高達(dá)卯％)腦炎或其它癥狀。甲病毒、黃病毒和布尼亞病毒(bunyavirus)的傳播循環(huán)通常包括在節(jié)肢動(dòng)物對(duì)宿主攝食期間病毒從被感染脊推動(dòng)物宿主(例如，鳥(niǎo))到節(jié)肢動(dòng)物/昆蟲(chóng)載體(例如，蚊子)的環(huán)狀通道。病毒在節(jié)肢動(dòng)物中大量增殖，然后當(dāng)蚊子再次攝食/叮咬時(shí)傳遞并感染新的宿主。對(duì)于蟲(chóng)媒病毒的傳播循環(huán)一般不夠了解，包括參與天然維持和將病毒傳播到新的地理區(qū)域和宿主的脊推動(dòng)物宿主和節(jié)肢動(dòng)物載體的物種。B類和C類蟲(chóng)媒病毒都是在被感染細(xì)胞的胞質(zhì)中進(jìn)行復(fù)制的包膜RNA病毒。已經(jīng)鑒定了參與病毒與宿主結(jié)合、在病毒的向性中發(fā)揮功能、以及作為宿主中和抗體靶標(biāo)的病毒包膜糖蛋白。該病毒還編碼病毒復(fù)制過(guò)程中所需的非結(jié)構(gòu)蛋白(如酶)。病毒的結(jié)構(gòu)蛋白的和非結(jié)構(gòu)蛋白的數(shù)目和類型對(duì)于每個(gè)病毒家族是特異性的；雖然已對(duì)某些進(jìn)行了廣泛的研究，而另一些還未進(jìn)行?；蚪M測(cè)序和其它核酸研究已確立了這些病毒中某些之間的關(guān)系，并且已導(dǎo)致鑒定了基因和蛋白質(zhì)上對(duì)于毒力、毒力衰減和相關(guān)發(fā)病機(jī)制具有重要性的的位點(diǎn)。對(duì)某些甲病毒和黃病毒的結(jié)構(gòu)蛋白的晶體學(xué)研究提供了蛋白質(zhì)功能以及鑒定用于開(kāi)發(fā)抗病毒藥物的潛在靶標(biāo)的啟示。本文所述的方法可用于檢測(cè)多種類型的病原體，包括但不限于來(lái)自任何以下病毒屬的病原體腺病毒科(Adenoviridae)、苜蓿花葉病毒屬(Alfamovirus)、青蔥病毒屬(Allexivirus)、異輕小病毒屬(Allolevivirus)、a-隱病毒屬(Alphacryptovirus)、a-皰滲病毒科(Alphaherpesvirinae)、a畫(huà)諾達(dá)病毒屬(Alphanodavirus)、a-逆轉(zhuǎn)錄病毒屬(Alpharetrovirus)、甲病毒屬(Alphavirus)、口掩病毒屬(Aphthovirus)、蘋(píng)果銹果類病毒屬(Apscaviroid)、雙節(jié)RNA病毒屬(Aquabirnavirus)、呼腸孤病毒屬(Aquareovirus)、沙粒病毒辨Arenaviridae)、沙粒病毒屬(Arenavirus)、動(dòng)樂(lè)，炎病毒科(Arteriviridae)、動(dòng)樂(lè)，炎病毒屬(Arterivirus)、嚢泡病毒科(Ascoviridae)、嚢泡病毒屬(Ascovirus)、非洲豬瘋病毒科(Asfarviridae)、非洲豬痘病毒屬(Asfivirus)、星形病毒科(Astroviridae)、星形病毒屬(Astrovirus)、黃金葛病毒屬(Aureusvirus)、燕麥病毒屬(Avenavirus)、禽腺病毒屬(Aviadenovirus)、雙節(jié)RNA病毒屬(Avibirnavirus)、禽肝DNA病毒屬(Avihepadnavirus)、禽痘病毒屬(Avipoxvirus)、鱘梨日斑類病毒屬(Avsunviroid)、聘梨日斑類病毒科(Avsunviroidae)、桿狀病毒科(Baculoviridae)、香蕉條紋病毒屬(Badnavirus)、桿狀RNA病毒科(Barnaviridae)、桿狀RNA病毒屬(Barnavirus)、蛭弧菌微小噬菌體屬(Bdellomicrovirus)、菜豆金色花葉病毒屬(Begomovirus)、甜菜壞死黃脈病毒屬(Benyvirus)、卩-隱藏病毒屬(Betacryptovirus)、P國(guó)皰滲病毒亞科(Betaherpesvirinae)、J3畫(huà)野田村病毒屬(Betanodavirus)、P-逆轉(zhuǎn)錄病毒屬(Betaretrovirus)、P國(guó)四病毒屬(Betatetravirus)、雙節(jié)RNA病毒科(Birnaviridae)、博納病毒科(Bornaviridae)、博納病毒屬(Bornavirus)、繭蜂病毒屬(Bracovirus)、短濃稠病毒屬(Brevidensovirus)、雀麥花葉病毒科(Bromoviridae)、雀麥花葉病毒屬(Bromovirus)、布尼亞病毒科(Bunyaviridae)、布尼亞病毒屬(Bunyavirus)、大麥黃花葉病毒屬(Bymovirus)、"c2樣病毒屬"、杯狀病毒科(Caliciviridae)、毛狀病毒組(Capillovirus)、山羊痘病毒屬(Capripoxvirus)、心臟病毒屬(Cardiovirus)、香石竹潛病毒纟且(Carlavirus)、香石竹斑駁病毒組(Carmovirus)、木薯脈花葉病毒屬("Cassavaveinmosaic-likeviruses")、花椰菜花葉病毒科(Caulimoviridae)、花椰菜花葉病毒屬(Caulimovirus)、衣原^^t小嗟菌體屬(Chlamydiamicrovirus)、綠虹彩病毒屬(Chloriridovirus)、綠藻病毒屬(Chlorovirus)、脊推動(dòng)物痘病毒亞科(Chordopoxvirinae)、(Chrysovirus)、圓環(huán)病毒科(Circoviridae)、圓環(huán)病毒屬(Circovirus)、線'性病毒科(Closteroviridae)、線'性病毒屬(Closterovirus)、(Cocadviroid)、錦紫蘇類病毒屬(Coleviroid)、呼腸孤病毒屬(Coltivirus)、5n豆花葉病毒科(Comoviridae)、5L豆花葉病毒屬(Comovirus)、冠狀病毒科(Coronaviridae)、冠狀病毒屬(Coronavirus)、被蓋病毒科(Corticoviridae)、被蓋病毒屬(Corticovirus)、類錄蟀麻痹病毒屬("Cricketparalysis-likeviruses")、毛形病毒屬(Crinivirus)、南;Mt葉病毒組(Cucumovirus)、甜菜曲頂病毒屬(Curtovirus)、質(zhì)型多角體病毒屬(Cypovirus)、嚢狀病毒科(Cystoviridae)、嚢狀病毒屬(Cystovirus)、巨細(xì)胞病毒屬(Cytomegalovirus)、質(zhì)型彈狀病毒屬(Cytorhabdovirus)、8-逆轉(zhuǎn)錄病毒屬(Deltarerovirus)、丁型肝炎病毒屬(Deltavirus)、^M^病毒亞科(Densovirinae)、iM^病毒屬(Densovirus)、依賴病毒屬(Dependovirus)、香石竹病毒纟且(Dianthovirus)、"埃博拉樣病毒屬"、(Enamovirus)、腸道病毒屬(Enterovirus)、昆蟲(chóng)雙節(jié)段dsRNA病毒(Entomobirnavirus)、昆蟲(chóng)痘病毒亞科(Entomopoxvirinae)、A型昆蟲(chóng)痘病毒屬(EntomopoxvirusA)、B型昆蟲(chóng)痘病毒屬(EntomopoxvirusB)、C型昆蟲(chóng)痘病毒屬(EntomopoxvirusC)、彈狀病毒屬(Ephemerovirus)、s-逆轉(zhuǎn)錄病毒屬(Epsilonretrovirus)、飄游病毒屬(Errantivirus)、紅病毒屬(Erythrovirus)、蠶豆萎蔫病毒組(Fabavirus)、變濟(jì)病毒屬(Fijivirus)、纖絲病毒科(Filoviridae)、黃病毒科(Flaviviridae)、黃病毒屬(Flavivirus)、凹陷病毒屬(Foveavirus)、真菌傳桿狀病毒屬(Furovirus)、小紡錘形噬菌體科(Fuselloviridae)、小紡錘形噬菌體屬(Fusellovirus)、y-皰滲病毒亞科(Gammaherpesvirinae)、y-逆轉(zhuǎn)錄病毒屬(Gammaretrovirus)、雙生病毒科(Geminiviridae)、賈第蟲(chóng)病毒屬(Giardiavirus)、顆粒體病毒屬(Granulovirus)、漢灘病毒屬(Hantavirus)、半病毒屬(Hemivirus)、黃病毒屬(Hepacivirus)、嗜肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)、"戊型肝炎樣病毒，，、肝病毒屬(Hepatovirus)、皰滲病j科(Herpesviridae)、大麥病毒(Hordeivirus)、卑酒花^Ht類病毒屬(Hostuviroid)、減毒病毒科(Hypoviridae)、減毒病毒屬(Hypovirus)姬蜂病毒(Ichnovirus)、魚(yú)回魚(yú)痕療病毒屬("Ictaluridherpes-likeviruses")、懸鉤子病毒屬(Idaeovirus)、等軸不穩(wěn)定環(huán)斑病4組(Ilarvirus)、"傳染性喉氣管炎才羊病毒"、A型5危感病毒(InfluenzavirusA)、B型5危感病毒(InfluenzavirusB)、C型流感病毒(InfluenzavirusC)、絲狀病毒科(Inoviridae)、絲狀病毒(Inovirus)、(Ipomovirus)、虹彩病毒科(Iridoviridae)、虹彩病毒(Iridovirus)、重復(fù)病毒屬(Iteravirus)、"L5樣病毒"、兔病毒屬樣病毒(Lagovirus"-likeviruses")、利什曼原蟲(chóng)病毒(Leishmaniavirus)、慢病毒屬(Lentivirus)、兔痘病毒屬(Leporipoxvirus)、輕小病毒科(Leviviridae)、輕小病毒屬(Levivirus)、月旨毛病毒科(Lipothrixviridae)、月旨毛病毒屬(Lipothrixvirus)、黃樓病毒科(Luteoviridae)、黃矮病毒屬(Luteovirus)、淋巴潛伏病毒屬(Lymphocryptovirus)、淋巴嚢腫病毒屬(Lymphocystivirus)、^"犬病毒屬(Lyssavirus)、玉米褪綠斑駁病毒屬(Machlomovirus)、柘樹(shù)屬病毒屬(Macluravirus)、玉米雷亞多非納病毒組(Marafivirus)、"馬爾堡樣病毒"、"馬雷克病樣病毒"、乳腺腺病毒屬(Mastadenovirus)、玉米線條病毒屬(Mastrevirus)、肺炎后病毒屬(Metapneumovirus)、變位病毒科(Metaviridae)、變位病毒屬(Metavirus)、微小病毒科(Microviridae)、微小病毒屬(Microvirus)、線粒體病毒屬(Mitovirus)、軟體動(dòng)物痘病毒屬(Molluscipoxvirus)、麻滲病毒屬(Morbillivirus)、"Mu樣病毒"、(Muromegalovirus)、(Myoviridae)、內(nèi)羅畢病毒屬(Nairovirus)、極微小病毒屬(Nanovirus)、棵露RNA病毒科(Narnaviridae)、棵露RNA病毒屬(Narnavirus)、壞死病毒組(Necrovirus)、線蟲(chóng)傳多面體病毒(Nepovirus)、野田村病毒科(Nodaviridae)、"諾沃克樣病毒"、(Novirhabdovirus)、核型多角體病毒屬(Nucleopolyhedrovirus)、細(xì)胞核彈狀病毒屬(Nucleorhabdovirus)、油橄欖病毒屬(Oleavirus)、12-四病毒屬(Omegatetravirus)、蛇形病毒屬(Ophiovirus)、環(huán)狀病毒屬(Orbivirus)、正嗜肝DNA病毒屬(Orthohepadnavirus)、正粘病毒科(Orthomyxoviridae)、正痘病毒屬(Orthopoxvirus)、正呼腸孤病毒屬(Orthoreovirus)、(Oryzavirus)、歐爾密病毒屬(Ourmiavirus)、"P1樣病毒"、"P2樣病毒"、"P22樣病毒"、(Panicovirus)、乳頭狀瘤病毒科(Papillomaviridae)、專L頭狀瘤病毒屬(Papillomavirus)、副粘病毒科(Paramyxoviridae)、葛'J粘病毒亞科(Paramyxovirinae)、葛'J痘病毒屬(Parapoxvirus)、副腸孤病毒(Parechovirus)、分體病毒科(Partitiviridae)、(Partitivirus)、細(xì)小病毒科(Parvoviridae)、細(xì)小病毒亞科(Parvovirinae)、細(xì)小病毒屬(Parvovirus)、花生^^蔟病毒屬(Pecluvirus)、書(shū)匕潛花葉類病毒屬(Pelamoviroid)、痙病毒屬(Pestivirus)、牽?；ㄈ~脈透明樣病毒屬("Petuniaveinclearingveinclearing-likeviruses")、褐藻病毒屬(Phaeovirus)，"-29樣病毒"、"-H樣病毒"、白蛉熱病毒屬(Phlebovirus)、藻DNA病毒科(Phycodnaviridae)、(Phytoreovirus)、微小RNA病毒科(Picornaviridae)、芽生病毒科(Plasmaviridae)、芽生病毒(Plasmavirus)、短桿狀逸菌體屬(Plectrovirus)、肺病毒亞科(Pneumovirinae)、肺病毒屬(Pneumovirus)、短尾病毒科(Podoviridae)、馬鈴薯巻葉病毒屬(Polerovirus)、多DNA病毒科(Polydnaviridae)、多瘤病毒科(Polyomaviridae)、多瘤病毒屬(Polyomavirus)、馬鈴薯帚頂病毒屬(Pomovirus)、(Pospiviroid)、(Pospiviroidae)、馬鈴薯X屬(Potexvirus)、馬鈴薯Y病毒科(Potyviridae)、馬鈴薯Y病毒屬(Potyvirus)、痘病毒科(Poxviridae)、(Prasinovirus)、朊病毒、(Prymnesiovirus)、假病毒科(Pseudoviridae)、假病毒(Pseudovirus)、"Ml樣病毒"、蛙病毒(Ranavirus)、呼腸孤病毒科(Reoviridae)、呼吸道病毒(Respirovirus)、逆轉(zhuǎn)錄病毒科(Retroviridae)、彈狀病毒科(Rhabdoviridae)、(Rhadinovirus)、鼻病毒屬(Rhinovirus)、才艮前毛菌病毒屬(Rhizidiovirus)、7JC稻東格魯桿狀病毒屬(Ricetungrobacilliform畫(huà)likeviruses)、玫瑰滲病毒(Roseolovirus)、輪狀病毒屬(Rotavirus)、風(fēng)滲病毒屬(Rubivirus)、麻滲病毒屬(Rubulavirus)、古嗟菌體科(Rudiviridae)、古逸菌體屬(Rudivirus)、黑麥草花葉病毒屬(Rymovirus)、扎榥樣病毒(Sapporo-likeviruses)、伴隨體、(Sequiviridae)、伴生病毒屬(Sequivirus)、單純皰滲病毒屬(Simplexvirus)、長(zhǎng)尾病毒科(Siphoviridae)、南方菜豆花葉病毒屬(Sobemovirus)、大豆退綠斑駁病毒屬(Soybeanchloroticmottle-likeviruses)、螺、4t微小病毒(Spiromicrovirus)、"SP01樣病毒"、泡沫病毒屬(Spumavirus)、豬痘病毒屬(Suipoxvirus)、"硫化葉菌屬SNDV樣病毒"、"T1樣病毒"、"T4樣病毒"、"T5樣病毒"、"T7樣病毒，，、覆蓋層病毒科(Tectiviridae)、覆蓋層病毒(Tectivirus)、水稻條紋葉枯病毒屬(Tenuivirus)、四病毒科(Tetraviridae)、瑟高特病毒(Thogotovirus)、煙草花葉病毒(Tobamovirus)、煙草脆裂病毒組(Tobravirus)、披膜病毒科(Togaviridae)、番茄叢矮病毒科(Tombusviridae)、番癡叢矮病毒(Tombusvirus)、環(huán)曲病毒屬(Torovirus)、番茄斑萎病毒屬(Tospovirus)、全病毒科(Totiviridae)、全病毒(Totivirus)、(Trichovirus)、小麥花葉病毒屬(Tritimovirus)、芄菁花葉病毒(Tymovirus)、(Umbravirus)、水痘病毒屬(Varicellovirus)、葉務(wù)jc曲張病毒屬(Varicosavirus)、7jc皰病毒屬(Vesiculovirus)、囊泡狀病毒屬(Vesivirus)、類病毒、(Vitivirus)、:^^Hfc病毒屬(W5kavirus)和亞塔痘病毒屬(Yatapoxvirus)。細(xì)菌病原體還可以使用本文所述的方法檢測(cè)細(xì)菌微生物。下文描述了特定有意義的病原性細(xì)菌，包括對(duì)免疫受損個(gè)體特別有意義的細(xì)菌以及可能用于恐怖攻擊的細(xì)菌。炭疽炭疽芽孢桿菌(5fl"7/ws""^mc/s)是導(dǎo)致炭疽的病原體，具有使其成為可怕的生物恐怖威脅的若干特征。這些特征包括其孢子形式的穩(wěn)定性、其培養(yǎng)和生產(chǎn)的容易性、其霧化能力、其所致疾病的嚴(yán)重性以及廣泛應(yīng)用的有效疫苗的缺乏。人炭疽有3種主要的臨床形式皮膚性、吸入性和胃腸性。如果不作治療，這3種形式都可導(dǎo)致敗血病和死亡。皮膚性和胃腸性炭疽的早期抗生素治療通常是有效的；然而，即使用抗生素治療，吸入性炭疽仍然是可能致死的疾病。雖然吸入性炭疽的病例死亡率估計(jì)是基于不完全的信息，但天然發(fā)生或偶然感染的歷史死亡率仍然是很高的(75%),即使使用適當(dāng)?shù)目股匾约八衅渌延械闹С中灾委熞彩侨绱恕Ｈ欢?，最M美國(guó)人為接觸炭疽的前10個(gè)病例的存活率為60%。吸入性炭疽發(fā)生在孢子存留在肺泡腔以及隨后被肺泡巨噬細(xì)胞攝取之后。然后，存活的孢子被運(yùn)送至縱隔淋巴結(jié)，在那里它們可萌發(fā)多達(dá)60天或更久。萌發(fā)后，復(fù)制的細(xì)菌釋放導(dǎo)致疾病的毒素。主要的毒力因子包括M噬的外部莢膜和至少兩種已良好表征的毒素。這兩種毒素叫做水腫因子(EF)和致死因子(LF)，它們可破壞細(xì)胞或抑制其正常功能。第三種組分叫做保護(hù)性抗原(PA)，當(dāng)與EF和LF聯(lián)合時(shí)使EF和LF能夠結(jié)合哺乳動(dòng)物細(xì)胞上的特定受體。該復(fù)合體被內(nèi)化后，細(xì)菌的毒效應(yīng)被激活。研究人員最近改造了結(jié)合天然受體的突變體重組PA(rPA)。這些突變體rPA還可通過(guò)阻斷和干擾LF和EF向細(xì)胞中遞ili^而取代野生型PA。最近的研究還鑒定了與PA結(jié)合的哺乳動(dòng)物細(xì)胞受體區(qū)域，并測(cè)定了LF結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)。包含毒素結(jié)合位點(diǎn)的受體可溶片段可作為假目標(biāo)來(lái)保護(hù)細(xì)胞免受LF的損傷。另一些最近的研究已表征了LF結(jié)合MAPKK(絲裂原活化蛋白激酶激酶)的位點(diǎn)，MAPKK是重要的胞內(nèi)酶，LF對(duì)它的破壞導(dǎo)致細(xì)胞死亡。對(duì)炭疽芽孢桿菌染色體基因組的測(cè)序已接近完成。LF、EF和PA的基因包含在已測(cè)序的質(zhì)粒中。NIAID正加大測(cè)序力度，對(duì)炭疽芽孢桿菌和相關(guān)芽a菌進(jìn)行廣泛的基因組分析。研究人員將使用來(lái)自所選菌林、隔離群以;M目關(guān)物種的序列數(shù)據(jù)來(lái)評(píng)估遺傳變異和多樣性的程度。這些遺傳信息將提供一個(gè)框架，利用該框架來(lái)評(píng)估已在菌林間發(fā)現(xiàn)的致病性和毒力差異的基礎(chǔ)?；蚪M數(shù)據(jù)的其它用途包括支持基礎(chǔ)研究從而鑒定用于菌林鑒定和分子的基因分型的特異性分子標(biāo)志物和把標(biāo)；開(kāi)先基于序列的檢測(cè)技術(shù)；以及設(shè)計(jì)有效的疫苗、治療方法和診斷工具。另外，所述數(shù)據(jù)將增強(qiáng)對(duì)與表型(抗藥性、致病率和傳染性)以及影響孢子在體內(nèi)萌發(fā)的關(guān)鍵事件或過(guò)程相關(guān)的遺傳多態(tài)性的檢測(cè)。廣泛的生物信息學(xué)資源將支持和維持微生物基因組數(shù)據(jù)庫(kù)以及開(kāi)發(fā)相關(guān)軟件和生物信息學(xué)工具。這些方法將作為其它可能用作生物恐怖病原體的微生物的原型。鼠疫鼠疫由細(xì)菌鼠疫耶爾森氏菌(RmVi/fl/7e幼:s)導(dǎo)致。它用作生物武器的潛力是基于已開(kāi)發(fā)用于生產(chǎn)和霧化大量細(xì)菌的方法，并基于其以某種形式在人與人之間的傳播性。另一因素是該細(xì)菌樣品在4^界研究實(shí)驗(yàn)室中的廣泛分布。即使吸入少量有毒的霧化鼠疫耶爾森氏菌(K/7M船)芽孢桿菌的感染也可導(dǎo)致肺鼠疫，這是一種可在人與人之間傳播的高致死性鼠疫形式。天然流行的鼠疫主要為腺鼠疫，它通過(guò)來(lái)自被感染嚙齒動(dòng)物的跳蚤進(jìn)行傳播。肺鼠疫的癥狀包括發(fā)熱和咳嗽，這與另一些呼吸道疾病(如肺炎)的癥狀類似。癥狀似乎在接觸后1~6天出現(xiàn)并迅速導(dǎo)致死亡。如果不加以治療，肺鼠疫的死亡率幾乎達(dá)到100%。抗生素對(duì)于鼠疫^(guò)1有效的，然而有效疫苗還不是廣泛可用的。盡管鼠疫耶爾森氏菌能夠非常有效地侵入宿主上皮細(xì)胞，然而協(xié)助其侵入的分子機(jī)制還是未知的。多種鐵轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制以及至少3種群感機(jī)制(quorum-sensingmechanisms)的相互作用似乎參與其中。由于已對(duì)鼠疫耶爾森氏菌的基因組進(jìn)行了完全測(cè)序，因此應(yīng)該有可能加快對(duì)表征發(fā)病機(jī)制中關(guān)鍵事件的努力，這將有助于鑒定適當(dāng)?shù)暮蜻x疫苗、診斷試劑和用于藥物介入的關(guān)鍵把標(biāo)。鼠疫耶爾森氏菌外表面膜蛋白(Y.pestisoutermembraneprotein,Yomp)(存在幾種)似乎是重要的毒力因子，并在發(fā)病機(jī)制中扮演重要角色。鼠疫耶爾森氏菌具有質(zhì)粒編碼的一組毒力相關(guān)蛋白。室溫和Ca十+水平通過(guò)所謂"低Ca+十應(yīng)答(LCR)機(jī)制"來(lái)調(diào)節(jié)這些蛋白質(zhì)的表達(dá)和分泌。對(duì)質(zhì)粒編碼蛋白及其在發(fā)病機(jī)制中的作用的進(jìn)一步^it可提供有效亞基疫苗的基礎(chǔ)。為導(dǎo)致感染，鼠疫耶爾森氏菌和另一些病原性細(xì)菌需要從宿主的鐵螯合蛋白和/或血紅素螯合蛋白中除去鐵(一種必要的微量營(yíng)養(yǎng)物)。鼠疫耶爾森氏菌包^分表征的3個(gè)鐵轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，所述鐵轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)在鐵轉(zhuǎn)運(yùn)和除去中扮演重要角色。這些系統(tǒng)之一為鐵載體依賴型，并涉及耶爾森菌素(Ybt)的合成。因?yàn)閅bt系統(tǒng)對(duì)于鼠疫早期階段鐵的獲得是必需的，所以它可能是用于早期介入和治療的優(yōu)良乾標(biāo)。肉毒中毒肉毒桿菌毒素由產(chǎn)芽孢的厭氧菌肉毒桿菌(C7仍加W/"/if)產(chǎn)生，它是劇毒的物質(zhì)，其主要威脅來(lái)自人為接觸。該毒素是高致死性的，并易于產(chǎn)生和釋放進(jìn)環(huán)境中。肉毒桿菌毒素穿過(guò)粘膜表面被吸收并與外周膽堿能神經(jīng)突觸不可逆結(jié)合。該毒素存在7種抗原類型(A-G)。所有這7種毒素均導(dǎo)致類似的臨^現(xiàn)和疾病；在美國(guó)，A、B和E型肉毒桿菌毒素與絕大多數(shù)食物傳播疾病有關(guān)。接觸該毒素誘導(dǎo)的癥狀包括肌肉麻瘠；語(yǔ)言、吞咽或視物困難；并且在嚴(yán)重的病例中需要機(jī)械輔助呼吸。接觸該毒素的人需要立即和加強(qiáng)的支持性護(hù)理和治療。癥狀的發(fā)病和嚴(yán)重程度取決于毒素吸收進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)的iUL和量。對(duì)于食物傳播的接觸，潛伏期為2小時(shí)到8天不等，但通常限于72小時(shí)。當(dāng)新的運(yùn)動(dòng)軸突小支^^痹的肌肉恢復(fù)知覺(jué)(reenervate)時(shí)，癥狀得以平復(fù)，該過(guò)程在成人中需要幾周或幾個(gè)月。肉毒桿菌通常不感染人類。然而，A^進(jìn)M該生物污染的食物之后接觸毒素。對(duì)于肉毒桿菌毒素的作用機(jī)制已非常了解。該毒素由通過(guò)一個(gè)二硫鍵連接的重鏈和輕鏈組成，所述J^危鍵對(duì)神經(jīng)毒性是必需的。該毒素的序列和三維結(jié)構(gòu)均已確定。該結(jié)構(gòu)由3個(gè)功能結(jié)構(gòu)域組成催化亞基、轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域和結(jié)合結(jié)構(gòu)域。該毒素與外周膽喊能突觸的突觸前膜上的未知受體不可逆結(jié)合，所述外周膽喊能突觸主要在神經(jīng)肌肉的掩^處。在毒素被內(nèi)化并轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞溶膠后，輕鏈上包含Zn+十的內(nèi)肽酶阻斷U動(dòng)神經(jīng)元中釋放乙酰膽堿。通過(guò)阻止包含乙酰膽堿的小泡與端膜融合來(lái)阻斷釋放。這7種肉毒桿菌毒素表現(xiàn)出某些不同的蛋白酶活性，它們?cè)诓煌稽c(diǎn)切割3種SNARE蛋白(突觸小泡蛋白/VAMP、SNAP-25和突觸融合蛋白)。尚未完全了解這一蛋白水解特異性的分子基礎(chǔ)。SNARE蛋白在將突觸小泡運(yùn)至突觸前膜中是必需的。土拉菌病土拉菌病由于其高感染性水平(僅僅10個(gè)生物體即可導(dǎo)致疾病)以及可霧化的能力而是潛在的生物恐怖病原體。導(dǎo)致土拉菌病的土拉熱弗朗西絲氏菌()是不產(chǎn)芽孢的兼性胞內(nèi)細(xì)菌，可在低溫下存活幾周。已表征了該生物的兩種菌林一在北美洲發(fā)現(xiàn)的A型毒力高于在歐洲和亞洲發(fā)現(xiàn)的B型。該疾病不在人與人之間傳播；它天然地從小哺乳動(dòng)物或者被污染的食物、土壤或7jc傳播到人類。在^空氣傳播的顆粒之后發(fā)生天然感染。土拉菌病可采取幾種形式之一，這取決于接觸的途徑。由吸入空氣傳播的土拉熱弗朗西絲氏菌(F.似/we"^)而引起的該疾病是最有可能的人為接觸。吸入形式是急性的非特異性疾病，其在呼吸接觸后3~5天發(fā)??；在某些病例中，在幾天或幾周后發(fā)生胸膜肺炎。如果不加以治療，該病可導(dǎo)致呼吸衰竭。用抗生素治療天然獲得的病例4吏死亡率降低2~60%。已開(kāi)發(fā)了活減毒土拉菌病疫苗，并已才艮據(jù)IND(investigationalnewdrug，新試驗(yàn)藥)應(yīng)用將其施用給數(shù)以千計(jì)的志愿者。迄今，這種疫苗的使用限于實(shí)驗(yàn)室和其它高風(fēng)險(xiǎn)人員。毒力和發(fā)病的基^制還是未知的。土拉熱弗朗西絲氏菌的細(xì)胞壁異乎尋常地富含脂肪酸。失去莢膜可導(dǎo)致毒力喪失，而不影響生存力；然而，莢膜既沒(méi)有毒性也沒(méi)有免疫原性。土拉熱弗朗西絲氏菌感染涉及網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)并導(dǎo)致細(xì)菌在肺、肝和脾中復(fù)制。在呼吸接觸后，土拉熱弗朗西絲氏菌感染吞噬細(xì)胞，包括肺的巨噬細(xì)胞。在肝中，土拉熱弗朗西絲氏菌已表現(xiàn)出侵入肝細(xì)胞并在其中復(fù)制。被感染肝細(xì)胞的破壞導(dǎo)致細(xì)菌釋放，隨后被吞嗟細(xì)胞攝取。當(dāng)通過(guò)施用單克隆抗體阻止肝細(xì)胞裂解時(shí)，細(xì)菌繼續(xù)在肝細(xì)胞中復(fù)制，導(dǎo)致迅速地致死。B類和C類細(xì)菌具有通過(guò)氣霧劑途徑感染的潛力，所述細(xì)菌包括布魯氏菌屬物種，類鼻疽伯克霍爾德氏菌(5wA/w/flfenVif)、鼻疽伯克霍爾德氏菌(5"A/^/flfer/"、伯氏考克斯氏體(6"/tiC7)和選擇立克次氏體屬物種(及/d^泡/"spp.)。這些生物中大多數(shù)導(dǎo)致動(dòng)物傳染病或感染，即可從^f推動(dòng)物(例如，嚙齒動(dòng)物、鳥(niǎo)類、家畜)向人類傳播的感染或者感染性疾病。不同的細(xì)菌通過(guò)不同的途徑感染人類，所述途徑包括攝取、^UV或節(jié)肢動(dòng)物介導(dǎo)的傳播。然而，相信所有這些病原體均能在piUV少量生物體后導(dǎo)致感染。因此，這些病原體在生物防御中受到特別關(guān)注，因?yàn)樗鼈兛勺鳛闅忪F劑^t從而用作武器。布氏菌病由布魯氏菌屬物種導(dǎo)致，它主要是綿羊、山羊和牛的動(dòng)物傳播感染，但也發(fā)生在某些野生物種中，如野牛、駝鹿和鹿。在中東、地中海盆地、印度和中國(guó)仍存在人類感染，但在美國(guó)(u.s.)較罕見(jiàn)。天然人類感染可在職業(yè)性接觸或者攝取被污染的肉或未經(jīng)高溫消毒的乳制品后發(fā)生。潛伏期為5至60天不等。癥狀是多樣的，從急性發(fā)熱疾病到腦、骨、泌尿生殖道和心內(nèi)膜的慢性感染。少于2%的感染導(dǎo)致死亡，主要由馬爾他布魯氏菌(及/f^份e/f^)導(dǎo)致的心內(nèi)膜炎所致。6種布魯氏菌屬物種中僅有4種——豬布魯氏菌(A訓(xùn)/s)、馬爾他布魯氏菌、流產(chǎn)布魯氏菌(及)和狗布魯氏菌(B.canis)-已知在人類中導(dǎo)致布氏菌病；認(rèn)為馬爾他布魯氏菌和豬布魯氏菌比流產(chǎn)布魯氏菌或狗布魯氏菌對(duì)人類更具毒力。在人類以及其它哺乳動(dòng)物和鳥(niǎo)類中導(dǎo)致類鼻疽的類鼻疽伯克霍爾德氏菌發(fā)現(xiàn)于接近赤道的國(guó)家(尤其在亞洲)的土壤和M水中。人類感染是由于破損的皮膚、^取或^IA^被污染的水或灰塵。該疾病的幾種形式具有從幾天到許多年的潛伏期。大多數(shù)人類接觸導(dǎo)致無(wú)疾病的血清轉(zhuǎn)化。在急性敗血癥性類鼻疽中，傳播的類鼻疽伯克霍爾德氏菌可導(dǎo)致肺、肝、脾和/或淋巴節(jié)中的膿腫。在慢性或復(fù)發(fā)性類鼻疽中，肺和淋巴結(jié)最?；疾?。即使使用抗生素治療，在重度或慢性疾病中死亡率仍很高(高達(dá)50%)。導(dǎo)致鼻疽的生物一鼻疽伯克霍爾德氏菌主要是馬、騾和驢的疾病。盡管在美國(guó)已經(jīng)消滅，它仍然在亞洲、非洲和南美洲的家畜中發(fā)現(xiàn)。天然傳播到人類是4艮少見(jiàn)的，通常由造成皮膚損傷的開(kāi)放性傷口污染所致。已報(bào)道了氣霧劑接觸之后的感染，造成壞死性肺炎。全身傳播可導(dǎo)致膿皰性滲和迅速致命的疾病。家畜是伯氏考克斯氏體的主要貯主，伯氏考克斯氏體是引起Q熱的原因。伯氏考克斯氏體是高感染性的，并分布在4mM:界。被感染的動(dòng)物常常是無(wú)癥狀的，但是懷孕的動(dòng)物可能流產(chǎn)或死產(chǎn)。Q熱被認(rèn)為是與感染動(dòng)物和尸體iO巨離接觸的工人的職業(yè)病，然而在未發(fā)生近距離接觸的情況下感染也通過(guò)霧化細(xì)菌發(fā)生。僅吸入少量生物體即可導(dǎo)致感染。在2~3周的潛伏期后，發(fā)生由發(fā)熱、頭痛以及常有的單側(cè)性肺炎組成的急性疾病。該生物在肺中增殖，然后可侵入血流，導(dǎo)致心內(nèi)膜炎、肝炎、骨髄炎或在嚴(yán)重的情況下導(dǎo)致腦炎。多達(dá)65%的^_性感染者可死于所述疾病。伯氏考克斯氏體可以無(wú)活性狀態(tài)在空氣和土壤中保持活力幾周至幾個(gè)月，并對(duì)許多化學(xué)消毒劑以及脫水具有抗性。斑滲傷寒組的立克次氏體(如普氏立克次氏體(及/cA:etoiVi/^hy^A//))在虱和跳蚤的糞便中傳播，其中存在維^HI定感染幾個(gè)月的形式。斑滲熱組的立克次氏體(包括立氏立克次氏體(J.WcA:eto//)和康氏立克次氏體(及.^"銷'/))通過(guò)蜱的叮咬進(jìn)行傳播。有限的研究已提出，某些立克次氏體物種具有通過(guò)氣霧劑途徑的低劑量感染性。普氏立克次氏體和立氏立克次氏體導(dǎo)致最嚴(yán)重的感染，由擴(kuò)散的血管內(nèi)皮感染導(dǎo)致的病例死亡率平均為20-25%?？凳狭⒖舜问象w和傷寒立克次氏體(及.《M似)感染的病例死亡率為1-3%,感染個(gè)體表現(xiàn)出相似的臨M現(xiàn)，包括發(fā)熱、頭痛、肌痛、咳嗽、惡心、嘔吐。常在癥狀開(kāi)始后3~5天發(fā)生疹。在兒童中病例死亡率較低。布魯氏菌屬物種是小的不產(chǎn)芽孢的不動(dòng)需氧型革蘭氏陰性M菌。一旦進(jìn)入身體，布魯氏菌屬物種被多形核細(xì)胞(PMN)和巨噬細(xì)胞^it吞噬，但仍可能在細(xì)胞內(nèi)存活并保持活力。還不完全了解所述生物逃避細(xì)胞內(nèi)PMN殺傷的機(jī)制；然而，可能包括抑制PMN中消除活性氧中間體的髓過(guò)氧化物(11^61(^61*(^(16)-11202-卣化物體系和銅-鋅超氧化物歧化酶。在巨噬細(xì)胞內(nèi)存活可能是由于通過(guò)布魯氏菌的可溶產(chǎn)物抑制吞噬體-溶酶體融合所致。細(xì)胞壁外的光滑型脂多糖(S-LPS)組分是主要的細(xì)胞壁抗原和毒力因子。非光滑型菌林具有減弱的毒力，并且對(duì)正常血清的裂解更加敏感。剛剛完成了對(duì)豬布魯氏菌菌林的一個(gè)菌林1330的基因組測(cè)序，并與綿羊布魯氏桿菌病有關(guān)的另一菌林的接近完成的序列一起公開(kāi)。馬爾他布魯氏菌菌林16M的基因組序列已完成早在2002年公開(kāi)。鼻疽伯克霍爾德氏菌和類鼻疽伯克霍爾德氏菌都是需氧型革蘭氏陰性桿菌鼻疽伯克霍爾德氏菌是不動(dòng)的，而類鼻疽伯克霍爾德氏菌是能動(dòng)的。對(duì)伯克霍爾德氏菌毒力的分子機(jī)制知之甚少。類鼻疽伯克霍爾德氏菌的多糖莢膜是一種重要的毒力因子，毒素和II型脂多糖也被認(rèn)為起作用。鼻疽伯克霍爾德氏菌的基因組測(cè)序幾近完成，而類鼻疽伯克霍爾德氏菌的基因組測(cè)序正在進(jìn)行中。伯氏考克斯氏體是高度多型性的革蘭氏陰性球桿菌。它通過(guò)存在的細(xì)胞受體被動(dòng)1宿主的吞嗟細(xì)胞，它在所i^噬細(xì)胞的吞嗟溶S^中存活。低pH是該生物的代謝必需的。實(shí)際上，伯氏考克斯氏體對(duì)補(bǔ)體具有抗性，并且是強(qiáng)免疫原。其細(xì)胞壁具有免疫調(diào)節(jié)活性，其在小鼠中產(chǎn)生毒性反應(yīng)。伯氏考克斯氏體的NineMile菌林的基因組測(cè)序已完成。立克次氏體是小的革蘭氏陰性專性胞內(nèi)細(xì)菌，主要位于內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞溶膠中或其節(jié)肢動(dòng)物宿主的細(xì)胞中。該生物在虱咬部位局部增殖，通itifii液傳播，然后感染毛細(xì)血管、小動(dòng)脈和靜脈的內(nèi)皮細(xì)胞。斑滲熱立克次氏體通過(guò)基于作用的移動(dòng)性(acting-basedmobility)在細(xì)胞之間擴(kuò)散，并通過(guò)產(chǎn)生活性氧種類4吏被感染細(xì)胞受到損傷。斑滲傷寒組立克次氏體在細(xì)胞溶膠中增殖直至細(xì)胞破裂。普氏立克次氏體(MadridE菌林)和康氏立克次氏體(Mulish7菌株)的基因組測(cè)序已完成，傷寒立克次氏體和立氏立克次氏體的基因組測(cè)序幾近完成。古細(xì)菌本文所述的方法可用于檢測(cè)多種類型的病原體，包括但不限于來(lái)自以下古細(xì)菌域的任何屬的病原體酸葉菌屬(Acidilobus)、氣熱菌屬(Aeropyrum)、古生球菌屬(Archaeoglobus)、暖球形菌屬(Caldisphaera)、暖枝菌屬(Caldivirga)、硫還原球菌屬(Desulfurococcus)、硫還原葉菌屬(Desulfurolobus)、亞鐵球菌屬(Ferroglobus)、^L^體屬(Ferroplasma)、地丸菌屬(Geoglobus)、鹽盒菌屬(Haloarcula)、鹽桿菌屬(Halobacterium)、鹽棒菌屬(Halobaculum)、鹽二型菌屬(Halobiforma)、鹽球菌屬(Halococcus)、富鹽菌屬(Haloferax)、鹽幾何菌屬(Halogeometricum)、鹽甲烷球菌屬(Halomethanococcus)、鹽棍菌屬(Halorhabdus)、Halorubrobacterium、鹽紅菌屬(Halorubrum)、鹽簡(jiǎn)菌屬(Halosimplex)、鹽陸生菌屬(Haloterrigena)、棲高溫菌屬(Hyperthermus)、燃球菌屬(Ignicoccus)、生金球菌屬(Metallosphaera)、甲烷#^菌屬(Methanimicrococcus)、甲烷桿菌屬(Methanobacterium)、甲烷短桿菌屬(Methanobrevibacter)、甲烷礫、菌屬(Methanocalculus)、甲烷暖球菌屬(Methanocaldococcus)、擬甲烷球菌屬(Methanococcoides)、甲烷球菌屬(Methanococcus)、甲烷粒菌屬(Methanocorpusculum)、甲烷袋狀菌屬(Methanoculleus)、甲烷泡菌屬(Methanofollis)、產(chǎn)甲烷菌屬(Methanogenium)、甲烷鹽菌屬(Methanohalobium)、甲烷嗜鹽菌屬(Methanohalophilus)、葉形甲烷菌屬(Methanolacinia)、甲烷葉菌屬(Methanolobus)、甲烷微菌屬(Methanomicrobium)、甲烷微球菌屬(Methanomicrococcus)、甲烷盤(pán)菌屬(Methanoplanus)、曱烷嗜熱菌屬(Methanopyrus)、鬃毛甲烷菌屬(Methanosaeta)、曱烷咸菌屬(Methanosalsum)、甲烷/\疊球菌屬(Methanosarcina)、曱烷球形菌屬(Methanosphaera)、曱烷螺菌屬(Methanospirillum)、甲烷熱桿菌屬(Methanothermobacter)、甲烷熱球菌屬(Methanothermococcus)、曱烷嗜熱菌屬(Methanothermus)、曱烷絲菌屬(Methanothrix)、甲烷炎菌屬(Methanotorris)、鹽無(wú)色菌屬(Natrialba)、鈉線菌屬(Natrinema)、嗜鹽堿桿菌屬(Natronobacterium)、嗜鹽堿球菌屬(Natronococcus)、嗜鹽堿單胞菌屬(Natronomonas)、鹽堿紅菌屬(Natronorubrum)、古老球菌屬(Palaeococcus)、嗜酸球菌屬(Picrophilus)、熱棒菌屬(Pyrobaculum)、火球菌屬(Pyrococcus)、熱網(wǎng)菌屬(Pyrodictium)、Pyrolobus、葡萄嗜熱菌屬(Staphylothermus)、斯特氏菌屬(Stetteria)、棲冥河菌屬(Stygiolobus)、石克化葉菌屬(Sulfolobus)、厭石克球菌屬(Sulfophobococcus)、硫磺球形菌屬(Sulfurisphaera)、硫磺球菌屬(Sulfurococcus)、熱分支菌屬(Thermocladium)、熱球菌屬(Thermococcus)、熱盤(pán)菌屬(Thermodiscus)、熱絲菌屬(Thermofilum)、熱原體屬(Thermoplasma)、熱變形菌屬(Thermoproteus)、熱球形菌屬(Thermosphaera)和火山鬃菌屬(Vulcanisaeta)。真細(xì)菌本文所述的方法可用于檢測(cè)多種類型的病原體，其包括但不限于來(lái)自以下細(xì)菌(或真細(xì)菌)域的任何屬的病原體乏養(yǎng)菌屬(Abiotrophia)、聚乙酸菌屬(Acetitomaculum)、醋弧菌屬(Acetivibrio)、厭氧醋菌屬(Acetoanaerobium)、醋桿菌屬(Acetobacter)、醋酸桿菌屬(Acetobacterium)、線形醋菌屬(Acetofilamentum)、產(chǎn)醋菌屬(Acetogenium)、醋鹽桿菌屬(Acetohalobium)、醋微菌屬(Acetomicrobium)、醋絲菌屬(Acetonema)、醋熱菌屬(Acetothermus)、無(wú)膽甾原體屬(Acholeplasma)、無(wú)色菌屬(Achromatium)、無(wú)色桿菌屬(Achromobacter)、#*^酸桿菌屬(Acidaminobacter)、^^酸球菌屬(Acidaminococcus)、嗜酸微菌屬(Acidimicrobium)、嗜酸菌屬(Acidiphilium)、嗜酸球形菌屬(Acidisphaera)、嗜酸石危桿菌屬(Acidithiobacillus)、酸桿菌屬(Acidobacterium)、^i&菌屬(Acidocella)、酸單胞菌屬(Acidomonas)、熱酸菌屬(Acidothermus)、食酸菌屬(Acidovorax)、不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)、Acrocarpospora、異壁放線菌屬(Actinoalloteichus)、放線桿菌屬(Actinobacillus)、放線棒菌屬(Actinobaculum)、雙孢放線菌屬(Actinobispora)、珊瑚狀放線菌屬(Actinocorallia)、放線動(dòng)孢菌屬(Actinokineospora)、馬杜拉放線菌屬(Actinomadura)、放線菌屬(Actinomyces)、游動(dòng)放線菌屬(Actinoplanes)、多態(tài)放線菌屬(Actinopolymorpha)、放線多孢菌屬(Actinopolyspora)、抱器放線菌屬(Actinopycnidium)、抱嚢放線菌屬(Actinosporangium)、束絲放線菌屬(Actinosynnema)、埃及小體屬(Aegyptianella)、Aequorivita、氣球菌屬(Aerococcus)、氣微菌屬(Aeromicrobium)、氣單胞菌屬(Aeromonas)、阿菲波菌屬(Afipia)、震球菌屬(Agitococcus)、阿格雷氏菌屬(Agreia)、土壤桿菌屬(Agrobacterium)、土壤球菌屬(Agrococcus)、土壤單胞菌屬(Agromonas)、壤霉菌屬(Agromyces)、Ahrensia、Albibacter、Albidovulum、產(chǎn)械菌屬(Alcaligenes)、械湖生菌屬(Alcalilimnicola)、食減菌屬(Alcanivorax)、嗟冷菌屬(Algoriphagus)、Alicycliphilus、脂環(huán)酸桿菌屬(Alicyclobacillus)、Alishewanella、Alistipes、嗜i嗜堿菌屬(Alkalibacterium)、械湖生菌屬(Alkalilimnicola)、Alkaliphilus、械螺菌屬(Alkalispirillum)、Alkanindiges、Allisonella、Allochromatium、Allofustis、差異球菌屬(Alloiococcus)、異單胞菌屬(Allomonas)、異根瘤菌屬(Allorhizobium)、交替球菌屬(Alterococcus)、交替單胞菌屬(Alteromonas)、小鏈菌屬(Alysiella)、Amaricoccus、#^桿菌屬(Aminobacter)、Aminobacterium、氛基單胞菌屬(Aminomonas)、Ammonifex、Ammoniphilus、可變軒菌屬(Amoebobacter)、無(wú)定形抱嚢菌屬(Amorphosporangium)、雙芽抱軒菌屬(Amphibacillus)、小瓶菌屬(Ampullariella)、無(wú)枝酸菌屬(Amycolata)、擬無(wú)枝酸菌屬(Amycolatopsis)、Anaeroarcus、厭氧桿菌屬(Anaerobacter)、厭氧棒菌屬(Anaerobaculum)、厭氧螺菌屬(Anaerobiospirillum)、厭氧分支桿菌屬(Anaerobranca)、厭氧球菌屬(Anaerococcus)、厭氧絲菌屬(Anaerofilum)、Anaeroglobus、厭氧繩菌屬(Anaerolinea)、Anaeromusa、Anaeromyxobacter、Anaerophaga、厭氧枝原體屬(Anaeroplasma)、棍狀厭氧菌屬(Anaerorhabdus)、Anaerosinus、Anaerostipes、厭氧弧菌屬(Anaerovibrio)、Anaerovorax、無(wú)形體屬(Anaplasma)、綠臂菌屬(Ancalochloris)、臂微菌屬(Ancalomicrobium)、彎桿菌屬(Ancylobacter)、石危胺素芽孢桿菌屬(Aneurinibacillus)、嚢球菌屬(Angiococcus)、角微菌屬(Angulomicrobium)、厭氧芽抱桿菌屬(Anoxybacillus)、Anoxynatronum、Antarctobacter、水軒菌屬(Aquabacter)、Aquabacterium、7jC^t菌屬(Aquamicrobium)、水螺菌屬(Aquaspirillum)、產(chǎn)液菌屬(Aquifex)、蛛菌屬(Arachnia)、隱秘扦菌屬(Arcanobacteiium)、原囊菌屬(Archangium)、弓形菌屬(Arcobacter)、Arenibacter、非紅單胞菌屬(Arhodomonas)、殺雄菌屬(Arsenophonus)、節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)、Asaia、Asanoa、無(wú)甾醇原體屬(Asteroleplasma)、不粘柄菌屬(Asticcacaulis)、Atopobacter、阿托波氏菌屬(Atopobium)、橙單胞菌屬(Aurantimonas)、金桿菌屬(Aureobacterium)、固氮弧菌屬(Azoarcus)、氮單胞菌屬(Azomonas)、固氮絲菌屬(Azomonotrichon)、Azonexus、固氮才艮瘤菌屬(Azorhizobium)、嗜氮根瘤菌屬(Azorhizophilus)、Azospira、固氮螺菌屬(Azospirillum)、固氮菌屬(Azotobacter)、Azovibrio、芽孢桿菌屬(Bacillus)、絲桿菌屬(Bacterionema)、Bacteriovorax、擬桿菌屬(Bacteroides)、Bactoderma、Balnearium、巴氏絲菌屬(Balneatrix)、巴氏通氏體屬(Bartonella)、蛭弧菌屬(Bdellovibrio)、貝日阿托氏菌屬(Beggiatoa)、拜葉林克氏菌屬(Beijerinckia)、貝內(nèi)克氏菌屬(Beneckea)、伯杰氏菌屬(Bergeyella)、Beutenbergia、X5^桿菌屬(Bifidobacterium)、嗜膽菌屬(Bilophila)、芽生桿菌屬(Blastobacter)、芽生綠菌屬(Blastochloris)、^球菌屬(Blastococcus)、芽單胞菌屬(Blastomonas)、蟑螂桿狀體屬(Blattabacterium)、博戈里亞湖菌屬(Bogoriella)、博德特氏菌屬(Bordetella)、疏螺旋體屬(Borrelia)、Bosea、短狀桿菌屬(Brachybacterium)、短狀單胞菌屬(Brachymonas)、短螺旋體屬(Brachyspira)、Brackiella、慢生根瘤菌屬(Bradyrhizobium)、布蘭漢氏球菌屬(Branhamella)、Brenneria、短芽^&^f菌屬(Brevibacillus)、短桿菌屬(Brevibacterium)、短螺4t體屬(Brevinema)、短波單胞菌屬(Brevundimonas)、索絲菌屬(Brochothrix)、布魯氏菌屬(Brucella)、Brumimicrobium、巴克納氏菌屬(Buchnera)、布戴約維采菌屬(Budvicia)、Bulleidia、伯克霍爾德氏菌屬(Burkholderia)、布丘氏菌屬(Buttiauxella)、丁酸弧菌屬(Butyrivibrio)、Caedibacter、Caenibacterium、熱桿菌屬(Calderobacterium)、熱解纖維素菌屬(Caldicellulosiruptor)、暖繩菌屬(Ca區(qū)腦)、Caldimonas、暖發(fā)菌屬(Caldithrix)、喜熱菌屬(Caloramator)、Caloranaerobacter、鞘桿菌屬(Calymmatobacterium)、Caminibacter、Caminicella、彎曲桿菌屬(Campylobacter)、二氧4匕碳嗜纖維菌屬(Capnocytophaga)、莢膜菌屬(Capsularis)、嗜碳菌屬(Carbophilus)、Carboxydibrachium、Carboxydobrachium、Carboxydocella、氧化碳嗜熱菌屬(Carboxydothermus)、心桿菌屬(Cardiobacterium)、Carnimonas、肉桿菌屬(Carnobacterium)、顯核菌屬(Caryophanon)、乳酪桿菌屬(Caseobacter)、鏈孢菌屬(Catellatospora)、Catertibacteriurn、鏈狀球菌屬(Catenococcus)、短鏈游動(dòng)菌屬(Catenuloplanes)、卡托氏菌屬(Catonella)、柄桿菌屬(Caulobacter)、西地西菌屬(Cedecea)、纖維單胞菌屬(Cellulomonas)、噬纖維素菌屬(Cellulophaga)、纖維^t桿菌屬(Cellulosimicrobium)、纖維弧菌屬(Cellvibrio)。蜈松菌屬(Centipeda)、Cetobacterium、欽氏菌屬(Chainia)、螯合桿菌屬(Chelatobacter)、螯合球菌屬(Chelatococcus)、嗟幾丁質(zhì)菌屬(Chitinophaga)、衣原體屬(Chlamydia)、嗜衣體屬(Chlamydophila)、綠棒菌屬(Chlorobaculum)、綠菌屬(Chlorobium)、綠屈撓菌屬(Chloroflexus)、綠滑菌屬(Chloroherpeton)、綠絲菌屬(Chloronema)、軟骨霉?fàn)罹鷮?Chondromyces)、著色菌屬(Chromatium)、色桿菌屬(Chromobacteri腿)、色鹽桿菌屬(Chromohalobacter)、金黃桿菌屬(Chryseobacterium)、金色單胞菌屬(Chryseomonas)、產(chǎn)金菌屬(Chrysiogenes)、檸檬酸球菌屬(Citricoccus)、檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)、棍狀桿菌屬(Clavibacter)、克里夫蘭氏菌屬(Clevelandina)、梭菌屬(Clostridium)、Cobetia、Coenonia、柯林斯菌屬(Collinsella)、科爾韋爾氏菌屬(Colwdlia)、從毛單胞菌屬(Comamonas)、Conexibacter、Conglomeromonas、糞芽孢菌屬(Coprobacillus)、糞球菌屬(Coprococcus)、糞熱桿菌屬(Coprothermobacter)、科里氏桿菌屬(Coriobacterium)、棒桿菌屬(Corynebacterium)、科氏游動(dòng)菌屬(Couchioplanes)、考德里氏體屬(Cowdria)、考克斯氏體屬(Coxiella)、脆弱球菌屬(Craurococcus)、泉發(fā)菌屬(Crenothrix)、發(fā)毛針?biāo){細(xì)菌屬(Crinalium)(未有^Ut表)、脊螺旋體屬(Cristispira)、Croceibacter、Crocinitomix、克洛氏菌屬(Crossiella)、嗜冷菌屬(Cryobacterium)、Cryomorpha、隱桿菌屬(Cryptobacterium)、Cryptosporangium、貪銅菌屬(Cupriavidus)、短小桿菌屬(Curtobacterium)、圓桿菌屬(Cyclobacterium)、解環(huán)菌屬(Cycloclasticus)、孢嚢桿菌屬(Cystobacter)、謹(jǐn)纖維菌屬(Cytophaga)、凈旨孢嚢菌屬(Dactylosporangium)、Dechloromonas、Dechlorosoma、鐵還原桿菌屬(Deferribacter)、Defluvibacter、Dehalobacter、Dehalospirillum、異常桿菌屬(Deinobacter)、異常球菌屬(Deinococcus)、德萊氏菌屬(Deleya)、戴爾福特菌(Delftia)、Demetria、Dendrosporobacter、反硝化桿菌屬(Denitrobacterium)、反硝化弧菌屬(Denitrovibrio)、皮桿菌屬(Dermabacter)、皮球菌屬(Dermacoccus)、嗜皮菌屬(Dermatophilus)、德克斯氏菌屬(Desulfobacula)、德庫(kù)菌屬(Desemzia)、脫硫狀菌屬(Desulfacinum)、脫亞硫酸菌屬(Desulfitobacterium)、Desulfobacca、脫疏菌屬(Desulfobacter)、脫硫桿菌屬(Desulfobacterium)、Desulfobacula、脫疏葉菌屬(Desulfobulbus)、Desulfocapsa、Desulfocdla、脫疏球菌屬(Desulfococcus)、Desulfofaba、Desulfofiigus、Desulfofostis、^L^t鹽菌屬(Desulfohalobium)、脫石^#_菌屬(Desulfomicrobium)、脫疏單胞菌屬(Desulfomonas)、脫疏念珠菌屬(Desulfomonile)、Desulfomusa、Desulfonatronovibrio、Desulfonatronum、Desulfonauticus、脫疏線菌屬(Desulfonema)、Desulfonispora、Desulforegula、Desulforhabdus、Desulforhopalus、脫疏八疊球菌屬(Desulfosarcina)、Desulfospira、Desulfosporosinus、Desulfotalea、Desulfotignum、脫疏腸狀菌屬(Desulfotomaculum)、4ML弧菌屬(Desulfovibrio)、Desulfovirga、疏還原菌屬(Desulfurella)、除疏桿菌屬(Desulfurobacterium)、脫石危單胞菌屬(Desulfuromonas)、硫還原變形菌屬(Desulfuromusa)、Dethiosulfovibrio、德沃斯氏菌屬(Devosia)、戴阿利斯特桿菌屬(Dialister)、Diaphorobacter、偶蹄形菌屬(Dichdobacter)、雙歧微菌屬(Dichotomicrobium)、網(wǎng)球菌屬(Dictyoglomus)、迪茨氏菌屬(Dietzia)、雙環(huán)菌屬(Diplocalyx)、Dolosicoccus、狡詐球菌屬(Dolosigranulum)、Dorea、杜辨氏菌屬(Duganella)、Dyadobacter、Dysgonomonas、夕卜疏紅螺菌屬(Ectothiorhodospira)、愛(ài)德華氏菌屬(Edwa油iella)、Eggerthella、埃里希氏體屬(Ehrlichia)、艾肯氏菌屬(Eikendla)、鞘孢嚢菌屬(Elytrosporangium)、穩(wěn)桿菌屬(Empedobacter)、水棲菌屬(Enhydrobacter)、Enhygromyxa、劍菌屬(Ensifer)、腸桿菌屬(Enterobacter)、腸球菌屬(Enterococcus)、腸弧菌屬(Enterovibrio)、蟲(chóng)原體屬(Entomoplasma)、血蟲(chóng)體屬(Eperythrozoon)、Eremococcus、歐文氏菌屬(Erwinia)、丹毒絲菌屬(Erysipelothrix)、赤細(xì)菌屬(Erythrobacter)、赤微菌屬(Erythromicrobium)、赤單胞菌屬(Erythromonas)、埃希氏菌屬(Escherichia)、真桿菌屬(Eubacterium)、愛(ài)文氏菌屬(Ewingella)、卓孢菌屬(Excellospora)、微小桿菌屬(Exiguobacterium)、費(fèi)克藍(lán)姆菌屬(Facklamia)、Faecalibacterium、干草菌屬(Faenia)、鐮刀弧菌屬(Falcivibrio)、高鐵桿菌屬(Ferribacterium)、高鐵單胞菌屬(Ferrimonas)、閃爍桿菌屬(Fervidobacterium)、絲狀桿菌屬(Fibrobacter)、線狀桿菌屬(Filibacter)、產(chǎn)線菌屬(Filifactor)、Filobacillus、線狀微菌屬(Filomicrobium)、芬戈?duì)柕戮鷮?Finegoldia)、Flammeovirga、黃色單胞菌屬(Flavimonas)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、彎桿菌屬(Flectobacillus)、屈撓桿菌屬(Flexibacter)、Flexistipes、柔發(fā)菌屬(Flexithrix)、熒光桿菌屬(Fluoribacter)、甲酸弧菌屬(Formivibrio)、弗朗西絲氏菌屬(Francisella)、弗蘭克氏菌屬(Frankia)、弗拉特氏菌屬(Frateuria)、Friedmanniella、冷軒菌屬(Frigoribacterium)、Fulvimarina、Fulvimonas、Fundibacter、Fusibacter、梭桿菌屬(Fusobacterium)、Gallibacterium、Gallicola、嘉利翁氏菌屬(Gallionella)、Garciella、加德納氏菌屬(Gardnerella)、Gelidibacter、Gelria、孿生球菌屬(Gemella)、出芽菌屬(Gemmata)、芽單胞菌屬(Gemmatimonas)、芽殖菌屬(Gemmiger)、芽殖桿菌屬(Gemmobacter)、嗜熱溶胞土芽孢桿菌(Geobacillus)、Geobacter、地嗜皮菌屬(Geodermatophilus)、喬治菌屬(Georgenia)、地發(fā)菌屬(Geothrix)、地^t袍菌屬(Geotoga)、Geovibrio、Glaciecola、球鏈菌屬(Globicatella)、葡糖酸醋酸桿菌屬(Gluconacetobacter)、葡糖酸醋酸桿菌屬(Gluconoacetobacter)、葡糖桿菌屬(Gluconobacter)、糖霉菌屬(Glycomyces)、Gordonia、Gordonia、薄壁芽孢桿菌屬(Gracilibacillus)、格雷厄姆氏體屬(Grahamella)、顆粒鏈菌屬(Granulicatella)、格里蒙菌屬(Grimontia)、血巴通氏體屬(Haemobartonella)、嗜血菌屬(Haemophilus)、哈夫尼菌屬(Hafnia)、河氏菌屬(Hahella)、Halanaerobacter、鹽厭氧菌屬(Halanaerobium)、Haliangium、束綽桿菌屬(Haliscomenobacter)、霍氏菌屬(Hallella)、鹽厭氧桿菌屬(Haloanaerobacter)、鹽厭氧菌屬(Haloanaerobium)、喜鹽芽孢桿菌屬(Halobacillus)、擬鹽桿菌屬(Halobacteroides)、嗜鹽菌屬(Halocella)、Halochromatium、棲鹽菌屬(Haloincola)、鹽微菌屬(Halomicrobium)、鹽單胞菌屬(Halomonas)、Halonatronum、嗜鹽紅螺菌屬(Halorhodospira)、鹽螺旋藻屬(Halospirulina)、鹽熱發(fā)菌屬(Halothermothrix)、鹽^f狀菌屬(Halothiobacillus)、鹽弧菌屬(Halovibrio)、創(chuàng)傷球菌屬(Helcococcus)、螺旋菌屬(Heliobacillus)、螺桿菌屬(Helicobacter)、螺旋桿菌屬(Heliobacterium)、嗜日菌屬(Heliophilum)、Heliorestis、螺絲菌屬(Helio仇rix)、草螺菌屬(Herbaspirillum)、草狀孢菌屬(Herbidospora)、滑柱菌屬(Herpetosiphon)、Hippea、海氏菌屬(Hirschia)、嗜組織菌屬(Histophilus)、Holdemania、霍蘭德氏菌屬(Hollandina)、全噬菌屬(Holophaga)、全孢菌屬(Holospora)、Hongia、氬桿菌屬(Hydrogenobacter)、Hydrogenobaculum、氳謹(jǐn)胞菌屬(Hydrogenophaga)、嗜氫菌屬(Hydrogenophilus)、Hydrogenothermus、氫弧菌屬(Hydrogenovibrio)、Hymenobacter、生絲微菌屬(Hyphomicrobium)、生絲單胞菌屬(Hyphomonas)、艾德昂菌屬(Ideonella)、Idiomarina、Ignavigranum、泥桿菌屬(Ilyobacter)、Inquilinus、間孢嚢菌屬(Intrasporangium)、紫桿菌屬(Iodobacter)、Isobaculum、Isochromatium、等球菌屬(Isosphaera)、兩面神菌屬(Janibacter)、Jannaschia、紫色桿菌屬(Janthinobacterium)、Jeotgalibacillus、Jeotgalicoccus、約翰森氏菌屬(Johnsonella)、瓊斯氏菌屬(Jonesia)、Kerstersia、Ketogulonicigenium、酮古龍酸菌屬(Ketogulonigenium)、擬孢嚢菌屬(Kibdelosporangium)、動(dòng)球菌屬(Kineococcus)、動(dòng)球體菌屬(Kineosphaera)、動(dòng)孢囊菌屬(Kineosporia)、金氏菌屬(Kingella)、北里氏菌屬(Kitasatoa)、北里孢菌屬(Kitasatospora)、北里孢菌屬(Kitasatosporia)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、克呂沃爾氏菌屬(Kluyvera)、諾爾氏菌屬(Knoellia)、庫(kù)克菌屬(Kocuria)、科澤氏菌屬(Koserella)、Kozakia、韓國(guó)生工菌屬(Kribbella)、庫(kù)特氏菌屬(Kurthia)、庫(kù)茨涅爾氏菌屬(Kutzneria)、皮球菌屬(Kytococcus)、雙頭菌屬(Labrys)、Lachnobacterium、毛螺菌屬(Lachnospira)、^L軒菌屬(Lactobacillus)、乳球菌屬(Lactococcus)、乳球形菌屬(Lactosphaera)、閃桿菌屬(Lamprobacter)、閃嚢菌屬(Lamprocystis)、俊片菌屬(Lampropedia)、鷗桿菌屬(Laribacter)、勞特洛普氏菌屬(Lautropia)、勞森氏菌屬(Lawsonia)、列舍瓦里爾菌屬(Lechevalieria)、勒克氏菌屬(Leclercia)、軍團(tuán)菌屬(Legionella)、賴氏細(xì)菌屬(Leifsonia)、Leisingera、勒米諾氏菌屬(Leminorella)、Lentibacillus、倫茨菌屬(Lentzea)、纖線菌屬(Leptonema)、鉤端螺旋體屬(Leptospira)、鉤端螺菌屬(Leptospirillum)、纖發(fā)菌屬(Leptothrix)、纖毛菌屬(Leptotrichia)、無(wú)色桿菌屬(Leucobacter)、明串珠菌屬(Leuconostoc)、亮發(fā)菌屬(Leucothrix)、萊文氏菌屬(Levinea)、Lewinella、Limnobacter、湖生藍(lán)絲藻屬(Limnothrix)、利斯特氏菌屬(Listeria)、利斯頓氏菌屬(Listonella)、Lonepinella、長(zhǎng)孢菌屬(Longispora)、射光桿菌屬(Lucibacterium)、Luteimonas、黃球菌屬(Luteococcus)、菌屬(Lysobacter)、溶菌屬(Lyticum)、大球菌屬(Macrococcus)、大單胞菌屬(Macromonas)、磁螺菌屬(Magnetospirillum)、丙二酸單胞菌屬(Malonomonas)、默罕氏菌屬(Mannheimia)、Maricaulis、Marichromatium、Marinibacillus、Marinilabilia、Marinilactibacillus、海棲熱菌屬(Marinithermus)、Marinitoga、海桿菌屬(Marinobacter)、海細(xì)菌屬(Marinobacterium)、海球菌屬(Marinococcus)、海單胞菌屬(Marinomonas)、海螺菌屬(Marinospirillum)、大理市雕菌屬(Marmoricola)、Massilia、巨單胞菌屬(Megamonas)、巨球形菌屬(Megasphaera)、亞棲熱菌屬(Meiothermus)、蜜蜂球菌屬(Melissococcus)、蜂窩嚢菌屬(Melittangium)、新月菌屬(Meniscus)、Mesonia、中嗜桿菌屬(Mesophilobacter)、中間原體屬(Mesoplasma)、中慢生才艮瘤菌屬(Mesorhizobium)、Methylarcula、甲基菌屬(Methylobacillus)、甲基細(xì)菌屬(Methylobacter)、曱基桿菌屬(Methylobacterium)、甲基暖菌屬(Methylocaldum)、甲基帽菌屬(Methylocapsa)、Methylocella、甲基球菌屬(Methylococcus)、甲基孢嚢菌屬(Methylocystis)、甲基微菌屬(Methylomicrobium)、甲基單胞菌屬(Methylomonas)、噬甲基菌屬(Methylophaga)、嗜甲基茵屬(Methylophilus)、Methylopila、Methylorhabdus、甲基/\疊球菌屬(Methylosarcina)、甲基*曲菌屬(Methylosinus)、曱基球形菌屬(Methylosphaera)、食甲基菌屬(Methylovorus)、云母弧菌屬(Micavibrio)、^t桿菌屬(Microbacterium)、小雙孢侖屬(Microbispora)、產(chǎn)微球莖菌屬(Microbulbifer)、微球菌屬(Micrococcus)、微環(huán)菌屬(Microcyclus)、微囊藍(lán)細(xì)菌屬(Microcystis)、小莢孢嚢菌屬(Microellobosporia)、小月菌屬(Microlunatus)、微單胞菌屬(Micromonas)、小單孢菌屬(Micromonospora)、小多孢菌屬(Micropolyspora)、微白霜菌屬(Micropruina)、微顫藍(lán)細(xì)菌屬(Microscilla)、叉絲殼屬(Microsphaera)、小四孢菌屬(Microtetraspora)、Microvirga、Microvirgula、光崗菌屬(Mitsuokella)、動(dòng)彎桿菌屬(Mobiluncus)、Modestobacter、米勒氏菌屬(Moellerella)、Mogibacterium、穆?tīng)柺暇鷮?Moorella)、莫拉氏菌屬(Moraxella)、摩根氏菌屬(Morganella)、南極嗜冷菌屬(Moritella)、莫羅氏球菌屬(Morococcus)、Muricauda、鼠球菌屬(Muricoccus)、棲霉菌屬(Mycetocola)、分枝桿菌屬(Mycobacterium)、枝動(dòng)菌屬(Mycoplana)、枝原體屬(Mycoplasma)、Myroides、粘球菌屬(Myxococcus)、侏嚢菌屬(Nannocystis)、Natroniella、Natronincola、Natronoincola、Nautilia、奈瑟氏球菌屬(Neisseria)、新衣原體屬(Neochlamydia)、新立克次氏體屬(Neorickettsia)、Neptunomonas、涅斯捷連科氏菌屬(Nesterenkonia)、涅瓦河菌屬(Nevskia)、硝化桿菌屬(Nitrobacter)、硝化球菌屬(Nitrococcus)、亞硝'化球菌屬(Nitrosococcus)、亞硝化葉菌屬(Nitrosolobus)、亞硝化單胞菌屬(Nitrosomonas)、亞硝化螺菌屬(Mtrosospira)、硝化刺菌屬(Nitrospina)、硝化螺菌屬(Nitrospira)、諾卡氏菌屬(Nocardia)、類諾卡氏菌屬(Nocardioides)、擬諾卡氏菌屬(Nocardiopsis)、野野村菌屬(Nonomuraea)、野野村氏菌屬(Nonomuria)、新鞘氨醇桿菌屬(Novosphingobium)、肥桿菌屬(Obesumbacterium)、Oceanicaulis、海單胞菌屬(Oceanimonas)、Oceanisphaera、海洋棲熱菌屬(Oceanithermus)、Oceanobacillus、海洋桿菌屬(Oceanobacter)、海洋單胞菌屬(Oceanomonas)、海洋螺菌屬(Oceanospirillum)、蒼白軒菌屬(Ochrobactrum)、Octadecabacter、酒球菌屬(Oenococcus)、厄氏菌屬(Oerskovia)、奧卡河桿菌屬(Okibacterium)、嗜油菌屬(Oleiphilus)、油螺旋菌屬(Oleispira)、寡源桿菌屬(Oligella)、寡養(yǎng)菌屬(Oligotropha)、Olsenella、豐佑菌屬(Opitutus)、Orenia、口腔桿菌屬(Oribaculum)、東方體屬(Orientia)、鳥(niǎo)氨酸球菌屬(Ornithinicoccus)、鳥(niǎo)氨酸微菌屬(Ornithinimicrobiiim)、鳥(niǎo)桿菌屬(Ornithobacterium)、綠顫藍(lán)細(xì)菌屬(Oscillochloris)、顫螺菌屬(Oscillospira)、Oxalicibacterium、草酸桿菌屬(Oxalobacter)、嗜草桿菌屬(Oxalophagus)、Oxobacter、類芽^&^f菌屬(Paenibacillus)、草酸菌屬(Pandoraea)、Pannonibacter、泛菌屬(Pantoea)、Papillibacter、富、J衣原體屬(Parachlamydia)、葛'J球菌屬(Paracoccus)、Paracraurococcus、Paralactobacillus、Paraliobacillus、Parascardovia、短小盒菌屬(Parvularcula)、巴斯德氏菌屬(Pasteurella)、巴斯德氏芽菌屬(Pasteuria)、Paucimonas、梳狀菌屬(Pectinatus)、果膠桿菌屬(Pectobacterium)、片球菌屬(Pediococcus)、土iik^+t菌屬(Pedobacter)、土微菌屬(Pedomicrobium)、Pelczaria、Pelistega、暗桿菌屬(Pelobacter)、暗網(wǎng)菌屬(Pelodictyon)、Pdospora、Pelotomaculum、消化球菌屬(Peptococcus)、嗜胨菌屬(Peptoniphilus)、消化鏈球菌屬(Peptostreptococcus)、Persephonella、Persicobacter、石油神袍菌屬(Petrotoga)、芬尼氏菌屬(Pfennigia)、褐螺菌屬(Phaeospirillum)、Phascolarctobacterium、苯^^f菌屬(Phenylobacterium)、Phocoenobacter、發(fā)光桿菌屬(Photobacterium)、光桿狀菌屬(Photorhabdus)、葉桿菌屬(Phyllobacterium)、Pigmentiphaga、發(fā)仙菌屬(Pilimelia)、Pillotina、脂肪桿菌屬(Pimelobacter)、小梨形菌屬(Pirella)、小小梨形菌屬(Pirellula)、魚(yú)立克次氏體屬(Piscirickettsia)、浮霉?fàn)罹鷮?Planctomyces)、Planktothricoides、浮游藍(lán)絲藻屬(Planktothrix)、游動(dòng)雙孢菌屬(Planobispora)、動(dòng)性球菌屬(Planococcus)、動(dòng)性桿菌屬(Planomicrobium)、游動(dòng)單孢菌屬(Planomonospora)、游動(dòng)多孢菌屬(Planopolyspora)、游動(dòng)四孢菌屬(Planotetraspora)、Plantibacter、Pleisomonas、Plesiocystis、鄰單胞菌屬(Plesiomonas)、極地桿菌屬(Polaribacter)、極單胞菌(Polaromonas)、多嚢菌屬(Polyangium)、多核桿菌屬(Polynucleobacter)、產(chǎn)卟##菌屬(Porphyrobacter)、吟啉單胞菌屬(Porphyromonas)、布拉格菌屬(Pragia)、普氏菌屬(Prauserella)、普雷沃氏菌屬(Prevotella)、Prochlorococcus、原綠藍(lán)細(xì)菌屬(Prochloron)、原綠絲藍(lán)細(xì)菌屬(Prochlorothrix)、噬嘌呤菌屬(Prolinoborus)、原小單胞菌屬(Promicromonospora)、Propionibacter、丙酸桿菌屬(Propionibacterium)、Propionicimonas、產(chǎn)丙酸菌屬(Propioniferax)、產(chǎn)丙酸菌屬(Propionigenium)、丙酸微菌屬(Propionimicrobium)、丙酸螺菌屬(Propionispira)、Propionispora、丙酸弧菌屬(Propionivibrio)、突柄桿菌屬(Prosthecobacter)、突柄綠菌屬(Prosthecochloris)、突柄微菌屬(Prosthecomicrobium)、變形菌屬(Proteus)、原單胞菌屬(Protomonas)、普羅威登斯菌屬(Providencia)、Pseudaminobacter、交^f^單胞菌屬(Pseudoalteromonas)、類無(wú)枝菌酸菌屬(Pseudoamycolata)、假丁酸弧菌屬(Pseudobutyrivibrio)、類殺手桿菌屬(Pseudocaedibacter)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、假諾卡氏菌屬(Pseudonocardia)、Pseudoramibacter、假紅桿菌屬(Pseudorhodobacter)、假螺菌屬(Pseudospirillum)、假黃色單胞菌屬(Pseudoxanthomonas)、嗜冷桿菌屬(Psychrobacter)、冷彎菌屬(Psychroflexus)、嗜冷單胞菌屬(Psychromonas)、Psychroserpens、四瓣藻屬(Quadricoccus)、查因氏菌屬(Quinella)、拉恩氏菌屬(Rahnella)、勞爾氏菌屬(Ralstonia)、Ramlibacter、Raoultella、稀有桿菌屬(Rarobacter)、拉氏桿菌屬(Rathayibacter)、Reichenbachia、腎桿菌屬(Renibacterium)、桿狀色菌屬(Rhabdochromatium)、Rheinheimera、根瘤桿菌屬(Rhizobacter)、根瘤菌屬(Rhizobium)、才艮單胞菌屬(Rhizomonas)、Rhodanobacter、Rhodobaca、紅細(xì)菌屬(Rhodobacter)、細(xì)菌屬(Rhodobium)、柏拉菌屬(Rhodoblastus)、紅簍菌屬(Rhodocista)、紅球菌屬(Rhodococcus)、紅環(huán)菌屬(Rhodocyclus)、紅育菌屬(Rhodoferax)、Rhodoglobus、紅微菌屬(Rhodomicrobium)、紅球形菌屬(Rhodopila)、紅游動(dòng)菌屬(Rhodoplanes)、紅假單胞菌屬(Rhodopseudomonas)、紅螺細(xì)菌屬(Rhodospira)、紅螺菌屬(Rhodospirillum)、紅海菌屬(Rhodothalassium)、紅嗜熱鹽菌屬(Rhodothermus)、紅弧菌屬(Rhodovibrio)、小紅卵菌屬(Rhodovulum)、立克次氏體屬(Rickettsia)、立克次氏小體屬(Rickettsiella)、立默氏菌屬(Riemerella)、理研菌屬(Rikenella)、羅卡利馬氏體屬(Rochalimaea)、Roseateles、羅斯氏菌屬(Roseburia)、Roseibium、玫瑰彎菌屬(Roseiflexus)、Roseinatronobacter、Roseivivax、玫瑰軒菌屬(Roseobacter)、玫^^菌屬(Roseococcus)、政瑰單胞菌屬(Roseoraonas)、玫瑰螺菌屬(Roseospira)、玫瑰螺菌屬(Roseospirillum)、Roseovarius、羅氏菌屬(Rothia)、Rubrimonas、Rubritepida、紅長(zhǎng)命菌屬(Rubrivivax)、紅色桿菌屬(Rubrobacter)、Ruegeria、鈹紋單胞菌屬(Rugamonas)、瘤胃桿菌屬(Ruminobacter)、瘤胃球菌屬(Ruminococcus)、古字狀菌屬(Runella)、糖桿菌屬(Saccharobacter)、糖球菌屬(Saccharococcus)、糖單孢菌屬(Saccharomonospora)、糖多孢菌屬(Saccharopolyspora)、糖螺菌屬(Saccharospirillum)、糖絲菌屬(Saccharothrix)、Sagittula、薩勒河菌屬(Salana)、Salegentibacter、需鹽芽孢桿菌屬(Salibacillus)、鹽^f菌屬(Salinibacter)、Salinibacterium、鹽水球菌屬(Salinicoccus)、鹽7JC球形菌屬(Salinisphaera)、鹽7jc弧菌屬(Salinivibrio)、沙門(mén)氏菌屬(Salmonella)、Samsonia、橘色桿菌(Sandaracinobacter)、血桿菌屬(Sanguibacter)、腐敗螺旋菌屬(Saprospira)、/\疊球菌屬(Sarcina)、原生質(zhì)桿菌屬(Sarcobium)、Scardovia、Schineria、Schlegelella、施氏菌(Schwartzia)、塞巴魯?shù)戮鷮?Sebaldella)、Sedimentibacter、Selenihalanaerobacter、月形單胞菌屬(Selenomonas)、塞里伯氏菌屬(Seliberia)、蛇形菌屬(Serpens)、小蛇菌屬(Serpula)、小蛇菌屬(Serpulina)、沙雷氏菌屬(Serratia)、希瓦氏菌屬(Shewandla)、志賀氏菌屬(Shigella)、Shuttleworthia、Silicibacter、芯卡體屬(Simkania)、西蒙斯氏菌屬(Simonsiella)、中華才艮瘤菌屬(Sinorhizobium)、Skermanella、斯科曼氏菌屬(Skermania)、Slackia、Smithella、Sneathia、Sodalis、Soehngenia、Solirubrobacter、Solobacterium、球桿菌屬(Sphaerobacter)、球衣菌屬(Sphaerotilus)、鞘氨醇桿菌屬(Sphingobacterium)、鞘脂菌屬(Sphingobium)、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、Sphingopyxis、Spirilliplanes、螺孢菌屬(Spirillospora)、螺菌屬(Spirillum)、螺旋體屬(Spirochaeta)、螺原體屬(Spiroplasma)、螺狀菌屬(Spirosoma)、Sporanaerobacter、魚(yú)孢菌屬(Sporichthya)、Sporobacter、Sporobacterium、生孢嗟纖維菌屬(Sporocytophaga)、螺旋鹽桿菌屬(Sporohalobacter)、芽孢乳桿菌屬(Sporolactobacillus)、鼠孢菌屬(Sporomusa)、芽孢八疊球菌屬(Sporosarcina)、芽孢腸狀菌屬(Sporotomaculum)、Staleya、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、Stappia、Starkeya、星狀菌屬(Stella)、寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas)、Sterolibacterium、Stibiobacter、標(biāo)樁菌屬(Stigmatella)、口腔球菌屬(Stomatococcus)、鏈?zhǔn)人峋鷮?Streptacidiphilus)、Streptimonospora、鏈異壁菌屬(Streptoalloteichus)、鏈桿菌屬(Streptobacillus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、鏈單孢菌屬(Streptomonospora)、鏈霉菌屬(Streptomyces)、阿孫鏈霉菌(S.abikoensis)、突發(fā)鏈霉菌(S.erumpens)、紅色鏈霉菌(S.erythraeus)、密執(zhí)安鏈霉菌(S.michiganensis)、細(xì)黃鏈霉菌(S.microflavus)、沙阿霉素鏈霉菌(S.zaomyceticus)、鏈孢嚢菌屬(Streptosporangium)、鏈輪絲菌屬(Streptoverticillium)、Subtercola、解琥珀酸菌屬(Succiniclasticum)、琥珀酸單胞菌屬(Succinimonas)、Succinispira、琥詢酸弧菌屬(Succinivibrio)、Sulfitobacter、硫化桿菌屬(Sulfobacillus)、Sulfurihydrogenibium、Sulfurimonas、Sulfurospirillum、Sutterella、薩頓氏菌屬(Suttonella)、共生小桿菌屬(Symbiobacterium)、共生小體屬(Symbiotes)、互養(yǎng)菌屬(Synergistes)、互營(yíng)桿菌屬(Syntrophobacter)、Syntrophobotulus、互營(yíng)球菌屬(Syntrophococcus)、共養(yǎng)單胞菌屬(Syntrophomonas)、共養(yǎng)生抱菌屬(Syntrophospora)、互營(yíng)熱菌屬(Syntrophothermus)、互營(yíng)菌屬(Syntrophus)、坦納菌屬(Tannerella)、塔特洛克氏菌屬(Tatlockia)、塔特姆氏菌屬(Tatumella)、泰勒氏菌屬(Taylorella)、革桿菌屬(Tectibacter)、Teichococcus、地神菌屬(Telluria)、Tenacibaculum、Tepidibacter、Tepidimonas、Tepidiphilus、Terasakiella、Teredinibacter、地軒菌屬(Terrabacter)、地球菌屬(Terracoccus)、Tessaracoccus、四聯(lián)球菌屬(Tetragenococcus)、Tefrasphaera、Thalassomonas、Thalassospira、索氏菌屬(Thauera)、熱氣單胞菌屬(Thermacetogenium)、Thermaerobacter、熱厭氧單胞菌屬(Thermanaeromonas)、Thermanaerovibrio、Thermicanus、熱疏軒狀菌屬(Thermithiobacillus)、高溫放線菌屬(Thermoactinomyces)、熱厭氧桿菌屬(Thermoanaerobacter)、熱厭氧桿菌屬(Thermoanaerobacterium)、熱厭氧菌屬(Thermoanaerobium)、熱軒菌屬(Thermobacillus)、棲熱擬桿菌屬(Thermobacteroides)、嗜熱放線菌屬(Thermobifida)、高溫雙孢菌屬(Thermobispora)、棲熱分枝菌屬(Thermobrachium)、熱著色菌屬(Thermochromatium)、Thermocrinis、熱密巻菌屬(Thermocrispum)、熱脫疏軒菌屬(Thermodesulfobacterium)、Thermodesulforhabdus、熱脫疏弧菌屬(Thermodesulfovibrio)、Thermohalobacter、嗜熱產(chǎn)氫菌屬(Thermohydrogenium)、棲熱嗜油菌屬(Thermoleophilum)、熱微菌屬(Thermomicrobium)、熱單胞菌屬(Thermomonas)、高溫單孢菌屬(Thermomonospora)、棲熱線菌屬(Thermonema)、棲熱腔菌屬(Thermosipho)、高溫互養(yǎng)桿菌屬(Thermosyntropha)、Thermoterrabacterium、嗜熱絲菌屬(Thermothrix)、棲熱袍菌屬(Thermotoga)、熱脫硫菌屬(Thermovenabulum)、棲熱弧菌屬(Thermovibrio)、棲熱菌屬(Thermus)、Thialkalicoccus、Thialkalimicrobium、Thialkalivibrio、石^^菌屬(Thioalkalicoccus)、Thioalkalimicrobium、石^t^螺旋菌屬(Thioalkalispira)、Thioalkalivibrio、石克橄欖菌屬(Thiobaca)、硫桿菌屬(Thiobacillus)、石危小桿菌屬(Thiobacterium)、莢硫菌屬(Thiocapsa)、^t^菌屬(Thiococcus)、嚢石危菌屬(Thiocystis)、網(wǎng)硫菌屬(Thiodictyon)、石克黃球菌屬(Thioflavicoccus)、石克鹽匣菌屬(Thiohalocapsa)、Thiolamprovum、石沐菌屬(Thiomargarita)、石危微螺菌屬(Thiomicrospira)、硫單胞菌屬(Thiomoims)、3fel硫菌屬(Thiopedia)、辨硫菌屬(Thioploca)、石克紅球菌屬(Thiorhodococcus)、石克紅螺旋菌屬(Thiorhodospira)、石克紅弧菌屬(Thiorhodovibrio)、石危球菌屬(Thiosphaera)、硫螺菌屬(Thiospira)、石危螺旋菌屬(Thiospirillum)、發(fā)硫菌屬(Thiothrix)、卵石克菌屬(Thiovulum)、Tindallia、替策氏菌屬(Tissierella)、Tistrella、Tolumonas、曲發(fā)菌屬(Toxothrix)、特拉布斯氏菌屬(Trabulsiella)、密螺旋體屬(Treponema)、Trichlorobacter、毛球菌屬(Trichococcus)、Tropheryma、^#氏菌屬(Tsukamurella)、蘇黎士菌屬(Turicella)、Turicibacter、Tychonema、尿^L^、體屬(Ureaplasma)、解脲芽孢桿菌屬(Ureibacillus)、漫游球菌屬(Vagococcus)、吸血弧菌屬(Vampirovibrio)、Varibaculum、貪嗟菌屬(Variovorax)、韋榮球菌屬(Veillonella)、祝微菌屬(Verrucomicrobium)、Verrucosispora、弧菌屬(Vibrio)、食物谷菌屬(Victivallis)、枝芽孢桿菌屬(Virgibacillus)、Virgisporangium、Virgosporangium、Vitellibacter、透明顫菌屬(Vitreoscilla)、Vogesella、沃氏菌屬(Volcaniella)、火山棲熱菌屬(Vulcanithermus)、華診體屬(Waddlia)、威克斯氏菌屬(Weeksella)、魏斯氏菌屬(Weissella)、Wigglesworthia、Williamsia、沃爾巴克氏體屬(Wolbachia)、'^*^氏菌屬(Wolinella)、黃色桿菌屬(Xanthobacter)、黃單胞菌屬(Xanthomonas)、Xenophilus、致病桿菌屬(Xenorhabdus)、Xylanimonas、木桿菌屬(Xylella)、嗜木桿菌屬(Xylophilus)、耶爾森氏菌屬(Yersinia)、預(yù)研菌屬(Yokenella)、扎瓦爾金氏菌屬(Zavarzinia)、Zobdlia、動(dòng)膠菌屬(Zoogloea)、Zooshikella、發(fā)酵細(xì)菌屬(Zymobacter)、發(fā)酵單胞菌屬(Zymomonas)和嗜發(fā)酵菌屬(Zymophilus)。迄今，大量細(xì)菌基因組和病毒基因組的完整序列已保存在多個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中并為'^眾利用，例如GenBank，基因組研究所，www.tigr.org;GOLD基因組在線數(shù)據(jù)庫(kù)，IntegratedGenomics;igweb.integratedgenomics.com/GOLD，www.ncbi.nlm.nih.gov/PMGifs/Genomes/10239.html。真菌的基因組信息也是本領(lǐng)域已知的，例如參見(jiàn)http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes。出人意料地，多達(dá)25%的微生物的開(kāi)放讀碼框是該屬或種獨(dú)有的(即特異性的)，il^明了微生物中巨大的多樣性(PucciMJ,B.T.,DoughertyTJ.2002.Bacterial"genes陽(yáng)toscreens",83-96頁(yè).K.Shaw(編輯)，PathogenGenomics.HumanaPressLie,Totowa,NJ.)。利用這些lt據(jù)，基于遺傳序列分析的診斷變?yōu)橛辛Φ墓ぞ?。而且，因?yàn)榭股乜剐曰蛞裗^征，它們還成為基于核酸的檢測(cè)和鑒定的潛在乾標(biāo)。WFCC-MIRCEN世界徵生物數(shù)據(jù)中心(WDCM)提供了培養(yǎng)物收集的綜合目錄、微生物和細(xì)胞系的數(shù)據(jù)庫(kù)以及生物多樣性、分子生物學(xué)和基因組計(jì)劃的入口(參見(jiàn)http:Vwdcm.nig.ac.jp/)。WDCM提供了以下鏈接(1)微生物基因組計(jì)M，包括京都大學(xué)生物信息學(xué)中心和奈良科學(xué)技術(shù)學(xué)院的枯草芽自菌(Bacillussubtilis)基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(BSORF);美國(guó)杜克大學(xué)衣藻資源中心；NITE基因組分析數(shù)據(jù)庫(kù)(DOGAN);網(wǎng)柄菌(Dictyostelium)cDNA數(shù)據(jù)庫(kù)盤(pán)基網(wǎng)柄菌(Dictyosteliumdiscoideum)cDNA計(jì)劃(Dicty_cDB);貝勒醫(yī)學(xué)院的網(wǎng)柄菌基因組測(cè)序計(jì)劃；美國(guó)威斯康辛-麥迪遜大學(xué)"大腸桿菌基因組計(jì)劃(K-12和-157);日本奈良科學(xué)技術(shù)學(xué)院的;U^桿菌基因組分析計(jì)劃(GenoBase);KazusaDNA研究所的藍(lán)細(xì)菌基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(CyanoBase);日本的基因組信息中介(GIB)DNA數(shù)據(jù)庫(kù)(2002年5月的84種微生物)；基因組至蛋白質(zhì)和功能;GOLD:美國(guó)的基因組在線數(shù)據(jù)庫(kù)主頁(yè)IntegratedGenomicsInc.;JGI計(jì)劃微生物基因組學(xué)DOE聯(lián)合基因組學(xué)會(huì)；MagnaportheDB;日本東京大學(xué)醫(yī)學(xué)科學(xué)院的瘧疾全長(zhǎng)cDNA數(shù)據(jù)庫(kù)(惡性瘧原蟲(chóng))；微生物的基因組數(shù)據(jù)庫(kù)比較分析(MBGD);PEDANT:德國(guó)MIPS的基因組分析和評(píng)注；大腸桿菌染色體模式(PEC);酵母基因組信息服務(wù)器；京都大學(xué)和藍(lán)細(xì)菌研究協(xié)會(huì)的集胞藍(lán)細(xì)菌PCC6803基因評(píng)注數(shù)據(jù)庫(kù)(SYORF)生物信息學(xué)中心；基因組研究^;(2)微生物遺傳保藏中心，包括大腸桿菌遺傳資源國(guó)家遺傳學(xué)會(huì)；美國(guó)耶魯大學(xué)的大腸桿菌遺傳保藏中心(CGSC);美國(guó)的真菌遺傳學(xué)保藏中心(FGSC);國(guó)際互聯(lián)網(wǎng)生物技術(shù)資源目錄；PGSC假單胞菌遺傳保藏中心(美國(guó))；MAFF基因庫(kù)的微生物部分；世界大腸桿菌保藏和數(shù)據(jù)庫(kù)；(3)其它的基因組計(jì)劃,包括東京大學(xué)的異常剪接數(shù)據(jù)庫(kù)HGC;擬南^Rt息資源TAIR;BODYMAP人類基因解剖學(xué)表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)；BodyMap:人類和小鼠基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)；人類基因組研究生物數(shù)據(jù)庫(kù)丹麥中心，丹麥奧爾胡斯大學(xué)的丹麥生物技術(shù)數(shù)據(jù)庫(kù);DDBJ國(guó)際核苷酸序列數(shù)據(jù)庫(kù);DNA信息和保存中心(DISC);FlyBase:日本的果蠅NIG遺傳和分子數(shù)據(jù)庫(kù)；Flybase:伯克利果蠅基因組if劃；GDB:基因組數(shù)據(jù)庫(kù)；GenomeNet生物信息學(xué)中心，京都大學(xué)化學(xué)研究學(xué)會(huì)；GENOTK:東京大學(xué)的人類cDNA數(shù)據(jù)庫(kù)OtsukaGEN研究所和HGC;日本的HOWDY(人類基因組)日本科學(xué)技術(shù)公司；人染色體21序列圖譜RIKEN基因組科學(xué)中心(GSC)，人類基因組科研組；未鑒定的人類基因編碼大蛋白質(zhì)(HUGE)，KazusaDNA研究所；人類基因組計(jì)劃信息；人類基因組測(cè)序中心(前身是"生物學(xué)家的控制臺(tái)")；INE(水稻基因組研究項(xiàng)目，曰本)；JohnWiley&SonsLtd.;日本科學(xué)技術(shù)公司的JST人類基因組測(cè)序頁(yè)；MAGEST:Maboya(真海鞘(H.roretzi)基因表達(dá)模式和序列標(biāo)記，京都大學(xué)；醫(yī)學(xué)研究委員會(huì)；代謝途徑；MoulonWWW服務(wù)器；RIKEN基因組科學(xué)中心的小鼠百科全書(shū)索引；小鼠基因組信息學(xué)(MGI);德國(guó)慕尼黑蛋白質(zhì)序列信息中心；NCBIGenbank;NEXTDB:線蟲(chóng)表&模式數(shù)據(jù)庫(kù)，國(guó)家遺傳學(xué)學(xué)會(huì)；國(guó)立衛(wèi)生研究院(NIH);核酸數(shù)據(jù)庫(kù)計(jì)劃(NDB);p53MDB:p53突變數(shù)據(jù)庫(kù)HGC，東京大學(xué)；大鼠基因組圖鐠，OtsukaGEN研究所，牛津大學(xué)，劍橋大學(xué)，ResearchGeneticsInc.和東京大學(xué)的HGC;水稻基因組研究項(xiàng)目(RGP);SPAD:信號(hào)途徑數(shù)據(jù)庫(kù)，九州大學(xué)；綜合的分枝菌數(shù)據(jù)庫(kù)(MycDB);OGMP;英國(guó)MRC人類基因組作圖計(jì)劃資源中心。本文所述的方法用于檢測(cè)病原體特異性靶標(biāo)核酸的存在并測(cè)量其水平，從而檢測(cè)生物樣品中(尤其是從免疫抑制患者獲得的樣品中)的病原體，所述病原體包括病毒、細(xì)菌、原生動(dòng)物和真菌病原體，尤其是病毒、細(xì)菌和原生動(dòng)物病原體。該方法允許定量病原體特異性靶標(biāo)核酸，例如核酸樣品中病原體來(lái)源的DNA或RNA，以單個(gè)形式和允許在單個(gè)^^應(yīng)中測(cè)定兩種或更多靶標(biāo)核酸水平(例如表達(dá)水平或拷貝數(shù))的多元形式均可。本文所述方法和試劑盒所包括的其它病原體包括以下原生動(dòng)物微小隱孢子蟲(chóng)(Cryptosporidiumparvum)、人環(huán)孢子蟲(chóng)(Cyclosporacayetanensis)、藍(lán)氏賈第鞭毛蟲(chóng)(Giardialamblia)、溶組織內(nèi)阿米巴(Entamoebahistolytica)、弓形蟲(chóng)和微孢子蟲(chóng)。原生動(dòng)物本文所述方法可用于檢測(cè)原生動(dòng)物病原體。在美國(guó)，由于腸原生動(dòng)物和原生生物可能通過(guò)受損的食物和供水進(jìn)行傳播，因此它們歸為B類病原體。許多這些生物感染家養(yǎng)和野生的動(dòng)物。這些生物包括原生動(dòng)物微小隱孢子蟲(chóng)、人環(huán)孢子蟲(chóng)、藍(lán)氏賈第鞭毛蟲(chóng)、溶組織內(nèi)阿米巴和人剛地弓形蟲(chóng)，以及原生生物微孢子蟲(chóng)，如腦炎微孢子蟲(chóng)(Encephalitozoon)和腸微孢子蟲(chóng)(Enterocytozoon)。盡管通常被這些生物中的大多數(shù)感染對(duì)于健"來(lái)說(shuō)是無(wú)癥狀的或自限性的，但在免疫抑制的人中發(fā)生臨床癥狀。就生物恐怖潛力而言，最重要的生物包括微小隱孢子蟲(chóng)、溶組織內(nèi)阿米巴和人剛地弓形蟲(chóng)。這些生物可通過(guò)被污染的水和/或食物感染大量的人。另外，所有這些感染(除弓形體病外)可容易地在人與人之間傳播并難以診斷。大多數(shù)還可以被遺傳操作從而提高毒力或抗感染劑抗性。大多數(shù)借助食品和7jC傳播的B類原生動(dòng)物和原生生物的生活史已非常清楚。然而，對(duì)這些生物中某些進(jìn)行實(shí)騶^研究的限制在于體外培養(yǎng)的困難和動(dòng)物模型的缺乏。攝取微小隱孢子蟲(chóng)的卵嚢導(dǎo)致腸上皮細(xì)胞的感染，其中所述生物在保護(hù)性液泡內(nèi)進(jìn)行復(fù)制。因?yàn)楫?dāng)卵囊從所述細(xì)胞釋放時(shí)可發(fā)生自身感染，所以但^攝食少量卵嚢4更可導(dǎo)致免疫受損患者中嚴(yán)重且持久的感染。雖然其發(fā)病機(jī)制還不清楚，但是微小隱孢子蟲(chóng)可破壞腸的離子轉(zhuǎn)運(yùn)。微小隱孢子蟲(chóng)的兩種不同的基因型感染人類，基因型I的測(cè)序幾乎完成，而基因型II的測(cè)序正在進(jìn)行中。盡管人環(huán)孢子蟲(chóng)的分類學(xué)鑒定直至1993年才得以解決，但是在1979年就鑒定其與痢疾有關(guān)。卵嚢是感染形式，并對(duì)水凍和氯化處理均有抗性。卵囊包含兩個(gè)孢母細(xì)胞，每個(gè)孢母細(xì)胞包含兩個(gè)子孢子。小腸的感染可導(dǎo)致絨毛萎縮和固有層炎性浸潤(rùn)。尚不知itA環(huán)孢子蟲(chóng)的發(fā)病機(jī)制是否由于對(duì)腸細(xì)胞的直接影響所致，或者是涉及分泌毒素。在攝取僅為10~25個(gè)的孢嚢之后，營(yíng)養(yǎng)子形式的藍(lán)氏賈第鞭毛蟲(chóng)就在小腸定殖。營(yíng)養(yǎng)子由4根鞭毛和吸盤(pán)或固著器組成，包括作為宿主識(shí)別的重要抗原的微管結(jié)構(gòu)。粘附于上皮的機(jī)制還不確定，但是可能涉及特定的受體。通過(guò)將富含胱氨酸的表面蛋白改變?yōu)樽凅w特異性表面蛋白(VSSP)，營(yíng)養(yǎng)子發(fā)生了抗原性變化；這些表面蛋白還結(jié)合對(duì)于刷狀緣酶具有重要性的金屬，如鋅。細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答可在腸的組織學(xué)損傷中發(fā)揮作用；未鑒定出腸毒素。有藍(lán)氏賈第鞭毛蟲(chóng)的基因組計(jì)劃，基因表達(dá)數(shù)據(jù)也是可用的。像賈第鞭毛蟲(chóng)一樣，溶組織內(nèi)阿米巴的生活史由營(yíng)養(yǎng)子和孢囊組成。由于新培養(yǎng)基的開(kāi)發(fā)，關(guān)于溶組織內(nèi)阿米巴發(fā)病機(jī)制的信息已迅速增加。粘附腸上皮細(xì)胞對(duì)于發(fā)病機(jī)制是關(guān)鍵的，因?yàn)闋I(yíng)養(yǎng)子僅憑直接接觸便能殺死乾細(xì)胞；粘附通過(guò)寄生生物的表面凝集素來(lái)介導(dǎo)。已鑒定出降解分泌型lgA、粘蛋白和其他宿主細(xì)胞表面糖蛋白、并促進(jìn)細(xì)胞殺傷的其它寄生因子。溶組織內(nèi)阿米巴基因組的測(cè)序正在進(jìn)行中。人剛地弓形蟲(chóng)以3種形式存在卵嚢、含有慢殖子的組織孢囊和速殖子。卵嚢形式僅存在于被感染貓的腸中。在攝取后，從卵嚢釋放的子胞子穿透腸上皮細(xì)胞并在其中繁殖。上皮細(xì)胞的侵入似乎通過(guò)類錐體(速殖子上的錐形結(jié)構(gòu))介導(dǎo)。速殖子包>^在上皮細(xì)胞內(nèi)的液泡中，保護(hù)其免受溶酶體融合，并在擴(kuò)散到淋巴結(jié)和其它組織之前破壞宿主細(xì)胞。孢囊形成發(fā)生在被感染組織中，包括腦、視網(wǎng)膜和肌肉。延遲型超^L^應(yīng)導(dǎo)致組織嚢肺的破裂和周圍組織的壞死，這在視網(wǎng)膜中是具有臨床重要性的。在免疫受損的宿主中，再次激活可導(dǎo)致顯著的組織損傷并導(dǎo)致死亡。也可發(fā)生經(jīng)胎盤(pán)的感染，在懷孕期間首次感染人剛地弓形蟲(chóng)的婦女中30%~40%發(fā)生胎兒感染。利用現(xiàn)有的;U^的基因組數(shù)據(jù)庫(kù)和EST序列，正在進(jìn)行人剛地弓形蟲(chóng)的基因組測(cè)序。微孢子蟲(chóng)是唯一的細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)芽胞原生生物組。感染人類的微孢子蟲(chóng)包括小腸腦炎微孢子蟲(chóng)(五/fc印/^/i'to^ww/nte幼'""/f's)、何氏腦炎^L孢子蟲(chóng)(五"c./^//ew)、兔腦炎微孢子蟲(chóng)(￡"c.cww/c"/i')和比氏腸微孢子蟲(chóng)(五"^wyto^w"6/e/iews/),其對(duì)治療具有抗性。所述孢子由抗性壁、一個(gè)或兩個(gè)細(xì)胞核、孢原質(zhì)、固定盤(pán)和螺旋極性管組成。在感染期間，所述極性管伸出，刺穿宿主細(xì)胞并注入孢原質(zhì)。復(fù)制導(dǎo)致成熟孢子的數(shù)目增加，最終使細(xì)胞破裂。對(duì)于微小隱孢子蟲(chóng)，自身感染的潛能增加了孢子的產(chǎn)生。感染通常局限于腸中，只是在免疫受損的個(gè)體中可波及許多組織。兔腦炎微孢子蟲(chóng)的完整基因組測(cè)序已完成，已計(jì)劃對(duì)比氏腸微孢子蟲(chóng)的基因組進(jìn)行測(cè)序。本文所述方法的定量測(cè)定方面一方面，本文所述的方法使用通過(guò)外源加入的已知不同濃度竟?fàn)巹┖怂岫a(chǎn)生的內(nèi)標(biāo)，所述內(nèi)標(biāo)產(chǎn)生已知大小的擴(kuò)增產(chǎn)物，其大小彼此不同，而且不同于病原體特異性靶標(biāo)核酸的大小。將尺寸分離(例如通過(guò)毛細(xì)管電泳進(jìn)行)與檢測(cè)(例如通過(guò)熒光檢測(cè)進(jìn)行)聯(lián)用生成了由竟?fàn)巹┖怂嵯鄳?yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物的豐度產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)曲線。所述標(biāo)準(zhǔn)曲線允許測(cè)定原始樣品中的病原體特異性靶標(biāo)核酸濃度。另一方面，描述了估計(jì)和/或測(cè)定核酸樣品中病原體特異性靶標(biāo)核酸水平的方法。該方法包括以下步驟。首先，為給定病原體選擇乾標(biāo)分子，所述耙標(biāo)分子是特異性針對(duì)該病原體的，即所述靶標(biāo)分子不與該測(cè)定中存在的其它病原體靶標(biāo)分子發(fā)生反應(yīng)。然后，對(duì)每種給定的病原體特異性靶標(biāo)核酸選擇一對(duì)擴(kuò)增引物，在使用該對(duì)引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄(對(duì)于RNA乾標(biāo))和擴(kuò)增(例如，PCR擴(kuò)增，對(duì)于RNA和DNA靶標(biāo)都是)后，所述引物將產(chǎn)生已知長(zhǎng)度的靶標(biāo)擴(kuò)增子。引物設(shè)計(jì)中的考慮因素是本領(lǐng)域技術(shù)人員/^p的；然而，其中更為關(guān)鍵的方面是特異性(即引物應(yīng)該在至少一組擴(kuò)增條件下僅擴(kuò)增期望的靶標(biāo)分子)以及與及^應(yīng)中可能使用的其它引物的相容性(例如進(jìn)行多元分析時(shí))。寡核苷酸引物的長(zhǎng)度和核苷酸含量(例如G+C含量)對(duì)于決定引物的特異性和雜交特征(例如，解鏈溫度)是很重要的。對(duì)于寡核苷酸引物選擇或設(shè)計(jì)的其他考慮因素是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的和/或描述于下文中。然后，產(chǎn)生至少為兩種的一組竟?fàn)巹┖怂?。所述竟?fàn)巹┖怂崤c病原體特異性靶標(biāo)核酸對(duì)于所選擴(kuò)增引物共有同樣的引物結(jié)合序列(或其互補(bǔ)序列)，但是與使用同一組擴(kuò)增引物擴(kuò)增病原體特異性靶標(biāo)序列時(shí)產(chǎn)生的擴(kuò)增子長(zhǎng)度不同。重要的是，當(dāng)選定的擴(kuò)增引物對(duì)用于產(chǎn)生各自的擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，所述至少兩種竟?fàn)巹┖怂峋哂邢鄬?duì)于彼此并相對(duì)于病原體特異性靶標(biāo)核酸來(lái)說(shuō)相似的擴(kuò)增效率(如本文對(duì)該術(shù)語(yǔ)的定義)。在至少兩種竟?fàn)巹┖怂岬慕M中，優(yōu)選在使用相同的引物時(shí)一種竟?fàn)巹┊a(chǎn)生較長(zhǎng)的擴(kuò)增子，另一種竟?fàn)巹┊a(chǎn)生較短的擴(kuò)增子。(如下文所討論的，也可以包含不同量的其它更長(zhǎng)或更短的竟?fàn)巹?，用于改變?cè)摐y(cè)定的分辨率)。在另一些實(shí)施方案中，所述至少兩種竟?fàn)巹┖怂嶂械拿恳环N可產(chǎn)生比靶標(biāo)核酸產(chǎn)生的擴(kuò)增子更長(zhǎng)的擴(kuò)增子。應(yīng)該理解，在這種情況下，每種竟?fàn)巹?yīng)該產(chǎn)生相對(duì)于彼此并_14目對(duì)于靶標(biāo)擴(kuò)增子為不同已知長(zhǎng)度的擴(kuò)增子。在另一些實(shí)施方案中，所述至少兩種竟?fàn)巹┖怂嶂械拿恳环N可產(chǎn)生比耙標(biāo)核酸產(chǎn)生的擴(kuò)增子更短的擴(kuò)增子——同樣，這時(shí)竟?fàn)巹U(kuò)增子彼此之間以及與靶標(biāo)擴(kuò)增子之間必須相差已知的長(zhǎng)度。產(chǎn)生本文所述方法中所使用核酸的方法是本領(lǐng)域眾所周知的，例如，PCR(對(duì)于DNA竟?fàn)巹?或者從質(zhì)粒或其它分離的模板DNA進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄(對(duì)于RNA竟?fàn)巹?，或者化學(xué)合成。用于PCR、體外轉(zhuǎn)錄以及產(chǎn)生與給定DNA模板長(zhǎng)度不同的模板的方法對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是爿>知的和/或描述于下文中。竟?fàn)巹┖怂釘U(kuò)增子的大小差異應(yīng)該是可通過(guò)能區(qū)分大小相差10個(gè)核普^/4^對(duì)或更少、優(yōu)選地5個(gè)核苷^A^iJ^或更少或者甚至1個(gè)核苷酸或>5^對(duì)的核酸的方法檢測(cè)到的差異。例如，非常適合的方法是毛細(xì)管電泳。使毛細(xì)管電泳允許檢測(cè)少至1個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度差異的4Ht^/^p的。雖然本文所述方法中旨在包括少至l個(gè)核苷酸的差異，然而優(yōu)選竟?fàn)巹┖桶袠?biāo)之間的差異至少為5個(gè)核苷酸，從而在通過(guò)例如毛細(xì)管電泳進(jìn)行分離時(shí)可以更好地分辨所得擴(kuò)增子與靶標(biāo)擴(kuò)增子。還考慮了大于5個(gè)核苷酸的差異，例如IO、20、30、40或50個(gè)核苷酸。然而，差異不應(yīng)大到使得靶標(biāo)擴(kuò)增子或至少一種其它竟?fàn)巹U(kuò)增子的擴(kuò)增效率顯著不同(即，導(dǎo)致擴(kuò)增效率E的差異絕對(duì)值大于0.2，其中E=(Pn+1-Pn)/(Pn-)(其中Pn是PCR產(chǎn)物在第n循環(huán)時(shí)的量)。影響擴(kuò)增效率的因素是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，其包括例如引物的L、擴(kuò)增子的長(zhǎng)度、擴(kuò)增子的核苷B成、靶標(biāo)或引物中可能的二級(jí)結(jié)構(gòu)以及例如反應(yīng)中核苷酸修飾的存在。擴(kuò)增效率及其影響因素的測(cè)量是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的和/或描述于下文中。一種產(chǎn)生竟?fàn)巹┖怂岬暮?jiǎn)^^方法包括在病原體特異性靶標(biāo)擴(kuò)增子的序列內(nèi)部插入或缺失序列。該方法4吏竟?fàn)巹┖怂岷桶覙?biāo)核酸之間的相似性最大化，這進(jìn)而使得擴(kuò)增效率更有可能是相似的。這樣，將在對(duì)應(yīng)于靶標(biāo)核酸的克隆或擴(kuò)增的序列拷貝(例如，克隆的cDNA)上進(jìn)行定點(diǎn)誘變，從而添加或缺失足以改變擴(kuò)增子大小的核苷酸序列，所述擴(kuò)增子是將選定引物對(duì)用于擴(kuò)增時(shí)產(chǎn)生的。當(dāng)然，很明顯不應(yīng)誘變所選引物對(duì)所結(jié)合的序列。可以通過(guò)本領(lǐng)域公知的多種方法中任何方法來(lái)進(jìn)行定點(diǎn)誘變。針對(duì)每種病原體特異性靶標(biāo)核酸產(chǎn)生3、4或更多竟?fàn)巹┖怂岬慕M可能是有用的。額外的竟?fàn)巹┛梢詳U(kuò)大或更精確地限定給定的測(cè)定中定量測(cè)定的范圍。也就是說(shuō)，當(dāng)在反應(yīng)中使用例如濃度范圍為10~10,000個(gè)分子的第一和第二竟?fàn)巹r(shí)，可以通過(guò)所述竟?fàn)巹┥傻臉?biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)測(cè)定給定體積初始樣品中10~10,000個(gè)分子的乾標(biāo)核酸濃度。盡管該測(cè)定可相當(dāng)精確，然而更窄的竟?fàn)巹舛确秶?例如10至500或1，000個(gè)分子)可以提高精確度。類似地，在首先進(jìn)行估計(jì)時(shí)，范圍可以較寬(例如，10~50,000個(gè)分子)，如果期望更精確地測(cè)定粑標(biāo)核酸濃度，則之后的反應(yīng)在較窄的濃度下進(jìn)行。對(duì)于給定反應(yīng)中的給定靶標(biāo)核酸來(lái)說(shuō)，包含不同濃度的3、4或更多種竟?fàn)巹┖怂峥赡苁怯欣?。本領(lǐng)域的技術(shù)人員會(huì)了解，隨著竟?fàn)巹舛鹊奶岣?，可能需要調(diào)整擴(kuò)增引物的量或擴(kuò)增反應(yīng)的其它M。一旦選擇了一對(duì)擴(kuò)增引物并且產(chǎn)生了一組竟?fàn)巹┖怂幔赏ㄟ^(guò)以下步驟來(lái)定量測(cè)定樣品中的耙標(biāo)核酸將測(cè)試核酸樣品與一組至少兩種竟?fàn)巹┓肿咏M合，對(duì)乾標(biāo)和竟?fàn)巹┖怂徇M(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄以及使用所述擴(kuò)增引物對(duì)來(lái)擴(kuò)增靶標(biāo)和竟?fàn)巹┬蛄小Ｔ谝粋€(gè)替代性方法中，可以在從測(cè)試樣品中提取核酸之前將竟?fàn)巹┖怂崽砑又翗悠分?。在這種情況下，靶標(biāo)和竟?fàn)巹┖怂釋⒁黄鸨环蛛x。為了盡可能精確，加至樣品中的竟?fàn)巹?yīng)該使得至少一種以低于靶標(biāo)核酸濃度的已知濃度添加，并且至少一種以高于靶標(biāo)核酸濃度的已知濃度添加。竟?fàn)巹┖怂岬囊阎獫舛葢?yīng)該相差至少一個(gè)數(shù)量級(jí)(即10倍)，但相差幾個(gè)數(shù)量級(jí)(例如100倍、1,000倍或更多)可能是有利的。如果靶標(biāo)核酸的預(yù)計(jì)量完全未知，則使用不同范圍的竟?fàn)巹┻M(jìn)行一次或多次預(yù)實(shí)驗(yàn)以鑒定給定把標(biāo)的預(yù)計(jì)范圍濃度可能是有利的?；蛘撸墒褂枚喾N較不精確的定量擴(kuò)增方法的一種或另一種從而獲得粗略估計(jì)的預(yù)計(jì)濃度。這些方法在本領(lǐng)域是已知的，并使用例如針對(duì)單個(gè)參照模板在一系列平行反應(yīng)中進(jìn)行滴定。當(dāng)病原體特異性乾標(biāo)核^ARNA時(shí)使用逆轉(zhuǎn)錄。逆轉(zhuǎn)錄是本領(lǐng)域公知的，并可利用從用于擴(kuò)增的酶中分離的斷例如，使用逆轉(zhuǎn)錄酶如MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶)或利用相同的酶(例如，Tth聚合酶或另一種本領(lǐng)域已知具有RNA模板依賴性和DNA模板依賴性引物延伸能力的聚合酶)來(lái)進(jìn)行?？梢栽赑CR步驟的同一反應(yīng)混合物中進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄(一步方案)，或者可以在應(yīng)用PCR擴(kuò)增之前進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄(兩步方案)。類似地，DNA擴(kuò)增是本領(lǐng)域公知的?？稍谀孓D(zhuǎn)錄RNA之后使用Taqman和QuantiTectSYBR系統(tǒng)。核酸擴(kuò)增方法本文所述方法主要借助標(biāo)準(zhǔn)PCR,其中耙序列側(cè)翼的一對(duì)選定引物指導(dǎo)模板依賴地合成復(fù)制的DNA。然而，這并不排除可適用于本文所述方法的其它方法(例如，連接酶介導(dǎo)的擴(kuò)增或另外的等溫?cái)U(kuò)增方法，例如自動(dòng)維持序列擴(kuò)增(SelfSustainedSequenceRqiHcation，3SR)，Gingeras等，1990,AnnalesdeBiologieClinique,48(7):498-501;Guatelli等，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,87:1874;見(jiàn)下文)。在任何這樣的替代方法中，關(guān)鍵要素仍然是實(shí)現(xiàn)靶標(biāo)RNA和一組至少兩種竟?fàn)巹┖怂岬南嗨茢U(kuò)增效率。3SR;4^于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增系統(tǒng)(trancription-basedamplification,TAS)的派生物，它利用高啟動(dòng)子序列特異性和噬菌體DNA依賴型RNA聚合酶的重復(fù)特性來(lái)降低實(shí)現(xiàn)高水平擴(kuò)增所需的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)(Kwoh等，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,83:1173-1177)。在3SR中，每種引發(fā)寡核苷酸包含嗟菌體RNA聚合酶結(jié)合序列和優(yōu)選的轉(zhuǎn)錄起始序列，例如T7RNA聚合酶結(jié)合序列(TAATACGACTCACTATA:)和優(yōu)選的T7聚合酵轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。每種引物的其余序列是與待擴(kuò)增分子的靶標(biāo)序列互補(bǔ)的。示例性3SR條件在下文中有所描述。所述3SR擴(kuò)增反應(yīng)在含有靶標(biāo)RNA、40mMTris-HCl(pH8.1)、20mMMgCl2、2mM亞精胺-HCl、5mM二石危蘇糖醇、80pg/mlBSA、1mMdATP、1mMdGTP、1mMdTTP、4mMATP、4mMCTP、1mMGTP、4mMdTTP、4mMATP、4mMCTP、4mMGTP、4mMUTP和適量寡核苷酸引物(250ng的57聚體；該量根據(jù)引物序列的長(zhǎng)度而按比例增加或降低)的100nl中進(jìn)行。3SR反應(yīng)使用3~6阿摩爾(attomole)的核酸把標(biāo)。作為背景對(duì)照，平行進(jìn)行無(wú)任何耙標(biāo)的3SR反應(yīng)。將所述反應(yīng)混合物加熱至100。Cl分鐘，然后迅速冷卻至42°C。1分鐘后，加入10單位(通常體積約為2[il)逆轉(zhuǎn)錄酶(例如，鳥(niǎo)類成髓細(xì)胞血癥(myoblastosis)病毒逆轉(zhuǎn)錄酶(AMV-RT);LifeTechnologies/Gibco-BRL)。該反應(yīng)在42'C孵育10分鐘，然后加熱至100'C1分鐘。(如果使用單鏈模板進(jìn)行3SR反應(yīng)，則反應(yīng)混合物改為加熱至65'C1分鐘。)然后，反應(yīng)冷卻至37。C2分鐘，之后加入4.6nl的3SR酶混合物，其包含1.6plAMV-RT(18.5單位/nl)、1.0plT7RNA聚合酶(100單位/Hl)(二者例如均來(lái)自Stratagene;LaJolla，CA)和2.0pl大腸桿菌RNaseH(4單位/pl)(例如來(lái)自Gibco/LifeTechnologies;Gaithersburg，MD)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知根據(jù)需要調(diào)整酶的體積來(lái)補(bǔ)償取自不同生產(chǎn)批次或由不同的制造商提供的酶的比活性變化。如果必要的話，還可以改變酶的單位數(shù)。反應(yīng)在37。C孵育1小時(shí)，并利用冷凍來(lái)終止。想要通過(guò)取樣來(lái)監(jiān)測(cè)擴(kuò)增逸艮時(shí)，可以在3SR反應(yīng)的任何階段進(jìn)行取樣。由于3SR在單一溫度下連續(xù)進(jìn)行，因此沒(méi)有可取出等分試樣的單個(gè)循環(huán)。因此，可以在擴(kuò)增孵育期的設(shè)定時(shí)間(例如，每分鐘、每?jī)煞昼?、?分鐘等)進(jìn)行取樣。然后，分離所取出或擠出的等分試樣中的核酸并檢測(cè)核酸，從而允許產(chǎn)生擴(kuò)增譜，從其中可以測(cè)定最初樣品中的靶標(biāo)豐度。也有人將3SR稱為基于核酸序列的擴(kuò)增(或NASBA,NucleicAcidBasedAmplification)(實(shí)例參見(jiàn)Compton，1991，Nature,350:91-92;Kievits等，1991，J.VirolMeth.35:273-286，二者均通過(guò)參考并入本文中)?？捎糜诒景l(fā)明的另一核酸擴(kuò)增方法是DNA連接酶擴(kuò)增>^應(yīng)(ligaseamplificationreaction,LAR)，它已被j描述為通過(guò)幾種細(xì)菌DNA連接酶中任何一種的活性來(lái)允許特定的短序列指數(shù)增加(Wu和Wallace,1989,Genomics,4:560;Barany,1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:189，二者均通過(guò)參考并入本文中)。這項(xiàng)技術(shù)是基于寡核苷酸探針的連接。將探針設(shè)計(jì)成精確匹配特定靶標(biāo)核酸的兩段鄰近序列。在過(guò)量的探針存在時(shí)，擴(kuò)增反應(yīng)重復(fù)三個(gè)步驟(1)雙鏈核酸的熱變性，(2)將探針退火至把標(biāo)核酸，以及(3)通過(guò)熱穩(wěn)定的DNA連接酶連接所述探針。所述>^應(yīng)通常重復(fù)20-30個(gè)循環(huán)。本文公開(kāi)的取樣方法允許產(chǎn)生詳細(xì)的擴(kuò)增譜。至于任何循環(huán)擴(kuò)增方案，需要時(shí)(例如需要建立擴(kuò)增鐠時(shí))，可在任意循環(huán)之后取樣，然而優(yōu)選在每個(gè)循環(huán)之后取樣。滾環(huán)擴(kuò)增(rollingcirlcereaction,RCA)是已證明影響與PCR—樣大的一種替代性擴(kuò)增技術(shù)。該技術(shù)利用某些病毒的DNA復(fù)制機(jī)制。在RCA中，類似于許多病毒使用的復(fù)制技術(shù)，聚合酶沿著DNA環(huán)讀出單個(gè)啟動(dòng)子，連續(xù)滾動(dòng)出該環(huán)的線性多連體拷貝。在這樣的線性RCA中，所述反應(yīng)可進(jìn)行3天，產(chǎn)生小環(huán)序列的幾百萬(wàn)拷貝。已經(jīng)開(kāi)發(fā)出了指數(shù)式變化形式，其中另一啟動(dòng)子在每個(gè)重復(fù)時(shí)取代雙鏈，并起始DNA復(fù)制中的超分枝(hyperbranching)，每小時(shí)產(chǎn)生多達(dá)1012個(gè)拷貝?？傻靡嬗诒疚墓_(kāi)的取樣方法的另一種擴(kuò)增方法是鏈置換擴(kuò)增(strand-displacementamplification,SDA;Walker等，1992,NucleicAcidsRes"20:1691-1696;Spargo等，1993,Mol.CellularProbes7:395-404，其中每篇均通過(guò)參考并入本文中)。SDA使用兩種類型的引物和兩種酶(DNA聚合酶和限制性內(nèi)切核酸酶)來(lái)不同步地指數(shù)式產(chǎn)生單鏈擴(kuò)增子?；痉椒ǖ淖兓问浇档土艘锱c引物的相互作用，所述方法中擴(kuò)增引物組錨定到芯片上的特定區(qū)段。這種所謂的"錨定SDA"方法使得可以進(jìn)行多元DNA或RNA而不會(huì)降低擴(kuò)增效率(Westin等，2000，NatureBiotechnology18:199-204,其通過(guò)參考并入本文中)。SDA可受益于本文所述的取j洋和分離方法，因?yàn)橹貜?fù)^l樣可以產(chǎn)生詳細(xì)的擴(kuò)增鐠。在逆轉(zhuǎn)錄(必要或期望時(shí))和擴(kuò)增后，本文所述的方法包括通過(guò)尺寸來(lái)分離核酸擴(kuò)增產(chǎn)物。核酸的尺寸分離是眾所周知的，例如，通過(guò)瓊脂糖或聚丙烯酰胺電泳或通過(guò)柱層析法(包括HPLC分離)。優(yōu)選使用既快速又精確的毛細(xì)管電泳方法，其容易實(shí)現(xiàn)分離尺寸差異小至僅為一個(gè)核苷酸的分子。毛細(xì)管電泳使用少量的樣品，并且非常適于進(jìn)行檢測(cè)(例如熒光檢測(cè))。毛細(xì)管電泳是本領(lǐng)域公知的并詳細(xì)描述于下文中。如上所討論的，在分離后檢測(cè)對(duì)應(yīng)于病原體特異性靶標(biāo)核酸和竟?fàn)巹┖怂岬臄U(kuò)增核酸。所述檢測(cè)同時(shí)記錄給定大小核酸的給定條帶的位置以及該核酸的豐度(例如通過(guò)UV吸收或優(yōu)選地通過(guò)熒光信號(hào))。可簡(jiǎn)單地通過(guò)在擴(kuò)增前或擴(kuò)增期間將一種或多種熒光核苷酸添加至擴(kuò)增反應(yīng)混合物，從而將這樣的核苷酸摻入擴(kuò)增核酸中。一種替代性方法是對(duì)一種或多種擴(kuò)增引物進(jìn)行熒光標(biāo)記，使得從該引物擴(kuò)增的每M均包含至少一個(gè)與其相連的熒光標(biāo)記。雖然本文所述方法意在完全包括^f吏用熒光標(biāo)記核苷酸類似物來(lái)標(biāo)記擴(kuò)增產(chǎn)物，然而標(biāo)記一種或多種擴(kuò)增引物的優(yōu)勢(shì)在于不同靶標(biāo)核酸的引物可用不同的熒光團(tuán)有區(qū)別地進(jìn)行標(biāo)記，從而擴(kuò)展用本文所述方法可實(shí)現(xiàn)的多元可能性范圍。使用該方法，即4^1大小相似的幾組不同的病原體特異性靶標(biāo)和竟?fàn)巹┑臄U(kuò)增子也可以在同一反應(yīng)中進(jìn)行區(qū)分。在對(duì)經(jīng)過(guò)擴(kuò)增、分離的病原體特異性把標(biāo)和竟?fàn)巹┓肿舆M(jìn)行檢測(cè)后，本文所述方法使用所檢測(cè)的竟?fàn)巹┝孔鳛闃?biāo)準(zhǔn)。因?yàn)榫範(fàn)巹┑脑紳舛纫阎?、擴(kuò)增序列的信號(hào)與每個(gè)序列的初始量成比例，并且每個(gè)靶標(biāo)和竟?fàn)巹┓肿拥臄U(kuò)增效率相似，所以可才艮據(jù)竟?fàn)巹┑牧縼?lái)測(cè)定原始樣品中靶標(biāo)核酸的量。當(dāng)優(yōu)選地作為內(nèi)標(biāo)的竟?fàn)巹┳畛跻越咏袠?biāo)分子濃度的濃度存在時(shí)，該方法的準(zhǔn)確度進(jìn)一步得到加強(qiáng)。應(yīng)注意到，所述擴(kuò)增方法(如PCR)通常表現(xiàn)出動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，這使得擴(kuò)增過(guò)程存在有限的指數(shù)階段，在所述指數(shù)階段中擴(kuò)增模板的量與反應(yīng)中的原始模板量嚴(yán)格成比例。在給定的循環(huán)方案中該階段的確切位置將根據(jù)以下因素而變化，所述因素包括乾標(biāo)序列、引物序列和最初的靶標(biāo)模板豐度。本文所述方法非常適于確定靶標(biāo)序列在指數(shù)階段中究竟何時(shí)被擴(kuò)增(或者說(shuō)正在擴(kuò)增，這是說(shuō)循環(huán)和檢測(cè)同時(shí)或至少同時(shí)期進(jìn)行時(shí)的情況)。因此，一方面，本文所述方法可受益于將擴(kuò)增循環(huán)方案中的重復(fù)取樣與所取出的樣品中靶標(biāo)及竟?fàn)巹┖怂岬姆蛛x和檢測(cè)聯(lián)用。例如，擴(kuò)增期間的多個(gè)點(diǎn)或循環(huán)的熒光標(biāo)記的靶標(biāo)和竟?fàn)巹U(kuò)增子4吏得人們可以產(chǎn)生靶標(biāo)(或者靶標(biāo)和竟?fàn)巹?擴(kuò)增子豐度對(duì)循環(huán)數(shù)的曲線(常為自動(dòng)繪制)。該方法對(duì)任意給定的靶標(biāo)或竟?fàn)巹?zhǔn)確鑒定其擴(kuò)增以指數(shù)進(jìn)行的階段，這繼而允許鑒定乾標(biāo)模板的原始量。內(nèi)標(biāo)(例如已知濃度的較長(zhǎng)和較短的竟?fàn)巹?的加入進(jìn)一步加強(qiáng)了可通過(guò)該方式獲得的數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確度。也就是說(shuō)，不僅具有提供用于鑒定原始濃度的曲線的內(nèi)標(biāo)，而且還具有了解原始^板和擴(kuò)增產(chǎn)物之間的對(duì)應(yīng)在^Jl中的哪一點(diǎn)為最佳的優(yōu)勢(shì)。這個(gè)點(diǎn)對(duì)于一個(gè)反應(yīng)中不同的擴(kuò)增子來(lái)說(shuō)可能不同。同樣，取樣方法及其得到的譜允許對(duì)反應(yīng)中的每種不同擴(kuò)增子確定這些不同的點(diǎn)，這允許針對(duì)給定測(cè)定中不同的目標(biāo)病毒進(jìn)行更精確的病毒載荷測(cè)定。在擴(kuò)增循環(huán)方案期間取出樣品可手動(dòng)進(jìn)行，或者優(yōu)選自動(dòng)進(jìn)行，例如在機(jī)器人控制下進(jìn)行。自動(dòng)化取樣可增強(qiáng)取出樣品時(shí)間的一致性，并可有助于避免在手動(dòng)取樣M下可能發(fā)生的交叉污染。自動(dòng)化取樣和分析設(shè)備(包括毛細(xì)管電泳設(shè)備)描述于2003年3月12日提交的共同未決的美國(guó)專利申請(qǐng)No.10/387,286，其4^P內(nèi)^it過(guò)參考并入本文中。本文所述的竟?fàn)幮远繙y(cè)定方法非常適于在單個(gè)反應(yīng)中多元測(cè)定給定樣品中多種不同的病原體特異性靶標(biāo)核酸。這優(yōu)選地通iti^擇耙標(biāo)擴(kuò)增子和竟?fàn)巹U(kuò)增子的大小，從而針對(duì)每種不同的耙標(biāo)核酸得到可通過(guò)擴(kuò)增子大小進(jìn)行區(qū)分的不同靶標(biāo)和竟?fàn)巹U(kuò)增子組來(lái)實(shí)現(xiàn)。作為替代或補(bǔ)充，可使用特異性針對(duì)不同靶標(biāo)/竟?fàn)巹U(kuò)增子組的區(qū)別性標(biāo)記擴(kuò)增引物，從而在同一反應(yīng)中區(qū)別性,測(cè)不同的靶標(biāo)擴(kuò)增子?；镜亩嘣狿CR方法和成功進(jìn)行該方法所必需考慮的因素是本領(lǐng)域已知的并且易于應(yīng)用到本文所述方法中，其中有效分離和檢測(cè)來(lái)自不同已知靶標(biāo)的不同尺寸擴(kuò)增子的能力允許在單個(gè)反應(yīng)中檢測(cè)多個(gè)(例如，2、3、5、10、20、50或更多)乾信號(hào)。多元PCR通常需要特異性針對(duì)不同耙標(biāo)的引物之間的相互作用最小化，從而減少假象——也就是說(shuō)，人們?cè)O(shè)法避免反應(yīng)中使用的任意兩種引物彼此雜交而不與其各自靶標(biāo)分子雜交的能力。通?？衫玫能浖梢苑治龊皖A(yù)測(cè)給定引物組的引物-引物相互作用。引物設(shè)計(jì)本文所述方法依賴于將DNA寡核苷酸引物用于擴(kuò)增病原體特異性靶標(biāo)和竟?fàn)巹┬蛄小＿@些方法中使用的寡核苷酸引物可才艮據(jù)本文所述的本領(lǐng)域公知的一般指導(dǎo)以及如本文所述的特殊需求，對(duì)所述特定方法的每個(gè)步驟進(jìn)^i殳計(jì)。l.引物設(shè)計(jì)的通用策略寡核苷酸引物的長(zhǎng)度為5~100個(gè)核苷酸，優(yōu)選17~45個(gè)核苷酸，盡管不同長(zhǎng)度的引物都可使用。用于合成cDNA的引物優(yōu)選為10-45個(gè)核苷酸，而用于擴(kuò)增的引物優(yōu)選約17-25個(gè)核苷酸。還通過(guò)解鏈溫度估計(jì)法將可用于本文所述方法中的引物設(shè)計(jì)成具有特定的解鏈溫度(Tm)?？墒褂蒙唐烦绦虬?1igoTM、PrimerDesign和互聯(lián)網(wǎng)上可利用的程序(包括Primer3和OligoCalculator)來(lái)計(jì)算可用于本發(fā)明中的多核苷酸序列的Tm。優(yōu)選地，可用于本發(fā)明的擴(kuò)增引物的Tm(通過(guò)OligoCalculator計(jì)算)優(yōu)選為約45'C65。C,更優(yōu)選為約50。C60。C。多核苷酸的Tm影響其與另一多核苷酸的雜交(例如，寡核苷酸引物退火至^^板多核苷酸)。在所述方法中，優(yōu)選的是多個(gè)步驟中使用的寡核苷酸引物與靶標(biāo)模板或者制備或分離自該靶標(biāo)模板的多核苷酸(即，cDNA的第一和笫二鏈以及擴(kuò)增產(chǎn)物)選擇性雜交。通常，選擇性雜^JL生在兩種多核苷酸序列基本互4K在至少14~25個(gè)核苷酸的一段上至少約65%互補(bǔ)，優(yōu)選至少約75%互補(bǔ)，更優(yōu)選至少約卯％互補(bǔ))時(shí)。參見(jiàn)Kanehisa,M.，1984，PolynucleotidesRes.12:203,其通過(guò)參考并入本文中。因此，預(yù)計(jì)引發(fā)位點(diǎn)處一定程度的錯(cuò)配是可以容忍的。這樣的錯(cuò)配可以很小，如l、2、3個(gè)核普酸?；蛘?，錯(cuò)配區(qū)可包含環(huán)，其定義為其中存在4個(gè)或更多個(gè)核苷酸的不間斷序列的錯(cuò)配的區(qū)域。本文所述方法優(yōu)選100%互補(bǔ)。多種因素影響引物與另一多核苷酸分子雜交的效率和選擇性。在設(shè)計(jì)可用于本文所述方法的引物時(shí)考慮了這些因素，包括引物長(zhǎng)度、核苷酸序列和/或組成、雜交溫度、緩沖液組成以及在引物需要雜交的區(qū)域中可能的空間位阻。引物長(zhǎng)度與引物退火至耙序列的效率和精確度之間均存在正相關(guān)。具體地，較長(zhǎng)的序列具有比較短的序列更高的解鏈溫度(TM)，并且在給定的乾序列內(nèi)重復(fù)的可能性更小，因此使混雜雜交最小化。高G"C含量或包含回文序列的引物序列傾向于像與其目標(biāo)乾位點(diǎn)雜交一樣進(jìn)行自身雜交，因?yàn)樵谌芤褐袉畏肿颖入p分子的雜交動(dòng)力學(xué)通常更有利。然而，也4艮重要的是設(shè)計(jì)包含足夠數(shù)目的G-C核苷酸對(duì)的引物，因?yàn)槊總€(gè)G-C對(duì)通過(guò)3個(gè)氬鍵結(jié)合，而不是像A和T4^對(duì)結(jié)合耙序列時(shí)那樣為2個(gè)氬鍵，因此形成更緊密更牢固的鍵。雜交溫度與引物退火效率反方向變化，對(duì)于可能包含在引發(fā)反應(yīng)或雜交混合物中的有機(jī)溶劑(例如甲酖胺)濃度也是如此，而鹽濃度的提高則有助于結(jié)合。在嚴(yán)格退火條件下，較長(zhǎng)的雜交探針或合成引物比較短的更有效地雜交，后者在更為寬松的條件下是足夠的。優(yōu)選地，在允許多核苷酸序列與寡核普酸引物雜交的條件下(例如，對(duì)于PCR擴(kuò)增為95°C)，在適當(dāng)?shù)木彌_液(例如lxRT緩沖液，Stratagene目錄號(hào)—600085，lxpfu緩沖液，Stratagene目錄號(hào)_200536;或lx克隆Pfu緩沖液，Stratagene目錄號(hào)_200532，或適于cDNA合成和擴(kuò)增所4吏用其它酶的其它緩沖液)中進(jìn)行嚴(yán)""格雜交。嚴(yán)格雜交的條件可根據(jù)寡核苷酸引物的長(zhǎng)度和/或多核苷酸組成而變化(例如鹽濃度小于約1M,更通常小于約500mM，優(yōu)選地小于約200mM)，雜交溫度也可根據(jù)它們而變化(例如從低至0。C到高于22'C、高于約30。C以及(最常)高于約37。C)。對(duì)于特定的雜交，較長(zhǎng)的片段可能需要較高的雜交溫度。因?yàn)閹追N因素影響雜交的嚴(yán)格性，所以參數(shù)的組合比單個(gè)因素的絕對(duì)度量更加重要。使用易于獲得的計(jì)算機(jī)程序可有助于設(shè)計(jì)本文所述方法中使用的引物組，所述計(jì)算機(jī)程序開(kāi)發(fā)用于輔助評(píng)估上述若干M并優(yōu)化引物序列。這才羊的程序的實(shí)例為DNAStai"TM軟件包(DNAStar,Inc.;Madison,WI)的"PrimerSelect"、OLIGO4.0(NationalBiosciences,Inc.)、PRIMER、OligonucleotideSelectionProgram、PGEN和Amplify(描述于如上引用的Ausubel等中)。2.寡核苷酸合成寡核苷酸引物本身使用本領(lǐng)域^H^的技術(shù)合成。制備特定序列寡核苷酸的方法包括例如克隆和限制性消化適當(dāng)?shù)男蛄幸约爸苯踊瘜W(xué)合成。設(shè)計(jì)完畢后，寡核苷酸也可通過(guò)適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)合成法來(lái)制備，所述方法包括例如描述于Narang等，1979，MethodsinEnzymology，68:90的磷酸三酯法、公開(kāi)于Brown等，1979,MethodsinEnzymology,68:109的褲酸二酯法、公開(kāi)在Beaucage等，1981,TetrahedronLetters,22:1859中的二乙基#^磷酸酯法，以及公開(kāi)于美國(guó)專利號(hào)4,458,066中的固體支持法，或者通過(guò)使用商品化的自動(dòng)化寡核苷酸合成儀(市售的)或VLSIPSTM技術(shù)的其它化學(xué)方法來(lái)制備。競(jìng)爭(zhēng)劑RNA的i殳計(jì)和合成當(dāng)用于如本文所述的方法中時(shí)，竟?fàn)巹┖怂釕?yīng)通過(guò)對(duì)給定病原體特異性把標(biāo)核酸選擇的相同引物組進(jìn)行擴(kuò)增，并與使用相同選定引物組的靶標(biāo)核酸具有相似的擴(kuò)增效率。竟?fàn)巹┖怂釕?yīng)該4吏用所選引物組獲得擴(kuò)增產(chǎn)物，所述擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度彼此可區(qū)分，并與靶標(biāo)核酸擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度可區(qū)分。分離技術(shù)的分辨率將必然影響可區(qū)分的長(zhǎng)度差異。如上所述，通常可實(shí)現(xiàn)少至一個(gè)核普酸的差異，盡管即4^1在這樣的情況下使用更長(zhǎng)的長(zhǎng)度以提供對(duì)信號(hào)的更好區(qū)分也是有用的。一個(gè)關(guān)鍵因素是使得長(zhǎng)度差異長(zhǎng)至足以通過(guò)所選方法(例如，毛細(xì)管電泳)進(jìn)行檢測(cè)，但又短至足以不顯著改變其相對(duì)于靶標(biāo)核酸的擴(kuò)增效率。也就是說(shuō)，較長(zhǎng)或較短的竟?fàn)巹┖怂岬臄U(kuò)增效率必須與靶標(biāo)核酸的擴(kuò)增效率相似。如上所述，竟?fàn)巹┖怂岬奶卣髟谟诖嬖谠试S其進(jìn)行擴(kuò)增的序列，所述擴(kuò)增通過(guò)選擇用于擴(kuò)增給定的病原體特異性靶標(biāo)核酸的寡核苷酸引物來(lái)進(jìn)行。竟?fàn)巹┖怂嵬ㄟ^(guò)擴(kuò)增病原體特異性靶標(biāo)核酸的相同引物對(duì)進(jìn)行擴(kuò)增，這確保了引物對(duì)靶標(biāo)和竟?fàn)巹┬蛄械耐嘶鹦适窍嗤?，ilXt于確保竟?fàn)巹┖桶袠?biāo)核酸相似的擴(kuò)增效率是重要的。為了維持相似的擴(kuò)增效率，重要的是竟?fàn)巹┖怂?或更準(zhǔn)確地說(shuō)，其擴(kuò)增產(chǎn)物)具有與耙標(biāo)核酸(或其擴(kuò)增產(chǎn)物)相似的Tm。用于對(duì)任何給定序列評(píng)估1\的方法是本領(lǐng)域>^知的。如果Tm相對(duì)于靶標(biāo)核酸在例如i-2'c、優(yōu)選o.s至rc或更小的差異內(nèi)，則Tm^l相似的。優(yōu)選竟?fàn)巹┖桶袠?biāo)核酸包含至少20個(gè)序列一致的核苷酸或M對(duì)。這優(yōu)選地作為共同引物結(jié)合序列的補(bǔ)充。靶標(biāo)和竟?fàn)巹┖怂岬囊锝Y(jié)合序列不需要一致，但應(yīng)該允許利用同樣的引物進(jìn)行擴(kuò)增。因?yàn)橐锿嘶鹦实牟町愑绊憯U(kuò)增效率，所以最簡(jiǎn)單的是維持病原體特異性靶標(biāo)和竟?fàn)巹┬蛄兄g這些序列的一致性。為了得到擴(kuò)增效率與病原體特異性靶標(biāo)核酸必然相似的竟?fàn)巹┖怂?，一種最簡(jiǎn)單的方法是修飾對(duì)應(yīng)于病原體特異性靶標(biāo)核酸的克隆cDNA,所述修飾通過(guò)在病原體特異性靶標(biāo)序列本身中插入或缺失短(例如插入或缺失1-20個(gè)核普酸，例如插入或缺失5-20個(gè)核苷酸或5-10個(gè)核苷酸)片段(即，內(nèi)部插入或缺失)來(lái)進(jìn)行。這確保了退火和擴(kuò)增效率的相似特征，僅有的差異是內(nèi)部的插入或缺失。雖然插入或缺失短連續(xù)序列更容易實(shí)現(xiàn)，但本實(shí)施方案中所涵蓋的插入或缺失還可包括插入或缺失不連續(xù)的核苷酸或4^對(duì)，也就是說(shuō)，在病原體特異性靶標(biāo)序列內(nèi)部的多于一個(gè)位置上取出或插入。對(duì)于較短的乾標(biāo)擴(kuò)增子序列(例如50~75個(gè)核苷酸)，使長(zhǎng)度差異保持在該范圍的較短一側(cè)(例如15個(gè)核苷酸)是有利的，因?yàn)檫@在百分比基礎(chǔ)上使得序列組成的變化較小。對(duì)于較長(zhǎng)的靶標(biāo)擴(kuò)增子序列，長(zhǎng)度差異可以更長(zhǎng)，而不顯著影響分子的擴(kuò)增特征。即使在較長(zhǎng)靶標(biāo)擴(kuò)增子序列的情況下，插入或缺失仍優(yōu)選10個(gè)核苷酸(或>^^)或更少，特別;K吏用能夠分辨少至1個(gè)核苷酸或>5^)"的方法(例如CE)進(jìn)行大小分離時(shí)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員會(huì)理解，一種影響擴(kuò)增效率的因素是存在相同核苷酸的重復(fù)片段(例如polyA、polyG等)，與沒(méi)有所述重復(fù)的相似序列相比，這通常降低擴(kuò)增效率。因此，當(dāng)考慮所添加(或缺失)的序列時(shí)，最好添加或缺失核苷酸組成大致平衡的序列。添加或缺失的序列可以是氨基酸編碼或非編碼序列，并且需要時(shí)任選地可包括常規(guī)或非常規(guī)核苷酸。使用本領(lǐng)域公知的定點(diǎn)誘變技術(shù)容易在竟?fàn)巹┖怂峤M的產(chǎn)生中實(shí)現(xiàn)序列插入或缺失。本領(lǐng)域已知允許DNA序列定向誘變的多種方法(參見(jiàn)如Ausubel等.ShortProtocolsinMolecularBiology(1995)第三版.JohnWiley&Sons,Inc.)。另外，有多種市售的試劑盒用于定點(diǎn)誘變，常規(guī)和基于PCR的方法均包括在內(nèi)。實(shí)例包括GeneMorph隨機(jī)誘變?cè)噭┖?Stratagene目錄號(hào)600550或200550)、可從Stratagene獲得的EXSITETM基于PCR的定點(diǎn)誘變?cè)噭┖?目錄號(hào)No.200502)和來(lái)自Stratagene的QUIKCHANGE定點(diǎn)誘變?cè)噭┖?目錄號(hào)No.200518)，以及同樣來(lái)自Stratagene的CHAMELEON⑧雙鏈定點(diǎn)誘變?cè)噭┖?目錄號(hào)No.200509)。擴(kuò)增效率的測(cè)量在下文進(jìn)行描述。一旦設(shè)計(jì)好竟?fàn)巹┑男蛄?，用于本文所述方法的竟?fàn)巹┖怂峥赏ㄟ^(guò)例如本領(lǐng)域已知的化學(xué)合成、PCR來(lái)產(chǎn)生，或者當(dāng)竟?fàn)巹┖薧:RNA時(shí)通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生。體外轉(zhuǎn)錄技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。簡(jiǎn)言之，將目的序列與用于原核生物聚合酶的啟動(dòng)子序列(如噬菌體T7、T3和Sp6RNA聚合酶啟動(dòng)子)連接，然后使用適當(dāng)?shù)木酆厦冈隗w外轉(zhuǎn)錄DNA模板。所述模板本身可以是線性PCR產(chǎn)物，其中已引入啟動(dòng)子，例如通過(guò)在PCR擴(kuò)增引物之一中包含適當(dāng)?shù)膯?dòng)子序列來(lái)引入。如有需要，與各在一個(gè)末端的兩個(gè)不同啟動(dòng)子連接產(chǎn)生了得到竟?fàn)巹㏑NA的互補(bǔ)序列的可能?；蛘?，可以將對(duì)應(yīng)于期望竟?fàn)巹㏑NA的DNA序列插入含有Sp6、T3或T7啟動(dòng)子的載體中。用適當(dāng)?shù)南拗菩悦笇⑺鲚d體線性化，所述限制性酶在位于竟?fàn)巹┬蛄邢掠蔚膯蝹€(gè)位點(diǎn)消化所述栽體。在酚/氯仿抽提后，用乙醇沉淀DNA，在70%乙醇中洗滌、干燥并重懸在無(wú)菌水中。不管啟動(dòng)子/模板構(gòu)建體的確切形式(即線性PCR產(chǎn)物或線性化的載體構(gòu)建體)如何，體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)均通過(guò)將所述線性DNA在轉(zhuǎn)錄緩沖液(200mMTris-HCl，pH8.0、40mMMgCl2、10mM亞精胺、250NaCl[T7或T3或者200mMTris-HCl,pH7.5、30mMMgCl2、10mM亞精胺[Sp6)、二硫蘇糖醇、RNase抑制劑、4種核糖核苷三磷酸中的每一種以及Sp6、T7或T3RNA聚合酶中孵育(例如37'C30分鐘)來(lái)進(jìn)行。如果期望制備包含RNA的標(biāo)記多核苷酸，則可以省略未標(biāo)記的UTP并將標(biāo)記的UTP包括在反應(yīng)混合物中。標(biāo)記可包括例如熒光標(biāo)記或放射性標(biāo)記。然后用DNasel孵育從而除去DNA模板。可以使用苯酚抽提除去DNA酶和聚合酶，然后沉淀并定量RNA,例如通過(guò)UV吸收和/或通過(guò)電泳并相對(duì)于已知的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行目測(cè)。聚合gm式反應(yīng)PCR提供了用于快速擴(kuò)增特定DNA序列的成熟方法，其通過(guò)使用由熱穩(wěn)定的DNA依賴性DNA聚合酶所催化的多個(gè)DNA復(fù)制循環(huán)來(lái)擴(kuò)增目的靶標(biāo)序列。PCR需要存在待擴(kuò)增的靶標(biāo)核酸序列、待擴(kuò)增序列側(cè)翼的兩種單鏈寡核普酸引物、DNA聚合酶、脫氧核糖核普三磷酸、緩沖液和鹽。在Mullis和Faloona，1987,MethodsEnzymol"155:335(其通過(guò)參考并入本文中)中以及美國(guó)專利No.4,683,202、4,683,195和4，800，159(其全部也通過(guò)參考并入本文中)均描述了PCR。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員用最少的實(shí)驗(yàn)即可容易地選擇或確定用于特異性擴(kuò)增耙標(biāo)序列的反應(yīng)條件。本領(lǐng)域的技術(shù)人員還了解基本方案的多種變化。根據(jù)實(shí)際的嚴(yán)格度要求來(lái)調(diào)整PCR循環(huán)每個(gè)步驟(變性、引物退火和延伸)的長(zhǎng)度和溫度以及循環(huán)數(shù)。退火溫度和時(shí)間通過(guò)引物退火至模板的預(yù)期效率和能夠容忍的錯(cuò)配程度來(lái)確定。優(yōu)化引物退火條件的嚴(yán)格度的能力在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的能力之內(nèi)。最常使用的退火溫度為30'C~72°C。；^板分子的最初變性通常發(fā)生在92'C99'C,例如4分鐘，然后為10-40個(gè)由變性(94。C-99。C，15秒~1分鐘)、退火(如上所述確定的溫度；30秒~2分鐘)和延伸(72'C，30秒~1分鐘；這對(duì)于Taq聚合酶是最佳的--本領(lǐng)域技術(shù)人員了解或者可以容易地確定針對(duì)不同熱穩(wěn)定聚合酶的適當(dāng)延伸條件)組成的循環(huán)。取決于產(chǎn)物的預(yù)期用途，最終的延伸步驟常進(jìn)行較長(zhǎng)的時(shí)間，例如在72。C進(jìn)行4分鐘，并且之后可以在4。C進(jìn)行無(wú)限期儲(chǔ)存(0-24小時(shí))。聚合酶本文所述的方法可使用多種DNA聚合酶。用于所述方法中的合適DNA聚合酶可以是或不是熱穩(wěn)定，盡管熱穩(wěn)定的聚合酶對(duì)于使用熱循環(huán)進(jìn)行擴(kuò)增的實(shí)施方案顯然是優(yōu)選的。已知的常規(guī)DNA聚合酶包括例如激烈火球菌()(Pfu)DNA聚合酶(Lundberg等，1991，Gene，108:1,由Stratagene提供)、沃氏火球菌(i^fwoccwsnwse/)(Pwo)DNA聚合酶(Hinnisdaels等，1996，Biotechniques，20:186-8,由BoehringerMannheim提供)、嗜熱棲熱菌(T7^簡(jiǎn)ms幼￡1*腳/^//"5)(Tth)DNA聚合酶(Myers和Gelfand1991,Biochemistry30:7661)、嗜熱脂肪芽^&^f菌(丑"c,7/ms對(duì)e"n^/^r挑o(/^i7MS)DNA聚合酶(Stenesh和McGowan，1977,BiochimBiophysActa475:32)、77^f腳coccws(Tli)DNA聚合酶(也叫作VentDNA聚合酶，Cariello等,1991，PolynucleotidesRes,19:4193，由NewEnglandBiolabs提供)、Ventexo(NewEnglandBiolabs)、9。NmDNA聚合酶(NewEnglandBiolabs的停產(chǎn)產(chǎn)品)、海棲熱袍菌(T7^/7ii0to^1附wrf附fl)(Tma)DNA聚合酶(Diaz和Sabino，1998,BrazJ.Med.Res,311239)、水生棲熱菌(T7ie簡(jiǎn)ms罕flri譜)(Taq)DNA聚合酶(Chien等，1976,J.Bacteoriol,127:1550)、i^vcoccwsAw/由r固wsKODDNA聚合酶(Takagi等,1997,Appl.Environ.Microbiol.63:4504)、JDF-3DNA聚合酶(來(lái)自熱球菌屬物種JDF-3，專利申請(qǐng)WO0132887)、火球菌屬GB-D(PGB-D)DNA聚合酶(也叫作Deep-VentDNA聚合酶，Juncosa-Ginesta等，1994，Biotechniques,16:820，providedbyNewEnglandBiolabs)、UlTmaDNA聚合酶(未自嗜熱菌海棲熱袍菌；Diaz和Sabino,1998,BrazJ.Med.Res.31:1239;由PEAppliedBiosystems提供)、TgoDNA聚合酶(來(lái)自gcgoiifln'附，由RocheMolecularBiochemicals提供)、^L^軒菌DNA聚合41(Lecomte和Doubleday，1983，PolynucleotidesRes.11:7505)、T7DNA聚合酶(Nordstrom等，1981,J.Biol.Chem.256:3112)以及古細(xì)菌的DP1/DP2DNA聚合酶II(Cam等,1998，Proc.Natl.Acad.Sci.USA95:14250-5)。對(duì)于熱循環(huán)反應(yīng)，所述聚合酶優(yōu)選熱穩(wěn)定的聚合酶如Taq、DeepVent、Tth、Pfu、Vent和UlTma,均易于從商業(yè)來(lái)源獲得。類似地，使用每一種這些酶的指導(dǎo)可以在指南、產(chǎn)品資料、互聯(lián)網(wǎng)(參見(jiàn)例如www.alkami.com)及其它來(lái)源的許多方案中容易找到。對(duì)于非熱循環(huán)反應(yīng)以及在某些熱循環(huán)反應(yīng)中，所述聚合酶常為本領(lǐng)域普遍使用和市售的多種聚合酶中的一種，如DNApolI、Klenow片段、T7DNA聚合酶和T4DNA聚合酶。在涉及轉(zhuǎn)錄的應(yīng)用中，多種RNA聚合酶也是市售的，如T7RNA聚合酶和SP6RNA聚合酶?？梢栽诋a(chǎn)品資料和一般的分子生物學(xué)指南(如Sambrook或Ausubel，二者均在前引用)容易地找到使用這些聚合酶的指導(dǎo)。聚合酶可在合成多核普酸期間摻入標(biāo)記的(例如熒光的)核苷酸或其類似物。參見(jiàn)，例如Hawkins等，U.S.專利號(hào)5，525，711，其中描述了通過(guò)Taq摻入的核普酸類似物的用途。如上所述，除另有說(shuō)明，本文所述方法所需的擴(kuò)增反應(yīng)通?？蒦^用標(biāo)準(zhǔn)>^應(yīng)*和試劑來(lái)進(jìn)行。這些試劑和4Hf是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，并且描述在許多參考文獻(xiàn)和實(shí)驗(yàn)方案中。參見(jiàn)，例如Innis(如上引用)；Sambrook(如上引用)；Ausubel，等編輯(1996)CurrentProtocolsinMolecularBiology,CurrentProtocols,由GreenePublishingAssociates,Inc.和JohnWiley&Sons,Inc.合資。還可參見(jiàn)Mullis等，(1987)美國(guó)專利號(hào)4,683,202和Arnheim&Levinson(19卯)C&EN6-47，TheJournalOfNIEResearch(1991)3:81-94;Kwoh等(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:1173;Guatdli等(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:1874;Lomell等(1989)J.Clin.Chem35:1826;Landegren等，(1988)Science241:1077-1080;VanBrunt(1990)Biotechnology8:291-294;Wu和Wallace,(1989)Gene4:560;Barringer等(1990)Gene89:117以及Sooknanan和Malek(1995)Biotechnology13:563-564。擴(kuò)增效率如上所述，在使用時(shí)，竟?fàn)巹┖怂岬臄U(kuò)增效率應(yīng)該類似于病原體特異性靶標(biāo)核酸的擴(kuò)增效率。在一個(gè)方面中，擴(kuò)增效率表達(dá)為每個(gè)PCR循環(huán)的擴(kuò)增倍數(shù)，表示為相對(duì)于理想倍增的分?jǐn)?shù)或百分比。100%或1.0的擴(kuò)監(jiān)測(cè)擴(kuò)增效率的一種方式是測(cè)量當(dāng)PCR產(chǎn)物的信號(hào)強(qiáng)度達(dá)到擴(kuò)增樣品的預(yù)定閾值(例如信號(hào)強(qiáng)度背景值的10倍標(biāo)準(zhǔn)差)時(shí)的閾值循環(huán)數(shù)(Ct)。例如，在擴(kuò)增方案的每個(gè)循環(huán)時(shí)取出樣品并分析靶標(biāo)擴(kuò)增子的量。比較初始量相等的兩種不同擴(kuò)增模板(例如靶標(biāo)RNA和竟?fàn)巹㏑NA)的Ct將確定擴(kuò)增效率是否相似。為了增加準(zhǔn)確度，該測(cè)定可以在靶標(biāo)和竟?fàn)巹㏑NA的幾種不同的相等初始濃度下進(jìn)行。如^t目等初始量的每種竟?fàn)巹?靶標(biāo)組的閾值循環(huán)(Ct)是相同的，則認(rèn)為擴(kuò)增效率是"相似的"。Ct與初始DNA的原始拷貝數(shù)或濃度的關(guān)系通過(guò)以下簡(jiǎn)單的數(shù)學(xué)等式來(lái)表示Log(拷貝數(shù))=aCt+b,其中a和b是常量。因此，通過(guò)測(cè)量來(lái)自兩種不同樣品的相同基因片段的ct，可容易地估計(jì)這些樣品中該基因的原始濃度?；蛘撸ㄟ^(guò)測(cè)量連續(xù)的循環(huán)中擴(kuò)增產(chǎn)物的量(例如，通過(guò)熒光強(qiáng)度或標(biāo)記摻入)來(lái)監(jiān)測(cè)擴(kuò)增效率，使用公式EKPn+廣Pn)/(Pn-P^)計(jì)算效率，其中P是在第H個(gè)循環(huán)中擴(kuò)增產(chǎn)物的量。盡管擴(kuò)增效率的相似性最終將經(jīng)驗(yàn)性確定，但維持竟?fàn)巹┲邪倚蛄械囊恢滦?除了為產(chǎn)生相對(duì)于靶標(biāo)可檢測(cè)的長(zhǎng)度差異而必需的插入或缺失以外)將有助于實(shí)現(xiàn)相似的效率。已知在核酸樣品制備物中存在的多種污染物可影響擴(kuò)增效率。本文所述方法的優(yōu)勢(shì)在于對(duì)于任意給定的病原體特異性靶標(biāo)，任何這樣的污染物很可能以相似的程度影響竟?fàn)巹┖颓瑯?biāo)擴(kuò)增子的擴(kuò)增效率，因?yàn)槊恳环N所述擴(kuò)增子在同一反應(yīng)中產(chǎn)生。這通常會(huì)降低任何這種對(duì)有效擴(kuò)增的抑制所帶來(lái)的影響。制備樣品本發(fā)明的病原體特異性靶標(biāo)多核苷酸可以是單鏈或雙鏈的，并且可以是DNA(例如gDNA或cDNA)、RNA、同時(shí)包含DNA和RNA的多核苷酸或者包含DNA、RNA和/或其類似物和衍生物的多核苷酸。如果希望測(cè)定病毒基因的表達(dá)水平，則靶標(biāo)多核苷^ARNA分子(例如mRNA分子)。在擴(kuò)增反應(yīng)前，可以獲得對(duì)于待使用的擴(kuò)增方法來(lái)說(shuō)為合適的量和性質(zhì)的病原體特異性靶標(biāo)多核苷酸。例如，在某些情形中，樣品包含低水平的靶標(biāo)多核苷酸，以至于進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)以增加靶標(biāo)多核苷酸的濃度是有用的。如果要擴(kuò)增樣品，通常根據(jù)已知的操作使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)進(jìn)行擴(kuò)增。在某些實(shí)施方案中，可能優(yōu)選將已知量的竟?fàn)巹┖怂崽砑又辽飿悠分?，然后共分離樣品中的竟?fàn)巹┖蜏y(cè)試核酸。可以從大量的來(lái)源找到制備包含乾標(biāo)多核苷酸的樣品的指導(dǎo)，包括PCRProtocols,AGuidetoMethodsandApplications(Innis等,如上引用；Sambrook等，如上引用；Ausubel等，如上引用)。本文所述的方法中可使用任何所述方法。通常，這些方法包括細(xì)胞裂解，然后通過(guò)如酚/氯仿抽提、電泳和/或?qū)游龅姆椒兓嗪似账?。這些方法常包括以下步驟沉淀多核苷酸(例如用乙醇)并重懸在用于加入PCR或類似反應(yīng)物的適當(dāng)緩沖液中。在某些實(shí)施方案中，來(lái)源于一種或多種樣品的兩種或更多的病原體特異性靶標(biāo)多核普酸在一個(gè)jl應(yīng)中進(jìn)行分析。在這些實(shí)施方案中，可以由單個(gè)樣品或單個(gè)個(gè)體擴(kuò)增多種病原體特異性耙標(biāo)多核苷酸，從而可以評(píng)估來(lái)自一個(gè)個(gè)體的樣品中可能存在的多種病原體，例如用于在免疫抑制個(gè)體中同時(shí)篩選多種病原體。使用本文所述的方法可以容易地完成上述任何應(yīng)用。反應(yīng)混合物可包含一種病原體特異性靶標(biāo)多核苷酸，或者它可包含兩種或更多種病原體特異性靶標(biāo)多核苷酸、多達(dá)例如15或16種病原體特異性粑標(biāo)多核普酸。因此，本方法允許同時(shí)分析單一樣品中的兩種或更多種多核苷酸，即多元分沖斤。一旦獲得初始的細(xì)胞、組織、器官或其它樣品，可通過(guò)本領(lǐng)域爿^的方法從它們制^^核酸(包括RNA和/或DNA)。來(lái)自免疫受損個(gè)體(例如維持免疫抑制治療的移植或移植物受者)的樣品通常是血液或血清樣品。^Muk液樣品中分離核酸的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的?？梢愿鶕?jù)以下方法從例如組織中純化RNA。取出目的組織后，切下《2g的組織塊并速凍在液氮中，以防止RNA降解。在加入適當(dāng)體積的胍溶液(例如每2g組織加入20ml胍溶液)后，用兩次或三次的10秒沖擊在組織研磨器中研磨組織樣品。為了制備組織胍溶液(1L),將5卯.8g異硫氰酸胍溶于約400ml的經(jīng)DEPC處理的H20中。加入25ml的2MTris-HCl，pH7.5(終濃度為0.05M)和20mlNa2EDTA(終濃度為0.01M)，將溶液過(guò)成攪拌，體積調(diào)節(jié)至950ml，并加入50ml的2-ME。勻漿的組織樣品在120C以12,000xg離心10分鐘。所得上清液在0.1倍體積的20。/。M^酖存在下在65°C孵育2分鐘，在9ml的5.7MCsCl溶液(0.1gCsCl/ml)中分層，并通過(guò)在22。C以H3，000xg過(guò)夜離心進(jìn)行分離。小心地除去上清液后，將管倒置并干燥。將管的底部(含有RNA沉淀)置于50ml塑料管中并在4°C在3ml組織重懸緩沖液(5mMEDTA，0.5%(體積/體積)肌氨酰，5%(體積/體積)2-ME)中孵育過(guò)夜(或更久)，從而使所述RNA沉淀完全重懸。所得的RNA溶液依次用25:24:1酚/氯仿/異戊醇、24:l氯仿/異戊醇進(jìn)行萃取，通過(guò)加入3M乙酸鈉(pH5.2)和2.5體積的100%乙醇進(jìn)行沉淀，并重懸在DEPC水中(Chirgwin等，1979,Biochemistry,18:5294)?；蛘?，可根據(jù)以下的一步方案從組織中分離RNA。在玻璃特富龍勻漿器中，每100mg組織在lml變性液(4M硫代硫酸胍、25mM檸檬酸鈉,pH7.0、0.1M2-ME，0.5%(重量/體積)N-十二烷基J3/L^酸)中通過(guò)勻漿來(lái)制備目的組織。將勻漿轉(zhuǎn)移至5ml聚丙烯管，依次加入0.1ml的2M乙酸鈉(pH4)、1ml用7jC飽和的苯酚和0.2亳升49:1氯仿/異戊醇。在加入每種組分后混合樣品，并在所有組分加入后于0-4'C孵育15分鐘。通過(guò)在4。C以lO，OOOxg離心20分鐘來(lái)分離樣品，通it^a入1ml的100%異丙醇進(jìn)行沉淀，在-20。C孵育30分鐘并通過(guò)4。C以10，000xg離心10分鐘進(jìn)行沉淀。所得的RNA沉淀溶于0.3ml變性液中，轉(zhuǎn)移至微量離心管，通過(guò)在-20。C加入0.3ml的100%異丙醇30分鐘進(jìn)行沉淀，并在4。C以10，000xg離心10分鐘。在70%乙醇中洗滌RNA沉淀，干燥并重懸在100-200ji1經(jīng)DEPC處理的水或經(jīng)DEPC處理的0.5%SDS中(Chomczynski和Sacchi,1987,Anal.Biochem.，162:156)。分離總RNA的試劑盒和試劑可從多個(gè)公司獲得，例如，RNA分離試劑盒(Stratagene,LaLola,CA，目錄號(hào)200345);PicoPureRNA分離試劑盒(Arcturus，MountainView,CA,目錄號(hào)KIT0202);RNeasyProtect小量、中量和大量試劑盒(Qiagen，目錄號(hào)74124)。在某些實(shí)施方案中，本方法使用的總RNA用于隨后的分析，例如用于逆轉(zhuǎn)錄。在另一些實(shí)施方案中，mRNA可以從總RNA或直接從樣品分離用于逆轉(zhuǎn)錄。分離mRNA的試劑盒和試劑從例如OligotexmRNA試劑盒(Qiagen,目錄號(hào)70022)獲得。標(biāo)記的核普酸本文所述的方法可受益于^^吏用標(biāo)記，包括例如熒光標(biāo)記。在一個(gè)方面中，熒光標(biāo)記可以是嵌入或結(jié)合擴(kuò)增的(通常是雙鏈的)核酸分子從而發(fā)出信號(hào)的標(biāo)記或染料?？捎糜谠搶?shí)施方案的一種染料是SYBR綠(SYBRGreen)(例如，SYBR綠I或II，從MolecularProbesInc.,Eugene,OR獲得)。本領(lǐng)域已知的其它染料也可使用在本文所述的方法中。該方法的一個(gè)優(yōu)勢(shì)是相對(duì)于使用例如標(biāo)記核苷酸來(lái)說(shuō)降低了成本。盡管如此，也可優(yōu)選通過(guò)附著到標(biāo)記的核苷酸或核香酸類似物來(lái)?yè)饺霕?biāo)記，所述標(biāo)記的核苷酸或核苷酸類似是聚合酶的底物?；蛘撸瑯?biāo)記可附著于擴(kuò)增引物。如上文所教導(dǎo)地，標(biāo)記的核苷酸可以是與熒光染料連接的核苷酸，或者它可以是固有地發(fā)出熒光的核苷酸。在本文所述方法的一個(gè)實(shí)施方案中，使用了連有熒光染料的常規(guī)脫氧核苷酸。一些有用的標(biāo)記核苷酸的非限制性實(shí)例列于表l中。表l.標(biāo)記核苷酸的實(shí)例<table>tableseeoriginaldocumentpage90</column></row><table>熒光染料標(biāo)記的核苷酸可從商業(yè)來(lái)源購(gòu)買(mǎi)。標(biāo)記的多核苷酸核苷酸還可通過(guò)任何本領(lǐng)域已知的多種方法進(jìn)行制備。可用作可檢測(cè)的標(biāo)記熒光染料是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，并且許多實(shí)例可以在HandbookofFluoresdentProbesandResearchChemicals第六版,RichardHaugland，MolecularProbes,Inc.,1996(ISBN0-9652240-0-7)中找到。優(yōu)選地，熒光染料可基于與自動(dòng)化毛細(xì)管電泳設(shè)備上檢測(cè)的相容性進(jìn)行選擇，因此應(yīng)該可通過(guò)光鐠進(jìn)行分辨并且不顯著干擾電泳分析。用作可檢測(cè)標(biāo)記的適當(dāng)熒光染料的實(shí)例可見(jiàn)于美國(guó)專利號(hào)5,750,409;5,366,860;5,231,191;5,840,999;5,847,162;4,439,356;4,481,136;5,188,934;5,654,442;5,840,999;5,750,409;5,066,580;5,750,409;5,366,860;5,231,191;5,840,999;5,847,162;5,486,(516;5,569，S87;5,569,766;5,627;027;5,321,130;5,410,030;S,436'134;5，5H416;5,582,977;5,658,751;5,656,449;5,863,753;pCT公開(kāi)WO99/27020;99/16832;歐洲專矛JEP0050684;Sauer等，1995，J.Fluorescence5:247-261;Lee等，1992，Nucl.AcidsRes.20:2471-2483;和Tu等，1998,Nucl.AcidsRes.26:2797-2802等文獻(xiàn)，以上所有均4^P并入本文中?？尚揎椇塑账嵋允蛊浒ㄓ糜谶B接熒光染料的官能團(tuán)，如伯胺和仲胺、羥基、硝基和羰基(參見(jiàn)表2)。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage91</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage92</column></row><table>有用的熒光團(tuán)包括但不限于德克薩斯紅TM(TR)、LissamineTM羅丹明B、Oregon綠TM488(2，,7，-二氟熒光素)、羧基rhodol和羧基羅丹明、Oregon綠TM500、6-JOE(6-絲-4，，5,誦二氯國(guó)2，，7,-二曱猛熒光素、伊紅F3S(6-絲甲石錄-2，，4，，5，，7，-四溴-三氟熒光素)、Cascade藍(lán)TM(CB)、氨甲基香豆素(AMC)、芘、丹磺酰氯(5-二曱基M參l-磺酰氯)和其它萘、PyMPO、ITC(l-(3-異硫氰酸苯)-4-(5-(4-甲氧苯基)-噁哇-2-基)溴化吡啶)、香豆素、熒光素、四氯熒光素、六氯熒光素、螢光黃、羅丹明、BODIPY、四曱基羅丹明、Cy3、Cy5、Cy7、伊紅和ROX。熒光團(tuán)組合如熒光素畫(huà)羅丹明二聚體(如Lee等(1997)，PolynucleotidesResearch25:2816所述)同樣適用。合適的熒光團(tuán)包括在可見(jiàn)光鐠或可見(jiàn)光鐠外吸收和發(fā)射(如在紫外或紅外范圍內(nèi))的熒光團(tuán)。合適的熒光染料標(biāo)記可以從MolecularProbes,Lie,Eugene,OR,US和ResearchOrganics，Inc.,Cleveland,OH，US等處獲得，并可以在HandbookofFluorescentProbesandResearchChemicals第六版,RichardHaugland,MolecularProbes,Inc"1996(ISBN0-9652240國(guó)0誦7)中找到。可用于本文所述方法的標(biāo)記核普酸包括本領(lǐng)域已知的固有發(fā)出熒光的核苷酸，例如美國(guó)專利號(hào)6,268,132(其全部通過(guò)參考并入本文中)所述的新型熒光核苷類似物。美國(guó)專利號(hào)6，268，132的熒光類似物具有3種通用的類型(A)C-核苷類似物；(B)N-核苷類似物；和(C)N-氮雜核苷酸和N-脫氮雜核苷酸類似物。所有這些化合物具有3個(gè)共同特征l)它們是普通核苷的結(jié)構(gòu)類似物，能夠在寡核苷酸的#成或化學(xué)合成中替換天然存在的核苷；2)當(dāng)用適當(dāng)波長(zhǎng)的光^L時(shí)，它們天然發(fā)出熒光，并且其檢測(cè)不需要另外的化學(xué)或酶方法；以及3)它們與一般天然存在的DNA在光鐠上顯著不同。在美國(guó)專利號(hào)6,268,132中已鑒定至少125種特定的化合物。這些化合物已根據(jù)其分類、結(jié)構(gòu)、化學(xué)名稱、吸收光鐠、發(fā)射光譜和合成方法進(jìn)行表征，顯示于美國(guó)專利號(hào)6，268，132的圖21A-21F-1中。本文所述的標(biāo)記核香酸還包括但不限于熒光N-核普和熒光結(jié)構(gòu)類似物。間型霉素A(通常稱為間型霉素)是熒光核苷類似物的原型，其最初作為抗腫瘤抗生素從中間型諾卡氏菌(Nocardiainterforma)的培養(yǎng)濾出液中分離(Hori等[1966J.Antibiotics,Ser.A17:96-99)，其結(jié)構(gòu)鑒定為7-^J^-3-b-D-呋喃核苷(ribafuranosyl)(1H-他喳(pyrazolo)-[4，3d嘧吱))。該抗生素還分離自淡紫灰鏈i菌(Streptomyceslavendulae)(Aizawa等[1965Agr.Biol.Cheni.29:375-376)和關(guān)島鏈霉菌(Streptomycesgummaensis)(日本專利號(hào)10,928，于1967年授權(quán)給NipponKayakuCo.,Ltd.)的培養(yǎng)液中，它是所有來(lái)源的RNA中普遍可見(jiàn)的N-核普的多種微生物C-核糖核普類似物之一。另一些分離自微生物的天然存在C-核糖核苷包括間型霉素B(Koyama等[1966TetrahedronLett.597-602;Aizawa等，如上引用；Umezawa等[1965AntibioticsSer.A18:178-181)、氧間型霉素B(Ishizuka等[1968J.Antibiotics21:1-4;Sawa等[1968Antibiotics21:334-339)、^>苷(Uematsu和Suahdolnik[1972Biochemistry11:4669-4674)、焦土霉素(Darnall等[1967]PNAS57:548-553)、吡唑霉素(Sweeny等[1973CancerRes.33:2619-2623)和最小霉素(Kusakabe等[1972J.Antibiotics25:44-47)。間型霉素、間型霉素B和氧間型霉素B是吡哇嘧咬核普(pyrazolopyrimidinenucleoside),分別是腺苷、肌苷和次黃嘌呤的結(jié)構(gòu)類似物；文獻(xiàn)中尚未才艮il^天然來(lái)源獲得的鳥(niǎo)苷的吡唑嘧啶結(jié)構(gòu)類似物。生物合成這些化合物的綜述參見(jiàn)Ochi等(1974)J.Antibioticsxxiv:909-916。每篇參考文獻(xiàn)的全部通過(guò)參考并入本文中。分離和檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)多核苷酸存在或量的方法是本領(lǐng)域公知的，并且任何這些所述方法可用于本文所述的方法，只要它們至少通過(guò)竟?fàn)巹┖桶袠?biāo)擴(kuò)增子之間的長(zhǎng)度差異能夠分離各個(gè)多核苷酸即可。所用的分離技術(shù)應(yīng)允許分辨長(zhǎng)度為25~1000個(gè)核普酸或44iJ^，并且分辨率為10個(gè)核苷酸或>5^對(duì)或更高。所述分離可在變性或非變性或天然條件下進(jìn)行，即分離可針對(duì)單鏈或雙鏈核酸來(lái)進(jìn)行。優(yōu)選分離和檢測(cè)所允許檢測(cè)的長(zhǎng)度差異小至1個(gè)核苷酸。更優(yōu)選分離和檢測(cè)可以高通量形式進(jìn)行，其允許實(shí)時(shí)或同時(shí)測(cè)定在循環(huán)反應(yīng)期間取出的多個(gè)反應(yīng)物等分試樣中的擴(kuò)增子豐度。可用于分離和分析擴(kuò)增產(chǎn)物的方法包括但不限于電泳(例如，毛細(xì)管電泳(CE)、層析(dHPLC)和質(zhì)譜)。在一個(gè)實(shí)施方案中，CE是優(yōu)選的分離手段，因?yàn)樗峁┝酥辽?0-1,000個(gè)>8*^的多核苷酸的良好分離，其分辨率為單個(gè)核苷酸或4對(duì)。可通過(guò)本領(lǐng)域公知的方法進(jìn)行CE，例如公開(kāi)于美國(guó)專利號(hào)6,217,731;6,001,230和5，963，456中，其通過(guò)參考并入本文中。高通量的CE儀器市面有售，例如來(lái)自SpectrumedixCorporation(StateCollege,PA)的HTS9610高通量分析系統(tǒng)和SCE9610全自動(dòng)96-毛細(xì)管電泳遺傳分析系統(tǒng)；來(lái)自BeckmanInstrumentsInc(Fullerton，CA)的P/ACE5000系列和CEQ系列；以及ABIPRISM3100遺傳分沖斤儀(AppliedBiosystems，F(xiàn)osterCity,CA)。在這些儀器接近CE柱末端的位置，擴(kuò)增的DNA片段經(jīng)過(guò)測(cè)量熒光標(biāo)記信號(hào)的熒光檢測(cè)器。這些儀器提供為熒光標(biāo)記PCR產(chǎn)物的檢測(cè)提供了自動(dòng)化的高通量。與常規(guī)的平板凝膠電泳相比，在本文所述方法中使用CE可得到更高的生產(chǎn)力。平板^電泳中的分離速;^1有限的，因?yàn)楫?dāng)高電場(chǎng)應(yīng)用于^時(shí)產(chǎn)生熱。因?yàn)槊?xì)管大表面積的散熱非常^il，所以毛細(xì)管電泳中可施加較高的電場(chǎng)，從而加快了分離過(guò)程。通過(guò)使用毛細(xì)管凝膠，分離速度比常規(guī)的平板^系統(tǒng)提高約10倍。使用CE還可以同時(shí)分析多種樣品，這對(duì)于高通量是必需的。例如，這通過(guò)4吏用多重毛細(xì)管系統(tǒng)來(lái)實(shí)現(xiàn)。在某些情形中，多孔1^質(zhì)和毛細(xì)管壁的光散射使得檢測(cè)DNA堿基的熒光變得復(fù)雜。然而，可使用共聚焦熒光掃描儀iM^免由于光散射造成的問(wèn)題(Quesada等，1991,Biotechniques10:616-25)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本文所述的方法測(cè)量樣品中包含的用作擴(kuò)增模板的特定病原體特異性靶標(biāo)多核苷酸(例如，DNA或RNA)的量(即拷貝數(shù))。在另一實(shí)施方案中，可以在免疫治療過(guò)程中或免疫抑制過(guò)程中監(jiān)測(cè)病原體水平的差異，而不是測(cè)量樣品中所包含的病原體特異性乾標(biāo)多核苷酸的絕對(duì)拷貝數(shù)。例如，可以對(duì)兩個(gè)獨(dú)立樣品中至少兩種竟?fàn)巹┖筒≡w特異性耙標(biāo)核酸中的每一種記錄尺寸分離后所檢測(cè)的信號(hào)強(qiáng)度，并用于確定兩種樣品中靶標(biāo)多核苷酸的相對(duì)比值。閾值循環(huán)數(shù)(Ct)計(jì)算為擴(kuò)增產(chǎn)物的PCR產(chǎn)物的信號(hào)強(qiáng)度達(dá)到一組閾值(例如信號(hào)強(qiáng)度背景值的10倍標(biāo)準(zhǔn)差)時(shí)的循環(huán)數(shù)。特定靶標(biāo)的運(yùn)算差異性表達(dá)測(cè)定為在值大于1個(gè)循環(huán)的兩個(gè)(或更多)樣品中該把標(biāo)的閾值循環(huán)數(shù)(Ct)的差異。除了在這樣的實(shí)施方案中通過(guò)參照來(lái)自至少兩種竟?fàn)巹┖怂岬男盘?hào)來(lái)實(shí)現(xiàn)定量以外，拷貝數(shù)以及通過(guò)該乾標(biāo)在兩種或更多種樣品中拷貝數(shù)的比值來(lái)測(cè)量表達(dá)差異。作為PCR或其它擴(kuò)增反應(yīng)的產(chǎn)物的核酸片段可使用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法分離(例如根據(jù)大小)和檢測(cè)，包括但不限于:^電泳(如瓊脂糖剿歐電泳、聚丙烯酰胺:^J歐電泳和毛細(xì)管:^電泳)、層析(如高效液相層析(HPLC)和氣相層析(GC))、光鐠法(如質(zhì)譜法(MS)和GC-MS)、紅外光鐠法和UV光鐠測(cè)定法)、分光光度法(如熒光分光光度法)、大氣壓化學(xué)電離質(zhì)謙法(atmosphericpressurechemicalionizationmassspectroscopy)、^t、定電勢(shì)電5充領(lǐng)'J定'法(potentiostaticamperometry)、免疫測(cè)定(如ELISA)、電化學(xué)檢測(cè)和解鏈曲線分析。已使用多種質(zhì)譜分析技術(shù)分析不同大小的DNA(Nelson等，"VolatilizationofHighMolecularWeightDNAbyPulsedLaserAblationofFrozenAqueousSolutions,Science,246，1585-87(1989);Huth國(guó)Fehre等,RapidCommunicationsinMassSpectrometry,6，209-13(1992);K.Tang等，RapidCommunicationsinMassSpectrometry,8，727-730(1994);Williams等,，，Time畫(huà)ofFlightMassSpectrometryofNucleicAcidsbyLaserAblationandIonizationfromaFrozenAqueousMatrix,"RapidCommunicationsinMassSpectrometry,4,348-351(1990))。近年來(lái)，用于質(zhì)鐠分析的電離技術(shù)(稱為基質(zhì)輔助激光解吸電離(MALDI))的開(kāi)發(fā)已在飛行時(shí)間質(zhì)鐠的用途及其性能的改進(jìn)中產(chǎn)生了廣泛的關(guān)注。MALDI對(duì)于電離大分子(例如肽和蛋白質(zhì)、碳水化合物、糖脂、糖蛋白和寡核苷酸(DNA))以及其他多聚體尤其有效，(MALDI-TOFanalysis:Ross，HighlevelmultiplexgenotypingbyMALDI-TOFmassspectrometry,NatureBiotechnology16(1998),1347-1351)。因此，質(zhì)i普法可用于檢測(cè)和/或定量本文所述方法的擴(kuò)增核酸產(chǎn)物以及任何病原體特異性標(biāo)志物或宿主基因產(chǎn)物，所述產(chǎn)物和標(biāo)志物為核酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)或其它多聚體。宿主應(yīng)答寄生生物感染引發(fā)宿主針對(duì)病原體的應(yīng)答。在宿主應(yīng)答中活化基因的產(chǎn)物可作為病原體感染的標(biāo)志物用于本文所述的方法中。或者，宿主基因可用作多元測(cè)定中的參考對(duì)照。在每種情形中，都可以與給定的生物樣品中病原體特異性序列或其它標(biāo)志物的鑒定和/或定量同時(shí)檢測(cè)和/或定量宿主基因的產(chǎn)物(轉(zhuǎn)錄物或多肽)。在一個(gè)方面中，所述產(chǎn)物由早期宿主應(yīng)^^基因編碼。宿主應(yīng)答基因產(chǎn)物的實(shí)例包括但不限于細(xì)胞因子、趨化因子、配體及其它可改變、增加或增強(qiáng)宿主對(duì)病原體的應(yīng)答的分子。取決于免疫抑制的類型和過(guò)程，這些宿主應(yīng)答基因中的一些在免疫抑制患者中可能不以與正常患者中相同的程度表達(dá)。然而，優(yōu)選地所述宿主應(yīng)^^基因與目的病原體特異性標(biāo)志物共表達(dá)，這使得可以同時(shí)檢測(cè)二者。針對(duì)一種或多種病原體的宿主應(yīng)答通常引發(fā)炎性應(yīng)答，其包括活化可在核酸和/或蛋白質(zhì)水平檢測(cè)到的因子級(jí)聯(lián)。通常，病原體逃避或破壞宿主的初級(jí)屏障如上皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞，導(dǎo)致組織損傷。所述組織損傷導(dǎo)致促炎^"質(zhì)(pro-inflammatorymediator,包括血漿蛋白酶系統(tǒng))、月旨質(zhì)介質(zhì)以及促炎肽和細(xì)胞因子的產(chǎn)生。血漿蛋白酶包括補(bǔ)體途徑中、激肽級(jí)聯(lián)中以及涉及內(nèi)穩(wěn)態(tài)的酶。炎癥的脂質(zhì)介質(zhì)包括前列腺素、白三烯和血小板活化因子。促炎肽包括組胺和血清素、神經(jīng)肽，急性期血漿蛋白包括c-反應(yīng)性蛋白、血清淀粉狀蛋白A和纖維蛋白原。促炎細(xì)胞因子包括但不限于TNFa、IL-1-P和IL-6。其它的炎癥介質(zhì)包括但不限于瘦素和脂質(zhì)運(yùn)載蛋白。本文所述方法還包括監(jiān)測(cè)由于感染一種或多種目的病原體而在免疫受損患者或者具有發(fā)生由所述一種或多種目的病原體導(dǎo)致的傳染病風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體中感染性疾病的發(fā)生情況，其中所述目的病原體選自病毒、細(xì)菌或原生動(dòng)物及其任意組合，其包括a)從患者或個(gè)體獲得的生物樣品，b)檢測(cè)和定量測(cè)定指示所述一種或多種目的病原體的一種或多種病原體特異性標(biāo)志物，其中所述病原體特異性標(biāo)志物可包括來(lái)源于所述樣品中所述一種或多種病原體的核酸、蛋白質(zhì)、多糖和/或脂質(zhì)或其任意組合，以及c)計(jì)算樣品中一種或多種所述目的病原體的量，其中所述量表示為每單位體積和/或重量所述樣品中的微生物拷貝數(shù)。在上述在生物樣品中檢測(cè)病原體的方法中，免疫受損患者可以并且很可能沒(méi)有感染性疾病的癥狀。測(cè)試樣品中一種或多種目的病原體的計(jì)算量允許評(píng)估發(fā)生由感染該一種或多種病原體所導(dǎo)致疾病的可能性，并且可以是確定向所測(cè)試免疫受損患者施用何種(如果有的話)預(yù)防性治療的一個(gè)因素，或者可以是確定免疫抑制治療方案將作何變化(如果有的話)的一個(gè)因素。所述免疫受損患者可以是移植或移植物受者，并且可以正在接受免疫抑制治療。在上述在生物樣品中檢測(cè)病原體的方法中，所述一種或多種目的病原體在多元測(cè)定中進(jìn)行評(píng)估，并可以在對(duì)單個(gè)患者樣品進(jìn)行的一系列病原體特異性測(cè)試中進(jìn)行評(píng)估。在一個(gè)方面中，所述患者樣品可選自血液、唾液和尿液。每種病原體特異性標(biāo)記的量可4吏用特異性針對(duì)每種所述病原體的抗體來(lái)測(cè)量，并可定期進(jìn)行以監(jiān)測(cè)感染性疾病的出現(xiàn)或iL艮。所述監(jiān)測(cè)可以例如一月一次或者更頻繁。實(shí)施例實(shí)施例1.設(shè)計(jì)和合成寡核苷酸使用PrimerSelect軟件(DNASTARInc，Madison，WI)基于以下標(biāo)準(zhǔn)來(lái)選擇引物19-24個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度；解鏈溫度(Tm)54.5-58.2'C;引物穩(wěn)定性為-45.9至-39.9kcal/mol;7個(gè)核香酸的獨(dú)特引物3'序列；避免自身引物和形成長(zhǎng)于2個(gè)連續(xù)威基(忽略從3'端的開(kāi)始的8個(gè)雙鏈體威基)的引物配對(duì)；避免長(zhǎng)于2個(gè)堿基的內(nèi)部引物發(fā)夾；3'五聚體的穩(wěn)定性最低為-8.5kcal/mo1或更高。另外，對(duì)所選引物對(duì)評(píng)估不同對(duì)之間多元二聚體形成，以消除任何穩(wěn)定性小于-6.0kcal/mol的潛在二聚體。另夕卜，使用BLAST檢索程序針對(duì)非冗余DNA數(shù)據(jù)庫(kù)(GeneBank,NCBI)來(lái)篩選引物，從而消除任何與哺乳動(dòng)物多核苷酸具有顯著(多于總體14個(gè)連續(xù)核苷酸或從3'端開(kāi)始10個(gè)連續(xù)核苷酸)同源性的引物。實(shí)施例2.PCR擴(kuò)增和微生物的終點(diǎn)檢測(cè)。A.使用微生物特異性引物進(jìn)行微生物RNA的一步式RT-PCR檢測(cè)。將RNA模;^AJl應(yīng)混合物中，所述反應(yīng)混合物在總體積50或100nl中含有0.25pM的每種RT引物(可選的)、0.25pM的基因特異性PCR引物(微生物特異性引物對(duì)之一在5'端用FAM標(biāo)記)、改良的lxStratageneRT-PCR緩沖液(BrilliantSingleQRT-PCR試劑盒目錄號(hào)600532)、0.1%TritonXIOO、0.2mMdNTP、1.5mMMgCl2和1.25UStrataScriptRTase(Stratagene，LaJolla，CA)，并用礦物油覆蓋。在45。C進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄50分鐘，然后在94'C孵育2分鐘以失活RTase。然后，樣品使用94。C30秒、60'C30秒和72。C1分鐘的44個(gè)循環(huán)組成的方案進(jìn)行PCR擴(kuò)增。當(dāng)升至第一個(gè)72。C延伸時(shí)，加入1U熱穩(wěn)定DNA聚合酶(Ventexo(-)(NewEnglandBiolabs))。在44個(gè)循環(huán)后，將擴(kuò)增等分試樣(3-5pl)立即與甲酰胺混合以終止^^應(yīng)。如下所述，通過(guò)毛細(xì)管電泳分析樣品。為了確認(rèn)無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物的情況不是由于反應(yīng)組分失效所致，在RT-PCR前將10-1000拷貝/反應(yīng)的對(duì)照RNA模板和對(duì)照模板的一對(duì)引物(0.25nM)加至反應(yīng)混合物中。不存在微生物特異性擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，存在擴(kuò)增的對(duì)照模板被認(rèn)為是不存在特定微生物的指示。通過(guò)毛細(xì)管電泳分離樣品。將3nl樣品加入包含適當(dāng)?shù)臒晒鈽?biāo)記DNA大小標(biāo)準(zhǔn)品(BioVentures,Murfreesboro,TN)的7pl曱St^中。將樣品熱變性、渦旋并上樣到3100遺傳分析儀毛細(xì)管電泳設(shè)備(ABI，F(xiàn)osterCity，CA)上。以3kV注射樣品20秒，然后以15kV在POP4聚合物(ABI，F(xiàn)osterCity,CA)上進(jìn)行分離。通過(guò)所述設(shè)備4C供的GeneScanv3.7.1軟件分析數(shù)據(jù)的峰和相對(duì)面積。B.兩步式RT-PCR方案對(duì)于逆轉(zhuǎn)錄來(lái)說(shuō)，將RNA模板和RT特異性寡核苷酸引物加至10%甘油中，在70。C加熱10分鐘，然后置于水上2分鐘。加入緩沖液(終濃度50mMTris國(guó)HCl，pH8.3、75mMKC1、3mMMgCl2、0.01MDTT、0.8mMdNTP、0.2mg/mlBSA、20%海藻糖)、160U的SuperscriptIIRNAaseH陽(yáng)逆轉(zhuǎn)錄酶(SSRTII;Invitrogen，Carlsbad,CA)和32U的RNA酶抑制劑(Ambion,Austin,TX)使總體積為40nl。在45。C進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄20分鐘，然后在75。C進(jìn)行變性步猓。加入50USSRTII起始在48'C進(jìn)行30分鐘的第二輪逆轉(zhuǎn)錄。所述樣品在80'C進(jìn)行另一2分鐘的變性步驟，然后加入50USSRTII在52'C進(jìn)行另一輪30分鐘的逆轉(zhuǎn)錄。用0.04MNaOH(終濃度)對(duì)樣品進(jìn)行堿處理并在65。C孵育15分鐘，之后加入終濃度為0.07M的Tris,pH7.5，然后將該樣品在室溫孵育5分鐘。然后，按照廠家說(shuō)明書(shū)使用QIAquick凝膠提取試劑盒(Qiagen，cat.28704，Valencia,CA)回收樣品，只是^提取前向每個(gè)RT樣品加入360nlQG緩沖液來(lái)調(diào)整pH。以50^110mMTris,pH8.5洗脫樣品。第二#^的合成包括將第一條DNA鏈加入總體積為60^1的4mMTris畫(huà)HCl(pH7.5)、20mMMgCl2、50mMNaCl、0.2dNTP和1.6[iM的上游第二"引物。將不包含引物的混合物加熱至95'C，然后加入引物。在95。C將反應(yīng)物變性4分鐘，降至37。C并加入6,5USequenaseDNA聚合酶。然后，在37。C孵育反應(yīng)物0.5-1小時(shí)。如上所述使用Qiagen的QlAquick凝膠提取試劑盒(目錄號(hào)28704)再次純化樣品并進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)緩沖液由以下組成10mMKC1、10mM(NH4)2S04、20mMTris-HCl(pH8.8)、2mMMgSO4、0.1%TritonX-100、0.2mMdNTP、20%Q溶液(Stratagene,LaJolla，CA)、2%DMSO、2UVent或Vent誦exo(醒)DNA!^合酶(NewEnglandBiolabs,Beverly,Ma.)和10pM的適當(dāng)引物(其中一種用熒光探針標(biāo)記)。在95。C對(duì)沒(méi)有引物和酶的樣品變性1分鐘。然后，加入PCR引物，再繼續(xù)變性4分鐘。擴(kuò)增進(jìn)行95'C30秒，62'C30秒和72'C1分鐘的45個(gè)循環(huán)。當(dāng)升至第一個(gè)72。C延伸循環(huán)時(shí)加入Vent聚合酶。在擴(kuò)增44個(gè)循環(huán)后，或者在整個(gè)擴(kuò)增循環(huán)中，取出等分試樣(3-5nl)并立即與甲酰胺混合以終止反應(yīng)。如上所述通過(guò)毛細(xì)管電泳分析樣品。實(shí)施例3.PCR擴(kuò)增和微生物的實(shí)時(shí)檢測(cè)。A.使用基西特異性引物進(jìn)行的微生物RNA—步式RT-PCR檢測(cè)。簡(jiǎn)言之，在50或100pl的總體積中，將RNA樣品(l-5nl)加A^應(yīng)混合物中，所述反應(yīng)混合物^^有0.25jaM的每種RT引物(可選的)、0.25pM的微生物特異性PCR引物(微生物特異性引物對(duì)之一在5'端用FAM標(biāo)記)、改良的lxStratageneRT-PCR緩沖液(BrilliantSingleQ-RT-PCR試劑盒目錄號(hào)600532)、0.1%TritonXIOO、0.2mMdNTP、1.5mMMgCl2和1.25UStrataScriptRTase(Stratagene,LaJolla,CA)，并用礦物油覆蓋。在45。C進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄50分鐘，然后在94'C孵育2分鐘以失活RTase。然后，使用由94'C30秒、60'C30秒和72。C1分鐘的44個(gè)循環(huán)組成的方案i^行樣品的PCR擴(kuò)增。當(dāng)升至第一個(gè)72。C延伸時(shí)，加入1U的熱穩(wěn)定DNA聚合酶(Ventexo(-)(NewEnglandBiolabs))。為了同時(shí)將DNA聚合酶加入多個(gè)管，預(yù)先將聚合酶分配至新的管蓋中，并用包含DNA聚合酶的管蓋替換覆蓋PCR管的管蓋。PCR擴(kuò)增20個(gè)循環(huán)后，連續(xù)收集24個(gè)循環(huán)延伸期末的3^1等分試樣。立即將所述等分試樣與曱跣胺混合以終止反應(yīng)。如下所述，通過(guò)毛細(xì)管電泳分析樣品。為了確認(rèn)無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物的情況不是由于反應(yīng)組分失效所致，在RT-PCR前將10-1000拷貝/反應(yīng)的對(duì)照RNA模板和對(duì)照模板的一對(duì)引物(0.25nM)加至反應(yīng)混合物中。不存在微生物特異性擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，存在擴(kuò)增的對(duì)照模板被認(rèn)為是不存在特定微生物的指示。通過(guò)毛細(xì)管電泳分離樣品。將3|il樣品加入包含適當(dāng)?shù)臒晒鈽?biāo)i己DNA大小標(biāo)準(zhǔn)品(BioVentures,Murfreesboro，TN)的7[il曱酰胺中。將樣品熱變性、渦旋并上樣至3100遺傳分析儀毛細(xì)管電泳設(shè)備(ABI,FosterCity,CA)。在3kV下注射樣品20秒，然后以15kV在POP4聚合物(ABI，F(xiàn)osterCity,CA)上進(jìn)行分離。通過(guò)與所述設(shè)備一起提供的GeneScanv3.7.1軟件分析數(shù)據(jù)的峰和相對(duì)面積。數(shù)據(jù)分析在MicrosoftExcel中將對(duì)應(yīng)于耙標(biāo)微生物特異性擴(kuò)增子的相對(duì)峰面積作為PCR循環(huán)數(shù)的對(duì)數(shù)函數(shù)作圖。##條曲線的線性部分外推至主觀決定的閾值(例如，1000相對(duì)熒光單位)以計(jì)算閾值循環(huán)(Ct)數(shù)。使用反應(yīng)中已知拷貝數(shù)微生物的ct值生成校準(zhǔn)曲線。B.使用帶標(biāo)簽的基因特異性引物的微生物RNA的兩步式RT-PCR檢測(cè)對(duì)于逆轉(zhuǎn)錄來(lái)說(shuō)，將樣品RNA和RT特異性寡核苷酸引物加至10%甘油中，在70。C加熱10分鐘，然后置于水上2分鐘。加入緩沖液(終濃度50mMTris國(guó)HCl，pH8.3、75mMKC1、3mMMgCl2、0.01MDTT、0.8mMdNTP、0.2mg/mlBSA、20。/。海藻糖)、160U的SuperscriptIIRNA酶H逆轉(zhuǎn)錄酶(SSRTII;Invitrogen，Carlsbad,CA)和32U的RNAsin(Ambion,Austin,TX)使總體積為40^1。在45'C進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄20分鐘，然后在75'C進(jìn)行變性步驟。加入50USSRTII起始在48'C進(jìn)行30分鐘的第二輪逆轉(zhuǎn)錄。所述樣品在80。C進(jìn)行另一2分鐘的變性步驟，然后加入50USSRTII在52。C進(jìn)行另一輪30分鐘的逆轉(zhuǎn)錄。用0.04MNaOH(終濃度)對(duì)樣品進(jìn)行堿處理并在65'C孵育15分鐘，之后加入終濃度為0.07M的Tris，pH7.5，然后將該樣品在室溫孵育5分鐘。然后，按照廠家說(shuō)明書(shū)使用QIAquick凝膠提取試劑盒(Qiagen，目錄號(hào)28704，Valencia,CA)回收樣品，只是在提取前向每個(gè)RT樣品加入360plQG緩沖液來(lái)調(diào)整pH。以50pl10mMTris，pH8.5洗脫樣品。第二#^的合成包括將第一條DNA鏈加入總體積為的4mMTris國(guó)HCl(pH7.5)、20mMMgCl2、50mMNaCl、0.2dNTP和1.6pM上游第二^:引物中。將不包含引物的混合物加熱至95。C，然后加入引物。在95。C將反應(yīng)變性4分鐘，降至37'C并加入6.5USequenaseDNA聚合酶。然后，在37'C孵育反應(yīng)1小時(shí)。如上所述4吏用Qiagen的QlAquick^JI^提取試劑盒(目錄號(hào)28704)再次純化樣品。在總體積IOOm!中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用無(wú)DNA酶的礦物油覆蓋反應(yīng)物以防止實(shí)驗(yàn)期間的蒸發(fā)。反應(yīng)緩沖液由以下組成10mMKCl、10mM(NH4)2S04、20mMTris-HCl(pH8.8)、2mMMgS04、0.1%TritonX-IOO、0.2mMdNTP、20%Q溶液(Stratagene,LaJolla，CA)、2%DMSO、2UVentDNA聚合酶(NewEnglandBiolabs，Beverly,Ma.)和lO^M的適當(dāng)引物(其中一種用熒光探針標(biāo)記)。在95。C對(duì)沒(méi)有引物和酶的樣品變性1分鐘。然后，加入PCR引物，再繼續(xù)變性4分鐘。進(jìn)行由95'C30秒、62°C30秒和72'C1分鐘的不同循環(huán)數(shù)(取決于實(shí)驗(yàn))組成的擴(kuò)增。當(dāng)升至第一個(gè)72。C延伸循環(huán)時(shí)加入Vent聚合酶。在24個(gè)循環(huán)中連續(xù)取出3pl的等分試樣，并立即加至包含合適的標(biāo)準(zhǔn)品的7[il甲酰胺中(見(jiàn)上文)。實(shí)施例4:使用以熒光標(biāo)記dNTP進(jìn)行的PCR擴(kuò)增和標(biāo)記DNA片段的毛細(xì)管電泳分離對(duì)微生物進(jìn)行終點(diǎn)檢測(cè)。將包含微生物RNA的5000個(gè)拷貝的血漿RNA41_取物與未標(biāo)記的微生物特異性引物(0.25hM)和dNTP(dATP、dCTP和dGTP每種100HM,dTTP65fiM)在50Brilliant單步定量RT-PCR核心試劑緩沖液(Stratagene目錄號(hào)600532)中混合，并在45。C逆轉(zhuǎn)錄50分鐘，所述緩沖液包含0.1%TritonX-IOO、1.5mMMgCl2和1.25UStrataScriptRTase(Stratagene,LaJolla,CA)。通it^94。C加熱2分鐘終止^Jl。RT完成后，將1U的Vent(Exo-)DNA聚合酶(NEBiolabs目錄號(hào)M0257S)和350|jM熒光素-12-2，-脫氧尿苷-5，-三磷酸(從Roche目錄號(hào)1373242獲得)加入混合物中。進(jìn)行40個(gè)循環(huán)的PCR擴(kuò)增94。C30秒、60°C30秒、72。C30秒。在PCR擴(kuò)增結(jié)束時(shí)取出3nl等分試樣，并如上所述利用毛細(xì)管電泳進(jìn)行分析。實(shí)施例5:使用熒光標(biāo)記的dNTP進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增，以及利用毛細(xì)管電泳分離標(biāo)記的DNA片段。將血漿RNA提取物ARE中微生物RNA的連續(xù)稀釋物與未標(biāo)記的微生物特異性引物(0.25uM)和dNTP(dATP、dCTP和dGTP每種100pM，dTTP65jiM)在50nLBrilliant單步定量RT-PCR核心試劑緩沖液(Stratagene目錄號(hào)600532)中混合，并在45。C逆轉(zhuǎn)錄50分鐘，所述緩沖液包含0.1。/。TritonX畫(huà)100、1.5mMMgCl2和1.25UStrataScriptRTase(Stratagene,LaJolla，CA)。通it^94。C加熱2分鐘終止^Jl。RT完成后，將1U的Vent(Exo-)DNA聚合酶(NEBiolabs目錄號(hào)M0257S)和350pM熒光素-12-2，-脫氧尿苷-5，-三磷酸(得自Roche目錄號(hào)1373242)加入混合物中。進(jìn)行40-45個(gè)循環(huán)的PCR擴(kuò)增94°C30秒、60卩30秒、72°C30秒。從第24個(gè)循環(huán)開(kāi)始，在每個(gè)PCR循環(huán)結(jié)束時(shí)取出3^1等分試樣，并如上所述利用毛細(xì)管電泳進(jìn)行分析。在MicrosoftExcel中將對(duì)應(yīng)于##條曲線的線性部分外推至主觀決^的閾值(例如，、iooo相對(duì)熒光單位)以計(jì)算閾值循環(huán)(Ct)數(shù)。使用反應(yīng)中已知拷貝數(shù)微生物的Ct值生成校準(zhǔn)曲線?；蛘撸瑢?duì)于檢測(cè)實(shí)驗(yàn)來(lái)說(shuō)，在適當(dāng)?shù)臒o(wú)摻入對(duì)照RNA中*種樣品從初始濃度進(jìn)行10倍連續(xù)稀釋，并用于單步RT-PCR方案中。對(duì)于使用純化的微生物RNA的實(shí)驗(yàn)來(lái)說(shuō)，在20ng/pl大腸桿菌tRNA中進(jìn)行稀釋。簡(jiǎn)言之，在50或100^1的總體積中，將RNA模板和0.25jaM的每種RT引物加至混合物中，所述混合物包含改良的lxStratagene緩沖液(目錄號(hào)600532)、0.1%TritonX-IOO、0.2mMdNTP、1.5mMMgCl2和1.25UStrataScriptRTase(Stratagene，LaJolla，CA)，并在45。C逆轉(zhuǎn)錄50分鐘，之后在94。C2分鐘失活RTase。然后，使用由94。C30秒、60'C30秒、72。C1分鐘的44個(gè)循環(huán)組成的方案進(jìn)行樣品的PCR擴(kuò)增。當(dāng)升至第一個(gè)72'C時(shí)，加入1U的熱穩(wěn)定DNA聚合酶。20個(gè)循環(huán)后，連續(xù)收集24個(gè)循環(huán)的延伸期結(jié)束時(shí)的3^1等分試樣。立即將等分試樣加入變性劑中終止反應(yīng)。如上所述，利用毛細(xì)管電泳分析樣品。實(shí)施例6:用于檢測(cè)樣品中病原體的六元病毒測(cè)定收集人全血到EDTA收集管中，使用標(biāo)準(zhǔn)方法在收集后24小時(shí)以內(nèi)制備血漿。使用CorbettXtractor提取DNA，并用75微升的艦液進(jìn)行洗脫。一旦進(jìn)行處理，在同一天進(jìn)行樣品篩選。在每個(gè)反應(yīng)中測(cè)試10微升的提取DNA。反應(yīng)以一式二份進(jìn)行。每個(gè)反應(yīng)混和液中包含以下組分lxQiagen復(fù)合緩沖液、10%甜菜堿、濃度為0.05~0.400pM的針對(duì)每個(gè)耙標(biāo)的引物、以及每個(gè)反應(yīng)100個(gè)拷貝的針對(duì)每種病毒耙標(biāo)的靈敏度對(duì)照質(zhì)粒。用礦物油覆蓋每種反應(yīng)混和物以防止蒸發(fā)。每個(gè)反應(yīng)都包含無(wú)模板對(duì)照。同時(shí)進(jìn)行總共16個(gè)^^應(yīng)。PCR清潔室里裝配反應(yīng)物，并轉(zhuǎn)移到^^板區(qū)，在這里將DNA提取樣品加至每個(gè)反應(yīng)物中。然后，將反應(yīng)物轉(zhuǎn)移至分配式熱循環(huán)儀，使用以下流程進(jìn)行PCR擴(kuò)增95。C15分鐘(酶活化)95'C/30秒，62。C/卯秒72。C/1分鐘95。C/30秒，60。C/90秒72。C/1分鐘95°C/30秒，58°C/卯秒72'C/1分鐘e.31個(gè)循環(huán)95。C/30秒，57。C/卯秒72。C/1分鐘為每組8個(gè)樣品準(zhǔn)備兩個(gè)96孔收集板，用于在72'C延伸的最后a.1個(gè)循環(huán):b.3個(gè)循環(huán):c.3個(gè)循環(huán):d.3個(gè)循環(huán):秒收集每個(gè)>^應(yīng)物的2pL等分試樣。含有0.3pLROX標(biāo)記的MapMaker1000DNA標(biāo)準(zhǔn)品(Bioventures)的8微升甲酰胺分配到96孑L板的每一個(gè)孔中，并置于分配式熱循環(huán)儀的收集區(qū)。在72r延伸期的最后1秒從每個(gè)反應(yīng)物取出2微升等分試樣并轉(zhuǎn)移至收集板中，從第18個(gè)循環(huán)開(kāi)始持續(xù)至第40個(gè)循環(huán)期。在PCR擴(kuò)增結(jié)束時(shí)，將收集板加熱密封，離心并在ABI3730XL(AppliedBiosystems，F(xiàn)osterCity，CA)遺傳分析儀上進(jìn)行片段分析(圖2).處理得到的數(shù)據(jù)以確定相對(duì)熒光單位(峰面積的對(duì)數(shù))，并以對(duì)數(shù)標(biāo)度對(duì)循環(huán)數(shù)作圖(圖3)。通過(guò)將每種特異性擴(kuò)增子峰面積的對(duì)數(shù)對(duì)循環(huán)數(shù)作圖以及選擇對(duì)應(yīng)于35000熒光單位的循環(huán)數(shù)(通過(guò)GeneMapper數(shù)據(jù)分析軟件(AppliedBiosystems,FosterCity，CA)計(jì)算)來(lái)計(jì)算i種病毒靶標(biāo)的閾值循環(huán)(圖4)。通過(guò)測(cè)量預(yù)定數(shù)量病毒DNA的Ct得到校準(zhǔn)曲線，該曲線用于確定作為每種特異性靶標(biāo)病毒載荷的函數(shù)的閾值循環(huán)(Ct)。可以使用針對(duì)每種病毒靶標(biāo)的特異性校準(zhǔn)曲線，通過(guò)選擇該特異性病毒耙標(biāo)的測(cè)量閾值循環(huán)相應(yīng)的病毒載荷來(lái)測(cè)定臨床樣品中的病毒載荷。用于檢測(cè)CMV、EBV、BK、HHV6、HHV7、JCV和人線粒體DNA的靶標(biāo)特異性寡核苷酸在表5中拔映。該測(cè)定定量檢測(cè)CMV、EBV、BK、HHV6、HHV7和JCV的存在情況。在該測(cè)定中還檢測(cè)人線粒體序列作為質(zhì)量度量，以證實(shí)從臨床樣品成功提取了DNA(如果線粒體擴(kuò)增子的測(cè)量閾值循環(huán)在23-27個(gè)循環(huán)的范圍內(nèi)，則i人為樣品制備成功)。其他實(shí)施方案上述實(shí)施方案展示了本發(fā)明人在得到和實(shí)施本發(fā)明時(shí)考慮到的實(shí)驗(yàn)和技術(shù)。相信對(duì)用于向本領(lǐng)域報(bào)告本發(fā)明的實(shí)踐以及用于證明其有用性的技術(shù)的公開(kāi)均包含在了這些實(shí)施方案中。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解，本文公開(kāi)的技術(shù)和實(shí)施方案僅為優(yōu)選的實(shí)施方案，可使用許多等同的方法和技術(shù)得到同樣的結(jié)果。除非另有定義，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)均具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員的普遍理解相同的含義。盡管可使用與本文所^目似或等同的方法和材料來(lái)實(shí)施或測(cè)試本發(fā)明，但合適的方法和材料描述如下。將本文提及的所有出版物、專利申請(qǐng)、專利及其它參考文獻(xiàn)通過(guò)參考整體并入本文中。在沖突的情況下，將以本說(shuō)明書(shū)(包括定義)為準(zhǔn)。另外，所述材料、方法和實(shí)施例僅為說(shuō)明性，而不意在限制。權(quán)利要求1.分析懷疑含有多種預(yù)定病原體中任何種的樣品以檢測(cè)病原體特異性靶標(biāo)的方法，所述方法包括a)選擇對(duì)應(yīng)于所述多種預(yù)定病原體中每一種病原體的病原體特異性引物對(duì)，其中所述病原體特異性引物對(duì)能夠介導(dǎo)從相應(yīng)病原體的核酸病原體特異性靶標(biāo)中擴(kuò)增選定的已知長(zhǎng)度多核苷酸擴(kuò)增子；b)在促進(jìn)多核苷酸擴(kuò)增子擴(kuò)增的條件下，在擴(kuò)增步驟中將來(lái)自所述懷疑含有多種預(yù)定病原體中任意種之樣品的核酸與多種病原體特異性引物對(duì)在反應(yīng)混合物中接觸。c)在擴(kuò)增步驟期間以一個(gè)或多個(gè)間隔取出反應(yīng)混合物的等分試樣；d)分離每個(gè)等分試樣中的擴(kuò)增子；和e)檢測(cè)每個(gè)等分試樣中的擴(kuò)增子。其中，檢測(cè)到一種或多種選定的已知長(zhǎng)度擴(kuò)增子指示樣品中含有該擴(kuò)增子相應(yīng)的病原體特異性靶標(biāo)。2.權(quán)利要求l的方法，其還包括定量所檢測(cè)到的擴(kuò)增子以及建立所檢測(cè)擴(kuò)增子的量與樣品中存在的病原體量之間的相關(guān)性。3.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述擴(kuò)增步驟包括通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)進(jìn)行擴(kuò)增。4.權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)的方法，其中所述來(lái)自樣品的核酸在擴(kuò)增步驟前進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄(RT)。5.權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)的方法，其中步驟(c)的擴(kuò)增子通過(guò)毛細(xì)管電泳進(jìn)行分離。6.權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)的方法，其中所述一種或多種病原體特異性引物包含可檢測(cè)標(biāo)記。7.權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)的方法，其中所述擴(kuò)增子通過(guò)包含可檢測(cè)標(biāo)記的核酸結(jié)合染料進(jìn)行檢測(cè)。8.權(quán)利要求6或7的方法，其中所述可檢測(cè)標(biāo)記選自熒光標(biāo)記、放射性標(biāo)記、比色標(biāo)記、磁性標(biāo)i己和酶標(biāo)記。9.權(quán)利要求6至8中任一項(xiàng)的方法，其中所述可檢測(cè)標(biāo)記是熒光標(biāo)記010.權(quán)利要求6至9中任一項(xiàng)的方法，其還包括通過(guò)對(duì)反應(yīng)混合物等分試樣中可檢測(cè)標(biāo)記的量進(jìn)行定量，從而定量樣品中病原體的量。11.權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)的方法，其中所述病原體選自病毒、細(xì)菌、原生動(dòng)物及其組合。12.權(quán)利要求l至ll中任一項(xiàng)的方法，其中所述多種特異性病原體靶標(biāo)包括以下的特異性病毒靶標(biāo)HSV1、HSV2、EBV、CMV、HHV6、HHV7、HHV8、VZV、丙型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、腺病毒、EEEV、WNE、JCV和BKV。13.權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)的方法，其中所述方法能夠檢測(cè)樣品中至少兩種病原體，14.權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)的方法，其中所述方法能夠檢測(cè)樣品中至少3種病原體。15.權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)的方法，其中所述方法能夠檢測(cè)樣品中至少4種病原體。16.權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)的方法，其中所述方法能夠檢測(cè)樣品中至少5種病原體。17.權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)的方法，其中所述方法能夠檢測(cè)樣品中至少6種病原體。18.權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)的方法，其中所述方法能夠檢測(cè)樣品中至少8種病原體。19.權(quán)利要求1至18中任一項(xiàng)的方法，其中所有病原體特異性引物對(duì)能夠在至少一組共同的反應(yīng)條件下促進(jìn)多核苷酸擴(kuò)增。20.權(quán)利要求1至19中任一項(xiàng)的方法，其中所述樣品是病原體宿主樣品。21.權(quán)利要求20的方法，其中所述宿主是哺乳動(dòng)物。22.權(quán)利要求20或21的方法，其中所述宿主是人。23.權(quán)利要求20至22中任一項(xiàng)的方法，其中所述宿主是免疫受損的人。24.權(quán)利要求23的方法，其中所述免疫受損的個(gè)體已接受移植。25.權(quán)利要求23的方法，其中所述免疫受損的個(gè)體已接受治療癌癥的化學(xué)治療。26.權(quán)利要求23至25中任一項(xiàng)的方法，其中所述方法用于監(jiān)測(cè)免疫抑制治療的過(guò)程。27.權(quán)利要求22至26中任一項(xiàng)的方法，其中所述宿主是對(duì)病原體感染無(wú)癥狀的人。28.權(quán)利要求20至27中任一項(xiàng)的方法，其中所述方法包括擴(kuò)增宿主的核酸。29.權(quán)利要求1至28中任一項(xiàng)的方法，其中所述方法還通過(guò)擴(kuò)增來(lái)自對(duì)照核酸分子的擴(kuò)增子來(lái)檢測(cè)不來(lái)自該樣品的對(duì)照核酸分子的存在情況。30.權(quán)利要求29的方法，其中所述對(duì)照核酸分子是竟?fàn)巹┖怂岱肿印?1.權(quán)利要求29或30的方法，其中檢測(cè)多種不同的對(duì)照核酸分子。32.權(quán)利要求29至31中任一項(xiàng)的方法，其中所述對(duì)照寡核苷酸以已知濃度存在于該反應(yīng)物中。33.權(quán)利要求31的方法，其中所述不同的對(duì)照寡核苷酸以不同的濃度存在于該反應(yīng)物中。34.權(quán)利要求29至33中任一項(xiàng)的方法，其中使用病原體特異性引物對(duì)來(lái)擴(kuò)增對(duì)照寡核苷酸所擴(kuò)增的擴(kuò)增子。35.權(quán)利要求29至33中任一項(xiàng)的方法，其中所述對(duì)照核酸以與該病原體特異性乾標(biāo)核酸相似的效率進(jìn)行擴(kuò)增。36.權(quán)利要求29至35中任一項(xiàng)的方法，其中所述對(duì)照核酸分子是DNA和/或RNA。37.權(quán)利要求29至36中任一項(xiàng)的方法，其中所述病原體特異性引物以相似的效率擴(kuò)增病原體核酸和對(duì)照核酸分子。38.用于檢測(cè)和定量樣品中多種預(yù)定病原體的方法，該方法包括a)獲得懷疑含有多種病原體中至少一種的樣品，其中每種病原體包含病原體特異性多核苷酸；b)從所述樣品中分離核酸；c)選擇靶向所述多種病原體特異性多核苷酸中每一種的病原體特異性引物對(duì)，其中所述引物對(duì)能夠介導(dǎo)擴(kuò)增子的擴(kuò)增，所述擴(kuò)增子的長(zhǎng)度明顯不同于靶向所述多種病原體核酸中每種其它成員的每種其它病原體特異性引物對(duì)所產(chǎn)生擴(kuò)增子的長(zhǎng)度；d)選擇至少一種竟?fàn)巹┒嗪塑账幔渲兴鼍範(fàn)巹┒嗪塑账崮軌蜃鳛槟０鍋?lái)介導(dǎo)通過(guò)一種病原體特異性引物對(duì)進(jìn)行的擴(kuò)增子的擴(kuò)增，其中所產(chǎn)生擴(kuò)增子的長(zhǎng)度明顯不同于靶向所述多種病原體特異性核酸中每種其它成員以及其他竟?fàn)巹┒嗪塑账岬拿糠N其它病原體特異性引物對(duì)所產(chǎn)生的擴(kuò)增子的長(zhǎng)度；e)向分離自該樣品的核酸中加入預(yù)定量的至少一種竟?fàn)巹┒嗪塑账幔缘玫綔y(cè)試混合物；f)在促進(jìn)擴(kuò)增子擴(kuò)增的條件下，將所述測(cè)試混合物與多種病原體特異性引物對(duì)在反應(yīng)混合物中接觸；g)分離步驟(f)中產(chǎn)生的擴(kuò)增子；h)檢測(cè)步驟(f)中產(chǎn)生的每種擴(kuò)增子的長(zhǎng)度；i)建立所檢測(cè)每種擴(kuò)增子的長(zhǎng)度與反應(yīng)混合物中所存在病原體或竟?fàn)巹┒嗪塑账嶂g的相關(guān)性。j)定量步驟(f)中產(chǎn)生的每種擴(kuò)增子的量；以及k)基于加入該測(cè)試混合物中的竟?fàn)巹┒嗪塑账岬念A(yù)定量，確定樣品中存在的病原體量。39.權(quán)利要求38的方法，其中在擴(kuò)增步驟期間，以一個(gè)或多個(gè)間隔取出步驟(f)的反應(yīng)混合物的等分試樣，并且其中對(duì)所述等分試樣進(jìn)行步驟(g)至步驟(k)。40.權(quán)利要求38和39的方法，其中所述樣品中存在的病原體的量檢測(cè)不到。41.權(quán)利要求38至40中任一項(xiàng)的方法，其中步猓(f)的擴(kuò)增在單個(gè)反應(yīng)中進(jìn)行。42.權(quán)利要求38至41中任一項(xiàng)的方法，其中通過(guò)毛細(xì)管電泳進(jìn)行步驟(g)的分離。43.權(quán)利要求38至42中任一項(xiàng)的方法，其中所述一種或多種病原體特異性引物包含可檢測(cè)標(biāo)記。44.權(quán)利要求38至43中任一項(xiàng)的方法，其中所述擴(kuò)增子通過(guò)包含可檢測(cè)標(biāo)記的核酸結(jié)合染料進(jìn)行檢測(cè)。45.權(quán)利要求43或44的方法，其中所述可檢測(cè)標(biāo)記選自熒光標(biāo)記、放射性標(biāo)記、比色標(biāo)記、磁性標(biāo)記和酶標(biāo)記。46.權(quán)利要求43至45中任一項(xiàng)的方法，其中所述可檢測(cè)標(biāo)記是熒光標(biāo)記。47.權(quán)利要求43至47中任一項(xiàng)的方法，其還包括通過(guò)對(duì)反應(yīng)混合物等分試樣中可檢測(cè)標(biāo)記的量進(jìn)行定量，從而定量該樣品中病原體的量。48.權(quán)利要求38至47中任一項(xiàng)的方法，其中所述病原體選自病毒、細(xì)菌、原生動(dòng)物及其組合。49.權(quán)利要求38至48中任一項(xiàng)的方法，其中所述多種特異性病原體耙標(biāo)包括選自以下的特異性病毒耙標(biāo)HSV1、HSV2、EBV、CMV、HHV6、HHV7、HHV8、VZV、丙型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、腺病毒、EEEV、WNE、JCV和BKV。50.權(quán)利要求38至49中任一項(xiàng)的方法，其中所述方法能夠檢測(cè)樣品中至少兩種病原體。51.權(quán)利要求38至50中任一項(xiàng)的方法，其中所述方法能夠檢測(cè)樣品中至少3種病原體。52.權(quán)利要求38至50中任一項(xiàng)的方法，其中所述方法能夠檢測(cè)樣品中至少4種病原體。53.權(quán)利要求38至50中任一項(xiàng)的方法，其中所述方法能夠檢測(cè)樣品中至少5種病原體。54.權(quán)利要求38至50中任一項(xiàng)的方法，其中所述方法能夠檢測(cè)樣品中至少6種病原體。55.權(quán)利要求38至50中任一項(xiàng)的方法，其中所述方法能夠檢測(cè)樣品中至少8種病原體。56.權(quán)利要求38至55中任一項(xiàng)的方法，其中所有病原體特異性引物對(duì)能夠在至少一組共同的反應(yīng)條件下促進(jìn)多核苷酸擴(kuò)增。57.權(quán)利要求38至56中任一項(xiàng)的方法，其中所述樣品是病原體宿主樣品。58.權(quán)利要求57的方法，其中所述宿主是哺乳動(dòng)物。59.權(quán)利要求57或58的方法，其中所述宿主是人。60.權(quán)利要求57至59中任一項(xiàng)的方法，其中所述宿主是免疫受損的人。61.權(quán)利要求60的方法，其中所述免疫受損的個(gè)體已接受移植。62.權(quán)利要求60的方法，其中所述免疫受損的個(gè)體已接受治療癌癥的化學(xué)治療。63.權(quán)利要求60至62中任一項(xiàng)的方法，其中所述方法用于監(jiān)測(cè)免疫抑制治療的過(guò)程。64.權(quán)利要求59至63中任一項(xiàng)的方法，其中所述宿主是對(duì)該病原體感染無(wú)癥狀的人。65.權(quán)利要求57至64中任一項(xiàng)的方法，其中所述方法包括擴(kuò)增宿主的核酸。66.權(quán)利要求38至65中任一項(xiàng)的方法，其中所述竟?fàn)巹┒嗪塑账嵋耘c該病原體特異性靶標(biāo)核酸相似的效率進(jìn)行擴(kuò)增。67.權(quán)利要求38至66中任一項(xiàng)的方法，其中所述竟?fàn)巹┒嗪塑账崾荄NA和/或RNA。68.權(quán)利要求38至67中任一項(xiàng)的方法，其中所述來(lái)自該樣品的核酸是DNA和/或RNA。69.權(quán)利要求68的方法，其中DNA和RNA分別從該樣品中分離。70.權(quán)利要求38至69中任一項(xiàng)的方法，其中將對(duì)來(lái)自所述樣品的多種預(yù)定病原體中至少兩種的定量組合在單個(gè)反應(yīng)中。71.權(quán)利要求38至70中任一項(xiàng)的方法，其中將對(duì)來(lái)自所述樣品的多種預(yù)定病原體中至少3種的定量組合在單個(gè)反應(yīng)中。72.權(quán)利要求38至71的方法，其中所述樣品是血。73.權(quán)利要求60至72中任一項(xiàng)的方法，其中所述方法用于監(jiān)測(cè)免疫抑制治療的過(guò)程。74.對(duì)受試者監(jiān)測(cè)由預(yù)定病原體感染所導(dǎo)致疾病的發(fā)生情況的方法，該方法包括從受試者獲得樣品；定量5種或更多種指示至少一種預(yù)定病原體的病原體特異性標(biāo)志物；計(jì)算樣品中至少一種預(yù)定病原體的量，其中該量表示為每體積或重量的樣品中病原體的拷貝數(shù)。75.權(quán)利要求74的方法，其中存在的病原體的量檢測(cè)不到。76.權(quán)利要求74或75的方法，其中所述樣品中病原體的存在量為零。77.權(quán)利要求74至76中任一項(xiàng)的方法，其中所述受試者是免疫受損的患者。78.權(quán)利要求74至77中任一項(xiàng)的方法，其中所述受試者是無(wú)癥狀的患者。79.權(quán)利要求74至78中任一項(xiàng)的方法，其中計(jì)算至少一種預(yù)定病原體的量。80.權(quán)利要求74至79中任一項(xiàng)的方法，其中該樣品中至少一種病原體的量用于確定免疫受損患者的治療方案。81.權(quán)利要求74至81中任一項(xiàng)的方法，其中所述患者是移植或移植物的受者，并且接受免疫抑制治療。82.權(quán)利要求74至80中任一項(xiàng)的方法，其中已向該免疫受損患者施用免疫抑制藥物，或者該免疫受損患者目前正在接受免疫抑制藥物。83.權(quán)利要求81或82的方法，其中樣品中一種或多種所述目的病原體的量是確定改變免疫抑制治療方案的因素。84.權(quán)利要求74至83中任一項(xiàng)的方法，其中該樣品中多于一種病原體的量在單個(gè)反應(yīng)中測(cè)定。85，權(quán)利要求74至83中任一項(xiàng)的方法，其中該樣品中多于一種病原體的量在多元測(cè)定中測(cè)定。86.權(quán)利要求74至85中任一項(xiàng)的方法，其中所述樣品是血、唾液或尿。87.權(quán)利要求74至86中任一項(xiàng)的方法，其中所述多種病原體的量通過(guò)擴(kuò)增靶標(biāo)病原體特異性核酸來(lái)測(cè)定。88.權(quán)利要求74至87中任一項(xiàng)的方法，其中所述監(jiān)測(cè)方法以定期方案進(jìn)行，以監(jiān)測(cè)感染性疾病的出現(xiàn)或發(fā)展。89.權(quán)利要求88的方法，其中定期方案約為每月一次。全文摘要本發(fā)明允許定量檢測(cè)一個(gè)樣品中的多種病原體。該方法包括用多種病原體特異性引物對(duì)來(lái)擴(kuò)增樣品，從而由每種病原體特異性引物對(duì)產(chǎn)生大小不同的擴(kuò)增子。該方法還包括使用對(duì)應(yīng)于每種病原體特異性引物對(duì)的多種競(jìng)爭(zhēng)劑多核苷酸靶標(biāo)。將所述競(jìng)爭(zhēng)劑多核苷酸以已知的濃度加入反應(yīng)混合物中，以定量樣品中病原體的量。該方法可用于監(jiān)測(cè)個(gè)體(優(yōu)選免疫受損的個(gè)體)中的病原體感染。文檔編號(hào)C12P19/34GK101351559SQ200680050163公開(kāi)日2009年1月21日申請(qǐng)日期2006年11月9日優(yōu)先權(quán)日2005年11月9日發(fā)明者伊麗莎白·加西亞,凱爾·哈特,卡祖米·希奧薩基,弗拉基米爾·I·斯列普尼奧夫申請(qǐng)人:普里梅拉生物系統(tǒng)有限公司