專利名稱：檢測病原體的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及特別針對(duì)與性傳播疾病相關(guān)的生物的診斷學(xué)，更具體地涉
及人乳頭瘤病毒(HP V)基因型、尤其是生殖器人乳頭瘤病毒基因型的檢測。
背景技術(shù)：
人乳頭瘤病毒及其重要性
據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)報(bào)告，宮頸癌是女性癌癥死亡的第二個(gè)最常見 的起因。HPV感染的存在已證明與全世界99。/。以上的宮頸癌相關(guān)。據(jù)估計(jì)， 全世界每年500，000以上的女性罹患宮頸癌，且273，000以上的病例是致死 的。即便使用Pap篩選程序，每年仍有大量女性死于宮頸癌。
HPV感染是全世界最頻繁的性傳播(STD)疾病，多至60%的性行為活 躍的女性在其一生中會(huì)^皮HPV感染生殖道一次。不論HPV感染的狀態(tài)如 何，不到l/10，000的女性會(huì)發(fā)生浸潤性宮頸癌(invasive cervical cancer)。大 部分HPV感染的女性不發(fā)生細(xì)胞異常或癌癥的事實(shí)解釋了在HPV感染的 女性中子宮頸疾病向癌癥發(fā)展的調(diào)節(jié)因素的重要性。這些因素可包括HPV 基因型和分子變體、HPV病毒載量、HPV感染的持久性、與其它STD物質(zhì) 的共感染、宿主的免疫狀態(tài)和環(huán)境因素如吸煙。
乳頭瘤病毒是小DNA病毒，其感染哺乳動(dòng)物上皮細(xì)胞，引起上皮增生 性病變，所述病變可以是良性的，例如纖維乳頭瘤(肉贅)，或其可以是惡 性的。所有的乳頭瘤病毒是相似的，因?yàn)樗鼈児蚕砘蚪M大小、排布、開 放讀碼框和蛋白質(zhì)功能。許多(但不是所有)基因組區(qū)域在多種乳頭瘤病毒 間是保守的。
因?yàn)槿轭^瘤病毒生活周期和宿主細(xì)胞分化狀態(tài)之間密切相關(guān)，乳頭瘤
病毒生活周期的細(xì)節(jié)尚未完全闡明。已知乳頭瘤病毒感染宿主上皮基底細(xì) 胞，在此病毒基因組得以建立并作為低拷貝數(shù)附加體維持，所述附加體與 宿主細(xì)胞復(fù)制協(xié)調(diào)復(fù)制。因?yàn)楸桓腥镜募?xì)胞分化為角質(zhì)形成細(xì)胞，所以病
毒DNA被擴(kuò)增、晚期基因被誘導(dǎo)，并且隨后乳頭瘤病毒進(jìn)行增殖復(fù)制。
乳頭瘤病毒感染廣泛的動(dòng)物，包括人。人乳頭瘤病毒(HPV)(包括乳頭 瘤病毒科(尸印說o附flWnV/ffe) ， a- 、 p- 、 y- 、 S畫丑型乳頭瘤病毒屬 (7VfM/7fl盧7/o附flv/r"s)和未分類的乳頭瘤病毒屬)是性傳播疾病的主要原因。 已經(jīng)通過DNA序列數(shù)據(jù)鑒定了若干類型的HPV，并且迄今為止完全測序了 96種HPV基因型。HPV的基因分型是以L1、 E6和E7基因的DNA序列為基 礎(chǔ)的。相對(duì)于先前確定的菌林而言10。/。的序列差異足夠定義新的病毒類型。 人乳頭瘤病毒群體的異質(zhì)性一般描述于deVilliers， 1989， J. Virology 63:4898-4903中，其被并入本文作為參考。大量HPV類型的基因組已經(jīng)被 測序和/或表4正。
HPV是DNA腫瘤病毒，其基因組被排布在三個(gè)區(qū)域內(nèi)早期基因(E1 到E7)、晚期基因(Ll和L2)區(qū)域和上游調(diào)控區(qū)(URR)或長控制區(qū)(LCR)。 URR擁有針對(duì)許多轉(zhuǎn)錄阻遏物和激活劑的結(jié)合位點(diǎn)，提示其可參與確定特 定HPV類型的宿主范圍。同時(shí)，E1和E2編碼的蛋白質(zhì)對(duì)于染色體外DNA 復(fù)制和病毒生活周期的完成是至關(guān)重要的。E2編碼兩個(gè)蛋白質(zhì) 一個(gè)抑制 早期區(qū)的轉(zhuǎn)錄；另一個(gè)提高早期區(qū)的轉(zhuǎn)錄。HPV相關(guān)宮頸癌的標(biāo)致是病毒 E2蛋白質(zhì)表達(dá)的缺失。最近描述了一個(gè)新的E2蛋白質(zhì)，其由小E8 0RF的 產(chǎn)物和E2蛋白質(zhì)的部分組成。該蛋白質(zhì)能夠阻抑病毒復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，因此被 認(rèn)為在病毒潛伏期中具有重要作用。
E4蛋白質(zhì)在完整病毒體得以裝配的感染晚期表達(dá)，并已知不具有轉(zhuǎn)化 特性；然而，其被認(rèn)為對(duì)病毒的成熟和復(fù)制起重要作用。E4蛋白質(zhì)也誘導(dǎo) 人角質(zhì)形成細(xì)胞中細(xì)胞質(zhì)的細(xì)胞角蛋白網(wǎng)絡(luò)的崩潰，該情況可加速病毒體 從被感染的細(xì)胞中釋放。
同時(shí)，E5開放讀碼框(ORF)通常在宮頸癌細(xì)胞中被刪除，指示其在維 持宿主細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化中可能不是必需的。E5存在時(shí)與多種跨膜蛋白如上
皮生長因子受體、血小板衍生的生長因子P和集落刺激因子相互作用。使
用HP V 16感染的細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)E5蛋白質(zhì)具有弱的轉(zhuǎn)化活性。
在致癌作用中，E6和E7 ORF被認(rèn)為起最重要的作用。這兩個(gè)單位編 碼癌蛋白，所述癌蛋白允許病毒的復(fù)制和具有HPV DNA的細(xì)胞的永生化和轉(zhuǎn)化。
晚期單元L1和L2在病毒體裝配的晚期編碼病毒衣殼蛋白。L1編碼的蛋 白質(zhì)在不同的乳頭瘤病毒物種間是高度保守的。L2編碼的較小的衣殼蛋白 與L1蛋白質(zhì)序列相比具有更多序列變異。
HPV能夠感染皮膚或組織內(nèi)襯的基底上皮細(xì)胞，并因此被歸為表皮類 型或粘膜(肛門生殖器)類型。
HPV DNA在良性宮頸前體病變中通常是染色體外的或附加體。然而， 在許多宮頸癌細(xì)胞以及宮頸癌細(xì)胞系和體外HPV轉(zhuǎn)化的人角質(zhì)形成細(xì)胞 中，HPVDNA被整合進(jìn)宿主基因組中。
癌組織可同時(shí)含有附加體和整合的HPV DNA,盡管整合顯示在HPV 18相關(guān)的宮頸癌中比在HPV 16相關(guān)的宮頸癌中更頻繁地發(fā)生。整合的HPV 16存在于一些癌前病變中，但并不總是存在于癌中。在HPV DNA整合期間， 病毒基因組通常在E1/E2區(qū)域中斷裂。斷裂通常導(dǎo)致E1和E2區(qū)域的喪失。 已知E2 (其編碼蛋白質(zhì)，包括抑制E6和E7區(qū)轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì))的喪失導(dǎo)致E6 和E7致癌蛋白失控和增加的表達(dá)。同時(shí)，已經(jīng)觀察到增加的E6和E7表達(dá)導(dǎo) 致宿主細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化和腫瘤形成。HPV病毒進(jìn)入宿主基因組DNA的整合 伴隨著宮頸上皮內(nèi)瘤(CIN)從多克隆到單克隆狀態(tài)的發(fā)展，這些事件在從低 級(jí)到高級(jí)子宮頸瘤的發(fā)展中起根本作用。
DNA拷貝數(shù)失衡(CNI)模式是子宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變(SIL)級(jí)別、人乳 頭瘤病毒(HPV)狀態(tài)和術(shù)后復(fù)發(fā)的特征。盡管在HG-SIL (高級(jí)SIL)和 LG-SIL(低級(jí)SIL)中以相似的頻率觀察到一些CNI，但是在發(fā)現(xiàn)其它(包括 lq、3q和16q的增加)在HG-SIL而非LG-SIL中頻繁出現(xiàn)。在顯示缺失HPV16 E2基因的HG-SIL和在隨后復(fù)發(fā)的HG-SIL中存在顯著更多的CNI/病例。所 述數(shù)據(jù)與宮頸SIL發(fā)展中的CNI相繼獲得相一致。與E2基因缺失相關(guān)的更
高的CNI頻率支持這樣的體外證據(jù)即高危型HPV整合與基因組不穩(wěn)定性 有關(guān)。
基于可獲得的分子、臨床和流行病學(xué)數(shù)據(jù)，明確HPV的一個(gè)亞類為宮 頸癌及其前體的病原體。已經(jīng)在約90%的宮頸腺癌和鱗狀上皮細(xì)胞癌中檢 測到HPV。大部分HPV感染自發(fā)清除，但是已經(jīng)在來自子宮頸腫瘤的轉(zhuǎn)移 灶中發(fā)現(xiàn)HPV DNA的持續(xù)感染。然而已知的高危型(或致癌)HPV是宮頸 癌的重要風(fēng)險(xiǎn)因子，并且日益發(fā)現(xiàn)它們?cè)谄渌┌Y中的作用。事實(shí)上所有 宮頸癌(99。/。)含有高危型HPV的基因，最常見的是類型16、 18、 31和45。 其它高危型包括31、 33、 35、 39、 45、 51、 52、 56、 58、 59、 68和73型。 HPV31、 33、 35、 51和52有時(shí)被認(rèn)為是"中危型"，因?yàn)樗鼈兏Ｒ娪谳p 度或嚴(yán)重的發(fā)育異常病變(dysplastic lesion)而不是癌。在高危型菌林中， HPV16和18是與宮頸癌最密切相關(guān)的。已經(jīng)在50%以上的鱗狀上皮細(xì)胞癌 中發(fā)現(xiàn)HPV16DNA，而在50。/。以上的腺癌中發(fā)現(xiàn)HPV18DNA。然而，大 部分肛門生殖器HPV具有致癌能力。
HPV與宿主細(xì)胞的相互作用具有兩個(gè)主要的生物學(xué)后果
a) 所有的肛門生殖器HPV誘導(dǎo)低級(jí)鱗狀病變，其為生產(chǎn)性感染 (productive infection)與正常E6、 E7表達(dá)帶來的永生化表型的形態(tài)學(xué)關(guān)聯(lián)。 永生化是乳頭瘤病毒利用資源進(jìn)行DNA復(fù)制并產(chǎn)生新后代的固有策略。
b) 罕見的是，HPV誘導(dǎo)增殖性上皮表型，此公認(rèn)為高級(jí)病變，并且是 浸潤性宮頸癌的近端細(xì)胞組織學(xué)前體(proximate cytohistologic precursor),這可能涉及失控的E6、 E7表達(dá)。
迄今為止，與HPV感染相關(guān)的臨床疾病以及HPV檢測和分型方法的潛 在應(yīng)用領(lǐng)域包括尖銳濕疣、硬化性莒蘚(lichensclerosus)、鱗狀細(xì)胞增生 (squamosus cell hyperplasia)、 夕卜陰上皮內(nèi)瘤變(vulvar intraepithelial neoplasia)、 鱗狀細(xì)胞癌(squamosus cell carcinoma)、 宮頸上皮內(nèi)瘤變 (cervical intraepithelial neoplasia)、宮頸癌、子宮頸腺癌、膽門上皮內(nèi)瘤變 (anal intraepithelial neoplasia)、 陰莖上皮內(nèi)瘤變(penile intraepithelial neoplasia)、喉腺癌(adenocarcinoma of the larynx)、 復(fù)發(fā)性呼吸系統(tǒng)享L頭
ii
瘤病(recurrent respiratory papillomatosis)， 和祝狀表皮發(fā)育不良 (epidermodysplasias verruciformis)。最近的證據(jù)提示HPV同才羊可在男'I"生前 列腺癌的發(fā)生中起作用。
使用巴氏染色法(Papanicolaou Stain)即以發(fā)明人George Papanicolaou 命名的巴氏涂片(Pap Smear)，對(duì)宮頸癌前體病變(上皮內(nèi)病變)或細(xì)胞學(xué)異 常進(jìn)行測試。該技術(shù)包括將子宮頸刮取物(cervical scrape)涂抹在玻璃片上， 并用核染料蘇木精對(duì)得自肛門生殖道的細(xì)胞進(jìn)行染色。然而巴氏涂片缺乏 可重復(fù)性，并且不足以預(yù)測即將發(fā)生的HPV誘導(dǎo)的瘤變。已經(jīng)顯示25%高 級(jí)原位癌的患者在診斷前數(shù)年可顯示正常的巴氏涂片，或在宮頸癌病例中 末次陰性細(xì)胞學(xué)在復(fù)查時(shí)一致為陽性。日漸普遍的問題是陰性巴氏涂片3 年內(nèi)浸潤性癌癥的發(fā)生。
目前可接受的假陰性率(即，根據(jù)觀察組織活檢而非涂片樣品的病理學(xué) 家專業(yè)儀器判斷的確患有發(fā)育異常，但是在常規(guī)涂片篩選中未予診斷的女 性)為大約5-10%，但是最近的研究提出實(shí)際的比率要高得多。另外，在約 7-8%的病例中，巴氏涂片顯示了無明確診斷意義的非典型鱗狀上皮細(xì)胞 (atypical squamous cells of undetermined significance, ASCUS)。 在另夕卜 20-30%的病例中，巴氏涂片由于存在炎癥細(xì)胞而不足以判讀。在子宮頸的 情況下，(通過陰道鏡檢查顯現(xiàn)的)平疣是可疑的癌前病變。平疣到原位癌 和宮頸癌的組織病理學(xué)發(fā)展已有充分描述。
上皮內(nèi)病變是患有偶發(fā)HPV感染的女性中常見的早期事件，偶發(fā) HPV-16或HPV-18感染和活檢確認(rèn)的CIN級(jí)別2-3之間的間隔似乎相對(duì)較 短。然而，研究證明高危型HPV的感染通常是瞬時(shí)的。HPV感染的持久性 顯著地增加發(fā)展成高級(jí)上皮內(nèi)病變和浸潤性疾病的風(fēng)險(xiǎn)。
疾病的發(fā)展是可變的，并與HPV的喪失或持續(xù)相關(guān)。大量的發(fā)育異常 病變自發(fā)退化，其它不能發(fā)展，而少數(shù)則發(fā)展迅速。
作為宮頸癌中高危型基因型選擇作用的結(jié)果，而且由于其它病理學(xué)狀 況不同、繼發(fā)(cons叫uential)和特征性的類型模式，HPV的鑒定和分型均 非常重要。另外，不同的高危型HPV對(duì)受染個(gè)體造成不同的風(fēng)險(xiǎn)。例如，
與其它HPV類型相比，HPV16和HPV18更一致地在高級(jí)宮頸發(fā)育異常和宮 頸癌中鑒定。HPV16在鱗狀癌(squamosuscarcinoma)病例中更為流行，而 HPV18在腺癌病例中更為流行。
從1980起，已經(jīng)克隆了若干種病毒基因組并在HPV診斷中用作類型特 異性探針。已利用濾膜雜交技術(shù)在與常規(guī)細(xì)胞學(xué)樣品一起收集的子宮頸刮 取物中檢測HPV DNA。已利用HPV DNA探針進(jìn)行不同的基于雜交的測定 (例如Southern (DNA雜交)和雜交印跡/Southern測定)，以檢測來自臨床的 組織樣品中的HPV DNA。另外，已經(jīng)展示了經(jīng)純化的活檢DNA和保存的 組織標(biāo)本中的原位雜交，即在完整的細(xì)胞中直接定位與核酸揮:針互補(bǔ)的序 列。
已經(jīng)報(bào)導(dǎo)了使用反向印跡(reverse-blotting)操作檢測HPV DNA類型的 方法。該操作包括形成膜，從而來自四種不同HPV類型的基因組DNA與所 述膜結(jié)合，然后使來自生物樣品的標(biāo)記的DNA和與膜結(jié)合的DNA雜交。
已經(jīng)開發(fā)了眾多方法使用類型特異性反應(yīng)來檢測人乳頭瘤類型， 一次 檢測一種HPV類型。已經(jīng)使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增和檢測HPV16和 HPV18 DNA的存在，尤其是在口和宮頸活檢中檢測HPV16。已經(jīng)描述了 通過PCR特異性擴(kuò)增類型la、 5、 6a、 8、 11、 16、 18和33的HPV序列的引 物混合物。美國專利No. 4，683，195和4，683，202公開了PCR和PCR在檢測樣 品中核酸序列存在與否方面的用途。
美國專利No. 5,447,839 (其并入本文作為參考)公開了用于HPV檢測和 分型的方法。在該方法中，使用共有引物(consensusprimer)擴(kuò)增樣品中的 HPV DNA序列，所述共有引物既擴(kuò)增致癌HPV類型又?jǐn)U增非致癌HPV類 型。因此，樣品中HPV的存在由擴(kuò)增產(chǎn)物的形成指示。然后使用類型特異 性DNA探針對(duì)HPV進(jìn)行分型，所述DNA探針與擴(kuò)增的DNA區(qū)域雜交。該 專利中公開的類型特異性雜交探針能夠鑒定和區(qū)分五種已知的HPV致癌 類型，即HPV-6、 HPV-ll、 HPV-16、 HPV-18和HPV-33。
已經(jīng)設(shè)計(jì)了多種用于檢測高危型HPV的方法。許多這些方法依賴于檢 測HPV基因組中的獨(dú)特序列。例如，本領(lǐng)域已經(jīng)報(bào)導(dǎo)了與特定的高危型 HPV菌林基因的部分互補(bǔ)的DNA或RNA探針，其適用于在患者樣品中篩選 特定高危型HPV菌林的存在(美國專利No. 4,849,332，并入本文作為參考)。 美國專利No. 5,705,627 (其并入本文作為參考)報(bào)導(dǎo)了使用PCR擴(kuò)增和檢測 HPV DNA，所述PCR使用簡并引物或混合的共有引物，然后使用基因型 特異性DNA探針混合物來分型。使用共有引物的其它實(shí)例可見于美國專利 No. 5，364，758和Kleter，B.等，Am. J. of Pathology,第153巻，第6期，1731-39 (1998)。這些參考文獻(xiàn)也通過參考并入本文。
存在以雜交和信號(hào)擴(kuò)增為基礎(chǔ)的可商業(yè)獲得的方法(Hybrid Capture II， Digene公司)。然而，該方法據(jù)報(bào)導(dǎo)具有特異性方面的問題，因?yàn)镠PV 基因組的一些部分具有高序列同源性。
基于擴(kuò)增的方法包括負(fù)責(zé)靈敏度的部分(擴(kuò)增)，所述部分獨(dú)立于負(fù)責(zé) 特異性的其它部分(通過雜交檢測)。這些技術(shù)在擴(kuò)增的基因組區(qū)段、引物 數(shù)量和檢測技術(shù)方面存在差異。最常用的擴(kuò)增方法為0 5+^ 6+ (通用引 物-GP)、 MY9-MY11、 PGMY、 SPF、 L1C和類型特異性PCR反應(yīng)。最常 用的檢測技術(shù)為序列特異性雜交、限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)和線性探 針測定(LiPA)。有時(shí)(但很少)使用測序或其它方法。擴(kuò)增的分析特性在大 范圍內(nèi)變化，并可通過能夠被擴(kuò)增的基因型數(shù)量、分析靈敏度、基因型擴(kuò) 增/檢測特異性和基因型之間靈敏度的差異來表征。
HPV實(shí)時(shí)PCR
人乳頭瘤病毒-16 (HPV-16)的病毒載量能夠作為預(yù)測高級(jí)子宮頸病變 存在的生物標(biāo)記。已經(jīng)開發(fā)了若干種實(shí)時(shí)PCR測定法，以精確地測量 HPV-16病毒載量(HPV-16L1、 HPV-16E6和HPV-16E6PG)。所述方法教 導(dǎo)我們進(jìn)行實(shí)時(shí)HPV檢測，但是一次只檢測一種基因型。
使用SYBR Green實(shí)時(shí)PCR在青少年發(fā)作的復(fù)發(fā)性呼吸道乳頭瘤病 (juvenile-onset recurrent respiratory papillomatosis)的患者中進(jìn)行HPV
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DNA鑒定。使用該方法在實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)中檢測多種人乳頭瘤病毒基因型。 然而，所述擴(kuò)增方法與本發(fā)明所述的不同。產(chǎn)生的擴(kuò)增子比本領(lǐng)域基于探 針的實(shí)時(shí)擴(kuò)增方法所接受的更長(約450 bp)。優(yōu)選的長度為150 bp或更短。 檢測方法是非特異性的并且不能可靠地區(qū)分基因型，這使得必須隨后使用 實(shí)時(shí)PCR進(jìn)行病毒分型，所述PCR使用針對(duì)HPV類型6、 11、 16、 18、 31 和33的類型特異性引物。這再一次對(duì)種種分離林(isolate)中人乳頭瘤病毒的 類型進(jìn)行檢測，但是一次只能檢測一種基因型。
與》匕類4以，他人通過4吏用單管嵌套反應(yīng)(single-tube nested reaction)方 法以一般方式檢測人乳頭瘤病毒基因型。然而，未描述型別(group)的特異 性檢測。
還使用另一種方法在性伴侶中檢測人乳頭瘤病毒DNA,所述方法使用 兩步途徑評(píng)價(jià)基因型和病毒載量數(shù)據(jù)。該方法使用GP5+Z6+聚合酶鏈?zhǔn)椒?應(yīng)(PRC)，然后;l^向線點(diǎn)分析(reverse-line blot analysis)。該方法;帔用于 在宮頸和陰莖刮取物樣品中檢測45種HPV類型。然后通過基于LightCycler 的實(shí)時(shí)PCR測定法在HPV類型16、 18、 31和33陽性的刮取物樣品中測定病 毒載量。GP5+ZGP6+PCR產(chǎn)生長150bp的擴(kuò)增子，這使得能夠應(yīng)用基于實(shí) 時(shí)探針的方法。然而該方法不能在一個(gè)反應(yīng)中檢測多個(gè)基因型或型別。
使用限制酶消化設(shè)計(jì)了用于核酸擴(kuò)增均相實(shí)時(shí)檢測和定量的方法。在 該均相系統(tǒng)中，檢測由其5，端含有報(bào)告子和猝滅劑部分的引物介導(dǎo)，所述 報(bào)告子和猝滅劑由編碼限制酶識(shí)別序列的短DNA區(qū)段隔開。在單鏈形式 中，來自熒光報(bào)告子的信號(hào)由于熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)而被猝滅。然而， 當(dāng)引物被摻入雙鏈擴(kuò)增子中時(shí)，反應(yīng)中存在的限制酶切割連接報(bào)告子與猝 滅劑的DNA，允許報(bào)告子的無限制性熒光。該體系使用與可切割的能量轉(zhuǎn) 移標(biāo)記組合的、特異于人乳頭瘤病毒(HPV)16E6基因的引物來測試，并被 用于擴(kuò)增HPV16陽性DNA。該方法不能用于檢測多個(gè)基因型或型別。
也已經(jīng)描述了用于同時(shí)定量與高危型宮頸癌相關(guān)的人乳頭瘤病毒類型 的基于實(shí)時(shí)PCR的體系。開發(fā)了用于檢測和定量HPV16、 -18、 -31、 -33、 -35、 -39、 -45、 -52、 -58和-67的實(shí)時(shí)PCR測定法。該測定法以來自每個(gè)患
者樣品的三個(gè)并列實(shí)時(shí)PCR為基礎(chǔ)(i)反應(yīng)1用三種不同的熒光團(tuán)檢測和定 量HPV16、 -31、 -18、和-45(HPV18和-45^f吏用一種探針一起檢測和定量)； (ii)反應(yīng)2再次用三種不同的熒光團(tuán)檢測和定量HPV33、 -35、 -39、 -52、 -58 和-67(HPV33、 -52、 -58和-67—起檢測和定量)，并且僅使用三種不同的揮: 針；和(iii)反應(yīng)3檢測和定量人單拷貝基因(HMBS，智人(i/o/m sfl/;&附)羥 曱基膽色烷合酶；GenBank登錄號(hào)M95623.1)的量。反應(yīng)l包括總共七種 PCR引物和三種探針，反應(yīng)2包括總共七中PCR引物和三種探針，而反應(yīng)3 包括兩種PCR引物和單個(gè)探針。該方法使用TaqMan可水解實(shí)時(shí)PCR探針。 描述了 一個(gè)反應(yīng)中僅有的三種探針在相同反應(yīng)中檢測最多6種基因型的用 途。該方法不能作為通用教導(dǎo)被用于設(shè)計(jì)檢測多個(gè)HPV基因型的反應(yīng)，因 為基因型之間的序列同 一性是有限的。反應(yīng)的擴(kuò)展受到使用基因型之間序 列同一性的限制。
先前已經(jīng)開發(fā)了通過使用熒光5，外切核酸酶測定法檢測和定量致癌人 乳頭瘤病毒(HPV)的方法。該方法以使用針對(duì)HPV類型16、 18、 31、 33和 35的類型特異性探針在單次PCR中擴(kuò)增來自El開放讀碼框3，部分的180-bp 片段為基礎(chǔ)。探針可獨(dú)立使用或每次測定與多達(dá)三種探針組合使用。該方 法局限于每次測定三種探針。
也描述了使用SybrGreen和分子信標(biāo)(molecular beacon)聚合酶鏈?zhǔn)椒?應(yīng)用于人乳頭瘤病毒檢測和基因分型的策略。該測定通過HPV-DNA擴(kuò)增 子的SybrGreen報(bào)告完成一般的HPV檢測，并通過實(shí)時(shí)分子信標(biāo)PCR完成 七種流行HPV類型(HPV畫6、 -11、畫16、 -18、陽31、 -33、隱45)的基因分型。 所述兩步法在一個(gè)PCR反應(yīng)中使用三種不同標(biāo)記的分子信標(biāo)。
也描述了另 一種方法稱為蝎子(Scorpion)的簡并HPV自身探測熒光 引物(self-probing fluorescent primer)和Scorpion混合物與帶尾的通用引物 組合使用。通過使用帶尾的引物使得引入共有位點(diǎn)成為可能，所述共有位 點(diǎn)使得單個(gè)Scorpion能夠識(shí)別許多不同的HPV擴(kuò)增子。這是理論上能夠檢 測超過40種不同HPV類型的兩步過程。在該研究中使用10種Scorpion分型 引物(HPV6、 11、 16、 18、 31、 33、 39、 45、 51、 56)。每種Scorpion的引 物序列是類型特異性的，并位于Jacobs等的GP 6+引物相同的序列位置上。 該方法教導(dǎo)了檢測HPV存在的通用檢測方法和對(duì)陽性樣品分型的類型特 異性檢測方法。其沒有解決用多種探針篩選導(dǎo)致探針交叉反應(yīng)性的問題。 事實(shí)上，該方法避免在一個(gè)反應(yīng)中使用多種探針。
已對(duì)使用實(shí)時(shí)LightCyclerTM和TaqManTM測定的基于實(shí)時(shí)PCR的HPV 檢測方法與常規(guī)6 5+/6+ PCR/酶免疫測定(EIA)進(jìn)行了比較，以評(píng)價(jià)宮頸 刮取物標(biāo)本中的人乳頭瘤病毒栽量。兩種實(shí)時(shí)PCR測定均類似地測定了刮 取物標(biāo)本中的HPV16栽量，但是這些測定與〇？5+/6+ PCR/EIA之間一致性 低，提示后一種方法不適合定量HPVDNA。也已經(jīng)通過同時(shí)檢測兩種HPV 基因類型的實(shí)時(shí)熒光定量PCR測定了 HPV6/11和HPV 16/18 DNA載量。
共有引物設(shè)計(jì)方法
僅用于檢測一種人乳頭瘤病毒核酸分子(例如編碼L1的部分的核酸分 子)的引物和探針可以使用例如計(jì)算機(jī)程序如OLIGO (Molecular Biology Insights Inc., Cascade, Colo.)或Primer3設(shè)計(jì)。這些寡核苷酸的適當(dāng)特征是 本領(lǐng)域技術(shù)人員/>知的。
存在許多關(guān)于PCR引物設(shè)計(jì)通用原則的文獻(xiàn)，導(dǎo)致了大量軟件應(yīng)用， 最值得注意的是Primer3及多種擴(kuò)展。還開發(fā)了用于測試引物配對(duì)相容性 的快速動(dòng)態(tài)編程公式(fast dynamic programming formulation)- 在過去的 數(shù)十年，多元PCR的應(yīng)用穩(wěn)定增長，需要更先進(jìn)的引物選擇方案。不同的 算法可支持特定的對(duì)象，或可以針對(duì)特定的技術(shù)平臺(tái)設(shè)計(jì)。 一般而言，鑒 定引物對(duì)以最大化單個(gè)測定的多元水平的問題已經(jīng)顯示是NP完全問題 (NP-complete)。已提出了消除3，堿基互補(bǔ)性同時(shí)解決產(chǎn)物大小約束 (constraint)的近似算法。
本發(fā)明的方法涉及設(shè)計(jì)多元PCR測定法的問題，尤其是設(shè)計(jì)共有f 1物 的問題。該問題的一般途徑是設(shè)計(jì)共有引物，從而使用少于靶標(biāo)數(shù)量的引 物對(duì)擴(kuò)增眾多靶標(biāo)。而且，設(shè)計(jì)同樣應(yīng)考慮多元PCR測定法的設(shè)計(jì)原則， 所述設(shè)計(jì)原則以共有的皰滲病毒為例進(jìn)行說明。
開發(fā)了基于共有簡并雜種寡核苷酸引物(CODEHOP)鑒定關(guān)系較遠(yuǎn)的 基因序列的特定途徑。具有高保守水平的蛋白質(zhì)短區(qū)域可以被表示為多重 比對(duì)蛋白質(zhì)序列的無空位區(qū)段(ungapped block)。 CODEHOP來自這些保守 的序列區(qū)段，并在PCR中用以擴(kuò)增它們之間的區(qū)域。CODEHOPPCR引物 由引物庫組成，每種引物在3，簡并核心區(qū)中含有不同的序列，其中每種引 物提供可能的密碼子組合(其編碼序列區(qū)段中耙向的3-4個(gè)保守氨基酸基序) 之一。另外，庫中每種引物上具有相同的5，共有鉗區(qū)(clamp region),其來 自編碼側(cè)接靶向基序的保守氨基酸的每個(gè)位置上最可能的核苷酸。通過庫 中3，簡并核心與靶模板具有最大相似性的引物的退火和延伸啟始擴(kuò)增。退 火由5，共有鉗部分穩(wěn)定，所述5，共有鉗部分與革巴模板部分匹配。 一旦引物 被摻入，其成為隨后擴(kuò)增循環(huán)的模板。因?yàn)樗械囊镌?，共有鉗區(qū)是相 同的，所以它們?cè)陔S后幾輪擴(kuò)增中都會(huì)以高嚴(yán)格度退火。該方法同樣用于 病毒學(xué)領(lǐng)域中。該途徑與本發(fā)明的方法是不同的，因?yàn)槠渲械奶禺愋孕蛄?區(qū)段被用于實(shí)現(xiàn)相關(guān)序列的有效擴(kuò)增。Codehop程序?qū)ふ矣糜跀U(kuò)增未知靶 標(biāo)的引物，但是在操作上進(jìn)行蛋白質(zhì)序列比對(duì)而非DNA序列比對(duì)。
存在處理共有/簡并引物設(shè)計(jì)的眾多方法，但是它們通常使用不同的算 法解決基本相同的問題鑒定用于有效擴(kuò)增相關(guān)靶序列的最適引物集合。 引物之間的協(xié)作不考慮在內(nèi)。
另 一 種途徑是PriFi程序 (http:〃cgi-www.daimi.au.dk/cgi-chili/PriFi/main)。該程序設(shè)計(jì)適用于PCR擴(kuò)增物種基因組DNA的引物對(duì)， 所述物種無法使用先前的序列信息。該程序在操作上進(jìn)行來自系統(tǒng)發(fā)生相 關(guān)物種的DNA序列比對(duì)，并輸出滿足許多標(biāo)準(zhǔn)的可能的簡并引物對(duì)列表， 從而所述引物高度可能在其他系統(tǒng)發(fā)生相關(guān)物種中擴(kuò)增直系同源序列。然 而，該程序不使用引物之間協(xié)作的概念。
基于比對(duì)的DNA序列型別設(shè)計(jì)PCR引物的Amplicon程序是類似的方 法。Amplicon的最重要的應(yīng)用是設(shè)計(jì)"型別特異的"PCR引物集合，以擴(kuò) 增來自給定分類型別的DNA區(qū)，而不擴(kuò)增來自其他分類型別的直系同源區(qū) 域。引物之間的協(xié)作仍未予考慮。
關(guān)于如何設(shè)計(jì)擴(kuò)增反應(yīng)引物以通過耙向眾多相關(guān)的擴(kuò)增耙標(biāo)進(jìn)行檢 測，文獻(xiàn)中沒有簡單明了的規(guī)則。然而，普遍接受的是不能預(yù)料的引物之 間的相互作用及其對(duì)擴(kuò)增資源的竟?fàn)幗档土朔磻?yīng)的靈敏度，并且更多的引 物意味著更大的誤引發(fā)概率，產(chǎn)生進(jìn)一步竟?fàn)庂Y源的無特異性產(chǎn)物。
HPV測試在宮頸癌篩選中的可能作用高度依賴于現(xiàn)存的基礎(chǔ)設(shè)施 (infrastructure)。對(duì)于開展有效的、有條理的、基于細(xì)胞學(xué)的程序的臨床 情況而言，焦點(diǎn)在于是否HPV測試對(duì)既有的程序、以及對(duì)目前實(shí)踐的成本 效益、質(zhì)量控制和附加值方面的問題有所裨益。相反，對(duì)于不存在篩選， 或篩選因?yàn)榧?xì)胞學(xué)質(zhì)量差或炎癥涂片的高發(fā)生率引起的固有限制而無效的 情況而言，更基礎(chǔ)的有關(guān)靈敏度、特異性和測試步驟簡單性的問題變得至 關(guān)重要。
實(shí)時(shí)PCR技術(shù)提供了滿足甚至超越上述兩種情形的需求的特征。最近 的研究確定了對(duì)于一些最頻繁的HPV類型而言，HPV DNA的量是發(fā)展為 子宮頸惡性腫瘤(CIS)的決定因素。每個(gè)細(xì)胞的拷貝數(shù)范圍在HPV類型之間 無差異，但是在具有最高病毒載量的百分位數(shù)中CIS的讓步比(odds ratio) 對(duì)于HPV16 (OR = 36.9; 95% CI = 8.9-153.2)而言顯著高于HPV 31 (OR = 3.2; 95% CI = 1.1-9.1)或HPV 18/45 (OR = 2.6; 95% CI = 1.0-6.4)。因此， 在涂片處于鱗狀異常陰性的階段，HPV病毒載量可以預(yù)測子宮頸CIS的未 來風(fēng)險(xiǎn)。實(shí)時(shí)技術(shù)提供了比現(xiàn)存HPV檢測技術(shù)更精確地測定病毒載量的前 提。實(shí)時(shí)技術(shù)提供了勝過現(xiàn)存方法的若干優(yōu)點(diǎn)。然而，尚未開發(fā)出在一個(gè) 反應(yīng)中能夠檢測三種以上人乳頭瘤病毒的實(shí)時(shí)擴(kuò)增和檢測方法。另外，尚 未開發(fā)出在一個(gè)反應(yīng)中分型別類地檢測臨床上重要的病毒型別(例如種種 低危型或高危型人乳頭瘤病毒)的方法。
精確的自取樣(self-sampled) HPV測試具有巨大的意義。這類測試展開 了評(píng)價(jià)否則不愿意或不能夠進(jìn)行骨盆檢的女性的可能性。在不發(fā)達(dá)地區(qū)， 這會(huì)提供勝過目前實(shí)踐的優(yōu)點(diǎn)。在開展有組織的篩選的地區(qū)，自取樣提供 了觸及拒絕進(jìn)行常規(guī)篩選的女性中附加途徑，并且可以在HPV陽性細(xì)胞學(xué) 陰性女性治療后的監(jiān)護(hù)或監(jiān)測中起作用，這些女性需要以短間隔進(jìn)行隨訪
檢查。具有接近患者的測試能力的自取樣途徑能夠提高篩選程序的質(zhì)量和
可及性(accessibility)。
以常規(guī)篩選和初步篩選市場為導(dǎo)向的HP V測試應(yīng)滿足所有這些需求。 實(shí)時(shí)PCR技術(shù)特別適用于在技術(shù)上滿足這些要求。該技術(shù)固有的簡單性有 助于降低基礎(chǔ)設(shè)施障礙，并且也比其它技術(shù)具有成本效益。另一方面，實(shí) 時(shí)PCR技術(shù)會(huì)加強(qiáng)分析的靈敏度和更重要地加強(qiáng)HPV檢測的特異性，提供 了改進(jìn)這些參數(shù)的臨床對(duì)應(yīng)物的更堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。內(nèi)部對(duì)照為該體系增加了 質(zhì)量控制能力。
在HPV檢測的接近患者的應(yīng)用中，實(shí)時(shí)技術(shù)是最可行的選擇。接近患 者的測試將是初步篩選中的下一前沿，而實(shí)時(shí)技術(shù)在該領(lǐng)域中其它病原體 的病例中已經(jīng)引起了大量關(guān)注，并可在實(shí)踐中提供附加值。
與其它方法相比實(shí)時(shí)PCR提高的靈敏度，以及實(shí)時(shí)PCR提供的特征改 進(jìn)(包括樣品納入(sample containment)和擴(kuò)增的產(chǎn)物的實(shí)時(shí)檢測)表明了 執(zhí)行該技術(shù)用于臨床實(shí)驗(yàn)室中人乳頭瘤病毒感染常規(guī)診斷的可行性。

發(fā)明內(nèi)容
第一方面，本發(fā)明提供了檢測至少一種病原體存在的方法，所述方法 包括將得自樣品的核酸與包含至少四個(gè)探針的集合接觸，其中每種所述探
針包含與來自病原體的序列互補(bǔ)的、側(cè)接四對(duì)或五對(duì)互補(bǔ)堿基的序列，其 中所述堿基在不與來自病原體的核酸雜交時(shí)形成莖結(jié)構(gòu)，其中所述探針用 第一相互作用標(biāo)記和第二相互作用標(biāo)記標(biāo)記，從而所述探針與來自病原體 的核酸的雜交引起檢測信號(hào)的改變。
本文4吏用術(shù)語"核酸"是指DNA和多種形式的RNA如mRNA和 hnRNA。核酸可以是單鏈的或雙鏈的。
本文使用術(shù)語"病原體"表示破壞動(dòng)物的正常生理，引起或伴隨著疾 病和病癥的生物因子。病原體可以是致病因子，即單獨(dú)或存在一種或多種 其它輔因子時(shí)用病原體感染患者產(chǎn)生疾病。
優(yōu)選病原體是與性傳播疾病相關(guān)的生物。本文使用術(shù)語"與性傳播疾
病相關(guān)的生物"表示遭受性傳播疾病的患者中存在的生物。與性傳播疾病
相關(guān)的生物的實(shí)例包括與衣原體(chlamydia)相關(guān)的沙眼衣原體(CMflwj^Zfl ^""c/r函fl,is)、 與淋病(Gonorrhoea)相關(guān)的淋病奈瑟菌(TVWwmVi ^mon7i^fle)、與生殖器皰疹相關(guān)的單純皰疹病毒(HSV)、與生殖器疣相關(guān) 的人乳頭瘤病毒，和與梅毒(Syphilis)相關(guān)的梅毒螺旋體(7>e/w"ema /7fl//,V/MW)。生物優(yōu)選為病毒，更優(yōu)選為人乳頭瘤病毒(HPV)。所述方法優(yōu) 選用于檢測一種或多種HPV基因型的存在。
盡管本發(fā)明的方法涉及病原體的檢測，但是所述方法可用于檢測任何 生物的存在與否，尤其是含有多于一種亞種的生物，或相關(guān)的生物。本文 使用"相關(guān)的生物"是指來自相同綱、屬或種，并具有高水平遺傳相似性 的生物，優(yōu)選至少80%的同一性，更優(yōu)選卯％。相關(guān)生物優(yōu)選為病毒，更 優(yōu)選人乳頭瘤病毒。
每種探針優(yōu)選具有通式結(jié)構(gòu)
3，-莖-F-HPV互補(bǔ)序列-F，-莖，—5，
F和F，是任選的連接序列，其將互補(bǔ)序列和側(cè)翼堿基對(duì)、莖和莖，連接 起來。莖和莖，是由互補(bǔ)堿基對(duì)形成的序列，所述互補(bǔ)堿基對(duì)在溶液中形成 雙螺旋莖結(jié)構(gòu)。這些序列優(yōu)選是回文的。優(yōu)選在探針的每一端存在4個(gè)堿基。 構(gòu)成莖的堿基優(yōu)選包含C-G對(duì)，優(yōu)選包含l、 2、 3、 4或5個(gè)C-G對(duì)。莖優(yōu)選 具有序列CGCG。
在我們的實(shí)驗(yàn)中確定，不存在可檢測的靶標(biāo)DNA時(shí)，四個(gè)堿基對(duì)莖分 子信標(biāo)隨著時(shí)間的推移不彼此相互作用引起不可預(yù)見的假擴(kuò)增信號(hào)，這似 乎依賴于莖結(jié)構(gòu)的開關(guān)速率(on-off rate)。偶爾需要使用五堿基對(duì)莖分子信 標(biāo)來優(yōu)化反應(yīng)。具有較長莖的信標(biāo)在單一檢測和多元檢測中均造成失控的 假擴(kuò)增信號(hào)。具有更短莖的信標(biāo)通常具有過低的解鏈溫度，而不能在實(shí)時(shí) 擴(kuò)增反應(yīng)中使用。
本文使用術(shù)語"相互作用標(biāo)記，，是指標(biāo)記對(duì)中一個(gè)標(biāo)記與標(biāo)記對(duì)的另 一個(gè)協(xié)作。該協(xié)作發(fā)生于標(biāo)記密切接近時(shí)，例如當(dāng)探針具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)時(shí)。 當(dāng)探針與互補(bǔ)核酸雜交時(shí)，標(biāo)記之間的協(xié)作減小或完全去除，因?yàn)樗鼈冎?br> 21
間的距離增加。標(biāo)記在探針的每一端附著于探針，優(yōu)選位于形成莖環(huán)結(jié)構(gòu) 的堿基上或與之相鄰。標(biāo)記附著在哪里并不重要，條件是當(dāng)探針從一種構(gòu) 象變?yōu)榱硪环N(即莖環(huán)打開)時(shí)能夠檢測到信號(hào)改變。當(dāng)探針處于開放位置 時(shí)(即其與互補(bǔ)的核酸序列雜交時(shí)，例如一個(gè)相互作用標(biāo)記猝滅來自第二個(gè) 相互作用標(biāo)記的信號(hào)時(shí))，信號(hào)改變可以是信號(hào)的增強(qiáng)?；蛘弋?dāng)探針處于開 放位置時(shí)(即其與互補(bǔ)的核酸序列雜交時(shí)，例如第一相互作用標(biāo)記引起來自 第二相互作用信號(hào)的信號(hào)被發(fā)射)，信號(hào)改變可以是信號(hào)的減弱。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，相互作用標(biāo)記是FRET供體和相應(yīng)的FRET受體。
FRET技術(shù)(參閱例如美國專利No. 4,996,143、 5,565,322、 S，849，489和 6，162，603)基于這樣的事實(shí)即當(dāng)供體和相應(yīng)的受體熒光部分被定位為彼此 之間處于某距離時(shí)，在兩個(gè)熒光部分之間發(fā)生能量轉(zhuǎn)移，所述能量轉(zhuǎn)移可 視或以其它方式被檢測和/或定量。本文使用FRET技術(shù)形式利用分子信標(biāo) 技術(shù)檢測人乳頭瘤病毒的存在與否。分子信標(biāo)技術(shù)使用雜交探針，所述雜 交探針用供體熒光部分和受體熒光部分標(biāo)記。熒光標(biāo)記通常位于探針的每 一端。分子信標(biāo)技術(shù)使用具有允許二級(jí)結(jié)構(gòu)形成(例如發(fā)夾)的序列的探針 寡核苷酸。作為4笨針內(nèi)二級(jí)結(jié)構(gòu)形成的結(jié)果，當(dāng)探針在溶液中時(shí)，兩個(gè)熒 光部分在空間上接近。與靶核酸(即HPV基因型核酸)雜交后，探針的二級(jí) 結(jié)構(gòu)被破壞并且熒光部分彼此分離，從而用合適波長的光激發(fā)后，第一熒 光部分的發(fā)射與不存在來自HPV基因型的核酸時(shí)所檢測的發(fā)射不同。
本文就供體和相應(yīng)受體焚光部分而言使用"相應(yīng)的"是指受體熒光部 分具有與供體熒光部分的激發(fā)光譜重疊的發(fā)射光譜。受體熒光部分的發(fā)射
光語的最大波長優(yōu)選應(yīng)比供體熒光部分的激發(fā)光譜的最大波長至少大IOO irni。因此，有效的非輻射能量轉(zhuǎn)移可以在它們中間產(chǎn)生。
通常選擇熒光供體和受體部分用于(a)高效Forster能量轉(zhuǎn)移；(b)巨大 的最終Stokes遷移(〉100 nm); (c)發(fā)射盡可能遠(yuǎn)地遷移進(jìn)入可見光語的紅光 部分(>600 nm);和(d)發(fā)射遷移至比在供體激發(fā)波長激發(fā)產(chǎn)生的拉曼 (Raman)水焚光發(fā)射更高的波長。例如，可選擇供體熒光部分，從而具有
接近激光線(例如氦-鎘442 nm或氬488nm)的激發(fā)最大值、高消光系數(shù)、高 量子產(chǎn)率和其熒光發(fā)射與相應(yīng)的受體熒光部分激發(fā)光鐠的良好重疊?？蛇x 擇相應(yīng)的受體熒光部分，從而具有高消光系數(shù)、高量子產(chǎn)率、其激發(fā)與受 體熒光部分發(fā)射和可見光譜紅光部分發(fā)射(>600 nm)的良好重疊。
在FRET技術(shù)中可與多種受體熒光部分一起使用的代表性供體焚光部 分包括焚光素(fluorescein)、熒光黃(Lucifer Yellow)、 B-藻紅蛋白、9-吖咬 異硫氰酸鹽(9-acridineisothiocyanate)、熒光黃VS、 4畫乙酰胺基-4，陽異硫代國 氛酸荒-2，2，畫二碌酸(4-acetamido-4，-isothio-cyanatostilbene-2，2，誦disulfonic acid)、 7-二乙氨基-3-(4，-異疏氰酰苯基)-4-曱基香豆素、琥珀酰亞胺基l-吡 P定酸(succinimdyl l-pyrenebutyrate)、 4-乙酰氨基-4，-異硫代氰酸芪-2，2，國二 碌酸衍生物(4- acetamido-4，-isothiocyanatostilbene-2，2，-disulfonic acid derivatives),任意取代的芘類、蒽類、萘類、吖啶類、芪類、吲咮類、苯 并吲味類、噁唑類、苯并噁唑類、噻唑類、苯并噻唑類、4-氨基-7-硝基苯 并-2-氧雜國1，3-二峻類(4畫3111^10-7- nitrobenz曙2-oxa-l，3-diazoles)、花菁類、 羰花菁類、喹諾酮類(carbostyryls)、卟啉類(porphyrins),水楊酸類、鄰氨 基苯甲酸類、甘菊藍(lán)類(azulenes)、茈類、吡啶類、喹啉類、香豆素類、 polyazaindacenes、卩占p屯類、巧悉"桊類、苯并5惡"秦類(benzoxazines)、卡巴"桊 類(carbazines)、次聯(lián)苯甲酮類(phenalenones)、苯次聯(lián)苯曱酮類 (benzphenalenones)、卡巴嚷類、鳴喚類、4-bora-3a，4a-diaza-s-indacenes、 fluorophoresceins 、 羅丹明類、對(duì)甲氨基酚類(rhodols) 、 5-carboxyfluorophoresceins (FAM)、 5-(2，-氨乙基)氨基奈誦l-磺酸類(EDANS)、 鄰氨基苯曱酰胺類(anthranilamides)、 一試螯合物類(terbium chelates)、活性 紅4 (Reactive Red 4)、德克薩斯紅類(Texas reds)、 ATTO類染料、EVO類 染料、DYO類染料、Alexa類染料和BODLPY類染料。
取決于使用的供體熒光部分，代表性的受體熒光部分包括 LC.TM.畫RED 640 (LightCycler.TM.畫Red 640畫N-羥基琥珀酰亞胺酯)、 LCTM. -RED 705 (LightCycler.TM.-Red 705-亞磷酰胺)、花菁類染料如 CY5和CY5.5、麗絲胺羅丹明B磺酰氯(Lissamine rhodamine B sulfonyl
chloride)、四曱基羅丹明異硫氰酸鹽、羅丹明x異硫氰酸鹽、赤蘚紅異硫氰 酸鹽(erythrosine isothiocyanate)、 焚光素、二亞乙基三胺五乙酸酯 (diethylenetriamine pentaacetate)或鑭系離子(例々口銪或鋱)的其它螫合物。 供體和受體熒光部分可得自例如分子探針公司(Molecular Probes, Junction City, Oreg.)或希格瑪化學(xué)公司(Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.)。
優(yōu)選受體熒光部分為猝滅劑。本文使用猝滅劑是指減少由熒光標(biāo)記發(fā) 射的熒光的部分。這包括完全和部分抑制焚光的發(fā)射。抑制程度并不重要， 只要去除猝滅劑就能檢測到熒光改變即可。
猝滅部分優(yōu)選選自任意取代的苯基類、萘基類、蒽基類(anthracenyls)、 苯并噻唑類、苯并嗜、唑類、或苯并咪唑類、芘類、蒽類、萘類、吖啶類、 芪類、吲哚類、苯并吲哚類、噁唑類、苯并噍唑類、噻唑類、苯并噻唑類、
4- 氨基-7-硝基苯并-2-氧雜-l，3-二唑類、花菁類、羰花菁類、會(huì)諾酮類、卟 啉類、水楊酸類、鄰氨基苯曱酸類、甘菊藍(lán)類、茈類、吡啶類、會(huì)啉類、 香豆素類、polyazaindacenes、 ^噸類、？惡嗪類、苯并^i，秦類、卡巴噪類、 次聯(lián)苯甲酮類、苯次聯(lián)苯甲酮類、卡巴嗪類、、噪嗪類、4-bora-3a，4a-diaza畫s畫indacenes、 fluorophorescdns、 羅丹明類、對(duì)甲氨基酚類、
5- carboxyfluorophoresceins (FAM) 、 5-(2，陽氨乙基)氨基奈-l-磺酸類 (EDANS)、鄰氨基苯甲酰胺類、鋱螯合物類、活性紅4、 dabcyls、硝基酪 氨酸類、孔雀石綠類、德克薩斯紅類、二硝基苯類、ATTO類染料、EVO 類染料、DYO類染料、Alexa類染料和BODLPY類染料。
合適的FRET供體和受體或猝滅劑的選擇落入技術(shù)人員知識(shí)范圍內(nèi)。 通常，如果檢測到的FRET量與缺乏人乳頭瘤病毒核酸分子的樣品中 的FRET在量統(tǒng)計(jì)學(xué)上有差異，則表明個(gè)體中存在人乳頭瘤病毒。探針與 核酸的雜交增加了供體和受體部分之間的距離，從而減少了 FRET相互作 用。例如，當(dāng)使用猝滅劑時(shí)，檢測到的波長發(fā)射的改變可以是發(fā)射的增加 或不同波長處的發(fā)射?；蛘呤褂梅氢绻w受體時(shí)，可以存在發(fā)射減少或 不同波長處的發(fā)射。
可以使用例如光子計(jì)數(shù)落射焚光顯微鏡系統(tǒng)(epifluorescent
microscope system)(含有適當(dāng)?shù)亩R和濾膜用于監(jiān)測特定范圍內(nèi)的熒光
發(fā)射)、光子計(jì)數(shù)光電倍增系統(tǒng)，或熒光計(jì)進(jìn)行熒光分析?？梢允褂脷咫x子
激光器、高強(qiáng)度汞(Hg)弧光燈、光纖光源或被適當(dāng)過濾用于在期望的范圍
內(nèi)激發(fā)的其它高強(qiáng)度光源進(jìn)行激發(fā)以啟動(dòng)能量轉(zhuǎn)移。
供體和受體熒光部分優(yōu)選附著于連接序列上的探針。供體和受體熒光
部分可以通過連接臂附著于適當(dāng)?shù)奶结樄押塑账?。各連接臂的長度也是重 要的，因?yàn)檫B接臂會(huì)影響供體熒光部分和受體熒光部分之間的距離。就本 發(fā)明的目的而言，連接臂的長度是以埃(ANG)計(jì)的、從核苷酸堿基到熒光 部分的距離。通常，連接臂為約10到約25 ANG。連接臂可以是WO 84/03285 中所述的種類。WO 84/03285還公開了將連接臂附著于特定的核苷酸堿基 的方法，以及將熒光部分附著于連接臂的方法。
探針必須與病原體或性傳播疾病相關(guān)生物的核酸具有足夠水平的同一 性，從而能夠在合適的條件下與來自一種或多種病原體或性傳播疾病相關(guān) 生物的核酸雜交。如果一條單鏈核酸與另一條之間形成雙鏈體，則稱它們 彼此雜交。這發(fā)生在一條核酸含有的序列與另一條的反向或互補(bǔ)的情況下
成為:螺旋構(gòu)型的^礎(chǔ)):雜交區(qū)域之間的完全互補(bǔ)性不是形i雙鏈體所必
需的；只需配對(duì)堿基的數(shù)量足以在所用的雜交條件下維持雙鏈體即可。通 常期望探針序列和病原體基因組序列之間存在一個(gè)或多個(gè)錯(cuò)配。這是防止 探針中形成不想要的二級(jí)結(jié)構(gòu)所必需的。因此，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中， 探針中病原體獨(dú)特的序列含有與病原體基因組序列的至少一個(gè)錯(cuò)配。合適 的雜交條件是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。例如42'C 0.2xSSC/0.1% SDS (對(duì) 中等嚴(yán)格條件而言)；和68。C O.lxSSC (對(duì)高嚴(yán)格條件而言)。洗滌可僅使 用給定條件之一進(jìn)行，或每種條件都可使用(例如以上文所列順序在每種條 件下洗滌10-15分鐘)?？梢灾貜?fù)任何或所有洗滌。最適條件可有所不同， 并可由技術(shù)人員根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定。
探針和病原體核酸之間的同 一性程度可根據(jù)探針的功能變化。例如，可使用探針鑒定病原體所有亞種如所有HPV基因型的存在，在該情況下 探針應(yīng)具有與這樣的序列雜交的序列，所述序列來自在所有亞種如HPV基 因型中高度保守的核酸區(qū)域。
可使用揮:針檢測來自某危險(xiǎn)型別(例如高風(fēng)險(xiǎn)或低風(fēng)險(xiǎn)的基因型等)的
病原體(例如HPV基因型)的存在。應(yīng)相應(yīng)地設(shè)計(jì)探針序列。例如，探針可 以被設(shè)計(jì)為檢測高風(fēng)險(xiǎn)基因型，能夠結(jié)合類型31、 33、 35、 39、 45、 51、 52、 56、 58、 59、 68和73，而不結(jié)合來自其它基因型的核酸。它們被稱作 "危險(xiǎn)型別探針"。
或者，每種探針可以具有這樣的序列，所述序列與一種特定基因型的 可變區(qū)具有高水平相似性，從而所述探針能夠僅與來自該基因型的核酸雜 交。這類探針被稱作"基因型特異性的"。人乳頭瘤病毒類型特異性探針的 成員可以在定義的基因型特異性區(qū)域內(nèi)雜交，優(yōu)選所擴(kuò)增的DNA上包含 SEQ ID NO: 53到103的那些區(qū)域。HPV基因型特異性探針優(yōu)選包含選自 SEQ ID NO: 33到52或SEQ ID No. 105到117的序列。這些序列形成了病原 體獨(dú)特序列的全部或部分。
探針集合包含至少四種探針，優(yōu)選5、 10、 15或20種不同的探針。這些 探針被仔細(xì)地設(shè)計(jì)，使得莖環(huán)結(jié)構(gòu)的"環(huán)，，中含有的序列不僅與待檢測核 酸中的期望序列雜交，而且它們與其它探針環(huán)中的序列不形成二級(jí)結(jié)構(gòu)。 因此，探針環(huán)部分的序列通常不僅僅是與待檢測基因組中序列100%互補(bǔ)的
序列。優(yōu)選人乳頭瘤病毒類型特異性探針能夠在定義的類型特異性區(qū)域中 雜交，優(yōu)選包含SEQIDNO: 53到103或SEQ ID NO. 105到117的那些區(qū)域。 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，每種探針包含選自SEQ ID NO: 33到52或SEQ IDNO. 105到117的序列。在尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中，探針集合包括 5，TET-CGGCGGGTCATCCTTATTTTTCCATAAGCCG-Dabcyl國3， 5，TET-CGGCGGGACATCCATATTACTCTATCAAAGCCG-Dabcyl-3" 5，TET-CGCGGGTCACCCTTATTACTCTATTACAAAACGCG-Dabcyl-3' 5'TET-CCGGCACCCATATTTCCCCCTTAAACCGG-Dabcyl-3' 5'TET畫CCGGACGACCAGCAAACAAGACACCCGG國Dabcyl畫3' 5'FAM-CGGCCAATAACAAAATATTAGTTCCTAAAGCCG國Dabcyl國3， 5，F(xiàn)AM畫CCGGTATCCTGCTTATTGCCACCCCGG畫Dabcyl-3" 5'FAM畫CGGCCATACCTAAATCTGACAATCCGCCG國Dabcyl-3， 5，F(xiàn)AM畫GCCGTTTTTTAGCGTTAGTAGGATTTTTCGGC-Dabcyl-3， 5,FAM畫CGGCAAAACAAGATTCTAATAAAATAGCAGCCG-Dabcyl-3" 5,FAM畫CGGCTTAAAGTGGGTATGAATGGTTGGCCG-Dabcyl-3， 5，F(xiàn)AM-CCGGGCTGTTCCTAAGGTATCCGCCGG-Dabcyl-3， 5，F(xiàn)AM-CGGCAGCACGCGTTGAGGTTTTAGCCG隱Dabcyl-3' 5'FAM-CCGGAGTTTTAGTTCCCAAGGTGTCCCGG-Dabcyl-3" 5，F(xiàn)AM隱CCCGCTGTGACTAAGGACAATACCAAACGGG-Dabcyl國3， 5'FAM-CGGCTTCCATCAAAAGTCCCAATAACGCCG-Dabcyl-3， 5'FAM-CGGCAAAGGTGGTAATGGTAGACAGGGCCG-Dabcyl-3" 5，F(xiàn)AM-CGGCAATCTGGTACCAAAACAAACATCGCCG-Dabcyl-3" 5，F(xiàn)AM畫CGGCTTAAGGTTCCTATGTCTGGGGGCCG誦Dabcyl-3，和 5'(德克薩斯紅)-TTTTTT-(熒光素)畫CGGCTGACATAGATCCCCATAGACAG TTGCCG-Dabcyl-3:
來自特定危險(xiǎn)型別的病原體的存在可以用兩種方式檢測。首先可以使 用"危險(xiǎn)型別"探針。優(yōu)選探針集合含有多于一種類型的危險(xiǎn)型別探針， 其中每種類型被差異標(biāo)記。例如，高危險(xiǎn)型別探針能夠與低危險(xiǎn)型別探針 區(qū)分開。因此，能夠檢測到來自任一危險(xiǎn)型別的病原體(例如HPV)的存在。 或者探針組可包含基因型特異性探針，其中針對(duì)來自某危險(xiǎn)型別的基因型 (例如高風(fēng)險(xiǎn)基因型)的所有探針均用相同的相互作用標(biāo)記進(jìn)行標(biāo)記。因此， 不能測定存在的特定基因型的身份，但是可以確認(rèn)來自某型別的基因型的 存在。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，方法還包括測定雙鏈核酸分子的解鏈溫度，所 述雙鏈核酸分子由所述探針之一和得自所述樣品的互補(bǔ)核酸形成。因?yàn)槊?種探針具有某核酸序列，所以雙鏈核酸分子的解鏈溫度對(duì)于每種探針而言 是獨(dú)特的，所述雙鏈核酸分子由探針和得自所述樣品的互補(bǔ)核酸形成。因
此，能夠檢測存在的特定病原體或基因型。例如，可以使用針對(duì)某危險(xiǎn)型 別的基因型特異性探針來確定是否存在來自該型別的基因型。然后可以測 定解鏈溫度以鑒定存在何種特定的基因型。
可以在進(jìn)行了檢測人乳頭瘤病毒科、屬或型別的方法之后，或與檢測
人乳頭瘤病毒的方法同時(shí)，進(jìn)行檢測個(gè)體HPV類型的方法。
如果^f吏用多于一種探針，則它們可彼此區(qū)分開，即在某波長下激發(fā)時(shí) 每種探針可檢測地發(fā)射不同的信號(hào)。因此如果使用兩種探針， 一種與來自 病原體的核酸雜交時(shí)在一個(gè)波長發(fā)射，所述波長能夠與溶液中兩種探針發(fā)
另一個(gè)探針與來自病原體的核酸雜交時(shí)發(fā)射的波長區(qū)分開。這允許同時(shí)顯 現(xiàn)與核酸雜交的兩種探針的存在。或者用不同的相互作用標(biāo)記(例如FRET 供體)標(biāo)記兩種探針，所述標(biāo)記在不同的波長激發(fā)。
這可通過使用相互作用標(biāo)記(例如FRET供體和受體)的不同的組合實(shí) 現(xiàn)。感興趣的標(biāo)記的合適組合的選擇對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是常規(guī)的。
在。優(yōu)選探針與固相支持物結(jié)合，從而每種類型的探針位于空間限定的位 置，所述位置能夠與其它探針的位置區(qū)分開。這允許使用以相同或相似的 相互作用標(biāo)記進(jìn)行標(biāo)記的探針(其在相同或相似的波長產(chǎn)生信號(hào))，同時(shí)又 提供了區(qū)分每種探針產(chǎn)生的信號(hào)的方式。或者，可以標(biāo)記探針使得每種類 型的探針產(chǎn)生不同的信號(hào)。技術(shù)人員會(huì)明白，大量可能的固相支持物在陣 列領(lǐng)域內(nèi)是廣泛使用的，并且任何這些"基質(zhì)"均能夠用于本發(fā)明探針陣 列的生產(chǎn)中。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，提供了用于構(gòu)建反應(yīng)的方法，所述反應(yīng)在 一個(gè)反應(yīng)中使用至少四種實(shí)時(shí)分子信標(biāo)探針來檢測靶向眾多相關(guān)的檢測靶 標(biāo)。所述方法包括選擇探針結(jié)合位點(diǎn)，確定滿足通常應(yīng)用于探針的標(biāo)準(zhǔn)的 探針序列(即針對(duì)完全互補(bǔ)性計(jì)算機(jī)程序如Primer3檢查探針)，和對(duì)探針序 列兩端均添加堿基(優(yōu)選四個(gè)或五個(gè)堿基)使得它們互補(bǔ)并能夠形成雙鏈 莖，所述雙鏈莖精確地剛好包括所述寡核苷酸的兩端。這些結(jié)構(gòu)一般被稱
作四莖分子信標(biāo)。另外，在接近平衡加熱和冷卻率測量時(shí)，探針序列的解 鏈溫度應(yīng)當(dāng)高于莖結(jié)構(gòu)的解鏈溫度。四莖分子信標(biāo)通常比其它莖長度更有 利，因?yàn)槠渚哂斜雀L莖分子信標(biāo)更短的開關(guān)速率，并具有比更短莖分子 信標(biāo)更高的解鏈溫度。
通常，探針混合物的成員與擴(kuò)增產(chǎn)物在某定義的類型特異性區(qū)域中雜 交。探針通常在一端用供體熒光部分標(biāo)記，而在另一端通常用相應(yīng)的受體 或猝滅劑熒光部分標(biāo)記。在一些實(shí)施方案中，供體熒光部分可含有焚光染
料的特異性復(fù)合物，包括所謂的采集染料(harvesterdye)，以遷移探針的發(fā) 射波長，從而提供獨(dú)特的熒光信號(hào)用于檢測。所述方法還包括檢測供體焚 光部分和受體或猝滅劑熒光部分之間熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)的存在、不 存在或改變。FRET的存在或改變指示著生物樣品中存在人乳頭瘤病毒， 而FRET的不存在指示生物樣品中不存在人乳頭瘤病毒。
通常，核酸與探針雜交并在被供體熒光部分吸收的波長下被激發(fā)。通 過顯現(xiàn)和/或測量由受體或猝滅劑焚光部分發(fā)射的波長，檢測結(jié)合探針的存 在與否?；蛘呖梢酝ㄟ^定量FRET檢測。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在與所述探針集合接觸之前，擴(kuò)增得自樣 品的核酸。優(yōu)選使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增反應(yīng)可以是PCR (參閱例如美國專利No. 4,683,195和4,683,202，和Innis等編輯，PCR Protocols, (Academic Press, New York, 1989); Sambrook等，《分子克隆》 (Molecular Cloning),第二版，(Cold Spring Harbour Laboratory, New York 1989))。當(dāng)RNA被分離并(優(yōu)選通過反轉(zhuǎn)錄)轉(zhuǎn)化為cDNA時(shí)，也可以使 用PCR。優(yōu)選使用Taq DNA聚合酶例如AmplitaqTM (珀金埃爾默公司， Perkin-Elmer， Norwalk， Conn.)進(jìn)行PCR 。 Taq聚合酶可得自MBI Fermentas7/^司，珀金埃爾默公司(Perkin Elmer)，寶靈曼公司(Boehringer Mannheim)和貝克曼儀器公司(Beckman Instruments),本發(fā)明的方法中也 可以使用等同的、優(yōu)選熱穩(wěn)定的DNA聚合酶，例如Tfl (黃色棲熱菌 //"v附))聚合酶(Gut等，Wro/. 3fe幼o(hù)ffe 77(1): 37-46 (1999))。
或者，擴(kuò)增反應(yīng)可以是RT-PCR (Yajima等，C7,Vi. Oiem, 44(12):
29
2441-2445 (1998); Martell等，/ Af/cra6,W， 37(2): 327- 332 (1999); Gut 等，飽/i油77(1): 37-46 (1999); Predhomme等，丄e"A:簡fl, 13(6): 957-964 (1999))，其中RNA被反轉(zhuǎn)錄為cDNA，隨后對(duì)所述cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
眾所周知，PCR包括DNA (或RNA)樣品的提取和(優(yōu)選通過熱)變性。 與聚合酶(其可以是熱穩(wěn)定的)、用于形成被擴(kuò)增的序列的dNTP—起，添加 摩爾過量的寡核苷酸引物。設(shè)計(jì)寡核苷酸引物，與期望擴(kuò)增序列的相反末 端雜交。在第一輪擴(kuò)增中，聚合酶復(fù)制DNA，產(chǎn)生兩條始于相應(yīng)引物的"長 產(chǎn)物"。然后變性總DNA并進(jìn)行第二輪聚合反應(yīng)(例如通過降低溫度)，所述 總DNA包括所述兩條長產(chǎn)物和兩條原始鏈。第二輪的結(jié)果是兩條原始鏈、 來自第一輪的兩條長產(chǎn)物、(產(chǎn)自原始鏈的)兩條新的長產(chǎn)物，和產(chǎn)自長產(chǎn) 物的兩條"短產(chǎn)物"。這些短產(chǎn)物具有單巴序列(有義或反義)的序列，每個(gè)末 端帶有一個(gè)引物。對(duì)于每輪額外的擴(kuò)增而言，短產(chǎn)物的數(shù)量指數(shù)增長，每 輪產(chǎn)生兩條額外的長產(chǎn)物和大量短產(chǎn)物，所述短產(chǎn)物等于前一輪結(jié)束時(shí)剩 余的長和短產(chǎn)物之和。
寡核苷酸引物可以通過多種途徑合成，例如Ozaki等，TVwc. /4"Vfe / d 20: 5205-5214 (1992); Agrawal等，TV"c.及"18: 5419-5423 (1990)等 等。寡核苷酸引物可通過自動(dòng)DNA合成儀(例如應(yīng)用生物系統(tǒng)公司，Applied Biosystems， Inc， Foster City， California 392或394型DNA/RNA合成儀)使用 標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)如亞磷酰胺化學(xué)(Beaucage和Iyer， 7^m/^rf/wi 48: 2223-2311 (1992)、美國專利No. 4980460、 4725677、 4415732、 4458066和4973679)便 利地合成。也可使用其他化學(xué)(包括非天然主鏈基團(tuán)如硫代磷酸酯和磷酰 胺)，只要得到的寡核苷酸的雜交效率不受不良影響即可。DNA引物的精確 長度和序列將取決于要擴(kuò)增的靶多核苷酸。優(yōu)選DNA引物的長度范圍為10 到60個(gè)核苷酸，更優(yōu)選范圍為15到30個(gè)或25個(gè)核苷酸。
優(yōu)選持續(xù)監(jiān)測擴(kuò)增核酸的產(chǎn)量。本文使用"持續(xù)監(jiān)測"表示定期測量 擴(kuò)增產(chǎn)物的量。例如，可以在第一個(gè)擴(kuò)增循環(huán)后和此后在每一個(gè)、兩個(gè)或 五個(gè)循環(huán)后進(jìn)行讀數(shù)。或者可以在某時(shí)間段(例如每一、二、五或十秒)對(duì)
存在的擴(kuò)增產(chǎn)物的量進(jìn)行測量。這允許"實(shí)時(shí)"地監(jiān)測所述過程。本領(lǐng)域 技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，隨著循環(huán)經(jīng)過退火、擴(kuò)增和變性的不同階段時(shí)，結(jié)合 的探針產(chǎn)生的信號(hào)水平會(huì)波動(dòng)。
與FRET技術(shù)結(jié)合的常規(guī)PCR方法能夠用于實(shí)施本發(fā)明的方法。在一 個(gè)實(shí)施方案中，使用快速熱循環(huán)儀如LIGHTCYCLERTM設(shè)備。
(Roche)網(wǎng)站。以下的專利申請(qǐng)描述了 LIGHTCYCLERtm技木中使用的實(shí) 時(shí)PCR: WO 97/46707、 WO 97/46714和WO 97/46712。 LIGHTCYCLERTM
設(shè)備是利用高品質(zhì)光學(xué)的與小體積焚光計(jì)組合的快速熱循環(huán)儀。該快速熱 循環(huán)技術(shù)使用薄玻璃管作為反應(yīng)器。通過交替的加熱的空氣和環(huán)境空氣來 控制反應(yīng)室的加熱和冷卻。因?yàn)榈偷目諝赓|(zhì)量以及管的高表面積與體積比， 可在熱量室中達(dá)到非?？焖俚臏囟雀淖兯俾?。該設(shè)備允許實(shí)時(shí)和在線地監(jiān) 測PCR。另外，反應(yīng)管起信號(hào)收集光學(xué)元件的作用(與玻璃光纖相似)，將 信號(hào)集中在管端。效果是有效的光照和小體積樣品的熒光監(jiān)測。放置反應(yīng) 管的旋轉(zhuǎn)式傳送帶(carousel)可以從設(shè)備中取出。因此，可以在設(shè)備外對(duì)樣 品上樣(例如在PCR清潔室中)。另外，該特征允許對(duì)樣品旋轉(zhuǎn)式傳送帶容 易地清潔和滅菌。熒光計(jì)作為裝置的一部分放置光源。發(fā)射的光經(jīng)過濾并 由落射光照透鏡(epi-illumination lens)聚焦在管頂。然后用相同的透鏡將從 樣品發(fā)射的熒光聚焦、經(jīng)過二色鏡、適當(dāng)?shù)剡^濾，并聚焦在數(shù)據(jù)收集濾光 片(photohybrid)上。設(shè)備中的光學(xué)單元優(yōu)選包括三帶通濾波器(530 nm、640 nm和710nm),所述濾波器提供了六種色彩的檢測和若干種熒光捕獲選項(xiàng)。 然而，本發(fā)明不受商業(yè)可獲得的設(shè)備的構(gòu)造限制。數(shù)據(jù)收集選項(xiàng)包括每個(gè) 循環(huán)步驟監(jiān)測一次、用于解鏈曲線分析的完全連續(xù)單樣品采集、連續(xù)取樣 (其中取樣頻率取決于樣品數(shù)量)和/或限定的溫度間隔后所有樣品的分步測
機(jī)器將毛細(xì)管相繼地定位到光學(xué)單元上時(shí)獲得來自樣品的信號(hào)。所述軟件 可以在每次測量后立即實(shí)時(shí)展示熒光信號(hào)。熒光采集時(shí)間是10-100 msec。 在每步循環(huán)后，可以對(duì)所有樣品持續(xù)地更新相對(duì)于循環(huán)數(shù)的熒光定量展示。產(chǎn)生的數(shù)據(jù)可存儲(chǔ)用于進(jìn)一步分析。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用至少一個(gè)選自SEQIDNO l到32的引物， 優(yōu)選使用包括SEQ ID NO l到32的引物混合物擴(kuò)增核酸。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該方法使用人工或天然的內(nèi)部對(duì)照DNA， 優(yōu)選通過在不同的、可區(qū)分的波長處檢測信號(hào)或FRET發(fā)射，或不考慮使 用的發(fā)射波長，檢測固相結(jié)合探針的空間可分辨定位處的發(fā)射改變。
上述方法還可以包括防止來自先前擴(kuò)增反應(yīng)的污染核酸的擴(kuò)增。防止 這類不想要的擴(kuò)增可以包括在存在尿嘧啶時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增步驟，并在第一步擴(kuò) 增前用尿嘧啶-DNA糖基化酶處理生物樣品。另外，可以對(duì)獨(dú)立的對(duì)照樣品 進(jìn)行循環(huán)步驟，以確定合適的擴(kuò)增條件。對(duì)照樣品可以包括人乳頭瘤病毒 核酸分子的一部分。或者，這樣的對(duì)照樣品可以使用一對(duì)對(duì)照引物擴(kuò)增并 使用 一對(duì)對(duì)照探針雜交。如果樣品中存在對(duì)照模板且對(duì)照探針與對(duì)照擴(kuò)增 產(chǎn)物雜交，則產(chǎn)生了對(duì)照擴(kuò)增產(chǎn)物。
對(duì)得自生物樣品的核酸進(jìn)行本發(fā)明的方法。代表性的生物樣品包括子 宮頸刮取物、活檢、涂片或石蠟組織切片，人乳頭瘤病毒感染發(fā)生的解剖 學(xué)位點(diǎn)的其它刮取物，和尿。優(yōu)選樣品選自支氣管吸出物(aspirate)、尿液、 前列腺按摩液(massate)、精液(ejaculatum)、血液和宮頸、夕卜陰、肛門、生 殖器、皮膚或喉細(xì)胞學(xué)樣品、刮取物或活組織檢查。
另一方面，本發(fā)明提供了包含至少四種探針的探針集合，其中每種所 述探針包含與來自病原體的序列互補(bǔ)的、側(cè)接四對(duì)或五對(duì)互補(bǔ)堿基的序列， 其中所述堿基在不與來自病原體的核酸雜交時(shí)形成莖結(jié)構(gòu)，其中所述探針 用第一相互作用標(biāo)記和第二相互作用標(biāo)記進(jìn)行標(biāo)記，從而所述探針與來自 所述病原體的核酸的雜交引起檢測信號(hào)的改變。
涉及探針的第一方面的優(yōu)選的實(shí)施方案適用于第二方面。
如上所述，選擇形成探針"環(huán)"部分的序列，使得它們不僅與靶生物 中期望的序列雜交，而且它們與其它探針的環(huán)區(qū)域不形成二級(jí)結(jié)構(gòu)。因此， 第三方面，本發(fā)明提供了包含SEQ ID NO. 33到52或SEQ ID NO. 105-117 中任一的核酸序列。這些核酸序列可在其它方法中用于檢測一種或多種
HPV基因型的存在。因此，本發(fā)明還提供了本發(fā)明的核酸用于檢測至少一 種HPV基因型存在與否的用途。優(yōu)選在持續(xù)監(jiān)測得自樣品的核酸的擴(kuò)增的 方法中使用所述核酸。
這類方法包括TAQMANtm技木，序列作為scorpion分子一部分的用途 和其它基于PCR的方法。
TAQMANTM技術(shù)檢測擴(kuò)增產(chǎn)物的存在與否，從而檢測人乳頭瘤病毒的 存在與否。TAQMANTM技術(shù)利用一個(gè)單鏈雜交探針，所述探針用兩種焚光 部分標(biāo)記。當(dāng)?shù)谝粺晒獠糠直缓线m波長的光激發(fā)時(shí)，根據(jù)FRET的原理， 吸收的能量被轉(zhuǎn)移至第二熒光部分。第二熒光部分通常是猝滅劑分子。在 PCR反應(yīng)的退火步驟中，標(biāo)記的雜交探針與耙DNA結(jié)合，并在隨后的延伸 階段被Taq聚合酶的5，到3，外切核酸酶活性降解。結(jié)果，被激發(fā)的焚光部 分和第二熒光部分彼此在空間上被隔開。結(jié)果，不存在第二熒光部分時(shí)激
發(fā)笫一熒光后，來自第一熒光部分的熒光發(fā)射可檢測地被改變。例如，如 果第二熒光部分是猝滅劑，來自第一熒光部分的熒光發(fā)射增加，并因此可 以被檢測。舉例而言，ABI PRISMA 7700序列檢測系統(tǒng)(應(yīng)用生物系統(tǒng)公 司，Applied Biosystems， Foster City, Calif.)使用TAQMANTM技術(shù)，并適用 于實(shí)施檢測人乳頭瘤病毒的方法。4吏用ABI PRISMTM 7700系統(tǒng)進(jìn)4亍PCR 擴(kuò)增和檢測的信息可見于應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(Applied Biosystems)的網(wǎng)站。 本發(fā)明第六方面提供了鑒定最小引物集合的方法，所述引物擴(kuò)增來自 兩種或多種相關(guān)生物的核酸序列，所述方法包括
(a) 鑒定所述生物之間具有至少30%同一性的引物結(jié)合位點(diǎn)；
(b) 設(shè)計(jì)能夠在(a)中鑒定的引物位點(diǎn)處啟動(dòng)擴(kuò)增的引物集合，其中每 種所述引物與至少一種所述生物的引物結(jié)合位點(diǎn)具有不多于3個(gè)錯(cuò)配，且其 中每種所述引物之間存在4個(gè)或更少核苷酸的差異；和
(c) 確定檢測可能的最大數(shù)目所述生物所需的最小引物數(shù)目；
(d) 確定所述引物集合中確保來自所有所述生物的核酸序列等同擴(kuò)增 所需的每種引物的相對(duì)量。
本文使用"相關(guān)生物"是指來自相同綱、屬或種，并具有高水平遺傳
相似性的生物，優(yōu)選至少80%的同一性，更優(yōu)選卯％同一性。相關(guān)生物優(yōu) 選為病毒，更優(yōu)選人乳頭瘤病毒。引物優(yōu)選擴(kuò)增人乳頭瘤病毒的L1區(qū)。
兩核酸序列的同一性百分比通過將序列就最佳比較的目的(例如可以 在第一個(gè)序列中引入空位，用于與序列最佳比對(duì))進(jìn)行比對(duì)，并比較相應(yīng)位 置上的核苷酸來確定。"最佳比對(duì)"是指導(dǎo)致最高同一性百分比的兩序列比 對(duì)。通過比較的序列中相同的核苷酸數(shù)確定同一性百分比(即同一性％=相 同位置數(shù)/位置總數(shù)x 100)。
可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的數(shù)學(xué)算法完成兩序列之間的同一性百
分比測定。用于比較兩個(gè)序列的數(shù)學(xué)算法的 一個(gè)實(shí)例是Karlin和Altschul (1990)TV"". Sd 87:2264-2268的算法，如Karlin和Altschul
(1993)TV"", y4cfff/. t/5L4卯:5873-5877中所述經(jīng)改良。Altschul等 (1990) / Mo/. 215:403-410的NBLAST和XBLAST程序整合了這樣的 算法。BLAST核苷酸搜索可以使用NBLAST程序進(jìn)行，得分=100，字長=12 以獲得與本發(fā)明核酸分子同源的核苷酸序列。為了獲得有空位的比對(duì)用于 比較的目的，可以如Altschul等(1997) 7Vwc/"c及m. 25:3389-3402中所 述使用空位BLAST (Gapped BLAST)?；蛘呖墒褂肞SI-Blast進(jìn)行重復(fù)搜索 (iterated search),所述搜索檢測分子之間的距離關(guān)系(/句。當(dāng)使用BLAST、 Gapped BLAST和PSI-Blast程序時(shí)，可以使用相應(yīng)程序(例如XBLAST和 NBLAST)的默認(rèn)參數(shù)。用于比較序列的數(shù)學(xué)算法的另 一實(shí)例是Myers和 Miller, CABIOS (1989)的算法。屬于CGC序列比對(duì)軟件包一部分的ALIGN 程序(2.0版)整合了這樣的算法。本領(lǐng)域已知的用于序列分析的其它算法包 才舌如Torellis和Robotti (1994) Cb附pW. 5Zo化i'， 10:3-5所述的
ADVANCE和ADAM;和Pearson和Lipman (1988) /Voc. 7Va汰Jc^w/. Sd. 55:2444-8中所述的FASTA。在FASTA中，ktup是設(shè)定搜索靈敏度和速度的 控制選項(xiàng)。
最小引物集合是含有從所需的盡可能多的相關(guān)生物中擴(kuò)增核,列所 需的最小數(shù)目引物的引物集合。所述引物集合可任選地含有校正引物，其 被用于在特定引物結(jié)合位點(diǎn)上控制引物之間的引發(fā)差異。校正引物應(yīng)當(dāng)與
引物結(jié)合位點(diǎn)具有不多于三個(gè)錯(cuò)配，所述引物結(jié)合位點(diǎn)是它們被設(shè)計(jì)作用 的引物結(jié)合位點(diǎn)。校正引物的添加有助于在檢測中產(chǎn)生至少為所有旨在被 檢測生物(例如所有人乳頭瘤病毒)的兩個(gè)數(shù)量級(jí)或更高的靈敏度水平。
本文使用"錯(cuò)配"是指引物中的堿基不根據(jù)Watson-Crick堿基配對(duì)原 則與引物結(jié)合位點(diǎn)中相應(yīng)的堿基形成堿基對(duì)。在兩個(gè)相應(yīng)的堿基不符合 Watson-Crick標(biāo)準(zhǔn)(例如C-T、 G-A)的情況下形成錯(cuò)配。錯(cuò)配優(yōu)選在引物最 接近5，端的一半中，更優(yōu)選形成引物5，端之前的3個(gè)核苷酸。
引物集合中的每種引物之間僅存在4個(gè)或更少核苷酸的差異。因此，如 果引物在長度上全部為15個(gè)核苷酸，則一種引物中的ll個(gè)核苷酸與其它每 種引物中的ll個(gè)核苷酸相同。相同的核苷酸優(yōu)選不是連續(xù)的。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，提供了用于構(gòu)建高度復(fù)雜的人乳頭瘤病毒 擴(kuò)增多元反應(yīng)的方法。所述方法包括選擇適當(dāng)接近的保守的引物結(jié)合位點(diǎn) (少于70。/。變異性)。所述引物結(jié)合位點(diǎn)應(yīng)當(dāng)以彼此間這樣的距離定位，所 述距離確保產(chǎn)生適當(dāng)大小的擴(kuò)增子。優(yōu)選產(chǎn)生長度為30-160個(gè)核苷酸的擴(kuò) 增子，更優(yōu)選長度為40-120、 50-100、 60-90或70-80個(gè)核苷酸。尤其優(yōu)選長 度130和160個(gè)核苷酸的擴(kuò)增子。引物構(gòu)成了所產(chǎn)生的擴(kuò)增子的部分。引物 優(yōu)選長度為10-30個(gè)核苷酸，更優(yōu)選長度為12-25、 15-22或18、 19、 20或21 個(gè)核苷酸。然后確定完整的引物集合的序列，其中引物滿足通常施加于引 物的標(biāo)準(zhǔn)(即針對(duì)完全互補(bǔ)性計(jì)算機(jī)程序如Primer3檢查引物)，并設(shè)計(jì)與所 有旨在被擴(kuò)增的相關(guān)生物(如人乳頭瘤病毒類型)僅具有三個(gè)錯(cuò)配(優(yōu)選位于 引物一端，更優(yōu)選位于5，端)的可能的最小引物數(shù)。另外，所述引物應(yīng)與幾 乎等同數(shù)目的類型結(jié)合，而具有不多于三個(gè)錯(cuò)配。其它擴(kuò)增差異通過改變 引物的相對(duì)濃度控制。得到的檢測靈敏度優(yōu)選對(duì)旨在檢測的所有相關(guān)生物 (例如人乳頭瘤病毒類型)而言在至少兩個(gè)數(shù)量級(jí)之內(nèi)。
相對(duì)于近來本領(lǐng)域所遵循的后續(xù)添加引物和試錯(cuò)法的技術(shù)而言，這為 重大的成就。設(shè)計(jì)的方法使竟?fàn)幈３肿钚×俊４嬖卺槍?duì)所有靶標(biāo)的被校正 的引發(fā)效率，導(dǎo)致高度等同的擴(kuò)增靈敏度。另外，通過確保引物優(yōu)選在其5， 端可變降低了誤引發(fā)的概率。
引物混合物能夠擴(kuò)增至少一種人乳頭瘤病毒類型L1區(qū)，優(yōu)選包含SEQ ID NO. 53到103。優(yōu)選包含至少一個(gè)來自SEQ ID NO. 1到16的正向引物和 至少一個(gè)來自SEQ ID N017到32的反向引物。
本發(fā)明的第七方面提供了可以通過第六方面的方法獲得的引物集合， 所述集合包含至少一個(gè)選自SEQIDNO l到32的引物。優(yōu)選包含至少一個(gè) 來自SEQ ID NO. 1到16的正向引物和至少一個(gè)來自SEQ ID NO 17到32的 反向引物。更優(yōu)選包括SEQIDN0 1到32。
另一方面，本發(fā)明提供了用于檢測一種或多種病原體的試劑盒，所述 試劑盒包含第二方面定義的探針集合。所述試劑盒優(yōu)選還包含根據(jù)第六方 面的方法鑒定的引物集合。
另外，本發(fā)明提供了用于檢測一種或多種病原體的試劑盒，所述試劑 盒包含根據(jù)第六方面的方法鑒定的引物集合。
優(yōu)選所述試劑盒可用于檢測與性傳播疾病相關(guān)的一種或多種生物，優(yōu) 選HPV基因型。優(yōu)選探針包含選自SEQ ID NO. 17到33的序列。探針集合 優(yōu)選包含至少一個(gè)選自SEQ ID NO l到32的序列，更優(yōu)選至少一個(gè)選自Seq ID No 1到16的序列和至少一個(gè)選自SEQ ID NO 17-32的序列。最優(yōu)選引物 混合物包括SEQ ID NO. l-32的引物。
優(yōu)選試劑盒還包含內(nèi)部對(duì)照。
試劑盒還包含包裝標(biāo)簽或包裝插頁，其上記載著有關(guān)使用引物混合物 和探針檢測生物樣品中人乳頭瘤病毒存在與否的說明書。
試劑盒可還包含其它成分，例如PCR所需的試劑。這類試劑包括緩沖 液、合適的DNA聚合酶，和dNTP如dATP、 dCTP、 dGTP和dTTP。試劑 盒成分可以存在于大量瓶或其它容器中。試劑可以是凍干的，隨后在用前 重構(gòu)。或者所述成分可以提供在即用型的適當(dāng)緩沖的溶液中。這類溶液可 含有合適的防腐劑。
除非另有說明，本文使用的所有科技術(shù)語具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技 術(shù)人員通常所理解的相同含義。下文描述了合適的方法和材料，不過與本 文公開的相似或等同的方法和材料可用于本發(fā)明的實(shí)施或檢驗(yàn)。另外，材
料、方法和實(shí)施例僅用于舉例說明目的而非旨在限制。本文提到的所有的 出版物、專利申請(qǐng)、專利和其它參考文獻(xiàn)都以其整體并入本文作為參考。 在沖突的情況下，以本說明書(包括定義)為準(zhǔn)。
本發(fā)明通過以下的非限制性實(shí)施例舉例說明。本發(fā)明的其它特征、對(duì) 象和優(yōu)點(diǎn)將會(huì)由于附圖
和詳細(xì)說明以及權(quán)利要求書而變得顯而易見。
實(shí)施例l
實(shí)時(shí)PCR檢測高危型和低危型HPV DNA
總反應(yīng)體積為20 nl,包括以下成分2 pi (~0，2 pg)克隆的HPV DNA、 18 nl聚合酶緩沖液(終濃度90 mM TRIS-HCl (pH=8，0)、 1 mM DTT、 50 mM KC1、 7mMMgCl2、 1% Tween-20 (希格瑪公司，SIGMA)、 1% Ficoll、 1% PVP、 250 nM每種dNTP (ATP， CTP, GTP， TTP)(普洛麥格公司，Promega)、 0,28 jiM每種引物SEQ. ID. NO: 1-32、 0.18 jiM每種分子信標(biāo)SEQ. ID. N():33-52，和7，5 U AmpliTaq Gold DNA聚合酶(羅氏，ROCHE))。反應(yīng)在 LightCycler 2.0 PCR熱循環(huán)儀中進(jìn)行，參數(shù)如下 步驟1:95。C IO分鐘； 步驟2: 55'C 5分鐘；
步驟3: l-37個(gè)循環(huán)95°C 30秒、42。C 60秒一單檢測模式，和72。C 30秒。 通過分子信標(biāo)SEQ. ID. NO: 38-51檢測高危型HPV。在530 nm處收集
焚光數(shù)據(jù)。
通過分子信標(biāo)SEQ. ID. NO: 33-37檢測低危型HPV基因型。在560 nm 處收集焚光數(shù)據(jù)。
通過分子信標(biāo)SEQ. ID. NO: 52檢測反應(yīng)內(nèi)部對(duì)照。在610 nm處收集熒 光數(shù)據(jù)。
成功地檢測了以下基因型低危型(6、 11、 42,43、 44/55)、高危型(16、 18、 31、 33、 35、 39、 45、 51、 52、 56、 58、 59、 66、 68)和內(nèi)部對(duì)照。
實(shí)施例2
實(shí)時(shí)PCR檢測HPV16、 HPV18和HPV6、 HPV11HPVDNA
總反應(yīng)體積為20 nl，包括以下成分2 fil (~0，2 pg)克隆的HPV DNA、 18 jil聚合酶緩沖液(終濃度卯mM TRIS-HC1 (pH=8，0)、 10 mM DTT、 50 mMKCl、 7mMMgCl2、 1% Tween畫20 (希格瑪公司，SIGMA) 、 1% Ficoll、 1% PVP、 250 nM每種dNTP (ATP， CTP， GTP， TTP)(普洛麥格公司， Promega)、 0,28fiM每種引物SEQ. ID. NO: 1-32、 0.18 nM每種分子信標(biāo) SEQ.ID.NO: 33、 34、 38、 39、 52,和7，5 U AmpliTaq Gold DNA聚合酶(羅 氏，ROCHE))。反應(yīng)在LightCycler2.0PCR熱循環(huán)儀中進(jìn)行，參數(shù)如下 步驟l : 95°C IO分鐘； 步驟2: 55°C 5分鐘；
步驟3: l-37個(gè)循環(huán)95°C 30秒、42°C 60秒一單檢測模式，和72。C 30秒。 通過分子信標(biāo)SEQ. ID. NO: 38-39檢測HPV16和HPV18基因型。在530
nm處收集焚光數(shù)據(jù)。
通過分子信標(biāo)SEQ. ID. NO: 33-34檢測HPV6和HPV ll基因型。在560
nm處收集熒光數(shù)據(jù)。
通過分子信標(biāo)SEQ. ID. NO: 52檢測反應(yīng)內(nèi)部對(duì)照。在610 nm處收集熒
光數(shù)據(jù)。
成功地檢測了以下基因型低危型(6、 11)、高危型(16、 18)和內(nèi)部對(duì)照。
正向引物
SEQ.ID.NO::1KP-F/1CGCACCAACATATTTTATT
SEQ.ID.NO::2KP-F/2CGCACAAGCATCTATTATTA
SEQ.ID.NO::3KP-F/3CGCACAAGCATATTTTATC
SEQ,ID.NO::4KP-F/4CGCACCAGTATATTTTATCA
SEQ,ID.NO::5KP-F/5CGCACAAGCATTTACTATCA
SEQ.ID.NO::6KP-F/6CGCACCAACTACTTTTACC
SEQ.ID.NO::7KP-F/7CGTACCAGTATTTTCTACCAC
SEQ.ID.NO::8KP-F/8CGCACAGGCATATATTACT
SEQ.ID.NO::9KP-F/9CGCACCAACATATATTATCA
SEQ.ID.NO::10 KP-F/10 CGTACCAACCTGTACTATTATGSEQ.ID.NO:11 KP-F/11 GCACCAACTTATTTTACCATSEQ.ID-NO:12 KP-F/12 ACCAACCTCTTTTATTATGGSEQ.ID.NO::13 KP-F/13 AGCACAAATATATATTATTATGGSEQ.ID.NO::14 KP-F/14 CGCACCGGATATATTACTSEQ.ID.NO:5 KP-F/15 CGCACAAATATTTATTATTATGCSEQ.ID.NO:16 KP-F/16 CGGACGAATGTTTATTACC反向引物
SEQ. ID. NO: 17 LIC2TACCCTAAATACTCTGTATTG
SEQ.ID-NO:18UR2TACCCTAAATACCCTATATTG
SEQ.ID.N0:19R1AATTCTAAAAACTCTGTACTG
SEQ.ID.NO:20 R45TACTCTAAATACTCTGTATTG
SEQ.ID.NO:21 RllTACCTTAAACACTCTATATTG
SEQ.ID,NO:22R16TATTCTAAATACCCTGTATTG
SEQ.ID.NO:23 R42AACTCTAAATACTCTGTACTG
SEQ.ID.NO :24 R44CATCTTAAAAACCCTATATTG
SEQ.ID.NO:25 R03AACCCTAAACACCCTGTATTG
SEQ.ID.NO:26 R04AACGCGAAAAACCCTATATTG
SEQ.ID.NO:27簡TACCCTAAAGACCCTATACTG
SEQ.ID.NO:28 R06AACTCTAAATACCCTATACTG
SEQ.ID,NO:29謂AACGTGAAATACACGATATTG
SEQ.ID.NO:30 R08CACACGGAACACCCTGTACTG
SEQ.ID-NO:31 R54CACCCTAAACACCCTATATTG
SEQ.ID.NO:32R85AACCCGAAACACTCGATACTG
探針序列 SEQ.ID.NO:33 HPV6B3: SEQ,ID.N0:34HPV11B2 SEQ.ID.NO:35 HPV42B2 SEQ.ID.NO:36 HPV43B2
GGGTCATCCTTATTTTTCCATAA GGGACATCCATATTACTCTA丁CAAA GGTCACCCTTATTACTCTATTACAAAA CACCCATATTTCCCCCTTAAA
SEQ.ID.NO:37 HPV44/55B2: ACGACCAGCAAACAAGACAC
SEQ.ID.NO:38 HPV16B5 SEQ.ID.NO:39HPV18B8 SEQ.ID.NO:40 HPV31B5 SEQ.ID.NO:41 HPV33B7 SEQ.ID.NO:42 HPV35B2 SEQ.ID.NO:43 HPV39B3 SEQ.ID.NO:44 HPV45B3 SEQ,ID.NO:45 HPV51B2 SEQ.ID.NO:46 HPV52B2 SEQ.ID.NO:47 HPV56B2 SEQ.ID.NO:48 HPV58B2 SEQ.ID.NO:49 HPV59B2 SEQ.ID.NO:50 HPV66B2 SEQ.ID.NO:51 HPV68B2 SEQ.ID.NO:52 HPV-ICB2
CAATAACAAAATATTAGTTCCTAAA TATCCTGCTTATTGCCACC CATACCTAAATCTGACAATCC TTTTTTAGCGTTAGTAGGATTTTT AAAACAAGATTCTAATAAAATAGCA TTAAAGTGGGTATGAATGGTTG GCTGTTCCTAAGGTATCCG AGCACGCGTTGAGGTTTTA AGTTTTAGTTCCCAAGGTGTC CTGTGACTAAGGACAATACCAAA TTCCATCAAAAGTCCCAATAAC AAAGGTGGTAATGGTAGACAGG AATCTGGTACCAAAACAAACATC TTAAGGTTCCTATGTCTGGGG TGACATAGATCCCCATAGACAGTT
S即D.NO:53 〉Hpv2a
cgga ctaatgtgta ttaccatggt ggcagttcta ggcttctcac tgtgggtcat ccatattact ctataaagaa gagtaataat aaggtggctg tgcccaaggt atctgggtac caatatcgtg tatttcacgt g
SEQ.ID.NO:54 〉HPV3
cgc accaacattt attattatgc aggcagttct cgcttgctga ccgtgggtca tccttatttt gctatcccca aatcttctaa ttccaagatg gatattccta aggtgtccgc ctttcaatat agagtgttta gggtg
SEQ.ID,NO:55
>HPV6
cgcacca acatatttta tcatgccagc agttctagac ttcttgcagt gggtcatcct tatttttcca taaaacgggc taacaaaact gttgtgccaa aggtgtcagg atatcaatac agggtattta
aggtg
SEQ.ID.NO:56 >hpvl1
cgcacc aacatatttt atcatgccag cagttctaga ctccttgctg tgggacatcc atattactct atcaaaaaag ttaacaaaac agttgtacca aaggtgtctg gatatcaata tagagtgttt aaggta
SEQ.ID,NO:57 >HPV13
cgtac caacatattt tatcatgcta gcagttctag actacttgca gtgggaaatc cttattttce tattaagaaa caaaacaaaa ctgttgtccc taaggtatct ggttatcagt ttagggtatt taaagtt
SEQ.ID.NO:58 >HPV16
cgcacaa acatatatta tcatgcagga acatccagac tacttgcagt tggacatccc tattttccta ttaaaaaacc taacaateac aaaatatteg ttccta肌gt atcaggatta caatacaggg tatttegaat ei
SEQ.ID.NO:59 >HPV18
c ccacaagcat attttatcat gctggcagct ctagattatt aactgttggt aatccatatt ttagggttcc tgcaggtggt ggcaataagc aggatattcc taaggtttct gcataccaat atagagtatt tagggtg
SEQ.ID.NO:60 〉HPV26
cgcacc ggcatatatt attatgcggg cagctctcgt ttattaacat taggacatcc atatttttcc atacctaaaa ctggecaaaa ggccgaaatt cctaaggtat ctgcctatca gtacagggta tttagagtg
SEQ.ID.N0:61
>HPV27
cggacgaatg tctattacca tggtggcagt tctaggctcc tcactgtcgg ccacccatat tattctataa agaagggtag caataatagg ttggcagtgc ctaaggtgtc cggctaccaa taccgtgtat ttcacgtt
SEQ.ID.NO:62 >HPV28
cgca ccaatattta ttattatgca ggcacttctc ggttgctgac cgtgggtcat ccttattttc ccattcctaa atcatccact aacaaagcag atgtgcccaa agtgtccgcc tttcagtata gggtattccg ggtg
SEQ.ID.NO:63 >HPV29
c gcacaaatat ttattattat gcaggcagtt ctcgcctgct cactgtgggt catccacatt attcaattcc caaatcctct ggtaataagg tagatgtgcc taaggtgtct gcatttcagt acagggtttt ccgtgtg
SEQ,ID.NO:64
>HPV30
eg caccaatata ttttatcatg caggcagctc acgtttgctt gctgttggac atccatatta ttctatttct aaggctggta attccaaaac agatgttccc aaggtgtctg catttcagta tagggtcttt agggtc
SEQ.ID.NO:65 >HPV31
eg aaccaacata tattatcacg caggcagtgc taggctgctt acagtaggcc atccatatta
ttccatacct aaatctgaca atcctaaaaa aatagttgta ccaaaggtgt caggattaca atatagggta tttagggtt
SEQ.ID.NO:66 >HPV33
cgcacaagca tttattatta tgctggtagt tccagacttc ttgctgttgg ccatccatat ttttctatta aaatcctac taacgctaaa aaattattgg tacccaaagt atcaggcttg caatataggg tttttagggt c
SEQ.ID.NO:67 〉HPV34
eg cacaaatata tattattatg caggtagtac acgcttgctg gcagtaggac atccctatta tcctataaag gatactaatg ggaaacgtaa gattgctgta cctaaagttt caggtttgca atacagggta tttagaata
SEQ.ID.NO:68 >HPV35
cgcacaaaca tctactatca tgcaggcagt tctaggctat tagctgtggg tcacccatac tatgctatta aaaaacaaga ttctaataaa atagcagtac ccaaggtatc tggtttgcaa tacagagtat ttagagt
SEQ.ID.NO:69 >HPV39
c gcacaggcat atattattat gctggcagct ctagattatt aacagtagga catccatatt ttaaagtggg tatgaatggt ggtcgcaagc aggacattcc aaaggtgtct gcatateaat atagggtatt tcgcgtg
SEQ.ID.NO:70 >HPV40
cgcaccag tttatattat catgctggta gtgccaggtt actgactata ggacatccat actttgagtt aaaaaaaccc aatggtgaca tttcagtgcc taaggtttct ggacatcaat acagggtatt tagggta
SEQ.ID.NO:71
〉HPV42
cgcacca actactttta ccatgccagc agttctaggc tattggttgt tggtcaccct tattactcta ttacaaaaag gecaaataag acatctatcc cca肌gtgtc tggtttacag tacagagtat ttagagtt
SEQ.ID.NO:72 >HPV43
cgcaccaact tattttatta tgctggcagt tcacgtttgc ttgcagtggg tcacccatat ttccccctta aaaattcctc tggtaaaata actgtaccta aggtttctgg ttatcaatac agagtattta gagtt
SEQ.ID.NO:73 〉HPV44
cgc accaacatat attaccatgc tagcagttct agacttcttg ctgtgggcaa cccttatttt gccatacgac cagcaaacaa gacacttgtg cctaaggttt cgggatttca atatagggtt tttaagatg
SEQ.ID.NO:74 >HPV45
cgcaca agcatatttt atcatgcagg cagttcccga ttattaactg taggcaatcc atattttagg gttgtaccta atggtgcagg taataaacag gctgttccta aggtatccgc atatcagtat agggtgttta gagta
SEQ.ID.NO:75 >HPV51
cgc accggcatat attactatgc aggcagttcc agactaataa cattaggaca tccctatttt ccaataccta aaacctcaac gcgtgctgct attcctaaag tatctgcatt tcaatacagg gtatttaggg ta
SEQ.ID,NO:76 >HPV52
c gcacaagcat c認(rèn)attat gcaggcagtt ctcgattact aacagtagga catccctatt tttctattaa aaacaccagt agtggtaatg gtaaaaaagt tttagttccc aaggtgtctg gcctgcaata cagggtattt agaatt
SEQ.ID.NO:77 〉HPV53
cgcaccact atattttatc atgctggaag ctctcgcttg cttaccgtgg gacatcctta ttaccccatt tctaaatctg gtaaagcaga catccctaag gtgtctgcat ttcagtatag ggtgtttaga gta
SEQ.ID.NO:78 >HPV54
cgcaca agcatatact atcatgcaag cagctctaga ttattggctg ttggacatcc atattttaaa gtacaaa肌a ccaat犯taa gca肌gtatt ccteaagtat caggatatca atatagggtg tttagggtg
SEQ.ID.NO:79 >I-IPV55
cgc accaacatag tttaccatgc tagcagttct agacttcttg ctgtaggcaa cccttatttt gccatacgac cagcaaacaa gacacttgtg cctaaagttt caggatttca atatagggtt tttaaggtg
SEQ.ID.NO:80 >HPV56
cgcacta gtatatttta tcatgcaggc agttcacgat tgcttgccgt aggacatccc tattactctg tgactaagga caataccaaa acaaacattc ccaaagttag tgcatatc￡ia tatagggtat ttagggta
SEQ.ID.NO:81〉HPV57
egg acgaatgttt attatcatgg tgggagctct cggctcctca cagtaggcca tccatattat tctataaaaa aaa魄gcaa taataaggtg tctgtgccca aggtatcggg ctaccagtac cgtgtgttcc atgtg
SEQ.ID.NO:82 >HPV58
c gcacaagcat ttattattat gctggcagtt ccagactttt ggctgttggc aatccatatt tttccatcaa aagtcccaat aacaataaaa aagtattagt tcccaaggta tcaggcttac agtatagggt ctttagggtg
SEQ.ID.NO:83 >HPV59
cgtaccag tattttctac cacgcaggca gttccagact tcttacagtt ggacatccat attttaaagt acctaaaggt ggtaatggta gacaggatgt tcctaaggtg tctgcatatc aatacagagt atttagggtt
SEQ.ID.NO:84 >HPV61
cgcaccaact tattttatta tggtggcagt tcccgtctgc ttactgtagg acatccctat tgtagtttgc agcttgatgg gctgcagggc aagaaaaaca ctatccccaa ggtgtctggc tatcaatata gggtgtttag ggta
SEQ.ID.NO:85 >HPV62
cgcacca acctttttta ttatgggggc agctcccgcc ttcttactgt gggacatcca tattgtactt tacaggttgg ccagggtaaa cgggccacca ttcctaaggt gtctgggtat cagtacaggg tgtttcgtgt
g
SEQ,ID.NO:86 >HPV66
cgtacca gtatatttta tcatgcaggt agctctaggt tgcttgctgt tggccatcct tattactctg tttccaaatc tggtaccaaa acaaacatcc ctaaagttag tgcatatcag tatagagtgt ttagggta
SEQ.ID.NO:87
〉HPV67
cgcacaag catttectat tacgctggta gctccagact tttagctgta ggccatcctt acttttccat tcctaatccc tccaacacta aaaaggtgtt agtgcccaag gtgtcaggtt tgcagtatag ggtatttagg gtt
SEQ.ID.NO:88 >HPV68
cgcactggca tgtattacta tgctggtaca tctaggttat taactgtagg ccatccatat tttaaggttc ctatgtctgg gggccgcaag cagggcattc ctaaggtgtc tgcatatcaa tacagagtgt ttagggtt
SEQ.ID.NO:89
>HPV69
cgcac cggatatatt actatgcagg cagctctcga ttattaactt tgggtcatcc ctattttcca attcctaaat ctggttcaac agcagaaatt cctaaagtgt ctgcttacca atatagggtt tttcgtgtt
SEQ.ID.NO:90 >HPV70
cgta caggcatata ttattatgct ggaagctctc gcttattaac agtagggcat ccttatttta aggtacctgt aaatggtggc cgcaagcagg aaatacctaa ggtgtctgca tatcagtata gggtatttag ggta
SEQ.ID.N0:91
〉HPV72
cgcacca acctctatta ttatggtggc agttctcgtc tactaactgt aggacatcct tactgtgcca tacctctcaa cggacagggc aaaaaaaaca ccattcctaa ggtttcgggg tatcaataca gggtgtttag agta
SEQ.ID.NO:92 〉1-IPV73
agaaca aatatatatt attatgcagg tagcacacgt ttgttggctg tgggacaccc atattttcct atcaaggatt ctcaaaaacg taaaaccata gttcctaaag tttcaggttt gcaatacagg gtgtttaggc tt
SEQ.ID.NO:93
>HPV74
cgcacc aacatctttt atcatgctag cagttctaga ctacttgctg taggaaatcc ctatttccct ataaaacagg ttaacaaaac agttgttcct aaagtgtctg gatatcaatt tagggtgttt aaggtg
SEQ.ID.NO:94 >HPV81
cgcacc aacctttttt attatggggg cagttcccgc cttcttactg tagggcatcc atattgtaca ttaactattg gtacccaagg aaagcgttcc actattccca aggtgtctgg gtatcagtac cgggtgtttc gtgtgSEQ.ID.NO:95
>HPV82
cgc'accggcatat attattatgc鄉(xiāng)cagttcc agacttatta cctt鄉(xiāng)aca tccatatttt tcaataccca aaaccaatac acgtgctgaa atacctaagg tatctgcctt tcagtatagg gtgtttaggg ta
SEQ.ID.NO:96 〉HPV83
eg caccaacctc ttttattacg gtggcagctc cagacttctt accgtaggac atccatatta tcctgtacag gttaatggtc aaggaaaaaa agccactatc cccaaggttt ctggctacca atatagggtg tttcgcatt
SEQ.ID.NO:97 >HPV84
cgcaccaac ttattttatt atggtggtag ttctcgcctg cttactgtgg gacatccata ttattctgtt cctgtgtcta cccctgggca aaacaacaaa aaggccacta tccccaaggt ttctgggtat caatacaggg tgtttagggt c
SEQ.ID.NO:98 >HPV85
cgta ccagtacatt ttatcatgct ggcagctcta ggcttctaac cgttggacat ccatactata aagttacctc aaatggaggc cgcaagcaag acattcctaa agtgtctgcc tatcagtatc gagtgtttcg ggtt
SEQ.ID.NO:99 >HPV86
cgtaccaac ctattttatt atggtggtag ttcccgcttg cttactgtgg gccatccata ttatcctgtt actgtttcct ccagccctgg acaaaac肌c aaaaaggeca atattcccaa ggtttcgggg tatcaataca gggtttttag ggtg
SEQ.ID.NO:腦 >HPV87
cgcaccaac ttattttatt atggtggcag ttctcgcctg cttactgtgg gtcaccctta ctatccagtt actgttacca cccctggtca gaacaagaaa tccaatattc caaaggtgtc tggctatcag tacagggtgt ttcgggtg
SEQ.ID.NO:lOl
>HPV89
cgtaccaac ctgtactatt atggaggcag ctcccgcctt attacagttg gccaccctta ttatactgta caggtcaatg gtgctaacaa aaaggccaac atacctaagg tatcagggta tcaatacagg gtatttaggg ta
SEQ.ID.NO:102 >HPV90
agaacaaacata tattattatg caggcagttc ccgactgtta actgttggcc atccttattt tgctatcaaa aagcaatcag gaaaaaaccc tatagtggtt cccaaggtgt ctggatatca atatagggtg tttagggta
SEQ.ID.NO:103 >HPV91
cgcacc aacttatttt accatgctgg cagttcccgt ttactggctg tgggccaccc tttttttcct ataaaaaata attctggtaa agtaattgtt cctaaagttt caggtcacca atatagggtg tttagagtt
SEQ.ID.NO:賜 HPV-IC
GATGATGATAGCAATACAGAGTATTTAGGGTA
SEQ,ID.NO:105 HPV11B3/2: AAAACAGTTGTACCAAAGGTGTCTG SEQ.ID.NO:賜HPV42B1: CAAAAAGGCCAAATAAGACA SEQ.ID.NO:107 HPV43B6: CCCCCTTAAAAATTCCTCT SEQ,ID.NO:腦HPV44/55B1 ATACGACCAGCAAACAAGAC SEQ.ID.NO:109 HPV39B4: TATGAATGGTGGTCGCAAG SEQ.ID.NO:llO HPV52B7: AAAACACCAGTAGTGCTAATG SEQ.ID.NO:lll HPV56B3: CCAAAACAAACATTCCCAA SEQ.ID.N0:112 HPV59B3: ATCCATATTTTAAAGTACCTAAAG SEQ,ID.N0:113 HPV66B1: CAAATCTGGTACCAAAACAAA SEQ.ID.NO:114 HPV-ICB4: CCCATAGACAGTTTATACAGATCA SEQ.ID.NO:115 HPV6B6: ATAAAACGGGCTAACAAAA SEQ.ID.NO:116 HPV26B1: TACCTAAAACTGGCCAAAAG SEQ.ID.NO:117 HPV35B4: ATTCTAATAAAATAGCAGTACCCAAG
4權(quán)利要求
1.檢測至少一種病原體存在的方法，所述方法包括將來自樣品的核酸與包含至少四種探針的集合接觸，其中每種所述探針包含與來自病原體的序列互補(bǔ)的、側(cè)接四對(duì)或五對(duì)互補(bǔ)堿基的序列，其中所述堿基在不與來自病原體的核酸雜交時(shí)形成莖結(jié)構(gòu)，其中所述探針用第一相互作用標(biāo)記和第二相互作用標(biāo)記進(jìn)行標(biāo)記，從而所述探針與來自所述病原體的核酸的雜交引起檢測信號(hào)的改變。
2. 權(quán)利要求l所述的方法，其中所述第一相互作用標(biāo)記和所述第二相 互作用標(biāo)記是FRET供體和FRET受體。
3. 權(quán)利要求2所述的方法，其中所述FRET受體是猝滅劑。
4. 權(quán)利要求1到3中任一項(xiàng)所述的方法，其中與來自病原體的序列互補(bǔ) 的所述序列在任一端通過連接序列與所述互補(bǔ)堿基對(duì)連接。
5. 權(quán)利要求1到4中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述互補(bǔ)堿基對(duì)包含C-G對(duì)。
6. 權(quán)利要求5所述的方法，其中所述探針包含序列3，畫CGCG畫F畫病原體獨(dú)特的序列-F， - CGCG畫5，， 其中F和F，是任選的連接序列。
7. 權(quán)利要求1到6中任一項(xiàng)所述的方法，其中探針中病原體獨(dú)特的序列 含有與病原體基因組序列的至少一個(gè)錯(cuò)配。
8. 權(quán)利要求1到7中任一項(xiàng)所述的方法，其中每種所述探針可以與每種 其它所述探針的區(qū)分開。
9. 權(quán)利要求1到8中任一項(xiàng)所述的方法，其中每種所述探針附著在固相 支持物限定的位置處。
10. 權(quán)利要求1到9中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述探針集合包含至少 10個(gè)、至少15個(gè)或至少20個(gè)探4十。
11. 權(quán)利要求1到10中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述方法還包括測定雙 鏈核酸分子的解鏈溫度，所述雙鏈核酸分子由所述探針之一和得自所述樣 品的互補(bǔ)核酸形成。
12. 權(quán)利要求l到ll中任一項(xiàng)所述的方法，其中在與所述探針集合接觸 之前擴(kuò)增得自樣品的所述核酸。
13. 權(quán)利要求12所述的方法，其中所述擴(kuò)增使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)完成。
14. 權(quán)利要求12或權(quán)利要求13的方法，其中持續(xù)監(jiān)測被擴(kuò)增的核酸的 產(chǎn)量。
15. 權(quán)利要求12到15中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述被擴(kuò)增的核酸在 一個(gè)擴(kuò)增循環(huán)后與所述探針集合接觸。
16. 權(quán)利要求12到15中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述被擴(kuò)增的核酸在 每個(gè)擴(kuò)增循環(huán)后與所述探針集合接觸。
17. 權(quán)利要求12到16中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述擴(kuò)增在所述探針 集合存在時(shí)進(jìn)行。
18. 權(quán)利要求12到17中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述方法還包括內(nèi)部 對(duì)照的擴(kuò)增。
19. 權(quán)利要求12到18中任一項(xiàng)所述的方法，其中防止污染核酸的擴(kuò)增。
20. 權(quán)利要求19所述的方法，其中通過在尿嘧啶存在時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增來防 止所述污染核酸的擴(kuò)增。
21. 權(quán)利要求20所述的方法，還包括在擴(kuò)增前用尿嘧咬-DNA糖基化酶 處理所述核酸。
22. 權(quán)利要求1到21中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述樣品選自支氣管吸 出物、尿液、前列腺按摩液、精液、血液和宮頸、外陰、肛門、生殖器、 皮膚或喉細(xì)胞學(xué)樣品、刮取物或活組織檢查。
23. 權(quán)利要求1到22中任一項(xiàng)所述的方法，所述方法用于檢測與性傳播 疾病相關(guān)的生物。
24. 權(quán)利要求1到23中任一項(xiàng)所述的方法，所述方法用于檢測至少一種 HPV基因型的存在。
25. 權(quán)利要求24所述的方法，所述方法用于檢測高危型或低危型HPV 基因型。
26. 權(quán)利要求24或權(quán)利要求25所述的方法，其中所述探針集合包含至 少一種纟笨針，所述探針包含至少一個(gè)選自SEQ ID NO. 33到52或SEQ ID NO. 105-117的序列。
27. 權(quán)利要求24到26中任一項(xiàng)所述的方法，其中使用選自SEQIDNO. 1到32的至少一種引物擴(kuò)增得自所述樣品的所述核酸。
28. 權(quán)利要求27所述的方法，其中使用包括SEQ ID NO. l到32的引物 混合物擴(kuò)增得自所述樣品的核酸。
29. 包含至少四種探針的探針集合，其中每種所述探針包含與來自病 原體的序列互補(bǔ)的、側(cè)接四對(duì)或五對(duì)互補(bǔ)堿基的序列，其中所述堿基在不與來自病原體的核酸雜交時(shí)形成莖結(jié)構(gòu)，其中所述探針用第一相互作用標(biāo) 記和第二相互作用標(biāo)記進(jìn)行標(biāo)記，從而所述探針與來自所述病原體的核酸的雜交引起檢測信號(hào)的改變。
30. 權(quán)利要求29所述的探針集合，其中所述第一相互作用標(biāo)記和所述 第二相互作用標(biāo)記是FRET供體和FRET受體。
31. 權(quán)利要求30所述的探針集合，其中所述FRET受體是醉滅劑。
32. 權(quán)利要求29到31中任一項(xiàng)所述的探針集合，其中與來自病原體的 序列互補(bǔ)的所述序列在任一端通過連接序列與所述互補(bǔ)堿基對(duì)連接。
33. 權(quán)利要求29到32中任一項(xiàng)所述的探針集合，其中所述互補(bǔ)堿基對(duì) 包含C-G對(duì)。
34. 權(quán)利要求33所述的探針集合，其中所述探針包含序列3， - CGCG-F-病原體獨(dú)特的序歹'J-F， - CGCG -5，， 其中F和F，是任選的連接序列。
35. 權(quán)利要求29到34中任一項(xiàng)所述的探針集合，其中探針中病原體獨(dú) 特的序列含有與病原體基因組的至少一個(gè)錯(cuò)配。
36. 權(quán)利要求29到35中任一項(xiàng)所述的探針集合，其中每種所述探針可 以與每種其它所述探針區(qū)分開。
37. 權(quán)利要求29到36中任一項(xiàng)所述的探針集合，其中每種所述探針附著在固相支持物限定的位置處。
38. 權(quán)利要求29到37中任一項(xiàng)所述的探針集合，其中所述病原體是與 性傳播疾病相關(guān)的生物。
39. 權(quán)利要求38所述的探針集合
40. 權(quán)利要求39所述的探針集合
41. 權(quán)利要求40所述的探針集合 型互補(bǔ)的序列。
42. 權(quán)利要求41所述的探針集合 型HPV基因型互補(bǔ)的序列。
43. 權(quán)利要求41所述的探針集合 型HPV基因型互補(bǔ)的序列。
44. 權(quán)利要求40到43中任一項(xiàng)所述的探針集合，其中所述探針集合包 含至少一種揮:針，所述4笨針包含至少一個(gè)選自SEQ ID NO. 33到52或SEQ ID NO. 105-117的序列。
45. 權(quán)利要求44的探針集合，其中所述探針集合的每種探針包含選自 SEQ ID NO. 33到52或SEQ ID NO 105-117的序列。
46. 權(quán)利要求44或權(quán)利要求45的探針集合，其中所述探針集合的每種 4笨針包含選自SEQ ID NO. 33到52的序列。
47. 核酸序列，包含SEQ ID NO. 33到52中的任一序列。
48. 核酸序列，包含SEQIDNO 105-117中的任一序列。
49. 權(quán)利要求47或權(quán)利要求48的核酸在檢測至少一種HPV基因型存在 與否中的用途。
50. 權(quán)利要求49的用途，采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，其中持續(xù)監(jiān)測被擴(kuò)增 的核酸的產(chǎn)量。
51. 鑒定最小引物集合的方法，所述引物擴(kuò)增來自兩個(gè)或多個(gè)相關(guān)生 物的核酸序列，所述方法包括(a) 鑒定所述生物之間具有至少30%同 一性的引物結(jié)合位點(diǎn)；(b) 設(shè)計(jì)能夠在(a)中鑒定的引物位點(diǎn)處啟動(dòng)擴(kuò)增的引物集合，其中每,其中所述生物是病毒。，其中所述病毒是人乳頭瘤病毒。，其中每種所述探針包含與HPV基因，其中所述每種所述探針包含與高危，其中所述每種所述探針包含與低危 種所述引物與至少一種所述生物的引物結(jié)合位點(diǎn)具有不多于3個(gè)錯(cuò)配，且其 中每種所述引物之間存在4個(gè)或更少核苷酸的差異；和(c) 確定檢測可能的最大數(shù)目所述生物所需的最小引物數(shù)目。
52. 權(quán)利要求51所述的方法，還包括(d) 確定所述引物集合中確保來自所有所述生物的核酸序列等同擴(kuò)增 所需的每種引物的相對(duì)量。
53. 權(quán)利要求51或權(quán)利要求52所述的方法，其中所述生物與性傳播疾 病相關(guān)。
54. 權(quán)利要求51到53中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述生物為病毒。
55. 權(quán)利要求54所述的方法，其中所述病毒是人乳頭瘤病毒。
56. 權(quán)利要求51到55中任一項(xiàng)所述的方法，其中步驟(d)還包括添加一 種或多種引物，其中所述引物與所述生物的引物結(jié)合位點(diǎn)具有不多于3個(gè)錯(cuò) 配，在所述生物中需要校正引發(fā)以實(shí)現(xiàn)等同擴(kuò)增。
57. 權(quán)利要求51到56中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述錯(cuò)配位于最接近 5'端的一半引物中。
58. 權(quán)利要求51到57中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述引物集合允許以 兩個(gè)數(shù)量級(jí)檢測存在的所有生物。
59. 能夠通過權(quán)利要求55到58中任一項(xiàng)的方法獲得的引物集合，其包 含至少一個(gè)選自SEQ ID NO. l到32的引物。
60. 權(quán)利要求59所述的引物集合，包括SEQIDNO. 1到32。
61. 用于檢測一種或多種病原體的試劑盒，其包含權(quán)利要求29到46中 任一項(xiàng)所述的探針集合。
62. 用于檢測一種或多種病原體的試劑盒，其包含根據(jù)權(quán)利要求51到 58中任一項(xiàng)的方法鑒定的引物集合。
63. 權(quán)利要求61所述的試劑盒，其還包含根據(jù)權(quán)利要求51到58中任一 項(xiàng)的方法鑒定的引物結(jié)合。
64. 權(quán)利要求61到63中任一項(xiàng)所述的試劑盒，其中所述病原體是與性 傳播疾病相關(guān)的生物。
65. 用于檢測一種或多種HPV基因型的試劑盒，其包含權(quán)利要求29到 46中任一項(xiàng)所述的探針集合。
66. 用于檢測一種或多種HPV基因型的試劑盒，其包含權(quán)利要求59或 權(quán)利要求60所述的探針集合。
67. 權(quán)利要求65的試劑盒，其還包含權(quán)利要求59或權(quán)利要求60的引物 集合。
68. 權(quán)利要求61到67中任一項(xiàng)所述的試劑盒，其還包含內(nèi)部對(duì)照。
全文摘要
描述了用于檢測病原體、尤其是與性傳播疾病相關(guān)的生物、特別是人乳頭瘤病毒基因型的方法。該方法涉及實(shí)時(shí)PCR的使用，所述實(shí)時(shí)PCR使用特別設(shè)計(jì)的探針。還描述了探針、用于進(jìn)行該方法的試劑盒，以及設(shè)計(jì)適用于本發(fā)明方法的引物的方法。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101360833SQ200680050988
公開日2009年2月4日 申請(qǐng)日期2006年11月15日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月15日
發(fā)明者C·耶奈伊, T·陶卡奇 申請(qǐng)人:類基因有限責(zé)任公司