專利名稱：用于提高油料植物中總含油量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在轉(zhuǎn)基因油料作物中通過(guò)表達(dá)來(lái)自酵母，優(yōu)選來(lái)自釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的甘油3-磷酸脫氫酶(G3PDH)，提高總含油量和/或甘油3-磷酸含量的方法，該油料作物包括按重量計(jì)占總脂肪酸含量至少20％的油酸，優(yōu)選在植物種子中。在該方法中獲得的油和/或游離脂肪酸可以被方便地添加在聚合物、食品、飼料、化妝品、藥物或者具有工業(yè)應(yīng)用的產(chǎn)品中。

背景技術(shù)：
提高轉(zhuǎn)基因油料作物，特別是植物種子中的總含油量和/或甘油3-磷酸含量對(duì)于傳統(tǒng)和現(xiàn)代植物育種，以及特別是對(duì)于植物生物技術(shù)而言是非常重要的。由于植物油在營(yíng)養(yǎng)或者工業(yè)應(yīng)用上的消耗在增加，提高或者修飾植物油的可能性逐漸成為當(dāng)代研究的主題[例如，

等人(1995)Science268681-686]。其目的特別是提高在種子油中的脂肪酸含量。
可以從植物油中獲得的脂肪酸也是特別有意義的。例如它們可以用作增塑劑、潤(rùn)滑劑、表面活性劑、化妝品等等的基質(zhì)，并且可以用作食品和飼料工業(yè)中有價(jià)值的原料。因此，例如，提供具有中鏈長(zhǎng)度的脂肪酸的菜籽油是特別重要的，因?yàn)樵诒砻婊钚詣┥a(chǎn)中尤其需要它們。
通過(guò)重組方法對(duì)植物代謝途徑的靶向調(diào)節(jié)使得可以以有利的方式對(duì)植物代謝進(jìn)行修飾，而這在使用傳統(tǒng)的育種方法時(shí)，就算是可以實(shí)現(xiàn)，也僅僅是在復(fù)雜的過(guò)程之后才可實(shí)現(xiàn)。因此，稀有脂肪酸(例如特定的多不飽和脂肪酸)僅僅在某些植物中合成，或者根本不在植物中合成，并且因此僅僅可以通過(guò)在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)相關(guān)酶而產(chǎn)生[例如Millar等人(2000)Trends Plant Sci 595-101]。
甘油三酯和其它脂質(zhì)從脂肪酸合成。由于區(qū)室化，脂肪酸生物合成和甘油三酯生物合成可以被認(rèn)為是分開(kāi)的生物合成途徑，但是考慮到終產(chǎn)物，可以被認(rèn)為是一個(gè)生物合成途徑。脂質(zhì)合成可以被分成兩部分機(jī)制，其一可以被稱為“原核”機(jī)制，另一可以被稱為“真核”機(jī)制(Browse等人(1986)Biochemical J 23525-31；Ohlrogge & Browse(1995)Plant Cell 7957-970)。該合成的原核機(jī)制定位于質(zhì)體中并且包括游離脂肪酸的生物合成，該游離脂肪酸被輸出到胞質(zhì)，在這里它們以脂肪酸乙酰輔酶A酯的形式進(jìn)入真核機(jī)制，被甘油3-磷酸(G3P)酯化以產(chǎn)生磷脂酸(PA)。PA是中性和極性脂質(zhì)合成的起點(diǎn)。中性脂質(zhì)尤其是通過(guò)Kennedy途徑在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成[Voelker(1996)Genetic Engineering，Setlow(編輯)18111-113；Shankline & Cahoon(1998)Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 49611-649；Frentzen(1998)Lipids 100161-166]。除了甘油三酯的生物合成，G3P也在甘油合成中發(fā)揮作用(例如為了滲透調(diào)節(jié)和抗低溫脅迫的目的)。
合成所必需的GP3這里是通過(guò)甘油3-磷酸脫氫酶(G3PDH)(也稱為二羥丙酮磷酸還原酶)還原二羥丙酮磷酸(DHAP)而合成的。通常，NADH作為還原共底物(EC 1.1.1.8)。另一類的甘油3-磷酸脫氫酶(EC 1.1.99.5)使用FAD作為共底物。這類酶催化DHAP與G3PDH反應(yīng)。在真核細(xì)胞中，這兩類酶分布在不同的區(qū)室中，那些NAD依賴的定位于胞質(zhì)，并且那些FAD依賴的定位于線粒體(針對(duì)釀酒酵母，參見(jiàn)，例如Larsson等人，1998，Yeast 14347-357)。
EP-A 0 353 049公開(kāi)了來(lái)自芽孢桿菌(Bacillus sp.)的不依賴NAD的G3PDH。不依賴NAD的G3PDH也在釀酒酵母中被鑒定[Miyata K，Nagahisa M(1969)Plant Cell Physiol 10(3)635-643]。
G3PDH是原核生物和真核生物中關(guān)鍵的酶，其除了在脂質(zhì)生物合成中發(fā)揮功能，還是通過(guò)作用于NAD+/NADH比例而對(duì)維持細(xì)胞的氧化還原狀態(tài)起作用的酶之一。在釀酒酵母中缺失GPD2基因(在此酵母中的兩個(gè)G3PDH同種型之一)，導(dǎo)致在缺氧條件下生長(zhǎng)減少。另外，G3PDH也表現(xiàn)出在酵母的脅迫反應(yīng)中發(fā)揮作用，主要是對(duì)滲透脅迫發(fā)揮作用。在釀酒酵母中缺失GPD1基因引起對(duì)氯化鈉的超敏感性。
而且公開(kāi)了昆蟲(黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)，果蠅(Drosophila virilis))、植物(擬南芥(Arabidopsis thaliana)，披針葉萼距花(Cuphea lanceolata))、哺乳動(dòng)物(人(Homo sapiens)，小鼠(Mus musculus)，野豬(Sus scrofa)，褐家鼠(Rattus norvegicus))、魚類(大西洋鮭(Salmo salar)，胡瓜魚(Osmerus mordax))、鳥類(綿羊(Ovis aries))、兩棲動(dòng)物(非洲爪蟾(Xenopus laevis))、線蟲(秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditis elegans))、藻類和細(xì)菌的G3PDH序列。
植物細(xì)胞具有至少兩個(gè)G3PDH同種型，即，細(xì)胞質(zhì)同種型和質(zhì)體同種型[Gee RW等人(1988)Plant Physiol 8698-103；Gee RW等人(1988)Plant Physiol 87379-383]。在植物中，首先在馬鈴薯塊莖中發(fā)現(xiàn)甘油3-磷酸脫氫酶的酶活性[Santora GT等人(1979)Arch Biochem Biophys 196403-411]。另外，在其它植物中也檢測(cè)到定位在胞質(zhì)和質(zhì)體中的其它G3PDH活性，例如豌豆、玉蜀黍或者大豆[Gee RW等人(1988)PLANT PHYSIOL86(1)98-103]。也公開(kāi)了來(lái)自藻類的G3PDH，例如來(lái)自Dunaliellatertiolecta的兩個(gè)質(zhì)體G3PDH同種型和一個(gè)胞質(zhì)G3PDH同種型[Gee R等人(1993)Plant Physiol 103(1)243-249；Gee R等人(1989)PLANTPHYSIOL 91(1)345-351]。關(guān)于來(lái)自披針葉萼距花的植物G3PDH，已經(jīng)提議通過(guò)在植物中過(guò)表達(dá)該酶而獲得提高的含油量或者脂肪酸模式的轉(zhuǎn)變(WO 95/06733)。然而，這些效果尚沒(méi)有被證明。
也公開(kāi)了細(xì)菌的G3PDH及其功能[Hsu和Fox(1970)J Bacteriol 103410-416和Bell(1974)J Bacteriol 1171065-1076]。
WO 01/21820公開(kāi)了利用突變的大腸桿菌(E.coli)G3PDH的異源表達(dá)，以提高脅迫耐性和修飾在貯藏油中的脂肪酸組成。該突變大腸桿菌G3PDH(gpsA2FR)表現(xiàn)出單一的氨基酸替代，其引起減少的來(lái)自G3P的抑制作用。該gpsA2FR突變體的異源表達(dá)導(dǎo)致具有增加的C16脂肪酸含量以及相應(yīng)地降低的C18脂肪酸含量的甘油酯類。對(duì)脂肪酸模式的修飾是相對(duì)較小的觀察到2至5％的16:0脂肪酸增加和1.5至3.5％的16:3脂肪酸增加，以及2至5％的18:2和18:3脂肪酸減少?？偢视王ヮ惖暮课词苡绊憽?br> WO 03/095655公開(kāi)了在擬南芥屬中表達(dá)酵母蛋白Gpd1p?？梢允箶M南芥植物增加大約22％的含油量。一個(gè)轉(zhuǎn)基因系的個(gè)體種子顯示出比野生型對(duì)照植物增加了41％的含油量。這個(gè)方法的缺點(diǎn)是擬南芥是模式植物，由于其農(nóng)學(xué)特點(diǎn)，其不適合用于商業(yè)生產(chǎn)油。而且，擬南芥積累顯著量的二十碳一烯酸(20:1)，這使得該油不能被用于食品或者藥物中。
此外，還描述了來(lái)自酵母(子囊菌)的G3PDH，例如 a)粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)[Pidoux AL等人(1990)Nucleic Acids Res 18(23)7145；GenBank Acc.-No.X56162；Ohmiya R等人(1995)Mol Microbiol 18(5)963-73；GenBank Acc.-No.D50796，D50797]， b)解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)(GenBank Acc.-No.AJ250328)， c)魯氏接合酵母(Zygosaccharomyces rouxii)[Iwaki T等人Yeast(2001)18(8)737-44；GenBank Acc.-NoAB047394，AB047395，AB047397]， d)釀酒酵母[Albertyn J等人(1994)Mol Cell Biol 14(6)4135-44；Albertyn J等人(1992)FEBS LETT 308(2)130-132；Merkel JR等人(1982)Anal Biochem 122(1)180-185；Wang HT等人(1994)J Bacteriol.176(22)7091-5；Eriksson P等人(1995)Mol Microbiol.17(1)95-107；GenBank Acc.-No.U04621，X76859，Z35169]， e)構(gòu)巢裸殼孢菌(Emericella nidulans)(GenBank Acc.-No.AF228340)，或者 f)漢遜德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)(GenBank Acc.-No.AF210060)。
目前公開(kāi)的提高轉(zhuǎn)基因植物中含油量的方法無(wú)一可以在可栽培植物中導(dǎo)致足以用于技術(shù)操作的含油量增加。因此，目前仍然存在提高轉(zhuǎn)基因可栽培植物的總含油量的強(qiáng)烈需要，優(yōu)選在這些植物的種子中提高含油量。這樣的方法應(yīng)該滿足如下標(biāo)準(zhǔn) ●為了提高該轉(zhuǎn)基因植物中的總含油量，導(dǎo)入植物的基因應(yīng)該盡可能少。
●該方法應(yīng)該盡可能地簡(jiǎn)單和廉價(jià)。
●為了獲得盡可能地高的產(chǎn)油量，應(yīng)該采用高含油量的植物。
●采用該植物應(yīng)該獲得高的產(chǎn)油量。
●飽和C14-C18脂肪酸應(yīng)該以盡可能少的量存在于產(chǎn)生的油中。
●在野生型和轉(zhuǎn)基因植物之間脂肪酸譜應(yīng)該僅僅被極少地修飾，如果可能則根本不修飾。
●另外，在該方法中應(yīng)該消除在油生物合成或者脂肪酸生物合成的前體上的任何瓶頸。
因此，本發(fā)明的目的是開(kāi)發(fā)提高作物植物中的總含油量的方法，其具有上述盡可能多的特征。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的通過(guò)提高轉(zhuǎn)基因油料作物中的總含油量的方法而實(shí)現(xiàn)，其中該轉(zhuǎn)基因油料作物包含按重量計(jì)占總脂肪酸含量至少20％的油酸，并且所述方法包括如下的方法步驟 a)將編碼來(lái)自酵母的甘油3-磷酸脫氫酶的核酸序列導(dǎo)入油料作物中， b)在油料作物中表達(dá)由該核酸編碼的甘油3-磷酸脫氫酶， c)篩選其中總含油量按重量計(jì)比非轉(zhuǎn)基因植物提高至少25％的那些油料作物。
有利地，轉(zhuǎn)基因油料作物包含按重量計(jì)占總脂肪酸含量至少21、22、23、24或25％的油酸，優(yōu)選按重量計(jì)占總脂肪酸含量至少26、27、28、29或30％的油酸，更優(yōu)選按重量計(jì)占總脂肪酸含量至少35、40、45、50、55或60％的油酸，特別優(yōu)選按重量計(jì)占總脂肪酸含量至少61、62、63、64、65、66、67、68、69或70％的油酸或者更多。此外，有利于本發(fā)明的方法的植物還具有按重量計(jì)不超過(guò)總脂肪酸含量的30、29、28、27或26％的優(yōu)選棕櫚酸含量，優(yōu)選按重量計(jì)為總脂肪酸含量的25、24、23、22、21或20％的棕櫚酸，尤其優(yōu)選按重量計(jì)為總脂肪酸含量的15、14、13、12、11、10或9％的棕櫚酸。其它優(yōu)選的植物具有按重量計(jì)為總脂肪酸含量的至少20、25、30、35、40、45或50％的亞油酸，優(yōu)選按重量計(jì)為總脂肪酸含量的55、60、65或70％的亞油酸，優(yōu)選的植物還可以以上述脂肪酸的組合為特征，其中總脂肪酸含量按重量計(jì)為100％。
作為該方法的結(jié)果，該轉(zhuǎn)基因油料作物中的總含油量按重量計(jì)被提高至少26、27、28、29或30％，優(yōu)選按重量計(jì)被提高至少31、32、33、34或35％，更優(yōu)選按重量計(jì)被提高至少36、37、38、39或40％，特別地更優(yōu)選按重量計(jì)被提高至少41、42、43、44或45％。
本方法中使用的優(yōu)選的油料作物在種子中具有高含油量。優(yōu)選的植物具有按重量計(jì)，至少20、25、30、35或40％的含油量，更優(yōu)選按重量計(jì)至少41、42、43、44或45％的含油量，特別優(yōu)選按重量計(jì)至少46、47、48、49或50％的含油量或者更高。
本方法中優(yōu)選的油料作物生產(chǎn)油、脂質(zhì)和/或游離脂肪酸，其包含按重量計(jì)小于4、3、2或1％，優(yōu)選按重量計(jì)小于0.9、0.8、0.7、0.6或0.5％，更優(yōu)選按重量計(jì)小于0.4、0.3、0.2、0.1或0.09％或者更少的豆蔻酸。進(jìn)一步優(yōu)選的油料作物包含按重量計(jì)小于5、4或3％的棕櫚酸和/或按重量計(jì)小于2、1.5或1％的硬脂酸。
優(yōu)選的油料作物應(yīng)該不僅在種子中有高的含油量，并且在種子中有低蛋白質(zhì)含量。如果可能，此蛋白質(zhì)含量應(yīng)該按重量計(jì)小于30、25或20％，優(yōu)選按重量計(jì)小于19、18、17、16或15％。
本方法優(yōu)選的油料作物的優(yōu)選特征是當(dāng)G3PDH編碼核酸序列被導(dǎo)入之后，C16:0、C16:3、C18:0、C18:1、C18:2、C18:3和C20:0脂肪酸的脂肪酸譜沒(méi)有顯著的改變，也就是說(shuō)，以總脂肪酸含量的重量百分比提及的各個(gè)脂肪酸的相對(duì)百分?jǐn)?shù)基本上維持相同?；旧舷嗤钢舅岚俜?jǐn)?shù)的變化小于5個(gè)百分點(diǎn)。
本方法使用的植物優(yōu)選具有高的每公頃油產(chǎn)量。該油產(chǎn)量為至少100、110、120、130、140或150 kg油/ha，優(yōu)選至少250、300、350、400、450或500 kg油/ha，優(yōu)選至少550、600、650、700、750、800、850、900或950 kg料/ha，特別優(yōu)選至少1000 kg油/ha或者更高。
適合于本發(fā)明方法的植物原則上是所有的可栽培油料作物。本發(fā)明方法優(yōu)選使用的油料作物選自漆樹(shù)科(Anacardiaceae)、棕櫚科(Arecaceae)、菊科(Asteraceae)、十字花科(Brassicaceae)、大麻科(Cannabaceae)、大戟科(Euphorbiaceae)、豆科(Fabaceae)、胡桃科(Juglandaceae)、亞麻科(Linaceae)、千屈菜科(Lythraceae)、木犀科(Oleaceae)、禾本科(Poaceae)和薔薇科(Rosaceae)中天然已經(jīng)具有高的含油量和/或已經(jīng)被用于工業(yè)上回收油的植物。
本發(fā)明方法使用的植物特別有利地選自下述屬和種的油料作物腰果(Anacardium occidentale)、落花生(Arachis hypogaea)、琉璃苣(Boragoofficinalis)、蕓苔(Brassica campestris)、歐洲油菜(Brassica napus)、蕪青(Brassica rapa)、芥菜(Brassica juncea)、亞麻薺(Camelina sativa)、大麻(Cannabis sativa)、紅花(Carthamus tinctorius)、椰子(Cocosnucifera)、海甘藍(lán)(Crambe abyssinica)、Cuphea ciliata、油棕(Elaeisguineensis)、大豆(Glycine max)、陸地棉(Gossypium hirsitum)、海島棉(Gossypium barbadense)、草棉(Gossypium herbaceum)、向日葵(Helianthus annus)、亞麻(Linum usitatissimum)、月見(jiàn)草(Oenotherabiennis)、油橄欖(Olea europaea)、蓖麻(Ricinus communis)、玉蜀黍(Zea mays)、核桃(Juglans regia)和扁桃(Prunus dulcis)、特別優(yōu)選蕓苔、歐洲油菜、蕪青、芥菜、亞麻薺、向日葵、亞麻和紅花，更優(yōu)選蕓苔、歐洲油菜、蕪青、芥菜和亞麻薺。
在本方法中，種子特異性地異源表達(dá)酵母gpd1p基因?qū)е略趦?yōu)選的十字花科植物中如上所述的顯著提高的含油量，例如在歐洲油菜中，特別地在種子中。含油量的增加優(yōu)選引起甘油三酯(儲(chǔ)備油)的增加。在3個(gè)獨(dú)立株系中，與野生型對(duì)照植物相比較，含油量被提高了大約35％(圖4)。有利地，來(lái)自酵母的甘油3-磷酸脫氫酶的轉(zhuǎn)基因表達(dá)沒(méi)有顯示出對(duì)于轉(zhuǎn)化的油料作物的生長(zhǎng)或者其它特性有副作用，該油料作物例如油籽油菜。
已經(jīng)表明通過(guò)增加G3PDH活性可以獲得優(yōu)選地甘油三酯(儲(chǔ)備油)含量的增加。在根據(jù)本發(fā)明的方法中，不僅僅是含油量，而且優(yōu)選地，甘油3-磷酸的含量也被提高，優(yōu)選地在表達(dá)G3PDH的油料作物的成熟種子中，優(yōu)選在轉(zhuǎn)基因十字花科植物中。甘油3-磷酸是甘油三酯生物合成的重要的前體，并且因此是提高油料作物中(特別是種子中)的含油量所必要的前體。
為了本發(fā)明的目的，植物或者油料作物包括植物細(xì)胞和植物的某些組織、器官和部分、繁殖材料(例如種子、塊莖和果實(shí))或者植物的種子，以及植物的所有方面，例如花藥、纖維、根毛、莖、葉、胚、愈傷組織、子葉、葉柄、枝條、幼苗、農(nóng)作物材料、植物組織、繁殖組織和衍生自實(shí)際的轉(zhuǎn)基因植物和/或可以被用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的細(xì)胞培養(yǎng)物。也包括成熟的植物。成熟的植物應(yīng)理解為在幼苗之上的任何發(fā)育階段的植物。幼苗指在發(fā)育階段早期的幼小的不成熟植物。
“植物”包括所有的一年生和多年生單子葉植物和雙子葉植物，并且包括上述優(yōu)選的油料作物。
優(yōu)選的單子葉植物特別地選自單子葉農(nóng)作物，例如禾本科，例如玉蜀黍。
在根據(jù)本發(fā)明的方法中，優(yōu)選使用雙子葉油料作物。優(yōu)選的雙子葉植物特別地選自雙子葉農(nóng)作物，例如 -菊科，例如向日葵、萬(wàn)壽菊(tagetes)或者金盞菊(calendula)和其它， -十字花科，特別是蕓苔屬，更特別是下述種歐洲油菜(油籽油菜(oil seed rape)、Brassica napus var.napus或Brassica rapa ssp.Oleifera(canola)、芥菜(印度芥菜(Indian mustard))、亞麻薺(false flax)及其它， -豆科(Leguminosae)，特別是大豆屬(Glycine)，更特別是大豆(Glycine max)、

豆(Glycine soya)或者花生及其它。
和亞麻、大豆、棉或者大麻。
具有提高的含油量的轉(zhuǎn)基因植物可以被直接上市而不必分離合成的油。在根據(jù)本發(fā)明的方法中，植物應(yīng)理解為指整個(gè)植株，并且也指所有的植物部分，植物器官或者植物部分例如葉、莖、種子、根、塊莖、花藥、纖維、根毛、莖、胚、愈傷組織、子葉、葉柄、農(nóng)作物材料、植物組織、繁殖組織、衍生自轉(zhuǎn)基因植物和/或可以被用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的細(xì)胞培養(yǎng)物。種子包括種子的所有部分，例如種皮、表皮細(xì)胞和種子細(xì)胞、胚乳或者胚胎組織。然而，根據(jù)本發(fā)明的方法產(chǎn)生的油也可以從植物中以油、脂肪、脂質(zhì)和/或游離脂肪酸的形式分離。由該方法產(chǎn)生的油可以通過(guò)從生長(zhǎng)植物的培養(yǎng)物或者從田間收獲植物而獲得。這可以通過(guò)壓榨或者提取植物部分，優(yōu)選植物的種子而完成。這里，油可以通過(guò)無(wú)熱量輸入的“冷攪打或者冷壓榨”方法壓榨而獲得。植物部分，特別是種子可以預(yù)先粉碎、蒸汽處理或者烘烤，以便它們可以被更容易地消化。然后，以這種方式預(yù)處理的種子可以使用溶劑進(jìn)行壓榨或者提取，例如熱己烷。之后，再次移出溶劑。在這種方式中，可以分離由本發(fā)明方法產(chǎn)生的油的96％以上。由此獲得的產(chǎn)品然后可以進(jìn)一步加工，即，精煉。這里，首先，除去植物粘液和引起混濁的物質(zhì)?？梢酝ㄟ^(guò)酶法，或者通過(guò)例如添加酸(例如磷酸)的化學(xué)-物理方法進(jìn)行所謂的“脫除”(desliming)。此后，游離脂肪酸可以通過(guò)使用堿(例如氫氧化鈉溶液)處理而除去。為了除去仍然存在于產(chǎn)物中的堿，使用水徹底地洗滌獲得的產(chǎn)物，并且干燥。為了除去仍然存在于產(chǎn)物中的色素，可以使用例如漂白土或者活性炭漂白產(chǎn)物。最后，使用例如蒸氣對(duì)產(chǎn)物除臭。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是根據(jù)本發(fā)明的方法制備的油或者通過(guò)混合這些油和動(dòng)物、微生物或者植物油、脂質(zhì)或者脂肪酸獲得的油在飼料、食品、化妝品或者藥物中的用途。根據(jù)本發(fā)明的方法制備的油可以以本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方式用于與其它油、脂質(zhì)、脂肪酸或者動(dòng)物來(lái)源的脂肪酸混合物(例如魚油)混合。根據(jù)本發(fā)明制備的油中存在的脂肪酸(其通過(guò)使用堿處理已經(jīng)從油中釋放出來(lái))也可以以常用量添加到食品、飼料、化妝品和/或藥物中，其或者直接地加入或者在與其它油、脂質(zhì)、脂肪酸或者動(dòng)物來(lái)源的脂肪酸混合物(例如魚油)混合之后加入。
由本發(fā)明方法制備的油包含化合物，例如鞘脂、磷酸甘油酯、脂質(zhì)、糖脂、磷脂、甘油單酯、甘油二酯、甘油三酯或其它脂肪酸酯、優(yōu)選甘油三酯(參見(jiàn)表1)。
從根據(jù)本發(fā)明的方法如此制備的油中，可以例如通過(guò)使用堿(例如使用KOH或NaOH水溶液)處理，或者通過(guò)酸水解(優(yōu)選在存在例如甲醇或者乙醇等醇的情況下進(jìn)行)，或者通過(guò)酶切割，釋放存在于其中的飽和的和不飽和脂肪酸，并且例如通過(guò)相分離和隨后的例如使用H2SO4的酸化作用實(shí)施分離。脂肪酸也可以被直接的釋放而不需要上述的后處理。
術(shù)語(yǔ)“油”也應(yīng)理解為包括“脂質(zhì)”或者“脂肪”或者“脂肪酸混合物”，其包含不飽和、飽和，優(yōu)選酯化的脂肪酸，優(yōu)選結(jié)合甘油三酰的脂肪酸。針對(duì)本發(fā)明油而言，其是優(yōu)選的。油可以包含多種其它的飽和/或者不飽和脂肪酸，例如棕櫚酸、棕櫚油酸、硬脂酸、油酸、亞油酸或者α-亞油酸等等。特別地，取決于來(lái)源的植物，油中的不同的脂肪酸的含量可以變化。
“總含油量”應(yīng)理解為指所有的油、脂質(zhì)、脂肪或者脂肪酸混合物的總和，優(yōu)選所有的甘油三酯的總和。
“油”包含天然的和/或極性的脂質(zhì)和其混合物。在表1中提及的那些可以作為示例，但是是非限制性的。
表1植物脂質(zhì)的分類 中性脂質(zhì)優(yōu)選指甘油三酯。中性和極性脂質(zhì)都可以包含各種各樣的脂肪酸。在表2中提及的脂肪酸可以作為非限性實(shí)例 表2多種脂肪酸的概述(摘選) 1鏈長(zhǎng)度雙鍵的數(shù)目 +僅僅在非常少的植物屬中發(fā)生 ＊在高等植物中不天然存在 油優(yōu)選指種子油。
“提高”總含油量指提高植物中或者其部分、組織或者器官中的含油量，優(yōu)選提高植物的種子器官中的含油量。在本申請(qǐng)中，相比較于起始植物，含油量被提高至少25％，優(yōu)選至少30％，特別優(yōu)選至少35％，更特別優(yōu)選至少40％，最優(yōu)選至少45％或者更多，其中所述起始植物沒(méi)有接受根據(jù)本發(fā)明方法的處理，由此是未修飾的，但處于相同的條件下。本文中的條件指所有的與植物的萌發(fā)、培養(yǎng)或者生長(zhǎng)相關(guān)的條件，例如土壤條件、氣候條件、光照條件、受精、灌溉、植物保護(hù)處理等等。
提高油料作物中的甘油3-磷酸的含量應(yīng)理解為指提高植物或者植物的部分，植物的組織或者器官中的含量，優(yōu)選提高植物的種子中的含量。這里，相比較于起始植物，甘油3-磷酸的含量按重量計(jì)被提高至少25、30、35、40、45或50％，優(yōu)選至少60、70、80、90或100％，更優(yōu)選至少110、120、130、140或150％，，特別更優(yōu)選至少200、250或300％，最優(yōu)選至少350或400％或者更多，其中所述起始植物沒(méi)有接受根據(jù)本發(fā)明方法的處理并由此是未修飾的，但是處于相同的條件下。在此的條件指所有的與植物的萌發(fā)、培養(yǎng)或者生長(zhǎng)相關(guān)的條件，例如土壤條件、氣候條件、光照條件、受精、灌溉、植物保護(hù)處理等等。
“酵母甘油3-磷酸脫氫酶”(下文稱為酵母“G3PDH”)一般地指所有那些能夠在酵母中天然表達(dá)的、將二羥丙酮磷酸(DHAP)轉(zhuǎn)化為甘油3-磷酸(G3P)的酶(優(yōu)選使用共底物(例如NADH或NADPH))。
酵母指具有明確的細(xì)胞壁并且形成假菌絲體(相對(duì)于霉菌)的單細(xì)胞真菌群體。它們通過(guò)芽殖和/或裂體生殖(分別是裂殖酵母(Schizosaccharomyces)和類酵母(Saccharomycodes))而營(yíng)養(yǎng)繁殖。
包括所謂的擬酵母，優(yōu)選隱球酵母科(Cryptococcaceae)、擲孢酵母科(Sporobolomycetaceae)，包括隱球菌屬(Cryptococcus)、球擬酵母屬(Torulopsis)、瓶形酵母屬(Pityrosporum)、酒香酵母屬(Brettanomyces)、假絲酵母屬(Candida)、克勒克酵母屬(Kloeckera)、三角酵母屬(Trigonopsis)、絲孢酵母屬(Trichosporon)、紅酵母屬(Rhodotorula)和擲孢酵母屬(Sporobolomyces)和布勒彈孢酵母屬(Bullera)，和真酵母(也能進(jìn)行有性生殖的酵母；子囊)，優(yōu)選內(nèi)孢霉科(Endomycetaceae)和酵母科(Saccharomycetaceae)，包括酵母屬(Saccharomyces)、德巴利酵母屬(Debaromyces)、油脂酵母屬(Lipomyces)、漢遜酵母屬(Hansenula)、擬內(nèi)孢霉屬(Endomycopsis)、畢赤酵母屬(Pichia)、有孢漢遜酵母屬(Hanseniaspora)。最優(yōu)選的是釀酒酵母、巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)、多形漢遜酵母(Hansenulapolymorpha)、粟酒裂殖酵母、乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces lactis)、魯氏接合酵母、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolitica)、構(gòu)巢裸殼孢菌、構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)、漢遜德巴利酵母和Torulaspora hansenii。
酵母G3PDH特別指具有以下述特征作為“必要特征”的多肽 a)使用NADH作為共底物將二羥丙酮磷酸轉(zhuǎn)化為甘油3-磷酸(EC1.1.1.8)，和 b)包含至少一個(gè)選自以下的序列基序的肽序列 i)GSGNWGT(A/T)IAK(SEQ ID NO22) ii)CG(V/A)LSGAN(L/I/V)AXE(V/I)A(SEQ ID NO26) iii)(L/V)FXRPYFXV(SEQ ID NO27)。
優(yōu)選序列基序選自 iv)GSGNWGTTIAKV(V/I)AEN(SEQ ID NO29) v)NT(K/R)HQNVKYLP (SEQ ID NO30) vi)D(I/V)LVFN(I/V)PHQFL(SEQ ID NO31) vii)RA(I/V)SCLKGFE (SEQ ID NO32) viii)CGALSGANLA(P/T)EVA(SEQ ID NO33) ix)LFHRPYFHV (SEQ ID NO34) x)GLGEII(K/R)FG(SEQ ID NO35)。
肽序列特別優(yōu)選包含選自序列基序i)、ii)和iii)或者選自序列基序iv)、v)、vi)、vii)、viii)、ix)和x)的至少2或者3個(gè)，更特別優(yōu)選至少4或者5個(gè)，最優(yōu)選所有的序列基序。(括號(hào)中的術(shù)語(yǔ)指可以在這個(gè)位點(diǎn)作為供選方案的氨基酸，例如(V/I)指纈氨酸或者異亮氨酸可以在這個(gè)位點(diǎn)。序列表在每種情況下僅僅提及一種可能的變體)。
另外，除了上述序列基序i)至x)的至少一個(gè)外，酵母G3PDH還可以任選地包含選自以下的另外的序列基序 m)H(E/Q)NVKYL (SEQ ID NO23) n)(D/N)(I/V)(L/I)V(F/W)(V/N)(L/I/V)PHQF)(V/L/I) (SEQ ID NO24) o)(A/G)(I/V)SC(L/I)KG (SEQ ID NO25) p)G(L/M)(L/G)E(M/I)(I/Q)(R/K/N)F(G/S/A) (SEQ ID NO28)。
最優(yōu)選，酵母G3PDH指如在SEQ ID NO2中顯示的酵母蛋白質(zhì)Gpd1p和其功能等價(jià)物，以及它們的功能等價(jià)部分。功能等價(jià)部分應(yīng)理解為指長(zhǎng)度具有至少51、60、90或120 bp，優(yōu)選具有至少210、300、330、420或450 bp，更優(yōu)選具有至少525、540、570或600 bp，特別地更優(yōu)選具有至少660、720、810、900或1101 bp或者更長(zhǎng)的序列。
功能等價(jià)物特別指如在SEQ ID NO2中顯示的酵母蛋白質(zhì)Gpd1p的天然或者人工突變體以及來(lái)自其它酵母并具有與如上定義的酵母G3PDH基本相同的特征的同源多肽。突變包括替代、添加、缺失、倒位或者插入一個(gè)或者多個(gè)氨基酸殘基。特別地優(yōu)選由SEQ ID NO4、SEQ ID NO5、SEQID NO7、SEQ ID NO9、SEQ ID NO11、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、SEQ ID NO16、SEQ ID NO38或SEQ ID NO40公開(kāi)的多肽。
可以使用SEQ ID NO2中顯示的示例性酵母G3PDH序列，或者使用SEQ ID NO1中顯示的編碼其的核酸序列，作為檢索序列或者探針，通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索或者通過(guò)篩選基因或者cDNA文庫(kù)，容易地找到屬于本發(fā)明范圍內(nèi)的優(yōu)選使用的酵母G3PDH。
所述的功能等價(jià)物優(yōu)選具有與SEQ ID NO2所示的蛋白質(zhì)至少50或60％，特別優(yōu)選至少70或80％，更特別優(yōu)選至少85或90％，最優(yōu)選至少91、92、93、94、95或96％或者更高的同源性。
兩個(gè)多肽之間的同源性應(yīng)理解為指在整個(gè)序列長(zhǎng)度上的氨基酸序列的同一性，其通過(guò)使用設(shè)置如下參數(shù)的GAP算法程序(Wisconsin PackageVersion 10.0，University of Wisconsin，Genetics Computer Group(GCG)，Madison，USA)通過(guò)序列比較而計(jì)算得出 空位權(quán)重(Gap Weight)8 長(zhǎng)度權(quán)重(Length Weight)2 平均匹配(Average Match)2,912 平均錯(cuò)配(Average Mismatch)-2,003。
例如，在蛋白質(zhì)水平上與SEQ ID NO2的序列具有至少80％同源性的序列應(yīng)理解為指當(dāng)在上述算法程序以及上述參數(shù)設(shè)置中與序列SEQ IDNO2比較時(shí)，具有至少80％同源性的序列。
功能等價(jià)物也包括由下述核酸序列編碼的蛋白質(zhì)，該核酸序列具有與SEQ ID NO1的核酸序列至少60、70或80％，優(yōu)選85、87、88、89或90％，特別優(yōu)選至少91、92、93、94或95％，最優(yōu)選至少96、97、98或99％的同源性。
兩個(gè)核酸序列之間的同源性應(yīng)理解為指在相應(yīng)的整個(gè)序列長(zhǎng)度上的兩個(gè)核酸序列的同一性，其通過(guò)使用設(shè)置如下參數(shù)的GAP算法程序(Wisconsin Package Version 10.0，University of Wisconsin，GeneticsComputer Group(GCG)，Madison，USA；Altschul等人(1997)NucleicAcids Res.253389 et seq.)通過(guò)序列比較而計(jì)算得出 空位權(quán)重50 長(zhǎng)度權(quán)重3 平均匹配10 平均錯(cuò)配0。
例如，在核酸水平上與SEQ ID NO1的序列具有至少80％同源性的序列應(yīng)理解為指當(dāng)在具有上述參數(shù)設(shè)置的上述算法程序中與SEQ ID NO1的序列比較時(shí)，具有至少80％同源性的序列。
功能等價(jià)物也包括由能夠在標(biāo)準(zhǔn)條件下與SEQ ID NO1的核酸序列、其互補(bǔ)核酸序列或者它們的部分雜交并且具有酵母G3PDH的必要特征的核酸序列編碼的蛋白質(zhì)。
“標(biāo)準(zhǔn)的雜交條件”應(yīng)作廣義理解，并且指嚴(yán)謹(jǐn)?shù)暮洼^不嚴(yán)謹(jǐn)?shù)碾s交條件。這樣的雜交條件例如描述在Sambrook J，F(xiàn)ritsch EF，Maniatis T等人，分子克隆(實(shí)驗(yàn)室指南)(Molecular Cloning(A Laboratory Manual))，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989，頁(yè)碼9.31-9.57)，或者在Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6中。
例如，在洗滌步驟中的條件可以選自低嚴(yán)謹(jǐn)條件(在50℃，大約2XSSC)至高嚴(yán)謹(jǐn)條件(在50℃，大約0.2X SSC，優(yōu)選在65℃)的范圍(20XSSC0.3M檸檬酸鈉，3M NaCl，pH 7.0)。在雜交過(guò)程中也可以使用變性劑，例如甲酰胺或者SDS。在存在50％的甲酰胺的情況下，雜交優(yōu)選在42℃實(shí)施。
在根據(jù)本發(fā)明的方法中，使用的核酸序列有利地被導(dǎo)入如下轉(zhuǎn)基因表達(dá)構(gòu)建體中，該構(gòu)建體可以確保酵母G3PDH在植物或者植物的組織、器官、部分、細(xì)胞或者繁殖材料中進(jìn)行轉(zhuǎn)基因表達(dá)。
在該表達(dá)構(gòu)建體中，優(yōu)選地編碼酵母G3PDH的核酸分子可操作地與至少一個(gè)遺傳調(diào)控元件(例如啟動(dòng)子和/或終止子)連接，所述元件確保核酸在植物生物體或者植物的組織、器官、部分、細(xì)胞或者繁殖材料中表達(dá)。
特別優(yōu)選使用的轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒是包含選自以下的編碼甘油3-磷酸脫氫酶的核酸序列的表達(dá)盒 a)SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQID NO10、SEQ ID NO13、SEQ ID NO15、SEQ ID NO37或SEQ IDNO39的序列，或 b)根據(jù)遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，衍生自SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQID NO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO13、SEQ ID NO15、SEQ ID NO37或SEQ ID NO39所示序列的序列，或者 d)具有與SEQ ID NO1的序列至少60％同一性的序列。
可操作的連接應(yīng)理解為指例如啟動(dòng)子和待表達(dá)的編碼酵母G3PDH的核酸序列(例如SEQ ID NO1中顯示的序列)，以及如果合適，另外的調(diào)控元件(例如終止子)以如下方式順序排列，所述方式使得當(dāng)該核酸序列被重組表達(dá)時(shí)，每個(gè)調(diào)控元件均可以發(fā)揮其功能。為了此目的，化學(xué)意義上的直接連接不是必需的。遺傳調(diào)控序列(例如增強(qiáng)子序列)也可以從更遠(yuǎn)分開(kāi)的位置上，或者實(shí)際上從其它的DNA分子上對(duì)靶序列發(fā)揮其功能。優(yōu)選的排列是這樣的，其中待重組表達(dá)的核酸序列位于作為啟動(dòng)子的序列之后，以便兩個(gè)序列彼此共價(jià)連接。啟動(dòng)子序列和待重組表達(dá)的核酸序列之間的距離優(yōu)選小于200個(gè)堿基對(duì)，特別優(yōu)選小于100個(gè)堿基對(duì)，更特別優(yōu)選小于50個(gè)堿基對(duì)。
可操作的連接和轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒都可以通過(guò)常規(guī)的重組和克隆技術(shù)方法產(chǎn)生，例如在如下文獻(xiàn)中公開(kāi)的技術(shù)Maniatis T，F(xiàn)ritsch EF和SambrookJ(1989)分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南，Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSpring Harbor(NY)，Silhavy TJ，Berman ML und Enquist LW(1984)基因融合的實(shí)驗(yàn)(Experiments with Gene Fusions)，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor(NY)，Ausubel FM等人(1987)CurrentProtocols in Molecular Biology，Greene Publishing Assoc.和WileyInterscience，Gelvin等人(1990)植物分子生物學(xué)指南(Plant MolecularBiology Manual)。然而，另外的序列也可以位于這兩個(gè)序列之間，例如作為接頭的具有特定的限制性酶剪切位點(diǎn)的序列，或者作為信號(hào)肽的序列。而且，序列的插入可以導(dǎo)致融合蛋白的表達(dá)。優(yōu)選地，包含連接有啟動(dòng)子的待表達(dá)核酸序列的表達(dá)盒可以是載體-整合的形式，并且可以例如通過(guò)轉(zhuǎn)化插入到植物基因組中。
然而，表達(dá)盒也應(yīng)理解為指那些構(gòu)建體，其中編碼酵母G3PDH的核酸序列被放置在內(nèi)源性啟動(dòng)子的后面，由此使得啟動(dòng)子可以引發(fā)酵母G3PDH的表達(dá)。
優(yōu)選導(dǎo)入到轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒中的啟動(dòng)子是在植物生物體或者植物的組織、器官、部分、細(xì)胞或者繁殖材料中有效的啟動(dòng)子。在植物生物體中有效的啟動(dòng)子應(yīng)理解為原則上指能夠控制基因(特別是外源基因)在植物或者植物部分、植物細(xì)胞、植物組織或者植物培養(yǎng)物中表達(dá)的任何的啟動(dòng)子。在本文中，表達(dá)可以是例如組成型的、可誘導(dǎo)的或者發(fā)育依賴的。
優(yōu)選 a)組成型啟動(dòng)子 “組成型”啟動(dòng)子指確保在大量的(優(yōu)選全部的)組織中，在大部分的植物發(fā)育期(優(yōu)選在植物發(fā)育的所有時(shí)間)中表達(dá)的那些啟動(dòng)子(Benfey等人(1989)EMBO J 82195-2202)。特別優(yōu)選使用植物啟動(dòng)子或者來(lái)源于植物病毒的啟動(dòng)子。特別優(yōu)選CaMV(花椰菜花葉病毒)35S轉(zhuǎn)錄物的啟動(dòng)子(Franck等人(1980)Cell 21285-294；Odell等人(1985)Nature313810-812；Shewmaker等人(1985)Virology 140281-288；Gardner等人(1986)Plant Mol Biol 6221-228)，或者19S CaMV啟動(dòng)子(US 5,352,605；WO 84/02913；Benfey等人(1989)EMBO J 82195-2202)。其它合適的組成型啟動(dòng)子是核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶小亞基(SSU)啟動(dòng)子(US 4,962,028)、豆球蛋白B啟動(dòng)子(GenBank Acc.No.X03677)，來(lái)自農(nóng)桿菌的胭脂氨酸合酶啟動(dòng)子，TR雙啟動(dòng)子，來(lái)自農(nóng)桿菌的OCS(章魚氨酸合酶)啟動(dòng)子，泛素啟動(dòng)子(Holtorf S等人(1995)Plant Mol Biol29637-649)，泛素1啟動(dòng)子(Christensen等人(1992)Plant Mol Biol 18675-689；Bruce等人(1989)Proc Natl Acad Sci USA 869692-9696)，Smas啟動(dòng)子，桂醇脫氫酶啟動(dòng)子(US 5,683,439)，液泡ATPase亞基啟動(dòng)子，擬南芥腈水解酶1基因啟動(dòng)子(GenBank Acc.No.U38846，核苷酸3862至5325或者5342)或者來(lái)自小麥的富含脯氨酸的蛋白質(zhì)的啟動(dòng)子(WO 91/13991)，以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的在植物中組成型表達(dá)的其它的基因啟動(dòng)子。優(yōu)選CaMV 35S啟動(dòng)子和擬南芥腈水解酶-1啟動(dòng)子。
b)組織特異性啟動(dòng)子 另外優(yōu)選的啟動(dòng)子是具有種子特異性的啟動(dòng)子，例如菜豆蛋白啟動(dòng)子(US 5,504,200；Bustos MM等人(1989)Plant Cell 1(9)839-53)，2S白蛋白基因啟動(dòng)子(Joseffson LG等人(1987)J Biol Chem 26212196-12201)，豆球蛋白啟動(dòng)子(Shirsat A等人(1989)Mol Gen Genet 215(2)326-331)，USP(未知種子蛋白質(zhì))啟動(dòng)子(

H等人(1991)Mol Gen Genet 225(3)459-67)，油菜籽蛋白基因啟動(dòng)子(US 5,608,152；Stalberg K等人(1996)L Planta 199515-519)，蔗糖結(jié)合蛋白啟動(dòng)子(WO 00/26388)或者豆球蛋白B4啟動(dòng)子(LeB4；

H等人(1991)Mol Gen Genet 225121-128；

等人(1992)Plant Journal 2(2)233-9；Fiedler U等人(1995)Biotechnology(NY)13(10)1090f)，擬南芥屬植物的油質(zhì)蛋白啟動(dòng)子(WO 98/45461)，和蕓苔屬Bce4啟動(dòng)子(WO 91/13980)。
其它合適的種子特異性啟動(dòng)子是編碼高分子量麥谷蛋白(HMWG)，麥醇溶蛋白，分支酶，ADP葡萄糖焦磷酸酶(AGPase)或者淀粉合酶的基因的啟動(dòng)子。其它優(yōu)選的啟動(dòng)子是允許在單子葉植物(例如玉蜀黍、大麥、小麥、黑麥、稻等等)中種子特異性表達(dá)的啟動(dòng)子。可以有利的使用lpt2或lpt1基因的啟動(dòng)子(WO 95/15389，WO 95/23230)，或者在WO 99/16890中公開(kāi)的啟動(dòng)子(大麥醇溶蛋白基因，谷蛋白基因，水稻素基因，谷醇溶蛋白(prolamin)基因，麥醇溶蛋白基因，麥谷蛋白基因，玉米醇溶蛋白基因，casirin基因或裸麥醇溶蛋白基因的啟動(dòng)子)。
c)化學(xué)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子 表達(dá)盒還可以包含化學(xué)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(綜述文章Gatz等人(1997)Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 4889-108)，通過(guò)該啟動(dòng)子，外源基因在植物中的表達(dá)可以被控制在特定的時(shí)間點(diǎn)。同樣可以使用這樣的啟動(dòng)子，例如PRP1啟動(dòng)子(Ward等人(1993)Plant Mol Biol 22361-366)，水楊酸誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(WO 95/19443)，苯磺酰胺誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(EP 0 388186)，四環(huán)素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(Gatz等人(1992)Plant J 2397-404)，脫落酸誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(EP 0 335 528)或者乙醇-或環(huán)己酮誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(WO 93/21334)。也適合的啟動(dòng)子是谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶同種型II基因(GST-II-27)的啟動(dòng)子，其可以通過(guò)外部使用的安全劑(例如N，N-二烯丙基-2，2-二氯乙酰胺(W0 93/01294))而被激活，并且其在大量的單子葉植物和雙子葉植物的組織中都是有效的。
特別優(yōu)選的是組成型啟動(dòng)子，并且特別更優(yōu)選的是種子特異性啟動(dòng)子，特別是油菜籽蛋白啟動(dòng)子和USP啟動(dòng)子。
另外，使得在其它的植物組織或者在其它的生物體(例如大腸桿菌)中表達(dá)成為可能的其它的啟動(dòng)子也可以與待表達(dá)的核酸序列可操作地連接。合適的植物啟動(dòng)子原則上是所有上述的啟動(dòng)子。
除啟動(dòng)子之外存在于轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒或者載體中的核酸序列還可以與其它的遺傳調(diào)控序列可操作地連接。術(shù)語(yǔ)遺傳調(diào)控序列應(yīng)廣義地理解，并且指所有的那些對(duì)根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)盒的組建和功能有作用的序列。遺傳調(diào)控序列修飾例如在原核生物或者真核生物中的轉(zhuǎn)錄和翻譯。根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)盒優(yōu)選包含位于待重組表達(dá)的核酸序列5’上游的植物特異性啟動(dòng)子和其它的遺傳調(diào)控序列，即，位于3’下游的終止子序列，以及如果合適，其它的常規(guī)調(diào)控元件，其中這些常規(guī)調(diào)控元件每一個(gè)都與待重組表達(dá)的核酸序列可操作地連接。
遺傳調(diào)控序列還包括其它的啟動(dòng)子，啟動(dòng)子元件或者能夠修飾表達(dá)調(diào)控特性的最小啟動(dòng)子。因此，遺傳調(diào)控序列可以例如引起額外地依賴于某些脅迫因子的組織特異性表達(dá)。這樣的元件例如是公開(kāi)的針對(duì)水脅迫、脫落酸脅迫(Lam E和Chua NH，J Biol Chem 1991；266(26)17131-17135)和熱脅迫(Schoffl F等人(1989)Mol Gen Genetics 217(2-3)246-53)的元件。
其它有利的調(diào)控序列例如是革蘭氏陽(yáng)性啟動(dòng)子amy和SPO2，以及酵母或真菌的啟動(dòng)子ADC1、MFa、AC、P-60、CYC1、GAPDH、TEF、rp28、ADH。
原則上，所有的天然啟動(dòng)子及其調(diào)控序列，如上述的那些，均可以用于根據(jù)本發(fā)明的方法。另外，也可以方便地使用合成的啟動(dòng)子。
遺傳調(diào)控序列還可以包括基因的5’非翻譯區(qū)、內(nèi)含子或者非編碼3’區(qū)，例如肌動(dòng)蛋白1內(nèi)含子或Adh1-S內(nèi)含子1、2和6(關(guān)于一般地參考，參見(jiàn)The Maize Handbook，Chapter 116，F(xiàn)reeling和Walbot，Eds.，Springer，New York(1994))。已經(jīng)證明這些在調(diào)控基因表達(dá)中可以發(fā)揮重要的作用。因此，5’非翻譯區(qū)序列已經(jīng)被證明可以增強(qiáng)異源基因的瞬時(shí)表達(dá)。以實(shí)例的方式提及的翻譯增強(qiáng)子是煙草花葉病毒5’前導(dǎo)序列(Gallie等人(1987)Nucl Acids Res 158693-8711)等等。而且它們還可以促進(jìn)組織特異性(Rouster J等人(1998)Plant J 15435-440)。
表達(dá)盒可以方便地包含一個(gè)或者多個(gè)所謂的增強(qiáng)子序列與啟動(dòng)子可操作連接，并且這使得提高核酸序列的重組表達(dá)成為可能。另外的有利的序列(例如其它的調(diào)控元件或者終止子)也可以被插入到待重組表達(dá)的核酸序列的3’末端。在基因構(gòu)建體中可以存在一個(gè)或者多個(gè)待重組表達(dá)的核酸序列的拷貝。
適合作為調(diào)控序列的多腺苷酸化信號(hào)是植物多腺苷酸化信號(hào)，優(yōu)選基本上對(duì)應(yīng)于根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)T-DNA多腺苷酸化信號(hào)的那些，特別是Ti質(zhì)粒pTiACHS的T-DNA(章魚氨酸合酶)的基因3的多腺苷酸化信號(hào)或者其功能等價(jià)物(Gielen等人(1984)EMBO J 3835以及以下頁(yè))。特別合適的終止子序列的實(shí)例是OCS(章魚氨酸合酶)終止子和NOS(胭脂氨酸合酶)終止子。
調(diào)控序列應(yīng)理解為指使得可以在宿主生物體的基因組中實(shí)現(xiàn)同源重組或者插入或者去除的那些序列。在同源重組的情況中，例如特定的內(nèi)源基因的編碼序列可以以定向的方式被置換為編碼dsRNA的序列。例如cre/lox技術(shù)等方法允許從宿主生物體基因組中組織特異地，可能地可誘導(dǎo)地，除去表達(dá)盒(Sauer B(1998)Methods.14(4)381-92)。在此，將某些側(cè)翼序列添加到靶基因的兩側(cè)(lox序列)，并且在稍后的時(shí)間可以通過(guò)cre重組酶實(shí)現(xiàn)去除。
表達(dá)盒和衍生自其的載體可以包含其它功能元件。術(shù)語(yǔ)功能元件應(yīng)廣義地理解，并且指所有的那些對(duì)本發(fā)明的表達(dá)盒、載體或者轉(zhuǎn)基因生物體的產(chǎn)生、復(fù)制或者功能有作用的元件?？梢蕴峒暗姆窍拗茖?shí)例是 a)選擇標(biāo)記，其賦予對(duì)代謝抑制劑(例如2-脫氧葡萄糖6-磷酸(WO 98/45456))、抗生素或者殺生物劑，優(yōu)選除草劑、例如卡那霉素、G 418、博來(lái)霉素、潮霉素或者膦絲菌素等等的抗性。特別優(yōu)選的選擇標(biāo)記是那些賦予對(duì)除草劑抗性的標(biāo)記。下述可以以舉例的方式被提及編碼膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶(PAT)以及失活谷氨酰胺合酶抑制劑的DNA序列(bar和pat基因)，5-烯醇式丙酮酰莽草酸3-磷酸合酶基因(EPSP合酶基因)(其賦予對(duì)Glyphosate

(N-(膦酰甲基)甘氨酸)的抗性)，gox基因(其編碼Glyphosate

-降解酶(N-膦酰甲基甘氨酸氧化還原酶))，deh基因(編碼失活茅草枯的脫鹵素酶)，失活磺酰脲和咪唑啉酮的乙酰乳酸合酶和bxn基因(其編碼降解溴苯腈的腈水解酶)，aasa基因(其賦予對(duì)抗生素apectinomycin的抗性)，鏈霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(SPT)基因(其允許對(duì)鏈霉素的抗性)，新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(NPTII)基因(其賦予對(duì)卡那霉素或遺傳霉素的抗性)，潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(HPT)基因(其賦予對(duì)潮霉素的抗性)，乙酰乳酸合酶基因(ALS)(其賦予對(duì)磺酰脲除草劑的抗性)(例如突變的ALS變體，具有例如S4和/或Hra突變)。
b)編碼容易計(jì)量的如下蛋白質(zhì)的報(bào)道基因，該蛋白質(zhì)通過(guò)其內(nèi)在的顏色或者酶活性使得可以評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)化效率或者表達(dá)位點(diǎn)或者時(shí)間。本發(fā)明中非常特別優(yōu)選的是報(bào)道蛋白質(zhì)(Schenborn E，Groskreutz D.Mol Biotechnol.1999；13(1)29-44)，例如“綠色熒光蛋白質(zhì)(GFP)(Sheen等人(1995)Plant Journal 8(5)777-784)，氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶，螢光素酶(Ow等人(1986)Science 234856-859)，水母發(fā)光蛋白基因(Prasher等人(1985)Biochem Biophys Res Commun 126(3)1259-1268)，β-半乳糖苷酶，特別優(yōu)選β-葡糖醛酸糖苷酶(Jefferson等人(1987)EMBO J63901-3907)。
c)復(fù)制原點(diǎn)，其允許根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)盒或者載體在例如大腸桿菌中復(fù)制。可以被提及的實(shí)例是ORI(DNA復(fù)制原點(diǎn))，pBR322 ori或P15A ori(Sambrook等人分子克隆，實(shí)驗(yàn)室指南，第二版，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989)。
d)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化所需的元件，例如T-DNA的右或者左邊界，或者vir區(qū)。
為了選擇已經(jīng)成功進(jìn)行同源重組的細(xì)胞或者已經(jīng)被成功轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，通常還要求導(dǎo)入選擇標(biāo)記，其賦予已經(jīng)成功進(jìn)行重組的細(xì)胞對(duì)抗殺生物劑(例如除草劑)、代謝抑制劑(例如2-脫氧葡萄糖6-磷酸(WO 98/45456))或者抗生素的抗性。選擇標(biāo)記使得可以從未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中選擇轉(zhuǎn)化的細(xì)胞(McCormick等人(1986)植物細(xì)胞通訊(Plant Cell Reports)581-84)。
另外，重組表達(dá)盒或者表達(dá)載體還可以包括如下其它的核酸序列，該序列不編碼酵母G3PDH并且其重組表達(dá)導(dǎo)致脂肪酸生物合成的進(jìn)一步提高(作為proOIL的結(jié)果)。例如，但不限于，另外重組表達(dá)的該proOIL核酸序列可以選自編碼乙酰輔酶A羧化酶(ACCase)、甘油3-磷酸?；D(zhuǎn)移酶(GPAT)，溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶(LPAT)，二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶(DAGAT)和磷脂二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶(PDAT)的核酸。這些序列對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是已知的并且可以從數(shù)據(jù)庫(kù)或者從相應(yīng)植物的合適cDNA文庫(kù)中容易地獲得。
可以方便地通過(guò)使用存在有本發(fā)明表達(dá)盒的載體將該表達(dá)盒導(dǎo)入生物體或者其細(xì)胞、組織、器官、部分或者種子(優(yōu)選導(dǎo)入植物或者植物細(xì)胞、組織、器官、部分或者種子)。因此，本發(fā)明還涉及所述的包含酵母G3PDH的重組表達(dá)盒的重組載體。
例如，載體可以是質(zhì)粒、粘粒、噬菌體、病毒或者農(nóng)桿菌?？梢酝ㄟ^(guò)合適的限制性切割位點(diǎn)將表達(dá)盒導(dǎo)入載體(優(yōu)選質(zhì)粒載體)。獲得的載體首先導(dǎo)入大腸桿菌。選擇正確轉(zhuǎn)化的大腸桿菌并使其生長(zhǎng)，以及使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法獲得重組載體。可以使用限制性分析和測(cè)序驗(yàn)證該克隆步驟。優(yōu)選的載體是使得該表達(dá)盒可以穩(wěn)定整合至宿主基因組中的載體。
例如可以通過(guò)使用相應(yīng)的蛋白質(zhì)或者核酸，經(jīng)轉(zhuǎn)化或者轉(zhuǎn)染而產(chǎn)生這樣的轉(zhuǎn)基因植物生物體。轉(zhuǎn)化的生物體(或者轉(zhuǎn)化的細(xì)胞或者組織)的產(chǎn)生需要將目的DNA(例如表達(dá)載體)、RNA或者蛋白質(zhì)導(dǎo)入目的宿主細(xì)胞中?？梢垣@得針對(duì)此操作的大量的方法，該操作被稱為轉(zhuǎn)化(或者轉(zhuǎn)導(dǎo)或者轉(zhuǎn)染)(Keown等人(1990)酶學(xué)方法(Methods in Enzymology)185527-537)。因此，例如DNA或者RNA可以通過(guò)微注射或者通過(guò)使用DNA包被的微粒轟擊而被直接地導(dǎo)入。細(xì)胞也可以是以化學(xué)方式透化(例如使用聚乙二醇)，由此使得DNA可以通過(guò)擴(kuò)散而進(jìn)入細(xì)胞。也可以通過(guò)原生質(zhì)體與其它的含有DNA的單元(例如小細(xì)胞、細(xì)胞、溶酶體或者脂質(zhì)體)融合而攝入DNA。電穿孔是另外的適合于導(dǎo)入DNA的方法；在此，通過(guò)電脈沖可逆地將細(xì)胞通透化。也可以將植物部分浸泡在DNA溶液中，或者進(jìn)行花粉或者花粉管轉(zhuǎn)化。這些方法已經(jīng)被公開(kāi)(例如在Bilang等人(1991)Gene 100247-250；Scheid等人(1991)Mol Gen Genet 228104-112；Guerche等人(1987)Plant Science 52111-116；Neuhause等人(1987)Theor Appl Genet 7530-36；Klein等人(1987)Nature 32770-73；Howell等人(1980)Science 2081265；Horsch等人(1985)Science 2271229-1231；DeBlock等人(1989)Plant Physiology 91694-701；Methods for PlantMolecular Biology(Weissbach和Weissbach編輯)Academic Press Inc.(1988)；和植物分子生物學(xué)方法(Methods in Plant Molecular Biology)(Schuler和Zielinski編輯)Academic Press Inc.(1989))中)。
在植物中，已經(jīng)被公開(kāi)用于從植物組織或者植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化和再生植物的方法均可以用于瞬時(shí)或者穩(wěn)定轉(zhuǎn)化。合適的方法特別是通過(guò)聚乙二醇誘導(dǎo)的DNA攝入的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化、使用基因槍的生物射彈方法，所謂的微粒轟擊方法、電穿孔、將干胚孵育在含有DNA的溶液中和微注射方法。
除了這些“直接“的轉(zhuǎn)化技術(shù)，轉(zhuǎn)化也可以通過(guò)使用根癌農(nóng)桿菌或者發(fā)根農(nóng)桿菌(Agrobacterium rhizogenes)進(jìn)行細(xì)菌感染，以及通過(guò)使用轉(zhuǎn)基因植物病毒感染以轉(zhuǎn)移相應(yīng)的重組Ti質(zhì)?；蛘逺i質(zhì)粒而完成。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化最適合于雙子葉植物的細(xì)胞。該方法例如在Horsch RB等人(1985)Science 2251229f)中公開(kāi)。
當(dāng)使用農(nóng)桿菌時(shí)，將表達(dá)盒整合至特定的質(zhì)粒，或者穿梭載體、或者中間載體或者二元載體。如果將Ti或Ri質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)化，至少Ti或Ri質(zhì)粒T-DNA的右邊界(但是在大多數(shù)情況下右和左邊界)作為側(cè)翼區(qū)與待導(dǎo)入的表達(dá)盒連接。
優(yōu)選使用二元載體。二元載體能夠在大腸桿菌和農(nóng)桿菌中復(fù)制。通常，它們包含被右和左T-DNA邊界序列包圍的選擇標(biāo)記基因和接頭或者多接頭。它們可以被直接轉(zhuǎn)化入農(nóng)桿菌中(Holsters等人(1978)Mol Gen Genet163181-187)。選擇標(biāo)記基因例如是nptII基因，其賦予對(duì)卡那霉素的抗性，允許選擇轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌。在這種情況下，作為宿主生物體的農(nóng)桿菌應(yīng)該已經(jīng)包含具有vir區(qū)的質(zhì)粒。Vir區(qū)是將T-DNA轉(zhuǎn)移入植物細(xì)胞所必需的。以這樣的方式轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌可以被用于轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞。應(yīng)用T-DNA轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞已經(jīng)得到深入研究和公開(kāi)(EP 120 516；Hoekema，二元植物載體系統(tǒng)(The Binary Plant Vector System)，Offsetdrukkerij Kanters B.V.，Alblasserdam，Chapter V；An等人(1985)EMBO J 4277-287)。已知多種二元載體，其中一些是可以購(gòu)買的，例如pBI101.2或pBIN19(ClontechLaboratories，Inc.USA)。
已經(jīng)公開(kāi)了其它的適合在植物中表達(dá)的啟動(dòng)子(Rogers等人(1987)Meth in Enzymol 153253-277；Schardl等人(1987)Gene 611-11；Berger等人(1989)Proc Natl Acad Sci USA 868402-8406)。
直接轉(zhuǎn)化技術(shù)適用于任何的生物體和細(xì)胞類型。在DNA或者RNA被注射或者電穿孔入植物細(xì)胞的情況中，所用的質(zhì)粒不需要滿足任何的特定要求。可以使用簡(jiǎn)單的質(zhì)粒，例如來(lái)自pUC系列的質(zhì)粒。如果將從轉(zhuǎn)化的細(xì)胞再生完整的植物，另外的可選擇標(biāo)記基因必需存在于質(zhì)粒上。
當(dāng)可選擇標(biāo)記是插入的DNA的一部分時(shí)，可以從未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中選擇出穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，即那些包含整合入宿主細(xì)胞DNA中的插入DNA的細(xì)胞。舉例說(shuō)明，任何的能夠賦予對(duì)抗生素或者除草劑(例如卡那霉素、G418、博來(lái)霉素、潮霉素或者膦絲菌素等等)抗性的基因都能夠用作標(biāo)記(參見(jiàn)如上內(nèi)容)。表達(dá)這些標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)化的細(xì)胞能夠在存在可以殺死未轉(zhuǎn)化的野生型細(xì)胞的抗生素或者除草劑濃度的條件下存活。實(shí)例在上文提及，并且優(yōu)選包括bar基因，其賦予對(duì)除草劑膦絲菌素的抗性(Rathore KS等人(1993)Plant Mol Biol 21(5)871-884)；nptII基因，其賦予對(duì)卡那霉素的抗性；hpt基因，其賦予對(duì)潮霉素的抗性；或EPSP基因，其賦予對(duì)除草劑草甘膦(Glyphosate)的抗性。選擇標(biāo)記允許從未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中篩選轉(zhuǎn)化的細(xì)胞(McCormick等人(1986)，植物細(xì)胞通訊(Plant Cell Reports)581-84)。獲得的植物可以以常規(guī)方式進(jìn)行育種和雜交。為了確?；蚪M整合是穩(wěn)定的并且可遺傳的，應(yīng)該生長(zhǎng)兩代或者更多代。
上述方法被公開(kāi)在例如Jenes B等人(1993)基因轉(zhuǎn)移技術(shù)(Techniques for Gene Transfer)，轉(zhuǎn)基因植物(Transgenic Plants)，Vol.1，Engineering and Utilization，SD Kung和R Wu編輯，AcademicPress，pp.128-143，和Potrykus(1991)Annu Rev Plant Physiol Plant MolecBiol 42205-225)。優(yōu)選待表達(dá)的構(gòu)建體被克隆入適用于根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的載體，例如pBin19(Bevan等人(1984)Nucl Acids Res 128711f)。
一旦產(chǎn)生轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法可以獲得完整的植物。例如，愈傷組織培養(yǎng)物可以用作起始材料。使用已知的方式可以從這個(gè)仍然還是未分化的細(xì)胞團(tuán)誘導(dǎo)芽和根的發(fā)育。獲得的小植物可以移植到戶外并用于育種。
本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉這樣的用于從植物細(xì)胞再生植物部分和完整植物的方法?？梢杂糜谶@個(gè)目的的方法例如公開(kāi)在Fennell等人(1992)Plant CellRep.11567-570；Stoeger等人(1995)Plant Cell Rep.14273-278；Jahne等人(1994)Theor Appl Genet 89525-533。
“轉(zhuǎn)基因”或者“重組”，例如就核酸序列、含有所述核酸序列的表達(dá)盒或者載體、或者使用所述的核酸序列、表達(dá)盒或者載體轉(zhuǎn)化的生物體而言，指通過(guò)重組方法建立的這些構(gòu)建體，在此構(gòu)建體中 a)編碼酵母G3PDH的核酸序列，或者 b)與a)中所述的核酸序列可操作地連接的遺傳調(diào)控序列，例如在植物生物體中有功能的啟動(dòng)子，或者 c)(a)和(b) 不在它們的天然遺傳環(huán)境中，或者已通過(guò)重組方法修飾，其中修飾可以例如是替代、添加、缺失、倒位或者插入一個(gè)或者多個(gè)核苷酸殘基。天然的遺傳環(huán)境指在來(lái)源生物中的天然染色體座位、或者存在于基因組文庫(kù)中。在基因組文庫(kù)的情況下，優(yōu)選至少在一定程度上保留核酸序列的天然遺傳環(huán)境。該環(huán)境至少存在于核酸序列的一側(cè)，并且具有至少50 bp，優(yōu)選至少500 bp，特別優(yōu)選至少1000 bp，更特別優(yōu)選至少5000 bp的序列長(zhǎng)度。天然表達(dá)盒，例如天然發(fā)生的編碼酵母G3PDH的基因與啟動(dòng)子的組合，當(dāng)該基因被非天然的、合成(“人工”)的方法修飾時(shí)，變成轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒，所述的方法例如是誘變處理。這樣的方法被公開(kāi)在(US 5,565,350；WO 00/15815；也參見(jiàn)上文)。
優(yōu)選作為轉(zhuǎn)基因生物體的宿主或者起始生物體，首先是根據(jù)上文定義的植物。對(duì)于本發(fā)明目的，包括植物界單子葉植物和雙子葉植物的所有屬和種，特別是用于獲得油的植物，例如油籽油菜、向日葵、芝麻、紅花、橄欖樹(shù)、大豆、玉蜀黍和堅(jiān)果物種。另外還包括的是成熟的植物、種子、枝條和幼苗、以及衍生自其的部分、繁殖材料和培養(yǎng)物，例如細(xì)胞培養(yǎng)物。成熟植物指處于幼苗階段之上的任何期望發(fā)育階段的植物。幼苗指在早期發(fā)育階段的幼小的、未成熟的植物。
使用上述的用于轉(zhuǎn)化或者轉(zhuǎn)染生物體的方法可以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物。
本發(fā)明還涉及根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物，以及衍生自其的細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)物、部分(例如在轉(zhuǎn)基因植物的情況中根、葉等等)和轉(zhuǎn)基因繁殖材料(例如種子或者果實(shí))在生產(chǎn)食品或者飼料、化妝品或者藥物(特別是油、脂肪、脂肪酸或者這些的衍生物)中的直接應(yīng)用。為此目的，以常規(guī)的量將植物或植物部分加入到食品、飼料、化妝品、藥物或者具有工業(yè)應(yīng)用的產(chǎn)品中。而且，也可以從植物，優(yōu)選從種子中獲得油和/或如果合適的話，游離脂肪酸，并且將它們以常規(guī)的量加入到食品、飼料、化妝品、藥物或者具有工業(yè)應(yīng)用的產(chǎn)品中。
除了影響含油量，在植物中轉(zhuǎn)基因表達(dá)酵母G3PDH還可以進(jìn)一步給予另外的有利效果，例如提高的脅迫抗性，例如對(duì)滲透脅迫的抗性。通過(guò)提高的甘油水平，酵母G3PDH可以給予抵抗這種類型的脅迫的保護(hù)作用，其中甘油作為滲透保護(hù)物質(zhì)起作用。這樣的滲透脅迫例如發(fā)生于鹽土和鹽水中，并且這樣的脅迫是農(nóng)業(yè)中不斷增加的問(wèn)題。提高的脅迫耐性使得例如可以將常規(guī)可耕種植物在其上不能茁壯生長(zhǎng)的土地用于農(nóng)業(yè)使用。
另外，酵母G3PDH的重組表達(dá)可以影響植物生物體中的NADH水平，并因此影響植物生物體的氧化還原平衡。脅迫(例如干旱、高或者低溫、UV光等等)可以導(dǎo)致NADH水平增加并導(dǎo)致活性氧(RO)形成增加。酵母G3PDH的轉(zhuǎn)基因表達(dá)可以降解過(guò)剩的NADH(其在所述的脅迫條件下累積)，并因此穩(wěn)定氧化還原平衡和減輕脅迫的影響。
序列簡(jiǎn)述 1.SEQ ID NO1，編碼釀酒酵母G3PDH(Gpd1p)的核酸序列， 2.SEQ ID NO2，釀酒酵母G3PDH(Gpd1p)的蛋白質(zhì)序列， 3.SEQ ID NO3，編碼釀酒酵母G3PDH(Gpd2p)的核酸序列， 4.SEQ ID NO4，釀酒酵母G3PDH(Gpd2p)的蛋白質(zhì)序列， 5.SEQ ID NO5，從第二個(gè)可選起始密碼子起始的釀酒酵母G3PDH(Gpd2p)的蛋白質(zhì)序列， 6.SEQ ID NO6，編碼粟酒裂殖酵母G3PDH的核酸序列， 7.SEQ ID NO7，粟酒裂殖酵母G3PDH的蛋白質(zhì)序列， 8.SEQ ID NO8，編碼粟酒裂殖酵母G3PDH的核酸序列， 9.SEQ ID NO9，粟酒裂殖酵母G3PDH的蛋白質(zhì)序列， 10.SEQ ID NO10，編碼解脂耶氏酵母G3PDH的核酸序列， 11.SEQ ID NO11，解脂耶氏酵母G3PDH的蛋白質(zhì)序列， 12.SEQ ID NO12，從第二個(gè)可選起始密碼子起始的解脂耶氏酵母G3PDH的蛋白質(zhì)序列， 13.SEQ ID NO13，編碼魯氏接合酵母G3PDH的核酸序列， 14.SEQ ID NO14，魯氏接合酵母G3PDH的蛋白質(zhì)序列， 15.SEQ ID NO15，編碼魯氏接合酵母G3PDH的核酸序列， 16.SEQ ID NO16，魯氏接合酵母G3PDH的蛋白質(zhì)序列， 17.SEQ ID NO17，用于釀酒酵母G3PDH的以pSUN-USP為基礎(chǔ)的表達(dá)載體(Gpd1p；1017-2190 bp插入物)， 18.SEQ ID NO18，寡核苷酸引物OPN1， 5′-ACTAGTATGTCTGCTGCTGCTGATAG-3′， 19.SEQ ID NO19寡核苷酸引物OPN2， 5′-CTCGAGATCTTCATGTAGATCTAATT-3′， 20.SEQ ID NO20寡核苷酸引物OPN3， 5′-GCGGCCGCCATGTCTGCTGCTGCTGATAG-3′， 21.SEQ ID NO21寡核苷酸引物OPN4 5′-GCGGCCGCATCTTCATGTAGATCTAATT-3′， 22-35SEQ ID NP 22-35酵母G3PDH的序列基序，給出了可能的序列變異(參見(jiàn)上文)。每個(gè)基序的變異可以各自單獨(dú)地發(fā)生，但是也可以彼此以不同的組合方式發(fā)生。
36.SEQ ID NO36，用于釀酒酵母G3PDH的以pGPTV-油菜籽蛋白為基礎(chǔ)的表達(dá)載體pGPTV-gpd1(Gpd1p；11962-13137bp的gdp1插入物；nos終止子13154-13408；油菜籽蛋白啟動(dòng)子10807-11951)。
37.SEQ ID NO37，編碼構(gòu)巢裸殼孢菌G3PDH的核酸序列。
38.SEQ ID NO38，構(gòu)巢裸殼孢菌G3PDH的蛋白質(zhì)序列。
39.SEQ ID NO39，編碼漢遜德巴利酵母G3PDH的核酸序列(部分)， 40.SEQ ID NO40，漢遜德巴利酵母G3PDH的蛋白質(zhì)序列(部分)。
附圖簡(jiǎn)述

圖1Northern印跡，在轉(zhuǎn)基因油籽油菜株系(8、6、9和3)的成熟種子中對(duì)酵母GPD1基因的轉(zhuǎn)錄的檢測(cè)。作為對(duì)比，使用野生型(WT)植物實(shí)施相同的檢測(cè)。在株系8、6和9中檢測(cè)到GPD1轉(zhuǎn)錄物。在株系3中GPD1基因沒(méi)有表達(dá)。此株系作為額外的對(duì)照用于其它的分析中。
圖2在轉(zhuǎn)基因GPD1油籽油菜株系8、6和9的成熟種子(40 DAF＝開(kāi)花后天數(shù))中的甘油3-磷酸的量(黑色條)。作為對(duì)比，也確定了在對(duì)應(yīng)的未轉(zhuǎn)化的野生型植物(WT)和未表達(dá)的轉(zhuǎn)基因株系3中甘油3-磷酸的含量(較淺的條)。所示誤差偏離在每種情況中為所有獲得的種子的6次獨(dú)立檢測(cè)的結(jié)果。
圖3在轉(zhuǎn)基因GPD1油籽油菜株系8、6和9的成熟種子(40 DAF)中的甘油3-磷酸脫氫酶的活性(黑色條)。作為比較，也檢測(cè)了在對(duì)應(yīng)的、未轉(zhuǎn)化野生型植物(WT)和未表達(dá)的轉(zhuǎn)基因株系3中的含量(較淺的條)。所示誤差偏離在每種情況中為所有獲得的種子的6次獨(dú)立檢測(cè)的結(jié)果。
圖4在轉(zhuǎn)基因GPD1p油籽油菜株系(黑色條)的種子中，相對(duì)于種子的生物量的脂質(zhì)總量。作為比較，也檢測(cè)了在對(duì)應(yīng)的、未轉(zhuǎn)化野生型植物(WT)和未表達(dá)的轉(zhuǎn)基因株系3中的含量(較淺的條)。所有3個(gè)轉(zhuǎn)基因的并且表達(dá)的植物顯示出在成熟種子中脂質(zhì)總量的顯著的提高。所示誤差偏離在每種情況中為所有獲得的種子的5次獨(dú)立檢測(cè)的結(jié)果。
圖5圖5顯示來(lái)自其它酵母的G3PDH同源物的序列比較。
表 表1GPD1p油籽油菜株系8、6和9的籽油的脂肪酸譜(mol％)。作為比較，也給出了在對(duì)應(yīng)的未轉(zhuǎn)化野生型植物(WT)和未表達(dá)的轉(zhuǎn)基因株系3中的脂肪酸譜。
一般方法 除非特別說(shuō)明，所有的化學(xué)藥品來(lái)自Fluka(Buchs)、Merck(Darmstadt)、Roth(Karlsruhe)、Serva(Heidelberg)和Sigma(Deisenhofen)。限制酶、DNA修飾酶和分子生物學(xué)試劑盒來(lái)自Amersham-Pharmacia(Freiburg)、Biometra(

)、Roche(Mannheim)、New England Biolabs(Schwalbach)、Novagen(Madison、Wisconsin、USA)、Perkin-Elmer(Weiterstadt)、Qiagen(Hilden)、Stratagen(Amsterdam、Netherlands)、Invitrogen(Karlsruhe)和Ambion(Cambridgeshire、United Kingdom)。根據(jù)廠商的說(shuō)明使用試劑。
例如，以已知的方式使用亞磷酰胺方法化學(xué)合成寡核苷酸(Voet，Voet，第二版，Wiley Press New York，頁(yè)碼896-897)。為了本發(fā)明目的實(shí)施的克隆步驟根據(jù)Sambrook等人(1989)Cold Spring Harbor LaboratoryPress；ISBN 0-87969-309-6的公開(kāi)實(shí)施，所述克隆步驟例如限制性剪切、瓊脂糖凝膠電泳、DNA片段純化、將核酸轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素和尼龍膜上，連接DNA片段、轉(zhuǎn)化大腸桿菌細(xì)胞、細(xì)菌培養(yǎng)、噬菌體擴(kuò)增和重組DNA序列分析。遵循Sanger的方法(Sanger等人(1977)Proc Natl Acad Sci USA745463-5467)，使用ABI激光熒光DNA測(cè)序儀對(duì)重組的DNA分子測(cè)序。
實(shí)施例1克隆酵母Gpd1基因 遵循下文公開(kāi)的操作方法自釀酒酵母S288C(Mat alpha SUC2 malmel gal2 CUP1 flo1 flo8-1；Invitrogen，Karlsruhe，德國(guó))分離基因組DNA 100ml的培養(yǎng)物在30℃生長(zhǎng)到光密度為1.0。將其中60ml的培養(yǎng)物在3000×g離心3分鐘。將沉淀物重懸于6ml雙蒸H2O中，并且將懸浮液分在1.5ml容器中并離心，將上清棄掉。通過(guò)渦旋將沉淀重懸于200μl溶液A，200μl苯酚/氯仿(1∶1)和0.3g玻璃珠中，然后裂解細(xì)胞。在加入200μlTE緩沖液(pH 8.0)之后，將裂解物離心5分鐘。使用1ml乙醇對(duì)上清進(jìn)行乙醇沉淀。沉淀之后，將獲得的沉淀溶解在400μl TE緩沖液pH 8.0+30μl/mlRNaseA中。在37℃孵育5分鐘之后，加入18μl 3 M乙酸鈉溶液(pH 4.8)和1ml乙醇，通過(guò)離心將析出的DNA沉淀。將DNA沉淀溶解在25μl雙蒸水中。通過(guò)基因組DNA在260nm的吸光度確定其濃度。
溶液A 2％Trition-X100 1％SDS 0.1 M NaCl 0.01 M Tris-HCl pH 8.0 0.001 M EDTA 為了克隆Gpd1基因，在PCR反應(yīng)中使用已經(jīng)分離的酵母DNA，并使用寡核苷酸引物ONP1和ONP2。
序列引物對(duì)15‘-ACTAGTATGTCTGCTGCTGCTGATAG 序列引物對(duì)25‘-CTCGAGATCTTCATGTAGATCTAATT PCR反應(yīng)的組成(50μl) 5.00μl5μg酵母基因組DNA 5.00μl10x緩沖液(Advantage聚合酶)+25 mM MgCl2 5.00μl2 mM dNTP 每個(gè)引物各1.25μl(10 pmol/uL) 0.50μl Advantage聚合酶。
使用的Advantage聚合酶來(lái)自Clontech。
PCR程序 在95℃最初變性2分鐘，然后95℃，45秒；55℃，45秒和72℃，2分鐘，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)。最后在72℃延伸5分鐘。
根據(jù)廠商說(shuō)明，將該P(yáng)CR產(chǎn)物克隆入載體pCR2.1-TOPO(Invitrogen)中，獲得載體pCR2.1-gpd1，并且通過(guò)測(cè)序驗(yàn)證該序列。
克隆入農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化載體pGPTV包括將0.5μg載體pCR2.1-gpd1與限制酶XhoI(New England Biolabs)孵育2小時(shí)，然后與Klenow片段(NewEngland Biolabs)孵育15分鐘。在與SpeI孵育2小時(shí)之后，通過(guò)凝膠電泳將DNA片段分開(kāi)。緊鄰載體(3.9 kb)的gpd1序列的1185 bp片段從凝膠上切除下來(lái)，遵循廠商說(shuō)明，使用Qiagen的“凝膠純化”試劑盒純化該片段，并使用50μl的洗脫緩沖液洗脫。首先，使用限制酶SacI消化0.1μg的載體pGPTV 1小時(shí)，然后與Klenow片段(New England Biolabs)孵育15分鐘。gpd1片段的10μl洗脫物和10 ng處理過(guò)的pGPTV載體在16℃過(guò)夜連接(T4連接酶，New England Biolabs)。遵循廠商說(shuō)明，然后將連接的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到TOP10細(xì)胞(Stratagene)中，并進(jìn)行適當(dāng)?shù)倪x擇，獲得載體pGPTV-gpd1。通過(guò)測(cè)序和使用引物1和2的PCR驗(yàn)證陽(yáng)性克隆。
為了產(chǎn)生載體pSUN-USP-gpd1，使用載體pCR2.1-gpd1和引物3和4實(shí)施PCR。
序列引物35‘-GCGGCCGCCATGTCTGCTGCTGCTGATAG 序列引物45‘-GCGGCCGCATCTTCATGTAGATCTAATT。
PCR反應(yīng)的組成(50μl) 5ng pCR2.1-gpd1質(zhì)粒DNA 5.00μl10x緩沖液(Advantage聚合酶)+25 mM MgCl2 5.00μl 2 mM dNTP 每種引物各1.25μl(10 pmol/μl) 0.50μl Advantage聚合酶。
使用的Advantage聚合酶來(lái)自Clontech。
PCR程序 在95℃最初變性2分鐘，然后95℃，45秒；55℃，45秒和72℃，2分鐘，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)。最后在72℃延伸5分鐘。
該1190 bp PCR產(chǎn)物使用限制酶NotI消化24小時(shí)。使用NotI消化載體pSUN-USP 2小時(shí)，然后與堿性磷酸酶(New England Biolabs)孵育15分鐘。100ng的預(yù)處理的gpd1片段和10ng處理過(guò)的載體pGPTV在16℃過(guò)夜連接(T4連接酶，New England Biolabs)。遵循廠商說(shuō)明，然后將連接的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到TOP10細(xì)胞(Stratagene)中，并進(jìn)行適當(dāng)?shù)倪x擇，獲得載體pSUN-USP-gpd1。通過(guò)測(cè)序和使用引物3和4的PCR驗(yàn)證陽(yáng)性克隆。
實(shí)施例2用于轉(zhuǎn)化植物的質(zhì)粒 例如pBinAR的二元載體可以被用于轉(zhuǎn)化植物(

和Willmitzer(1990)Plant Science 66221-230)?？梢酝ㄟ^(guò)將cDNA以有義或者反義方向連接入T-DNA而構(gòu)建該二元載體。位于cDNA 5’的植物啟動(dòng)子激活cDNA的轉(zhuǎn)錄。多腺苷酸化序列位于cDNA的3’。
使用組織特異性啟動(dòng)子可以獲得組織特異性表達(dá)。例如通過(guò)將油菜籽蛋白或LeB4-或USP啟動(dòng)子克隆到cDNA的5’端而可以獲得種子特異性表達(dá)。也可以使用任何其它種子特異性啟動(dòng)子。CaMV 35S啟動(dòng)子可以用于在整個(gè)植物中的組成型表達(dá)。
另外的二元載體實(shí)例是載體pSUN-USP和pGPTV-油菜籽蛋白，實(shí)施例2的片段被克隆入其中。載體pSUN-USP包含USP啟動(dòng)子和OCS終止子。載體pGPTV-油菜籽蛋白包含截短型的油菜籽蛋白啟動(dòng)子和nos終止子。
分別將實(shí)施例2的片段克隆入載體pSUN-USP和pGPTV-油菜籽蛋白的多克隆位點(diǎn)，以便可以實(shí)現(xiàn)GPD1的種子特異性表達(dá)。相應(yīng)的pSUN-USP-gpd1構(gòu)建體在SEQ ID NO16中公開(kāi)，以及pGPTV-油菜籽蛋白中的G3PDH構(gòu)建體由SEQ ID NO36公開(kāi)。
實(shí)施例3農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化例如可以使用根癌農(nóng)桿菌菌株GV3101(pMP90)(Koncz和Schell(1986)Mol Gen Genet 204383-396)或LBA4404(Clontech)實(shí)施。可以使用標(biāo)準(zhǔn)的轉(zhuǎn)化技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)化(Deblaere等人(1984)Nucl Acids Res 134777-4788)。
實(shí)施例4植物轉(zhuǎn)化 使用標(biāo)準(zhǔn)的轉(zhuǎn)化和再生技術(shù)完成農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化(GelvinStanton B.，Schilperoort Robert A.，植物分子生物學(xué)指南，第二版，DordrechtKluwer Academic Publ.，1995，in Sect.，Ringbuch ZentraleSignaturBT11-P ISBN 0-7923-2731-4；Glick Bernard R.，Thompson JohnE.，植物分子生物學(xué)和生物技術(shù)的方法(Methods in Plant MolecularBiology and Biotechnology)，Boca RatonCRC出版，1993，360 pp.，ISBN0-8493-5164-2)。
例如，通過(guò)子葉或下胚軸轉(zhuǎn)化實(shí)現(xiàn)對(duì)油籽油菜的轉(zhuǎn)化(Moloney等人(1989)植物細(xì)胞通訊(Plant Cell Report)8238-242；De Block等人(1989)Plant Physiol 91694-701)。用于篩選農(nóng)桿菌和植物的抗生素的使用取決于用于轉(zhuǎn)化的二元載體和農(nóng)桿菌菌株。使用卡那霉素作為可選擇植物標(biāo)記實(shí)施油籽油菜的篩選。
例如可以使用Mlynarova等人(1994)植物細(xì)胞通訊13282-285公開(kāi)的技術(shù)，在亞麻中實(shí)現(xiàn)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移。
例如可以使用在EP-A-0 0424 047(Pioneer Hi-Bred International)或者在EP-A-0 0397 687，US 5,376,543，US 5,169,770(University of Toledo)中公開(kāi)的技術(shù)轉(zhuǎn)化大豆。
使用微粒轟擊、聚乙二醇介導(dǎo)的DNA攝入或者通過(guò)碳酸硅纖維技術(shù)進(jìn)行的植物轉(zhuǎn)化公開(kāi)在例如Freeling和Walbot“玉蜀黍手冊(cè)(The MaizeHandbook)”(1993)ISBN 3-540-97826-7，Springer Verlag New York)中。
實(shí)施例5在轉(zhuǎn)化的生物體中研究重組基因產(chǎn)物的表達(dá) 用于檢測(cè)基因轉(zhuǎn)錄水平的合適的方法(其顯示可用于基因產(chǎn)物翻譯的RNA的量)是如下文公開(kāi)的Northern印跡(請(qǐng)參見(jiàn)Ausubel等人(1988)Current Protocols in Molecular Biology，WileyNew York，或者上面的實(shí)施例部分)，其中經(jīng)設(shè)計(jì)以與目的基因結(jié)合的引物用可檢測(cè)標(biāo)記物進(jìn)行標(biāo)記(通常是放射性標(biāo)記物或者化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物)，以便當(dāng)生物體培養(yǎng)物的總RNA被提取、凝膠上分離、轉(zhuǎn)移到穩(wěn)定基質(zhì)上并與此探針?lè)跤龝r(shí)，探針的結(jié)合和結(jié)合的程度顯示出該基因的mRNA的存在以及其含量。這個(gè)信息顯示出轉(zhuǎn)化基因的轉(zhuǎn)錄程度?？梢允褂枚喾N方法從細(xì)胞、組織或者器官制備細(xì)胞的總RNA，所有這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，例如Bormann，E.R.，等人(1992)Mol.Microbiol.6317-326公開(kāi)的方法。Northern雜交 為了實(shí)施RNA雜交，遵循Amasino公開(kāi)的方法(1986，Anal.Biochem.152，304)，使用甲醛在1.25％濃度的瓊脂糖凝膠上通過(guò)凝膠電泳將20μg的總RNA或1μg的poly(A)+RNA分開(kāi)，使用10xSSC通過(guò)毛細(xì)力將其轉(zhuǎn)移到帶正電荷的尼龍膜(Hybond N+，Amersham，Brunswick)上，通過(guò)UV光照固定并且在68℃使用雜交緩沖液(10％硫酸葡聚糖w/v，1 M NaCl，1％SDS，100 mg鯡精DNA)預(yù)雜交3小時(shí)。在預(yù)雜交步驟，使用α-32P-dCTP(Amersham Pharmacia，Brunswick，德國(guó))和Highprime DNA標(biāo)記試劑盒(Roche，Mannheim，德國(guó))將DNA探針標(biāo)記，在將標(biāo)記的DNA探針加入到相同的緩沖液中之后，在68℃過(guò)夜實(shí)施雜交。在68℃，使用2 X SSC進(jìn)行兩次15分鐘的洗滌步驟和使用1 X SSC，1％SDS進(jìn)行兩次30分鐘的洗滌步驟。密封的濾膜在-70℃進(jìn)行為期1-14天的曝光。
為了研究從此mRNA翻譯的蛋白質(zhì)的存在或者相對(duì)的量，可以使用標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)，例如Western印跡(參見(jiàn)例如，Ausubel等人(1988)CurrentProtocols in Molecular Biology，WileyNew York)。在這個(gè)方法中，提取細(xì)胞的總蛋白質(zhì)，通過(guò)凝膠電泳將蛋白質(zhì)分開(kāi)，將其轉(zhuǎn)移到基質(zhì)上(例如象硝酸纖維素膜)并與探針?lè)跤?，該探針例如是特異結(jié)合目的蛋白質(zhì)的抗體。通常提供的此探針具有可以被容易地檢測(cè)的化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物或者顯色標(biāo)記物。觀察到的標(biāo)記物的存在和量指示出存在于細(xì)胞中的目的突變蛋白質(zhì)的存在和量。
圖1顯示4個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因油籽油菜株系和野生型的Northern印跡的結(jié)果。株系6、8和9的植物在Northern印跡中顯示出明確的檢測(cè)信號(hào)。因此，這些植物在成熟種子中表達(dá)GPD1基因。相反，在株系3的種子樣品中沒(méi)有檢測(cè)到GPD1基因的轉(zhuǎn)錄，除了野生型，其被用作另外的對(duì)照。而且株系3表明轉(zhuǎn)移的基因的表達(dá)不是在每個(gè)單獨(dú)的事件中都是成功的，其取決于在歐洲油菜基因組中的整合位點(diǎn)。
實(shí)施例6分析重組蛋白質(zhì)對(duì)目的產(chǎn)物生產(chǎn)的影響 植物中遺傳修飾的效果或者對(duì)目的化合物(例如脂肪酸)生產(chǎn)的影響可以通過(guò)在合適的條件(例如上文描述的那些)下生長(zhǎng)經(jīng)修飾的植物，以及檢測(cè)培養(yǎng)基和/或細(xì)胞組分中目的產(chǎn)物(即脂質(zhì)或者脂肪酸)生產(chǎn)的增加，而進(jìn)行檢測(cè)。這些分析技術(shù)對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是已知的，并且包括分光術(shù)、薄層層析、多種染色方法、酶方法和微生物學(xué)方法，以及分析型層析，例如高效液相層析(參見(jiàn)例如，Ullmann，Encyclopedia of IndustrialChemistry，vol.A2，pp.89-90和pp.443-613，VCHWeinheim(1985)；Fallon A等人(1987)“在生物化學(xué)中應(yīng)用HPLC(Applications of HPLC inBiochemistry)”生化和分子生物學(xué)的實(shí)驗(yàn)室技術(shù)(Laboratory Techniquesin Biochemistry and Molecular Biology)，vol.17；Rehm等人(1993)Biotechnology，vol.3，第III章“產(chǎn)物回收和純化”，pp.469-714，VCHWeinheim；Belter PA等人(1988)生物分離生物技術(shù)的下游操作方法(Bioseparationsdownstream processing for Biotechnology)，John Wiley和Sons；Kennedy JF和Cabral JMS(1992)生物材料的回收方法(Recoveryprocesses for biological Materials)，John Wiley和Sons；Shaeiwitz JA和Henry JD(1988)生物化學(xué)分離(Biochemical Separations)，Ullmann氏工業(yè)化學(xué)百科全書(Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry)，vol.B3；第11章，p.1-27，VCHWeinheim；和Dechow，F(xiàn).J.(1989)生物技術(shù)中的分離和純化技術(shù)(Separation and purification techniques inbiotechnology)，Noyes Publications)。
除了上述的方法，可以如Cahoon等人公開(kāi)的方法從植物材料中提取植物脂質(zhì)(Cahoon等人(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96(22)12935-12940，和Browse等人(1986)分析化學(xué)(Analytic Biochemistry)152141-145)。脂質(zhì)或者脂肪酸的定性和定量分析也被公開(kāi)Christie，William W.，脂質(zhì)方法的進(jìn)展(Advances in Lipid Methodology)，Ayr/ScotlandOily Press(Oily Press Lipid Library；2)；Christie，WilliamW.，氣相層析和脂質(zhì)，操作指南(Gas Chromatography and Lipids.APractical Guide)-Ayr，ScotlandOily Press，1989，Repr.1992，IX，307pp.(Oily Press Lipid Library；1)；“脂質(zhì)研究進(jìn)展(Progress in LipidResearch)，OxfordPergamon Press，1(1952)-16(1977)中題目脂肪和其它脂質(zhì)CODEN的化學(xué)進(jìn)展。
一個(gè)實(shí)例是分析脂肪酸(縮寫FAME，脂肪酸甲基酯；GC-MS，氣液色譜法/質(zhì)譜法；TAG，三酰甘油；TLC，薄層層析法)。
通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的分析方法(GC，GC-MS或TLC)分析重組生物體可以獲得存在脂肪酸產(chǎn)物的明確的證據(jù)，所述方法見(jiàn)Christie及其中所引用的參考文獻(xiàn)的描述(1997，脂質(zhì)方法進(jìn)展(Advances on Lipid Methodology)，第四版Christie，Oily Press，Dundee，119-169；1998，Gaschromatographie-Massenspektrometrie-Verfahren[氣相色譜/質(zhì)譜方法]，Lipide 33343-353)。
待分析的材料可以通過(guò)超聲波、在玻璃研磨器中研磨、液氮和研磨或者其它可應(yīng)用的方法而破碎。破碎之后，必須對(duì)材料進(jìn)行離心。將沉淀重懸于蒸餾水中，在100℃加熱10分鐘，在冰上冷卻并重新離心，之后在于甲醇中的0.5 M硫酸中用2％二甲氧基丙烷90℃提取1小時(shí)，其產(chǎn)生水解的油和脂質(zhì)化合物，得到轉(zhuǎn)甲基化的脂質(zhì)。這些脂肪酸甲基酯在石油醚中萃取，并且最后使用毛細(xì)管柱(Chrompack，WCOT Fused Silica，CP-Wax-52CB，25μm，0.32 mm)，在170℃至240℃的溫度梯度中持續(xù)20分鐘以及在240℃持續(xù)5分鐘進(jìn)行GC分析。獲得的脂肪酸甲基酯的身份必須使用可以從商業(yè)渠道(即Sigma)獲得的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行確定。
首先通過(guò)在研缽中研磨而機(jī)械勻漿植物材料以使其更容易被提取。
下述方案用于定量分析轉(zhuǎn)化了Gpd1基因的蕓苔屬植物的油的量 從種子提取脂質(zhì)通過(guò)Bligh & Dyer(1959)Can J Biochem Physiol 37911的方法實(shí)施。為了此目的，使用Sartorius(

)微量天平將5mg的Arabidopsis Brassica種子稱重到1.2 ml Qiagen微型管(Qiagen，Hilden)中。使用1ml氯仿/甲醇(1∶1；含有Sigma的單-C17-甘油，作為內(nèi)標(biāo))在來(lái)自Retsch(Haan)的MM300 Retsch研磨機(jī)中勻漿種子材料，并在室溫孵育20分鐘。離心之后，將上清轉(zhuǎn)移到新管中，沉淀使用1ml氯仿/甲醇(1∶1)進(jìn)行再提取。合并上清并且蒸發(fā)至干。通過(guò)酸性甲醇分解作用衍生脂肪酸。為了此目的，使用甲醇中的0.5 M硫酸和2％(v/v)二甲氧基丙烷處理已經(jīng)提取的脂質(zhì)，并且在80℃孵育60分鐘。隨后使用石油醚進(jìn)行兩次萃取，再使用100 mM碳酸氫鈉和水進(jìn)行洗滌步驟。由此制備的脂肪酸甲基酯被蒸發(fā)到干燥，并溶解在確定體積石油醚中。最后通過(guò)在毛細(xì)管柱(Chrompack，WCOT Fused Silica，CP-Wax-52 CB，25 m，0.32 mm)上的氣相色譜(HP 6890，Agilent Technologies)分離2μl的脂肪酸甲基酯溶液，并且通過(guò)火焰離子化檢測(cè)器進(jìn)行分析。通過(guò)比較衍生的脂肪酸的信號(hào)強(qiáng)度與內(nèi)標(biāo)單-C17-甘油(Sigma)的信號(hào)強(qiáng)度而對(duì)油進(jìn)行定量。例如，圖4顯示出在3個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因油籽油菜株系和未表達(dá)的對(duì)照株系以及未轉(zhuǎn)化的野生型植物的T3種子中含油量的定量檢測(cè)結(jié)果。使用每個(gè)株系的種子池進(jìn)行5次獨(dú)立的提取，并獨(dú)立地對(duì)提取物進(jìn)行檢測(cè)。從三個(gè)獨(dú)立的檢測(cè)結(jié)果計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。
在轉(zhuǎn)基因株系6，8和9的種子樣品中檢測(cè)到比野生型和未表達(dá)的對(duì)照株系顯著增加的總脂質(zhì)含量。該增加為大約20至22％的種子重量。相反地，在野生型和對(duì)照株系3中的脂質(zhì)含量?jī)H僅大約是15％。此對(duì)應(yīng)于總含油量分別是33％或者大約47％的增加。相反，作為GPD1表達(dá)的結(jié)果，脂肪酸組成沒(méi)有被改變(參見(jiàn)表1)。
表1顯示在轉(zhuǎn)基因表達(dá)GDH的株系8、6和9和未表達(dá)的對(duì)照株系3和未轉(zhuǎn)化的野生型植物的T3種子中的脂肪酸組成。使用每個(gè)株系的種子池進(jìn)行5次獨(dú)立的提取，并獨(dú)立地對(duì)提取物進(jìn)行檢測(cè)。從三個(gè)獨(dú)立的檢測(cè)結(jié)果計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。
不僅在轉(zhuǎn)基因并表達(dá)GDH的株系8、6和9中，而且在未表達(dá)的對(duì)照株系3和未轉(zhuǎn)化野生型植物中，油酸(18:1)都在油中占大部分，為大于55％ 實(shí)施例7甘油3-磷酸的提取 為了從成熟的油籽油菜的籽中提取甘油3-磷酸，在振蕩式磨機(jī)(Retsch)中勻漿油菜籽，使用500μl冷16％(w/v)TCA/二乙醚處理并在冰上孵育20分鐘。之后，加入800μl冷16％TCA/H2O，5 mM EGTA，并將混合物在冰上孵育3小時(shí)。通過(guò)離心沉淀不溶的組分。將上部液相轉(zhuǎn)移到新管中，使用500μl冷的水飽和二乙醚在4℃洗滌，并再離心。親水的底相再接受3次洗滌，并使用5 M KOH/1M TEA將pH調(diào)整為6-7。親水相在液氮中急驟冷凍，在冷凍干燥器(Christ)中干燥并隨后溶解在800μl水中。
實(shí)施例8檢測(cè)甘油3-磷酸(G3P)的量 通過(guò)循環(huán)酶法(enzymic cycling assay)(Gibon等人2002)檢測(cè)G3P的量。為了此目的，使用46μl Tricine/KOH(200 mM，pH 7.8)/10 mMMgCl2，在95℃處理10μl親水相(參見(jiàn)上文)或者10μl G3PDH復(fù)本(參見(jiàn)下文)20分鐘，以破壞二羥丙酮磷酸。之后，將樣品短暫地進(jìn)行初期離心(incipient centrifugation)，并且使用45μl反應(yīng)混合物(2 U甘油3-磷酸氧化酶，0.4 U甘油3-磷酸脫氫酶，130 U過(guò)氧化氫酶，0.12μmol NADH)處理上清。該反應(yīng)導(dǎo)致凈消耗NADH，其可以在光度計(jì)上通過(guò)340 nm吸光度的減少而被直接地監(jiān)測(cè)。通過(guò)不同G3P濃度的校準(zhǔn)曲線計(jì)算G3P的量。
有趣的是，酵母GDP的種子特異性表達(dá)導(dǎo)致在轉(zhuǎn)基因油籽油菜植物的成熟種子(40 DAF)中顯著的G3P含量增加。在株系6，8和9的種子(40 DAF)中G3P含量為大約350至420 nmol G3P/g鮮重。相反，在野生型種子和未表達(dá)株系的種子中的G3P含量?jī)H僅為大約50至100 nmol G3P/g鮮重(參見(jiàn)圖2)。
實(shí)施例9G3PDH活性的檢測(cè) 為了檢測(cè)在成熟的油菜籽中的G3PDH活性，從冷凍的豆莢中分離成熟的種子，在微量天平上稱重并且使用振蕩式磨機(jī)(Retsch)將種子勻漿。之后樣品在液氮中重新冷凍。
將500微升冷提取緩沖液(50 mM HEPES pH 7.4，5 mM MgCl2，1 mMEDTA，1 mM EGTA，5 mM二硫蘇糖醇，10％(v/v)甘油，2 mM芐脒，2 mM己酸，0.5 mM苯甲磺酰氟，1 g/l聚乙烯聚吡咯烷酮)加入到勻漿的樣品中，徹底混合并在4℃的暗處孵育30分鐘，其間連續(xù)的振蕩。之后，在4℃，14000 rpm離心樣品15分鐘(Eppendorf centrifuge)。將包含可溶的蛋白質(zhì)的上清轉(zhuǎn)移到新的Eppendorf管中，并且其可以被直接用于檢測(cè)G3PDH活性或者在-80℃?zhèn)溆谩?br> 吸取10μl的蛋白質(zhì)提取物和90μl的反應(yīng)混合物(50 mM HEPES pH 7.4中含有4 mM二羥丙酮磷酸；0.2 mM NADH)，并在24℃孵育30分鐘。然后通過(guò)在95℃加熱20分鐘而終止反應(yīng)。
每個(gè)樣品以3個(gè)復(fù)本進(jìn)行G3PDH活性的檢測(cè)，其中一個(gè)樣品進(jìn)行直接的加熱并作為空白對(duì)照。隨后，通過(guò)Gibon等人2002的方法(參見(jiàn)上文)檢測(cè)形成的甘油3-磷酸(G3P)的量。
在轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)為陽(yáng)性的轉(zhuǎn)基因株系6，8和9顯示出在成熟種子(40 DAF)中具有比野生型或者未表達(dá)的對(duì)照株系3的種子顯著增加的甘油3-磷酸脫氫酶活性。在株系6，8和9中，檢測(cè)到達(dá)到大約400 nmol G3P/g鮮重/分鐘的活性。相反，在野生型和未表達(dá)的對(duì)照株系3中，活性僅僅達(dá)到大約250 nmol G3P/g鮮重/分鐘。這說(shuō)明在株系6，8和9中GPD1不僅在RNA水平，而且在酶水平上表達(dá)。
等同方案 本領(lǐng)域技術(shù)人員僅僅通過(guò)常規(guī)實(shí)驗(yàn)，即可以認(rèn)識(shí)到或者識(shí)別到此處公開(kāi)的本發(fā)明特定實(shí)施方案的許多等同方案。這些等同方案將包含在本發(fā)明的權(quán)利要求中。
序列表
<110>巴斯福植物科學(xué)有限公司
<120>用于提高油料植物中總含油量的方法
<130>PF57253
<140>20050715
<141>2006-21-07
<160>40
<170>PatentIn Ver.2.1
<210>1
<211>1176
<212>DNA
<213>釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<220>
<221>CDS
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<223>編碼G3PDH
<400>1
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Ala Gly Arg Lys Arg Ser Ser Ser Ser Val Ser Leu Lys Ala Ala Glu
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<220>
<221>CDS
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<223>編碼G3PDH(可選起始密碼子)
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Thr Ile Ala Lys Val Ile Ala Glu Asn Thr Glu Leu His Ser His Ile
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Phe Glu Pro Glu Val Arg Met Trp Val Phe Asp Glu Lys Ile Gly Asp
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Glu Asn Leu Thr Asp Ile Ile Asn Thr Arg His Gln Asn Val Lys Tyr
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Leu Pro Asn Ile Asp Leu Pro His Asn Leu Val Ala Asp Pro Asp Leu
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Leu His Ser Ile Lys Gly Ala Asp Ile Leu Val Phe Asn Ile Pro His
115 120 125
Gln Phe Leu Pro Asn Ile Val Lys Gln Leu Gln Gly His Val Ala Pro
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His Val Arg Ala Ile Ser Cys Leu Lys Gly Phe Glu Leu Gly Ser Lys
145 150 155 160
Gly Val Gln Leu Leu Ser Ser Tyr Val Thr Asp Glu Leu Gly Ile Gln
165 170 175
Cys Gly Ala Leu Ser Gly Ala Asn Leu Ala Pro Glu Val Ala Lys Glu
180 185 190
His Trp Ser Glu Thr Thr Val Ala Tyr Gln Leu Pro Lys Asp Tyr Gln
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Gly Asp Gly Lys Asp Val Asp His Lys Ile Leu Lys Leu Leu Phe His
210 215 220
Arg Pro Tyr Phe His Val Asn Val Ile Asp Asp Val Ala Gly Ile Ser
225 230 235 240
Ile Ala Gly Ala Leu Lys Asn Val Val Ala Leu Ala Cys Gly Phe Val
245 250 255
Glu Gly Met Gly Trp Gly Asn Asn Ala Ser Ala Ala Ile Gln Arg Leu
260 265 270
Gly Leu Gly Glu Ile Ile Lys Phe Gly Arg Met Phe Phe Pro Glu Ser
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290 295 300
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gga aat tgg gga acc gct att gct aaa ata tgt ggt gaa aat gcc aag 144
Gly Asn Trp Gly Thr Ala Ile Ala Lys Ile Cys Gly Glu Asn Ala Lys
35 40 45
gct cat cct gat att ttc cat cct caa gta cac atg tgg atg tat gaa 192
Ala His Pro Asp Ile Phe His Pro Gln Val His Met Trp Met Tyr Glu
50 55 60
gag aag att caa cat gag gga aaa gag tgc aat ctc acg gaa gtt ttt 240
Glu Lys Ile Gln His Glu Gly Lys Glu Cys Asn Leu Thr Glu Val Phe
65 70 75 80
aac act act cat gaa aac gtt aaa tat ctc aaa ggt atc aaa tgc cct 288
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85 90 95
tct aac gtc ttc gca aac ccg gac att cgt gat gta ggt tca cgt agc 336
Ser Asn Val Phe Ala Asn Pro Asp Ile Arg Asp Val Gly Ser Arg Ser
100 105 110
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Asp Ile Leu Val Trp Val Leu Pro His Gln Phe Val Val Arg Ile Cys
115 120 125
aat caa ttg aag gga tgc cta aag aag gat gct gtt gca att tca tgc432
Asn Gln Leu Lys Gly Cys Leu Lys Lys Asp Ala Val Ala Ile Ser Cys
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atc aaa ggt gta tct gtc acc aag gac cgt gtt cgc ctc ttt tct gat480
Ile Lys Gly Val Ser Val Thr Lys Asp Arg Val Arg Leu Phe Ser Asp
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att atc gaa gaa aac acg gga atg tat tgt ggc gtt ctc tct ggc gcc528
Ile Ile Glu Glu Asn Thr Gly Met Tyr Cys Gly Val Leu Ser Gly Ala
165 170 175
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Asn Ile Ala Ser Glu Val Ala Gln Glu Lys Phe Cys Glu Thr Thr Ile
180 185 190
gga tat ttg cct aat agt tct gtt aat ccc cgc tat act cct aag act624
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Ile Gln Ala Leu Phe Asn Arg Pro Tyr Phe Arg Val Asn Ile Val Glu
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Ser Ala Val Met Arg Ile Gly Leu Leu Glu Met Gln Lys Phe Gly Arg
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atg ttt ttc gat tgt aag cct ctt act atg agc gag gaa tct tgt ggc864
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ata gcc gat tta att aca act tgc tta ggc ggc cgt aac cac aaa tgc912
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gct gtg gca ttt gtc aag aca gga aag ccc atg cat gtt gtt gaa caa 960
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Glu Leu Leu Asp Gly Gln Lys Leu Gln Gly Ala Ala Thr Ala Lys Glu
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gtt tat gag ttc ctt gat aac cag aat aag gta agc gaa ttc cca ttg 1056
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ttt aca gct gtt tat cgc att gtt tat gag gga ctt cca cct aat aag 1104
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Gln Leu Leu Gln Gly Ala Ala Thr Ser Lys Asp Val His Glu Phe Leu
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Lys Arg Phe Phe Pro Glu Thr Asp Ile Asn Thr Leu Thr Val Glu Ser
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cag gac gtg gag aag gag ctt ctc aac ggc cag tcc gcc cag ggc gtc1056
Gln Asp Val Glu Lys Glu Leu Leu Asn Gly Gln Ser Ala Gln Gly Val
340 345 350
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130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
Val Leu Lys Ala Leu Phe His Arg Pro Tyr Phe His Val Arg Cys Val
225 230 235 240
Gln Asp Val Ala Gly Val Ser Ile Gly Gly Ala Leu Lys Asn Val Val
245 250 255
Ala Leu Cys Ala Gly Phe Val Glu Gly Lys Asn Trp Gly Asp Asn Ala
260 265 270
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275 280 285
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290 295 300
Ala Gly Val Ala Asp Leu Ile Thr Ser Cys Ala Gly Gly Arg Asn Phe
305 310 315 320
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325 330 335
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<400>12
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1 5 10 15
Ser Ala Pro Leu Ser Ala Ala Asn Thr Ala Gly Lys Ala Pro Phe Lys
20 25 30
Val Ala Val Val Gly Ser Gly Asn Trp Gly Thr Thr Val Ala Lys Ile
35 40 45
Val Ala Glu Asn Cys Thr Ala His Pro Glu Leu Phe Glu Pro Glu Val
50 55 60
Arg Val Trp Val Arg Glu Glu Lys Val Asn Gly Lys Asn Leu Thr Asp
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Ile Phe Asn Ala Glu His Glu Asn Val Arg Tyr Leu Pro Lys Ile Lys
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Gly Ala Asn Ile Ile Val Phe Asn Leu Pro His Gln Phe Leu Ala Gly
115 120 125
Val Cys Lys Gln Leu Lys Gly His Val Asn Pro Lys Ala Arg Ala Ile
130 135 140
Ser Cys Leu Lys Gly Leu Asp Val Thr Pro Gln Gly Val Tyr Leu Leu
145 150 155 160
Ser Asp Val Ile Glu Asn Glu Thr Gly Leu His Cys Gly Val Leu Ser
165 170 175
Gly Ala Asn Leu Ala Thr Glu Ile Ala Leu Glu Lys Tyr Ser Glu Thr
180 185 190
Thr Val Ala Tyr Asn Arg Pro Lys Asp Phe Phe Gly Glu Gly Asp Val
195 200 205
Thr Asn Asp Val Leu Lys Ala Leu Phe His Arg Pro Tyr Phe His Val
210 215 220
Arg Cys Val Gln Asp Val Ala Gly Val Ser Ile Gly Gly Ala Leu Lys
225 230 235 240
Asn Val Val Ala Leu Cys Ala Gly Phe Val Glu Gly Lys Asn Trp Gly
245 250 255
Asp Asn Ala Lys Ala Ala Ile Met Arg Arg Gly Met Leu Glu Met Ile
260 265 270
Asn Phe Ser Lys Arg Phe Phe Pro Glu Thr Asp Ile Asn Thr Leu Thr
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290 295 300
Arg Asn Phe Lys Val Gly Arg Ala Phe Gly Lys Glu Ser Gly Ser Gly
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Asn
385
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<213>魯氏接合酵母(Zygosaccharomyces rouxii)
<220>
<221>CDS
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<223>編碼G3PDH
<400>13
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tct atg aag aag acc gac tca tca atg tca gtc gtt acc gct gag aat96
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20 25 30
cca tac aaa gtt tcc gtc gtc ggc tct ggt aac tgg ggt acc acc atc144
Pro Tyr Lys Val Ser Val Val Gly Ser Gly Asn Trp Gly Thr Thr Ile
35 40 45
gcc aag gtc gtt gcc gaa aac acc aag gaa aag cca gaa ttg ttc caa192
Ala Lys Val Val Ala Glu Asn Thr Lys Glu Lys Pro Glu Leu Phe Gln
50 55 60
gaa cgt gtg gac atg tgg gtg ttt gaa gaa cag atc gac ggt act cca240
Glu Arg Val Asp Met Trp Val Phe Glu Glu Gln Ile Asp Gly Thr Pro
65 70 75 80
ttg gcc caa atc atc aac acc aag cac cag aac gtg aaa tac ttg cca288
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aac atc gac ctt ccg gac aat ttg gtc gct aac cca gac ttg att gcc336
Asn Ile Asp Leu Pro Asp Asn Leu Val Ala Asn Pro Asp Leu Ile Ala
100 105 110
acc acg aag gac gcc gat gtg att gtt ttc aac gtt ccc cat caa ttt384
Thr Thr Lys Asp Ala Asp Val Ile Val Phe Asn Val Pro His Gln Phe
115 120 125
ttg ggc cgt atc gtt gct caa atg aag ggt caa atc aaa cca act gca432
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130 135 140
cgt gcg gtc tcc tgt cta aag ggt ttc gaa gtt ggt cca aag ggt gtg480
Arg Ala Val Ser Cys Leu Lys Gly Phe Glu Val Gly Pro Lys Gly Val
145 150 155 160
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165 170 175
gct cta tct ggt gct aac ttg gcc cca gaa gtc gcc aag gaa cac tgg576
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180 185 190
tcc gag acc acc gtc gct tac cac atc cca gac gac ttc aag ggt gac624
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195 200 205
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210 215 220
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Gly Ala Leu Lys Asn Val Val Ala Leu Gly Cys Gly Phe Val Thr Gly
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Leu
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
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130 135 140
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Gln Leu Leu Ser Asp Tyr Val Thr Gln Glu Leu Gly Ile Glu Cys Gly
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Gly Glu Ile Ile Lys Phe Gly Arg Met Phe Phe Pro Glu Ser Lys Val
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Leu
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<212>DNA
<213>魯氏接合酵母
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1167)
<223>編碼G3PDH
<400>15
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act acc aag gac gct gat gtc atc gtt ttc aac gtt cct cac caa ttt384
Thr Thr Lys Asp Ala Asp Val Ile Val Phe Asn Val Pro His Gln Phe
115 120 125
ttg ggc cgt atc gtt tct caa atg aag ggt caa atc aaa cca gat gct432
Leu Gly Arg Ile Val Ser Gln Met Lys Gly Gln Ile Lys Pro Asp Ala
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Arg Ala Ile Ser Cys Leu Lys Gly Phe Glu Val Gly Pro Lys Gly Val
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Gly Glu Ile Ile Lys Phe Gly Arg Met Phe Phe Pro Glu Ser Lys Val
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Glu Thr Tyr Tyr Gln Glu Ser Ala Gly Val Ala Asp Leu Ile Thr Thr
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Cys Ser Gly Gly Arg Asn Val Arg Val Ala Thr Glu Met Ala Lys Thr
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<211>389
<212>PRT
<213>魯氏接合酵母
<400>16
Met Ala Ala Thr Asp Arg Leu Asn Gln Thr Ser Asp Ile Leu Ser His
1 5 10 15
Ser Met Lys Lys Thr Asp Thr Ser Met Ser Ile Val Thr Ala Glu Asn
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Pro Tyr Lys Val Ala Val Val Gly Ser Gly Asn Trp Gly Thr Thr Ile
35 40 45
Ala Lys Val Val Ala Glu Asn Thr Lys Glu Lys Pro Glu Leu Phe Gln
50 55 60
Gly Arg Val Asp Met Trp Val Phe Glu Glu Gln Ile Asp Gly Thr Pro
65 70 75 80
Leu Thr Gln Ile Ile Asn Thr Lys His Gln Asn Val Lys Tyr Leu Pro
85 90 95
Asn Ile Asp Leu Pro Gly Asn Leu Val Ala Asn Pro Asp Leu Ile Ser
100 105 110
Thr Thr Lys Asp Ala Asp Val Ile Val Phe Asn Val Pro His Gln Phe
115 120 125
Leu Gly Arg Ile Val Ser Gln Met Lys Gly Gln Ile Lys Pro Asp Ala
130 135 140
Arg Ala Ile Ser Cys Leu Lys Gly Phe Glu Val Gly Pro Lys Gly Val
145 150 155 160
Gln Leu Leu Ser Asp Tyr Val Thr Gln Glu Leu Gly Ile Gln Cys Gly
165 170 175
Ala Leu Ser Gly Ala Asn Leu Ala Pro Glu Val Ala Lys Glu His Trp
180 185 190
Ser Glu Thr Thr Val Ala Tyr Gln Val Pro Asp Asp Phe Lys Gly Glu
195 200 205
Gly Lys Asp Ile Asp His Arg Val Leu Lys Gln Leu Phe His Arg Pro
210 215 220
Tyr Phe His Val Asn Val Ile Asp Asp Val Ala Gly Ile Ser Ile Ala
225 230 235 240
Gly Ala Leu Lys Asn Val Val Ala Leu Gly Cys Gly Phe Val Thr Gly
245 250 255
Leu Gly Trp Gly Asn Asn Ala Ala Ala Ala Ile Gln Arg Val Gly Leu
260 265 270
Gly Glu Ile Ile Lys Phe Gly Arg Met Phe Phe Pro Glu Ser Lys Val
275 280 285
Glu Thr Tyr Tyr Gln Glu Ser Ala Gly Val Ala Asp Leu Ile Thr Thr
290 295 300
Cys Ser Gly Gly Arg Asn Val Arg Val Ala Thr Glu Met Ala Lys Thr
305 310 315 320
Gly Lys Ser Gly Glu Gln Val Glu Lys Asp Ile Leu Asn Gly Gln Ser
325 330 335
Ala Gln Gly Leu Ile Thr Ala Lys Glu Val His Gln Trp Leu Glu Ser
340 345 350
Ser Gly His Thr Glu Glu Tyr Pro Leu Phe Glu Ala Val Tyr Gln Ile
355 360 365
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Leu Asp Ile Val Glu
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<210>17
<211>8809
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述含有酵母屬G3PDH的表達(dá)載體pSUN-USP
<220>
<221>misc_feature
<222>(1017)..(2189)
<223>編碼G3PDH
<400>17
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tttacccgcc aatatatcct gtcaaacact gatagtttaa actgaaggcg ggaaacgaca 180
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cgactctaga ctagtggatc cgatatcgcc cgggctcgag gtaccgagct cgaattcggc 300
gcgccgagct cctcgagcaa atttacacat tgccactaaa cgtctaaacc cttgtaattt 360
gtttttgttt tactatgtgt gttatgtatt tgatttgcga taaattttta tatttggtac 420
taaatttata acacctttta tgctaacgtt tgccaacact tagcaatttg caagttgatt 480
aattgattct aaattatttt tgtcttctaa atacatatac taatcaactg gaaatgtaaa 540
tatttgctaa tatttctact ataggagaat taaagtgagt gaatatggta ccacaaggtt 600
tggagattta attgttgcaa tgatgcatgg atggcatata caccaaacat tcaataattc 660
ttgaggataa taatggtacc acacaagatt tgaggtgcat gaacgtcacg tggacaaaag 720
gtttagtaat ttttcaagac aacaatgtta ccacacacaa gttttgaggt gcatgcatgg 780
atgccctgtg gaaagtttaa aaatattttg gaaatgattt gcatggaagc catgtgtaaa 840
accatgacat ccacttggag gatgcaataa tgaagaaaac tacaaattta catgcaacta 900
gttatgcatg tagtctatat aatgaggatt ttgcaatact ttcattcata cacactcact 960
aagttttaca cgattataat ttcttcatag ccagcccacc gcggtgggcg gccgccatgt 1020
ctgctgctgc tgatagatta aacttaactt ccggccactt gaatgctggt agaaagagaa 1080
gttcctcttc tgtttctttg aaggctgccg aaaagccttt caaggttact gtgattggat 1140
ctggtaactg gggtactact attgccaagg tggttgccga aaattgtaag ggatacccag 1200
aagttttcgc tccaatagta caaatgtggg tgttcgaaga agagatcaat ggtgaaaaat 1260
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ccgacaattt ggttgctaat ccagacttga ttgattcagt caaggatgtc gacatcatcg 1380
tcttcaacat tccacatcaa tttttgcccc gtatctgtag ccaattgaaa ggtcatgttg 1440
attcacacgt cagagctatc tcctgtctaa agggttttga agttggtgct aaaggtgtcc 1500
aattgctatc ctcttacatc actgaggaac taggtattca atgtggtgct ctatctggtg 1560
ctaacattgc cactgaagtc gctcaagaac actggtctga aacaacagtt gcttaccaca 1620
ttccaaagga tttcagaggc gagggcaagg acgtcgacca taaggttcta aaggccttgt 1680
tccacagacc ttacttccac gttagtgtca tcgaagatgt tgctggtatc tccatctgtg 1740
gtgctttgaa gaacgttgtt gccttaggtt gtggtttcgt cgaaggtcta ggctggggta 1800
acaacgcttc tgctgccatc caaagagtcg gtttgggtga gatcatcaga ttcggtcaaa 1860
tgtttttccc agaatctaga gaagaaacat actaccaaga gtctgctggt gttgctgatt 1920
tgatcaccac ctgcgctggt ggtagaaacg tcaaggttgc taggctaatg gctacttctg 1980
gtaaggacgc ctgggaatgt gaaaaggagt tgttgaatgg ccaatccgct caaggtttaa 2040
ttacctgcaa agaagttcac gaatggttgg aaacatgtgg ctctgtcgaa gacttcccat 2100
tatttgaagc cgtataccaa atcgtttaca acaactaccc aatgaagaac ctgccggaca 2160
tgattgaaga attagatcta catgaagatt aggcggccgc ctgcagtcta gaaggcctcc 2220
tgctttaatg agatatgcga gacgcctatg atcgcatgat atttgctttc aattctgttg 2280
tgcacgttgt aaaaaacctg agcatgtgta gctcagatcc ttaccgccgg tttcggttca 2340
ttctaatgaa tatatcaccc gttactatcg tatttttatg aataatattc tccgttcaat 2400
ttactgattg tccgtcgacg aattcactgg ccgtcgtttt acaacgactc agagcttgac 2460
aggaggcccg atctagtaac atagatgaca ccgcgcgcga taatttatcc tagtttgcgc 2520
gctatatttt gttttctatc gcgtattaaa tgtataattg cgggactcta atcataaaaa 2580
cccatctcat aaataacgtc atgcattaca tgttaattat tacatgctta acgtaattca 2640
acagaaatta tatgataatc atcgcaagac cggcaacagg attcaatctt aagaaacttt 2700
attgccaaat gtttgaacga tcggggatca tccgggtctg tggcgggaac tccacgaaaa 2760
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cagcccattc gccgccaagc tcttcagcaa tatcacgggt agccaacgct atgtcctgat 2940
agcggtccgc cacacccagc cggccacagt cgatgaatcc agaaaagcgg ccattttcca 3000
ccatgatatt cggcaagcag gcatcgccat gtgtcacgac gagatcctcg ccgtcgggca 3060
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cagccatgat ggatactttc tcggcaggag caaggtgaga tgacaggaga tcctgccccg 3300
gcacttcgcc caatagcagc cagtcccttc ccgcttcagt gacaacgtcg agcacagctg 3360
cgcaaggaac gcccgtcgtg gccagccacg atagccgcgc tgcctcgtcc tgcagttcat 3420
tcagggcacc ggacaggtcg gtcttgacaa aaagaaccgg gcgcccctgc gctgacagcc 3480
ggaacacggc ggcatcagag cagccgattg tctgttgtgc ccagtcatag ccgaatagcc 3540
tctccaccca agcggccgga gaacctgcgt gcaatccatc ttgttcaatc atgcgaaacg 3600
atccagatcc ggtgcagatt atttggattg agagtgaata tgagactcta attggatacc 3660
gaggggaatt tatggaacgt cagtggagca tttttgacaa gaaatatttg ctagctgata 3720
gtgaccttag gcgacttttg aacgcgcaat aatggtttct gacgtatgtg cttagctcat 3780
taaactccag aaacccgcgg ctgagtggct ccttcaacgt tgcggttctg tcagttccaa 3840
acgtaaaacg gcttgtcccg cgtcatcggc gggggtcata acgtgactcc cttaattctc 3900
cgctcatgat cagattgtcg tttcccgcct tcagtttaaa ctatcagtgt ttgacaggat 3960
cactgcttgg taataattgt cattagattg tttttatgca tagatgcact cgaaatcagc 4020
caattttaga caagtatcaa acggatgtta attcagtaca ttaaagacgt ccgcaatgtg 4080
ttattaagtt gtctaagcgt caatttgttt acaccacaat atatcctgcc accagccagc 4140
caacagctcc ccgaccggca gctcggcaca aaatcaccac gcgtctaaaa aggtgatgtg 4200
tatttgagta aaacagcttg cgtcatgcgg tcgctgcgta tatgatgcga tgagtaaata 4260
aacaaatacg caaggggaac gcatgaaggt tatcgctgta cttaaccaga aaggcgggtc 4320
aggcaagacg accatcgcaa cccatctagc ccgcgccctg caactcgccg gggccgatgt 4380
tctgttagtc gattccgatc cccagggcag tgcccgcgat tgggcggccg tgcgggaaga 4440
tcaaccgcta accgttgtcg gcatcgaccg cccgacgatt gaccgcgacg tgaaggccat 4500
cggccggcgc gacttcgtag tgatcgacgg agcgccccag gcggcggact tggctgtgtc 4560
cgcgatcaag gcagccgact tcgtgctgat tccggtgcag ccaagccctt acgacatatg 4620
ggccaccgcc gacctggtgg agctggttaa gcagcgcatt gaggtcacgg atggaaggct 4680
acaagcggcc tttgtcgtgt cgcgggcgat caaaggcacg cgcatcggcg gtgaggttgc 4740
cgaggcgctg gccgggtacg agctgcccat tcttgagtcc cgtatcacgc agcgcgtgag 4800
ctacccaggc actgccgccg ccggcacaac cgttcttgaa tcagaacccg agggcgacgc 4860
tgcccgcgag gtccaggcgc tggccgctga aattaaatca aaactcattt gagttaatga 4920
ggtaaagaga aaatgagcaa aagcacaaac acgctaagtg ccggccgtcc gagcgcacgc 4980
agcagcaagg ctgcaacgtt ggccagcctg gcagacacgc cagccatgaa gcgggtcaac 5040
tttcagttgc cggcggagga tcacaccaag ctgaagatgt acgcggtacg ccaaggcaag 5100
accattaccg agctgctatc tgaatacatc gcgcagctac cagagtaaat gagcaaatga 5160
ataaatgagt agatgaattt tagcggctaa aggaggcggc atggaaaatc aagaacaacc 5220
aggcaccgac gccgtggaat gccccatgtg tggaggaacg ggcggttggc caggcgtaag 5280
cggctgggtt gtctgccggc cctgcaatgg cactggaacc cccaagcccg aggaatcggc 5340
gtgagcggtc gcaaaccatc cggcccggta caaatcggcg cggcgctggg tgatgacctg 5400
gtggagaagt tgaaggccgc gcaggccgcc cagcggcaac gcatcgaggc agaagacgcc 5460
ccggtgaatc gtggcaaggg gccgctgatc gaatccgcaa agaatcccgg caaccgccgg 5520
cagccggtgc gccgtcgatt aggaagccgc ccaagggcga cgagcaacca gattttttcg 5580
ttccgatgct ctatgacgtg ggcacccgcg atagtcgcag catcatggac gtggccgttt 5640
tccgtctgtc gaagcgtgac cgacgagctg gcgaggtgat ccgctacgag cttccagacg 5700
ggcacgtaga ggtttccgca gggccggccg gcatggccag tgtgtgggat tacgacctgg 5760
tactgatggc ggtttcccat ctaaccgaat ccatgaaccg ataccgggaa gggaagggag 5820
acaagcccgg ccgcgtgttc cgtccacacg ttgcggacgt actcaagttc tgccggcgag 5880
ccgatggcgg aaagcagaaa gacgacctgg tagaaacctg cattcggtta aacaccacgc 5940
acgttgccat gcagcgtacg aagaaggcca agaacggccg cctggtgacg gtatccgagg 6000
gtgaagcctt gattagccgc tacaagatcg taaagagcga aaccgggcgg ccggagtaca 6060
tcgagatcga gctagctgat tggatgtacc gcgagatcac agaaggcaag aacccggacg 6120
tgctgacggt tcaccccgat tactttttga tcgatcccgg catcggccgt tttctctacc 6180
gcctggcacg ccgcgccgca ggcaaggcag aagccagatg gttgttcaag acgatctacg 6240
aacgcagtgg cagcgccgga gagttcaaga agttctgttt caccgtgcgc aagctgatcg 6300
ggtcaaatga cctgccggag tacgatttga aggaggaggc ggggcaggct ggcccgatcc 6360
tagtcatgcg ctaccgcaac ctgatcgagg gcgaagcatc cgccggttcc taatgtacgg 6420
agcagatgct agggcaaatt gccctagcag gggaaaaagg tcgaaaaggt ctctttcctg 6480
tggatagcac gtacattggg aacccaaagc cgtacattgg gaaccggaac ccgtacattg 6540
ggaacccaaa gccgtacatt gggaaccggt cacacatgta agtgactgat ataaaagaga 6600
aaaaaggcga tttttccgcc taaaactctt taaaacttat taaaactctt aaaacccgcc 6660
tggcctgtgc ataactgtct ggccagcgca cagccgaaga gctgcaaaaa gcgcctaccc 6720
ttcggtcgct gcgctcccta cgccccgccg cttcgcgtcg gcctatcgcg gcctatgcgg 6780
tgtgaaatac cgcacagatg cgtaaggaga aaataccgca tcaggcgctc ttccgcttcc 6840
tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc gagcggtatc agctcactca 6900
aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca ggggataacg caggaaagaa catgtgagca 6960
aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg 7020
ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg 7080
acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt 7140
ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt 7200
tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc 7260
tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt 7320
gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag cagccactgg taacaggatt 7380
agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc taactacggc 7440
tacactagaa ggacagtatt tggtatctgc gctctgctga agccagttac cttcggaaaa 7500
agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt 7560
tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt gatcttttct 7620
acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt catgcatgat 7680
atatctccca atttgtgtag ggcttattat gcacgcttaa aaataataaa agcagacttg 7740
acctgatagt ttggctgtga gcaattatgt gcttagtgca tctaacgctt gagttaagcc 7800
gcgccgcgaa gcggcgtcgg cttgaacgaa tttctagcta gacattattt gccgactacc 7860
ttggtgatct cgcctttcac gtagtggaca aattcttcca actgatctgc gcgcgaggcc 7920
aagcgatctt cttcttgtcc aagataagcc tgtctagctt caagtatgac gggctgatac 7980
tgggccggca ggcgctccat tgcccagtcg gcagcgacat ccttcggcgc gattttgccg 8040
gttactgcgc tgtaccaaat gcgggacaac gtaagcacta catttcgctc atcgccagcc 8100
cagtcgggcg gcgagttcca tagcgttaag gtttcattta gcgcctcaaa tagatcctgt 8160
tcaggaaccg gatcaaagag ttcctccgcc gctggaccta ccaaggcaac gctatgttct 8220
cttgcttttg tcagcaagat agccagatca atgtcgatcg tggctggctc gaagatacct 8280
gcaagaatgt cattgcgctg ccattctcca aattgcagtt cgcgcttagc tggataacgc 8340
cacggaatga tgtcgtcgtg cacaacaatg gtgacttcta cagcgcggag aatctcgctc 8400
tctccagggg aagccgaagt ttccaaaagg tcgttgatca aagctcgccg cgttgtttca 8460
tcaagcctta cggtcaccgt aaccagcaaa tcaatatcac tgtgtggctt caggccgcca 8520
tccactgcgg agccgtacaa atgtacggcc agcaacgtcg gttcgagatg gcgctcgatg 8580
acgccaacta cctctgatag ttgagtcgat acttcggcga tcaccgcttc ccccatgatg 8640
tttaactttg ttttagggcg actgccctgc tgcgtaacat cgttgctgct ccataacatc 8700
aaacatcgac ccacggcgta acgcgcttgc tgcttggatg cccgaggcat agactgtacc 8760
ccaaaaaaac agtcataaca agccatgaaa accgccactg cgttccatg 8809
<210>18
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸引物
<400>18
actagtatgt ctgctgctgc tgatag26
<210>19
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸引物
<400>19
ctcgagatct tcatgtagat ctaatt26
<210>20
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸引物
<400>20
gcggccgcca tgtctgctgc tgc tgatag29
<210>21
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸引物
<400>21
gcggccgcat cttcatgtag atctaatt 28
<210>22
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述酵母G3PDH序列基序
<220>
<221>變體
<222>(8)
<223>Thr
<400>22
Gly Ser Gly Asn Trp Gly Thr Ala Ile Ala Lys
1 5 10
<210>23
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述酵母G3PDH序列基序
<220>
<221>變體
<222>(2)
<223>Gln
<400>23
His Glu Gln Asn Val Lys Tyr Leu
1 5
<210>24
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述酵母G3PDH序列基序
<220>
<221>變體
<222>(1)
<223>Asn
<220>
<221>變體
<222>(2)
<223>Val
<220>
<221>變體
<222>(3)
<223>Ile
<220>
<221>變體
<222>(5)
<223>Trp
<220>
<221>變體
<222>(6)
<223>Asn
<220>
<221>變體
<222>(7)
<223>Ile或Val
<220>
<221>變體
<222>(12)
<223>Leu或Ile
<400>24
Asp Ile Leu Val Phe Val Leu Pro His Gln Phe Val
1 5 10
<210>25
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述酵母G3PDH序列基序
<220>
<221>變體
<222>(1)
<223>Gly
<220>
<221>變體
<222>(2)
<223>Val
<220>
<221>變體
<222>(5)
<223>Ile
<400>25
Ala Ile Ser Cys Leu Lys Gly
1 5
<210>26
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述酵母G3PDH序列基序
<220>
<221>變體
<222>(3)
<223>Ala
<220>
<221>變體
<222>(9)
<223>Ile或Val
<220>
<221>變體
<222>(13)
<223>Ile
<400>26
Cys Gly Val Leu Ser Gly Ala Asn Leu Ala Xaa Glu Val Ala
1 5 10
<210>27
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述酵母G3PDH序列基序
<220>
<221>變體
<222>(1)
<223>Val
<400>27
Leu Phe Xaa Arg Pro Tyr Phe Xaa Val
1 5
<210>28
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述酵母G3PDH序列基序
<220>
<221>變體
<222>(2)
<223>Met
<220>
<221>變體
<222>(3)
<223>Gly
<220>
<221>變體
<222>(5)
<223>Ile
<220>
<221>變體
<222>(6)
<223>Gln
<220>
<221>變體
<222>(7)
<223>Lys或Asn
<220>
<221>變體
<222>(9)
<223>Ser或Ala
<400>28
Gly Leu Leu Glu Met Ile Arg Phe Gly
1 5
<210>29
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述酵母G3PDH序列基序
<220>
<221>變體
<222>(13)
<223>Ile
<400>29
Gly Ser Gly Asn Trp Gly Thr Thr Ile Ala Lys Val Val Ala Glu Asn
1 5 10 15
<210>30
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述酵母G3PDH序列基序
<220>
<221>變體
<222>(3)
<223>Arg
<400>30
Asn Thr Lys His Gln Asn Val Lys Tyr Leu Pro
1 5 10
<210>31
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述酵母G3PDH序列基序
<220>
<221>變體
<222>(2)
<223>Val
<220>
<221>變體
<222>(7)
<223>Val
<400>31
Asp Ile Leu Val Phe Asn Ile Pro His Gln Phe Leu
1 5 10
<210>32
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述酵母G3PDH序列基序
<220>
<221>變體
<222>(3)
<223>Val
<400>32
Arg Ala Ile Ser Cys Leu Lys Gly Phe Glu
1 5 10
<210>33
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述酵母G3PDH序列基序
<220>
<221>變體
<222>(11)
<223>Thr
<400>33
Cys Gly Ala Leu Ser Gly Ala Asn Leu Ala Pro Glu Val Ala
1 5 10
<210>34
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述酵母G3PDH序列基序
<400>34
Leu Phe His Arg Pro Tyr Phe His Val
1 5
<210>35
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述酵母G3PDH序列基序
<220>
<221>變體
<222>(7)
<223>Arg
<400>35
Gly Leu Gly Glu Ile Ile Lys Phe Gly
1 5
<210>36
<211>13718
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述表達(dá)載體pGPTV-gpd1
<220>
<221>啟動(dòng)子
<222>(10807)..(11951)
<223>napin啟動(dòng)子
<220>
<221>終止子
<222>(13154)..(13408)
<223>nos終止子
<220>
<221>misc_feature
<222>(11962)..(13137)
<223>編碼酵母G3PDH(gpd1)
<400>36
gatctggcgc cggccagcga gacgagcaag attggccgcc gcccgaaacg atccgacagc 60
gcgcccagca caggtgcgca ggcaaattgc accaacgcat acagcgccag cagaatgcca 120
tagtgggcgg tgacgtcgtt cgagtgaacc agatcgcgca ggaggcccgg cagcaccggc 180
ataatcaggc cgatgccgac agcgtcgagc gcgacagtgc tcagaattac gatcaggggt 240
atgttgggtt tcacgtctgg cctccggacc agcctccgct ggtccgattg aacgcgcgga 300
ttctttatca ctgataagtt ggtggacata ttatgtttat cagtgataaa gtgtcaagca 360
tgacaaagtt gcagccgaat acagtgatcc gtgccgccct ggacctgttg aacgaggtcg 420
gcgtagacgg tctgacgaca cgcaaactgg cggaacggtt gggggttcag cagccggcgc 480
tttactggca cttcaggaac aagcgggcgc tgctcgacgc actggccgaa gccatgctgg 540
cggagaatca tacgcattcg gtgccgagag ccgacgacga ctggcgctca tttctgatcg 600
ggaatgcccg cagcttcagg caggcgctgc tcgcctaccg cgatggcgcg cgcatccatg 660
ccggcacgcg accgggcgca ccgcagatgg aaacggccga cgcgcagctt cgcttcctct 720
gcgaggcggg tttttcggcc ggggacgccg tcaatgcgct gatgacaatc agctacttca 780
ctgttggggc cgtgcttgag gagcaggccg gcgacagcga tgccggcgag cgcggcggca 840
ccgttgaaca ggctccgctc tcgccgctgt tgcgggccgc gatagacgcc ttcgacgaag 900
ccggtccgga cgcagcgttc gagcagggac tcgcggtgat tgtcgatgga ttggcgaaaa 960
ggaggctcgt tgtcaggaac gttgaaggac cgagaaaggg tgacgattga tcaggaccgc 1020
tgccggagcg caacccactc actacagcag agccatgtag acaacatccc ctcccccttt 1080
ccaccgcgtc agacgcccgt agcagcccgc tacgggcttt ttcatgccct gccctagcgt 1140
ccaagcctca cggccgcgct cggcctctct ggcggccttc tggcgctctt ccgcttcctc 1200
gctcactgac tcgctgcgct cggtcgttcg gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa 1260
ggcggtaata cggttatcca cagaatcagg ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa 1320
aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct 1380
ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac 1440
aggactataa agataccagg cgtttccccc tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc 1500
gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttt 1560
ccgctgcata accctgcttc ggggtcatta tagcgatttt ttcggtatat ccatcctttt 1620
tcgcacgata tacaggattt tgccaaaggg ttcgtgtaga ctttccttgg tgtatccaac 1680
ggcgtcagcc gggcaggata ggtgaagtag gcccacccgc gagcgggtgt tccttcttca 1740
ctgtccctta ttcgcacctg gcggtgctca acgggaatcc tgctctgcga ggctggccgg 1800
ctaccgccgg cgtaacagat gagggcaagc ggatggctga tgaaaccaag ccaaccagga 1860
agggcagccc acctatcaag gtgtactgcc ttccagacga acgaagagcg attgaggaaa 1920
aggcggcggc ggccggcatg agcctgtcgg cctacctgct ggccgtcggc cagggctaca 1980
aaatcacggg cgtcgtggac tatgagcacg tccgcgagct ggcccgcatc aatggcgacc 2040
tgggccgcct gggcggcctg ctgaaactct ggctcaccga cgacccgcgc acggcgcggt 2100
tcggtgatgc cacgatcctc gccctgctgg cgaagatcga agagaagcag gacgagcttg 2160
gcaaggtcat gatgggcgtg gtccgcccga gggcagagcc atgacttttt tagccgctaa 2220
aacggccggg gggtgcgcgt gattgccaag cacgtcccca tgcgctccat caagaagagc 2280
gacttcgcgg agctggtgaa gtacatcacc gacgagcaag gcaagaccga gcgcctttgc 2340
gacgctcacc gggctggttg ccctcgccgc tgggctggcg gccgtctatg gccctgcaaa 2400
cgcgccagaa acgccgtcga agccgtgtgc gagacaccgc ggccgccggc gttgtggata 2460
cctcgcggaa aacttggccc tcactgacag atgaggggcg gacgttgaca cttgaggggc 2520
cgactcaccc ggcgcggcgt tgacagatga ggggcaggct cgatttcggc cggcgacgtg 2580
gagctggcca gcctcgcaaa tcggcgaaaa cgcctgattt tacgcgagtt tcccacagat 2640
gatgtggaca agcctgggga taagtgccct gcggtattga cacttgaggg gcgcgactac 2700
tgacagatga ggggcgcgat ccttgacact tgaggggcag agtgctgaca gatgaggggc 2760
gcacctattg acatttgagg ggctgtccac aggcagaaaa tccagcattt gcaagggttt 2820
ccgcccgttt ttcggccacc gctaacctgt cttttaacct gcttttaaac caatatttat 2880
aaaccttgtt tttaaccagg gctgcgccct gtgcgcgtga ccgcgcacgc cgaagggggg 2940
tgccccccct tctcgaaccc tcccggcccg ctaacgcggg cctcccatcc ccccaggggc 3000
tgcgcccctc ggccgcgaac ggcctcaccc caaaaatggc agcgctggca gtccttgcca 3060
ttgccgggat cggggcagta acgggatggg cgatcagccc gagcgcgacg cccggaagca 3120
ttgacgtgcc gcaggtgctg gcatcgacat tcagcgacca ggtgccgggc agtgagggcg 3180
gcggcctggg tggcggcctg cccttcactt cggccgtcgg ggcattcacg gacttcatgg 3240
cggggccggc aatttttacc ttgggcattc ttggcatagt ggtcgcgggt gccgtgctcg 3300
tgttcggggg tgcgataaac ccagcgaacc atttgaggtg ataggtaaga ttataccgag 3360
gtatgaaaac gagaattgga cctttacaga attactctat gaagcgccat atttaaaaag 3420
ctaccaagac gaagaggatg aagaggatga ggaggcagat tgccttgaat atattgacaa 3480
tactgataag ataatatatc ttttatatag aagatatcgc cgtatgtaag gatttcaggg 3540
ggcaaggcat aggcagcgcg cttatcaata tatctataga atgggcaaag cataaaaact 3600
tgcatggact aatgcttgaa acccaggaca ataaccttat agcttgtaaa ttctatcata 3660
attgggtaat gactccaact tattgatagt gttttatgtt cagataatgc ccgatgactt 3720
tgtcatgcag ctccaccgat tttgagaacg acagcgactt ccgtcccagc cgtgccaggt 3780
gctgcctcag attcaggtta tgccgctcaa ttcgctgcgt atatcgcttg ctgattacgt 3840
gcagctttcc cttcaggcgg gattcataca gcggccagcc atccgtcatc catatcacca 3900
cgtcaaaggg tgacagcagg ctcataagac gccccagcgt cgccatagtg cgttcaccga 3960
atacgtgcgc aacaaccgtc ttccggagac tgtcatacgc gtaaaacagc cagcgctggc 4020
gcgatttagc cccgacatag ccccactgtt cgtccatttc cgcgcagacg atgacgtcac 4080
tgcccggctg tatgcgcgag gttaccgact gcggcctgag ttttttaagt gacgtaaaat 4140
cgtgttgagg ccaacgccca taatgcgggc tgttgcccgg catccaacgc cattcatggc 4200
catatcaatg attttctggt gcgtaccggg ttgagaagcg gtgtaagtga actgcagttg 4260
ccatgtttta cggcagtgag agcagagata gcgctgatgt ccggcggtgc ttttgccgtt 4320
acgcaccacc ccgtcagtag ctgaacagga gggacagctg atagacacag aagccactgg 4380
agcacctcaa aaacaccatc atacactaaa tcagtaagtt ggcagcatca cccataattg 4440
tggtttcaaa atcggctccg tcgatactat gttatacgcc aactttgaaa acaactttga 4500
aaaagctgtt ttctggtatt taaggtttta gaatgcaagg aacagtgaat tggagttcgt 4560
cttgttataa ttagcttctt ggggtatctt taaatactgt agaaaagagg aaggaaataa 4620
taaatggcta aaatgagaat atcaccggaa ttgaaaaaac tgatcgaaaa ataccgctgc 4680
gtaaaagata cggaaggaat gtctcctgct aaggtatata agctggtggg agaaaatgaa 4740
aacctatatt taaaaatgac ggacagccgg tataaaggga ccacctatga tgtggaacgg 4800
gaaaaggaca tgatgctatg gctggaagga aagctgcctg ttccaaaggt cctgcacttt 4860
gaacggcatg atggctggag caatctgctc atgagtgagg ccgatggcgt cctttgctcg 4920
gaagagtatg aagatgaaca aagccctgaa aagattatcg agctgtatgc ggagtgcatc 4980
aggctctttc actccatcga catatcggat tgtccctata cgaatagctt agacagccgc 5040
ttagccgaat tggattactt actgaataac gatctggccg atgtggattg cgaaaactgg 5100
gaagaagaca ctccatttaa agatccgcgc gagctgtatg attttttaaa gacggaaaag 5160
cccgaagagg aacttgtctt ttcccacggc gacctgggag acagcaacat ctttgtgaaa 5220
gatggcaaag taagtggctt tattgatctt gggagaagcg gcagggcgga caagtggtat 5280
gacattgcct tctgcgtccg gtcgatcagg gaggatatcg gggaagaaca gtatgtcgag 5340
ctattttttg acttactggg gatcaagcct gattgggaga aaataaaata ttatatttta 5400
ctggatgaat tgttttagta cctagatgtg gcgcaacgat gccggcgaca agcaggagcg 5460
caccgacttc ttccgcatca agtgttttgg ctctcaggcc gaggcccacg gcaagtattt 5520
gggcaagggg tcgctggtat tcgtgcaggg caagattcgg aataccaagt acgagaagga 5580
cggccagacg gtctacggga ccgacttcat tgccgataag gtggattatc tggacaccaa 5640
ggcaccaggc gggtcaaatc aggaataagg gcacattgcc ccggcgtgag tcggggcaat 5700
cccgcaagga gggtgaatga atcggacgtt tgaccggaag gcatacaggc aagaactgat 5760
cgacgcgggg ttttccgccg aggatgccga aaccatcgca agccgcaccg tcatgcgtgc 5820
gccccgcgaa accttccagt ccgtcggctc gatggtccag caagctacgg ccaagatcga 5880
gcgcgacagc gtgcaactgg ctccccctgc cctgcccgcg ccatcggccg ccgtggagcg 5940
ttcgcgtcgt ctcgaacagg aggcggcagg tttggcgaag tcgatgacca tcgacacgcg 6000
aggaactatg acgaccaaga agcgaaaaac cgccggcgag gacctggcaa aacaggtcag 6060
cgaggccaag caggccgcgt tgctgaaaca cacgaagcag cagatcaagg aaatgcagct 6120
ttccttgttc gatattgcgc cgtggccgga cacgatgcga gcgatgccaa acgacacggc 6180
ccgctctgcc ctgttcacca cgcgcaacaa gaaaatcccg cgcgaggcgc tgcaaaacaa 6240
ggtcattttc cacgtcaaca aggacgtgaa gatcacctac accggcgtcg agctgcgggc 6300
cgacgatgac gaactggtgt ggcagcaggt gttggagtac gcgaagcgca cccctatcgg 6360
cgagccgatc accttcacgt tctacgagct ttgccaggac ctgggctggt cgatcaatgg 6420
ccggtattac acgaaggccg aggaatgcct gtcgcgccta caggcgacgg cgatgggctt 6480
cacgtccgac cgcgttgggc acctggaatc ggtgtcgctg ctgcaccgct tccgcgtcct 6540
ggaccgtggc aagaaaacgt cccgttgcca ggtcctgatc gacgaggaaa tcgtcgtgct 6600
gtttgctggc gaccactaca cgaaattcat atgggagaag taccgcaagc tgtcgccgac 6660
ggcccgacgg atgttcgact atttcagctc gcaccgggag ccgtacccgc tcaagctgga 6720
aaccttccgc ctcatgtgcg gatcggattc cacccgcgtg aagaagtggc gcgagcaggt 6780
cggcgaagcc tgcgaagagt tgcgaggcag cggcctggtg gaacacgcct gggtcaatga 6840
tgacctggtg cattgcaaac gctagggcct tgtggggtca gttccggctg ggggttcagc 6900
agccagcgct ttactggcat ttcaggaaca agcgggcact gctcgacgca cttgcttcgc 6960
tcagtatcgc tcgggacgca cggcgcgctc tacgaactgc cgataaacag aggattaaaa 7020
ttgacaattg tgattaaggc tcagattcga cggcttggag cggccgacgt gcaggatttc 7080
cgcgagatcc gattgtcggc cctgaagaaa gctccagaga tgttcgggtc cgtttacgag 7140
cacgaggaga aaaagcccat ggaggcgttc gctgaacggt tgcgagatgc cgtggcattc 7200
ggcgcctaca tcgacggcga gatcattggg ctgtcggtct tcaaacagga ggacggcccc 7260
aaggacgctc acaaggcgca tctgtccggc gttttcgtgg agcccgaaca gcgaggccga 7320
ggggtcgccg gtatgctgct gcgggcgttg ccggcgggtt tattgctcgt gatgatcgtc 7380
cgacagattc caacgggaat ctggtggatg cgcatcttca tcctcggcgc acttaatatt 7440
tcgctattct ggagcttgtt gtttatttcg gtctaccgcc tgccgggcgg ggtcgcggcg 7500
acggtaggcg ctgtgcagcc gctgatggtc gtgttcatct ctgccgctct gctaggtagc 7560
ccgatacgat tgatggcggt cctgggggct atttgcggaa ctgcgggcgt ggcgctgttg 7620
gtgttgacac caaacgcagc gctagatcct gtcggcgtcg cagcgggcct ggcgggggcg 7680
gtttccatgg cgttcggaac cgtgctgacc cgcaagtggc aacctcccgt gcctctgctc 7740
acctttaccg cctggcaact ggcggccgga ggacttctgc tcgttccagt agctttagtg 7800
tttgatccgc caatcccgat gcctacagga accaatgttc tcggcctggc gtggctcggc 7860
ctgatcggag cgggtttaac ctacttcctt tggttccggg ggatctcgcg actcgaacct 7920
acagttgttt ccttactggg ctttctcagc cccagatctg gggtcgatca gccggggatg 7980
catcaggccg acagtcggaa cttcgggtcc ccgacctgta ccattcggtg agcaatggat 8040
aggggagttg atatcgtcaa cgttcacttc taaagaaata gcgccactca gcttcctcag 8100
cggctttatc cagcgatttc ctattatgtc ggcatagttc tcaagatcga cagcctgtca 8160
cggttaagcg agaaatgaat aagaaggctg ataattcgga tctctgcgag ggagatgata 8220
tttgatcaca ggcagcaacg ctctgtcatc gttacaatca acatgctacc ctccgcgaga 8280
tcatccgtgt ttcaaacccg gcagcttagt tgccgttctt ccgaatagca tcggtaacat 8340
gagcaaagtc tgccgcctta caacggctct cccgctgacg ccgtcccgga ctgatgggct 8400
gcctgtatcg agtggtgatt ttgtgccgag ctgccggtcg gggagctgtt ggctggctgg 8460
tggcaggata tattgtggtg taaacaaatt gacgcttaga caacttaata acacattgcg 8520
gacgttttta atgtactggg gtggtttttc ttttcaccag tgagacgggc aacagctgat 8580
tgcccttcac cgcctggccc tgagagagtt gcagcaagcg gtccacgctg gtttgcccca 8640
gcaggcgaaa atcctgtttg atggtggttc cgaaatcggc aaaatccctt ataaatcaaa 8700
agaatagccc gagatagggt tgagtgttgt tccagtttgg aacaagagtc cactattaaa 8760
gaacgtggac tccaacgtca aagggcgaaa aaccgtctat cagggcgatg gcccactacg 8820
tgaaccatca cccaaatcaa gttttttggg gtcgaggtgc cgtaaagcac taaatcggaa 8880
ccctaaaggg agcccccgat ttagagcttg acggggaaag ccggcgaacg tggcgagaaa 8940
ggaagggaag aaagcgaaag gagcgggcgc cattcaggct gcgcaactgt tgggaagggc 9000
gatcggtgcg ggcctcttcg ctattacgcc agctggcgaa agggggatgt gctgcaaggc 9060
gattaagttg ggtaacgcca gggttttccc agtcacgacg ttgtaaaacg acggccagtg 9120
aattaattcc catcttgaaa gaaatatagt ttaaatattt attgataaaa taacaagtca 9180
ggtattatag tccaagcaaa aacataaatt tattgatgca agtttaaatt cagaaatatt 9240
tcaataactg attatatcag ctggtacatt gccgtagatg aaagactgag tgcgatatta 9300
tgtgtaatac ataaattgat gatatagcta gcttagctca tcgggggatc cgtcgaagct 9360
agcttgggtc ccgctcagaa gaactcgtca agaaggcgat agaaggcgat gcgctgcgaa 9420
tcgggagcgg cgataccgta aagcacgagg aagcggtcag cccattcgcc gccaagctct 9480
tcagcaatat cacgggtagc caacgctatg tcctgatagc ggtccgccac acccagccgg 9540
ccacagtcga tgaatccaga aaagcggcca ttttccacca tgatattcgg caagcaggca 9600
tcgccatggg tcacgacgag atcctcgccg tcgggcatgc gcgccttgag cctggcgaac 9660
agttcggctg gcgcgagccc ctgatgctct tcgtccagat catcctgatc gacaagaccg 9720
gcttccatcc gagtacgtgc tcgctcgatg cgatgtttcg cttggtggtc gaatgggcag 9780
gtagccggat caagcgtatg cagccgccgc attgcatcag ccatgatgga tactttctcg 9840
gcaggagcaa ggtgagatga caggagatcc tgccccggca cttcgcccaa tagcagccag 9900
tcccttcccg cttcagtgac aacgtcgagc acagctgcgc aaggaacgcc cgtcgtggcc 9960
agccacgata gccgcgctgc ctcgtcctgc agttcattca gggcaccgga caggtcggtc 10020
ttgacaaaaa gaaccgggcg cccctgcgct gacagccgga acacggcggc atcagagcag 10080
ccgattgtct gttgtgccca gtcatagccg aatagcctct ccacccaagc ggccggagaa 10140
cctgcgtgca atccatcttg ttcaatccaa gctcccatgg gccctcgact agagtcgaga 10200
tctggattga gagtgaatat gagactctaa ttggataccg aggggaattt atggaacgtc 10260
agtggagcat ttttgacaag aaatatttgc tagctgatag tgaccttagg cgacttttga 10320
acgcgcaata atggtttctg acgtatgtgc ttagctcatt aaactccaga aacccgcggc 10380
tgagtggctc cttcaacgtt gcggttctgt cagttccaaa cgtaaaacgg cttgtcccgc 10440
gtcatcggcg ggggtcataa cgtgactccc ttaattctcc gctcatgatc ttgatcccct 10500
gcgccatcag atccttggcg gcaagaaagc catccagttt actttgcagg gcttcccaac 10560
cttaccagag ggcgccccag ctggcaattc cggttcgctt gctgtccata aaaccgccca 10620
gtctagctat cgccatgtaa gcccactgca agctacctgc tttctctttg cgcttgcgtt 10680
ttcccttgtc cagatagccc agtagctgac attcatccgg ggtcagcacc gtttctgcgg 10740
actggctttc tacgtgttcc gcttccttta gcagcccttg cgccctgagt gcttgcggca 10800
gcgtgaagct ttcttcatcg gtgattgatt cctttaaaga cttatgtttc ttatcttgct 10860
tctgaggcaa gtattcagtt accagttacc acttatattc tggactttct gactgcatcc 10920
tcatttttcc aacattttaa atttcactat tggctgaatg cttcttcttt gaggaagaaa 10980
caattcagat ggcagaaatg tatcaaccaa tgcatatata caaatgtacc tcttgttctc 11040
aaaacatcta tcggatggtt ccatttgctt tgtcatccaa ttagtgacta ctttatatta 11100
ttcactcctc tttattacta ttttcatgcg aggttgccat gtacattata tttgtaagga 11160
ttgacgctat tgagcgtttt tcttcaattt tctttatttt agacatgggt atgaaatgtg 11220
tgttagagtt gggttgaatg agatatacgt tcaagtgaat ggcataccgt tctcgagtaa 11280
ggatgaccta cccattcttg agacaaatgt tacattttag tatcagagta aaatgtgtac 11340
ctataactca aattcgattg acatgtatcc attcaacata aaattaaacc agcctgcacc 11400
tgcatccaca tttcaagtat tttcaaaccg ttcggctcct atccaccggg tgtaacaaga 11460
cggattccga atttggaaga ttttgactca aattcccaat ttatattgac cgtgactaaa 11520
tcaactttaa cttctataat tctgattaag ctcccaattt atattcccaa cggcactacc 11580
tccaaaattt atagactctc atcccctttt aaaccaactt agtaaacgtt ttttttttta 11640
attttatgaa gttaagtttt taccttgttt ttaaaaagaa tcgttcataa gatgccatgc 11700
cagaacatta gctacacgtt acacatagca tgcagccgcg gagaattgtt tttcttcgcc 11760
acttgtcact cccttcaaac acctaagagc ttctctctca cagcacacac atacaatcac 11820
atgcgtgcat gcattattac acgtgatcgc catgcaaatc tcctttatag cctataaatt 11880
aactcatccg cttcactctt tactcaaacc aaaactcatc aatacaaaca agattaaaaa 11940
catacacgag gatccactag tatgtctgct gctgctgata gattaaactt aacttccggc 12000
cacttgaatg ctggtagaaa gagaagttcc tcttctgttt ctttgaaggc tgccgaaaag 12060
cctttcaagg ttactgtgat tggatctggt aactggggta ctactattgc caaggtggtt 12120
gccgaaaatt gtaagggata cccagaagtt ttcgctccaa tagtacaaat gtgggtgttc 12180
gaagaagaga tcaatggtga aaaattgact gaaatcataa atactagaca tcaaaacgtg 12240
aaatacttgc ctggcatcac tctacccgac aatttggttg ctaatccaga cttgattgat 12300
tcagtcaagg atgtcgacat catcgtcttc aacattccac atcaattttt gccccgtatc 12360
tgtagccaat tgaaaggtca tgttgattca cacgtcagag ctatctcctg tctaaagggt 12420
tttgaagttg gtgctaaagg tgtccaattg ctatcctctt acatcactga ggaactaggt 12480
attcaatgtg gtgctctatc tggtgctaac attgccactg aagtcgctca agaacactgg 12540
tctgaaacaa cagttgctta ccacattcca aaggatttca gaggcgaggg caaggacgtc 12600
gaccataagg ttctaaaggc cttgttccac agaccttact tccacgttag tgtcatcgaa 12660
gatgttgctg gtatctccat ctgtggtgct ttgaagaacg ttgttgcctt aggttgtggt 12720
ttcgtcgaag gtctaggctg gggtaacaac gcttctgctg ccatccaaag agtcggtttg 12780
ggtgagatca tcagattcgg tcaaatgttt ttcccagaat ctagagaaga aacatactac 12840
caagagtctg ctggtgttgc tgatttgatc accacctgcg ctggtggtag aaacgtcaag 12900
gttgctaggc taatggctac ttctggtaag gacgcctggg aatgtgaaaa ggagttgttg 12960
aatggccaat ccgctcaagg tttaattacc tgcaaagaag ttcacgaatg gttggaaaca 13020
tgtggctctg tcgaagactt cccattattt gaagccgtat accaaatcgt ttacaacaac 13080
tacccaatga agaacctgcc ggacatgatt gaagaattag atctacatga agattagctc 13140
gacgaatttc cccgatcgtt caaacatttg gcaataaagt ttcttaagat tgaatcctgt 13200
tgccggtctt gcgatgatta tcatataatt tctgttgaat tacgttaagc atgtaataat 13260
taacatgtaa tgcatgacgt tatttatgag atgggttttt atgattagag tcccgcaatt 13320
atacatttaa tacgcgatag aaaacaaaat atagcgcgca aactaggata aattatcgcg 13380
cgcggtgtca tctatgttac tagatcggga attcagatcg gctgagtggc tccttcaacg 13440
ttgcggntct gtcagtncca aacgtaaaac gggttggtcc gcggnatcgg gcggggggcc 13500
ttaaccgtgn actnccntna ttnctccggc ttcantgnnn agaattggnc ntttccccgn 13560
cntcagttta aactatcagg tgtttgacag gatatatttg gcgggtaaac ctaaganaaa 13620
agagcgttta ttagaataat cggatattta aaagggccgn gaaaaggttt atcccttccg 13680
tccatttgta tgngcatgcc naccaccagg gttcccca 13718
<210>37
<211>1254
<212>DNA
<213>構(gòu)巢裸殼孢菌(Emericella nidulans)
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1251)
<223>編碼G3PDH
<400>37
atg ggc tct ctt gga ccg tat aag caa aag cac aag gtg act gtg gtg 48
Met Gly Ser Leu Gly Pro Tyr Lys Gln Lys His Lys Val Thr Val Val
1 5 10 15
gga tcg ggt aac tgg ggc acc gct ata gcc aaa atc gtc gcc gag aat 96
Gly Ser Gly Asn Trp Gly Thr Ala Ile Ala Lys Ile Val Ala Glu Asn
20 25 30
act gcc agc aac cct gcg gtc ttt gag aag gat gtt cag atg tgg gtt 144
Thr Ala Ser Asn Pro Ala Val Phe Glu Lys Asp Val Gln Met Trp Val
35 40 45
ttc gag gaa aag gtc gag att ccg aaa tcg tcg aag cat tat gat cct 192
Phe Glu Glu Lys Val Glu Ile Pro Lys Ser Ser Lys His Tyr Asp Pro
50 55 60
gcc tct tct ctt tgc cag ggc ccg cag aat ctg aca gat att atc aac 240
Ala Ser Ser Leu Cys Gln Gly Pro Gln Asn Leu Thr Asp Ile Ile Asn
65 70 75 80
cat acc cat gag aat atc aag tac ctc ccc gga att acc ctt ccg gaa 288
His Thr His Glu Asn Ile Lys Tyr Leu Pro Gly Ile Thr Leu Pro Glu
85 90 95
aac ttg att gcc aat cca tcg cta gtc gac gcg gtt caa gac agc act 336
Asn Leu Ile Ala Asn Pro Ser Leu Val Asp Ala Val Gln Asp Ser Thr
100 105 110
atc ctc gtc ttc aac cta ccc cat caa ttc atc atc aat att tgt gaa384
Ile Leu Val Phe Asn Leu Pro His Gln Phe Ile Ile Asn Ile Cys Glu
115 120 125
cag atc aag ggc aag att gtc cca tac gcg cgt gga att tct tgc ata432
Gln Ile Lys Gly Lys Ile Val Pro Tyr Ala Arg Gly Ile Ser Cys Ile
130 135 140
aag ggc gtg gat gtg aat gag gaa gga gtc cac ctg ttt tcc gaa aca480
Lys Gly Val Asp Val Asn Glu Glu Gly Val His Leu Phe Ser Glu Thr
145 150 155 160
att gga aag att ctc ggg atc tac tgt ggc gcc ctg tcc ggt gcc aac528
Ile Gly Lys Ile Leu Gly Ile Tyr Cys Gly Ala Leu Ser Gly Ala Asn
165 170 175
atc gcg aat gag gtc gcc cag gaa aag tgg tcc gag tct agc att ggt576
Ile Ala Asn Glu Val Ala Gln Glu Lys Trp Ser Glu Ser Ser Ile Gly
180 185 190
tat gat cca ccg cat ttt gac tct aaa gcc cct tct cct ccc aac cga624
Tyr Asp Pro Pro His Phe Asp Ser Lys Ala Pro Ser Pro Pro Asn Arg
195 200 205
tcc cct tcc gca tcg act gac aat atc ctg cac ttc gag cac aaa gac672
Ser Pro Ser Ala Ser Thr Asp Asn Ile Leu His Phe Glu His Lys Asp
210 215 220
gtt tcg ggt caa ctt tcg cgg gta aag cta cag gct cta cct tcc gaa720
Val Ser Gly Gln Leu Ser Arg Val Lys Leu Gln Ala Leu Pro Ser Glu
225 230 235 240
ttt cct ccc atc gac cat gcc ctt ctc aag tcg cta ttc cac cgt cct768
Phe Pro Pro Ile Asp His Ala Leu Leu Lys Ser Leu Phe His Arg Pro
245 250 255
tac ttc cat att ggt gtg gta agt gac gtc gca ggt gtt tcg tta gga816
Tyr Phe His Ile Gly Val Val Ser Asp Val Ala Gly Val Ser Leu Gly
260 265 270
ggt gcc ctt aag aat gtc gtt gct gtc gcg gca ggg tgg gtt gtg ggc864
Gly Ala Leu Lys Asn Val Val Ala Val Ala Ala Gly Trp Val Val Gly
275 280 285
aaa gga tgg gga gac aat gcg aag gct gca att atg cga gtt ggg ctt 912
Lys Gly Trp Gly Asp Asn Ala Lys Ala Ala Ile Met Arg Val Gly Leu
290 295 300
ttg gaa atg gtg aag ttc ggc gaa cag ttt ttc ggt gct acc atc aac 960
Leu Glu Met Val Lys Phe Gly Glu Gln Phe Phe Gly Ala Thr Ile Asn
305 310 315 320
act cgc acc ttc act gaa gaa agt gct ggt gtt gcc gat cta atc acg 1008
Thr Arg Thr Phe Thr Glu Glu Ser Ala Gly Val Ala Asp Leu Ile Thr
325 330 335
agt tgc agt ggc gga cga aac ttc cgc tgc gca aag ctt agc att gaa 1056
Ser Cys Ser Gly Gly Arg Asn Phe Arg Cys Ala Lys Leu Ser Ile Glu
340 345 350
aga aac cag ccg att gag aaa atc gag gag aca gag ttg aac ggc cag 1104
Arg Asn Gln Pro Ile Glu Lys Ile Glu Glu Thr Glu Leu Asn Gly Gln
355 360 365
aag ctg caa ggc act ttg act gca gtc gaa gtc aac agt ttc ttg aaa 1152
Lys Leu Gln Gly Thr Leu Thr Ala Val Glu Val Asn Ser Phe Leu Lys
370 375 380
aag caa ggt tta gaa gaa gag ttc cca ttg ttt act gca gtc tac cga 1200
Lys Gln Gly Leu Glu Glu Glu Phe Pro Leu Phe Thr Ala Val Tyr Arg
385 390 395 400
gtt ctt caa ggc acc atg tct gtg gac gag att cct tct ttc att gag 1248
Val Leu Gln Gly Thr Met Ser Val Asp Glu Ile Pro Ser Phe Ile Glu
405 410 415
cgg taa 1254
Arg
<210>38
<211>417
<212>PRT
<213>構(gòu)巢裸殼孢菌
<400>38
Met Gly Ser Leu Gly Pro Tyr Lys Gln Lys His Lys Val Thr Val Val
1 5 10 15
Gly Ser Gly Asn Trp Gly Thr AlaIle Ala Lys Ile Val Ala Glu Asn
20 25 30
Thr Ala Ser Asn Pro Ala Val Phe Glu Lys Asp Val Gln Met Trp Val
35 40 45
Phe Glu Glu Lys Val Glu Ile Pro Lys Ser Ser Lys His Tyr Asp Pro
50 55 60
Ala Ser Ser Leu Cys Gln Gly Pro Gln Asn Leu Thr Asp Ile Ile Asn
65 70 75 80
His Thr His Glu Asn Ile Lys Tyr Leu Pro Gly Ile Thr Leu Pro Glu
85 90 95
Asn Leu Ile Ala Asn Pro Ser Leu Val Asp Ala Val Gln Asp Ser Thr
100 105 110
Ile Leu Val Phe Asn Leu Pro His Gln Phe Ile Ile Asn Ile Cys Glu
115 120 125
Gln Ile Lys Gly Lys Ile Val Pro Tyr Ala Arg Gly Ile Ser Cys Ile
130 135 140
Lys Gly Val Asp Val Asn Glu Glu Gly Val His Leu Phe Ser Glu Thr
145 150 155 160
Ile Gly Lys Ile Leu Gly Ile Tyr Cys Gly Ala Leu Ser Gly Ala Asn
165 170 175
Ile Ala Asn Glu Val Ala Gln Glu Lys Trp Ser Glu Ser Ser Ile Gly
180 185 190
Tyr Asp Pro Pro His Phe Asp Ser Lys Ala Pro Ser Pro Pro Asn Arg
195 200 205
Ser Pro Ser Ala Ser Thr Asp Asn Ile Leu His Phe Glu His Lys Asp
210 215 220
Val Ser Gly Gln Leu Ser Arg Val Lys Leu Gln Ala Leu Pro Ser Glu
225 230 235 240
Phe Pro Pro Ile Asp His Ala Leu Leu Lys Ser Leu Phe His Arg Pro
245 250 255
Tyr Phe His Ile Gly Val Val Ser Asp Val Ala Gly Val Ser Leu Gly
260 265 270
Gly Ala Leu Lys Asn Val Val Ala Val Ala Ala Gly Trp Val Val Gly
275 280 285
Lys Gly Trp Gly Asp Asn Ala Lys Ala Ala Ile Met Arg Val Gly Leu
290 295 300
Leu Glu Met Val Lys Phe Gly Glu Gln Phe Phe Gly Ala Thr Ile Asn
305 310 315 320
Thr Arg Thr Phe Thr Glu Glu Ser Ala Gly Val Ala Asp Leu Ile Thr
325 330 335
Ser Cys Ser Gly Gly Arg Asn Phe Arg Cys Ala Lys Leu Ser Ile Glu
340 345 350
Arg Asn Gln Pro Ile Glu Lys Ile Glu Glu Thr Glu Leu Asn Gly Gln
355 360 365
Lys Leu Gln Gly Thr Leu Thr Ala Val Glu Val Asn Ser Phe Leu Lys
370 375 380
Lys Gln Gly Leu Glu Glu Glu Phe Pro Leu Phe Thr Ala Val Tyr Arg
385 390 395 400
Val Leu Gln Gly Thr Met Ser Val Asp Glu Ile Pro Ser Phe Ile Glu
405 410 415
Arg
<210>39
<211>999
<212>DNA
<213>漢遜德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(996)
<223>編碼G3PDH(部分)
<400>39
gga tct ggt aac tgg ggt act gct gtt gct aag atc gta tct gaa aac48
Gly Ser Gly Asn Trp Gly Thr Ala Val Ala Lys Ile Val Ser Glu Asn
1 5 10 15
acg gct gaa aaa cca gaa gtg ttc gaa aag caa gtg aac atg tgg gtt96
Thr Ala Glu Lys Pro Glu Val Phe Glu Lys Gln Val Asn Met Trp Val
20 25 30
ttt gaa gaa gaa gtt gac gga caa aag ttg act gaa atc atc aac gcc144
Phe Glu Glu Glu Val Asp Gly Gln Lys Leu Thr Glu Ile Ile Asn Ala
35 40 45
aaa cac gaa aac gtt aag tac ttg cca gaa gtc aag ttg ccg gaa aac192
Lys His Glu Asn Val Lys Tyr Leu Pro Glu Val Lys Leu Pro Glu Asn
50 55 60
ttg gtt gca aac cca gac gtt gtt gac act gtc aag gat gca gac tta240
Leu Val Ala Asn Pro Asp Val Val Asp Thr Val Lys Asp Ala Asp Leu
65 70 75 80
tta att ttt aac att cca cat caa ttc tta cca aga gtg tgt aag caa288
Leu Ile Phe Asn Ile Pro His Gln Phe Leu Pro Arg Val Cys Lys Gln
85 90 95
ttg gtt ggc cat gtc aag cca tct gcc aga gcc atc tcc tgt ttg aag336
Leu Val Gly His Val Lys Pro Ser Ala Arg Ala Ile Ser Cys Leu Lys
100 105 110
ggt ttg gaa gtt ggc cca gaa ggt tgt aag ttg tta tcg caa tct atc384
Gly Leu Glu Val Gly Pro Glu Gly Cys Lys Leu Leu Ser Gln Ser Ile
115 120 125
aac gat act tta ggt gtc cac tgt ggt gtc tta tct ggt gcc aac att432
Asn Asp Thr Leu Gly Val His Cys Gly Val Leu Ser Gly Ala Asn Ile
130 135 140
gcc aac gaa gtt gcc aga gaa aga tgg tct gaa acc acc att gcc tac480
Ala Asn Glu Val Ala Arg Glu Arg Trp Ser Glu Thr Thr Ile Ala Tyr
145 150 155 160
aac att cca gaa gat ttc aga ggt aag ggt aga gat atc gac gaa tac528
Asn Ile Pro Glu Asp Phe Arg Gly Lys Gly Arg Asp Ile Asp Glu Tyr
165 170 175
gtc tta aag caa tta ttc cac aga acc tac ttc cat gtc aga gtc atc 576
Val Leu Lys Gln Leu Phe His Arg Thr Tyr Phe His Val Arg Val Ile
180 185 190
aac gac atc ata ggt gct tct ttc gct ggt gct ttg aag aat gtt gtt 624
Asn Asp Ile Ile Gly Ala Ser Phe Ala Gly Ala Leu Lys Asn Val Val
195 200 205
gcc tgt gct gtt ggt ttc gtt atc ggt gcc ggc tgg ggt gac aac gct 672
Ala Cys Ala Val Gly Phe Val Ile Gly Ala Gly Trp Gly Asp Asn Ala
210 215 220
aag gcc gct atc atg aga atc ggt atc aga gaa atc atc cac ttt gcc 720
Lys Ala Ala Ile Met Arg Ile Gly Ile Arg Glu Ile Ile His Phe Ala
225 230 235 240
tct tac tac caa aag ttc ggt gtc aag ggt cca gct cca gaa tcc act 768
Ser Tyr Tyr Gln Lys Phe Gly Val Lys Gly Pro Ala Pro Glu Ser Thr
245 250 255
act ttc act gag gaa tct gcc ggt gtc gct gac tta atc acc act tgt 816
Thr Phe Thr Glu Glu Ser Ala Gly Val Ala Asp Leu Ile Thr Thr Cys
260 265 270
tcc ggt ggt aga aat gtc aag gtt gct aga tac atg att gaa aac aac 864
Ser Gly Gly Arg Asn Val Lys Val Ala Arg Tyr Met Ile Glu Asn Asn
275 280 285
gtt gac gct tgg gaa gcc gaa aag att gtc tta aag ggt caa tct tct 912
Val Asp Ala Trp Glu Ala Glu Lys Ile Val Leu Lys Gly Gln Ser Ser
290 295 300
caa ggt atc tta act gcc aag gaa gtc cac gaa ttg tta act aac tac 960
Gln Gly Ile Leu Thr Ala Lys Glu Val His Glu Leu Leu Thr Asn Tyr
305 310 315 320
aac tta tcg aat gaa ttc cca tta ttt gaa gcc gta tac 999
Asn Leu Ser Asn Glu Phe Pro Leu Phe Glu Ala Val
325 330
<210>40
<211>332
<212>PRT
<213>漢遜德巴利酵母
<400>40
Gly Ser Gly Asn Trp Gly Thr Ala Val Ala Lys Ile Val Ser Glu Asn
1 5 10 15
Thr Ala Glu Lys Pro Glu Val Phe Glu Lys Gln Val Asn Met Trp Val
20 25 30
Phe Glu Glu Glu Val Asp Gly Gln Lys Leu Thr Glu Ile Ile Asn Ala
35 40 45
Lys His Glu Asn Val Lys Tyr Leu Pro Glu Val Lys Leu Pro Glu Asn
50 55 60
Leu Val Ala Asn Pro Asp Val Val Asp Thr Val Lys Asp Ala Asp Leu
65 70 75 80
Leu Ile Phe Asn Ile Pro His Gln Phe Leu Pro Arg Val Cys Lys Gln
85 90 95
Leu Val Gly His Val Lys Pro Ser Ala Arg Ala Ile Ser Cys Leu Lys
100 105 110
Gly Leu Glu Val Gly Pro Glu Gly Cys Lys Leu Leu Ser Gln Ser Ile
115 120 125
Asn Asp Thr Leu Gly Val His Cys Gly Val Leu Ser Gly Ala Asn Ile
130 135 140
Ala Asn Glu Val Ala Arg Glu Arg Trp Ser Glu Thr Thr Ile Ala Tyr
145 150 155 160
Asn Ile Pro Glu Asp Phe Arg Gly Lys Gly Arg Asp Ile Asp Glu Tyr
165 170 175
Val Leu Lys Gln Leu Phe His Arg Thr Tyr Phe His Val Arg Val Ile
180 185 190
Asn Asp Ile Ile Gly Ala Ser Phe Ala Gly Ala Leu Lys Asn Val Val
195 200 205
Ala Cys Ala Val Gly Phe Val Ile Gly Ala Gly Trp Gly Asp Asn Ala
210 215 220
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225 230 235 240
Ser Tyr Tyr Gln Lys Phe Gly Val Lys Gly Pro Ala Pro Glu Ser Thr
245 250 255
Thr Phe Thr Glu Glu Ser Ala Gly Val Ala Asp Leu Ile Thr Thr Cys
260 265 270
Ser Gly Gly Arg Asn Val Lys Val Ala Arg Tyr Met Ile Glu Asn Asn
275 280 285
Val Asp Ala Trp Glu Ala Glu Lys Ile Val Leu Lys Gly Gln Ser Ser
290 295 300
Gln Gly Ile Leu Thr Ala Lys Glu Val His Glu Leu Leu Thr Asn Tyr
305 310 315 320
Asn Leu Ser Asn Glu Phe Pro Leu Phe Glu Ala Val
325 330
權(quán)利要求
1.在轉(zhuǎn)基因油料作物中提高總含油量的方法，其中該轉(zhuǎn)基因油料作物包含按重量計(jì)占總脂肪酸含量至少20％的油酸并且所述方法包含下述方法步驟
a)將編碼來(lái)自酵母的甘油3-磷酸脫氫酶的核酸序列導(dǎo)入油料作物中，
b)在該油料作物中表達(dá)由該核酸編碼的甘油3-磷酸脫氫酶，以及
c)篩選在植物中的總含油量按重量計(jì)比非轉(zhuǎn)基因植物提高至少25％的油料作物。
2.提高轉(zhuǎn)基因油料作物中的總含油量的方法，其中該轉(zhuǎn)基因油料作物包含按重量計(jì)占總脂肪酸含量至少20％的油酸，并且在該植物中的總含油量按重量計(jì)比非轉(zhuǎn)基因植物提高至少45％。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中該編碼甘油3-磷酸脫氫酶的核酸序列衍生自酵母，該酵母選自如下屬隱球菌屬、球擬酵母屬、瓶形酵母屬、酒香酵母屬、假絲酵母屬、克勒克酵母屬、三角酵母屬、絲孢酵母屬、紅酵母屬、擲孢酵母屬、布勒彈孢酵母屬、酵母屬、德巴利酵母屬、油脂酵母屬、漢遜酵母屬、擬內(nèi)孢霉屬、畢赤酵母屬和有孢漢遜酵母屬。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的方法，其中該編碼甘油3-磷酸脫氫酶的核酸序列衍生自酵母，該酵母選自如下種釀酒酵母、巴斯德畢赤酵母、多形漢遜酵母、粟酒裂殖酵母、乳酸克魯維酵母、魯氏接合酵母、解脂耶氏酵母、構(gòu)巢裸殼孢菌、漢遜德巴利酵母和Torulaspora hansenii。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的方法，其中由該核酸序列編碼的甘油3-磷酸脫氫酶使用NADH或NADPH作為共底物將二羥丙酮磷酸轉(zhuǎn)化為甘油3-磷酸，并且具有包含至少一個(gè)選自如下序列基序的序列基序的肽序列
i)GSGNWGT(A/T)IAK
ii)CG(V/A)LSGAN(L/I/V)AXE(V/I)A
iii)(L/V)FXRPYFXV
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的方法，其中由該核酸序列編碼的甘油3-磷酸脫氫酶使用NADH或NADPH作為共底物將二羥丙酮磷酸轉(zhuǎn)化為甘油3-磷酸，并且具有包含至少一個(gè)選自如下序列基序的序列基序的肽序列
iv)GSGNWGTTIAKV(V/I)AEN
v)NT(K/R)HQNVKYLP
vi)D(I/V)LVFN(I/V)PHQFL
vii)RA(I/V)SCLKGFE
viii)CGALSGANLA(P/T)EVA
ix)LFHRPYFHV
x)GLGEII(K/R)FG。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6的方法，其中由該核酸序列編碼的甘油3-磷酸脫氫酶另外還包含至少一個(gè)選自如下序列基序的序列基序
xi)H(E/Q)NVKYL
xii)(D/N)(I/V)(L/I)V(F/W)(V/N)(L/I/V)PHQF(V/L/I)
xiii)(A/G)(I/V)SC(L/I)KG
xiv)G(L/M)(L/G)E(M/I)(I/Q)(R/K/N)F(G/S/A)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的方法，其中編碼甘油3-磷酸脫氫酶的核酸序列選自
a)具有SEQ ID NO2、4、5、7、9、11、12、14、16、38或40所示序列的核酸序列，或者
b)編碼與SEQ ID NO2所示序列具有至少60％同一性的蛋白質(zhì)的、a)的功能等價(jià)物。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的方法，其中為了表達(dá)根據(jù)權(quán)利要求1(a)和(b)的核酸序列，將該序列與啟動(dòng)子或者終止子可操作地連接。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的方法，其中油料作物的種子中的總含油量被提高。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中該油料作物的種子在植物生長(zhǎng)之后收獲，并且如果合適，分離存在于該種子中的油。
12.根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的方法，其中該油料作物選自腰果、落花生、琉璃苣、蕓苔、歐洲油菜、蕪青、芥菜、亞麻薺、大麻、Curthamustinctorius、椰子、海甘藍(lán)、Cuphea ciliata、油棕、大豆、陸地棉、海島棉、草棉、向日葵、亞麻、月見(jiàn)草、油橄欖、蓖麻、玉蜀黍、核桃和扁桃。
13.根據(jù)權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)的方法，其中在該轉(zhuǎn)基因油料作物中，不僅總含油量提高，而且甘油3-磷酸的含量按重量計(jì)提高至少20％。
14.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中存在于油中的脂肪酸被釋放出來(lái)。
15.根據(jù)權(quán)利要求10或11的方法，其中將該油或者該已經(jīng)被釋放出來(lái)的脂肪酸添加到聚合物、食品、飼料、化妝品、藥物或者具有工業(yè)應(yīng)用的產(chǎn)品中，或者用作潤(rùn)滑劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及通過(guò)表達(dá)來(lái)自酵母，優(yōu)選來(lái)自釀酒酵母的甘油3-磷酸脫氫酶(G3PDH)而提高轉(zhuǎn)基因油料作物中的總含油量和/或甘油3-磷酸含量的方法，該轉(zhuǎn)基因油料作物，優(yōu)選在植物種子中，包含按重量計(jì)為總脂肪酸含量之至少20％的油酸。由該方法獲得的油和/或游離脂肪酸可以有利地被添加到聚合物、食品、飼料、化妝品、藥物或者具有工業(yè)應(yīng)用的產(chǎn)品中。
文檔編號(hào)C12N15/82GK101356278SQ200680050502
公開(kāi)日2009年1月28日 申請(qǐng)日期2006年11月6日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月7日
發(fā)明者T·燦克, O·奧斯瓦德, J·鮑爾, H·維格奧拉斯, P·蓋根貝格爾, P·瓦爾德克, M·斯蒂特 申請(qǐng)人:馬克思-普朗克科學(xué)促進(jìn)協(xié)會(huì)公司, 巴斯福植物科學(xué)有限公司