專利名稱：：△-9延伸酶及其在制備多不飽和脂肪酸中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
。更具體地講，本發(fā)明涉及編碼A9脂肪酸延伸酶的核酸片段的鑒定，和這些延伸酶在制備長鏈不飽和脂肪酸(PUFAs)中的用途。^
背景技術(shù)：
：PUFAs的重要性是毋庸置疑的。例如，某些PUFAs是健康細(xì)胞的重要生物成分，并且被認(rèn)為是"必需，，脂肪酸，它們在哺乳動物中不能從頭合成，而是必須在飲食中獲得，或者通過亞油酸(LA;18:2co-6)或oc-亞麻酸(ALA;18:3co-3)的進(jìn)一步去飽和及延伸而衍生；細(xì)J包質(zhì)膜的組分，其中它們可以諸如磷脂或甘油三酯的形式存在；對于適當(dāng)?shù)陌l(fā)育(特別是發(fā)育中的嬰兒腦)和組織形成和修復(fù)是必須的；并且，是一些在哺乳動物中具有重要性的生物活性類二十烷酸(如前列環(huán)素、類二十烷酸、白三烯、前列腺素)的前體。此外，攝取大量長鏈w-3PUFAs具有心血管保護(hù)作用(Dyerberg,J.等，J.A^廣，28:958-966(1975);Dyerberg,J.等,丄匿e"2(8081):117-119(July15,1978);Shimokawa,H.,A^化88:100-108(2001);vonSchacky,C.和Dyerberg，J.,Pf^Wi^v.M/化88:90-99(2001))。通過針對多種癥狀和疾病(如哮喘、牛皮癬、濕滲、糖尿病、癌癥)施用w-3和/或w-6PUFAs，賦予了許多其它研究文件記載的廣泛i"走康益處。目前，正在研究多種不同的宿主，包括植物、藻類、真菌和酵母作為商業(yè)化PUFA生產(chǎn)的手段。盡管宿主生物的天然PUFA生產(chǎn)能力有時對于特定方法是特異性的，基因工程已經(jīng)證明了可以顯著增強(qiáng)一些宿主(甚至是天然限于LA和ALA脂肪酸生產(chǎn)的那些)的天然能力，以生產(chǎn)高水平的各種長鏈co-3/w-6PUFAs。不:^侖該作用是天然能力還是重組技術(shù)的結(jié)果，生產(chǎn)花生四烯酸(ARA;20:4co-6)、二十碳五烯酸(EPA;20:5co-3)和二十二碳六烯酸(DHA;22:6co-3)都需要A9延伸酶/A8去飽和酶途徑(其在一些生物，例如眼蟲類物種中起作用，并且特征在于生產(chǎn)二十碳二烯酸[EDA;20:2co-6]和/或二十碳三烯酸[ETrA;20:3co-3])或A6去飽和酶/A6延伸酶途徑(主要存在于藻類、莒蘚、真菌、線蟲和人類中，其特征在于生產(chǎn)Y-亞油酸[GLA;18:3oo畫6]和/或十八碳四烯酸[STA;18:4co-3])的表達(dá)(圖1)。對于本文的目的，本申請致力于采用A9延伸酶/A8去飽和酶途徑，更具體地，是釆用A9延伸酶。目前鑒定的大多數(shù)A9延伸酶具有將LA轉(zhuǎn)化為EDA和將ALA轉(zhuǎn)化為ETrA的能力(其中在與A8去飽和酶反應(yīng)后，隨后分別從EDA和ETrA合成DGLA和ETA;在與A5去飽和酶反應(yīng)后，隨后分別從DGLA和ETA合成ARA和EPA;并且，DHA合成需要隨后表達(dá)額外的C20/22延伸酶和△4去飽和酶)。盡管需要用于生產(chǎn)ARA、EPA和DHA的新方法，只鑒定了4艮少的A9延伸酶。例如，在本申請人的發(fā)明之前，目前僅僅知道一種A9延伸酶。具體地，PCT公開No.WO2002/077213，No.WO2005/083093，No.WO2005/012316和No.WO2004/057001描述了來自球等l便金藻(Isochrysisgalbana)的△9延伸酶及其用途(也參見GenBank登錄號AAL37626)。因此，需要鑒定和分離額外的編碼A9延伸酶的基因，其適用于在多種宿主生物中異源表達(dá)，用于生產(chǎn)co-3/00-6脂肪酸。過去鑒定的延伸酶在它們所作用的底物方面是不同的。它們存在于動物和植物中。動物中存在的那些可以作用于飽和的、單不々包和以及多不飽和脂肪。但是，植物中存在的那些對于飽和以及單不飽和脂肪酸是特異性的。因此，需要PUFA特異性延伸酶，用于在植物中生產(chǎn)PUFAs。植物中的延伸過程涉及4步過程，該過程通過丙二酸和脂肪酸縮合的關(guān)鍵步驟起始，伴隨釋放二氧化碳分子。脂肪酸延伸中的底物是CoA-硫酯?？s合步驟由3-酮脂酰合酶介導(dǎo)，其對于四個反應(yīng)的總體循環(huán)通常是限速的，并且提供一些底物特異性。一個延伸循環(huán)的產(chǎn)物再生了脂肪酸，所述脂肪酸延長了兩個碳原子(Browse等，7>e"cfc說oc/zem/ca/S"'e"c^,27(9):467-473(2002年9月)；Napier,7>e"&尸/朋fS"e"c^,7(2):51-54(2002年2月))。基于與△8去飽和酶一起表達(dá)△9延伸酶的用途，也付出了相當(dāng)多的努力，以便從多種來源鑒定和表征A8去飽和酶。迄今為止，大多數(shù)努力致力于從纖細(xì)眼蟲(Euglenagracilis)分離和表征A8去飽和酶；已經(jīng)寺艮道了纖細(xì)眼蟲A8去飽和酶的一些序列變異(參見例如Wallis等，v4rc/z.Aoc/zem.am/Ao尸/z".，365(2):307-316(May1999);PCT公開No.WO2000/34439;美國專利No.6,825,017;PCT^>開No.WO2004/057001;2005年6月24日提交的美國申"i青No.11/166,003(PCT公開No.WO2006/012325和No.WO2006/012326;2006年2月2日公開))。最近，PCT公開No.WO2005/103253(2005年4月22日公開)公開了來自鹽生巴夫藻(Pavlovasalina)的A8去々包和酶。Sayanova等(T^:^S丄e".,580:1946-1952(2006))描述了從游離的存活土壤阿米巴-卡氏,束變形蟲(Acanthamoebacastellanii)分離和表4正cDNA,所述cDNA當(dāng)在擬南芥中表達(dá)時，編碼C2。A8去飽和酶。同樣，共同未決的臨時申請No.60/795810(2006年4月28日提交)公開了來自尸"v/麵雄e〃(CCMP459)的A8去飽和酶的氨基酸和核酸序列，而2006年10月23曰提交的共同擁有的、共同未決的申請，即美國臨時申請No.60/853563公開了來自目艮蟲類，即r"n^&印"a/om《M"e"w;CCMP1491、雙孝便藻蟲種CCMP389和五z^ej^/e〃ac/—gym"a^caCCMP1594的A8去々包和酶。以下共同擁有的專利申請涉及在含油酵母(即解脂耶氏酵母(K^ravWa/^0(y"ca))中生產(chǎn)PUFAs,包括PCT公開No.WO2004/101757和PCT公開No.WO2004/101753(都^>開于2004年11月25日)；美國申請No.11/265,761(2005年11月2日提交；相應(yīng)于PCT公開No.WO2006/052870);美國申請No.11/264,784(2005年11月1日提交；相應(yīng)于PCT公開No.WO2006/055322);和美國申"i青No.11/264,737(2005年11月1日提交；相應(yīng)于PCT公開No.WO2006/052871)。此外，PCT公開No.WO2004/071467(2004年8月26日公開)涉及在植物中生產(chǎn)PUFAs，而PCT公開No.WO2004/071178(2004年8月26日公開)涉及膜聯(lián)蛋白啟動子及其在植物中表達(dá)轉(zhuǎn)基因中的用途；這兩者都是共同擁有和共同未決的申請。申請人通過分離來自纖細(xì)眼蟲和雙鞭藻蟲種CCMP389的編碼A9延伸酶的基因，解決了指出的問題。發(fā)明概述本發(fā)明涉及編碼具有A9延伸酶活性的多肽的新遺傳構(gòu)建體，以及它們在植物、藻類、細(xì)菌、酵母和真菌中生產(chǎn)PUFAs的用途。因此，本發(fā)明提供了選自下組的分離的多核苷酸(a)分離的核酸序列，包含編碼具有△9延伸酶活性的多肽的核苷酸序列，其中基于ClustalV比對方法，所述多肽與SEQIDNO:2或SEQIDNO:5所示氨基酸序列相比，具有至少70%氨基酸同一性；(b)分離的核酸序列，包含編碼具有A9延伸酶活性的多肽的核苷酸序列，其中基于BLASTN比對方法，所述核苷酸序列與SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4或SEQIDNO:6所示核苷酸序列相比，具有至少70%序列同一性；(c)分離的核酸序列，包含編碼具有△9延伸酶活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列在以下嚴(yán)格雜交條件下與SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4或SEQIDNO:6所示核苷酸序列雜交0.1XSSC,0.1%SDS,65°C,并且用2XSSC,0.1%SDS洗滌，隨后用0.1XSSC,0.1。/。SDS洗滌；或(d)上述(a)、(b)或(c)的核苦酸序列的互補(bǔ)序列，其中所述互補(bǔ)序列和所述核苷酸序列由相同數(shù)目的核苷酸組成，并且是100%互補(bǔ)的。此外，本發(fā)明提供了由本發(fā)明的分離的核酸序列編碼的多肽。具體地，本發(fā)明提供了A9延伸酶多肽，其中所述多肽的氨基酸序列選自下組(a)SEQIDNO:2或SEQIDNO:5所示的氨基酸序列；和(b)通過至少一個保守氨基酸取代而與(a)的氨基酸序列不同的氨基酸序列。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用本發(fā)明的分離的核酸序列轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，其中優(yōu)選的宿主細(xì)胞是諸如藻類、細(xì)菌、酵母、卵菌和真菌的微生物物種。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了生產(chǎn)二十碳二烯酸的方法，包括a)提供分離的轉(zhuǎn)化的酵母宿主細(xì)胞，其包含i)分離的多核苷酸序列，編碼具有A9延伸酶活性的多肽，所述多核普酸序列選自(1)分離的核酸序列，包含編碼具有A9延伸酶活性的多肽的核苷酸序列，其中基于ClustalV比對方法，所述多肽與SEQIDNO:2或SEQIDNO:5所示氨基酸序列相比，具有至少70%氨基酸同一'性；(2)分離的核酸序列，包含編碼具有A9延伸酶活性的多月太的核普酸序列，其中所述核苷酸序列在以下嚴(yán)格條件下與SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4或SEQIDNO:6所示核苷酸序列雜交0.1XSSC,0.1%SDS,65°C,并且用2XSSC,0.1%SDS洗滌，隨后用0.1XSSC，0.P/。SDS洗滌；和(ii)亞油酸的來源；b)在表達(dá)編碼△9延伸酶多肽的核酸序列并且將亞油酸轉(zhuǎn)化為二十碳二烯酸的條件下使步驟(a)的酵母宿主細(xì)胞生長；以及c)任選回收步驟(b)的二十碳二烯酸。在一種替代的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了生產(chǎn)二十碳三烯酸的方法，包括a)提供分離的轉(zhuǎn)化的酵母宿主細(xì)胞，其包含i)分離的多核苷酸序列，編碼具有A9延伸酶活性的多肽，所述多核普酸序列選自(1)分離的核酸序列，包含編碼具有A9延伸酶活性的多肽的核苦酸序列，其中基于ClustalV比對方法，所述多肽與SEQIDNO:2或SEQIDNO:5所示氨基酸序列相比，具有至少70%氨基酸同一性；(2)分離的核酸序列，包含編碼具有A9延伸酶活性的多肽的核普酸序列，其中所述核苦酸序列在以下嚴(yán)^f各雜交條件下與SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4或SEQIDNO:6所示核苷酸序列雜交0.1XSSC,0.1%SDS,65。C,并且用2XSSC，0.1%SDS洗滌，隨后用0.1XSSC,0.1。/。SDS洗滌；和(ii)cc-亞麻酸的來源；b)在表達(dá)編碼△9延伸酶多肽的核酸序列并且將ct-亞麻酸轉(zhuǎn)化為二十碳三烯酸的條件下使步驟(a)的宿主細(xì)胞生長；以及c)任選回收步驟(b)的二十碳三烯酸。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了由本發(fā)明的轉(zhuǎn)化的宿主生產(chǎn)的微生物油。在一個分開的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的微生物油的食品。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的油的動物飼料。生物保藏以下質(zhì)粒保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC),10801UniversityBoulevard,Manassas,VA20110-2209,具有以下名稱、保藏號和保藏日(表1)。表1ATCC保藏<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>附圖和序列表簡述圖1描述了co-3/co-6脂肪酸生物合成途徑，該途徑提供了通過多種中間體將豆蔻酸轉(zhuǎn)化為DHA。圖2顯示了本發(fā)明的纖細(xì)眼蟲A9延伸酶的氨基酸序列(SEQIDNO:2)、本發(fā)明的雙鞭藻蟲種CCMP389sp.CCMP389)A9延伸酶的氨基酸序列(SEQIDNO:5))和來自球等鞭金藻的長鏈PUFA延伸酶的氨基酸序列(NCBI登錄號AAL37626(GI17226123))(SEQIDNO:8)的ClustalV比對(采用默認(rèn)參數(shù))。圖3顯示纖細(xì)眼蟲細(xì)胞提取物的脂質(zhì)i普的色"i普(實(shí)施例1)。圖4顯示本發(fā)明的纖細(xì)眼蟲△9延伸酶的氨基酸序列(SEQIDNO:2)和來自球等鞭金藻的長鏈PUFA延伸酶的氨基酸序列(NCBI登錄號AAL37626(GI17226123))(SEQIDNO:8)的ClustalV比對(采用默認(rèn)參數(shù))。圖5是質(zhì)粒pY119的圖譜。圖6是啤酒糖酵母中的纖細(xì)眼蟲△9延伸酶(EgD9e)的功能分析。圖7A是質(zhì)粒pY5-30的圖譜；圖7B是質(zhì)粒pDMW263的圖譜；圖7C是pZUF17的質(zhì)粒圖。圖8是質(zhì)粒pY115的圖譜。圖9A是解脂耶氏酵母Gateway目的載體pBYl的圖譜；圖9B是質(zhì)粒pBY2的圖鐠；圖9C是質(zhì)粒pBYl-FAE的圖譜。圖10顯示纖細(xì)眼蟲A9延伸酶基因的DNA序列(EgD9e;SEQIDNO:l)和為在解脂耶氏酵母中表達(dá)而進(jìn)行了密碼子優(yōu)化的合成基因(EgD9eS;SEQIDNO:3)的比4交。圖IIA是質(zhì)粒pY120的圖譜，而圖11B是質(zhì)粒pKR912的圖"i普。圖12A是質(zhì)粒pKR911的圖鐠，而圖12B是質(zhì)粒pKR913的圖鐠。圖13A是質(zhì)粒pKR886的圖譜，而圖13B是質(zhì)粒pKR886r的圖譜。圖14A是質(zhì)粒pKR669的圖譜，而圖14B是質(zhì)粒pKR873的圖鐠。圖15A是pFBAIN-389El0的質(zhì)粒圖，而圖15B是pZUFE389S的質(zhì)粒圖。圖16顯示雙鞭藻蟲種CCMP389A9延伸酶基因(E389D9e;SEQIDNO:4)和為在解脂耶氏酵母中表達(dá)而進(jìn)行了密碼子優(yōu)化的合成基因(E389D9eS;SEQIDNO:6)的比4交。通過以下的詳細(xì)說明以及附圖和序列表能夠更全面地理解本發(fā)明，這些內(nèi)容構(gòu)成了本發(fā)明的一部分。下列序列遵循37C.F.R.§1.821-1.825("對含有核苷酸序列和/或氨基酸序列公開內(nèi)容的專利申請的要求…序列規(guī)則")，并符合世界知識產(chǎn)權(quán)組織(WIPO)標(biāo)準(zhǔn)ST.25(1998)以及EPO和PCT的序列表要求(管理細(xì)則的規(guī)則5.2和49.5(a-bis),以及第208節(jié)和附錄C)。應(yīng)用于核苷酸和氨基酸序列信息的符號和格式遵循37C.F.R.§1.822所述頭見則。序列表說明SEQIDNOs:1-17,21,22,45-48,51-61，68-71，76-79,81-93,96-102和118-129是表2中鑒定的、編碼基因或蛋白(或其部分)的ORFs或質(zhì)粒。表2核酸和蛋白序列編號的概括<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>complextableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>SEQIDNO:18是用于對纖細(xì)眼蟲cDNA文庫eeglc進(jìn)行測序的M13F通用引物。SEQIDNOs:19和20分別相應(yīng)于用于從克隆eeglc.pk001.n5.f擴(kuò)增EgD9e的oEugELl畫l和oEugELl-2。SEQIDNOs:23-38分別相應(yīng)于用于擴(kuò)增IgD9eS的引物IL3-1A,IL3-1B,IL3畫2A,IL3畫2B,IL3-3A,IL3-3B,IL3-4A,IL3-4B,IL3畫5A,IL3-5B,IL3-6A,IL3-6B,IL3國7A,IL3國7B,IL3-8A和IL3國8B。SEQIDNOs:39-42分別相應(yīng)于用于擴(kuò)增IgD9eS的引物IL3-1F,IL3-4R,IL3-5F和IL3-8R。SEQIDNO:43是來自pT9(l-4)的417bpA^o//PW/片段。SEQIDNO:44是來自pT9(5誦8)的377bp片段。SEQIDNOs:49和50分別相應(yīng)于用于從載體pY115擴(kuò)增IgD9eS的引物ig-s和ig畫as。SEQIDNOs:62和63分別相應(yīng)于用于從cDNA擴(kuò)增EgD8的引物Eg5-1和Eg3-3。SEQIDNOs:64-67分別相應(yīng)于用于對EgD8進(jìn)行測序的引物T7,M13-28Rev，Eg3畫2和Eg5-2。SEQIDNO:72是pKR457的KTi盒5'末端多克隆位點(diǎn)(MCS)的序列。SEQIDNO:73是pKR457的KTi盒3'末端多克隆位點(diǎn)(MCS)的序列，其中包括大豆白蛋白轉(zhuǎn)錄3，終止子。SEQIDNOs:74和75分別相應(yīng)于用于/人大豆基因組DNA擴(kuò)增大豆白蛋白轉(zhuǎn)錄終止子的引物oSalb-12和oSalb曙13。SEQIDNO:80相應(yīng)于加入到pKR287中用于生產(chǎn)pKR767的限制位點(diǎn)。SEQIDNOs:94和95分別相應(yīng)于用于在生產(chǎn)pKR160的過程中建立限制位點(diǎn)的引物oSAlb-9和oSAlb-2。SEQIDNOs:103-105分別相應(yīng)于用于雙鞭藻蟲種CCMP389cDNA合成的SMARTIV寡核普酸引物、CDSIII/3'PCR引物和5，-PCR引物。SEQIDNO:106是編碼SEQIDNO:107中所示肽的簡并引物EuEF3的核苷酸序列。類似地，SEQIDNO:108是簡并引物EuER3的核苷酸序列，其編碼SEQIDNO:109所示的肽。SEQIDNOs:110-113分別相應(yīng)于用于PCR擴(kuò)增編碼E389D9e的cDNA的5，末端的引物389Elo-5-l,389Elo-5-2,DNRCDS5'陽2和389Elo-5-4。SEQIDNOs:114和115分別相應(yīng)于用于PCR擴(kuò)增編碼E389D9e的cDNA的3，末端的引物389Elo畫3畫l和389Elo國3-2。SEQIDNOs:116和117分別相應(yīng)于用于擴(kuò)增編碼E389D9e的全長cDNA的引物389ELO-F和389ELO-R1。發(fā)明詳述在此全文導(dǎo)入本文引用的所有專利、專利申請和公開文獻(xiàn)作為參考。這特別包括了以下共同擁有和共同未決的申請美國專利申請No.10/840478，No.10/840579和No.10/840325(2004年5月6日提交)，美國專利申請No.10/869630(2004年6月16日提交)，美國專利申請No.10/882760(2004年7月1日提交)，美國專利申請No.10/985109和No.10/985691(2004年11月10日提交)，美國專利申請No.10/987548(2004年11月12日提交)，美國專利申請No.11/024545和No.11/024544(2004年12月29日提交)，美國專利申請No.11/166993(2005年6月24日提交)，美國專利申請No.11/183664(2005年7月18日提交)，美國專利申請No.11/185301(2005年7月20日提交)，美國專利申請No.11/190750(2005年7月27日提交)，美國專利申請No.11/198975(2005年8月8日提交)，美國專利申請No.11/225354(2005年9月13日提交)，美國專利申請No.11/251466(2005年10月14日提交)，美國專利申請No.11/254173和No.11/253882(2005年10月19日提交)，美國專利申請No.11/264784和No.11/264737(2005年11月1日提交)，美國專利申請No.11/265761(2005年11月2日提交)，美國專利申請No.60/739989(2005年11月23日提交)，美國專利申請No.60/795810(2006年4月28日提交)，美國專利申請No.60/793575(2006年4月20日提交)，美國專利申請No.60/796637(2006年5月2日提交)，美國專利申請No.60/801172(2006年5月17日提交)，美國專利申請No.60/801119(2006年5月17日提交)，美國專利申請No.60/853563(2006年10月23日提交)，美國專利申請No.60/855177(2006年10月30日提交)。這額外包括以下共同擁有和共同未決的申請美國專利申請No.10/776311，其涉及在植物中生產(chǎn)PUFAs;和美國專利申請No.10/776889,其涉及膜聯(lián)蛋白啟動子以及它們在植物中表達(dá)轉(zhuǎn)基因中的用途。本發(fā)明提供了新的纖細(xì)眼蟲和雙鞭藻蟲種CCMP389△9延伸酶，以及編碼所述酶的基因，它們可以用于操縱用于生產(chǎn)i"老康PUFAs的生化途徑。通過本文所爿>開的方法制備的PUFAs，或其^汙生物可^皮用作^:食代用品，或補(bǔ)充物和嬰兒配方，用于靜脈內(nèi)喂飼的患者或用于預(yù)防或治療營養(yǎng)不良。另外，可以將純化的PUFAs(或其衍生物)摻入烹飪油，脂肪，或配制的人造奶油中，以便在正常使用時，接受者能接受到所需數(shù)量的飲食補(bǔ)充。還可將PUFAs摻入嬰兒配方，營養(yǎng)補(bǔ)充物或其他食品中，并且可以用作抗炎劑或降膽固醇劑?？扇芜x將所述組合物用于藥學(xué)用途(人或獸醫(yī))。定義在本說明書中，使用了多種術(shù)語和縮寫。提供了以下定義。"讀碼框'4皮縮寫為ORF。"聚合酶鏈反應(yīng)"被縮寫為PCR。"美國典型培養(yǎng)物保藏中心"被縮寫為ATCC。"多不飽和脂肪酸"被縮寫為PUFA(s)。"三酰甘油"；故縮寫為TAGs。術(shù)語"發(fā)明"或"本發(fā)明"不限于本發(fā)明的任何特定實(shí)施方案，而是通?？梢赃m用于權(quán)利要求和說明書中描述的本發(fā)明的任何和所有實(shí)施方案。術(shù)語"脂肪酸"表示具有各種鏈長的長鏈脂族酸(鏈烷酸)，從大約C12-C22(不過已知可以采用更長和更短鏈長的酸)。主要的鏈長為C16至(:22。關(guān)于"飽和脂肪酸"與"不飽和脂肪酸"、"單不飽和脂肪酸"與"多不飽和脂肪酸"(或"PUFAs")和"co-6脂肪酸"(co-6或"-6)與"oo-3脂肪酸"(co-3或"-3)的差別的其它細(xì)節(jié)提供于PCT公開No.WO2004/101757。脂肪酸在本文中是通過簡單的符號系統(tǒng)"X:Y"表示的，其中，X是在特定脂肪酸中的碳(C)原子的總數(shù)，而Y是雙鍵的數(shù)量。脂肪酸命名后的數(shù)字表示從脂肪酸羧基末端開始的雙鍵的位置，其中詞綴"c"表示雙鍵的順式構(gòu)型[例如棕櫚酸(16:0),硬脂酸(18:0)，油酸(18:1，9c)，巖芽酸(18:1，6c),LA(18:2,9c,12c),GLA(18:3,6c,9c,12c)和ALA(18:3,9c,12c，15c)]。除非特別指出，18:1、18:2和18:3是指油酸、LA和ALA脂肪酸。如果不特別指出相反的意思，認(rèn)為雙鍵是順式構(gòu)型。例如，18:2(9,12)中的雙鍵將認(rèn)為是順式構(gòu)型。在本公開內(nèi)容中用于描述PUFAs的術(shù)語示于下表3。在命名為"簡化符號"的列中，用oo參照系統(tǒng)表明碳的數(shù)目、雙鍵的數(shù)目和與co碳距離最近的雙鍵的位置，所述位置從co碳(其為此目的而編號為1)開始計數(shù)。該表的其余部分概括了co-3和oo-6脂肪酸及其前體的名稱，將在說明書的其余部分中使用的縮寫，以及每個化合物的化學(xué)名稱。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>術(shù)語"必需脂肪酸"表示生物體為了生存必須攝入的特定PUFA，因?yàn)樗錾矬w不能從頭合成所述特定必需脂肪酸。例如，哺乳動物不能合成必需脂肪酸LA。其他必需脂肪酸包括但不限于GLA,DGLA,ARA,EPA和DHA。術(shù)語"脂肪"表示脂類物質(zhì)，它在25。C下是固體，并且通常是飽和的。術(shù)語"油"表示在25。C下是液體并且通常是多不飽和的脂類。PUFAs存在于某些藻類，含油酵母和絲狀真菌的油中。"微生物油"或"單細(xì)胞油"是由微生物在生命過程中天然產(chǎn)生的油。術(shù)語"三酰甘油"、"油"和"TAGs"是指中性脂質(zhì)，包含酯化于甘油分子的三個脂肪?；?所述術(shù)語在本發(fā)明中可互換使用)。所述油可以包括長鏈PUFAs、較短的飽和和不飽和脂肪酸，以及4交長鏈的飽和脂肪酸。因此，"油生物合成"通常是指細(xì)胞中TAGs的合成。"總脂質(zhì)和油級分中的PUFAs百分比(％)"是指這些級分中PUFAs相對于總脂肪酸的百分比。術(shù)語"總脂質(zhì)級分，，或"脂質(zhì)級分"都指含油生物內(nèi)的所有脂質(zhì)的總和(即中性和極性)，由此包括位于磷脂酰膽堿(PC)級分、磷脂酰乙醇胺(PE)級分和三酰甘油(TAG或油)級分中的脂質(zhì)。但是，該術(shù)語"脂質(zhì)"和"油，，在說明書中可以互換使用。術(shù)語"轉(zhuǎn)化效率，和"底物轉(zhuǎn)化百分比"表示特定的酶(例如，去飽和酶)可以將底物轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物的效率。轉(zhuǎn)化效率是按照以下公式計算的([產(chǎn)物]/[底物+產(chǎn)物])*100,其中'產(chǎn)物，包括中間產(chǎn)物和衍生自中間產(chǎn)物的途徑中的所有產(chǎn)物。生物化學(xué)意義上的代謝途徑或生物合成途徑可以認(rèn)為是細(xì)胞內(nèi)發(fā)生的一系列化學(xué)反應(yīng)，由酶催化，形成要被細(xì)胞使用或儲存的代謝產(chǎn)物或開始另一種代謝途徑(然后稱作流通產(chǎn)生步驟)。這些途徑中的很多都是精細(xì)的，涉及逐步修飾起始物質(zhì)，將其塑造為具有需要的精確化學(xué)結(jié)構(gòu)的產(chǎn)物。術(shù)語"PUFA生物合成途徑"是指將油酸轉(zhuǎn)化為LA,EDA,GLA,DGLA,ARA,ALA,STA,ETrA,ETA,EPA,DPA和DHA的代謝過程。該過程詳細(xì)描述于文獻(xiàn)中(例如參見PCT7>開No.WO2005/003322和No.WO2006/052870)。類似地，該過程包括通過加入碳原子延伸碳鏈和通過加入雙鍵使分子去飽和，這是通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜中存在的一系列的特定去飽和和延伸酶(即"PUFA生物合成途徑酶")進(jìn)行的。更具體地，"PUFA生物合成途徑酶"表示與PUFA的生物合成相關(guān)的以下任何酶(以及編碼所述酶的基因)，包括A4去飽和酶、A5去飽和酶、A6去飽和酶、A12去飽和酶、A15去飽和酶、A17去飽和酶、A9去飽和酶、A8去飽和酶、A9延伸酶、C14/16延伸酶、C16/18延伸酶、C18/20延伸酶和/或C20/22延伸酶。術(shù)語"W-3/W-6脂肪酸生物合成途徑"表示一組基因，當(dāng)它們在合適的條件下表達(dá)時，編碼能催化W-3和W-6脂肪酸生產(chǎn)的酶。通常，參與W-3/W-6脂肪酸生物合成途徑的基因編碼PUFA生物合成途徑酶。在圖1中示出了典型的途徑，它可以經(jīng)各種中間體將豆蔻酸轉(zhuǎn)化成DHA,并且證實(shí)了如何由共同來源生產(chǎn)co-3和cd-6脂肪酸。該途徑天然分成兩個部分，其中一個部分產(chǎn)生W-3脂肪酸，另一個部分僅僅產(chǎn)生W-6脂肪酸。在W-3/W-6脂肪酸生物合成途徑的范圍中使用的術(shù)語"功能性"表示途徑中的一些(或所有)基因表達(dá)活性酶，導(dǎo)致體內(nèi)催化或底物轉(zhuǎn)化。應(yīng)該理解，"W-3/W-6脂肪酸生物合成途徑"或"功能性W-3/W-6脂肪酸生物合成途徑"不表示需要所有PUFA生物合成途徑酶基因，因?yàn)楹芏嘀舅岙a(chǎn)物僅僅需要表達(dá)該途徑的一個亞組的基因。術(shù)語"A9延伸酶/A8去飽和酶途徑"是指用于生產(chǎn)長鏈PUFAs的生物合成途徑。該途徑最少包括A9延伸酶和A8去飽和酶，從而使得能夠分別從LA和ALA生物合成DGLA和/或ETA。隨著表達(dá)其它去飽和酶和延伸酶，也可以合成ARA,EPA,DPA和DHA。該途徑在一些實(shí)施方案中可能是有利的，因?yàn)榕懦薌LA和/或STA的生物合成。術(shù)語"中間脂肪酸"是指在脂肪酸代謝途徑中產(chǎn)生的任何脂肪酸，其可以在該途徑中通過其它代謝途徑酶的作用進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為目的產(chǎn)物脂肪酸。例如，當(dāng)用A9延伸酶/A8去飽和酶途徑生產(chǎn)EPA時，可以產(chǎn)生EDA,ETrA,DGLA，ETA和ARA,并且被認(rèn)為是"中間脂肪酸，，，因?yàn)檫@些脂肪酸可以通過其它代謝途徑酶的作用進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為EPA。術(shù)語"副產(chǎn)物脂肪酸"是指脂肪酸代謝途徑中產(chǎn)生的不作為途徑的目標(biāo)脂肪酸產(chǎn)物，也不作為途徑的"中間脂肪酸"的任何脂肪酸。例如，當(dāng)用A9延伸酶/A8去飽和酶途徑生產(chǎn)EPA時，通過A5去飽和酶對EDA或ETrA的作用，也分別可以產(chǎn)生金水〉酸(SCI)和刺柏酸(JUP)。它們也被認(rèn)為是"副產(chǎn)物脂肪酸"，因?yàn)樗鼈兌疾荒芡ㄟ^其它代謝途徑酶的作用進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為EPA。"去飽和酶"表示能夠?qū)σ环N或多種脂肪酸去飽和，即，導(dǎo)入雙鍵，以便產(chǎn)生脂肪酸或感興趣的前體的多肽。盡管在本說明書中①-參考系統(tǒng)被用于表示特定的脂肪酸，更方便的是，利用A-系統(tǒng)從底物的羧基末端開始計數(shù)以表示去飽和酶的活性。感興趣的去飽和酶包括例如1.)A8去飽和酶，它使脂肪酸的位于從該分子的羧基末端開始計數(shù)的第8和第9個碳原子之間去飽和，例如，催化EDA轉(zhuǎn)化成DGLA和/或EtrA轉(zhuǎn)化成ETA;2.)△5去飽和酶，它能催化DGLA轉(zhuǎn)化成ARA和/或ETA轉(zhuǎn)化成EPA;3.)A6去飽和酶，它能催化LA轉(zhuǎn)化成GLA和/或ALA轉(zhuǎn)化成STA;4.)A4去飽和酶，它能催化DPA轉(zhuǎn)化成DHA;5.)A12去飽和酶，它能催化油酸轉(zhuǎn)化成LA;6.)△15去飽和酶，它能催化LA轉(zhuǎn)化成ALA和/或GLA轉(zhuǎn)化成STA;7.)△17去飽和酶，它能催化ARA轉(zhuǎn)化成EPA和/或DGLA轉(zhuǎn)化成ETA;和8)△9去飽和酶，它能催化棕櫚酸轉(zhuǎn)化成棕櫚油酸(16:1)和/或硬脂酸轉(zhuǎn)化成油酸(18:1)。在本領(lǐng)域中，基于將co-6脂肪酸轉(zhuǎn)化為oo-3對應(yīng)物(如分別將LA轉(zhuǎn)化為ALA和ARA轉(zhuǎn)化為EPA)的能力，有時也將△15和A17去飽和酶稱作"omega-3去飽和酶"、"w-3去飽和酶"和/或"C0-3去飽和酶"。在一些實(shí)施方案中，最理想的是經(jīng)驗(yàn)確定特定脂肪酸去飽和酶的特異性，這是通過用脂肪酸去飽和酶基因轉(zhuǎn)化合適的宿主，并且確定其對宿主脂肪酸鐠的作用而確定的。對于本文的目的，術(shù)語"EgD8"是指分離自纖細(xì)眼蟲的A8去飽和酶(SEQIDNO:61),由本文的SEQIDNO:60編碼。EgD8與PCT公開No.WO2006/012325和No.WO2006/012326描述的"Eg5"[美國公開No.2005-0287652-A1的SEQIDNO:2]具有100%同一性并且是功能上等同的。類似地，術(shù)語"EgD8S"是指本文中為在解脂耶氏酵母中表達(dá)而進(jìn)NOs:68和69)。EgD8S與PCT公開No.WO2006/012325和No.WO2006/012326描述的"D8SF"具有100%同一性并且是功能上等同的。術(shù)語"延伸酶系統(tǒng)，，表示負(fù)責(zé)延伸脂肪酸碳鏈，以便產(chǎn)生比延伸酶作用的脂肪酸底物長2個碳原子的脂肪酸的一組四種酶。更具體地，這種延伸過程是與脂肪酸合酶相關(guān)發(fā)生的，其中，CoA是?；d體(Lassner等，ThePlantCell8:281-292(1996))。在第一步中(其是底物特異性和限速的)，丙二酰-CoA與長鏈?；?CoA縮合，產(chǎn)生二氧化碳(C02)和(3-酮?；?CoA(其中，?；糠盅娱L了兩個碳原子)。隨后的反應(yīng)包括還原成P-羥?；?CoA,脫水形成烯?；?CoA,并且第二次還原，產(chǎn)生延長的酰基-CoA。由延伸酶催化的反應(yīng)的例子是將GLA轉(zhuǎn)^1成DGLA，STA轉(zhuǎn)化成ETA和將EPA轉(zhuǎn)化成DPA。為了本發(fā)明的目的，催化第一個縮合反應(yīng)(即丙二酰-CoA轉(zhuǎn)化為P-酮酰基-CoA)的酶統(tǒng)稱為"延伸酶"。概言之，延伸酶的底物選擇性一定程度是寬范圍的，但是由于鏈長度和不飽和化的程度而不同。因此，延伸酶可以具有不同的特異性。例如，Ci4/i6延伸酶利用Cm底物(如豆蔻酸)，Ci6/18延伸酶利用Ci6底物(如棕櫚酸)，Cis/20延伸酶(也稱作A6延伸酶，因?yàn)樗鲂g(shù)語可以互換J吏用)利用Cis底物(如GLA、STA)，C20/22延伸酶利用C20底物(如EPA)。以相似的方式，本文特別感興趣的是，"A9延伸酶"夠催化LA和ALA分別轉(zhuǎn)化為EDA和EtrA。重要的是注意，一些延伸酶具有廣泛特異性，因此，單個酶可能能夠催化一些延伸酶反應(yīng)。因此，例如，A9延伸酶也可以作為Ci6/18延伸酶，Ci8/20延伸酶和/或C20/22延伸酶，并且可以分別對A5和A6脂肪酸，如EPA和/或GLA具有替代的〗旦不是優(yōu)選的特異性。在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，理想的是經(jīng)驗(yàn)確定脂肪酸延伸酶的特異性，該確定是通過用脂肪酸延伸酶的基因轉(zhuǎn)化合適的宿主，并且確定其對宿主的脂肪酸譜的影響。對于本文的目的，術(shù)語"EgD9e"是指分離自纖細(xì)眼蟲的A9延伸酶(SEQIDNO:2)，由本文的SEQIDNO:1編碼。相反，術(shù)語"EgD9eS，，是指為在解脂耶氏酵母中表達(dá)而進(jìn)行了密碼子優(yōu)化的來源于纖細(xì)眼蟲的合成的△9延伸酶(即SEQIDNOs:3和2)。術(shù)語"E389D9e"是指分離自雙鞭藻蟲種CCMP389的A9延伸酶(SEQIDNO:5),由SEQIDNO:4編碼。相反，術(shù)語"E389D9eS"是指為在解脂耶氏酵母中表達(dá)而進(jìn)行了密碼子優(yōu)化的來源于雙鞭藻蟲種CCMP389的合成的A9延伸酶(即SEQIDNOs:6和5)。術(shù)語"lgD9e"是指分離自球等鞭金藻的A9延伸酶(SEQIDNO:8;NCBI登錄號AAL37626[GI17226123]，基因座AAL37626,CDSAF390174;GenBank登錄號AF390174),由SEQIDNO:7編碼。相反，術(shù)語"lgD9eS，，是指為在解脂耶氏酵母中表達(dá)而進(jìn)行了密碼子優(yōu)化的來源于球等鞭金藻的合成的A9延伸酶(即SEQIDNOs:9和8)。IgD9eS的合成和功能分析描述于PCT公開No.WO2006/052870(其中IgD9eS等同于其中的SEQIDNOs:51和50)。術(shù)語"氨基酸"是指蛋白或多肽的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)單位。氨基酸是通過與A^c/ez'ci^eorc/z,13:3021-3030(1985)和Sz'oc/zemz.ca/Jow72a/,219(2):345-373(1984)中描述的IUPAC-IYUB標(biāo)準(zhǔn)一致的一字母代碼或三字母代碼表示的氨基酸，所述文獻(xiàn)在此導(dǎo)入作為參考。術(shù)語"保守氨基酸取代"是指用另一種氨基酸取代特定蛋白中的氨基酸殘基，而不改變該蛋白的化學(xué)或功能性質(zhì)。例如，本領(lǐng)域公知，該基因中導(dǎo)致特定位點(diǎn)產(chǎn)生化學(xué)等同氨基酸(但不影響編碼的折疊蛋白的結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì))的基因改變是共有的。對于本發(fā)明的目的，"保守氨基酸取代"定義為以下5組之一內(nèi)的交換1.小的脂族、非極性或微極性殘基Ala[A],Ser[S]，Thr[T](Pro[P],Gly[G]);2.極性、帶負(fù)電殘基及其酰胺Asp[D],Asn[N]，Glu[E],Gin[Q];3.極性、帶正電殘基His[H]，Arg[R],Lys[K];4.大的脂族、非極性殘基:Met[M],Leu[L]，lie[I],Val[V](Cys[C]);和5.大的芳香族殘基Phe[F],Tyr[Y],Trp[W]。保守氨基酸取代通常保持1)取代區(qū)中多肽主鏈的結(jié)構(gòu)；2)分子粑位點(diǎn)的電荷或疏水性；或3)側(cè)鏈的容量。此外，在很多情況下，預(yù)期蛋白分子的N-末端和C-末端部分也不會改變蛋白的活性。術(shù)語"非保守氨基酸取代"是指通常預(yù)期產(chǎn)生蛋白性質(zhì)的最大改變的氨基酸取代。因此，例如，非保守氨基酸取代可以是l)親水殘基取代疏水殘基/被疏水殘基取代(如Ser或Thr取代Leu,lie,Val或被Leu,lie,Val取代)；2)Cys或Pro取代另一殘基/被另一殘基取代；3)具有正電性側(cè)鏈的殘基取代負(fù)電性殘基/被負(fù)電性殘基取代(例如Lys,Arg或His取代Asp或Glu/被Asp或Glu取代)；或4)具有大側(cè)取代Gly或被Phe被Gly取代)。有時，5組之中兩組之間的非保守氨基酸取代將不影響編碼的蛋白的活性。術(shù)語"多核苷酸"、"多核苷酸序列"、"核酸序列"、"核酸片段"和"分離的核酸片段"在本文中可以互換使用。這些術(shù)語包括核苷酸序列等。多核苷酸可以是單鏈或雙鏈RNA或DNA的聚合物，其任選包含合成的、非天然或改變的核苷酸堿基。DNA聚合物形式的多核苷酸可以包含一個或多個cDNA片段、基因組DNA、合成DNA或其混合物。核苷酸(通常以它們的5，-單磷酸形式存在)由如下單字母符號表示"A"表示腺苷酸或脫氧腺苷酸(分別表示RNA或DNA),"C"表示胞苷酸或脫氧胞苷酸，"G"表示鳥苷酸或脫氧鳥苷酸，"U"表示尿苦酸，"T，，表示脫氧胸苷酸，"R"表示嘌呤(A或G),"Y"表示嘧啶(C或T),"K，，表示G或T,"H"表示A或C或T,'T，表示肌苷，"N"表示任何核苷酸。術(shù)語"在功能上等同的亞片段"和"功能等同的亞片段"在本文中可互換使用。這些術(shù)語是指分離核酸片段的一部分或亞序列，其中無論該片段或亞片段是否編碼活性酶，都保留了改變基因表達(dá)或產(chǎn)生某種表型的能力。例如，該片段或亞片段可以用于嵌合基因的設(shè)計中，用于在轉(zhuǎn)化的植物中產(chǎn)生需要的表型。嵌合基因可以設(shè)計用于通過連接核酸片段或其亞片段而進(jìn)行的阻抑中，無論其是否編碼活性酶，其相對于植物啟動子序列是有義或反義方向。術(shù)語"保守結(jié)構(gòu)域"或"基序"表示在沿著進(jìn)行比對的進(jìn)化上相關(guān)的蛋白的序列的特定位置上保守的一組氨基酸。盡管其它位置的氨基酸在同源蛋白之間可以不同，但在特定位置高度保守的氨基酸表明這些氨基酸是蛋白的結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性或活性必須的。由于它們是通過在比對的蛋白同源物家族的序列中的高保守程度鑒定的，它們可以用作標(biāo)識物，或"信號"，來確定具有新確定的序列的蛋白是否屬于以前鑒定的蛋白家族。為了本發(fā)明的目的，下表描述了本發(fā)明的基序，其作為具有a9延伸酶活性的蛋白的指示。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>術(shù)語"同源性"、"同源"、"基本相似，，和"基本相應(yīng)"在本文中可以互換使用。它們表示核酸片段，其中一個或多個核苷酸堿基的改變不影響核酸片段介導(dǎo)基因表達(dá)或產(chǎn)生某種表型的能力。這些術(shù)語也表示本發(fā)明的核酸片段的修飾，例如一個或多個核苷酸的缺失或插入，相對于最初未修飾的片段，其不顯著改變得到的核酸片段的功能性質(zhì)。因此可以理解，如本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的，本發(fā)明包括除特定示例序列之外的序列。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，本發(fā)明包括的基本相似的核酸SSC，0.1%SDS，60°C)或與本文公開的核苷酸序列的任何部分(其在功能上等同于本文公開的任何核酸序列)雜交的能力而確定?？梢哉{(diào)節(jié)嚴(yán)格條件，用于篩選中等相似的片段(例如來自遠(yuǎn)相關(guān)生物的同源序列)至高度相似的片段(例如從遠(yuǎn)相關(guān)生物復(fù)制功能酶的基因)。雜交后洗滌決定嚴(yán)格條件。術(shù)語"選擇性雜交"包括核酸序列與特定核酸靶序列在嚴(yán)格雜交條件下的雜交，與非靶核酸序列雜交相比，其達(dá)到可檢測地更高程度(例如比背景高至少2倍)，并且基本排除非把核酸序列。選擇性雜交的序列典型地彼此具有大約至少80%的序列同一性，或90%的序列同一性，最高達(dá)并且包括100%的序列同一性(即完全互補(bǔ))。術(shù)語"嚴(yán)格條件"或"嚴(yán)格雜交條件"包括探針將與其靶序列選擇性雜交的條件。嚴(yán)格條件是序列依賴性的，并且在不同的環(huán)境中將會不同。通過控制雜交和/或洗滌條件的嚴(yán)格性，可以筌定與探針100%互補(bǔ)的耙序列(同源探測)?；蛘?，可以調(diào)整嚴(yán)格條件，使序列之間能夠存在一些錯配，以便檢測到更低的相似性程度(異源探測)。通常，探針的長度小于約1000個核苷酸，任選地，長度小于約500個核苷酸。典型地，嚴(yán)格條件是這樣的條件其中鹽濃度小于約1.5MNa離子，典型地在pH7.0-8.3是約0.01-1.0MNa離子濃度(對于其它鹽)，溫度對于短探針(如10-50個核苷酸)是至少約30°C,對于長探針(例如大于50個核苷酸)是至少約60°C。也可以通過加入去穩(wěn)定劑如曱酰胺而實(shí)現(xiàn)嚴(yán)格條件。示例的低嚴(yán)格條件包括37°C下與30-35%甲酰胺，1MNaCl，1%SDS(十二烷基硫酸鈉)的緩沖液雜交，并且50-55。C下在IX-2XSSC(20XSSC=3.0MNaCl/0.3M檸檬酸三鈉)中洗滌。示例的中等嚴(yán)格條件包括37。C下在40-45。/o曱酰胺，1MNaCl,1%SDS中雜交，并且55-60。C下在0.5X-IXSSC中洗滌。示例的高嚴(yán)格條件包括37。C下在50%甲酰胺，1MNaCl,P/。SDS中雜交，并且60-65。C在0.1XSSC中洗滌。其它示例的嚴(yán)才各雜交條件包括0.1XSSC,0.1%SDS，65°C和用2XSSC，0.1%SDS洗滌，然后用0.1XSSC，0.P/。SDS洗滌。特異性典型地是雜交后洗滌的函數(shù)，重要的因子是離子強(qiáng)度和最終洗滌溶液的溫度。對于DNA-DNA雜交體，可以從Meinkoth等，v4加/.c/zem.,138:267-284(1984)的公式Tm=81.5°C+16.6(logM)+0.41(%GC)-0.61(y。曱酰胺)-500/L估算Tm,其中M是單價陽離子的摩爾濃度，。/。GC是DNA中鳥苷和胞苷核苷酸的百分比，％甲酰胺是雜交溶液中的甲酰胺百分比，L是以堿基對表示的雜交體長度。Tm是50。/。的互補(bǔ)粑序列與完美匹配的探針雜交的溫度(在確定的離子強(qiáng)度和pH)。對于每1%的錯配，Tm減少約1。C;因此，可以調(diào)整Tm、雜交和/或洗滌條件，以便與具有需要的同一性的序列雜交。例如，如果尋求^90%同一性的序列，Tm可以減少10。C。通常，選擇的嚴(yán)格條件比特定序列及其互補(bǔ)序列在確定的離子強(qiáng)度和pH下的熱解鏈溫度(Tm)低約5。C。但是，高嚴(yán)格條件可以利用比熱解鏈溫度(TnO低1、2、3或4。C的溫度下的雜交和/或洗滌，中等嚴(yán)格雜交條件可以利用比熱解鏈溫度(Tm)低6、7、8、9或10°C的溫度下的雜交和/或洗滌；低嚴(yán)才各雜交條件可以利用比熱解鏈溫度(Tm)低11、12、13、14、15或20°C的雜交和/或洗滌。采用該公式、雜交和洗滌組合物，以及需要的Tm，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，固有描述了雜交和/或洗滌溶液的嚴(yán)格性的變化。如果需要的錯配程度導(dǎo)致Tm小于45。C(水溶液)或32。C(曱酰胺溶液)，優(yōu)選增加SSC濃度，以便可以使用更高的溫度。核酸雜交的全面指導(dǎo)參見Tijssen,Z/a6onaf/ory7fec/z/z々wesz'w5/oc/ze附^s7y少M(fèi)b/ecw/arS/o/ogy—外6"Wz她'owvW/7zjVwc/e/c爿"'t/尸ra6es,第I部分，第二章"Overviewofprinciplesofhybridizationandthestrategyofnucleicacidprobeassays",Elsevier,NewYork(1993);和Cwn^W尸rafoco/sMo/ecw/arS/o/ogy,第2章，Ausubel等,Eds.,GreenePublishingandWiley-Interscience,NewYork(1995)。雜交和/或洗滌條件可以應(yīng)用至少10,30,60,90,120或240分鐘。核酸或多肽序列內(nèi)容中的"序列同一性"或"同一性"是指在指定比較窗中為最大對應(yīng)而比對時，兩個序列中相同的核酸堿基或氨基酸殘基。因此，"序列同一性百分比"是指通過在比較窗中比較兩個最優(yōu)比對的序列而確定的值，其中比較窗中多核苷酸或多肽序列的部分與用于進(jìn)行兩個序列的最優(yōu)比對的參照序列(其不包含添加或缺失)相比，可以包含添加或缺失(即空位)。百分比是如下計算的確定兩個序列中存在相同核酸堿基或氨基酸殘基的位置數(shù)，得到匹配的位置數(shù)，用匹配的位置數(shù)除以比較窗中的位置總數(shù)，并且將結(jié)果乘以100,得到序列同一性百分比。有用的序列同一性百分比的實(shí)例包括但不限于50%,55%,60%,65°/。，70%,75%,80%,85Q/。，90%或95%,或50%-100%的任何整數(shù)百分比。這些同一性可以用本文描述的任何程序確定?？梢杂迷O(shè)計用來檢測同源序列的多種比較方法來確定序列比對和同一性百分比或相似性計算，所述方法包括但不限于，LASERGENE生物信息計算軟件包(DNASTARInc.，Madison,WI)的MegAlign程序。在本申請的上下文中，可以理解，當(dāng)用序列分析軟件進(jìn)行分析時，分析結(jié)果將基于提到的程序的"默認(rèn)值"，除非特別指出相反的意思。本文用到的"默認(rèn)值"表示第一次初始化時最初隨軟件加載的任何組的值或參數(shù)。"ClustalV比對方法"相應(yīng)于標(biāo)記為ClustalV的比對方法(描述于Higgins和Sharp,C4S/OS1,5:151-153(1989);Higgins，D.G.等，C謹(jǐn)戶"，/.W固..,8:189-191(1992))并且存在于LASERGENE生物信息計算軟件包(參見上文)的MegAlignTM程序中。對于多重比對，默認(rèn)參數(shù)相應(yīng)于GAPPENALTY=10和GAPLENGTHPENALTY=10。采用Clustal方法的逐對比對和蛋白序列同一性百分比計算的默認(rèn)參數(shù)是KTUPLE=1,GAPPENALTY=3,WINDOW=5和DIAGONALSSAVED=5。對于核酸，這些參數(shù)是KTUPLE=2,GAPPENALTY=5，WINDOW=4和DIAGONALSSAVED=4。用ClustalV程序進(jìn)行序列比對后，可以通過觀察同一程序中的"序列距離"表，獲得"同一性百分比"。"BLASTN比對方法"是國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)提供的一種算法，采用默認(rèn)參數(shù)比較核苷酸序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員充分理解，很多序列同一性水平可以用于從其它物種鑒定多肽，其中所述多肽具有相同或相似的功能或活性。同一性百分比的有用實(shí)例包括但不限于50%，55%，60%,65%,70%,75%,80%，85%,90%或95%,或50%-100%的任何整數(shù)百分比。實(shí)際上，從50%-100%的任何整數(shù)氨基酸同一性都可以用于描述本發(fā)明，如51%,52%,53%,54%,55%,56%,57%，58%,59%,60%,61%,62%,63%,64%，65%，66%，67%,68%，69%,70%,71%，72%,73%，74%,75%,76%,77%,78%，79%，80%,81%，82%，83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%，90%，91%,92%，93%，94%，95%,96%,97%，98%或99%。同樣，感興趣的是該分離的核苷酸片段的任何全長或部分互補(bǔ)序列。當(dāng)用于植物細(xì)胞時，術(shù)語"基因"不僅僅包括存在于細(xì)胞核中的染色體DNA,也包括存在于細(xì)胞的亞細(xì)胞成分(如線粒體、質(zhì)體)中的細(xì)胞器DNA。"基因"表示能表達(dá)特定蛋白的核酸片段，其包括位于編碼序列前面(5，非編碼序列)和后面(3，非編碼序列)的調(diào)節(jié)序列。"天然基因"表示天然與它自身的調(diào)節(jié)序列一起存在的基因。"嵌合基因"表示不是天然基因的任何基因，包括不是天然一起存在的調(diào)節(jié)和編碼序列。因此，嵌合基因可以包括來自不同來源的調(diào)節(jié)序列和編碼序列，;扁碼序列。5正常'lf況下不;在;宿主:物中，'但:外源"'i因表示通過基因轉(zhuǎn)移導(dǎo)入所述宿主生物的基因。外源基因可以包括插入非天然生物的天然基因，或嵌合基因。"轉(zhuǎn)基因"是業(yè)已通過轉(zhuǎn)化方法導(dǎo)入基因組的基因。"密碼子優(yōu)化的基因"是具有經(jīng)過設(shè)計以便模擬宿主細(xì)胞的優(yōu)選的密碼子選擇頻率的密碼子選擇頻率的基因。"等位基因"是占據(jù)染色體上的特定基因座的基因的幾種可選形式中的一種。當(dāng)存在于染色體的給定基因座上的所有等位基因都相同時，植物在該基因座是純合的。如果存在于染色體的給定基因座上的等位基因是不同的，植物在該基因座是雜合的。"編碼序列"表示編碼特定氨基酸序列的DNA序列。"調(diào)節(jié)序列"表示位于編碼序列上游(5，非編碼序列)，序列內(nèi)，或下游(3'非編碼序列)的核苷酸序列，并且，它能影響相關(guān)編碼序列的轉(zhuǎn)錄、RNA加工或穩(wěn)定性、或翻譯。調(diào)節(jié)序列可以包括但不限于啟動子、翻譯前導(dǎo)序列、內(nèi)含子、聚腺苷酸化識別序列、RNA加工位點(diǎn)、效應(yīng)物結(jié)合位點(diǎn)和莖-環(huán)結(jié)構(gòu)。"啟動子"表示能夠控制編碼序列或功能性RNA表達(dá)的DNA序列。啟動子序列由近端和更遠(yuǎn)端的上游元件組成,后一種元件通常稱作增強(qiáng)子。因此，"增強(qiáng)子"是能夠刺激啟動子活性的DNA序列，并且可以是啟動子的天然元件，或插入用于增強(qiáng)啟動子的水平或組織同一性的異源元件。啟動子可能完全來自天然基因，或者包括來自天然存在的不同啟動子的不同元件，或者甚至包括合成的DNA片段。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，不同的啟動子能夠指導(dǎo)基因在不同的組織或細(xì)胞類型中的表達(dá)，或者在發(fā)育的不同階段的表達(dá)，或者對不同的環(huán)境條件作出反應(yīng)的表達(dá)。還應(yīng)當(dāng)理解的是，由于在大多數(shù)場合下，調(diào)節(jié)序列的確切邊界未能完全確定，不同長度的DNA片段可能具有相同的啟動子活性。能導(dǎo)致基因在大多數(shù)細(xì)胞類型中在大多數(shù)時間表達(dá)的啟動子通常被稱作"組成型啟動子"。正在不斷發(fā)現(xiàn)用于植物細(xì)胞中的各種類型的新啟動子；許多實(shí)例可以參見Okamuro,J.K.,andGoldberg,R.B.Aoc/zem/Wr少。/尸/aw",15:1-82(1989)中的編輯。"翻譯前導(dǎo)序列，，是指位于基因的啟動子序列和編碼序列之間的多核苷酸序列。翻譯前導(dǎo)序列存在于翻譯起始序列上游的完全加工的mRNA中。翻i奪前導(dǎo)序列可以影響一級轉(zhuǎn)錄物加工為mRNA、mRNA穩(wěn)定性或翻譯效率。已經(jīng)描述了翻譯前導(dǎo)序列的實(shí)例(Turner,R.andFoster,G.D.,A/o/.Aofec/mo/.，3:225-236(1995))。術(shù)語"3'非編碼序列"、"轉(zhuǎn)錄終止子"或"終止序列"表示位于編碼序列下游的DNA序列，包括聚腺苷酸化識別序列以及編碼能夠影響mRNA加工或基因表達(dá)的調(diào)控信號的其它序列。聚腺苷酸化信號通常以影響聚腺苷酸添加在mRNA前體的3'末端為特征。不同3，非編碼序列的使用由Ingelbrecht,I.L.,等尸/朋fCe〃，1:671-680(1989)例舉。"RNA轉(zhuǎn)錄物，，表示由RNA聚合酶催化的DNA序列轉(zhuǎn)錄而得到的產(chǎn)物。當(dāng)RNA轉(zhuǎn)錄物是所述DNA序列的完全互補(bǔ)的拷貝時，它#皮稱作初級轉(zhuǎn)錄物。當(dāng)它是來自初級轉(zhuǎn)錄物的轉(zhuǎn)錄后加工的RNA序列時，RNA轉(zhuǎn)錄物—皮稱作成熟RNA。"信使RNA"或"mRNA"表示沒有內(nèi)含子，并且能夠由細(xì)胞翻譯成蛋白的RNA。"cDNA"表示一種DNA,它是互補(bǔ)于mRNA才莫板并且用逆轉(zhuǎn)錄酶由mRNA合成的。CDNA可以是單鏈的，或用DNA聚合酶I的klenow片段轉(zhuǎn)化為雙鏈形式。"有義"RNA表示包括mRNA,并能夠由細(xì)胞翻譯成蛋白的RNA轉(zhuǎn)錄物。"反義RNA，，表示互補(bǔ)于耙初級轉(zhuǎn)錄物或mRNA的全部或部分的RNA,并且它能阻斷靶基因的表達(dá)(美國專利No.5,107,065)。反義RNA的互補(bǔ)性可以是與特定基因轉(zhuǎn)錄物的任何部分，即，在5，非編碼序列、3，非編碼序列、內(nèi)含子或編碼序列處互補(bǔ)的。"功能性RNA"表示反義RNA、核酶RNA、或不能翻譯，但仍然能影響細(xì)胞加工的其他RNA。術(shù)語"互補(bǔ)序列"和"反向互補(bǔ)序列"在mRNA轉(zhuǎn)錄物方面在本文中可以互換使用，用于限定反義信使RNA。術(shù)語"可操作性連接的"表示核酸序列締合在單個核酸片段上，以便其中一個的功能受到另一個的影響。例如，當(dāng)啟動子能夠調(diào)節(jié)編碼序列的表達(dá)時，它就是與該編碼序列可操作性連接的(即，所述編碼序列受所述啟動子的轉(zhuǎn)錄控制)。編碼序列能夠沿有義或反義方向可操作性與調(diào)節(jié)序列連接。在另一實(shí)例中，本發(fā)明的互補(bǔ)RNA區(qū)可以直接或間接連接在單巴mRNA的5',或靶mRNA的3',或靶mRNA中，或第一互補(bǔ)區(qū)在粑mRNA的5，，其互補(bǔ)序列在靶mRNA的3，。本文采用的標(biāo)準(zhǔn)重組DNA和分子克隆技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，并且完整描述于Sambrook,J.,Fritsch，E.F.andManiatis，T.MolecularCloning:ALaboratoryManual;ColdSpringHarborLaboratory:ColdSpringHarbor,NY(1989)。轉(zhuǎn)化方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并且描述于下文。"PCR"或"聚合酶鏈反應(yīng)"是用于合成大量特定DNA片段的技術(shù)，由一系列重復(fù)的循環(huán)組成(PerkinElmerCetusInstruments,Norwalk,CT)。典型地，使雙鏈DNA熱變性，在低溫下使兩個與靶片段的3'邊界互補(bǔ)的引物退火，然后在中等溫度下延伸。一組上述三個連續(xù)步驟稱作一個"循環(huán)"。術(shù)語"重組的，，是指兩個原本分離的序列片段的人工重組，例如通過化學(xué)合成或通過基因工程技術(shù)操作核酸的分離片段。術(shù)語"質(zhì)粒"，"載體"和"盒"表示染色體外元件，它通常攜帶有不作為細(xì)胞的中心代謝部分的基因，并且通常是環(huán)狀雙鏈DNA片段形式的。所述元件可以是自主復(fù)制的序列、基因組整合序列、噬菌體或核苷酸序列、線性或環(huán)狀的單或雙鏈DNA或RNA,可以來自任寸可來源，其中，多個核苷酸序列業(yè)已連接或重組成獨(dú)特的結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)能夠?qū)幼悠魏瓦x定的基因產(chǎn)物的DNA序列，以及合適的3，非翻譯序列導(dǎo)入細(xì)胞。"轉(zhuǎn)化盒"表示包括外源基因，并且除了外源基因之外還具有能促進(jìn)在特定宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)化的元件的特定載體。"表達(dá)盒"表示包括外源基因，并且除了外源基因之外，還具有能夠增強(qiáng)基因在外源宿主中表達(dá)的元件的特定載體(即離散的核酸片段，核酸序列或片段可以在其中移動)。術(shù)語"重組構(gòu)建體"、"表達(dá)構(gòu)建體"、"嵌合構(gòu)建體"、"構(gòu)建體"和"重組DNA構(gòu)建體，，在本文中可以互換使用。重組構(gòu)建體包含核酸片段，如天然不一起存在的調(diào)節(jié)和編碼序列的人工組合。例如，嵌合構(gòu)建體可以包含來源于不同來源的調(diào)節(jié)序列和編碼序列，或來源于相同來源，但以不同于天然的方式排列的調(diào)節(jié)序列和編碼序列。所述構(gòu)建體可以單獨(dú)使用或可以結(jié)合載體使用。如果使用載體，則載體的選擇取決于本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的用于轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的方法。例如，可以使用質(zhì)粒載體。技術(shù)人員熟知為成功轉(zhuǎn)化、選擇和繁殖包含本發(fā)明的任何分離核酸片段而必須存在于載體上的遺傳元件。本領(lǐng)域技術(shù)人員也可以認(rèn)識到，不同的獨(dú)立轉(zhuǎn)化事件將導(dǎo)致不同的表達(dá)水平和模式(Jones等，甜卵J.，4:2411-2418(1985);DeAlmeida等，M/.G饑GewWc^218:78-86(1989)),因此，為了獲得展示需要的表達(dá)水平和才莫式的細(xì)胞系，篩選多個事件是優(yōu)選的。所述篩選可以通過DNA的DNA印跡分析、mRNA表達(dá)的RNA印跡分析、蛋白表達(dá)的免疫印跡分析或表型分析等實(shí)現(xiàn)。本文使用的術(shù)語"表達(dá)"是指產(chǎn)生功能性終產(chǎn)物(如mRNA或蛋白[前體或成熟])。術(shù)語"導(dǎo)入，，表示將核酸(如表達(dá)構(gòu)建體)或蛋白提供到細(xì)胞中。導(dǎo)入包括將核酸摻入真核或原核細(xì)胞，其中核酸可以摻入細(xì)胞的基因組，并且包括給細(xì)胞瞬時提供核酸或蛋白。導(dǎo)入包括穩(wěn)定或瞬時轉(zhuǎn)化方法，以及有性雜交。因此，將核酸片段(如重組DNA構(gòu)建體/表達(dá)構(gòu)建體)插入細(xì)胞的上下文中的"導(dǎo)入"表示"轉(zhuǎn)染"或"轉(zhuǎn)化"或"轉(zhuǎn)導(dǎo)，，，并且包括將核酸片段摻入真核或原核細(xì)胞，其中核酸片段可以摻入細(xì)胞的基因組(如染色體、質(zhì)粒、質(zhì)體或線粒體DNA)，轉(zhuǎn)化為自主復(fù)制子，或瞬時表達(dá)(如轉(zhuǎn)染的mRNA)。"成熟"蛋白表示翻譯后加工的多肽(即，業(yè)已除去了存在于初級翻譯產(chǎn)物中的所有前肽或原肽的蛋白)。"前體"蛋白表示mRNA翻譯的初級產(chǎn)物(即，仍然存在前肽和原肽)。前肽和原肽可以是(但不局限于)細(xì)胞內(nèi)定位信號。"穩(wěn)定轉(zhuǎn)化"是指核酸片段轉(zhuǎn)移到宿主生物的基因組，包括細(xì)胞核和細(xì)胞器基因組，導(dǎo)致遺傳學(xué)穩(wěn)定的遺傳。相反，"瞬時轉(zhuǎn)化"是指核酸片段轉(zhuǎn)移到宿主生物的細(xì)胞核或含DNA的細(xì)胞器，導(dǎo)致基因表達(dá)而不導(dǎo)致整合或穩(wěn)定遺傳。含轉(zhuǎn)化的核酸片段的宿主生物稱作"轉(zhuǎn)基因"生物。本文用到的"轉(zhuǎn)基因的"是指基因組中包含異源多核苷酸的植物或細(xì)胞。優(yōu)選地，異源多核苷酸穩(wěn)定整合到基因組中，使得多核苷酸傳遞到后續(xù)世代中。異源多核苷酸可以單獨(dú)整合到基因組中或作為表達(dá)載體的一部分。"轉(zhuǎn)基因的，，在本文中包括通過異源核酸的存在而使基因型改變的任何細(xì)胞、細(xì)胞系、愈傷組織、組織、植物部分或植物，包括最初如此改變或通過有性雜交或無性繁殖從最初的轉(zhuǎn)基因生物得到的轉(zhuǎn)基因生物。本文用到的術(shù)語"轉(zhuǎn)基因的"不包括通過常規(guī)植物育種方法或通過天然發(fā)生的事件如隨機(jī)交叉受精、非重組病毒感染、非重組細(xì)菌轉(zhuǎn)化、非重組轉(zhuǎn)座或自發(fā)突變導(dǎo)致的基因組(染色體或染色體外)改變。"反義抑制"是指產(chǎn)生能夠抑制靶蛋白表達(dá)的反義RNA轉(zhuǎn)錄物。"共抑制"是指產(chǎn)生能夠抑制相同或基本相似的外來或內(nèi)源基因表達(dá)的有義RNA轉(zhuǎn)錄物(美國專利No.5,231,020)。以前通過以有義方向超量表達(dá)與內(nèi)源mRNA具有同源性的核酸序列設(shè)計了植物中的共抑制構(gòu)建體，其導(dǎo)致所有與超量表達(dá)的序列具有同源性的RNA減少(Vaucheret等，尸/a"f丄，16:651-659(1998);Gura，A^fwe,404:804-808(2000))。該現(xiàn)象的總體效率低，RNA減少的程度廣泛可變。更近的研究描述了"發(fā)夾"結(jié)構(gòu)，其以互補(bǔ)方向摻入mRNA編碼序列的全部或部分，導(dǎo)致表達(dá)的RNA的"莖-環(huán)"結(jié)構(gòu)(PCT公開No.WO99/53050;PCT公開No.WO02/00904)。這增加了回收的轉(zhuǎn)基因植物中共抑制的頻率。另一種變化形式描述了使用植物病毒序列指導(dǎo)近端mRNA編碼序列的抑制或"沉默"(PCT公開No.WO98/36083)。這些共抑制現(xiàn)象都沒有從機(jī)理上闡述，但遺傳證據(jù)解開了該復(fù)雜狀況(Elmayan等，尸/a"/Ce〃，10:1747-1757(1998))。術(shù)語"含油的"表示傾向于以脂質(zhì)形式儲存它們的能源的生物(Weete:FungalLipidBiochemistry,2nded.,Plenum,1980)。鑒定為含油的一類植物通常稱作"油籽"植物。油籽植物的實(shí)例包括但不限于大豆(G/戸'weandW"取)、亞麻(Lz'w謂s/.)、油菜軒(^ra肌.C(2s/.)、玉米、才帛花、纟工花(GaTY/zamz^s/.)和向曰葵(7/e"(3w/1/21/5s/.)。一般，在含油微生物內(nèi)，細(xì)胞油或TAG含量遵循S形曲線，其中，脂類的濃度增加，直到在后對數(shù)期或早期靜止生長期的最大值，然后在晚期靜止期和死亡期逐漸減少(Yongmanitchai和Ward,Appl.Environ,Microbiol.57:419-25(1991))。術(shù)語"含油酵母，，表示被分類為酵母的微生物，它們能夠產(chǎn)生油。含油微生物積累占干細(xì)胞重量的大約25°/。以上的油并非是不常見的。含油酵母的例子包括，但不局限于以下屬耶氏酵母屬，假絲酵母屬，紅酵母屬，紅冬孢屬，隱球酵母屬，絲孢酵母屬和油脂酵母屬。術(shù)語"棵藻綱(Euglenophyceae)"是指在淡水、海水、土壤和寄生環(huán)境中存在的一組單細(xì)胞無色或光合鞭毛蟲("眼蟲類(euglenoids)")。該綱的特征在于單獨(dú)的單細(xì)胞，其中大多數(shù)是自由游泳的，并且具有從稱作儲水池的前褶伸出的兩個編毛(其中之一可以是不出現(xiàn)的)。光合眼蟲類包含一個至多個葉綠體，其從小盤狀到大盤或帶狀。已經(jīng)描述了大約1000個物種，并且分類為大約40個屬和6個目?？迷寰V的實(shí)例包括但不限于以下屬雙鞭藻蟲屬(^^印"e/Za)、目艮蟲屬(五wg/ewa)禾口7fe"we/rep〃a。術(shù)語"植物"是指完整的植物、植物器官、植物組織、種子、植物細(xì)胞、種子及其后代。植物細(xì)胞包括但不限于種子細(xì)胞、懸浮培養(yǎng)物、胚、分生組織區(qū)、愈傷組織、葉、根、芽、配子體、孢子體、花粉和小孢子。"后代"包括植物的任何后續(xù)世代。概述脂肪酸和甘油三酯的微生物生物合成一般地，含油微生物中的脂質(zhì)積累是反應(yīng)于生長培養(yǎng)基中存在的總體碳氮比而引發(fā)的。導(dǎo)致游離棕櫚酸(16:0)在含油微生物中從頭合成的該過程詳細(xì)描述于2004/101757。棕櫚酸是長鏈々包和和不々包和脂肪酸衍生物的前體，其通過延伸酶和去飽和酶的作用形成(圖1)。通過一系列反應(yīng)形成TAGs(脂肪酸的主要存儲單位)，所述一系列反應(yīng)包括1.)一個分子的?；?CoA通過?；D(zhuǎn)移酶酯化為甘油-3-磷酸，以產(chǎn)生溶血磷脂酸；2.)第二個分子的?；?CoA通過酰基轉(zhuǎn)移酶酯化，產(chǎn)生1,2-二酰基甘油磷酸(通常鑒定為磷脂酸)；3.)由磷脂酸磷酸酶除去一個磷酸，產(chǎn)生1,2-二?；视?DAG);和4.)通過酰基轉(zhuǎn)移酶的作用加入第三個脂肪酸，以形成TAG?？梢詫V泛的脂肪酸摻入TAGs，包括飽和和不飽和脂肪酸，以及短鏈和長鏈脂肪酸。w脂肪酸的生物合成將油酸轉(zhuǎn)化為長鏈o)-3/co-6脂肪酸的代謝過程涉及通過加入碳原子而延伸碳鏈和通過加入雙鍵使分子去飽和。這需要一系列存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜中的特殊的去飽和和延伸酶。但是，如圖1所示和下文的描述，通常存在多個替代途徑用于生產(chǎn)特定的(o-3/co-6脂肪酸。具體地，所有途徑都需要通過A12去飽和酶的作用最初將油酸轉(zhuǎn)化為LA,即cd-6脂肪酸的第一個。然后，利用"A9延伸酶/A8去飽和酶途徑"，通過如下過程形成長鏈co-6脂肪酸(1)通過A9延伸酶的作用，LA轉(zhuǎn)化為EDA;(2)通過A8去飽和酶的作用，EDA轉(zhuǎn)化為DGLA;和(3)通過A5去飽和酶的作用，DGLA轉(zhuǎn)化為ARA?；蛘?，可以利用"△9延伸酶/A8去飽和酶途徑"，通過如下過程形成長鏈co-3脂肪酸(1)通過A15去飽和酶的作用，LA轉(zhuǎn)化為ALA,即cd-3脂肪酸的第一個；(2)通過A9延伸酶的作用，ALA轉(zhuǎn)化為ETrA;(3)通過A8去飽和酶的作用，ETrA轉(zhuǎn)化為ETA，(4)通過A5去飽和酶的作用，ETA轉(zhuǎn)化為EPA,(5)通過C2o/22延伸酶的作用，EPA轉(zhuǎn)化為DPA;和(6)通過A4去飽和酶的作用，DPA轉(zhuǎn)化為DHA。任選地，co-6脂肪酸可以轉(zhuǎn)化為co-3脂肪酸；例如，通過A17去飽和酶活性，分別從DGLA和ARA生產(chǎn)ETA和EPA。用于生物合成oo-3/co-6脂肪酸的替代途徑利用A6去飽和酶和C18/20延伸酶(即"A6去飽和酶/A6延伸酶途徑")。更具體地，通過A6去飽和酶的作用，LA和ALA可以分別轉(zhuǎn)化為GLA和STA;然后，C18/2。延伸酶將GLA轉(zhuǎn)化為DGLA和/或STA轉(zhuǎn)化為ETA?？紤]需要導(dǎo)入特定宿主生物以生產(chǎn)w-3/co-6脂肪酸的特定功能性將依賴于宿主細(xì)胞(及其天然PUFA譜和/或去飽和酶/延伸酶"i普)、底物的可獲得性和需要的終產(chǎn)物。例如，在一些實(shí)施方案中，與A6去飽和酶/A6延伸酶的表達(dá)相比，A9延伸酶/A8去飽和酶途徑的表達(dá)可能是優(yōu)選的，因?yàn)橥ㄟ^后一途徑產(chǎn)生的PUFAs不含GLA。本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠鑒定編碼co-3/co-6脂肪酸生物合成所需的每一種酶的多種候選基因。有用的去飽和酶和延伸酶序列可以來源于任何來源，如分離自天然來源(如細(xì)菌、藻類、真菌、植物、動物等)，通過半合成途徑產(chǎn)生或從頭合成。盡管導(dǎo)入宿主中的去飽和酶和延伸酶基因的特定來源對于本發(fā)明不是關(guān)鍵的，但用于選擇具有去飽和酶或延伸酶活性的特定多肽的考慮包括1)多肽的底物特異性；2)多肽或其成分是否是限速酶；3.)去飽和酶或延伸酶對于需要的PUFA的合成是否是必須的；和/或4.)多肽需要的輔因子。表達(dá)的多肽優(yōu)選具有與其在宿主細(xì)胞中的位置的生化環(huán)境相容的參數(shù)(其它細(xì)節(jié)參見PCT公開No.WO2004/101757)。在其它實(shí)施方案中，考慮每種特定去飽和酶和/或延伸酶的轉(zhuǎn)化效率也是有用的。更具體地，由于每種酶;f艮少以100%的效率將底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物，在宿主細(xì)胞中生產(chǎn)的未純化油的最終脂質(zhì)譜將典型是多種PUFAs的混合物，其由需要的co-3/co-6脂肪酸以及多種上游中間PUFAs組成。因此，當(dāng)對需要的脂肪酸的生物合成進(jìn)行優(yōu)化時，考慮每種酶的轉(zhuǎn)化效率也是重要的，必須根據(jù)產(chǎn)物的最終需要的脂質(zhì)譜進(jìn)行考慮。根據(jù)上述每一種考慮，可以根據(jù)公眾可獲得的文獻(xiàn)(如GenBank)、專利文獻(xiàn)和具有生產(chǎn)PUFAs的能力的微生物的實(shí)驗(yàn)分析，筌定具有合適去飽和酶和延伸酶活性(例如A6去飽和酶，Cis/2。延伸酶，A5去飽和酶，A17去飽和酶，A15去々包和酶，A9去々包和酶，A12去々包和酶，。14/16延伸酶，dsA8延伸酶，A9延伸酶，A8去飽和酶，A4去飽和酶和C20/22延伸酶)的候選基因。這些基因適于導(dǎo)入特定宿主生物，以便能夠增強(qiáng)生物的PUFAs合成。新A9延伸酶的序列鑒定在本發(fā)明中，從纖細(xì)眼蟲(本文命名為"EgD9e")和雙鞭藻蟲種CCMP389(本文命名為"E389D9e")分離了編碼△9延伸酶的核苷酸序列。采用ClustalV分析，與公共數(shù)據(jù)庫比較EgD9e核苷酸堿基和推定的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)在258個氨基酸的長度上最相似的已知序列(即IgD9e)與EgD9e的氨基酸序列具有大約31.8%同一性。采用ClustalV分析，與公共數(shù)據(jù)庫比較E389D9e核苷酸堿基和推定的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)在263個氨基酸的長度上最相似的已知序列(即IgD9e)與本文報道的E389D9的氨基酸序列具有大約33.1%同一性。作為參考，采用ClustalV分析，本文描述為SEQIDNO:2和SEQIDNO:5的新EgD9e和E389D9e蛋白序列具有65.1%同一性。在本發(fā)明的上下文中，優(yōu)選的氨基酸片段與本文的EgD9e和E389D9e序列具有至少約70%-85%同一性，其中具有至少約85%-90%同一性的那些序列是特別合適的，具有至少約90%-95%同一性的那些序列是最優(yōu)選的。相應(yīng)于本發(fā)明的ORFs的優(yōu)選EgD9e和E389D9e編碼核酸序列分別是編碼活性蛋白的那些和與本文報道的EgD9e和E389D9e的核酸序列具有至少約70%-85%同一性的那些，其中具有至少85%-90%同一性的那些序列是特別合適的，具有至少約90%-95°/0同一性的那些序列是最優(yōu)選的。在替代實(shí)施方案中，本發(fā)明的EgD9e和E389D9e序列可以為在特定宿主生物中表達(dá)而進(jìn)行密碼子優(yōu)化。如本領(lǐng)域公知的，在替代宿主中進(jìn)一步優(yōu)化酶的表達(dá)是有用的方法，因?yàn)樗拗鲀?yōu)選的密碼子的使用可以顯著增強(qiáng)編碼多肽的外來基因的表達(dá)。一般地，通過檢驗(yàn)蛋白(優(yōu)選以最大量表達(dá)的那些)中的密碼子選擇和確定哪些密碼子以最高的頻率使用，可以在特定感興趣的宿主物種中確定宿主優(yōu)選的密碼子。然后，可以用宿主物種中優(yōu)選的密碼子全部或部分地合成具有例如延伸酶活性的感興趣多肽的編碼序列。也可以合成DNA的全部(或部分)，以除去轉(zhuǎn)錄的mRNA中存在的任何二級結(jié)構(gòu)去穩(wěn)定序列或區(qū)域。也可以合成DNA的全部(或部分)，以將石咸基組成改變成在需要的宿主細(xì)^^包中更優(yōu)選的組成。在本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方案中，EgD9e和E389D9e為在解脂耶氏酵母中表達(dá)而進(jìn)行了密碼子優(yōu)化。通過首先確定解脂耶氏酵母密碼子選擇鐠(參見PCT公開No.WO04/101757)然后鑒定優(yōu)選的那些密碼子，可以實(shí)現(xiàn)上述目的。通過確定"ATG'，起始密碼子附近的共有序列，實(shí)現(xiàn)解脂耶氏酵母中基因表達(dá)的進(jìn)一步優(yōu)化。EgD9e的優(yōu)化導(dǎo)致777bp編碼區(qū)中117bp的修飾(15.1%)和106個密碼子的優(yōu)化。密碼子優(yōu)化的基因("EgD9eS";SEQIDNO:3)中的修飾都沒有改變編碼的蛋白的氨基酸序列(SEQIDNO:2)。如實(shí)施例8的描述，當(dāng)在解脂耶氏酵母中表達(dá)時，密碼子優(yōu)化的基因在將LA延伸為EDA方面比野生型EgD9e基因的效率高約16.2%。類似地，E389D9e的優(yōu)化導(dǎo)致792編碼區(qū)中128bp的修飾(16.2%)和113個密碼子的優(yōu)化。密碼子優(yōu)化的基因("E389D9eS";SEQIDNO:6)中的修飾都沒有改變編碼的蛋白的氨基酸序列(SEQIDNO:5)。如實(shí)施例24的描述，當(dāng)在解脂耶氏酵母中表達(dá)時，密碼子優(yōu)化的基因在將LA延伸為EDA方面與野生型EgD9e基因的效率相似。因此，本發(fā)明涉及編碼具有A9延伸酶活性的多肽的多核普酸序列，選自下組(a)分離的核酸序列，包含編碼具有△9延伸酶活性的多肽的核苷酸序列，其中基于ClustalV比對方法，所述多肽與SEQIDNO:2(EgD9e)或SEQIDNO:5(E389D9e)所示氨基酸序列相比，具有至少70%氨基酸同一性；(b)分離的核酸序列，包含編碼具有A9延伸酶活性的多肽的核苷酸序列，其中基于BLASTN比對方法，所述核苷酸序列與SEQIDNO:1(EgD9e)、SEQIDNO:3(EgD9eS)、SEQIDNO:4(E389D9e)或SEQIDNO:6(E389D9eS)所示核苷酸序列相比，具有至少70%序列同一性；(c)分離的核酸序列，包含編碼具有△9延伸酶活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列在以下嚴(yán)才各雜交條件下與SEQIDNO:1(EgD9e)、SEQIDNO:3(EgD9eS)、SEQIDNO:4(E389D9e)或SEQIDNO:6(E389D9eS)所示核苷酸序列雜交O.IXSSC，0.1%SDS,65。C，并且用2XSSC，0.1。/oSDS洗滌，隨后用O.IXSSC,0.1%SDS洗滌；和(d)上述(a)、(b)或(c)的核苷酸序列的互補(bǔ)序列，其中所述互補(bǔ)序列和所述核普酸序列由相同數(shù)目的核苦酸組成，并且是100%互補(bǔ)的。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠采用本文的教導(dǎo)，基于野生型EgD9e和/或E389D9e序列，制備其它適于在替代的宿主(即除解脂耶氏酵母外)中最優(yōu)表達(dá)的密碼子優(yōu)化的A9延伸酶蛋白。這種替代的宿主生物可以包括但不限于植物或植物部分。因此，本發(fā)明涉及來源于野生型EgD9e(即由SEQIDNO:2編碼)或野生型E389D9e(即由SEQIDNO:5編碼)的任何密碼子優(yōu)化的A9延伸酶蛋白。這包括但不限于SEQIDNO:3(其編碼合成的A9延伸酶蛋白(即EgD9eS))和SEQIDNO:6(其編碼合成的A9延伸酶蛋白(即E389D9eS))所示的核苷酸序列，這兩者都為在解脂耶氏酵母中表達(dá)而進(jìn)行了密碼子優(yōu)化。另一方面，本發(fā)明涉及分離的核酸片段，其包含編碼A9延伸酶的核酸序列，排除SEQIDNO:8(即"lgD9e",來自球等鞭金藻的A9延伸酶(NCBI登錄號AAL37626(GI17226123)),其中包含所述A9延伸酶的氨基酸序列包含至少一個選自下組的以下氨基酸序列基序a)YNX(L或F)XXXXSXXSF(SEQIDNO:123);b)FYXSKXX(E或D)YXD(T或S)XXL(SEQIDNO:124);c)L(Q或H)XEHHXGA(SEQIDNO:125);d)MYXYYXXXXXXX(K或R或N)￡(SEQIDNO:126);e)KXL(I或L或M)TXXQ(SEQIDNO:127);f)WX￡NXXY(SEQIDNO:128);和g)YXQXYXXLF(SEQIDNO:129);其中X可以是任何氨基酸。加下劃線的氨基酸可以是A9延伸酶特有的。圖2顯示了用ClustalV比對(采用默認(rèn)參數(shù))進(jìn)行的本發(fā)明的A9延伸酶與來自球等鞭金藻的A9延伸酶的比較。具體地，比較了SEQIDNO:2(EgD9e)，SEQIDNO:5(E389D9e)和SEQIDNO:8(IgD9e)。包含本發(fā)明的基序的區(qū)域在框中表示。同源物的鑒定和分離任何本發(fā)明的延伸酶序列(即EgD9e,EgD9eS，E389D9e,藻類、真菌:眼1類或4物物種中檢索A9延伸酶同源j/一般地，所述計算機(jī)軟件通過將同源性程度賦予多個取代、缺失和其它修飾，匹配相似的序列?；蛘?，任何本發(fā)明的延伸酶序列或其部分也可以用作鑒定A9延伸酶同源物的雜交試劑。核酸雜交試驗(yàn)的基本組分包括探針，懷疑含有目標(biāo)基因或基因片段的樣品，和特定雜交方法。本發(fā)明的探針典型地是與待測核酸序列互補(bǔ)的單鏈核酸序列。探針與待測核酸序列"可雜交"。探針長度可以從5個堿基至數(shù)萬堿基，但典型地，約15堿基至約30堿基的探針長度是合適的。僅僅探針分子的一部分需要與待測核酸序列互補(bǔ)。另外，探針和粑序列之間的互補(bǔ)性不需要是完全的。雜交會發(fā)生在非完全互補(bǔ)的分子之間，結(jié)果是，雜交區(qū)中的某些堿基部分未與適當(dāng)?shù)幕パa(bǔ)名咸基配對。雜交方法是非常確定的。典型地，必須在允許核酸雜交的條件下，混合探針和樣品。這包含，在適當(dāng)濃度和溫度條件下，在有無機(jī)或有機(jī)鹽存在下，使探針接觸樣品。探針和樣品核酸必須接觸足夠長的時間，使探針和樣品核酸之間可以發(fā)生任何可能的雜交?；旌衔镏刑结樆虬械臐舛龋瑳Q定著發(fā)生雜交所需的時間。探針或靶濃度越高，所需的雜交溫育時間越短。任選地，可以加入離液劑(例如氯化胍，硫氰酸胍，石危氰酸鈉，四氯醋酸鋰，高氯酸鈉，四氯醋酸銣，二碘化鉀、三氟醋酸銫)。如果需要，可以向雜交混合物中加入曱酰胺，典型地，30-50%(v/v)?？梢允褂枚喾N雜交溶液。典型地，它們包含約20-60%體積(優(yōu)選30%)的極性有機(jī)溶劑。常見的雜交溶液使用約30-50%v/v甲酰胺，約0.15-1M氯化鈉，約0.05-0.1緩沖劑(例如，檸檬酸鈉，Tris-HCl，PIPES或HEPES(pH范圍約6-9))，約0,05-0.2%去污劑(例如，十二烷基石危酸鈉)，或0.5-20mMEDTA,FICOLL(PharmaciaInc.)(約300-500kdal),聚乙烯吡咯酮(約250-500kdal)和血清白蛋白。在典型的雜交溶液中還包含約0.1-5mg/mL未標(biāo)記的載體核酸，斷裂的核酸DNA(例如，小牛胸腺或鮭精DNA,或酵母RNA),和任選的約0.5-2%wt/vol甘氨酸。也可以包含其它添加劑，例如體積排阻劑，包括許多極性的水-溶的或可溶脹的試劑(例如，聚乙二醇)，陰離子聚合物(例如，聚丙烯酸酯或聚曱基丙烯酸酯)和陰離子糖聚合物(例如，硫酸葡聚糖)。核酸雜交適用于許多測定形式。最適當(dāng)?shù)男问街皇菉A心測定形式。夾心測定特別適用于在非變性條件下的雜交。夾心型測定的基本組分是固體支持物。固體支持物具有吸附或共價結(jié)合到它上面的固定化的核酸探針，后者未被標(biāo)記，且與序列的一部分互補(bǔ)。在另外的實(shí)施方案中，任何本文描述的A9延伸酶核酸片段(或其任何鑒定的同源物)都可以用于從相同或其它細(xì)菌、藻類、真菌、眼蟲類或植物物種中分離編碼同源蛋白的基因。使用序列依賴性的方法分離同源基因，是本領(lǐng)域眾所周知的。序列依賴性的方法的實(shí)例包括^f旦不限于l.)核酸雜交方法；2.)DNA和RNA擴(kuò)增方法，如通過4吏用各種核酸擴(kuò)增技術(shù)所例證的[例如，聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，Mullis等，美國專利4,683,202;連接酶鏈反應(yīng)(LCR)，Tabor,S.等，尸radc"dS"USA82:1074(1985);或鏈置換擴(kuò)增(SDA),Walker,等，脂/.S""S.A，89:392(1992)];和3.)文庫構(gòu)建和篩選互補(bǔ)的方法。例如，通過使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法，使用本發(fā)明的核酸片段的全部或一部分作為DNA雜交探針，來從例如任何目標(biāo)酵母或真菌(其中生產(chǎn)EDA和/或ETrA的生物是優(yōu)選的)篩選文庫，可以直接分離編碼與本文所述A9延伸酶類似的蛋白或多肽的基因。通過本領(lǐng)域已知的方法(Maniatis,可以設(shè)計和合成基于本發(fā)明的核酸序列的特異性寡核苷酸探針。此外，通過技術(shù)人員已知的方法(例如，隨機(jī)引物DNA標(biāo)記，切口平移或末端標(biāo)記技術(shù))，可以將完整序列直接用于合成DNA探針，或使用可得到的體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)，合成RNA探針。另外，可以設(shè)計特異性的引物，并用于擴(kuò)增本發(fā)明序列的一部分(或全長)?？梢栽跀U(kuò)增反應(yīng)過程中直接標(biāo)記得到的擴(kuò)增產(chǎn)物，或在擴(kuò)增反應(yīng)后標(biāo)記，并用作探針，來在適當(dāng)嚴(yán)格性條件下分離全長DNA片段。典型地，在PCR-型擴(kuò)增技術(shù)中，引物具有不同的序列，且彼此不互補(bǔ)。根據(jù)希望的測試條件，引物的序列應(yīng)當(dāng)設(shè)計成能提供靶核酸的有效且可靠的復(fù)制。PCR引物設(shè)計方法是本領(lǐng)域常見的且眾所周知的(Thdn和Wallace,"TheuseofoligonucleotidesasspecifichybridizationprobesintheDiagnosisofGeneticDisorders",inHumanGeneticDiseases:爿/Va"/ca/4^proac/z，K.E.DavisEd.，(1986)pp33-50，IRL:Herndon,VA;和Rychlik,W.,InMethodsinMolecularBiology,White,B.A.Ed.,(1993)Vol.15,pp31-39,PCRProtocols:CurrentMethodsandApplications.Humania:Totowa,NJ)。通常，本發(fā)明序列的兩個短片段可以用于聚合酶鏈反應(yīng)方法中，以從DNA或RNA擴(kuò)增編碼同源基因的更長核酸片段。聚合酶鏈反應(yīng)也可以在克隆的核酸片段文庫上進(jìn)行，其中一個引物的序列源自本發(fā)明的核酸片段，且另一個引物的序列利用聚腺苷酸束，其存在于編碼微生物基因的mRNA前體的3'末端?；蛘?，第二個引物序列可以基于源自克隆載體的序列。例如，技術(shù)人員可以按照RACE方法(Frohman等，/WJS85:8998(1988))，使用PCR擴(kuò)增轉(zhuǎn)錄物中的單個點(diǎn)和3'或5'末端之間的區(qū)域的拷貝，產(chǎn)生cDNA。從本發(fā)明序列，可以設(shè)計朝向3'和5'方向的引物。使用可商業(yè)得到的3'RACE或5'RACE系統(tǒng)(例如，BRL,Gaithersburg,MD),可以分離特異性的3'或5'cDNA片段(Ohara等，尸A^4SV&486:5673(1989);Loh等，S"e證243:217(1989))。在其它實(shí)施方案中，可以用本文描述的任何A9延伸酶核酸片賴二(或其任何鑒定的同源物)制備新的和改進(jìn)的脂肪酸延伸酶。如本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，可以用體外誘變和選擇、化學(xué)誘變、"基因改組"方法或其它方法獲得天然延伸酶基因的突變(其中所述突變可以包括缺失、插入和點(diǎn)突變或其組合)。這使得能夠在體內(nèi)生產(chǎn)分別具有延伸酶活性的多肽，其具有在宿主細(xì)胞中起作用的更理想的物理和動力學(xué)參數(shù)(如更長的半衰期或生產(chǎn)需要的PUFA的更高速度)?；蛘?，如果需要，可以通常規(guī)誘變、得到的突變多肽的表達(dá)和它們活性的確定，來測定對酶活性重要的感興趣多肽(即A9延伸酶)的區(qū)域。這些技術(shù)的綜述描述于PCT公開No.WO2004/101757。來源于EgD9e,EgD9eS,E389D9e和E389D9eS的所有所述突變蛋白和編碼它們的核苷酸序列都在本發(fā)明的范圍內(nèi)?；蛘?，可以通過結(jié)構(gòu)域交換合成改進(jìn)的脂肪酸，其中來自本文描述的任何△9延伸酶核酸片段的功能性結(jié)構(gòu)域與替代的延伸酶基因中的功能性結(jié)構(gòu)域交換，從而得到新的蛋白。生產(chǎn)多種oo-3和/或co-6脂肪酸的方法合適的啟動子控制下的本文描述的編碼A9延伸酶(即EgD9e,EgD9eS,E389D9e,E389D9eS或其它突變酶、密碼子優(yōu)化的酶或其同源物)的嵌合基因的導(dǎo)入預(yù)期將分別導(dǎo)致轉(zhuǎn)化的宿主生物中EDA和/或ETrA的生產(chǎn)增加。因此，本發(fā)明包括用于直接生產(chǎn)PUFAs的方法，包括將脂肪酸底物(即LA和/或ALA)暴露于本文描述的延伸酶(如EgD9e,EgD9eS,E389D9e，E389D9eS),使得底物轉(zhuǎn)化為需要的脂肪酸產(chǎn)物(即EDA和/或ETrA)。更具體地，本發(fā)明的目的是提供在宿主細(xì)胞(如含油酵母、大豆)中生產(chǎn)EDA的方法，其中所述宿主細(xì)胞包含a)分離的多核苷酸序列，編碼具有A9延伸酶活性的多肽，所述多核苷酸序列選自(1)分離的核酸序列，包含編碼具有A9延伸酶活性的多肽的核苷酸序列，其中基于ClustalV比對方法，所述多肽與SEQIDNO:2(EgD9e)或SEQIDNO:5(E389D9e)所示氨基酸序列相比，具有至少70%氨基酸同一性；(2)分離的核酸序列，包含編碼具有A9延伸酶活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核普酸序列在以下嚴(yán)才各條件下與SEQIDNO:胸D9e)、SEQIDNO:3(EgD9eS)、SEQIDNO:4(E389D9e)或SEQIDNO:6(E389D9eS)所示核苷酸序列雜交0.1XSSC,0.1%SDS，65°C,并且用2XSSC,0.1。/。SDS洗滌，隨后用0.1XSSC，0.1%SDS洗滌；和b)LA的來源；其中在表達(dá)A9延伸酶并且將LA轉(zhuǎn)化為EDA的條件下使宿主細(xì)月包生長；以及任選回收EDA。在本發(fā)明的替代實(shí)施方案中，A9延伸酶可以用于將ALA轉(zhuǎn)化為ETrA。因此，本發(fā)明提供了生產(chǎn)ETrA的方法，其中所述宿主細(xì)胞包含a)分離的多核苷酸序列，編碼具有A9延伸酶活性的多肽，所述多核苷酸序列選自(1)分離的核酸序列，包含編碼具有A9延伸酶活性的多肽的核苷酸序列，其中基于ClustalV比對方法，所述多肽與SEQIDNO:2(EgD9e)或SEQIDNO:5(E389D9e)所示氨基酸序列相比，具有至少70%氨基酸同一性；(2)分離的核酸序列，包含編碼具有A9延伸酶活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列在以下嚴(yán)格條件下與SEQIDNO:胸D9e)、SEQIDNO:3(EgD9eS)、SEQIDNO:4(E389D9e)或SEQIDNO:6(E389D9eS)所示核苷酸序列雜交0.1XSSC,0.1%SDS,65°C,并且用2XSSC,0.P/。SDS洗滌，隨后用0.1XSSC，0.1%SDS洗滌；和b)ALA的來源；其中在表達(dá)A9延伸酶并且將ALA轉(zhuǎn)化為ETrA的條件下使宿主細(xì)胞生長；以及任選回收ETrA?；蛘?，本文描述的每種A9延伸酶基因及其相應(yīng)酶產(chǎn)物可以間接用于生產(chǎn)各種oo-6和co-3PUFAs,包括例如DGLA,ETA,ARA,EPA,DPA和/或DHA(圖1;參見PCT公開No.WO2004/101757)。當(dāng)脂肪酸底物通過中間步驟或中間途徑間接轉(zhuǎn)化為需要的脂肪酸產(chǎn)物時，發(fā)生co-3/co-6PUFAs的間接生產(chǎn)。因此，考慮本文描述的△9延伸酶(例如EgD9e,EgD9eS,E389D9e,E389D9eS或其它突變酶，密碼子優(yōu)4匕的酶或其同源物)可以與編碼PUFA生物合成途徑的酶(例如△6去々包和酶，(:18/2。延伸酶，A17去飽和酶，A15去飽和酶，A9去飽和酶，A12去飽和酶，d4A6延伸酶，(16/18延伸酶，A5去飽和酶，A8去飽和酶，A4去飽和酶，C，22延伸酶)的其它基因聯(lián)合表達(dá)，導(dǎo)致更高水平的長鏈w-3/co-6脂肪酸(例如ARA，EPA,DPA和DHA)的生產(chǎn)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的A9延伸酶將最少與A8去飽和酶(例如SEQIDNO:61所示的△8去飽和酶[EgD8]或SEQIDNO:69所示的密碼子優(yōu)化的A8去飽和酶[EgD8S])聯(lián)合表達(dá)。但是，特定表達(dá)盒中包含的特定基因?qū)⑷Q于宿主細(xì)胞(及其PUFA譜和/或去飽和酶/延伸酶譜)、底物的可獲得性和需要的終產(chǎn)物。在替代的實(shí)施方案中，基于本文公開的完整序列、這些完整序列的互補(bǔ)序列、這些序列的主要部分、來源于它們的密碼子優(yōu)化的延伸酶和與其基本同源的序列，破壞宿主生物的天然△9延伸酶可能是有用的。植物表達(dá)系統(tǒng)、盒和載體，以及轉(zhuǎn)化在一種實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及重組構(gòu)建體，其包含與至少一個適于在植物中表達(dá)的調(diào)節(jié)序列可操作性連接的本發(fā)明的任意一種△9延伸酶多核苷酸。列產(chǎn)生RNA的DNA序列。啟動子區(qū)影響產(chǎn)生基因的RNA轉(zhuǎn)錄物的速度、發(fā)育階段和細(xì)胞類型。加工RNA轉(zhuǎn)錄物，產(chǎn)生mRNA,其作為用于將RNA序列翻譯為所編碼的多肽的氨基酸序列的模板。5'非翻譯前導(dǎo)序列是蛋白編碼區(qū)上游的mRNA區(qū)，其在mRNA的起始和翻譯中起作用。3'轉(zhuǎn)錄終止/聚腺苷酸化信號是蛋白編碼區(qū)下游的非翻譯區(qū)，其在植物細(xì)胞中導(dǎo)致RNA轉(zhuǎn)錄物的終止和在RNA的3，末端添加聚腺苷酸。選擇用于驅(qū)動A9延伸酶編碼序列表達(dá)的啟動子的起點(diǎn)不是重要的，只要它具有足夠的轉(zhuǎn)錄活性，從而通過在正確的時間在需要的宿主組織中表達(dá)需要的核酸片l殳的可翻i奪mRNA而實(shí)現(xiàn)本發(fā)明?？梢杂卯愒椿蚍钱愒?即內(nèi)源)啟動子實(shí)施本發(fā)明。例如，合適的啟動子包括，但不限于P-大豆球蛋白(conglycinin)啟動子的a-引發(fā)亞基、Kunitz胰蛋白酶抑制劑3啟動子、膜聯(lián)蛋白啟動子、Glyl啟動子、P-大豆球蛋白啟動子的P亞基、P34/GlyBdm30K啟動子、白蛋白啟動子、LegAl啟動子和LegA2啟動子。膜聯(lián)蛋白或P34啟動子描述于PCT公開No.WO2004/071178(2004年8月26日公開)。膜聯(lián)蛋白啟動子的活性水平與很多已知的強(qiáng)啟動子相似，例如(1)CaMV35S啟動子(Atanassova等，尸/a"fMo/.所o/.,37:275-285(1998);Battraw和Hall,尸/a"fMo/.Ao/.,15:527-538(1990);Holtorf等，尸/"WMo/.Ao/.，29:637-646(1995);Jefferson等，EMS(9J.,6:3901-3907(1987);Wilmink等，尸/tmfMo/.5z'o/.，28:949-955(1995));(2)擬南芥油質(zhì)蛋白啟動子(Plant等，尸/a"f她/.Ao/.,25:193-205(1994);Li,TexasA&MUniversityPh.D.dissertation,pp.107-128(1997》;(3)擬南芥遍在蛋白延伸蛋白啟動子(Callis等，丄腸/.CZzem.，265(21》12486-93(19卯));(4)番茄遍在蛋白基因啟動子(Rollfinke等，211(2):267-76(1998));(5)大豆熱激蛋白啟動子(Schoffl等，M/.217(2-3):246-53(1989));和(6)玉米H3組蛋白基因啟動子(Atanassova等，尸/a^Mo/.所o/.,37(2):275-85(1989))。膜聯(lián)蛋白啟動子的另一個有用的特征是其在發(fā)育中的種子中的表達(dá)鐠。膜聯(lián)蛋白啟動子在早期階段(授粉后10天之前)的發(fā)育中的種子中活性最高，并且在晚期階段是很大程度靜止的。膜聯(lián)蛋白啟動子的表達(dá)譜與很多種子特異性啟動子，如種子貯藏蛋白啟動子不同，所述種子貯藏蛋白啟動子通常在發(fā)育的較晚階段提供最高活性(Chen等，Dev.10:112-122(1989);Ellerst腿等,尸/"m1她/.淑.,32:1019-1027(1996);Keddie等，尸/a"fA^o/.Ao/.，24:327-340(1994);Plant等，(^7丄)；Li,(^L/:》。膜聯(lián)蛋白啟動子具有更常規(guī)的表達(dá)譜，但保持與其它已知的種子特異性啟動子不同。因此，當(dāng)需要在早期發(fā)育階段中在胚中超量表達(dá)或抑制基因時，膜聯(lián)蛋白啟動子將是非常有吸引力的候選物。例如，可能需要超量表達(dá)調(diào)節(jié)早期胚發(fā)育的基因或在種子成熟前參與代謝的基因。鑒定適用于表達(dá)特定A9延伸酶編碼序列的合適啟動子后，隨后用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的常規(guī)方法以有義方向可操作性連接啟動子。本文采用的標(biāo)準(zhǔn)重組DNA和分子克隆技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，并且更完整描述于Sambrook,J.等,M/ecw/"/rC7owVzg.'J丄"6ora^^Mww"/;第二版；ColdSpringHarborLaboratoryPress:ColdSpringHarbor,NewYork,1989(下文稱作"Sambrook等，1989")或A應(yīng)bel,F.M.，Brent,R.，Kingston,R.E.,Moore,D.D.，Seidman,J,G,,Smith,J,A.和Struhl,K.,Eds.;Cw/rew/尸/x^ocoAs1z'wMo/ecw/"rJohnWileyandSons:NewYork,1990(下文稱作"A觀bel等,1990")。一旦制備了重組構(gòu)建體，隨后可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法(例如轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)化和電穿孔)將其導(dǎo)入選擇的植物細(xì)胞。油籽植物細(xì)胞是優(yōu)選的植物細(xì)胞。隨后在合適的條件下培養(yǎng)和再生轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，從而使得能夠表達(dá)長鏈PUFA,然后任選回收和純化長鏈PUFA。本發(fā)明的重組構(gòu)建體可以導(dǎo)入植物細(xì)胞；或者，替代地，每種構(gòu)建體可以導(dǎo)入分開的植物細(xì)胞。按照上文的描述可以通過瞬時或穩(wěn)定方式實(shí)現(xiàn)植物細(xì)胞的表達(dá)。可以在種子中表達(dá)需要的長鏈PUFAs。從所述轉(zhuǎn)化的植物獲得的種子或植物部分也包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。植物部分包括分化和未分化的組織，包括但不限于以下這些才艮、莖、芽、葉、花粉、種子、瘤組織和多種形式的細(xì)胞和培養(yǎng)物(例如單細(xì)胞、原生質(zhì)體、胚和愈傷組織)。植物組織可以在植物中或植物器官、組織或細(xì)胞培養(yǎng)物中。術(shù)語"植物器官"是指植物組織或一組組織，其構(gòu)成植物的形態(tài)和功能上不同的部分。術(shù)語"基因組"是指以下l)在生物的每個細(xì)胞或病毒或細(xì)胞器中存在的遺傳材料(基因和非編碼序列)的完整互補(bǔ)物；和/或2)作為(單倍體)單位從一個親本遺傳的完整的一組染色體。因此，本發(fā)明也涉及轉(zhuǎn)化細(xì)胞的方法，包括用本發(fā)明的重組構(gòu)建體轉(zhuǎn)化細(xì)胞，并且選擇用所述重組構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的細(xì)月包。也感興趣的是用于生產(chǎn)轉(zhuǎn)化的植物的方法，包括用本發(fā)明的△9延伸酶多核苦酸轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，并且從轉(zhuǎn)化的植物細(xì)l包再生植物。公開了用于轉(zhuǎn)化雙子葉植物(主要通過使用根癌土壤桿菌)并且獲得轉(zhuǎn)基因植物的方法，其用于例如棉花(美國專利No.5,004,863;美國專利No,5,159,135);大豆(美國專利No.5,569,834;美國專利No.5,416,011);蕓苔(美國專利No.5,463,174);花生(Cheng等，尸/耐Ce〃15:653-657(1996);McKently等，尸/^Ce〃i^;.,14:699-703(1995));木瓜(Ling,K.等，Ao々ec/wo/og》9:752-758(1991》；和3宛豆(Gmnt等，尸/a"fCe〃Ae/.,15:254-258(1995))。關(guān)于其它常用植物轉(zhuǎn)化方法的綜述參見Newell，C.A.(Mo/.Ao&c/mo/.,16:53-65(2000))。這些轉(zhuǎn)化方法之一采用發(fā)根土壤桿菌(Tepfler，M.andCasse-Delbart，F(xiàn).,A^cra&o/.5W.，4:24-28(1987))。公開了采用PEG融合(PCT公開No.WO92/17598),電穿孔(Chowrira，G.M.等，Mo/.Ao&c/mo/.,3:17-23(1995);Christou,P.等，iVw/.Scz..t/&4,84:3962-3966(1987)),微注射，或粒子轟擊(McCabe,D.E.等，Bzo/rec/mo/ogy，6:923(1988);Christou等，尸/am1尸/2^s7V/.,87:671-674(1988)),通過直接送遞DNA而轉(zhuǎn)化大豆。存在4艮多用于從植物組織再生植物的方法。特定再生方法將取決于起始的植物組織和要再生的特定植物物種。從單植物原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化體或從多個轉(zhuǎn)化的外植體再生、發(fā)育和培養(yǎng)植物的方法是本領(lǐng)域公知的(AVeissbach禾口Weissbach,:MethodsforPlantMolecularBiology,(Eds.)，Academic:SanDiego,CA(1988))。這種再生和生長過程通常包括以下步驟選擇轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，培養(yǎng)所述單個細(xì)胞，經(jīng)過通常的胚發(fā)育階段到有根幼苗階段。類似地再生轉(zhuǎn)基因胚和種子。得到的轉(zhuǎn)基因有根的芽隨后種植在合適的植物生長培養(yǎng)基如土壤中。優(yōu)選地，再生的植物是自授粉的，以提供純合轉(zhuǎn)基因植物。否則，從再生的植物獲得的花粉與農(nóng)業(yè)重要品系的種子生長的植物雜交。相反，來自這些重要品系的植物的花粉用于給再生植物授粉。用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法培養(yǎng)含需要的多肽的本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物。除了上文討論的程序，從業(yè)者熟知標(biāo)準(zhǔn)資源，其針對以下內(nèi)容描述了特定條件和程序大分子(如DNA分子、質(zhì)粒等)的構(gòu)建、操作和分離；重組DNA片段和重組表達(dá)構(gòu)建體的制備；和克隆的篩選和分離。參見,例如Sambrook等,MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarbor:NY(1989);Maliga等，MethodsinPlantMolecularBiology,ColdSpringHarbor:NY(1995);Birren等,GenomeAnalysis:DetectingGenes,Vol.1，ColdSpringHarbor:NY(1998);Birren等，GenomeAnalysis:AnalyzingDNA，Vol.2,ColdSpringHarbor:NY(1998);PlantMolecularBiology:ALaboratoryManual,eds.Clark,Springer:NY(1997)。油籽植物的實(shí)例包括但不限于大豆、蕓苔物種、向日葵、玉米、棉花、亞麻和紅花。具有至少20個碳原子和5個或更多碳-碳雙鍵的PUFAs的實(shí)例包括但不限于co-3脂肪酸，例如EPA,DPA和DHA。從所述植物獲得的種子以及從所述種子獲得的油也屬于本發(fā)明的范圍。因此，在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，涉及油籽植物，其包含a)第一重組DNA構(gòu)建體，包含編碼A9延伸酶多肽的分離的多核苷酸，所述多核苷酸與至少一個調(diào)節(jié)序列可操作性連接；和b)至少一個另外的重組DNA構(gòu)建體，包含編碼多肽的分離的多核苦酸，所述多核普酸與至少一個調(diào)節(jié)序列可操作性連接，所述多肽選自A4去々包和酶，A5去々包和酶，A6去飽和酶，A8去々包和酶，A9去飽和酶，A12去飽和酶，A15去飽和酶，A17去飽和酶，(314/16延伸酶，(:16/18延伸酶，ds/20延伸酶和C2Q/22延伸酶。所述另外的去々包和酶討{侖于例如美國專利No.6,075，183,No.5,968,809，No.6,136,574，No.5,972,664,No.6,051,754，No.6,410,288和PCT公開No.WO98/46763,No.WO98/46764,No.WO00/12720和No.WO00/40705。使用的盒的組合的選自部分取決于要轉(zhuǎn)化的油籽植物細(xì)月包的PUFA譜和/或去飽和酶/延伸酶譜，以及要表達(dá)的長鏈PUFA(s)。另一方面，本發(fā)明涉及在植物細(xì)胞中制備長鏈PUFAs的方法，包括(a)用本發(fā)明的重組構(gòu)建體轉(zhuǎn)化細(xì)胞；和(b)選擇產(chǎn)生長鏈PUFAs的轉(zhuǎn)化細(xì)月包。另一方面，本發(fā)明涉及在大豆細(xì)胞中生產(chǎn)至少一種PUFA的方法，包括(a)用第一重組DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化大豆細(xì)胞，所述構(gòu)建體包含(i)編碼A9延伸酶多肽的分離的多核普酸，所述多核苦酸與至少一個調(diào)節(jié)序列可操作性連接；和(ii)至少一個另外的重組DNA構(gòu)建體，包含編碼多肽的分離的多核苷酸，所述多核苷酸與至少一個調(diào)節(jié)序列可操作性連接，所述多肽選自A4去飽和酶，A5去飽和酶，A6去々包和酶,△8去々包和酶，A9去飽和酶，A12去飽和酶，A15去飽和酶，A17去飽和酶，d4A6延伸酶，016/18延伸酶，d8/20延伸酶和C2。/22延伸酶；(b)從步驟(a)的轉(zhuǎn)化細(xì)胞再生大豆植物；和(c)從步驟(b)的植物選擇獲得的種子，所述種子與從未轉(zhuǎn)化的大豆植物獲得的種子中PUFAs的水平相比，具有改變的PUFAs水平。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，至少一種另外的重組DNA構(gòu)建體編碼>具有A8去飽和酶活性的多肽，例如分離和/或來源于纖細(xì)眼蟲，并且如SEQIDNOs:61和69所示的△8去飽和酶。微生物表達(dá)表達(dá)系統(tǒng)、盒和載體，以及轉(zhuǎn)化也可以在異源微生物宿主細(xì)胞，特別是含油酵母(如解脂耶氏酵母)的細(xì)胞中生產(chǎn)本文描述的A9延伸酶基因和基因產(chǎn)物(即EgD9e，EgD9eS,E389D9e，E389D9eS,或其它突變酶，密碼子優(yōu)化的酶或其同源物)。重組微生物宿主中的表達(dá)可以用于生產(chǎn)多種PUFA途徑中間體，或用于調(diào)節(jié)已經(jīng)存在于宿主中的PUFA途徑，用于合成目前采用所述宿主尚不能合成的新產(chǎn)物。含有指導(dǎo)外源蛋白的高水平表達(dá)的調(diào)節(jié)序列的微生物表達(dá)系統(tǒng)和表達(dá)載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。上述任何載體都可以用于構(gòu)建用于生產(chǎn)本發(fā)明序列的任何基因產(chǎn)物的嵌合基因。然后可以通過轉(zhuǎn)化將這些嵌合基因?qū)牒线m的微生物中，以提供編碼的酶的高水平表達(dá)。用于轉(zhuǎn)化合適的微生物宿主細(xì)胞的載體或DNA盒是本領(lǐng)域公知的。構(gòu)建體中存在的序列的特定選擇依賴于需要的表達(dá)產(chǎn)物(同上文)、宿主細(xì)胞的性質(zhì)和提出的分離轉(zhuǎn)化的細(xì)胞與未轉(zhuǎn)化細(xì)胞的方法。但是，典型地，載體或盒含有指導(dǎo)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄和翻譯的序列、選擇標(biāo)記和使得能夠進(jìn)行自主復(fù)制和染色體整合的序列。合適的載體包含控制轉(zhuǎn)錄起始的基因的5，的區(qū)域(如啟動子)和控制轉(zhuǎn)錄終止的DNA片段3，的區(qū)域(即終止子)。當(dāng)兩個控制區(qū)都來自轉(zhuǎn)化的微生物宿主細(xì)胞的基因時是最優(yōu)選的，但是，應(yīng)該理解，所述控制區(qū)不一定必須來自選作生產(chǎn)宿主的特定物種的天然基因?？捎糜谠谛枰奈⑸锼拗骷?xì)胞中驅(qū)動本發(fā)明的A9延伸酶ORF的表達(dá)的起始控制區(qū)或啟動子是多種多樣的，并且為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。實(shí)際上，能夠指導(dǎo)這些基因在選定的宿主細(xì)胞中表達(dá)的任何啟動子都適合本發(fā)明。在微生物宿主細(xì)胞中的表達(dá)能夠以瞬時或穩(wěn)定的方式進(jìn)行。瞬時表達(dá)可以通過誘導(dǎo)可操作地連接在目標(biāo)基因上的可調(diào)控啟動子的活性而實(shí)現(xiàn)。穩(wěn)定表達(dá)可以通過使用可操作地與目標(biāo)基因連接的組成型啟動子而實(shí)現(xiàn)。例如，當(dāng)宿主細(xì)胞是酵母時，提供能夠在酵母細(xì)胞中起作用的轉(zhuǎn)錄和翻譯區(qū)，特別是來自宿主物種的那些(例如，關(guān)于解脂耶氏酵母中的優(yōu)選轉(zhuǎn)錄起始調(diào)節(jié)區(qū)，參見PCT公開No.WO2004/101757[美國乂>開2005-0136519-Al]和PCT7>開No.WO2006/052870[美國公開2006國0115881隱A1])?？梢允褂枚喾N調(diào)節(jié)序列中的任意一種，這取決于是需要組成型轉(zhuǎn)錄還是誘導(dǎo)型轉(zhuǎn)錄，啟動子在表達(dá)目標(biāo)ORF方面的效率，以及構(gòu)建的方便性等。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)翻譯起始密碼子'ATG，附近的核苷酸序列影響酵母細(xì)胞中的表達(dá)。如果需要的多肽在酵母中的表達(dá)不良，可以修飾外源基因的核苷酸序列，以導(dǎo)入有效的酵母翻譯起始序列，獲得最優(yōu)的基因表達(dá)。為了在酵母中表達(dá)，可以通過對效率不佳地表達(dá)的基因的定點(diǎn)誘變而實(shí)現(xiàn)，所述誘變是通過將其與內(nèi)源酵母基因，優(yōu)選高表達(dá)的基因符合讀框地融合而實(shí)現(xiàn)的。或者，如此處對于解脂耶氏酵母所證明的，可以確定宿主中的共有翻譯起始序列，并且將該序列工程化為異源序列，以便它們在感興趣的宿主中最優(yōu)表達(dá)。終止區(qū)可源于基因的3，區(qū)(起始區(qū)是從該基因獲得的)或者源于不同的基因。大量終止區(qū)是已知的，并且能在多種宿主(當(dāng)在與產(chǎn)生它們的相同和不同的屬和種中使用時)中發(fā)揮令人滿意的作用。終止區(qū)通常在更大程度上是根據(jù)方便性選擇的，而不是因?yàn)槿魏翁厥馓匦?。?yōu)選的是，當(dāng)微生物宿主是酵母細(xì)胞時，終止區(qū)源于酵母基因(特別是糖酵母屬、裂殖酵母屬、假絲酵母屬、耶氏酵母屬或克魯維酵母屬)。同樣已知編碼Y-干擾素和a-2干擾素的哺乳動物基因的3，-區(qū)在酵母中起作用。終止控制區(qū)還可以來自優(yōu)選宿主天然具有的各種基因。終止位點(diǎn)可以任選是必需的；不過，如果具有，則是最優(yōu)選的。盡管不意欲限制，本發(fā)明公開中使用的終止區(qū)包括解脂耶氏酵母胞外蛋白酶的3，區(qū)的約lOObp(XPR;GenBank登錄號Ml7741);?；?coA氧化酶(Aco3:GenBank登錄號AJ001301和No.CAA04661;Pox3:GenBank登錄號XP—503244)終止子；Pex20(GenBank登錄號AF054613)終止子；Pexl6(GenBank登錄號U75433)終止子；丄*/(GenBank登錄號Z50020)終止子；Zj>2(GenBank登錄號AJ012632)終止子；和3-氧?；?coA硫解酶(OCT;GenBank登錄號X69988)終止子。正如技術(shù)人員所了解的，僅僅將基因插入克隆載體，不能確保它能夠在需要的水平上成功地表達(dá)。根據(jù)對高表達(dá)速度的需要，業(yè)已通過操縱多種不同的遺傳元件產(chǎn)生了多種特化的表達(dá)載體，這些遺傳元件能控制來自微生物宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄、翻譯、蛋白穩(wěn)定性、含氧極限、以及分泌。更具體地講，業(yè)已對某些分子特征進(jìn)行了操縱，以控制基因表達(dá)，包括1.)相關(guān)轉(zhuǎn)錄啟動子和終止子序列的性質(zhì)；2.)克隆基因的拷貝數(shù)量，以及所述基因是質(zhì)粒攜帶的或者是整合到宿主細(xì)胞的基因組上的；3.)合成的外源蛋白的最終細(xì)胞定位；4.)宿主生物的翻譯效率和蛋白的正確折疊；5.)克隆的基因的mRNA和蛋白在宿主細(xì)胞中的內(nèi)在穩(wěn)定性；和6.)克隆的基因內(nèi)的密碼子選擇，使得它的頻率達(dá)到宿主細(xì)胞優(yōu)選的密碼子選擇的頻率。上述每一種類型的修飾包括在本發(fā)明中，作為進(jìn)一步優(yōu)化本文描述的A9延伸酶的表達(dá)的手段。一旦獲得了適合在合適的微生物宿主細(xì)胞(如含油酵母)中表達(dá)的編碼多肽的DNA(如包含啟動子、ORF和終止子的嵌合基因)，將它放入能夠在宿主細(xì)胞中自主復(fù)制的質(zhì)粒載體上，或者將它直接整合到宿主細(xì)胞的基因組中。表達(dá)盒的整合可以在宿主基因組中隨機(jī)地進(jìn)行，或者可以通過使用含有與宿主基因組具有足夠同源性以靶定宿主基因座內(nèi)的重組的區(qū)域的構(gòu)建體靶定。盡管本發(fā)明不完全基于此，當(dāng)所述構(gòu)建體被靶定于內(nèi)源基因座時，轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)節(jié)區(qū)的全部或某些可以通過內(nèi)源基因座提供。在本發(fā)明中，在解脂耶氏酵母中表達(dá)基因的優(yōu)選方法是通過將線性DNA整合到宿主的基因組中；并且，當(dāng)需要基因的高水平表達(dá)時，整合到基因組中的多個位置是特別有用的。為此，需要鑒定基因組中以多個拷貝存在的序列。Schmid國Berger等(J.Bact.176(9):2477-2482(1994))發(fā)現(xiàn)了解脂耶氏酵母中的第一個反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子樣元件Ylt1。該反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的特征在于存在長的末端重復(fù)序列(LTRs;每一個的長度是大約700bp),其稱作[tau]區(qū)。Yltl和單獨(dú)的[tau]元件分別以至少35個拷貝/基因組和50-60個拷貝/基因組，以分散的方式存在于基因組中；確定這兩個元件都作為同源重組位點(diǎn)起作用。此外，Juretzek等(Yeast18:97-113(2001))的研究證明了通過將質(zhì)粒靶定到酵母基因組的重復(fù)區(qū)中(用兩端都具有LTR[tau]區(qū)的線性DNA),與用低拷貝質(zhì)粒轉(zhuǎn)化體獲得的表達(dá)相比，可以顯著增加基因表達(dá)。因此，定位于[tau]的整合作為確保將多個質(zhì)粒DNA整合到解脂耶氏酵母中的手段是理想的，從而允許高水平基因表達(dá)。然而，不幸的是，并不是解脂耶氏酵母的所有菌抹都具有[tau]區(qū)(如鑒定為ATCC保藏號20362的菌抹)。當(dāng)菌林缺乏所述區(qū)域時，也可以將包含表達(dá)盒的質(zhì)粒DNA整合到替代的基因座中，以達(dá)到表達(dá)盒的需要的拷貝數(shù)。例如，優(yōu)選的替代基因座包括Ura3基因座(GenBank登錄號AJ306421)、Leu2基因座(GenBank登錄號AF260230)、Lys5基因(GenBank登錄號M34929)、Aco2基因座(GenBank登錄號AJ001300)、Pox3基因座(Pox3:GenBank登錄號XP—503244;或Aco3:GenBank登錄號AJ001301)、[delta]12去飽和酶基因基因座(PCT公開No.WO2004/104167)、Lip1基因座(GenBank登錄號Z50020)和/或Lip2基因座(GenBank登錄號AJ012632)。有利的是，Ura3基因可以與5-氟乳清酸(即5-氟尿嘧啶-6-甲酸單水合物；"FOA"，)選擇組合，重復(fù)使用(參見下文)，從而容易地使基因修飾以容易的方式整合到耶氏酵母基因組中。當(dāng)從分開的復(fù)制載體表達(dá)兩種或更多種基因時，理想的是每種載體具有不同的選擇方法，并且應(yīng)該缺乏與其它構(gòu)建體的同源性，以維持穩(wěn)定的表達(dá)并且防止構(gòu)建體之間元件的重新分配。調(diào)節(jié)區(qū)的明智選擇、選擇方法和導(dǎo)入的構(gòu)建體的增殖方法可以實(shí)-驗(yàn)確定，由此以必須的水平表達(dá)所有導(dǎo)入的基因，并且提供需要的產(chǎn)物的合成。可以通過任何標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將包含感興趣的基因的構(gòu)建體導(dǎo)入微生物宿主細(xì)胞。這些技術(shù)包括轉(zhuǎn)化(如醋酸鋰轉(zhuǎn)化[MethodsinEnzymology,194:186-187(1991)])、原生質(zhì)體融合、生物射彈沖擊(bolisticimpact)、電穿孔、微注射或任何其它將感興趣的基因?qū)胨拗骷?xì)胞的方法。適用于含油酵母(即解脂耶氏酵母)的更特別的教導(dǎo)包括美國專利No.4,880,741和No.5,071,764以及Chen,D.C.etal.(ApplMicrobiolBiotechnol.48(2):232-235(1997))。為了方便起見，業(yè)已通過任何方法操作以攝入DNA序列(例如，表達(dá)盒)的宿主細(xì)胞在本文中被稱作"轉(zhuǎn)化的"或"重組的"。轉(zhuǎn)化的宿主具有至少一個拷貝的表達(dá)構(gòu)建體，并且可以具有兩個或兩個以上拷貝，這取決于所述基因是整合在所述基因組上、擴(kuò)增的、或者存在于具有多個拷貝的染色體外元件上。可以通過多種選擇技術(shù)鑒定轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，如PCT公開No.WO2004/101757[美國公開2005-0136519國Al]和PCT公開No.WO2006/052870[美國/>開2006-0115881-Al]中的描述。此處4吏用的優(yōu)選選擇方法是對卡那霉素、潮霉素和氨基糖苷G418的抗性以及在缺少尿嘧啶、亮氨酸、賴氨酸、色氨酸或組氨酸的培養(yǎng)基上生長的能力。在替代的實(shí)施方案中，為了選擇酵母Ura-轉(zhuǎn)化體，使用5-FOA。該化合物對具有起作用的編碼乳清苷5，-一磷酸脫羧酶(OMP脫羧酶)的URA3基因的酵母細(xì)胞具有毒性；因此，基于該毒性，5-FOA對于Ura-突變酵母抹的選擇和鑒定特別有用(Bartel,RL.andFields,S.,Yeast2-HybridSystem,OxfordUniversity:NewYork,v.7，pp109-147,1997)。更具體地，可以首先敲除天然Ura3基因，生產(chǎn)具有Ura-表型的菌抹，其中基于5-FOA抗性發(fā)生選擇。然后，可以將一簇多個嵌合基因和新的Um3基于整合到耶氏酵母的不同基因座，從而產(chǎn)生具有Ura+表型的新菌林。當(dāng)敲除導(dǎo)入的Ura3基因時，隨后的整合產(chǎn)生新的Ura3-菌抹(再次用5-FOA選擇鑒定)。因此，Um3基因(與5-FOA選擇組合)可以用作多輪轉(zhuǎn)化中的選擇標(biāo)記。(任選其它在宿主細(xì)胞中共表達(dá)的PUFA酶)的底物，或它們可以外源提供。用于表達(dá)本發(fā)明的基因和核酸片段的微生物宿主細(xì)胞包括以下宿主，其在大范圍的溫度和pH值下，在多種飼料上生長，所述飼料包括簡單的或復(fù)雜的碳水化合物，有機(jī)酸、油和醇，和/或烴。盡管在本發(fā)明中所披露的基因已經(jīng)為在含油酵母(特別是解脂耶氏酵母)中的表達(dá)進(jìn)行了分離，但是，考慮到到由于轉(zhuǎn)錄、翻譯和蛋白生物合成工具是高度保守的，任何細(xì)菌、酵母、藻類和/或真菌都是適合表達(dá)本發(fā)明的核酸片段的宿主。優(yōu)選的微生物宿主是含油酵母。這些生物可天然地進(jìn)行油類合成和積累，其中油可以占大于約25%細(xì)胞干重，更優(yōu)選地大于約30%細(xì)胞干重，且最優(yōu)選地大于約40%細(xì)胞干重。常鑒定為含油酵母的屬包括但不限于但不局限于耶氏酵母屬、假絲酵母屬、紅酵母屬、紅冬孢屬、隱球酵母屬、絲孢酵母屬和油脂酵母屬。更具體地講，典型的油合成酵母包括類酵母紅冬孢、斯達(dá)氏油脂酵母、產(chǎn)油油脂酵母、拉可夫氏假絲酵母、鐵紅假絲酵母、熱帶假絲酵母、產(chǎn)朊假絲酵母、茁芽絲孢酵母、皮狀絲孢酵母、膠粘紅酵母、禾木科紅酵母和解脂耶氏酵母(以前被劃分為解脂假絲酵母)。最優(yōu)選的是含油酵母解脂耶氏酵母；而在其它實(shí)施方案中，最優(yōu)選的是解脂耶氏酵母菌株，被命名為ATCC#20362，ATCC#8862,ATCC#18944,ATCC#76982,ATCC#90812和/或LGAMS(7)1(PapanikolaouS.,和AggelisG.，5&^yow:7fec/wo/.82(1):43-9(2002》。以前已經(jīng)將解脂耶氏酵母的多種菌抹用于制備和生產(chǎn)異檸檬酸裂解酶；脂肪酶；多羥基鏈烷酸；檸檬酸；赤蘚糖醇；2-氧戊二酸；y-癸內(nèi)酯；y-十二內(nèi)醋；和丙酮酸。用于在解脂耶氏酵母中對ARA,EPA和DHA的生產(chǎn)進(jìn)行工程化的特定教導(dǎo)分別提供于美國專利申請No.11/264784(PCT公開No.WO2006/055322),No.11/265761(PCT公開No.WO2006/052870)和No.11/264737(PCT公開No.WO2006/052871)。其它優(yōu)選的微生物宿主包括含油細(xì)菌、藻類和其它真菌；并且，在該廣泛的一組微生物宿主中，特別感興趣的是合成co-3/W-6脂肪酸的微生物(或可以為此目的而基因工程化的那些[例如，其它酵母，如啤酒糖酵母])。因此，例如，用誘導(dǎo)型或受調(diào)節(jié)的啟動子控制下的任何本發(fā)明的A9延伸酶轉(zhuǎn)化高山^^孢霉(其在商業(yè)上用于生產(chǎn)ARA),可以產(chǎn)生能夠合成增加量的EDA的轉(zhuǎn)化生物；如果共表達(dá)A8去飽和酶基因，EDA可以轉(zhuǎn)化，增加DGLA的量。轉(zhuǎn)化高山被孢霉的方法由Mackenzie等(J///.五m^n".A^'croZzo/.,66:4655(2000》4苗述。類4以地，轉(zhuǎn)化破嚢壺菌微生物的方法公開于美國專利No.7,001,772?；谏衔拿枋龅慕虒?dǎo)，本發(fā)明的一個實(shí)施方案涉及分別生產(chǎn)EDA或ETrA的方法，包括a)提供包含以下成分的含油酵母(i)第一重組DNA構(gòu)建體，所述構(gòu)建體包含編碼△9延伸酶多肽的分離的多核苷酸，所述多核苷酸與至少一個調(diào)節(jié)序列可操作性連接；和(ii)分別由LA或ALA組成的延伸酶底物來源；以及b)在合適的可發(fā)酵碳源存在下生長步驟(a)的酵母，其中表達(dá)編碼△9延伸酶多肽的基因，并且分別由LA轉(zhuǎn)化為EDA或由ALA轉(zhuǎn)化為ETrA;以及c)任選分別回收步驟(b)的EDA或ETrA?？赡苄枰孜镅a(bǔ)料。在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，編碼A9延伸酶的基因的核苷酸序列選自SEQIDNO:1和SEQIDNO:4。在替代的優(yōu)選實(shí)施方案中，編碼A9延伸酶多肽的基因的核苷酸序列示于SEQIDNO:3(其中至少106個密碼子為在耶氏酵母中表達(dá)而相對于SEQIDNO:l進(jìn)行了優(yōu)化)。并且，在其它優(yōu)選實(shí)施方案中，編碼A9延伸酶多肽的基因的核苷酸序列如SEQIDNO:6所示(其中至少113個密碼子為在耶氏酵母中表達(dá)而相對于SEQIDNO:4進(jìn)行了優(yōu)化)。當(dāng)然，由于含油酵母中天然生產(chǎn)的PUFAs限于18:2脂肪酸(即LA)，并且較不常見地是18:3脂肪酸(即ALA),在本發(fā)明的更優(yōu)選實(shí)施方案中，含油酵母將基因工程化，用于表達(dá)長鏈PUFA生物合成所必須的多種酶(從而使得能夠生產(chǎn)例如ARA,EPA,DPA和DHA)以及本文描述的A9延伸酶。具體地，在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及含油酵母，其中包含a)第一重組DNA構(gòu)建體，包含編碼A9延伸酶多肽的分離的多核苷酸，所述多核苦酸與至少一個調(diào)節(jié)序列可操作性連接；和b)至少一個另外的重組DNA構(gòu)建體，包含編碼多肽的分離的多核苷酸，所述多核苷酸與至少一個調(diào)節(jié)序列可操作性連接，所述多肽選自A4去々包和酶，A5去々包和酶，A6去飽和酶，A8去々包和酶，A9去飽和酶，A12去飽和酶，A15去飽和酶，A17去飽和酶，(314/16延伸酶，。16/18延伸酶,C，o延伸酶和C，2延伸酶。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，至少一種另外的重組DNA構(gòu)建體編碼具有A8去飽和酶活性的多肽，例如分離和/或來源于纖細(xì)眼蟲，并且如SEQIDNOs:61和69所示的△8去々包和酶。微生物中(o-3和/或co-6脂肪酸生物合成的代謝工程化預(yù)期許多操作將能夠使含油酵母，特別是lj脂耶氏酵母中的coJ和/或w-6脂肪酸生物合成最大化。這可能需要直接于PUFA生物合成途徑中的代謝工程化，或各種其它代謝途徑的協(xié)調(diào)操作。在PUFA生物合成途徑內(nèi)進(jìn)行操作的情況下，可能需要增加LA的生產(chǎn)，使得能夠增加co-6和/或oo-3脂肪酸的生產(chǎn)。導(dǎo)入和/或擴(kuò)增編碼△9去飽和酶和/或A12去飽和酶的基因可能實(shí)現(xiàn)此目的。為了使w-6不飽和脂肪酸的生產(chǎn)最大，本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的是，所述生產(chǎn)在基本不含ALA的宿主微生物中是有利的；因此，優(yōu)選地，通過除去或抑制使LA轉(zhuǎn)化為ALA的△15或co-3型去飽和酶活性，選擇或獲得宿主?？梢酝ㄟ^例如以下方法減少或消除內(nèi)源去飽和酶活性(1)提供用于將反義序列轉(zhuǎn)錄為A15去飽和酶轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的盒；(2)通過插入、取代和/或缺失靶基因的全部或部分而破壞A15去飽和酶基因；或(3)使用天然具有^f艮少或不具有[或經(jīng)過突變而具有^f艮少或不具有]A15去飽和酶活性的宿主細(xì)^^包。也可以通過利用特定去^:包和酶抑制劑(如U.S.4,778,630中描述的那些)實(shí)現(xiàn)不需要的去飽和酶途徑的抑制?；蛘?，可能需要使co-3脂肪酸的生產(chǎn)最大化(并且使oo-6脂肪酸的合成最小化)。在該實(shí)例中，可以利用宿主微生物，其中除去或抑制使油酸能夠轉(zhuǎn)化為LA的A12去飽和酶活性；隨后，將合適的表達(dá)盒與合適的底物(如ALA)—起導(dǎo)入宿主，用于轉(zhuǎn)化為ALA的co-3脂肪酸務(wù)T生物(如STA,ETrA,ETA,EPA,DPA,DHA)。在替代的實(shí)施方案中，可以通過基因破壞或其它方式(如反義mRNA)下調(diào)，消除與w-3和/或co-6脂肪酸生物合成途徑竟?fàn)幠芰炕蛱嫉纳緩交蚋蓴_特定PUFA終產(chǎn)物生產(chǎn)的天然PUFA生物合成途徑酶。關(guān)于PUFA生物合成途徑內(nèi)的操作，以及增加ARA,EPA或DHA的方法(及其相關(guān)技術(shù))的詳細(xì)討論分別公開于PCT公開No.WO2006/055322[美國專利公開No.2006-0094092畫A1]，PCT公開No.WO2006/052870[美國專利公開No.2006-0115881-Al]和PCT公開No.WO2006/052871[美國專利公開No.2006-0110806-A1],所述文獻(xiàn)也公開了TAG生物合成途徑和TAG降解途徑的所需操作(及其相關(guān)技術(shù))。在本發(fā)明的上下文中，可能有用的是通過上文描述的任一策略調(diào)節(jié)脂肪酸生物合成途徑的表達(dá)。例如，本發(fā)明提供了方法，從而將編碼A9延伸酶/A8去飽和酶生物合成途徑中的關(guān)鍵酶的基因?qū)牒徒湍福糜谏a(chǎn)co-3和/或co-6脂肪酸。特別有用的將是在天然不具有co-3和/或oo-6脂肪酸生物合成途徑的含油酵母中表達(dá)本發(fā)明的A9延伸酶基因，并且協(xié)調(diào)這些基因的表達(dá)，從而用各種用于對宿主生物進(jìn)行代謝工程化的方法使優(yōu)選PUFA產(chǎn)物的生產(chǎn)最大化。用于PUFA生產(chǎn)的微生物發(fā)酵方法轉(zhuǎn)化的微生物宿主細(xì)胞是在優(yōu)化嵌合去飽和酶和延伸酶基因的表達(dá)，并且產(chǎn)生最大和最經(jīng)濟(jì)的所需PUFAs產(chǎn)率的條件下生長的。一般，可以優(yōu)化的培養(yǎng)基條件包括碳源的類型和用量、氮源的類型和用量、碳氮比、氧水平、生長溫度、pH、生物量生產(chǎn)期的長度、油積累期的長度，以及細(xì)胞收獲時間和方法。感興趣的樣i生物，如含油酵母(如解脂耶氏酵母)在復(fù)雜培養(yǎng)基(例如，酵母提取物-蛋白胨-右旋糖培養(yǎng)液(YPD))或缺少生長所必需的成分，以便強(qiáng)制選擇需要的表達(dá)盒的限定基本培養(yǎng)基(例如，酵母氮基(DIFCOLaboratories,Detroit,MI))中生長。本發(fā)明的發(fā)酵培養(yǎng)基必須包括合適的碳源。合適的碳源可以包括，但不局限于單糖(例如，葡萄糖、果糖)、二糖(例如，乳糖、蔗糖)、寡糖、多糖(例如，淀粉、纖維素或它們的混合物)、糖醇(例如，甘油)或可更新飼料(例如，干酪乳清滲透物、玉米漿、甜菜糖漿、大麥芽)的混合物。另外，碳源可以包括鏈烷、脂肪酸、脂肪酸酯、甘油一酯、甘油二酯、甘油三酯、磷脂，和脂肪酸的各種商業(yè)來源，包括植物油(例如，大豆油)和動物脂肪。另外，碳源可以包括一碳源(例如，二氧化碳、甲醇、甲醛、甲酸和含碳的胺)，業(yè)已證實(shí)了其轉(zhuǎn)化成關(guān)鍵生物化學(xué)中間體的代謝轉(zhuǎn)化。因此，預(yù)計，用于本發(fā)明的碳源可以包括多種含碳的來源，并且僅僅受宿主生物的選擇的限制。優(yōu)選的碳源是糖、甘油和/或脂肪酸。最優(yōu)選的是葡萄糖和/或含有10-22個碳的脂肪酸。氮可以由無機(jī)(例如，(NH4)2S04)或有機(jī)來源(例如，尿素或谷氨酸)提供。除了合適的碳和氮源之外，發(fā)酵培養(yǎng)基必須還包括合適的礦物質(zhì)、鹽、輔因子、緩沖液、維生素，和本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的適合含油生物生長，并且促進(jìn)PUFA生產(chǎn)所需要的酶途徑的其他成分。特別關(guān)注若干金屬離子(例如，Mn+2、Co+2、Zn+2、Mg+2),它們能促進(jìn)脂質(zhì)和PUFAs的合成(Nakahara,T.etal.，Ind.Appl.SingleCellOils,D.J.KyleandR.Colin,eds.pp61-97(1992))。本發(fā)明的優(yōu)選的生長培養(yǎng)基是常見的商業(yè)制備的培養(yǎng)基，如酵母氮基(DIFCOLaboratories,Detroit,MI)。其他確定的或合成的生長培養(yǎng)基也可以使用，并且適合特定轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞生長的培養(yǎng)基是微生物學(xué)或發(fā)酵科學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員所公知的。用于發(fā)酵的合適的pH范圍通常為大約pH4.0-pH8.0,其中pH5.5-pH7.5是起始生長條件的優(yōu)選范圍。發(fā)酵可以在需氧或厭氧條件下進(jìn)行，其中，微需氧條件是優(yōu)選的。通常，高水平PUFAs在含油酵母細(xì)胞中的積累，需要兩個階段的過程，因?yàn)樵谥镜纳L和合成/儲存之間的代謝狀態(tài)必須是"平衡的，，。因此，最優(yōu)選的是，需要兩個階段的發(fā)酵過程在含油酵母(如解脂耶氏酵母)中生產(chǎn)PUFAs。該方法描述于WO2004/101757,在生長過程中具有多個合適的發(fā)酵過程設(shè)計(即分批、補(bǔ)料分批和連續(xù))和考慮。PUFA油的純化和加工PUFA可以作為游離脂肪酸形式出現(xiàn)在宿主微生物和植物中，或者以諸如酰基甘油、磷脂、硫脂或糖脂的脂化形式出現(xiàn)在宿主微生物和植物中，并且可以通過本領(lǐng)域所熟知的多種方法從宿主細(xì)胞中提取。酵母脂質(zhì)的提取技術(shù)、品質(zhì)分析和可接受性標(biāo)準(zhǔn)的一篇綜述是Z.Jacobs(CriticalReviewsinBiotechnology12(5/6):463-491(1992))。有關(guān)下游加工的簡單綜述還可以參見A.Singh和O.Ward(Adv.Appl.Microbiol.45:271-312(1997))。一般地，純化PUFAs的方法可以包括用有機(jī)溶劑萃取、超聲波處理、超臨界流體萃取(例如，使用二氧化碳)、皂化和物理方法，如壓力，或它們的組合。其它細(xì)節(jié)可參考PCT公開No.WO2004/101757的教導(dǎo)。分離種子油的方法是本領(lǐng)域公知的(Young等，ProcessingofFatsandOils,InT7ze丄;i/7/(iJ7aw<iZooA:,Gunstone等,eds.,第5章,pp253-257;Ch叩man&Hall:London(1994))。例如，用一系列步驟，包括從含油種子提取和純化食用油產(chǎn)物，制備大豆油。用下表所示的概括的步驟生產(chǎn)大豆油和大豆副產(chǎn)物。大豆油和副產(chǎn)物生產(chǎn)的概括歩驟<table>tableseeoriginaldocumentpage61</column></row><table>更具體地，清洗大豆種子、調(diào)和、去殼并且切成薄片，從而增加油提取的效率。通常通過溶劑(如己烷)提取完成油提取，但也可以通過物理壓力和/或溶劑提取的組合實(shí)現(xiàn)。得到的油稱作粗制油?？梢酝ㄟ^水合磷脂和促進(jìn)它們從非水合、甘油三酯級分(大豆油)分離的極性和中性脂質(zhì)復(fù)合物，使粗制油脫膠。得到的卵磷脂膠可以進(jìn)一步加工，以制備在多種食品和工業(yè)產(chǎn)品中用作乳化劑和釋放(抗粘)劑的商業(yè)上重要的卵磷脂產(chǎn)品。脫膠的油可以進(jìn)一步精制，以除去雜質(zhì)(主要是游離脂肪酸、色素和殘余膠)。通過加入與游離酸反應(yīng)形成皂并且水合粗制油中的磷脂和蛋白的腐蝕劑，實(shí)現(xiàn)精制。精制過程中，用水洗去形成的痕量的皂。皂料副產(chǎn)物可以直接用于動物飼料中，或酸化以回收游離脂肪酸。通過用除去大多數(shù)葉綠素和類胡蘿卜素化合物的漂白土吸附，除去顏色。精制的油可以氫化，從而得到具有多種熔解特性和質(zhì)地的脂肪。冷濾(分級分離)可以用于通過在小心控制的冷卻條件下結(jié)晶，從氫化油除去硬脂。除臭(主要通過真空下的蒸汽蒸餾)是最后一個步驟，設(shè)計用于除去給油帶來臭味或味道的化合物。除臭過程中可以除去其它有價值的副產(chǎn)物，如生育酚和固醇。含有這些副產(chǎn)物的除臭的餾出物可以出售，用于生產(chǎn)天然維生素E和其它高價值的藥用產(chǎn)品。精制的、漂白的、(氫化的、分級分離的)和除臭的油和脂肪可以包裝并直接出售或進(jìn)一步加工為更特化的產(chǎn)物。大豆種子加工、大豆油生產(chǎn)和副產(chǎn)物利用的更詳細(xì)參考可以參見Erickson,PracticalHandbookofSoybeanProcessingandUtilization,TheAmericanOilChemists'SocietyandUnitedSoybeanBoard(1995)。大豆油在室溫下是液體的，因?yàn)榕c諸如椰子油、棕櫚油、棕櫚仁油和可可油相比，其飽和脂肪酸的含量相對較低?？梢詺浠呀?jīng)精制和/或純化的含PUFAs的植物和微生物油，從而得到具有多種熔解特性和質(zhì)地的脂肪。很多經(jīng)過加工的脂肪，(包括糊、甜食脂肪、硬質(zhì)脂肪、人造黃油、烘烤起酥等)，需要室溫下的各種程度的固化，并且僅僅可以通過改變原料油的物理特性而制備。這最常見是通過催化氫化實(shí)現(xiàn)的。氫化是一種化學(xué)反應(yīng)，其中在諸如鎳的催化劑輔助下將氬加入不4:包和脂肪酸雙4定。例如，高油酸大豆油含有不々包和油酸、LA和亞麻酸脂肪酸，其中每一種都?xì)浠杌哂袃蓚€主要作用。首先，由于不飽和脂肪酸含量的減少，油的氧化穩(wěn)定性增加。其次，油的物理性質(zhì)改變，這是因?yàn)橹舅嵝揎椩黾恿巳埸c(diǎn)，在室溫下得到半液體或固體脂肪。存在許多影響氫化反應(yīng)的變量，其隨后改變終產(chǎn)物的組成。包括壓力、溫度、催化劑類型和濃度、攪拌和反應(yīng)器設(shè)計的操作條件是可以控制的較重要的參數(shù)中的一些。選擇性氬化條件可以相對于較不飽和的脂肪酸而言優(yōu)先用于氫化更飽和的脂肪酸。通常用非常輕的或刷洗氬化來增加液體油的穩(wěn)定性。進(jìn)一步的氬化將液體油轉(zhuǎn)化為物理固體的脂肪。氫化的程度依賴于針對特定終產(chǎn)物設(shè)計的所需性能和熔解特征。液體起酥(用于制備烘烤產(chǎn)品、用于商業(yè)煎炸和烘烤操作的固體脂肪和起酥)，以及用于制造人造黃油的堿原料是通過氬化得到的多種可能的油和脂肪產(chǎn)品中的一些。氫化和氫化產(chǎn)物的更詳細(xì)描述可以參見Patterson,H.B.W,,HydrogenationofFatsandOils:TheoryandPractice.TheAmericanOilChemists'Society,(1994)。氫化的油在某種程度上有爭議，因?yàn)榇嬖谟蓺浠^程導(dǎo)致的反式脂肪酸異構(gòu)體。攝入大量反式異構(gòu)體與有害的健康作用相關(guān)，包括增加血漿中低密度脂蛋白與高密度脂蛋白的比例，和增加冠心病的風(fēng)險。用于食料中的含PUFA的油目前的市場支持大量摻入0>3和/或-6脂肪酸(特別是ARA、EPA和DHA)的食品和祠料產(chǎn)品?？紤]本發(fā)明的植物/種子油、改變的種子和微生物油將在食品和飼料產(chǎn)品中起作用，賦予本發(fā)明的制劑的健康益處。與其它植物油相比，從物理)見點(diǎn)，認(rèn)為本發(fā)明的油與食物應(yīng)用中的其它油功能上相似(例如，部分氬化的油，如大豆油，被廣泛用作軟糊、人造黃油和用于烘烤和煎炸的起酥的成分)。此處描述的含co-3和/或co-6脂肪酸的植物/種子油、改變的種子和微生物油將適用于多種食品和飼料產(chǎn)品中，包括但不限于食物類似物、肉類產(chǎn)品、谷物產(chǎn)品、快餐食品、烘烤食品和乳制品。此外，本發(fā)明的植物/種子油、改變的種子和微生物油可以用于制劑中，在包括醫(yī)學(xué)營養(yǎng)品、飲食補(bǔ)充物、嬰兒配方和藥品的醫(yī)學(xué)食品中賦予健康益處。食品加工和食品制劑領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解植物和微生物油的量和組成如何添加到食物或食品中。所述量在此稱作"有效"量，并且依賴于食品或飼料產(chǎn)品、該產(chǎn)品意欲補(bǔ)充的飲食或該醫(yī)學(xué)食品或醫(yī)學(xué)營養(yǎng)品意4炎矯正或治療的醫(yī)學(xué)狀況?？梢杂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法制備食物類似物?？梢蕴岬降氖侨忸愃莆?、干酪類似物、乳類似物等。從大豆制備的肉類似物含大豆蛋白或豆腐和其它混合在一起的成分，以模擬各種肉類。這些肉替代品以冷凍、罐裝或干燥食品出售。通常，它們可以以它們所替代的食品相同的方式使用。肉類似物的實(shí)例包括但不限于火腿類似物、香腸類似物、咸肉類似物等。根據(jù)功能和組成特征，可以將食物類似物分類為模擬物或替代物。例如，模擬干酪僅僅需要模擬其設(shè)計用于替代的干酪。然而，只有當(dāng)一種產(chǎn)品在營養(yǎng)上等同于它所要替代的干酪和滿足該干酪的最小組成需要，才能將其稱作替代干酪。因此，替代干酪通常比模擬干酪具有更高的蛋白水平，并且可以用維生素和礦物質(zhì)進(jìn)行強(qiáng)化。乳類似物或非乳制食品包括但不限于模擬乳和非乳制冷凍甜點(diǎn)(如從大豆和/或大豆蛋白產(chǎn)品制備的那些)。肉產(chǎn)品包括廣泛的產(chǎn)品。在美國，"肉，，包括從牛、狗和羊生產(chǎn)的"紅肉"。除了紅肉外，還有禽類，包括雞、火雞、鵝、珍珠雞、鴨，以及魚類和曱殼類動物。存在各種類型的調(diào)味和加工的肉類產(chǎn)品新鮮的、熟化和煎炸的、以及熟化和蒸煮的。香腸和熱狗是加工的肉產(chǎn)品的實(shí)例。因此，此處用到的"肉產(chǎn)品"包括但不限于加工的肉產(chǎn)品。谷物食品是來源于谷物加工的食品。谷物包括來自產(chǎn)生可食用谷物(籽粒)的草本科植物的任何植物。最常見的谷物是大麥、玉米、小米、燕麥、奎藜、稻、黑麥、高粱、黑小麥、小麥和野生稻。谷物食品的實(shí)例包括但不限于全谷、全谷粗粉、粗谷粉、面粉、麩、胚芽、早餐谷物、寄出食品、意大利面食等。烘烤食品包括上文描述的任何谷物食品，并且以能夠烘烤，即通過熱干燥或硬化的方式烘烤或加工過。烘烤食品的實(shí)例包括但不限于面包、蛋糕、炸面圈、面包條、意大利面食、面包屑、烘烤的快餐、小餅干、小薄脆餅干、小甜餅和小脆餅干。如上文提到的，本發(fā)明的油可以用作一種成分?？觳褪称钒ㄉ衔幕蛳挛拿枋龅娜魏问称?。煎炸食品包括經(jīng)過煎炸的上文或下文描述的任何食品。健康食品是任何賦予健康益處的食品。很多油籽來源的食品可以認(rèn)為是健康食品。飲料可以是液體或干粉形式。例如，可以提到的是非碳酸飲料；果汁、新鮮的、冷凍的、罐裝的或濃縮飲料；調(diào)味的或普通的乳飲料等。成人和嬰兒營養(yǎng)配方是本領(lǐng)域公知的并且可以商購(如來自RossProductsDivision,AbbottLaboratories的Similac、Ensure、Jevity⑧和Alimentum)。嬰兒配方是給嬰兒或幼兒喂食的液體或重配粉末。此處將"嬰兒配方，，定義為腸道營養(yǎng)品，其可以在哺乳期嬰兒中代替母乳，并且通常包含與在水溶液中與所需百分比的碳水化合物和蛋白混合的所需百分比的脂肪(例如參見U.S.4,670,285)?；谑澜绶秶慕M成研究以及專家組規(guī)定的水平，平均母乳典型地含約0.20%-0.40%的總脂肪酸(假定大約50%的熱卡來自脂肪)；并且，DHA與ARA的比例通常是大約1:1-1:2(參見例如EnfamilLIPILTM[MeadJohnson&Company〗和SimilacAdvanceTM[RossProductsDivision,AbbottLaboratories]的酉己方)。嬰兒配方在嬰兒飲食中起作特殊作用，因?yàn)樗鼈兺ǔＪ菋雰籂I養(yǎng)物質(zhì)的唯一來源；并且盡管母乳喂養(yǎng)是嬰兒的最佳營養(yǎng)，但嬰兒配方足夠接近，因此嬰兒不僅存活，還苗壯成長。乳制品是來源于乳的產(chǎn)品。乳類似物或非乳制品來源于除乳以外的來源，例如，上文討論的大豆乳。這些產(chǎn)品包括但不限于全乳、脫脂乳、發(fā)酵乳產(chǎn)品如酸奶酪或酸奶、乳酪、黃油、煉乳、脫水乳、調(diào)咖啡用白油、咖啡伴侶、冰激凌、干酪等?？梢該饺氡景l(fā)明的含PUFA的油的其它食品包括，例如口香糖、糖果和糖霜、明膠和布丁、硬糖和軟糖、果醬和果凍、白砂糖、糖替代品、甜調(diào)料、糕點(diǎn)裝飾物和糖漿，以及干粉混合物。用于i^康食品和藥品中的含PUFA的油健康食品是賦予健康益處的任何食品，包括功能性食品、醫(yī)學(xué)食品、醫(yī)學(xué)營養(yǎng)品和飲食補(bǔ)充物。此外，本發(fā)明的植物/種子油、改變的種子和樣丈生物油可以用于標(biāo)準(zhǔn)藥物組合物中。例如，本發(fā)明的油可以容易地?fù)饺肷鲜鋈魏问称分校瑥亩a(chǎn)例如功能性或醫(yī)學(xué)食品。包含PUFAs的更濃縮的制劑包括膠嚢、粉末、片劑、軟凝膠、凝膠帽、液體濃縮物和乳狀液，它們可以用作人或人以外的其它動物的營養(yǎng)補(bǔ)充物。用于動物飼料中的含PUFA的油動物祠料在此一般定義為意欲用作除人之外的動物的飼料或混合于飼料中的產(chǎn)品。并且，如上文提到的，本發(fā)明的植物/種子油、改變的種子和微生物油可以用作各種動物祠料中的成分。更具體地，盡管不進(jìn)行限制，預(yù)計本發(fā)明的油可以用于寵物食品中、反芻動物和禽類動物食品中以及水產(chǎn)養(yǎng)殖食品中。寵物食品是意欲喂飼寵物[如狗、貓、鳥類、爬行動物、嚙齒類動物]的產(chǎn)品；這些產(chǎn)品包括上文所述的谷物和健康食品，以及肉和肉副產(chǎn)品、大豆蛋白產(chǎn)品、草和干草產(chǎn)品(如紫花苜蓿、梯牧草、燕麥或雀麥草、蔬菜)。反芻動物和禽類動物食品是意欲喂飼給例如火雞、雞、牛和豬的食品。至于上文所述的寵物食品，這些食品包括谷物和上文列出的健康食品、大豆蛋白產(chǎn)品、肉和肉副產(chǎn)品、以及草和干草產(chǎn)品。水產(chǎn)養(yǎng)殖食品(或"水產(chǎn)養(yǎng)殖飼料")是意欲用于水產(chǎn)養(yǎng)殖的產(chǎn)品，所述水產(chǎn)養(yǎng)殖涉及淡水或海水中水生生物和/或動物的繁殖、培養(yǎng)和飼養(yǎng)。實(shí)施例在以下實(shí)施例中進(jìn)一步限定本發(fā)明，其中部分和百分比是基于重量，度是攝氏度，除非另外指出。應(yīng)當(dāng)理解的是，在這些實(shí)施方案中，盡管指明了是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，但是，是以說明形式提供的。通過上文的討論和這些實(shí)施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性特征，并且，在不超出本發(fā)明的構(gòu)思和范圍的前提下，可以對本發(fā)明進(jìn)行各種改變和改進(jìn)，以便適應(yīng)各種用途和條件。因此，除本文顯示和描述的以外，本領(lǐng)域技術(shù)人員從前述說明書可以明白各種修飾。所述修飾異源包含在所述權(quán)利要求的范圍內(nèi)。一般方法用于實(shí)施例中的標(biāo)準(zhǔn)重組DNA和分子克隆4支術(shù)為本領(lǐng)域所熟知的,并且一皮露于以下文獻(xiàn)中1.)Sambrook,J.,Fritsch,E.F.andManiatis，T.MolecularCloning:ALaboratoryManual;ColdSpringHarborLaboratory:ColdSpringHarbor,NY(1989)(Maniatis);2.)T.J.Silhavy,M.L.Bennan,andL.W.Enquist,ExperimentswithGeneFusions;ColdSpringHarborLaboratory:ColdSpringHarbor,NY(1984);和3.)Ausubel,F.Metal.，CurrentProtocolsinMolecularBiology,由GreenePublishingAssoc.andWiley-Interscience(1987)出版。適合微生物培養(yǎng)物維持和生長的材料和方法為本領(lǐng)域所公知。適合在以下實(shí)施例中使用的技術(shù)可以參見以下文獻(xiàn)ManualofMethodsforGeneralBacteriology(PhillippGerhardt,R.G.E.Murray,RalphN.Costilow,EugeneW.Nester,WillisA.Wood,NoelR.KriegandG.BriggsPhillips,Eds),AmericanSocietyforMicrobiology:Washington,D.C.(1994));或參見ThomasD.BrockinBiotechnology:ATextbookofIndustrialMicrobiology,2nded.,SinauerAssociates:Sunderland,MA(1989)。用于生長和維持微生物細(xì)胞的所有試劑，限制酶和材料都是從AldrichChemicals(Milwaukee,WI),DIFCOLaboratories(Detroit,MI),GIBCO/BRL(Gaithersburg,MD),或SigmaChemicalCompany(St.Louis，MO)獲得的，除非另有說明。大腸桿菌菌抹通常是在37。C下在LuriaBertani(LB)平板上生長的。按照標(biāo)準(zhǔn)方法(Sambrook等，同上)進(jìn)行一般分子克隆。用載體和插入片段特異性引物的組合，采用染料終止子技術(shù)(U.S.5,366,860;EP272,007)在ABI自動測序儀上產(chǎn)生DNA序列。在測序儀(GeneCodesCorporation,AnnArbor,MI)上進(jìn)行序列編輯。所有序列代表每個方向覆蓋至少兩次。用DNASTAR軟件(DNASTARInc.,Madison,WI)完成基因序列的比較?？s寫的含義如下"sec"表示秒，"min"表示分鐘，"h"表示小時，"d"表示天，>L，，表示微升，"mL"表示毫升，"L"表示升，"i^M"表示微摩爾濃度，"mM"表示毫摩爾濃度，"M"表示摩爾濃度，"mmol"毫摩爾，",ole，，表示微摩爾，"g"表示克，'Vg，，表示微克，"ng"表示納克，"U"表示單位，"bp"表示堿基對，而"kB"表示千堿基。解脂耶氏酵母的轉(zhuǎn)化和培養(yǎng)從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(Rockville,MD)購買解脂耶氏酵母菌抹ATCC#20362、#76982和#90812。解脂耶氏酵母菌抹在28°C下在YPD瓊脂(1%酵母提取物，2%細(xì)菌用蛋白胨，2%葡萄糖，2%瓊脂)上生長。才艮據(jù)Chen,D.C.等人(Appl.MicrobiolBiotechnol.48(2):232-235(1997))的方法進(jìn)行解脂耶氏酵母的轉(zhuǎn)化，除非另外指明。簡言之，將耶氏酵母劃線到Y(jié)PD平板上，在30。C下生長大約18小時。從平板上刮下幾個大滿環(huán)的細(xì)胞，重懸于1ml轉(zhuǎn)化緩沖液中，該緩沖液含有2.25mL50%PEG,平均分子量3350;0.125mL2M醋酸鋰，pH6.0;0.125mL2MDTT;和50|ug剪切的鮭魚精子DNA。然后，將大約500ng線性化的質(zhì)粒DNA在lOOiul重懸的細(xì)胞中溫育，以15分鐘間隔渦旋下在39。C維持1小時。將細(xì)胞鋪板到選擇培養(yǎng)基板上，在30。C下維持2畫3天。為了選擇轉(zhuǎn)化體，一般使用基本培養(yǎng)基("MM");MM的組成如下不含硫酸按或氨基酸的0.17%酵母氮基(DIFCOLaboratories,Detroit,MI)、2%葡萄糖、0.1%脯氨酸，pH6.1。合適的情況下加入尿嘧啶補(bǔ)充物，達(dá)到0.01%的終濃度(從而得到"MMU"選擇培養(yǎng)基，用20g/L瓊脂制備)?；蛘?，在5-氟乳清酸("FOA";也稱作5-氟尿嘧啶-6羧酸一水合物)選擇培養(yǎng)基上選擇轉(zhuǎn)化體，該培養(yǎng)基包含不含硫酸銨或氨基酸的0.17%酵母氮基(DIFCOLaboratories)、2%葡萄糖、0.1%脯氨酸、75mg/L尿嘧啶、75mg/L尿苷、900mg/LFOA(ZymoResearchCorp.，Orange,CA)和20g/L瓊脂。解脂耶氏酵母的脂肪酸分析為了進(jìn)行脂肪酸分析，通過離心收集細(xì)胞，并且按照披露于以下文獻(xiàn)中的方法提取脂質(zhì)Bligh,E.G.&Dyer,W.J.(Can.J.Biochem.Physiol.37:911-917(1959))。脂肪酸甲酯是通過脂質(zhì)提取物與甲醇鈉的酉旨交才奐反應(yīng)制備的(Roughan,G.,andNishidaI.ArchBiochemBiophys.276(1):38-46(1990)),并且隨后用裝有30-mX0.25mm(內(nèi)徑)HP-I麗OWAX(Hewlett-Packard)柱的Hewlett-Packard6890GC進(jìn)行分析。烘箱溫度以3.5。C/分鐘的速度從170°C(25分鐘保持時間)提高到185°C。為了進(jìn)行直接的堿酯交換，收獲耶氏酵母培養(yǎng)物(3mL)，在蒸餾水中洗滌一次，在Speed-Vac中真空干燥5-10分鐘。將曱醇鈉(1001%)加入樣品，然后渦S走并搖動樣品20分鐘。加入3滴lMNaCl和400]ul己烷后，渦旋和離心樣品。取出上層，按照上文的描述通過GC進(jìn)行分析。實(shí)施例1纖細(xì)眼蟲生長條件、脂質(zhì)譜和mRNA分離本實(shí)施例描述了纖細(xì)眼蟲的生長、培養(yǎng)液分析和mRNA分離。生長和脂質(zhì)分析纖細(xì)眼蟲獲自密西根州立大學(xué)(EastLansing,MI)的RichardTriemer博士的實(shí)驗(yàn)室。從10mL活躍生長的培養(yǎng)物中將1mL等分物轉(zhuǎn)移到500mL玻璃瓶中的250mL纖細(xì)眼蟲(Eg)培養(yǎng)基中。Eg培養(yǎng)基是通過在970mL水中混合以下成分而制備的lg醋酸鈉、lg牛肉提取物(目錄號U126-01，DifcoLaboratories,Detroit,MI)、2gBacto胰蛋白胨(目錄號0123-17-3,DifcoLaboratories)和2gBacto⑤酵母提取物(目錄號0127-17-9,DifcoLaboratories)。過濾滅菌后，無菌加入30mL土壤-水上清液(目錄號15-3790,CarolinaBiologicalSupplyCompany,Burlington,NC),得到最終的Eg培養(yǎng)基。使纖細(xì)眼蟲培養(yǎng)物在23。C,16小時光、8小時暗周期中無攪拌條件下生長2周。2周后，取出10mL培養(yǎng)物進(jìn)行脂質(zhì)分析，并且在1,800xg離心5分鐘。用水洗滌沉淀物一次，重新離心。真空中將得到的沉淀物干燥5分鐘，重懸于100^L三曱基氫氧化锍(TMSH)，振蕩下在室溫中溫育15分鐘。此后，加入0.5mL己烷，振蕩下將管形瓶室溫下溫育15分鐘。分離脂肪酸甲酯(從己烷層注射的5pL),用裝有Omegawax320熔融二氧化硅毛細(xì)管柱(目錄號24152,SupelcoInc.)的Hewlett-Packard6890氣相色鐠進(jìn)行定量。對烤箱溫度進(jìn)行程序化，在220。C保持2.7分鐘，以20°C/min增加到240°C,然后再保持2.3分鐘。通過Whatman氫發(fā)生器提供載體氣體。將保留時間與商購的標(biāo)準(zhǔn)物(目錄號U-99-A,Nu-ChekPrep,Inc.)的甲酯進(jìn)行比較，得到的色譜圖示于圖3。從纖細(xì)眼蟲制備mRNA通過1,800xg離心10分鐘，沉淀剩余的2周培養(yǎng)物(240mL),用水洗滌1次，再次離心。采用RNASTAT-60試劑(TEL-TEST,Inc.,Fdendswood,TX),根據(jù)提供的制造商的方案(采用5mL試劑，0.5mL水中的溶解的RNA)提取總RNA。以此方式，從沉淀物獲得了1mg總RNA(2mg/mL)。用mRNA純4乜試劑盒(AmershamBiosciences,Piscataway,NJ),按照提供的制造商的方案從lmg總RNA分離mRNA。以此方式，獲得了85^igmRNA。實(shí)施例2纖細(xì)眼蟲cDNA合成、文庫構(gòu)建和測序用CloneminercDNA文庫構(gòu)建試劑盒(目錄號18249-029，InvitrogenCorporation,Carlsbad,CA)并且按照所提供的制造商的方案(B版本，25-0608)制備cDNA文庫。采用非放射性標(biāo)記方法，用生物素-""B2-寡(dT)引物從3.2|ugmRNA(實(shí)施例l)合成cDNA。合成第一和第二鏈后，加入a"Bl銜接子，連接，并且用柱層析對cDNA進(jìn)行大小分級分離。濃縮來自級分7和8(大小是約800-1500bp)的DNA,重組到pDONRTM222中，并且轉(zhuǎn)化到大腸桿菌ElectroMAXDH10BTMTl噬菌體抗性細(xì)胞(InvitrogenCorporation)中。纖細(xì)眼蟲文庫命名為"eeglc，，。為了測序，首先從在384孔冷凍培養(yǎng)基平板中生長/冷凍的甘油培養(yǎng)物回收克隆，用無菌的384針復(fù)制器(Genetix，Boston,MA)在含有LB+75jug/mL卡那霉素的384孔微量滴定板(雙份板)中復(fù)制。然后按照制造商的方案，用TempliphiDNA測序擴(kuò)增試劑盒方法(AmershamBiosciences)分離質(zhì)粒。簡言之，Templiphi方法利用噬菌體(1)29DNA聚合酶，通過等溫滾環(huán)擴(kuò)增來擴(kuò)增環(huán)狀單鏈或雙鏈DNA(Dean等，Gew麵eto.，11:1095-1099(2001》Nelson等，腸fec/mz々腦，32:S44-S47(2002))。37。C下生長20小時后，將來自雙份^1的細(xì)l包加入5稀釋緩沖液中，95。C下變性3分鐘，以便部分裂解細(xì)胞和釋放變性的模板。然后，將Templiphi預(yù)混合物(5juL)加入每個樣品，將得到的反應(yīng)混合物在30°C下溫育16小時，然后65°C下溫育10分鐘，以滅活4)29DNA聚合酶活性。在蒸餾水中將擴(kuò)增的樣品1:3稀釋后，用PicoGreendsDNA定量試劑(MolecularProbes)進(jìn)行DNA定量。然后，95°C下4吏擴(kuò)增的產(chǎn)物變性10分鐘，用M13F通用引物(SEQIDNO:18)和ABIBigDye3.1版Prism測序試劑盒在384孔板中進(jìn)行終末測序。對于測序反應(yīng)，使用100-200ng模板和6.4pmol引物，將以下反應(yīng)條件重復(fù)25次96°C下10秒，50°C下5秒，和60°C下4分鐘。基于乙醇的清除后，分辨循環(huán)測序反應(yīng)產(chǎn)物，并且在Perkin-ElmerABI3730x1自動化測序4義上4全測。實(shí)施例3從纖細(xì)眼蟲cDNA文庫eeglc鑒定A9延伸酶進(jìn)行BLAST(基本局部比對檢索工具；Altschul，S.F.,等，J.Mol.Biol.215:403-410(1993)和NucleicAcidsRes.25..3389-3402(1997))檢索，得到與包含在BLAST"nr"數(shù)據(jù)庫中的序列(包括所有非冗余的GenBankCDS翻譯、來源于三維結(jié)構(gòu)Brookhaven蛋白數(shù)據(jù)庫的序列、SWISS-PROT蛋白序列數(shù)據(jù)庫、EMBL和DDBJ數(shù)據(jù)庫的最新的主要發(fā)布)的相似性，從而鑒定編碼長鏈多不飽和脂肪酸延伸酶同源物(即LC-PUFAELO同源物或△9延伸酶)的cDNA克隆。采用國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)提供的BLASTN算法，分析實(shí)施例2中獲得的cDNA序列與"nr，，數(shù)據(jù)庫中包含的所有公眾可獲得的DNA序列的相似性。在所有讀碼框中翻譯DNA序列，并且用NCBI提供的BLASTX算法(Gish和States,A^.,3:266-272(1993))比較與"nr，，數(shù)據(jù)庫中包含的所有公眾可獲得的蛋白序列的相似性。為了方便，本文中將通過BLAST計算的、僅僅偶然觀察到cDNA序列與檢索的數(shù)據(jù)庫中包含的序列的匹配的P-值(概率)報道為"pLog"值，其代表報道的P-值的負(fù)對數(shù)。因此，pLog值越大，cDNA序列和BLAST"命中"代表同源蛋白的可能性就越大。利用來自克隆eeg1c.pkOO1.n5.f的核苷酸序列進(jìn)行的BLASTX檢索發(fā)現(xiàn)由cDNA編碼的蛋白與IgD9e(即本文表示為SEQIDNO:8的、來自球等鞭金藻的長鏈PUFA延伸酶；NCBI登錄號AAL37626(GI17226123),基因座AAL37626，CDSAF390174;Qi等，M朋Z",.510(3):159-165(2002))的相似性。來自克隆eeglc.pk001.n5.f的cDNA插入片段的一部分的序列示于SEQIDNO:10(cDNA插入片段的5，末端)。按照上文的描述，從eeglc.pk001.n5.1的cDNA插入片段的3，末端獲得額外的序列，但使用聚腺苷酸尾-引發(fā)的WobbleT寡核普酸。簡言之，WobbleT引物是21聚體聚(T)A,聚(T)C和聚(T)G的等摩爾混合物，用于對cDNA克隆的3'末端進(jìn)行測序。3'末端序列示于SEQIDNO:11。用Sequencher(4.2片反,GeneCodesCorporation,AnnArbor,MI)對5，和3，序列進(jìn)行比對，得到的cDNA序列示于SEQIDNO:12。來自eeglc.pk001.n5.f中的cDNA的編碼序列的序列和相應(yīng)的推導(dǎo)氨基酸序列分別示于SEQIDNO:1和SEQIDNO:2。在上文^艮道的同源性的基礎(chǔ)上，推斷eeglc.pk001.n5.1的cDNA插入片l殳的纖細(xì)眼蟲基因產(chǎn)物編碼A9延伸酶，并因此命名為"EgD9e"。通過BLASTP評估SEQIDNO:2所示的氨基酸序列(即EgD9e),得到38.70(E值為2e-39)與IgD9e(SEQIDNO:8)的pLog值。用LASERGENE生物信息計算程序組(DNASTARInc.,Madison，WI)的MegAlignv6.1程序，采用逐對比對的默認(rèn)參數(shù)(KTUPLE二2)，通過JotunHein法(Hein,J.J.，A/e仇,183:626-645(1990))進(jìn)行序列同一性百分比計算。采用ClustalV方法，EgD9e(SEQIDNO:2)與IgD9e(SEQIDNO:8)的同一性是31.8%(圖4)。釆用LASERGENE生物信息計算程序組的MegAlignv6.1程序，采用逐對比對的默認(rèn)參數(shù)(KTUPLE=1,GAPPENALTY=3，WINDOW=5,DIAGONALSSAVED=5和GAPLENGTHPENALTY=10)，通過ClustalV法(Higgins,D.G.andSharp,P.M.,Com戶z^.5z^".，5:151-153(1989);Higgins等，Co附pW.4pp/.,8:189-191(1992》進(jìn)行序列同一性百分比計算。BLAST評分和概率表明，本發(fā)明的核酸片段(SEQIDNO:12)編碼完整的纖細(xì)眼蟲A9延伸酶。實(shí)施例4纖細(xì)眼蟲A9延伸酶(EgD9e)在嘩酒糖酵母中的功能分析本實(shí)施例描述了在啤酒糖酵母中進(jìn)行的EgD9e的功能分析。這需要(l)將EgD9e克隆到酵母表達(dá)載體pY-75中，產(chǎn)生pY119;(2)底物補(bǔ)料后，比較包含pY-75和pY119的轉(zhuǎn)化生物中的脂質(zhì)譜；和(3)不進(jìn)行底物補(bǔ)料后，比較包含pY-75和pY119的轉(zhuǎn)化生物中的脂質(zhì)譜。構(gòu)建包含EgD9e的質(zhì)粒pY-75(對照)和pY119酵母附加型質(zhì)粒(YEp)型載體pRS425(Christianson等，Gene,110:119-122(1992))含有來自啤酒糖酵母2iu內(nèi)源質(zhì)粒的序列、LEU2選擇標(biāo)記和基于多功能噬菌粒pBluescriptIISK(+)的主鏈的序列。按照與Jia等(PhysiologicalGenomics,3:83-92(2000))中描述的相同方法在pRS425的SacII和Spel位點(diǎn)之間克隆啤酒糖酵母的強(qiáng)組成型甘油醛-3-磷酸脫氬酶(GPD)啟動子，以制備pGPD-425。將Notl位點(diǎn)導(dǎo)入pGPD-425的BamHI位點(diǎn)，由此產(chǎn)生側(cè)翼于BamHI位點(diǎn)的Notl位點(diǎn)，該質(zhì)粒稱作pY-75。根據(jù)制造商的方案，采用VentR⑤DNA聚合酶(目錄號M0254S,NewEnglandBiolabsInc.,Beverly,MA),用寡核普酸引物oEugELl國l(SEQIDNO:19)和oEugELl畫2(SEQIDNO:20)從eeglc.pk001,n5.f擴(kuò)增EgD9e。按照制造商的方案，用ZeroBluntPCR克隆試劑盒(InvitrogenCorporation)將得到的DNA片段克隆到pCR-Blunt⑧克隆載體中，以制備pKR906。通過用M/I消化，從pKR906釋i欠EgD9e，并且克隆到pY-75的A^ort位點(diǎn)，以制備pY119(SEQIDNO:21;圖5)。EgD9e在圖5中標(biāo)記為"eugell"。通過底物補(bǔ)料對EgD9e延伸酶活性進(jìn)行的功能分析用標(biāo)準(zhǔn)醋酸鋰轉(zhuǎn)化程序?qū)①|(zhì)粒pY119和pY-75轉(zhuǎn)化到啤酒糖酵母INVSC1(InvitrogenCorporation)中。在補(bǔ)力口了CSM-leu(Qbiogene,Carlsbad,CA)的DOBA培養(yǎng)基上選擇轉(zhuǎn)化體。將來自每個平板的轉(zhuǎn)化體接種到2mL補(bǔ)加了CSM-leu(Qbiogene)和2%tergitol的DOB培養(yǎng)基上。細(xì)胞在30。C下生長1天，此后將O.lmL轉(zhuǎn)移到補(bǔ)加了LA[18:2(9,12)]，ALA[18:3(9，12,15)],GLA[18:3(6,9，12)]，STA[18:4(6,9,12,15)]，ARA[20:4(5，8,11,14)]或EPA[20:5(5,8,11,14,17)]的3mL相同培養(yǎng)基中。將它們在3(TC，250rpm溫育16小時，通過離心獲得沉淀物。用水洗滌細(xì)胞一次，通過離心沉淀，并且在空氣中干燥。50。C下用500nL1。/。曱醇鈉對沉淀物進(jìn)行酯交換(Roughan,G.,andNishidaI.,爿rc/z5zoc/zew歷o;/z".,276(1):38-46(1990))30分鐘，然后加入5001M氯4t鈉和100pL庚烷。徹底混合和離心后，按照實(shí)施例1的描述通過GC分析脂肪酸曱酉旨(FAMEs)。圖6中顯示了對含有pY75(載體對照)或pY119(3個獨(dú)立的轉(zhuǎn)化體，命名為pY119-5，pY119-6和pY119-8)的細(xì)胞進(jìn)行補(bǔ)料的結(jié)果。月旨肪酸鑒定為16:0(棕櫚酸)，16:1(9)(棕櫚油酸)，18:0,18:1(9)(油酸)，LA,GLA,ALA,STA,EDA,DGLA,ARA，ETrA,ETA,EPA，22:2(13,16)(二十二碳二烯酸)，22:4(7，10,13,16)(腎上腺酸)，DPA和24:1(神經(jīng)酸)。對每種脂肪酸("FA")補(bǔ)料計算延伸效率("％Elo")為[%FA產(chǎn)物/(%FA產(chǎn)物+%FA底物)*100]。圖6的數(shù)據(jù)證明，克隆的EgD9e有效地分別將LA和ALA延伸為EDA和ETrA。不進(jìn)行底物補(bǔ)料條件下EgD9e延伸酶活性的功能分析此外，用略微不同的溫度鐠通過GC分析來自沒有進(jìn)行脂肪酸補(bǔ)料的細(xì)胞的FAMEs，以便實(shí)現(xiàn)油酸[OA-18:l(9)]和11-十八碳烯酸[VA-18:1(11)]的分離，11-十八碳烯酸是棕櫚油酸[PA-16:l(9)]延伸的產(chǎn)物。用裝配Omegawax320熔凝二氧化珪毛細(xì)管柱(SupelcoInc.,目錄號24152)的Hewlett-Packard6890氣相色譜進(jìn)行脂肪酸甲酯(3juL,從己烷層注射)的分離和定量?？鞠錅囟韧ㄟ^程序控制在200。C下2.7分鐘，以20。C/分鐘增加到240°C,然后再保持額外的2.3分鐘。結(jié)果示于表6。表6<table>tableseeoriginaldocumentpage74</column></row><table>基于上述結(jié)果，除了作為能夠催化LA和ALA分別延伸為EDA和EtrA的A9延伸酶的主要作用，EgD9e既可以作為Ci6/18延伸酶，也可以作為Cis/20延伸酶。.實(shí)施例5構(gòu)建解脂耶氏酵母表達(dá)載體pY115,其包含為在解脂耶氏酵母中表達(dá)而進(jìn)行了密碼子優(yōu)化的合成的A9延伸酶基因(IgD9eS)(來源于球等鞭金藻)本實(shí)施例描述了解脂耶氏酵母表達(dá)載體pY115的構(gòu)建，該載體包含嵌合FBAINm::IgD9eS::Pex20基因，其中IgD9eS是來源于球等鞭金藻的合成的A9延伸酶并且為在解脂耶氏酵母中表達(dá)而進(jìn)行了密碼子優(yōu)化。如下文實(shí)施例6和7的描述，質(zhì)粒pY115間接地使IgD9eS的△9延伸酶活性能夠與EgD9e的A9延伸酶活性進(jìn)行比較。質(zhì)粒pY115(SEQIDNO:45;圖8)的構(gòu)建需要(1)構(gòu)建pDMW263;(2)合成IgD9eS并制備質(zhì)粒pDMW237;和(3)連接來自質(zhì)粒pDMW263和pDMW237的片段。pDMW263的構(gòu)建質(zhì)粒pY5-30(圖7A;以前描述于PCT公開No.WO05/003310[在此導(dǎo)入其內(nèi)容作為參考])是一種穿梭質(zhì)粒，其可以在大腸桿菌和解脂耶氏酵母中復(fù)制。質(zhì)粒pY-30含有以下成分耶氏酵母自主復(fù)制序列(ARS18);ColEl質(zhì)粒復(fù)制起點(diǎn)；氨千青霉素抗性基因(AmpR),用于在大腸桿菌中選擇；耶氏酵母LEU2基因，用于在耶氏酵母中選擇；和嵌合TEF::GUS::XPR基因。用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的技術(shù)用解脂耶氏酵母FBAINm啟動子(PCT公開No.WO05/049805)代替TEF啟動子，從而從pY5-30制備質(zhì)粒pDMW263(SEQIDNO:22;圖7B)。簡言之，該啟動子表示》務(wù)飾的啟動子，其位于果糖-二磷酸醛縮酶(E.C.4.1.2.13)的"ATG"翻譯起始密碼子前面的5，上游非翻譯區(qū)，加上一部分具有內(nèi)含子的5，編碼區(qū)，所述酶由yZ)a/基因編碼，并且是表達(dá)所必須的，其中FBAINm具有位于ATG翻譯起始密碼子和FBAIN啟動子的內(nèi)含子之間的52bp缺失(從而僅僅包含N-末端的22個氨基酸)和內(nèi)含子后的新的翻譯共有基序。表7概括了pDMW263的成分。<table>tableseeoriginaldocumentpage76</column></row><table>以類似于PCT公開No.WO2004/101753(US-2004-0253621-Al)和PCT公開No.WO2006/052870(US-2006-0115881-Al)描述的方式，對球等鞭金藻的A9延伸酶基因(IgD9e;SEQIDNOs:7和8)的密碼子選擇進(jìn)行優(yōu)化，用于在解脂耶氏酵母中表達(dá)，所述每篇文獻(xiàn)都在此全文導(dǎo)入作為參考。具體地，基于IgD9e(SEQIDNO:7)的編碼序列，根據(jù)耶氏酵母密碼子選擇模式和RNA穩(wěn)定性的一般規(guī)則(Guhaniyogi，G和J.Brewer,265(1-2):11-23(2001)),i殳計密碼子優(yōu)化的A9延伸酶基因(命名為"lgD9eS，，；SEQIDNO:9)。除了修飾翻譯起始位點(diǎn)，修飾了792bp編碼區(qū)的127bp(16.0%),優(yōu)化了122個密碼子。密碼子優(yōu)化基因中的修飾都沒有改變編碼的蛋白的氨基酸序列(SEQIDNO:8)。更具體地，設(shè)計了8對寡核苷酸來延伸全長IgD9eS(例如IL3-1A，IL3陽1B,IL3國2A,IL3誦2B,IL3-3A，IL3畫3B,IL3畫4A,IL3國4B,IL3國5A,IL3-5B,IL3-6A,IL3-6B，IL3-7A,IL3國7B,IL3-8A和IL3國8B，相應(yīng)于SEQIDNOs:23-38)。每對有義(A)和反義(B)寡核苦酸是互補(bǔ)的，每個5，-末端的4bp突出端除外。此夕卜，分別給引物IL3-1F,IL3-4R,IL3-5F和IL3-8R(SEQIDNOs:39-42)導(dǎo)入Vco/,尸W/，尸W/和限制位點(diǎn)，用于隨后的亞克隆。37。C下在含有50mMTris-HCl(pH7.5)、10mMMgCl2、10mMDTT、0.5mM亞精胺、0.5mMATP和10UT4多核苷酸激酶的20jul體積中對每種寡核苷酸(100ng)進(jìn)行磷酸化1小時?；旌厦繉τ辛x和反義寡核苷酸，采用以下參數(shù)在熱循環(huán)儀中退火95°C(2min)，85。C(2min),65°C(15min),37°C(15min),24°C(15min)和4。C(15min)。因此，將IL3-1A(SEQIDNO:23)與IL3國1B(SEQIDNO:24)退火,產(chǎn)生雙鏈產(chǎn)物"IL3-1AB"。類似地，將IL3誦2A(SEQIDNO:25)與IL3-2B(SEQIDNO:26)退火，產(chǎn)生雙鏈產(chǎn)物"IL3-2AB，，等。然后將退火的雙鏈寡核普酸的兩個獨(dú)立的集合連接到一起，如下所示集合1(包含IL3-1AB、IL3-2AB、IL3-3AB和IL3-4AB);和集合2(包含IL3-5AB、IL3-6AB、IL3-7AB和IL3-8AB)。在20|ul的體積中將每個退火的寡核普酸的集合與IOU的T4DNA連接酶混合，16。C下溫育連接反應(yīng)過夜。然后將每個連接反應(yīng)的產(chǎn)物用作模板，通過PCR擴(kuò)增設(shè)計的DNA片段。具體地，采用連接的"集合r混合物(即IL3-1AB、IL3-2AB、IL3-3AB和IL3-4AB)作為模板,寡核苦酸IL3隱1F和IL3-4R(SEQIDNOs:39和40)作為引物，通過PCR擴(kuò)增IgD9eS的第一部分。將417bpPCR片段亞克隆到pGEM-Teasy載體(Promega)中,得到pT9(l畫4)(SEQIDNO:43)。采用連接的"集合2"混合物(即IL3-5AB、IL3-6AB、IL3-7AB和IL3-8AB)作為才莫板，寡核普酸IL3-5F和IL3-8R(SEQIDNOs:41和42)作為引物，通過PCR類似地擴(kuò)增IgD9eS的第二部分，克隆到pGEM-T-easy載體中，得到pT9(5-8)(SEQIDNO:44)。分別用pT9(1-4)(SEQIDNO:43)和pT9(5國8)(SEQIDNO:44)轉(zhuǎn)化大腸桿菌，從氨千青霉素抗性轉(zhuǎn)化體中分離質(zhì)粒DNA。純化質(zhì)粒DNA，用合適的限制內(nèi)切酶消化，以釋放pT9(1-4)的417bpNcoI/PstI片段和pT9(5-8)的377bpPstl/Notl片段。然后混合這兩個片段，按照方向與Ncol/Notl消化的pZUF17(SEQIDNO:121;圖7C)連接在一起，得到pDMW237(SEQIDNO:46)。這樣，合成產(chǎn)生的IgD9eS基因的側(cè)翼是FBAIN啟動子和表達(dá)載體pDMW237內(nèi)的耶氏酵母尸ex20終止子。解脂耶氏酵母表達(dá)載體pY115的最終構(gòu)建將來自pDMW263(含有解脂耶氏酵母FBAINm啟動子)的iVcoIASW/IDNA片段克隆到pDMW237(含有IgD9eS)的A^col/Sa/IDNA片段中，得到pY115(SEQIDNO:45;圖8),其包含嵌合FBAINm::IgD9eS::Pex20基因。在圖8中，F(xiàn)BAINm標(biāo)示為"Fbal+內(nèi)含子"，IgD9eS標(biāo)示為"球等鞭金藻合成A9延伸酶"。實(shí)施例6構(gòu)建解脂耶氏酵母表達(dá)載體pBY2(包含EgD9e)和pBYl-FAE(包含IgD9eS)本發(fā)明描述了解脂耶氏酵母表達(dá)載體pBY2(包含嵌合FBAINm::EgD9e::Pex20基因)和pBYl-FAE(包含嵌合FBAINm::IgD9eS::Pex20基因)的合成。如實(shí)施例7(下文)的描述，當(dāng)在解脂耶氏酵母中表達(dá)時，將IgD9eS的A9延伸酶活性與EgD9e的延伸酶活性進(jìn)行比較。構(gòu)建解脂耶氏酵母表達(dá)載體pBY2用7VcoI/M^1消化質(zhì)粒pY115(SEQIDNO:45;實(shí)施例5),用Klenow填充得到的DNA末端。填充形成平端后，用小牛腸堿性磷酸酶處理DNA片段，用瓊脂糖凝膠電泳分離。從瓊脂糖凝膠切下含解脂耶氏酵母FBAINm啟動子的6989bp片段，用QIAquick⑧凝膠提取試劑盒(QiagenInc.,Valencia,CA)按照制造商的方案純化。釆用Gateway載體轉(zhuǎn)化系統(tǒng)(目錄號11823-029,InvitrogenCorporation),用盒rfA連接純化的6989bp片段，形成解脂耶氏酵母Gateway目的載體pBYl(SEQIDNO:47;圖9A)。按照制造商的方案，用QIAprep⑧旋轉(zhuǎn)微量制備試劑盒(QiagenInc.,Valencia,CA)從纖細(xì)眼蟲克隆eeglc.pk001.n5.f(實(shí)施例2和3)純化質(zhì)粒。采用GatewayLRClonaseII酶混合物(目錄號11791-020,InvitrogenCorporation),并且按照制造商的方案，將來自eeglc.pk001.n5.f的cDNA轉(zhuǎn)移到pBYl,形成pBY2(SEQIDNO:48;圖9B)。由于采用WobbleT引物進(jìn)行測序，eeglc.pk001.n5.f的3，末端的完整序列(即含有聚腺苷酸尾)是未知的。基于限制性消化和瓊脂糖凝膠分析，聚腺苷酸尾A的長度似乎小于100bp。構(gòu)建解脂耶氏酵母表達(dá)載體pBYl-FAE按照制造商的方案，用AccuPrime高保真聚合酶(目錄號12346-086,InvitrogenCorporation),用寡核苦酸引物ig-s(SEQIDNO:49)和ig國as(SEQIDNO:50)從pY115(SEQIDNO:45;實(shí)施例5)擴(kuò)增IgD9eS。按照制造商的方案，用pENTRTMDirectionalTOPO克隆試劑盒(InvitrogenCorporation)將得到的DNA片段克隆到PENTrTM/D-TOPO⑧中，得到pENTR-FAE。如上文的描述，按照制造商的方案，用QIAprep⑧旋轉(zhuǎn)微量制備試劑盒(QiagenInc.,Valencia,CA)純化質(zhì)粒pENTR-FAE。采用GatewayLRClonaseII酶混合物(目錄號11791-020,InvitrogenCorporation)并且按照制造商的方案，將IgD9eS的CDS轉(zhuǎn)移到pBYl，形成pBYl-FAE(SEQIDNO:51;圖9C)。載體轉(zhuǎn)化為大腸桿菌制備pBY2和pBYl-FAE后，將每個載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH10BTM(InvitrogenCorporation)細(xì)胞中。培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，用QIAprep⑧旋轉(zhuǎn)凝:量制備試劑盒(QiagenInc.,Valencia,CA)分離pBY2和pBYl-FAE。實(shí)施例7解脂耶氏酵母林Y2224中的EgD9e功能分析本實(shí)施例描述了解脂耶氏酵母抹Y2224中的EgD9e功能分析。這需要(1)構(gòu)建菌林Y2224(即來自野生型耶氏酵母株ATCC#20362的t/ra3基因自主突變的FOA抗性突變體)；和(2)比較包含pBY2(表達(dá)EgD9e)或pBYl-FAE(表達(dá)IgD9eS)的解脂耶氏酵母抹Y2224的轉(zhuǎn)化生物體內(nèi)的脂質(zhì)鐠。制備解脂耶氏酵母株Y2224按照以下方式分離菌抹Y2224:將來自YPD瓊脂板的解脂耶氏酵母ATCC#20362細(xì)胞劃線到含有250mg/L5-F0A(ZymoResearch)的基本培養(yǎng)基板(尿嘧啶和尿苷各75mg/L,6.7g/L含有硫酸銨的YNB,無氨基酸，20g/L葡萄糖)上。將板在28。C下溫育，將得到的菌落中的4個斑點(diǎn)分離到含有200mg/mL5-FOA的基本培養(yǎng)基板和缺乏尿嘧啶和尿苷的基本培養(yǎng)基板上，以證實(shí)尿嘧啶〖7ra3營養(yǎng)缺陷。隨后，使解脂耶氏酵母抹Y2224于28°C在YPD瓊脂上生長。包含pBYl-FAE和pBY2的解脂耶氏酵母轉(zhuǎn)化體的功能分析按照一般方法的描述，將pBYl-FAE(包含嵌合FBAINm::IgD9eS::Pex20基因)和pBY2(包含嵌合FBAINm::EgD9e::Pex20基因)轉(zhuǎn)化到解脂耶氏酵母抹Y2224中。將細(xì)胞鋪板到缺乏尿嘧啶的基本培養(yǎng)基上，并且在30。C下維持2-3天。然后使轉(zhuǎn)化體的單菌落30。C下在3mL缺乏尿嘧啶的基本培養(yǎng)基中生長至OD600為約1.0。作為對照，Y2224也在補(bǔ)加尿嘧，定的基本培養(yǎng)基中以相似的方式生長。隨后用水洗滌細(xì)胞，通過離心收集，并且按照上文的描述進(jìn)行酯交換。釆用實(shí)施例4描述的方法(即，對于含pY119的啤酒糖酵母細(xì)胞的描述)通過GC分析來自含pBYl-FAE、pBY2或無表達(dá)載體的細(xì)胞的FAMEs進(jìn)行分析。代表三次重復(fù)的平均值的結(jié)果示于表8。脂肪酸鑒定為16:0(棕櫚酸)，16:1(9)(棕櫚油酸)，17:1(9)，18:0,18:1(9)(油酸)，LA和EDA。按照實(shí)施例4的描述計算延伸效率("％EloLA，，)。表8表達(dá)EgD9e和IgD9eS的耶氏酵母的脂質(zhì)譜的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage81</column></row><table>如表8所示，結(jié)果證明當(dāng)將LA轉(zhuǎn)化為EDA時，EgD9e以比IgD9eS更高的底物轉(zhuǎn)化效率起作用。實(shí)施例8解脂耶氏酵母表達(dá)載體pZuFmEgD9ES的構(gòu)建和功能分析，該載體包含為在解脂耶氏酵母中表達(dá)而進(jìn)行了密碼子優(yōu)化的合成的A9延伸酶基因(EgD9eS)(來源于纖細(xì)眼蟲)本實(shí)施例描述了解脂耶氏酵母表達(dá)載體pZuFmEgD9ES的構(gòu)建，該載體包含嵌合FBAINm::EgD9ES::Pex20基因，其中EgD9eS是來源于纖細(xì)眼蟲的合成的A9延伸酶并且為在解脂耶氏酵母中表達(dá)而進(jìn)行了密碼子優(yōu)化。因此，該分析需要(1)合成EgD9eS;(2)將pZuFmEgD9ES構(gòu)建和轉(zhuǎn)化到解脂耶氏酵母林Y2224中；和(3)分析包含pZuFmEgD9ES(表達(dá)EgD9eS)的解脂耶氏酵母林Y2224的轉(zhuǎn)化生物體中的脂質(zhì)譜。合成EgD9eS以類似于實(shí)施例5和PCT公開No.WO2004/10175中描述的方式，優(yōu)化纖細(xì)眼蟲A9延伸酶基因(EgD9e;SEQIDNOs:l和2)的密碼子選擇。具體地，根據(jù)耶氏酵母密碼子選擇才莫式(PCT公開No.WO2004/101753)，基于EgD9e的編碼序列(即來自克隆eeglc.pk001.n5.f)、"ATG"翻譯起始密碼子附近的共有序列和RNA穩(wěn)定性的一般規(guī)則(Guhaniyogi,G.和J.Brewer,Owe,265(1-2):11-23(2001))設(shè)計密碼子優(yōu)化的A9延伸酶基因(命名為"EgD9eS";SEQIDNO:3)。除了修飾翻譯起始位點(diǎn)，修飾了777bp編碼區(qū)的117bp(15.1%)，并且優(yōu)化了106個密碼子。圖10顯示了EgD9e和EgD9eS的核苦酸序列的比較。密碼子優(yōu)化的基因中的修飾都沒有改變編碼的蛋白的氨基酸序列(SEQIDNO:2)。由GenScript公司(Piscataway,NJ)合成設(shè)計的EgD9eS基因，并且克隆到pUC57(GenBank登錄號Y14837)中，以制備pEgD9S。制備構(gòu)建體pZuFmEgD9E(包含EgD9E)和pZuFmEgD9ES(包含EgD9ES)通過用來自包含EgD9eS的pEgD9S的WcoI片段取代pZUF17(圖7C;SEQIDNO:121)的WcoI/WwI片段，構(gòu)建包含嵌合FBAINm::EgD9ES::Pex20基因的質(zhì)粒pZuFmEgD9ES(SEQIDNO:53)。該連接的產(chǎn)物是自主復(fù)制的表達(dá)載體pZuFmEgD9ES,其因此包含以下成分表9<table>tableseeoriginaldocumentpage83</column></row><table>以類似的方式，用pZUF17質(zhì)粒主鏈合成包含嵌合FBAINm::EgD9E::Pex20基因的質(zhì)粒pZuFmEgD9E(SEQIDNO:52)。包含pZuFmEgD9E和pZuFmEgD9ES的解脂耶氏酵母轉(zhuǎn)化體的功能分析按照一般方法中的描述，將質(zhì)粒pZuFmEgD9E和pZuFmEgD9ES(分另"包含嵌合FBAINm::EgD9e::Pex20基因和FBAINm::EgD9eS::Pex20基因)轉(zhuǎn)化到菌抹Y2224(來自野生型耶氏酵母抹ATCC#20362的Vra3基因自主突變的FOA抗性突變體，實(shí)施例7)中。在MM板上選擇轉(zhuǎn)化體。30。C下生長2天后，挑選在MM板上生長的3個轉(zhuǎn)化體，重新劃線到新的MM板上。一旦生長，將這些菌林30。C下單個接種到3mL液體MM中，并且250rpm/min下振蕩2天。通過離心收集細(xì)胞，提取脂質(zhì)，通過酯交換制備脂肪酸甲酯，隨后用Hewlett-Packard6890GC進(jìn)4亍分析。GC分析顯示在所有7個含有pZuFmEgD9E的轉(zhuǎn)化體中產(chǎn)生占總脂質(zhì)3.2%的EDA(C20:2),其中在這7個菌抹中LA(C18:2)轉(zhuǎn)化為EDA的平均轉(zhuǎn)化效率確定為約18.3%(平均值；按照實(shí)施例4的描述計算)。不同的是，GC分析顯示在所有7個含有pZuFmEgD9ES的轉(zhuǎn)化體中產(chǎn)生占總脂質(zhì)3.6%的EDA(C20:2)，其中在這7個菌抹中LA(C18:2)轉(zhuǎn)化為EDA的平均轉(zhuǎn)化效率確定為約20.P/o(平均值)。因此，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證明為在解脂耶氏酵母中表達(dá)而進(jìn)行了密碼子優(yōu)化的合成的纖細(xì)眼蟲△9延伸酶(即EgD9eS;SEQIDNO:3)在將LA延伸為EDA方面比野生型EgD9e基因(即SEQIDNO:l)的效率高約16.2%。實(shí)施例9構(gòu)建用于表達(dá)纖細(xì)眼蟲A9延伸酶(EgD9e)的解脂耶氏酵母表達(dá)載體pY120本實(shí)施例描述了構(gòu)建用于表達(dá)EgD9e的解脂耶氏酵母載體pY120。具體地，將來自pKR906(包含EgD9e;來自實(shí)施例4)的WcoI/A^IDNA片段克隆到來自pY115(圖8;實(shí)施例5;包含解脂耶氏酵母FBAINm啟動子)的A^oI/MrtDNA片段中，產(chǎn)生pY120(SEQIDNO:54;圖IIA)。在該圖中，EgD9e標(biāo)示為"eugell"。實(shí)施例10構(gòu)建用于表達(dá)纖細(xì)眼蟲△9延伸酶(EgD9e)的大豆表達(dá)載體pKR912本實(shí)施例描述了構(gòu)建用于表達(dá)EgD9e的大豆載體pKR912。初始質(zhì)粒pKR72(ATCC保藏號PTA-6019;SEQIDNO:55)，即以前描述于PCT公開No.WO02/008269(其內(nèi)容在此導(dǎo)入作為參考)的pKS123衍生物，含有潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶(HPT)(Gritz，L.和Davies,J.,G匿,25:179-188(1983)),其側(cè)翼是T7啟動子和轉(zhuǎn)錄終止子(T7prom/HPT/T7term終止子盒)和細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)(ori)，用于在細(xì)菌(如大腸桿菌)中進(jìn)行選擇和復(fù)制。此外，pKR72也含有HPT基因，其側(cè)翼是35S啟動子(Odell等,淑,,313:810-812(1985))和NOS3，轉(zhuǎn)錄終止子(Depicker等，丄A/o/.j/^/.1:561-570(1982))(35S/HPT/NOS3，盒)，用于在植物，如大豆中進(jìn)行選擇。pKR72也含有MfI限制位點(diǎn)，側(cè)翼是e-大豆球蛋白的ot，亞基的啟動子("BCONPro";Beachy等，4:3047-3053(1985))和菜豆蛋白的3，轉(zhuǎn)錄終止區(qū)(Doyle等，J.S/o/.C/zem.，261:9228-9238(1986》，由此使得克隆到A^I位點(diǎn)的基因能夠在大豆種子中進(jìn)行組織特異性強(qiáng)表達(dá)。通過用AWI消化，從pKR906釋放EgD9e(實(shí)施例4),并且克隆到pKR72的7VWI位點(diǎn)，產(chǎn)生pKR912(SEQIDNO:56)。pKR912的示意性描述示于圖11B;EgD9e在其中標(biāo)示為"eugell"。實(shí)施例11構(gòu)建用于表達(dá)纖細(xì)眼蟲A9延伸酶(EgD9e)的大豆中間克隆載體pKR911本實(shí)施例描述了構(gòu)建用于表達(dá)EgD9e的大豆載體pKR911。以前描述于PCT公開No.WO02/00卯5(其內(nèi)容在此導(dǎo)入作為參考)中的載體pKS102(SEQIDNO:57)含有T7prom/HPT/T7terai盒(描述于實(shí)施例10)和細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)(ori),用于在細(xì)菌(如大腸桿菌)中進(jìn)行選擇和復(fù)制。通過組合來自含有T7prom/HPT/T7term盒和細(xì)菌oh的質(zhì)粒pKS102(SEQIDNO:57)的Acl片段和來自含有Pcon/A^//Phas盒的質(zhì)粒pKR72(描述于實(shí)施例10)的J化I片段，構(gòu)建以前描述于PCT公開No.WO04/071467(其內(nèi)容在此導(dǎo)入作為參考)的載體pKR197(SEQIDNO:58)。通過用WWI消化，從pKR906(實(shí)施例4)釋放EgD9e,并且克隆到pKR197的A^I位點(diǎn)中，產(chǎn)生中間克隆載體pKR911(SEQIDNO:59)。pKR911的示意性描述示于圖12A;EgD9e在其中標(biāo)示為"eugeir。實(shí)施例12纖細(xì)眼蟲△8去飽和酶的cDNA合成本實(shí)施例描述了按照美國專利申請No.11/166003和No.11/166993(相應(yīng)于PCT公開No.WO06/012325和No,WO06/012326[其內(nèi)容在此導(dǎo)入作為參考])公開的內(nèi)容，從纖細(xì)眼蟲分離A8去飽和酶(命名為"EgD8")。該基因的分離是需要的，使得能夠共表達(dá)EgD9e和EgD8，從而允許表達(dá)A9延伸酶/A8去飽和酶途徑，并且能夠從LA和/或ALA積累DGLA和/或ETA。根據(jù)制造商的方案，采用用于cDNA合成的Superscript選擇系統(tǒng)(InvitrogenTMLifeTechnologies,Carlsbad,CA)，用提供的寡聚(dT)引物，從765ngmRNA(實(shí)施例1)合成纖細(xì)眼蟲cDNA。將合成的cDNA溶解于20|uL水中。采用下文所述條件，從cDNA擴(kuò)增纖細(xì)眼蟲A8去飽和酶。具體地，將cDNA(1iliL)與50pmolEg5-1(SEQIDNO:62)、50pmolEg3-3(SEQIDNO:63)、1juLPCR核苷酸混合物(10mM,Promega,Madison,WI)、5|uL10XPCR緩沖液(Invitrogen)、1.5(iLMgCl2(50mM,Invitrogen公司)、0.5)uTaq聚合酶(Invitrogen公司)和水混合到50|uL。反應(yīng)條件是94°C3分鐘，然后是35個循環(huán)的94°C45秒，55°C45秒和72。C1分鐘。72。C下使PCR終止7分鐘，然后保持在4。C。用5|uL通過瓊脂糖凝膠電泳分析PCR反應(yīng)，觀察到分子量為大約1.3kB的DNA條帶。通過瓊脂糖凝膠電泳分離剩余的45fiL產(chǎn)物，按照制造商的方案，用Zymoclean凝膠DNA回收試劑盒(ZymoResearch,Orange，CA)純化DNA條帶。按照制造商的方案將得到的DNA克隆到pGEM-TEasy載體(Promega)中。用T7(SEQIDNO:64)、M13-28Rev(SEQIDNO:65)、Eg3-2(SEQIDNO:66)和Eg5曙2(SEQIDNO:67)對多個克隆進(jìn)行測序。由此獲得了纖細(xì)眼蟲△8去飽和酶(即Eg5)的DNA序列(SEQIDNO:60)。Eg5的翻譯得到了SEQIDNO:61所示的蛋白序列。為了本文的目的，"Eg5"在說明書其余的部分稱作"EgD8"。盡管在此沒有詳細(xì)描述，也用上文實(shí)施例5描述的方法制備了為在解脂耶氏酵母中表達(dá)而進(jìn)行了密碼子優(yōu)化的合成形式的EgD8(如美國專利申請No.11/166003和No.11/166993(相應(yīng)于PCT公開No.WO06/012325和No.WO06/012326)中的公開)。該基因命名為EgD8S,在本文描述為SEQIDNOs:68和69。實(shí)施例13構(gòu)建用于共表達(dá)EgD9e和EgD8的大豆表達(dá)載體pKR913本實(shí)施例描述了構(gòu)建用于共表達(dá)EgD9e和EgD8的大豆載體pKR913。以前描述于PCT公開No.WOO2/00904(其內(nèi)容在此導(dǎo)入作為參考)的載體pKS121(SEQIDNO:70)含有Wofl位點(diǎn)，其側(cè)翼是Kunitz大豆胰蛋白酶抑制劑(KTi)啟動子(Jofuku等，尸/"WC"/,1:1079-1093(1989))和KTi3，終止區(qū)，其分離描述于美國專利No.6,372,965(KTi/脂I/KTi3，盒)。以前描述于PCT公開No.WO05/047479(其內(nèi)容在此導(dǎo)入作為參考)的載體pKR457(SEQIDNO:71)是pKS121的衍生物，其中KTi/Mrt/KTi3，盒上游和下游的限制位點(diǎn)通過許多亞克隆步驟而改變。載體pKR457也含有以前描述于PCT公開No.WO04/071467(其內(nèi)容在此導(dǎo)入作為參考)中的大豆白蛋白轉(zhuǎn)錄終止子(GM-ALBTERM),位于KTi終止子下游，用于延伸和加強(qiáng)轉(zhuǎn)錄終止。在pKR457中，除去KTi/A^I/KTi3，盒中的KTi啟動子上游的SamHI位點(diǎn)，并且加入含有5wWI，Sa/I,幼/I和歷wdIII位點(diǎn)的新序列(SEQIDNO:72)，其中SWWI位點(diǎn)距離Kti啟動子的5'末端最近。此外，除去來自pKS121的KTi脂I/KTi3，盒中的Kti終止子下游的Sa/I點(diǎn)，并且加入含X6"I(距離Kti終止子的3'末端最近)，3awHI位點(diǎn)，大豆白蛋白轉(zhuǎn)錄終止子序列，5WWI位點(diǎn)和另一SamHI位點(diǎn)的新序列(SEQIDNO:73)。以前已經(jīng)用設(shè)計用于在終止子的3，末端導(dǎo)入&AVI位點(diǎn)的引物oSalb-12(SEQIDNO:74)和設(shè)計用于在終止子的5，末端導(dǎo)入SamHI位點(diǎn)的引物oSalb-13(SEQIDNO:75),從大豆基因組DNA擴(kuò)增白蛋白轉(zhuǎn)錄終止子。通過用消化，從實(shí)施例12描述pGEM⑧-TEasy載體釋放EgD8(SEQIDNO:60)，并且克隆到pKR457的A^I位點(diǎn)，產(chǎn)生pKR680(SEQIDNO:76)。然后用Bw'WI消化質(zhì)粒pKR680，將含有EgD8的片段克隆到pKR911(SEQIDNO:59;實(shí)施例ll)的位點(diǎn)。pKR913的示意性描述示于圖12B。其中EgD9e標(biāo)示為"eugell",EgD8標(biāo)示為eugd8-sq5。實(shí)施例14構(gòu)建用于共表達(dá)EgD9e和EgD8的大豆表達(dá)載體本實(shí)施例描述了構(gòu)建用于共表達(dá)EgD9e和EgD8的大豆載體。具體地，用^AVI消化質(zhì)粒pKR680(SEQIDNO:76;實(shí)施例13),將含有EgD8(SEQIDNO:60)的片段克隆到pKR912(SEQIDNO:56;實(shí)施例10)的SwWI位點(diǎn)。以此方式，在強(qiáng)、種子特異性啟動子控制下共表達(dá)EgD8與EgD9e。實(shí)施例15構(gòu)建用于與高山被孢霉△5去飽和酶(Mad5)共表達(dá)EgD9e和EgD8的載體本實(shí)施例描述了構(gòu)建用于共表達(dá)EgD9e和EgD8以及其它PUFA基因(即A5去飽和酶)的大豆載體。以下面的方式構(gòu)建美國專利No.6,075,183和PCT公開Nos.WO04/071467和WOO5/0479479(其內(nèi)容在此導(dǎo)入作為參考)中描述的含EgD8(SEQIDNO:60),EgD9e(SEQIDNO:l)和高山^皮孢霉A5去飽和酶(SEQIDNO:78;"Mad5")的大豆表達(dá)載體，所有這些都處于強(qiáng)的種子特異性啟動子控制下。通過許多亞克隆步驟，將DNA序列(SEQIDNO:80)有效加入載體pKR287(描述于PCT公開No.WO04/071467，其內(nèi)容在此導(dǎo)入作為參考)的SmaI位點(diǎn)，以產(chǎn)生pKR767(SEQIDNO:81)。以此方式，將幼/1限制位點(diǎn)加入Gyl/Mad5/legA2盒的leglA轉(zhuǎn)錄終止子的3，末端，其描述于PCT公開Nos.WO04/071467和WO05/0479479。通過用幼/I消化，從pKR767釋放Gyl/Mad5/legA2盒，將得到的片段克隆到實(shí)施例14描述的載體的幼yi位點(diǎn)，產(chǎn)生共表達(dá)處于種子特異性強(qiáng)啟動子控制下的所有三種基因(即EgD9e,EgD8和Mad5)的新載體。實(shí)施例16與異絲水霉A17去飽和酶(SdD17)共表達(dá)包含EgD9e、EgD8和Mad5的大豆表達(dá)載體本實(shí)施例描述了與表達(dá)多種不同的種子特異性啟動子/長鏈PUFA生物合成基因組合(如表達(dá)A17去飽和酶)的其它載體一起共轉(zhuǎn)化實(shí)施例15描述的大豆表達(dá)載體(表達(dá)EgD9e，EgD8和Mad5)。釆用了完整質(zhì)粒或來自含有合適的基因組合的質(zhì)粒的純化y45Cl片段(也可以采用任何質(zhì)粒片段的任何組合)。例如，實(shí)施例15描述的載體可以與包含膜聯(lián)蛋白啟動子控制下的異絲水霉A17去飽和酶(SdD17)并且具有用于在植物中進(jìn)行選擇的潮霉素抗性基因的pKR328(SEQIDNO:82，描述于PCT公開No.WO04/071467)共轉(zhuǎn)化。類似地，實(shí)施例15描述的載體可以與pKR886或pKR886r(分別見圖13A和13B)共轉(zhuǎn)化，pKR886和pKR886r是兩種類似于pKR328的載體，但具有SAMS/ALS/ALS3，盒(描述于PCT公開No.WO04/071467)，用于在植物中進(jìn)行選擇。具體地，通過將含有來自pKR271(SEQIDNO:85,描述于PCT公開No.WO04/071467)的Ann/Sddl7/BD30盒的尸Wl片l殳克隆到pKR226(SEQIDNO:86，描述于PCT公開No.WO04/071467)的幼yi位點(diǎn)，制備載體(SEQIDNO:83)和pKR886r(SEQIDNO:84)。實(shí)施例17與SdD17和擬南芥Fad3共表達(dá)包含EgD9e、EgD8和Mad5的大豆表達(dá)載體本實(shí)施例描述了與表達(dá)多種不同的種子特異性啟動子/長鏈PUFA生物合成基因組合(如表達(dá)A17去飽和酶和Fad3)的其它載體一起共轉(zhuǎn)化實(shí)施例15描述的大豆表達(dá)載體(表達(dá)EgD9e,EgD8和Mad5)。實(shí)施例15的載體可以與pKR275(SEQIDNO:87,描述于PCT公開No.WO04/071467并具有ATCC保藏號PTA-4989)或pKR329(SEQIDNO:88,描述于PCT公開No.WO04/07146)共轉(zhuǎn)化到大豆中。質(zhì)粒pKR275和pKR329分別具有ALS或潮霉素選擇，并且除Ann/Sddl7/BD30盒外還含有KTi/Fad3/KTi3，基因盒(描述于PCT公開No.WO04/071467)。以此方式，擬南芥Fad3基因可以與種子特異性強(qiáng)啟動子后的異絲水霉A17去飽和酶(SdD17)共表達(dá)。實(shí)施例18與SdD17和串珠鐮孢A15去飽和酶(FmD15)共表達(dá)包含EgD9e、EgD8和Mad5的大豆表達(dá)載體本實(shí)施例描述了與表達(dá)多種不同的種子特異性啟動子/長鏈PUFA生物合成基因組合(如表達(dá)A17去飽和酶和A15去飽和酶)的其它載體一起共轉(zhuǎn)化實(shí)施例15描述的大豆表達(dá)載體(表達(dá)EgD9e,EgD8和Mad5)。實(shí)施例15描述的載體可以與具有潮霉素選擇并且含有KTi啟動子控制下的串珠鐮孢A15去飽和酶(FmD15)的pKR585(SEQIDNO:89,描述于PCT公開No.WO05/0479479并具有ATCC保藏號PTA-6019)共轉(zhuǎn)化到大豆中。實(shí)施例15描述的載體也可以與具有ALS選擇并且含有KTi啟動子控制下的串珠鐮孢A15去飽和酶以及Ann/Sddl7/BD30盒的pKR669共轉(zhuǎn)化到大豆中。通過以下途徑生產(chǎn)質(zhì)粒pKR669。KTi啟動子:FmD15:KTi終止子盒通過5wWI消化從質(zhì)粒pKR578(SEQIDNO:90,描述于PCT公開No.WO05/0479479并具有ATCC保藏No.PTA-6280)釋放，并且克隆到質(zhì)粒pKR226(SEQIDNO:86，描述于PCT公開No.WO04/071467)的^zWI位點(diǎn)中，得到pKR667(SEQIDNO:91),所述質(zhì)粒pKR226含有用于選擇的ALS基因、T7prom/HPT/T7term盒和細(xì)菌oh區(qū)。用尸WI消化質(zhì)粒pKR271(SEQIDNO:85,描述于PCT公開No.WO04/071467),將含有異絲水霉△17去飽和酶的片段克隆到pKR667的幼/I位點(diǎn)，產(chǎn)生pKR669。以此方式，串珠鐮孢A15去飽和酶可以與種子特異性強(qiáng)啟動子后的異絲水霉A17去飽和酶共表達(dá)。pKR669的示意性描述示于圖14A。實(shí)施例15描述的載體也可以與具有ALS選擇并且含有大豆白蛋白啟動子控制下的串珠鐮孢A15去飽和酶(FmD15)(描述于PCT公開No.WO04/071467)以及Ann/Sddl7/BD30盒的pKR873(SEQIDNO:92)共轉(zhuǎn)化到大豆中。具體地，通過以下途徑生產(chǎn)質(zhì)粒pKR873。用PCR從質(zhì)粒pKR132(SEQIDNO:93，描述于PCT公開No.WO04/071467)擴(kuò)增SA/iVort/SA3，盒。設(shè)計引物oSAlb-9(SEQIDNO:94)，用于在啟動子的5，末端導(dǎo)入Z&"I和SwWI位點(diǎn)，并設(shè)計引物oSAlb-2(SEQIDNO:95),用于在終止子的3，末端導(dǎo)入S&WI和Z6"I位點(diǎn)。隨后將得到的PCR片l殳克隆到AMPSK(+)(StratageneCompany,SanDiego,CA)中，產(chǎn)生pKR160(SEQIDNO:96)。然后用^AVI消化質(zhì)粒pKR160，并且將SA/A^//SA3，盒連接到pKR124(SEQIDNO:97，描述于PCT公開No.WO05/0479479)的位點(diǎn)中，產(chǎn)生pKR163(SEQIDNO:98)。將來自pY34(SEQIDNO:99,描述于PCT公開No.WO05/0479479)的含有串珠鐮孢A15去飽和酶的Wort片段克隆到pKR163(SEQIDNO:98)的Wort位點(diǎn)，產(chǎn)生pKR863(SEQIDNO:100)。通過用^AVI消化從質(zhì)粒pKR863釋放SA/FmD15/SA3，盒，并且克隆到質(zhì)粒pKR226(SEQIDNO:86,描述于PCT公開No.WO04/071467)的5wWI位點(diǎn)，產(chǎn)生pKR869(SEQIDNO:101)，所述質(zhì)粒pKR863含有用于選擇的ALS基因、T7prom/HPT/T7term和細(xì)菌oh區(qū)。用尸Wl消化質(zhì)粒pKR271(SEQIDNO:85,描述于PCT公開No.WO04/071467),將含有異絲水霉A17去飽和酶的片段克隆到pKR869(SEQIDNO:101)的幼yi位點(diǎn)中，產(chǎn)生pKR873(SEQIDNO:92)。以此方式，串珠鐮孢A15去飽和酶可以與種子特異性強(qiáng)啟動子后的異絲水霉A17去飽和酶共表達(dá)。pKR873的示意性描述示于圖14B。實(shí)施例19與SdD17和高山被孢霉延伸酶(MaELO)共表達(dá)包含EgD9e、EgD8和Mad5的大豆表達(dá)載體本實(shí)施例描述了與表達(dá)多種不同的種子特異性啟動子/長鏈PUFA生物合成基因組合(如表達(dá)A17去飽和酶和延伸酶)的其它載體一起共轉(zhuǎn)化實(shí)施例15描述的大豆表達(dá)載體(表達(dá)EgD9e,EgD8和Mad5)。實(shí)施例15描述的載體可以與具有ALS選擇并且含有大豆白蛋白啟動子控制下的高山被孢霉延伸酶(描述于PCT公開Nos.WO04/071467和WO00A2720)以及Ann/Sddl7/BD30盒的載體共轉(zhuǎn)化到大豆中。該質(zhì)?？梢酝ㄟ^與上文所述相似的方式產(chǎn)生。例如，含有高山被孢霉延伸酶("Maelo")的來自pKR270(SEQIDNO:102,描述于PCT公開No.WO04/07M67)的片l殳可以克隆到pKR163(SEQIDNO:98)的iW/I位點(diǎn)，產(chǎn)生具有SA/Maelo/SA3，盒的載體?？梢酝ㄟ^用SwWI消化從該質(zhì)粒釋放SA/Maelo/SA3，盒，并且克隆到質(zhì)粒pKR226(SEQIDNO:86,描述于PCT公開No.WO04/071467)的5WWI位點(diǎn)，產(chǎn)生新質(zhì)粒，所述質(zhì)粒pKR226含有用于選擇的ALS基因、T7prom/HPT/T7term和細(xì)菌on'區(qū)。然后可以用尸WI消化質(zhì)粒pKR271(SEQIDNO:85，描述于PCT公開No.WO04/071467)，并且可以將含有異絲水霉A17去飽和酶的片段克隆到含有SA/Maelo/SA3，盒的新質(zhì)粒的幼yi位點(diǎn)。以此方式，高山被孢霉延伸酶可以與種子特異性強(qiáng)啟動子后的異絲水霉△17去飽和酶共表達(dá)。實(shí)施例20與C20/22延伸酶和A4去飽和酶共表達(dá)包含EgD9e、EgD8和Mad5的大豆表達(dá)載體本實(shí)施例描述了與表達(dá)多種不同的種子特異性啟動子/長鏈PUFA生物合成基因組合(如表達(dá)C2。/22延伸酶和A4去飽和酶)的其它載體一起共轉(zhuǎn)化實(shí)施例15描述的大豆表達(dá)載體(表達(dá)EgD9e,EgD8和Mad5)。。20/22延伸酶(也鑒定為△5延伸酶和/或EPA延伸酶)和/或A4去飽和酶也可以在與本文描述相類似的大豆表達(dá)載體中共表達(dá)。例如，可以將來自聚集裂殖壺菌(Schizochytriumaggregatum)的△4去飽和酶(描述于PCT公開No.WO02/090493)或來自巴夫藻(Pavlova)的△5延伸酶(描述于PCT公開No.WO04/071467)克隆到合適的大豆表達(dá)載體，如描述于PCT公開No.WO04/071467描述的載體中。設(shè)計用于在A4去飽和酶或A5延伸酶的5，和3，末端導(dǎo)入A^fl位點(diǎn)的PCR引物可以用于擴(kuò)增基因。然后，可以用AWI消化得到的PCR產(chǎn)物，并且克隆到含有位點(diǎn)的合適大豆表達(dá)載體中，所述位點(diǎn)的側(cè)翼是種子特異性強(qiáng)啟動子和轉(zhuǎn)錄終止子。進(jìn)一步亞克隆到其它載體，如本文或PCT7^開No.WO04/071467或PCT公開No.WO05/047479描述的那些載體中，應(yīng)該產(chǎn)生適合用于在大豆中表達(dá)和共表達(dá)A4去飽和酶和A5延伸酶的載體。實(shí)施例21制備雙鞭藻蟲種CCMP389基因組DNA、RNA和cDNA本實(shí)施例描述了從雙鞭藻蟲種CCMP389制備基因組DNA、RNA和cDNA,其購自Provasoli-Guillard國家海洋浮游植物培養(yǎng)中心(CCMP)(Bigelow海洋科學(xué)實(shí)"驗(yàn)室，WestBoothbayHarbor,緬因州)。從雙鞭藻蟲種CCMP389制備RNA和基因組DNA才艮據(jù)制造商的方案，用Trizol試劑(Invitrogen,Carlsbad,CA)從1升培養(yǎng)物分離總RNA和基因組DNA。具體地，將細(xì)胞沉淀物懸浮在0.75mLTrizol^式劑中,與0.5mL0.5mm的玻璃珠混合，在Biospec樣￡珠攪拌器(Bartlesville,OK)中以最高設(shè)置勻漿3分鐘。將混合物在Eppendorf離心機(jī)中以14,000rpm離心30秒,以除去碎屑和玻璃珠。用150jul24:l氯仿:異戊醇(Invitrogen)萃取上清液。將上層水相用于RNA分離，下層有4幾相用于DNA分離。為了分離RNA,將水相與0.375mL異丙醇混合，在室溫下溫育5分鐘。通過以8,000rpm4。C下離心5分鐘，收集沉淀的RNA。將沉淀物用0.7mL80y。乙醇洗滌一次，在空氣中干燥。以此方式，獲得了360iug總RNA。為了分離基因組DNA，將下層有機(jī)相與75jul乙醇混合，在室溫下溫育5分鐘。然后在Eppendorf離心機(jī)中以5,000rpm將樣品離心2分鐘。用0.75mLO.lM檸檬酸鈉10Q/()乙醇將沉淀物洗滌兩次。每次，將樣品在洗滌溶液中室溫下溫育15分鐘，然后4°C下以5,000rpm離心5分鐘。將沉淀物在空氣中干燥，重新溶解于300lul8mMNaOH中。用1MHEPES將樣品的pH調(diào)節(jié)到7.5。然后完全按照制造商的方案，用QiagenPCR純化試劑盒(Valencia,CA)進(jìn)一步純化基因組DNA。由此，分離了40ng基因組DNA。從雙鞭藻蟲種CCMP389制備cDNA用BDBioscienceClontech(PaloAlto,CA)的CreatorSMARTTMcDNA文庫構(gòu)建試劑盒制備雙鏈cDNA。具體地，為了合成第一鏈cDNA,將1jul總RNA樣品(1.2jug)單獨(dú)與1ju1SMARTIV寡核苷酸(SEQIDNO:103),1julCDSI11/3，PCR引物(SEQIDNO:104)和2pl水混合。將混合物加熱到75。C持續(xù)5分鐘，在水上冷卻5分鐘。在樣品中加入2jul5x第一鏈緩沖液，1jul20mMDTT,1iuldNTP混合物(dATP,dCTP,dGTP和dTTP各10mM)和1|u1PowerScript逆轉(zhuǎn)錄酶。將樣品在42°C下溫育1小時。將第一鏈cDNA合成混合物用作擴(kuò)增模板。具體地，反應(yīng)混合物含有2)il上述第一鏈cDNA樣品，80ml水，10jul1OXAdvantage2PCR緩沖液，2jul50XdNTP混合物(dATP，dCTP，dGTP和dTTP各10mM),2jul5'誦PCR引物(SEQIDNO:105),2ju1CDSIII/3'-PCR引物(SEQIDNO:104)和2)i15OXAdvantage2聚合酶混合物。用以下條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增95。C下l分鐘，然后是20個循環(huán)的95°C下10秒和68。C下6分鐘。完全按照制造商的方案，用QiagenPCR純化試劑盒純化擴(kuò)增產(chǎn)物。用50jul水洗脫純化的產(chǎn)物。實(shí)施例22從雙鞭藻蟲種CCMP389分離全長△9延伸酶本實(shí)施例描述了通過使用來源于纖細(xì)眼蟲(EgD9e;實(shí)施例3)和球等鞭金藻(IgD9e)A9延伸酶序列保守區(qū)的引物，從雙鞭藻蟲種CCMP389鑒定編碼A9延伸酶的部分cDNA片段。然后，基于部分cDNA片段，分離基因的5，和3，末端。這使得能夠組裝重疊群(SEQIDNO:17),其延伸雙鞭藻蟲種CCMP389△9延伸酶翻譯起始"ATG，，密碼子上游的51個;咸基并且超過A9延伸酶終止密碼子662bp。鑒定編碼來自雙鞭藻蟲種CCMP389的部分A9延伸酶的cDNA片段分析雙鞭藻蟲種CCMP389中A9延伸酶的存在。適于分離雙鞭藻蟲種CCMP389△9延伸酶的簡并引物的設(shè)計是基于當(dāng)用DNASTAR軟件的MegAlign程序的ClustalW方法(緩慢，準(zhǔn)確，Gonnet選項(xiàng)；Thompson等,A^c/ezd油to.,22:4673-4680(1994))對兩種延伸酶進(jìn)行比對時，鑒定了EgD9e(SEQIDNO:2)和IgD9e(SEQIDNO:8)共有的一些保守氨基酸序列段(ClustalW比對在本文中沒有示出，參照圖4提供的EgD9e和IgD9e的ClustalV比對)?；谠摫葘?，設(shè)計了如下簡并寡核苷酸組，用于擴(kuò)增雙鞭藻蟲種CCMP389的A9延伸酶基因的一部分編碼區(qū)，如表10所示。表10用于從雙鞭藻蟲種CCMP389擴(kuò)增A9延伸酶基因的簡并寡核苷酸<table>tableseeoriginaldocumentpage95</column></row><table>[注用于SEQIDNOs:106和108的核酸簡并密碼如下R=A/G;Y=C/T;D=G/A/T;N=A/C/T/G.]反應(yīng)混合物含有l(wèi)jull:20稀釋的cDNA,正向和反向引物(20juM)各5jul,14jul水和25julTaKaRaExTaq2X預(yù)混合物(TaKaRaBio,MountainView,CA)。用以下參數(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增94。C下1min，然后是35個循環(huán)的94°C下20sec,55。C下20sec，和72°C下1min,然后是72°C下5min的最終延伸循環(huán)。PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠分析顯示獲得了約200bp的片段。用QiagenPCR純化試劑盒純化片段，克隆到pCR2.1-TOPO(Invitrogen)中并測序。當(dāng)?shù)玫降男蛄?SEQIDNO:13)翻譯時，基于BLAST程序分析(基本局部比對檢索工具;Altschul,S.F.,等，丄Mo/.Ao/.，215:403-410(1993);實(shí)施例3),與來自球等鞭金藻的9延伸酶(IgD9e;SEQIDNO:8)具有同源性。分離雙鞭藻蟲種CCMP389A9延伸酶的5，-末端序列在兩輪獨(dú)立的PCR擴(kuò)增中，將雙鞭藻蟲種CCMP389的雙鏈cDNA(實(shí)施例21)用作模板。在第一輪PCR擴(kuò)增中，寡核苷酸引物由基因特異性寡核苷酸(即389Elo-5-l[SEQIDNO:110])和來自BD-ClontechCreatorSMARTcDNA文庫試劑盒的通用寡核苷酸5，-PCR引物(SEQIDNO:105)組成。以50|n1總體積進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中包含1|ull:10稀釋的雙鞭藻蟲種CCMP389cDNA作為模板，每種引物(20juM)各1|a1,22ji1水和25ju1TaKaRaExTaq2X預(yù)混合物。擴(kuò)增在以下條件下進(jìn)行94。C下90sec,然后是30個循環(huán)的94°C下30see,55°C下30sec和72°C下1min,然后是72。C下7min的最終延伸。第二輪PCR擴(kuò)增釆用1jil來自第一輪PCR反應(yīng)的稀釋產(chǎn)物(l:50)作為模板。引物由基因特異性寡核苷酸(即389Elo-5-2(SEQIDNO:111))和寡核苷酸DNRCDS5'-2(SEQIDNO:112)組成。按照上文的描述進(jìn)行擴(kuò)增。在1%(w/v)瓊脂糖中電泳第二輪PCR反應(yīng)產(chǎn)物，顯示為跨200-800bp的大小范圍的分散條帶。根據(jù)制造商的方案用Qiagen凝膠純化試劑盒分離400bp-600bp之間的產(chǎn)物，克隆到pCR2.1-TOPO(Invitrogen)中，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中。在含有氨芐青霉素(100ng/mL)的LB瓊脂中選擇轉(zhuǎn)化體。對來自一個包含推定A9延伸酶cDNA的5'區(qū)的轉(zhuǎn)化體的質(zhì)粒DNA進(jìn)行序列分析，發(fā)現(xiàn)406bp的片段(即5，-cDNA片段1;SEQIDNO:14)。該片段延伸到基因的"ATG"翻譯起始密碼子附近，但起始密碼子和前20-30個氨基酸都沒有包括在SEQIDNO:14中。然后，設(shè)計額外的寡核苷酸(即389Elo-5-4(SEQIDNO:113)),用于基于5，-cDNA片段1(SEQIDNO:14)的序列通過PCR獲得基因的完整5，末端。反應(yīng)混合物和擴(kuò)增條件與上文用于第二輪PCR的相同，只是用389Elo-5-4代替了引物389Elo-5-2。當(dāng)通過瓊脂糖凝膠電泳分析時，PCR產(chǎn)物再次顯示為200-800bp的分散條帶，分離大小為200-500bp的條帶，按照上文的描述克隆和轉(zhuǎn)化。對來自一個包含推定A9延伸酶cDNA的5，區(qū)的轉(zhuǎn)化體的質(zhì)粒DNA進(jìn)行序列分析，發(fā)現(xiàn)197bp的片段(5，-cDNA片段2;SEQIDNO:15)。這包括cDNA的5，-末端和上游非翻譯區(qū)的51bp。分離雙鞭藻蟲種CCMP389A9延伸酶的3，-末端采用cDNA作為才莫板，也通過PCR擴(kuò)增推定的A9延伸酶的3，末端。方法是上文針對分離5，末端而描述的方法；但是，用于第一輪和第二輪PCR擴(kuò)增的引物示于下表11,并且用10juM代替20juM。此外，72。C下的最終延伸循環(huán)從7分鐘減少到5分鐘。表11用于3，cDNA分離的寡核苷酸引物<table>tableseeoriginaldocumentpage97</column></row><table>文庫構(gòu)建試劑盒中提供從第二輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)生約1kBDNA片段，用QiagenPCR純化試劑盒純化，克隆到pCR2.1-TOPO中，轉(zhuǎn)化并測序。一些克隆的序列分析顯示所述約1kB的DNA片段含有推定A9延伸酶cDNA的3，-區(qū)，包括聚腺普酸尾。3，-區(qū)的920bp的組裝重疊群序列示于SEQIDNO:16。從雙鞭藻蟲種CCMP389組裝全長A9延伸酶序列組裝最初的部分cDNA片段(SEQIDNO:13)、兩個5，cDNA片段(SEQIDNOs:14和15)和3，-cDNA片段(SEQIDNO:16),得到來自雙鞭藻蟲種CCMP389的A9延伸酶的完整序列，加上51bp的5，非翻譯區(qū)和662bp的3，非翻譯區(qū)(SEQIDNO:17;1504bp)。編碼區(qū)的長度是792bp，并且編碼263個氨基酸的蛋白(SEQIDNO:5)。SEQIDNO:4是雙鞭藻蟲種CCMP389△9延伸酶(本文中命名為E389D9e)的編碼序列的核苷酸序列。比較雙鞭藻蟲種CCMP389的A9延伸酶序列(E389D9e)與已知的△9延伸酶通過進(jìn)行BLAST相似性檢索，確定SEQIDNO:5(i.e.,E389D9e)與BLAST"nr"數(shù)據(jù)庫中包含的序列(實(shí)施例3)的同一性。概括了與SEQIDNO:5具有最高相似性的BLAST比較的結(jié)果是根據(jù)同一性百分比、相似性百分比和預(yù)期值來報道的。"同一性百分比"定義為在兩種蛋白之間相同的氨基酸的百分比。"相似性百分比"定義為在兩種蛋白之間相同或保守的氨基酸的百分比。"預(yù)期值，，估計了匹配的統(tǒng)計學(xué)顯著性，給匹配的數(shù)目指定特定得分，其是完全隨機(jī)在該大小的數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行檢索而預(yù)期的。因此，本文描述為SEQIDNO:5的氨基酸片段與球等鞭金藻的△9延伸酶IgD9e(SEQIDNO:8)具有38%同一性和56%相似性，預(yù)期值為2E-43。類似地，釆用ClustalV方法，E389D9e與IgD9e具有33.10/。同一性，E389D9e與EgD9e具有65.1%同一性(圖2)。采用LASERGENE生物信息計算程序組的MegAlignv6.1程序通過ClustalV方法進(jìn)行序列同一性百分比計算(Higgins,D.G.和Sharp,RM，Com/n^.^;/.A頻.，5:151-153(1989);Higgins等，C麵-.柳/.A函'.,8:189-191(1992)),其中采用逐對比對的默認(rèn)參數(shù)(KTUPLE4,GAPPENALTY=3，WINDOW=5，DIAGONALSSAVED=5和GAPLENGTHPENALTY=10)。實(shí)施例23解脂耶氏酵母表達(dá)載體pFBAIN-389Elo(包含雙鞭藻蟲種CCMP389△9延伸酶(E389D9e》在解脂耶氏酵母抹Y2224中的構(gòu)建和功能分析本實(shí)施例描述了解脂耶氏酵母表達(dá)載體pFBAIN-389Elo(包含嵌合FBAINm::E389D9e::Pex20基因)的合成。隨后確定當(dāng)在解脂耶氏酵母林Y2224中表達(dá)時E389D9e的A9延伸酶活性。構(gòu)建解脂耶氏酵母表達(dá)載體pFBAIN-389Elo用寡核苷酸389Elo-F和389Elo-Rl(分別是SEQIDNOs:116和117)作為引物，擴(kuò)增E389D9e的全長cDNA(SEQIDNO:4)。在50ju1總體積中單個進(jìn)行以雙鞭藻蟲種CCMP389cDNA(實(shí)施例21)為才莫板的PCR反應(yīng)，所述總體積中包含20juM正向和反向引物各1nl,1julcDNA，10jul5XPCR緩沖液，1|u1dNTP混合物(各10|uM),35ju1水和1ju1Phusion聚合酶(NewEnglandBiolabs,Inc.,Ipswich,MA)。98°C下擴(kuò)增1min,然后是30個循環(huán)的98°C下10sec,55°C下10sec,和72。C下30sec,然后是72。C下5min的最終延伸。用Wcol和五wl消化PCR產(chǎn)物，得到約210bp的片段，其含有△9延伸酶cDNA的5，區(qū)。也用五wl和消化，得到約600bp的片段，其含有cDNA的3，區(qū)。在1%(w/v)瓊脂糖中凝膠電泳后，純化A^coI/五wI和五arl/A^fl消化的片段。將A^coI/￡wI和the￡wI/A^I△9延伸酶消化的片段有方向地連接于iVc0I/7V0rt消化的pFBAIN-MOD國l(SEQIDNO:118),使得E389D9e基因處于解脂耶氏酵母FBAINm啟動子和PEX20-3，終止子區(qū)的控制下。具體地，連接反應(yīng)包含10jul2X連接緩沖液，1julT4DNA連接酶(Promega),約210bp和約600bp的片段各4ju1(各約300ng),和1julpFBAIN-MOD-l(約150ng)。將反應(yīng)混合物在室溫下溫育2小時，并且用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌ToplO感受態(tài)細(xì)胞(Invitrogen)。用Qiagen微量制備試劑盒回收來自轉(zhuǎn)化體的質(zhì)粒。通過限制性圖譜鑒定正確的克隆，最終構(gòu)建體命名為"pFBAIN-389Elo"。由此，pFBAIN-389Elo(圖15A;SEQIDNO:119)含有以下成分質(zhì)粒pFBAIN-389Elo(SEOIDNO:119)的成分<table>tableseeoriginaldocumentpage100</column></row><table>包含pFBAIN-389Elo的解脂耶氏酵母轉(zhuǎn)化體的功能分析按照一般方法中的描述，將pFBAIN-389Elo(包含E389D9e)和對照質(zhì)粒pFBAIN-MOD-l的五個(5個)單個克隆轉(zhuǎn)化到解脂耶氏酵母林Y2224(實(shí)施例7)中。將細(xì)胞鋪板到缺乏尿嘧啶的MM板中，30。C下保持2-3天。然后，刮掉每個板的細(xì)胞，提取脂質(zhì)，通過酯交換制備脂肪酸曱酯，隨后用Hewlett-Packard6890GC分析。GC分析顯示在所有5個包含pFBAIN-389Elo的轉(zhuǎn)化體中都產(chǎn)生EDA,而對照菌抹中不產(chǎn)生EDA(表13)。脂肪酸鑒定為18:2(LA)和20:2(EDA);每一種脂肪酸的組成以總脂肪酸的百分比表示。根據(jù)以下公式計算轉(zhuǎn)化效率([產(chǎn)物]/[產(chǎn)物+底物])*100,其中"產(chǎn)物"包括來源于其的途徑中的中間產(chǎn)物和所有產(chǎn)物。表13工程化以超量表達(dá)雙鞭藻蟲種CCMP389A9延伸酶(E389D9e〗的解脂耶氏酵母株Y2224中的脂質(zhì)組成<table>tableseeoriginaldocumentpage101</column></row><table>上面所示的結(jié)果證實(shí)本文描述為SEQIDNOs:4和5的來自雙鞭藻蟲種CCMP389的克隆cDNA有效將LA去飽和為EDA,由此作為△9延伸酶而起作用。實(shí)施例24解脂耶氏酵母表達(dá)載體pZUFE389S的構(gòu)建和功能分析，該載體包含為在解脂耶氏酵母中表達(dá)而進(jìn)行了密碼子優(yōu)化的合成的A9延伸酶基因(E389D9eS)(來源于雙鞭藻蟲種CCMP389)本實(shí)施例描述了解脂耶氏酵母載體pZUFE389的功能表達(dá)，該載體包含嵌合FBAIN::E389D9eS::Pex20基因，其中E389D9eS是來源于雙鞭藻蟲種CCMP389的合成的A9延伸酶并且為在解脂耶氏酵母中表達(dá)而進(jìn)行了密碼子優(yōu)化。因此，該分析需要(l)合成E389D9eS;(2)將pZUFE389S構(gòu)建和轉(zhuǎn)化到解脂耶氏酵母林Y2224中；和(3)分析包含pZUFE389S(表達(dá)E389D9eS)的解脂耶氏酵母抹Y2224的轉(zhuǎn)化生物體中的脂質(zhì)譜。合成E389D9eS以類似于實(shí)施例5、實(shí)施例8和PCT公開No.WO2004/101753中描述的方式，優(yōu)化雙鞭藻蟲種CCMP389的A9延伸酶基因(E389D9e;SEQIDNOs:4和5)的密碼子選擇。具體地，基于E389D9e的編碼序列(SEQIDNO:4)、根據(jù)耶氏酵母密碼子選擇模式(PCT公開No.WO2004/101753)、"ATG"翻譯起始密碼子附近的共有序列和RNA穩(wěn)定性的一般規(guī)則(Guhaniyogi，G.和J.Brewer,G隱,265(1-2):11-23(2001))設(shè)計密碼子優(yōu)化的A9延伸酶基因(命名為"E389D9eS",SEQIDNO:6)。除了修飾翻譯起始位點(diǎn)，修飾了792bp編碼區(qū)的128bp(包括終止密碼子)(16.2%),并且優(yōu)化了113個密碼子。GC含量從野生型基因(即E389D9e)中的45.7%增加到合成基因(即E389D9eS)中的50.1%。分別在翻譯起始密碼子附近和E389D9eS的終止密碼子后摻入iVco/位點(diǎn)和iVW/位點(diǎn)。圖16顯示了E389D9e和E389D9eS的核苷酸序列的比較。密碼子優(yōu)化的基因中的修飾都沒有改變編碼的蛋白的氨基酸序列(SEQIDNO:5)。由GenScript公司(Piscataway,NJ)合成設(shè)計的E389D9eS基因(SEQIDNO:6),并且克隆到pUC57(GenBank登錄號Y14837)中，產(chǎn)生pE389S(SEQIDNO:120)。制備包含E389D9eS的構(gòu)建體pZUFE389S。通過用pE389S(SEQIDNO:120)的AAco1/MfI片段代替pZUF17(圖7C;SEQIDNO:121)的OTwI片段，構(gòu)建質(zhì)粒pZUFE389S(圖15B;SEQIDNO:122)。該連接的產(chǎn)物是pZUFE389S,其由此含有以下成分表14<table>tableseeoriginaldocumentpage103</column></row><table>包含pZUFE389S的解脂耶氏酵母轉(zhuǎn)化體的功能分析按照一般方法中的描述，將質(zhì)粒pZUFE389S轉(zhuǎn)化到菌抹Y2224(來自野生型耶氏酵母抹ATCC#20362的t/ra3基因自主突變的FOA抗性突變體，實(shí)施例7)中。在MM板上選擇轉(zhuǎn)化體。30。C下生長2天后，挑選轉(zhuǎn)化體，重新劃線到新的MM板上。一旦生長，將這些菌株30。C下單個接種到3mL液體MM中，并且250rpm/min下振蕩2天。通過離心收集細(xì)胞，提取脂質(zhì)，通過酯交換制備脂肪酸甲酯，隨后用Hewlett-Packard6890GC進(jìn)行分析。GC分析顯示在所有12個轉(zhuǎn)化體中產(chǎn)生占總脂質(zhì)的約2.2%的C20:2(EDA),其中在這12個菌抹中C18:2轉(zhuǎn)化為C20:2的平均轉(zhuǎn)化效率確定為約12%(平均值；按照實(shí)施例23的描述計算)。實(shí)施例25構(gòu)建用于表達(dá)纖細(xì)眼蟲(EgD9e或EgD9eS)和/或雙鞭藻蟲種CCMP389(E389D9e或E389D9eS)△9延伸酶的替代大豆表達(dá)載體本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，上文的實(shí)施例是說明性的，而不是限制性的。例如，上文實(shí)施例10、11和13-15建立的用于表達(dá)EgD9e修飾，用于替代地能夠表達(dá)(或共表達(dá))EgD9eS,E389D9e和/或E389D9eS。設(shè)計用于在△9延伸酶的5，和3，末端導(dǎo)入位點(diǎn)的PCR引物可以用于擴(kuò)增基因。然后可以用消化得到的PCR產(chǎn)物，并且可以克隆到合適的大豆表達(dá)載體中，該載體含有Mrt位點(diǎn)，該位點(diǎn)的側(cè)翼是種子特異性強(qiáng)啟動子和轉(zhuǎn)錄終止子。按照本文或PCT公開Nos.WO2004/071467或WO2005/047479(但不限于這些)的描述進(jìn)一步亞克隆到其它載體中，將產(chǎn)生適用于在大豆中表達(dá)A9延伸酶的載體。此外，除了本文描述的基因、啟動子、終止子和基因盒，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，可以通過類似于但不限于本文針對EgD9e，EgD9eS，E389D9e和/或E389D9eS的表達(dá)所描述的方式合成其它啟動子/基因/終止子盒。類似地，可能需要表達(dá)其它PUFA基因(如下文表17描述的那些)，用于與本發(fā)明的任何A9延伸酶共表達(dá)。例如，PCT公開Nos.WO2004/071467和WO2004/071178描述了分離許多啟動子和轉(zhuǎn)錄終止子序列，用于在大豆中進(jìn)行胚特異性表達(dá)。此夕卜，PCT公開Nos.WO2004/071467、WO2005/047479和WO2006/012325描述了通過將各個啟動子、基因和轉(zhuǎn)錄終止子以獨(dú)特的組合連接在一起而合成多個啟動子/基因/終止子盒的組合。通常，用側(cè)翼于合適的啟動子(例如列于但不限于表15的那些)和轉(zhuǎn)錄終止子(例如列于但不限于表16的那些)的A^fl位點(diǎn)克隆需要的基因?？梢圆捎肞CR擴(kuò)增，用設(shè)計用于在基因的5，和3，導(dǎo)入A^I位點(diǎn)的寡核苷酸進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將A^I位點(diǎn)加入感興趣的基因，例如但不限于表17列出的那些。然后用iVWI消化得到的PCR產(chǎn)物，并且克隆到合適的啟動子/AAort/終止子盒。此外，PCT公開Nos.WO2004/071467，WO2005/047479和WO2006/012325描盒)進(jìn)一步連接在一起，以便獲得需要的表型表達(dá)。盡管這主要是用不同的限制酶位點(diǎn)進(jìn)行的，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，可以利用許多技術(shù)實(shí)現(xiàn)需要的啟動子/基因/轉(zhuǎn)錄終止子的組合。以此方式，可以實(shí)現(xiàn)胚特異性啟動子/基因/轉(zhuǎn)錄終止子盒的任何組合。本領(lǐng)域技術(shù)人員也可以理解，這些盒可以位于單獨(dú)的DNA片段或多個片段上，其中基因的共表達(dá)是多個DNA片段共轉(zhuǎn)化的結(jié)果。表15種子特異性啟動子<table>tableseeoriginaldocumentpage105</column></row><table>表16<table>tableseeoriginaldocumentpage106</column></row><table>表17<table>tableseeoriginaldocumentpage106</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage107</column></row><table>實(shí)施例26轉(zhuǎn)化大豆體細(xì)胞胚培養(yǎng)物培養(yǎng)條件可以在26。C下150rpm的旋轉(zhuǎn)振蕩器上的35mL液體培養(yǎng)基SB196(參見下文的配方)中維持大豆胚發(fā)生懸浮培養(yǎng)物(cv.Jack),其中采用60-85jaE/m2/s的光密度，16:8h日/夜的光周期。每7天-2周，通過將大約35mg組織接種到35mL新鮮的液體SB196中，對培養(yǎng)物進(jìn)行傳代培養(yǎng)(優(yōu)選的傳代培養(yǎng)間隔是每隔7天)?？梢酝ㄟ^粒子槍轟擊方法(Klein等，A^we(London),327:70-73(1987);美國專利No.4,945,050),用前面描述的質(zhì)粒和DNA轉(zhuǎn)化大豆胚發(fā)生懸浮培養(yǎng)物。可以將DuPontBiolisticPDS1000/HE儀器(氦改進(jìn)型)用于所有轉(zhuǎn)化。大豆胚發(fā)生懸浮培養(yǎng)起始大豆培養(yǎng)每個月起始兩次，每次起始之間采用5-7天的間隔。挑選具有來自種植后45-55天可獲得的大豆植物的不成熟種子的豆莢，從它們的殼中取出，放置在滅菌的洋紅色盒子中。通過在含有1滴象牙急(即95mL高壓滅菌蒸餾水+5mLClorox和1滴皂，充分混合)的5%Clorox溶液中振蕩15分鐘，給大豆種子滅菌。用兩個l升的瓶子中的滅菌蒸餾水沖洗種子，將小于4mm的種子放置在單個顯微鏡載玻片上。切除種子的小末端，將子葉擠出種皮。將子葉轉(zhuǎn)移到含有SB1培養(yǎng)基(每板25-30個子葉)的板中。用纖維膠帶包裹板，儲存8周。此后，切下次生胚，放置在SB196液體培養(yǎng)基中7天。制備用于轟擊的DNA:完整質(zhì)粒或含有感興趣的基因和選擇標(biāo)記基因的DNA質(zhì)粒片段可以用于轟擊?？梢酝ㄟ^消化的質(zhì)粒的凝膠分離獲得來自質(zhì)粒，如pKR274(ATCC保藏號PTA-4988),pKR685(ATCC保藏號PTA-6047)或pKR681(ATCC保藏號PTA-6046)和/或其它表達(dá)質(zhì)粒的片段。在每種情況下，可以將IOOpg質(zhì)粒DNA用于下文描述的0.5mL特異性酶混合中。可以用NEBuffer4(20mMTris-醋酸，10mM醋酸鎂，50mM醋酸鉀，lmM二硫蘇糖醇，pH7.9)中的^sc1(100個單位)、100^g/mLBSA和5mMP-巰基乙醇在37°C下將質(zhì)粒消化1.5小時?？梢酝ㄟ^在1%SeaPlaqueGTG瓊脂糖(BioWhitakerMolecularApplications)上凝膠電泳，分離得到的DNA片段，可以從瓊脂糖凝膠上切下含PUFA生物合成基因的DNA片段?？梢园凑罩圃焐痰姆桨?，用GELase⑧消化酶從瓊脂糖純化DNA?；蛘撸梢允褂猛暾|(zhì)?；蛲暾|(zhì)粒與片段的組合?？梢詫⒑?mg金粒子(3mg金)的50yL無菌蒸餾水等分物加入5uL1ing/juLDNA溶液(按照上文的描述制備的質(zhì)?；駾NA片段)，50jLiL2.5MCaCl2和20juLof0.1M亞精胺。以渦旋振蕩器的水平3將混合物振蕩3分鐘，在臺式離心機(jī)中離心10秒。用400nL100%乙醇洗滌后，通過在40juL100%乙醇中超聲處理，懸浮沉淀物。將5iuLDNA懸浮液分散到BiolisticPDS1000/HE儀器盤的每個飛行盤上。每5pL等分物含有用于每次轟擊(如每盤)的大約0.375mg金。組織制備和用DNA轟擊將大約150-200mg7日齡胚懸浮培養(yǎng)物置于空的、無菌60x15mm培養(yǎng)皿中，用塑料篩網(wǎng)覆蓋培養(yǎng)皿。用設(shè)置為1100PSI的膜爆裂壓和抽真空到27-28英寸汞柱的真空的室，以每板1-2次射擊，轟擊組織。將組織放置在距離保留/終止篩大約3.5英寸。選擇轉(zhuǎn)化的胚用潮霉素(當(dāng)潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶(HPT)基因用作選擇標(biāo)記時)或氯磺隆(Chlorsulfuron)(即，當(dāng)乙酰乳酸合酶(ALS)基因用作選擇標(biāo)記時)選擇轉(zhuǎn)化的胚。潮霉素(HPT)選擇轟擊后，將組織放置在新的SB196培養(yǎng)基中，按照上文的描述培養(yǎng)。轟擊后6天，將SB196用含有30mg/L潮霉素選擇劑的SB196交換。選擇培養(yǎng)基每周更新。選擇后4-6周，可以觀察到從未轉(zhuǎn)化的壞死胚發(fā)生簇中長出綠色的轉(zhuǎn)化組織。取出分離的綠色組織，接種到多孔板中，產(chǎn)生新的、克隆繁殖的、轉(zhuǎn)化的胚發(fā)生懸浮培養(yǎng)物。氯磺隆(ALS)選擇轟擊后，在含有新的SB196培養(yǎng)基的兩個燒瓶中分裝組織，按照上文的描述培養(yǎng)。轟擊后6-7天，將SB196用含有100ng/L氯磺隆選擇劑的SB196交換。選擇培養(yǎng)基每周更新。選擇后4-6周，可以觀察到從未轉(zhuǎn)化的壞死胚發(fā)生簇中長出綠色的轉(zhuǎn)化組織。取出分離的綠色組織，接種到含有SB196的多孔板中，產(chǎn)生新的、克隆繁殖的、轉(zhuǎn)化的胚發(fā)生懸浮培養(yǎng)物。將大豆體細(xì)胞胚再生為植物為了從胚發(fā)生懸浮培養(yǎng)物獲得完整植物，需要進(jìn)行組織再生。胚成熟在26。C下，在SB196中，在冷白色熒光(Phillips冷白色EconowattF40/CW/RS/EW)和氬(PhillipsF40Agro)燈泡(40瓦)下，以16:8小時光周期，光強(qiáng)度90-120|uE/m2s，按照上文的描述在多孔板中將來自生產(chǎn)轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化胚發(fā)生簇培養(yǎng)4-6周(模型系統(tǒng)是1-3周)。此后，將胚簇轉(zhuǎn)移到固體瓊脂培養(yǎng)基SB166中持續(xù)1-2周(模型系統(tǒng)是1周)，然后在SB103培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)2-4周，成為成熟的胚。在板上的SB103中成熟后，從簇中取出單個的胚，干燥，篩選，用于按照上文的描述改變它們的脂肪酸組成。當(dāng)需要時，按照下文的描述從一些事件獲得植物?；蛘?，在一些模型系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)中，用改進(jìn)的程序使胚在大豆組織分化和成熟液體培養(yǎng)基(SHaM液體培養(yǎng)基；Schmidt等，Ce〃S/o/ogy和Mo^/wge"e^s24:393(2005))中成熟。簡言之，按照上文在SB196中選擇4周后，將胚簇轉(zhuǎn)移到250mLErlenmeyer燒瓶中的35mLSB228(SHaM液體培養(yǎng)基)中。26°C下將組織保持在130rpm的旋轉(zhuǎn)振蕩器上的SHaM液體培養(yǎng)基中，采用冷白色熒光，16:8hr光/暗光周期，光強(qiáng)度是60-85yE/m2/s，持續(xù)2-3周，使胚成熟。在SHaM液體培養(yǎng)基中生長2-3周的胚在大小和脂肪酸含量方面與在SB166/SB103上培養(yǎng)5-8周的胚相同。在SHaM液體培養(yǎng)基中成熟后，從蔟中取出單個的胚，干燥，篩選，用于按照上文的描述改變它們的脂肪酸組成。當(dāng)需要時，按照下文的描述從一些事件獲得植物。胚干燥和萌芽通過放置在空的小培養(yǎng)皿(35x10mm)中大約4-7天，可以干燥成熟的單個的胚。用纖維膠帶密封平板(產(chǎn)生小的濕室)。可以將干燥的胚種植在SB71-4培養(yǎng)基中，其中使它們在上文描述的相同培養(yǎng)條件下萌芽。從萌芽培養(yǎng)基上取出萌芽的幼苗，用水徹底沖洗，然后種植在透明塑料圓頂覆蓋的24室包裝盤中的Redi土壤中。兩周后，取下圓頂，使植物強(qiáng)化一周。如果幼苗看起來是強(qiáng)化的，則將它們移植到10英寸罐的Redi土:t裏中，每罐最多3個幼苗。10-16周后，可以收獲成熟的種子，切碎，按照上文進(jìn)行脂肪酸分析。培養(yǎng)基配方SB196FN滴鹽液體增殖培養(yǎng)基〖每升)MSFeEDTA-100x儲液110mLMS》危酸鹽-10(^^|液210mLFN低鹽卣化物-100x儲液310mLFN4氐鹽P，B,Mo-10(^^諸液410mL維生素B5(1mL/L)1.0mL2,4-D(10mg/L終濃度)1.0mLKN032.83gm(NH4)2S040.463gm天冬酰胺1.0gm蔗糖(1%)pH5.810gmFN低鹽儲液儲液編號1000mL1-MSFeEDTA100x儲液Na2EDTA*3.724gFeS047H202.784g*首先添加，攪拌下溶解在暗瓶中500mL1.862gl，g2MS辟u酸鹽lOOx儲液MgS04-7H2037.0g18.5gMnS04-H201.69g0.845gZnS04-7H200.86g0,43gCuS04-5H200.0025g0.00125g;FN低鹽卣化物lOOx儲液CaCl2-2H2030.0g15.0gKI0.083g0.0715gCoCl2-6H200.0025g0.00125g4FN寸氐鹽P,B,MolOOxj渚液KH2P0418.5g9.25gH3B〇30.62g0.31gNa2Mo04-2H200.025g0.0125gSBl固體培養(yǎng)基〖每升)1包MS鹽(Gibco/BRL-目錄號)，1mL維生素B51000X儲液，31.5g嚴(yán)糖，2mL2,4-D(20mg/L終濃度)，pH5,7，8gTC瓊脂SB166固體培養(yǎng)基(每升)1包MS鹽(Gibco/BRL-目錄號)，1mL維生素B51000X儲液，60g麥芽糖，750mgMgCl2六水合物，5g活性m炭，pH5.7,2g脫乙酰吉蘭^f唐月交SB103固體培養(yǎng)基(每升〗1包MS鹽(Gibco/BRL誦目錄號)，1mL維生素B51000X儲液，60g麥芽糖，750mgMgC12六水合物，pH5.7,2g脫乙酰吉蘭糖膠SB71-4固體培養(yǎng)基(每升)1瓶Gamborg的B5鹽w/蔗糖(Gibco/BRL目錄號21153-036),pH5.7,5gTC瓊月旨2,4-D儲液從Phytotech目錄號D295獲得預(yù)制品-濃度1mg/mL維生素B5儲液(每100mL):10g肌醇,100mg煙酸，100mg吡噴醇HC1,lg硫胺。-20。C下儲存等分物；如果溶液不能足夠快地溶解，則通過熱攪拌板施加低水平的熱。氯石黃隆^(渚液lmg/mL，溶于0.01N氫氧化銨為了i秀導(dǎo)體細(xì)月包胚，可以將/人大豆品種A2872的表面滅菌的未成熟種子解剖出的3-5mm長的子葉在26。C下在合適的瓊脂培養(yǎng)基上在光或暗條件下培養(yǎng)6-10周。然后，切下產(chǎn)生次生胚的體細(xì)i包胚，放置在合適的液體培養(yǎng)基中。重復(fù)選擇作為早期球形階段胚而增殖的體細(xì)胞胚的簇后，按照下文的描述保持懸浮液?？梢?6。C下在150rpm的旋轉(zhuǎn)振蕩器上的35mL液體培養(yǎng)基中保持大豆胚發(fā)生懸浮培養(yǎng)物，其中采用16:8h日/夜方案的熒光。通過將大約35mg組織接種在35mL液體培養(yǎng)基中，每兩周對培養(yǎng)物進(jìn)行一次傳代培養(yǎng)。然后可以通過粒子槍轟擊方法(Klein等，A^we(London),327:70-73,美國專利No.4,945,050)，轉(zhuǎn)化大豆胚發(fā)生懸浮培養(yǎng)物?？梢詫uPontBiolisticPDS1000/HE儀器(氦改進(jìn)型)用于這些轉(zhuǎn)化?？梢杂糜诖龠M(jìn)大豆轉(zhuǎn)化的選擇標(biāo)記基因是包含花椰菜花葉病毒的35S啟動子(Odell等，A^wre,313:810-812(1985))、質(zhì)粒pJR225(來自大腸桿菌；Gritz等，G,，25:179-188(1983))的潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶基因和來自根癌土壤桿菌的Ti質(zhì)粒的T-DNA的胭脂堿合酶基因的3，區(qū)的重組DNA構(gòu)建體。包含菜豆蛋白5'區(qū)、編碼本發(fā)明的多肽的片段和菜豆蛋白3'區(qū)的種子表達(dá)盒可以作為限制性片段分離。然后可以將該片段插入攜帶標(biāo)記基因的載體的獨(dú)特限制位點(diǎn)。在50iuL60mg/mLlium金粒子懸浮液中"姿順序)加入以下成分5inLDNA(ljug/juL),20juL亞精胺(O.lM),和50|uLCaCl2(2.5M)。然后將粒子制劑攪拌3分鐘，在微量離心機(jī)中離心IO秒，除去上清液。然后在400juL70。/。乙醇中將DNA包凈皮的粒子洗滌一次，重新懸浮于40yL無水乙醇中?？梢詫NA/粒子懸浮液超聲處理3次，每次1秒。然后將5juLDNA包被的金粒子加入每個大載體盤。將大約300-400mg兩周齡的懸浮培養(yǎng)物置于空的60x15mm培養(yǎng)亞中，用移液管從組織除去殘留液體。對于每個轉(zhuǎn)化實(shí)^^,通常轟擊大約5-10個平板的組織。膜爆裂壓設(shè)置為1100psi，室抽真空到28英寸汞柱的真空。將組織放置在距離保留篩大約3.5英寸并轟擊3次。轟擊后，可以將組織分成兩半，放置到液體中，按照上文培養(yǎng)。轟擊后5-7天，可以用新鮮培養(yǎng)基更換液體培養(yǎng)基，并且在轟擊后11-12天，用含有50mg/mL潮霉素的新培養(yǎng)基更換?？梢悦恐芨鼡Q該選擇培養(yǎng)基。選擇后7-8周，可以觀察到從未轉(zhuǎn)化的壞死胚發(fā)生簇中長出綠色的轉(zhuǎn)化組織。取出分離的綠色組織，接種到各個燒瓶中，產(chǎn)生新的、克隆繁殖的、轉(zhuǎn)化的胚發(fā)生懸浮培養(yǎng)物。每個新的細(xì)胞系作為獨(dú)立轉(zhuǎn)化事件處理。然后可以傳代培養(yǎng)并且作為未成熟胚的簇保持這些懸浮液，通過單個體細(xì)胞胚的成熟和萌芽，再生為完整植物。權(quán)利要求1.選自下組的分離的多核苷酸(a)分離的核酸序列，包含編碼具有Δ9延伸酶活性的多肽的核苷酸序列，其中基于ClustalV比對方法，所述多肽與SEQIDNO2或SEQIDNO5所示氨基酸序列相比，具有至少70％氨基酸同一性；(b)分離的核酸序列，包含編碼具有Δ9延伸酶活性的多肽的核苷酸序列，其中基于BLASTN比對方法，所述核苷酸序列與SEOIDNO1、SEQIDNO3、SEQIDNO4或SEQIDNO6所示核苷酸序列相比，具有至少70％序列同一性；(c)分離的核酸序列，包含編碼具有Δ9延伸酶活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列在以下嚴(yán)格雜交條件下與SEQIDNO1、SEQIDNO3、SEQIDNO4或SEQIDNO6所示核苷酸序列雜交0.1XSSC，0.1％SDS，65℃，并且用2XSSC，0.1％SDS洗滌，隨后用0.1XSSC，0.1％SDS洗滌；或(d)上述(a)、(b)或(c)的核苷酸序列的互補(bǔ)序列，其中所述互補(bǔ)序列和所述核苷酸序列由相同數(shù)目的核苷酸組成，并且是100％互補(bǔ)的。2.權(quán)利要求1的多核苷酸，其中所述核苷酸序列包含SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4或SE(^IDNO:6。3.權(quán)利要求2的多核苷酸，選自SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4或SEQIDNO:6。4.A9延伸酶多肽，其中所述多肽的氨基酸序列選自下組(a)SEQIDNO:2或SEQIDNO:5所示的氨基酸序列；和(b)通過至少一個保守氨基酸取代而與(a)的氨基酸序列不同的氨基酸序列。5.分離的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，包含權(quán)利要求1的分離的核酸序列。6.權(quán)利要求5的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞選自藻類、細(xì)菌、酵母、卵菌和真菌。7.權(quán)利要求6的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞是選自下組的真菌破嚢壺菌種、裂殖壺菌種和被孢霉種。8.權(quán)利要求6的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，其中所述酵母是含油酵母。9.權(quán)利要求8的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，其中所述含油酵母選自耶氏酵母屬，假絲酵母屬，紅酵母屬，紅冬孢屬，隱球酵母屬，絲孢酵母屬和油脂酵母屬。10.權(quán)利要求9的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，其中所述酵母是耶氏酵母種。11.權(quán)利要求10的轉(zhuǎn)化的酵母，其中所述耶氏酵母種選自解脂耶氏酵母ATCC#20362、解脂耶氏酵母ATCC#8862、解脂耶氏酵母ATCC#18944、解脂耶氏酵母ATCC#76982和解脂耶氏酵母LGAMS(7)l。12.生產(chǎn)二十碳二烯酸的方法，包括a)提供分離的轉(zhuǎn)化的酵母宿主細(xì)胞，其包含i)分離的多核苷酸序列，編碼具有A9延伸酶活性的多肽，所述多核苦酸序列選自(1)分離的核酸序列，包含編碼具有A9延伸酶活性的多肽的核香酸序列，其中基于ClustalV比對方法，所述多肽與SEQIDNO:2或SEQIDNO:5所示氨基酸序列相比，具有至少70%氨基酸同一性；(2)分離的核酸序列，包含編碼具有A9延伸酶活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核普酸序列在以下嚴(yán)格雜交條件下與SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4或SEQIDNO:6所示核苷酸序列雜交O.IXSSC，0.1%SDS,65。C,并且用2XSSC,0.1%SDS洗滌，隨后用O.IXSSC,0.P/。SDS洗滌；和(ii)亞油酸的來源；b)在表達(dá)編碼△9延伸酶多肽的核酸序列并且將亞油酸轉(zhuǎn)化為二十碳二烯酸的條件下使步驟(a)的酵母宿主細(xì)胞生長；以及c)任選回收步驟(b)的二十碳二烯酸。13.生產(chǎn)二十碳三烯酸的方法，包括a)提供分離的轉(zhuǎn)化的酵母宿主細(xì)胞，其包含i)分離的多核苷酸序列，編碼具有A9延伸酶活性的多肽，所述多核苷酸序列選自(1)分離的核酸序列，包含編碼具有A9延伸酶活性的多肽的核普酸序列，其中基于ClustalV比對方法，所述多肽與SEQIDNO:2或SEQIDNO:5所示氨基酸序列相比，具有至少70%氨基酸同一性；(2)分離的核酸序列，包含編碼具有A9延伸酶活性的多肽的核苦酸序列，其中所述核苷酸序列在以下嚴(yán)格雜交條件下與SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4或SEQIDNO:6所示核苷酸序列雜交0.1XSSC,0.1%SDS,65。C,并且用2XSSC，0.1%SDS洗滌，隨后用0.1XSSC,0.1。/。SDS洗滌；和(ii)oc-亞麻酸的來源；b)在表達(dá)編碼A9延伸酶多肽的核酸序列并且將oc-亞麻酸轉(zhuǎn)化為二十碳三烯酸的條件下使步驟(a)的宿主細(xì)胞生長；以及c)任選回收步驟(b)的二十碳三烯酸。14.權(quán)利要求12或13的方法，其中所述編碼A9延伸酶多肽的分離的多核普酸序列編碼包含SEQIDNO:2或SEQIDNO:5所示氨基酸序列的多肽。15.權(quán)利要求14的方法，其中所述編碼A9延伸酶多肽的分離的多核苷酸序列選自a)SEQIDNO:5,其中至少113個密碼子為在耶氏酵母中表達(dá)而進(jìn)行了密碼子優(yōu)化；和b)SEQIDNO:2,其中至少106個密碼子為在耶氏酵母中表達(dá)而進(jìn)行了密碼子優(yōu)化。16.由權(quán)利要求6的宿主細(xì)l包生產(chǎn)的微生物油。17.包含有效量的權(quán)利要求16的微生物油的食品。18.權(quán)利要求17的食品，選自食物類似物、肉類產(chǎn)品、谷物產(chǎn)品、供烤食品、快餐食品和乳制品。19.一種產(chǎn)品，選自包含有效量的權(quán)利要求16的微生物油的醫(yī)學(xué)食品、營養(yǎng)補(bǔ)充物、嬰兒配方和藥物。20.包含有效量的權(quán)利要求16的微生物油的動物飼料。21.權(quán)利要求20的動物飼料，其中所述動物飼料選自寵物飼料、反芻動物飼料、禽類飼料和水產(chǎn)養(yǎng)殖飼料。全文摘要本發(fā)明涉及Δ9延伸酶，其具有將亞油酸[18:2，LA]轉(zhuǎn)化為二十碳二烯酸[20:2，EDA]的能力。公開了包含編碼Δ9延伸酶的核酸片段和包含所述片段的重組構(gòu)建體，以及制備用這些Δ9延伸酶在植物和含油酵母中制備長鏈多不飽和脂肪酸(PUFAs)的方法。文檔編號C12N9/10GK101365788SQ200680051550公開日2009年2月11日申請日期2006年11月16日優(yōu)先權(quán)日2005年11月23日發(fā)明者B·麥戈尼格爾,H·G·達(dá)穆德,Q·Q·朱,Z·薛申請人:納幕爾杜邦公司