專利名稱：血管生成性酪氨酰tRNA合成酶組合物和方法
血管生成性酪氨酰tRNA合成酶組合物和方法相關(guān)申請的交叉援引本申請要求2005年12月2日提交的專利系列號為60/741,580的美 國臨時申請的利益，該臨時申請通過援31并入本文。政府利益申述在此描述的工作的 一部分由國家衛(wèi)生研究院基金號CA92577資助。 美國政府在本發(fā)明中享有一定的權(quán)利。發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及血管生成性酪氨酰tRNA合成酶(TyrRS)組合物。更具體 的說本發(fā)明涉及血管生成性TyrRS蛋白變體和其血管生成片段，以及由 此刺激血管生成的方法。發(fā)明背景氨基酰基-tRNA合成酶是催化作為蛋白質(zhì)合成第 一 步的氨基酸加載 到關(guān)聯(lián)tRNA上的必需酶。這些必需酶根據(jù)獨特序列基序的存在以及催 化結(jié)構(gòu)域的整體結(jié)構(gòu)分為兩種類型。I類合成酶在其十個成員的催化結(jié) 構(gòu)域中具有兩個高度保守的氨基酸基序，即序列HIGH(SEQ ID NO: l)和 KMSKS(SEQIDNO:2)。相反，II類合成酶具有三個高度簡并的序列基 序，稱為基序1-3。在過去的二十年中，tRNA合成酶的一些附加功能被 發(fā)現(xiàn)，包括RNA剪接、核輸出以及調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄。在這些古老的酶的 長期進(jìn)化中獲得了這些附加功能。許多這些附加功能是附加結(jié)構(gòu)域的結(jié) 果，這些結(jié)構(gòu)域已經(jīng)和核心的合成酶序列融合。在高等真核生物中，兩 種合成酶的附加結(jié)構(gòu)域已經(jīng)證明具有與核心酶功能無關(guān)的生物學(xué)功能。 例如，兩種人類tRNA合成酶，即酪氨酰-tRNA合成酶(TyrRS)和色氨酰 基-tRNA合成酶(TrpRS),的片段已經(jīng)證明具有細(xì)胞因子樣活性。人類 TrpRS的兩個相關(guān)片段，稱為微型-TrpRS ( mmi-TrpRS )和T2-TrpRS, 是血管生成的負(fù)調(diào)節(jié)物。人類TyrRS(SEQ ID NO: 3)可被容易地分成兩 個活性片段。C末端附加結(jié)構(gòu)域片段具有類似于促炎細(xì)胞因子內(nèi)皮-單核細(xì)胞-活化多肽II(EMAPII)的活性，而N末端片段(微型-TyrRS, SEQ ID NO: 3殘基l-364)誘導(dǎo)血管生成。血管生成是嚴(yán)密調(diào)節(jié)的過程，其中必須維持促血管生成和抗血管生 成的因子之間的縝密平衡。該平衡破壞導(dǎo)致過度或不足的血管生長，與 諸如老年性黃斑變性、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、傷口愈合遲緩及許多其它狀況 的疾病有關(guān)。調(diào)控通過各種過程包括轉(zhuǎn)錄和翻譯控制、翻譯后修飾以及 配體加工來得以控制。其它的促血管生長細(xì)胞因子，包括腫瘤壞死因子 -a和肝細(xì)胞生長因子，是由前體蛋白的蛋白水解切割而產(chǎn)生的。類似的， 蛋白酶切割由人類TrpRS和TyrRS釋放出活性細(xì)胞因子片段。高等真核生物的TrpRS和TyrRS酶由核心催化區(qū)域組成，包括具有 許多a巻曲和散布的卩片層節(jié)段的Rossmann折疊。人類TyrRS的 Rossmann折疊催化結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO: 3的殘基1至230)包括在 Rossmann折疊區(qū)域的a5巻曲和反密碼子識別結(jié)構(gòu)域的a14巻曲之間的 氳鍵連接(tether)(見圖3底部和圖4頂部)。該連接部分地阻止了在該 蛋白活性位點結(jié)構(gòu)域a5巻曲中的Glu-Leu-Arg (ELR)基序。人類TyrRS和TrpRS的催化結(jié)構(gòu)域均與它們各自相應(yīng)的細(xì)菌和低等 真核生物酶的催化結(jié)構(gòu)域同源，各自附加C末端或N末端延伸。人類 TyrRS的C末端延伸與促炎細(xì)胞因子EMAP II有大約51%的序列同一 性。在每種情況中，全長的酶雖有合成酶功能，但無細(xì)胞因子活性。當(dāng) 高等真核生物特有的延伸被移除時，酶變成能夠控制血管生成的活性細(xì) 胞因子。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，相對于天然人類TyrRS的以下巻曲的間隔，打開 Rossmann折疊結(jié)構(gòu)域的a5巻曲和反密碼子(anticodon)識別結(jié)構(gòu)域的a14 巻曲之間的間隔使該蛋白具有血管生成作用。本發(fā)明提供TyrRS蛋白變 體和其片段，它們可用于在哺乳動物組織中刺激血管生成。發(fā)明概述本發(fā)明提供一種生物活性的TyrRS多肽變體，和其血管生成片段 (angiogenic fragments)(在此統(tǒng)稱為"TyrRS多肽變體")，它們適用于在 哺乳動物組織中刺激血管生成(angiogenesis)。本發(fā)明的分離的酪氨酰 tRNA合成酶(TyrRS)多肽變體包含Rossmann折疊結(jié)構(gòu)域或其部分；反 密碼子(anticodon)識別結(jié)構(gòu)域或其部分；以及包括相對于人類TyrRS氨基酸殘基序列(SEQ ID NO: 3)的至少一個非保守氨基酸殘基取代。該變 體顯示的血管生成活性大于天然的人類TyrRS的血管生成活性。優(yōu)選 地，本發(fā)明的TyrRS多肽變體具有相對于人類TyrRS的氨基酸殘基序列 (SEQ ID NO: 3)的至少50%的氨基酸殘基序列同 一性，更優(yōu)選地至少 80%的序列同一性，最優(yōu)選地，與SEQIDNO: 3相比至少大約95%的序 列同一性。優(yōu)選地，該TyrRS多肽變體包括在對應(yīng)于SEQ ID NO: 3的 位置46、 340、以及341的一個或多個位置上的氨基酸殘基的非保守氨 基酸殘基取代。在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的TyrRS多肽變體包含Rossmann折疊 區(qū)域或其部分，其包括a5巻曲，以及反密碼子識別結(jié)構(gòu)域或其部分， 包括a14巻曲。TyrRS多肽變體具有相對于人類TyrRS的氨基酸殘基序 列(SEQIDNO:3，圖l)的至少大約50%的氨基酸殘基序列同一性。相對 于人類TyrRS的氨基酸殘基序列，該變體包括至少一個非保守的氨基酸 殘基取代，其打開了(open up)在a5巻曲和a14巻曲之間的分隔 (separation),相對于天然的人類TyrRS的a5巻曲和a 14巻曲之間的分 隔而言。優(yōu)選地，在該變體的三級結(jié)構(gòu)中該a14巻曲與a5巻曲至少有 大約6埃的間隔，這是由a14巻曲的任一氨基酸殘基的a碳和a5巻曲 中的任一氨基酸殘基的a碳之間的空間間隔決定的。該變體優(yōu)選在a5 巻曲和al4巻曲之間沒有氫鍵。在本發(fā)明的TyrRS多肽變體的另 一個優(yōu)選實施方案中，a5巻曲包 括ELR基序，在該變體的三級結(jié)構(gòu)中a14巻曲與a5巻曲的ELR基序至 少有大約6埃的距離，這是由a14巻曲的任一氨基酸殘基的a碳和a5 巻曲的ELR基序的Y壬一氨基酸殘基的a -l之間的空間間隔(spatml separation)決定的。在該多肽三級結(jié)構(gòu)的外面部分存在暴露的ELR基序。 該TyrRS多肽變體具有與人類TyrRS氨基酸殘基序列(SEQ ID NO: 3, 圖l)相比至少大約50%的氨基酸殘基序列同一性，并包括相對于人類 TyrRS的氨基酸殘基序列的至少一個非保守的氨基酸殘基取代，消除了 該TyrRS多肽變體中a5巻曲的ELR基序和a14巻曲的氨基酸殘基之間 的氫鍵的形成，或者以其它方式使該變體三級結(jié)構(gòu)中的ELR基序得以暴洛。在另 一個優(yōu)選實施方案中，該TyrRS多肽變體包括在相當(dāng)于SEQ ID NO: 3的位置46、 340和341的一個或多個位置上的氨基酸殘基的非保守氨基酸殘基取代。 一種特別優(yōu)選的取代是在相當(dāng)于SEQ ID NO: 3的 341位的酪氨酸上使用具有脂肪族側(cè)鏈的氨基酸殘基，優(yōu)選非極性脂肪 族側(cè)鏈，如丙氨酸殘基進(jìn)行的氨基酸替代。本發(fā)明的TyrRS變體適用于在哺乳動物(例如，人類)組織中刺激血 管生成。本發(fā)明還提供了通過使本發(fā)明的TyrRS多肽變體接觸組織而在哺 乳動物的組織中刺激血管生成和內(nèi)皮細(xì)月包遷移的方法，如本文所述。附圖簡述

圖1顯示了人類TyrRS的氨基酸殘基序列(SEQ ID NO: 3)。 圖2顯示了本發(fā)明優(yōu)選的人類TyrRS變體的氨基酸殘基序列(SEQ ID NO: 4)。圖3(頂部)顯示了野生型人類TyrRS序列的示意圖，由3個結(jié)構(gòu)域 組成Rossmann折疊催化結(jié)構(gòu)域(黃色，殘基1-230)，反密碼子識別結(jié) 構(gòu)域(綠色，殘基231-364)和C末端結(jié)構(gòu)域(紫色，殘基364-528)。頭兩 個結(jié)構(gòu)域形成具有活性的核心酶，被稱作微型TyrRS(mmi TyrRS)(殘基 1-364)。底部顯示了人類TyrRS的二聚物才莫型，該才莫型基于微型TyrRS 和C-結(jié)構(gòu)域的晶體結(jié)構(gòu)，是由實驗確定的。圖4(頂部)顯示ELR區(qū)域與其它的殘基相互作用的細(xì)節(jié)，包括 Y341。底部則顯示了來自于多種生物TyrRS的部分序列比對，其中相當(dāng) 于人類TyrRS三個結(jié)構(gòu)域的殘基被比對，即殘基39-55(區(qū)域1),殘基 87-97(區(qū)域2)，殘基337-346(區(qū)域3)。參與結(jié)構(gòu)域接觸(contacts)的保守 殘基被突出顯示。第1行包括人類TyrRS的氨基酸殘基，其中區(qū)域1對應(yīng) SEQ ID NO: 5,區(qū)域2對應(yīng)SEQ ID NO: 6,區(qū)域3對應(yīng)SEQ ID NO: 7。第 2行顯示了鼠TyrRS的比對，其中如人類TyrRS —樣，區(qū)域1對應(yīng)SEQ ID NO: 5,區(qū)域2對應(yīng)SEQIDNO: 6,區(qū)域3對應(yīng)SEQ ID ID NO: 7。第 3行顯示牛TyrRS的比對，其中區(qū)域1對應(yīng)SEQ ID NO: 5,區(qū)域2對應(yīng) SEQ ID NO: 8,區(qū)域3對應(yīng)SEQ ID NO: 9。第4行顯示果蠅(Dmyo/7/n7a we/朋og仏"e。TyrRS的比對，其中區(qū)域1對應(yīng)SEQ ID NO: 5,區(qū)域2對 應(yīng)SEQIDNO: 10，區(qū)域3對應(yīng)SEQIDNO: 11。第5行顯示了秀麗線蟲 (C廳o,/m論m e/eg—的TyrRS的比對，其中區(qū)域1對應(yīng)SEQ ID NO: 12，區(qū)域2對應(yīng)SEQ ID NO: 13,區(qū)域3對應(yīng)SEQ ID ID NO: 14。第64亍顯示了釀酒酵母(5"acc/z"ra附j(luò)/c^ ce^ ww"^的TyrRS的比7于，其中區(qū) 域1對應(yīng)SEQ ID NO: i5,區(qū)域2對應(yīng)SEQ ID NO: 16,區(qū)域3對應(yīng)SEQ ID ID NO: 17。第7行顯示了裂殖酵母(^acc/zaTO/^c^ / ow6ej TyrRS的 比對，其中區(qū)域1對應(yīng)SEQIDNO: 18,區(qū)域2對應(yīng)SEQ ID NO: 19,區(qū) 域3對應(yīng)SEQ ID ID NO: 20。第8行顯示大腸桿菌(&c/zehc/na co//) TyrRS的比對，其中區(qū)域1對應(yīng)SEQ ID NO: 21 ，區(qū)域2對應(yīng)SEQ ID NO: 22,區(qū)域3對應(yīng)SEQ ID NO: 23 。第9行顯示枯草芽孢桿菌fB""〃w w&z7^ TyrRS的比對，其中區(qū)域1對應(yīng)SEQ ID NO: 24,區(qū)域2對應(yīng)SEQ ID NO: 25,區(qū)域3對應(yīng)SEQIDNO:26。圖5顯示了對人類TyrRS和TyrRS-Y341A的X射線散射分布。對 人類TyrRS和TyrRS的Y341A突變，采用它們測量出的小角度X射線 散射(SAXS)曲線來計算電子對距離分布函數(shù)。對兩個分子，旋轉(zhuǎn)半徑 (Radius of Gyration)(Rg)和最大距離(D咖x)被計算出。Y341A具有的Rg 比野生型TyrRS的要大大約4埃，Dm^比野生型TyrRS的要大大約20 埃(angstrom)。圖6圖解說明Y341A突變在整個人類TyrRS三級結(jié)構(gòu)上的開口效 果(openmg effect),它暴露了ELR基序。通過SAXS分析和蛋白酶消化 研究確證了 Y341A突變，以開放TyrRS結(jié)構(gòu)，如圖所示。圖7說明了 TyrRS-Y341A在小鼠基質(zhì)膠(Matrigel)血管生成模型中 的活性。小鼠接受400(iL生長因子減少的基質(zhì)膠的單獨皮下注射，或與 250nM TyrRS蛋白混合注射。人類VEGF^(20nM)作為陽性對照。五天 培養(yǎng)之后，小鼠被靜脈內(nèi)注射熒光素標(biāo)記的內(nèi)皮結(jié)合凝集素 (fluorescein-labeled endothelial binding lectin) G",m力(Bandeiraea) 5"w^"c'〖/b/w I、同工凝集素(isolectin)B4。栓(plugs)一皮切下、溶解并通過 光譜測定法評定熒光素含量。打開的TyrRS-Y341A變體被觀察到具有相 對于野生型TyrRS的增加的血管生成活性。圖8顯示了人類TyrRS和TyrRS-Y341A在雞尿嚢絨膜試-驗(chick chorioallantoic membrane assay)中的活性。使用雞尿嚢絨月莫試-驗測定 TyrRS蛋白在體內(nèi)的血管生成活性。TyrRS變體(l(iM)、由VEGF和bFGF 的組合組成的陽性對照以及由單獨的緩沖液組成的陰性對照^皮用于尼 龍網(wǎng)lt嵌的月交原氺反(nylon mesh-imbedded collagen onplant)中的CAM。圖9顯示了使用本發(fā)明TyrRS變體和對照處理的受損內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)物中剩余無細(xì)月包區(qū)域(remaining cells-free area)相對于初始損傷區(qū)域 (area of the initial wound)的百分比面積(area)(縱軸)圖。優(yōu)選實施方案的詳細(xì)描述蛋白質(zhì)中的氨基酸殘基已經(jīng)按不同的方法進(jìn)行了分類，主要基于氨 基酸側(cè)鏈所賦予的物理化學(xué)特征。例如， 一種通常的分類包括三類氨基 酸(l)疏水(非極性)氨基酸，包括甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、 脯氨酸、曱硫氨酸、異亮氨酸基和亮氨基酸；(2)帶電氨基酸，包括天冬 氨酸、谷氨酸、賴氨酸和精氨酸；以及(3)極性氨基酸，包括絲氨酸、蘇 氨酸、酪氨酸、組氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和色氨酸；甘 氨酸有時被包括入第四類，只有它自己(見Chapter 1 of Branden and Tooze, to /Voto'w 5V^w"w/^, Second Edition, GarlandPublishing, Inc. 1998, pages 3-12，其通過援引并入本文)。氨基酸殘基還可以根據(jù)它們的側(cè)鏈?zhǔn)侵咀暹€是芳香族、小或大、 極性的或非極性的、帶電或不帶電、其組合等等進(jìn)一步地分類。如在此 使用的，非極性脂肪族氨基酸包括甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨基酸、 異亮氨酸、甲硫氨酸和脯氨酸；不帶電的大的(bulky)氨基酸包括酪氨酸、 色氨酸、苯丙氨酸、亮氨基酸、異亮氨酸基和曱硫氨酸；小的(small)非 極性氨基酸包括甘氨酸、丙氨酸和脯氨酸。如在此和附加的權(quán)利要求中使用的術(shù)語"非保守的"，當(dāng)用于氨基 酸殘基取代時，表示在野生型或天然蛋白中的氨基酸殘基被明顯不同的 結(jié)構(gòu)類別的氨基酸殘基取代，例如具有明顯不同的極性分類(即非極性對 極性)、大小分類、帶電性分類、其組合等等。例如，對于非保守性替 換，極性氨基酸比如酪氨酸可被非極性氨基酸、相對小的非極性氨基酸 等等取代；而小的非極性氨基酸比如甘氨酸或丙氨酸可被大的氨基酸、 帶電氨基酸等等取代。體現(xiàn)本發(fā)明的優(yōu)選的分離的TyrRS多肽變體適用于在哺乳動物組 織中刺激血管生成，其包含Rossmann折疊區(qū)域或其部分(a portion thereof),它包括a5巻曲以及包括a14巻曲的反密碼子識別結(jié)構(gòu)域或其 部分。該變體在a5巻曲和a14巻曲之間具有間隔，該間隔大于在天然 的人類TyrRS中的a5巻曲和a14巻曲之間的間隔。優(yōu)選地，在該變體 的三級結(jié)構(gòu)中，al4巻曲與a5巻曲至少間隔大約6埃，這是通過a14巻曲的任一氨基酸殘基的a碳和a5巻曲的任一氨基酸殘基的a碳之間的 空間間隔決定的。該變體優(yōu)選在(x5巻曲和a14巻曲之間無氬4建存在。 該TyrRS多肽變體具有相對于天然人類TyrRS的氨基酸殘基序列(SEQ ID NO: 3,圖l)的至少大約50%的氨基酸殘基序列同一性，更優(yōu)選的至 少大約80% ,最優(yōu)選的至少大約95%的序列同一性。相對于人類TyrRS 的氨基酸殘基序列，該變體包括至少一個非保守的氨基酸殘基取代，相 對于天然的人類TyrRS的a5巻曲和a14巻曲的間隔，它打開了 a5巻曲 和a14巻曲之間的間隔，并賦予該變體血管生成活性。在另 一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的TyrRS變體包含Rossmann折 疊區(qū)域或其部分，其在多肽三級結(jié)構(gòu)外面部分(external portion)提供暴露 的ELR基序，并且該變體具有相對于人類TyrRS的氨基酸殘基序列(SEQ ID NO: 3)的至少大約50%的氨基酸殘基序列同一性，優(yōu)選的至少大約 80% ,最優(yōu)選的大約95%的序列同一性。該TyrRS多肽變體相對于人 類TyrRS的氨基酸殘基序列包括至少一個非保守氨基酸殘基取代，其暴 露了催化性Rossmann折疊結(jié)構(gòu)域的a5巻曲的ELR基序，從而賦予該 多肽血管生成活性。本發(fā)明的變體中，變體三級結(jié)構(gòu)中a5巻曲的ELR 殘基與al4巻曲的每個殘基優(yōu)選地至少距離大約6埃，這由al4巻曲的 任一氨基酸殘基a碳和a5巻曲ELR基序的任一氨基酸殘基a碳之間的 空間間隔決定。優(yōu)選地，所述至少一個非保守氨基酸殘基取代是在相當(dāng)于SEQ ID NO: 3的氨基酸殘基46、 340和341的一個或多個位置上的氨基酸殘基 的取代。例如，SEQIDNO: 3中341位的酪氨酸優(yōu)選被具有非極性側(cè)鏈 的氨基酸殘基(例如，非極性的脂肪族氨基酸，例如甘氨酸、丙氨酸、纈 氨酸、亮氨基酸、異亮氨酸、曱硫氨酸和脯氨酸)取代。相當(dāng)于SEQ ID NO: 3的46位甘氨酸和/或340位丙氨酸的氨基酸殘基優(yōu)選地:故具有大的 (bulky)非極性側(cè)鏈的氨基酸殘基(例如，較大的不帶電的疏水性氨基酸， 例如酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、亮氨基酸、異亮氨酸基或曱硫氨酸) 取代。如在此使用的，提到TyrRS多肽變體中"相當(dāng)于，，(corresponding to)給定序列比如SEQ ID NO: 3中的氨基酸殘基的氨基酸，表示在TyrRS 多肽變體的同源序列中某個位置的氨基酸，當(dāng)該同源序列與該給定序列 相比較時，與SEQ ID NO: 3中的給定位置對準(zhǔn)(即對應(yīng))。蛋白質(zhì)領(lǐng)域 普通技術(shù)人員可以理解，同源序列中氨基酸殘基的編號可能與給定序列的編號不同(例如,SEQ ID NO:3)。在另一實施方案中，本發(fā)明的分離的TyrRS多肽變體包含Rossmann 折疊區(qū)域或其部分，其在該蛋白或片段的外面部分提供暴露的ELR基 序，并且它具有相對于人類TyrRS的氨基酸殘基序列(SEQ ID NO: 3)的 至少大約50%的氨基酸殘基序列同一性。優(yōu)選地，該變體的氨基酸殘基 序列具有相對于SEQ ID NO: 3的至少大約80%的序列同一性，更優(yōu)選 地大約95%,并且包括在相當(dāng)于SEQ ID NO: 3的341位的位置上的具 有非極性側(cè)鏈的氨基酸殘基。優(yōu)選地，該氨基酸殘基具有非極性的脂肪 族側(cè)鏈。例如，該變體相當(dāng)于人類TyrRS的第341位酪氨酸殘基的氨基 酸殘基可以是甘氨酸殘基、丙氨酸殘基、苯丙氨酸殘基、纈氨酸殘基、 亮氨基酸殘基、異亮氨酸殘基、曱硫氨酸殘基或脯氨酸殘基。在某些實 施方案中，相當(dāng)于人類TyrRS的341位酪氨酸的氨基酸殘基是甘氨酸殘 基、丙氨酸殘基或脯氨酸殘基，優(yōu)選丙氨酸殘基。在另 一個優(yōu)選實施方案中，分離的TyrRS多肽變體包含SEQ ID NO: 4(圖2)的氨基酸殘基序列或其片段，其中SEQ ID NO: 4的341位的殘基 X是甘氨酸殘基、丙氨酸殘基、苯丙氨酸殘基、纈氨酸殘基、亮氨基酸 殘基、異亮氨酸殘基、曱硫氨酸殘基或脯氨酸殘基，優(yōu)選甘氨酸、丙氨 酸或脯氨酸殘基，更優(yōu)選丙氨酸殘基。優(yōu)選地，該TyrRS多肽變體包含 SEQ ID NO: 4的整個N末段區(qū)域(即殘基1-364)。優(yōu)選地，片段至少包 括Rossmann折疊區(qū)域a5鏈的殘基，即相當(dāng)于SEQ ID NO: 4的87至104 位的殘基。更優(yōu)選地，該片段包括整個Rossmann折疊區(qū)域(SEQ ID NO: 4的1-230殘基)。本發(fā)明的特別優(yōu)選的血管生成TyrRS多肽變體由SEQ ID NO: 4的 氨基酸殘基序列組成，其中SEQ ID NO: 4的位置341上的殘基X乂人由 甘氨酸殘基、丙氨酸殘基、苯丙氨酸殘基、纈氨酸殘基、亮氨基酸殘基、 異亮氨酸殘基、甲硫氨酸殘基和脯氨酸殘基構(gòu)成的組中選擇。更優(yōu)選地， SEQ ID NO: 4的341位的殘基X從由甘氨酸殘基、丙氨酸殘基、脯氨酸 殘基構(gòu)成的組中選出，最優(yōu)選丙氨酸殘基。本發(fā)明也提供 一 種在哺乳動物的組織中刺激血管生成的方法。該方 法包括讓組織接觸血管生成量(angiogenic amount)的在此詳細(xì)描寫的 本發(fā)明的TyrRS多肽變體。另 一 方面，本發(fā)明提供 一 種在哺乳動物的組織中刺激內(nèi)皮細(xì)胞遷移的方法。該方法包括讓組織接觸內(nèi)皮細(xì)胞遷移刺激量(endothelial cells migration stimulating amount)的在此詳細(xì)描寫的本發(fā)明的TyrRS多月太變體。TyrRS-Y341A和微型-TyrRS-Y341A質(zhì)粒是通過使用 QuikChange定點誘變試劑盒(Stratagene, La Jolla, CA)構(gòu)建的。模板分別 是包含野生型TyrRS和微型-TyrRS的pET 20b(+)(Novagen, Masdison, WI)載體。所有的蛋白質(zhì)連同C末端His標(biāo)簽表達(dá)以利于多肽的分離。 合成寡核苷酸從Invitrogen公司(Carlsbad, CA)購買。蛋冷者W i Z和力^ # ^去,.重組多肽用大腸桿菌 B121-CodonPlus (DE 3)-RIL細(xì)l包(Stratagene， La Jolla, CA)表達(dá)。當(dāng)細(xì)胞 生長至OD6QQ為0.8時，使用ImM異丙基P-D-硫代半乳糖吡喃糖苦 (Roche, Basel, Switzerland)誘導(dǎo)3小時。然后細(xì)胞被沉淀出來并在緩沖 液A(20mM Tris-HCl, pH 7.9, 30mM咪唑，500mM NaCl)中重懸。超聲裂 解后，通過74,000g離心30分鐘分離細(xì)胞石,片。有His標(biāo)簽的多肽通過 Ni-NTA親和色語純化。上清液加樣至Ni-NTA親和柱(Qiagen， Valencia, CA)上，用lOOml緩沖液B(緩沖液A加上0.1% Triton-Xl 14(Sigma, St. Loms， MO))和150mL緩沖液A洗滌。多肽通過緩沖液A和緩沖液 C(20mM Tris-HCl, pH 7.9, 250mM咪唑，500mM NaCl)的線性梯度洗脫。 含有〉95%純度多肽的級份被收集、濃縮并透析至儲存緩沖液(50%磷酸 鹽緩沖鹽水，PBS, pH 7.4, 50%甘油，2mM 二石克蘇糖醇，DTT )。蛋白濃度 通過使用Bio-Rad Protem Assay試劑(Bio-Rad， Hercules, CA)以牛血清清 蛋白(BSA, Sigma， St. Louis, MO)作為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行Bradford試驗來確定。內(nèi) 毒素濃度通過使用Limulus Amebocyte Lysate (LAL)試-驗(BioWhittaker, Walkersville, MD )確定。V、^^ Z身錄炎身在斯坦福同步輻射實驗室(SSRL)對野生型 TyrRS和本發(fā)明的TyrRS-Y341A變體于beamlme 4-2實施小角度X射線 散射(SAXS)測定。對不同濃度(2-20g/L)的樣品測量X射線散射曲線。X 射線波長(X)為1.38A,檢測器通道數(shù)被轉(zhuǎn)變?yōu)閯恿總鬟fQ=47T*sme/X,其 中2 *e是散射角。兩個不同的樣本-檢測器距離用于覆蓋極小至中等的散 射角，即2.5米覆蓋大約0.01-0.25 A-]的Q范圍，而0.5米覆蓋大約0.03-0.93 A"的Q范圍。用等分樣本裝滿帶有云母窗的聚碳酸酯池(polycarbonate cell)并在 測量過程中保持20°C 。在整個數(shù)據(jù)采集過程中使用MarCCD165檢測器。 一套典型的數(shù)據(jù)采集由每個10秒鐘依次記錄的24個二維散射影像組 成。 一系列數(shù)據(jù)與匹配的緩沖散射數(shù)據(jù)一起處理，該緩沖散射數(shù)據(jù)典型 地在蛋白溶液測量之后或之前立即記錄。數(shù)據(jù)針對整合的光束強(qiáng)度標(biāo)定 (scaled for integrated beam intensity)、按方位平均(azimuthally averaged)、 觀察時間-依賴性變化，其通常由輻射損傷所引起，并進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。 平均水平上，大約為匹配緩沖數(shù)據(jù)的波動(variation)的大約1.5倍高的統(tǒng) 計波動是允許的。相對于超過該水平的第一個蛋白散射數(shù)據(jù)幀(data frame),任何顯示更高水平偏差的數(shù)據(jù)幀都被淘汰。在上述數(shù)據(jù)處理之 后，處理的緩沖散射曲線(buffer scattering curves)從相應(yīng)的蛋白散射曲線 中扣除。小角度和高角度數(shù)據(jù)的標(biāo)定通過PRIMUS軟件程序(Konarev W 2003. "PRIMUS: a Windows PC-based system for small-angle scattering data analysis" , /. J/ / /. Cr，to〃ogr 36:1277-1282)進(jìn)4亍，該軟件程序也應(yīng) 用于通過Q*Rg 0.45-1.3的范圍內(nèi)進(jìn)行Guimer繪圖來計算Rg和I(Q=0)。 通過使用Svergun等的GNOM小角度散射數(shù)據(jù)處理程序(可以從 embl-hamburg (dot)de網(wǎng)站獲得)進(jìn)行實驗數(shù)據(jù)的間接Fourier變換獲得 電子對距離分布函數(shù)TYrj,最初僅用小角度數(shù)據(jù)來獲得最大距離(LUx) 的準(zhǔn)確估算。然后再次計算/Yr,包括具有以上給定D皿值的高角度數(shù) 據(jù)用于模型構(gòu)造。蛋^滲游7A. 將野生型TyrRS和TyrRS-Y341A與血漿素或白細(xì)胞 彈性蛋白酶按蛋白對蛋白酶大約32昭比1(ig血漿素和2S00(ig每單位彈 性蛋白酶的比率混合。混合物在20。C孵育大約2小時，然后加入甲酸至 0.1%的終濃度以終止反應(yīng)?；旌衔镏械那懈钇瓮ㄟ^MALDI TOF質(zhì)譜 和使用Edman降解法的N末端測序進(jìn)4亍分析。C4M if^成試-發(fā).雞尿嚢絨膜(CAM)血管生成試驗通過以下步 驟進(jìn)行。將受精的補(bǔ)體固定禽白血病病毒(COFAL)-陰性卵(Charles River 實驗室，Storrs， CT)在38。C/60。/o濕度下孵育3.5天。然后卵被打開，胚 胎被轉(zhuǎn)移至無菌的塑料稱量盒中。胚胎被覆蓋并在37.5。C/90。/。濕度下孵 育。五天之后，將含有大約30pL的PBS, VEGF和bFGF(各自大約0.15和0.5pg)或TyrRS多肽(lpM)的月交原/網(wǎng)板(collagen/mesh onplant)i丈至 胚胎的CAM膜上，再孵育66小時。植入物的上網(wǎng)層(upper mesh layers) 在立體顯微鏡下檢查并對"方框"(即，被網(wǎng)纖維限定的三維區(qū)域)的比 例評分，其含有相對于方框總數(shù)的血管。^i^^辰i^i成試?yán)L。在Athymic wehi小鼠皮下才直入400pL的生 長因子耗盡的基質(zhì)膠(Matrigel)(Becton Dickinson),基質(zhì)膠中補(bǔ)充有 PBS、 20nMVEGF或250nMTyrRS、微型-TyrRS、 TyrRS-Y341A或微型 -TyrRS-Y341A。五天后，將小鼠靜脈內(nèi)注射入熒光素標(biāo)記的內(nèi)皮結(jié)合凝 集素 0#簡'<2 (Bandeiraea) Wmp/hyb/z" I , 同工凝集素 B4 (GSL-B4)(Vector實驗室，Burlmgame， CA)。切下基質(zhì)月交栓并在it射免 疫-沉淀(RIPA)緩沖液(10mM磷酸鈉，pH 7.4, 150mM氯化鈉，1% Nomdet P-40, 0.5%脫氧膽酸鈉，0.1%十二烷基硫酸鈉)中勻漿。勻漿之 后，使用分光光度分析定量每個栓(plug)的熒光素含量。移試-發(fā)。人類臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)(Cambrex)在含 有10。/。胎牛血清(FBS)的EGM培養(yǎng)基(Cambrex)中按大約3乂105每孔的 密度接種于6孔培養(yǎng)板，并生長至匯合單層。將細(xì)胞在不含有FBS的培 養(yǎng)基中饑餓16小時并用移液管尖頭沿著孔損傷細(xì)胞。損傷層用無血清 培養(yǎng)基洗滌兩次以除去細(xì)胞碎片，并讓細(xì)胞在存在和缺少TyrRS變體和 對照因子(control factors)的條件下遷移。在損傷后0和6小時，無細(xì)胞 創(chuàng)傷區(qū)域被照像，并用圖像分析軟件(NIH ImageJ 1.33)分析。按剩余無 細(xì)胞區(qū)與初始的創(chuàng)傷區(qū)的百分比計算內(nèi)皮細(xì)胞遷移率，從中確定每種條 件下的閉合區(qū)域百分比。我差^承必斧^。通過ATP-焦磷酸酯(PPi)交換反應(yīng)測定氨基酸活 化作用。反應(yīng)在37。C于含有Tris-HCl (100mM, pH 7.8)、 KF (10mM)、 MgCl2(2mM)、 ATP(lmM)、 BSA (O.lmg /mL) 、 NaPPi(2mM, 130cpm /nmole)、 p-巰基乙醇(5mM)、酪氨酸(2mM)和200nM的該多肽的緩沖液 中進(jìn)行。7>ri^ ^戲^ K^/犮7「Mcwre」厲資￡XW j# #潛種。人們知道 微型-TyrRS(即人類TyrRS的1-364氨基酸殘基)而不是全長TyrRS可作 為促血管生成細(xì)胞因子起作用。促血管生成活性依賴于ELR基序的存在，而ELR基序也存在于CXC趨化因子比如IL-8中，并為其活性所必 需。在圖3頂端展示了 TyrRS的氨基酸序列簡圖，它由3個結(jié)構(gòu)域組成: Rossmann折疊催化結(jié)構(gòu)域(黃色，殘基1-230)，反密碼子識別結(jié)構(gòu)域(綠 色，殘基231-364)以及C末端結(jié)構(gòu)域(紫色，殘基364_528)。前兩個結(jié)構(gòu) 域形成了活性的核心酶，被稱作微型TyrRS(殘基1-364)。最近解析的微 型-TyrRS的三級結(jié)構(gòu)顯示出圍繞ELR基序的氫鍵網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)連接了 該蛋白的反密碼子識別以及活性部位結(jié)構(gòu)域(參見圖3，底部)。在ELR 基序的R93的側(cè)鏈和反密碼子識別結(jié)構(gòu)域的主鏈A340之間有兩個氳鍵 相互作用，其將a5巻曲連接(tether)至al4巻曲。另夕卜，Y341的芳環(huán)和 主鏈G46之間的疊加相互作用(stacking interactions),創(chuàng)建了這些的結(jié)構(gòu) 域之間的接觸。這四個殘基中，R93、 G46和Y341在迄今鑒定的所有真 核生物TyrRS蛋白中是保守的。如圖3(底部)所示，每個片段表面靜電 勢的互補(bǔ)性提供了在a5巻曲和otl4巻曲之間的連接的證據(jù)。ELR基序(在 螺旋a5上)被C-結(jié)構(gòu)域所屏蔽，當(dāng)C-結(jié)構(gòu)域被移除后暴露出來。因為這 個原因，對于血管生成，微型TyrRS是有活性的，而全長TyrRS無活性。 Tyr341殘基(來自反密碼子識別結(jié)構(gòu)域螺旋a14 )與ELR互相作用，并 在連接C-結(jié)構(gòu)域來阻擋ELR中發(fā)揮重要作用。A340也是高度保守的， 在&cereww"e中只由另一種小氨基酸，甘氨酸，所取代。兩種獨立的方法用來展示Y341A突變對TyrRS產(chǎn)生的三維結(jié)構(gòu)打 開。第一種方法是小角度X射線散射(SAXS)。當(dāng)電磁輻射的波長與樣本 微粒在相同長度尺度上時，該微粒將對輻射產(chǎn)生散射。探測并分析該散 射圖樣可以得到關(guān)于微粒大小、形狀以及內(nèi)部結(jié)構(gòu)的有價值的信息。 SAXS技術(shù)是一種探測在溶液中的大分子(如蛋白質(zhì))的整體構(gòu)象變化的 有力技術(shù)。從測量的野生型人類TyrRS和Y341A突變的散射曲線，計 算出各樣本的電子對距離分布函數(shù)(圖5)。隨后從該分布函數(shù)/Yd中導(dǎo)出 旋轉(zhuǎn)半徑ORg)和最大距離(Z^。》的值。圖4顯示了 R93和Y341之間的氬鍵連接。該氫4建連4妻的破壞打開 三級結(jié)構(gòu)并暴露ELR基序。在野生型人類TyrRS和Y341 ;故丙氨酸取代 的變體(TyrRS-Y341A)的小角度X射線散射研究提供這種開口的直接證 據(jù)(參見圖5)。X射線散射研究顯示相對于野生型蛋白該變體的電子對距 離分布變寬。TyrRS Y341A具有的Ag比野生型TyrRS的大大約4埃， D腦x比野生型TyrRS的大大約20埃。這證明了 TyrRS Y341A具有相對于野生型TyrRS更開放和更伸展的構(gòu)象。支持相對于野生型人類TyrRS而言TyrRS-Y341A中有開放結(jié)構(gòu)的 其他證據(jù)是從使用血漿素(plasmm)和彈性蛋白酶的酶切消化研究中獲得 的。蛋白酶通常在柔性的環(huán)區(qū)切割蛋白質(zhì)，這里沒有確定的二級結(jié)構(gòu)如 a螺旋或卩鏈。與Y341A突變相關(guān)的暴露ELR基序的結(jié)構(gòu)上的開口的 存在被額外的切割片段證實，觀察到的這些額外的切割片段是由于在更 松弛、開放的結(jié)構(gòu)上存在額外切割位點所造成的。^使用血漿素和白細(xì)胞 彈性蛋白酶，在Y341A突變體上》見察到相對于野生型TyrRS的額外的 切割位點。7見察到的這些額外切割位點是L333、 K334和A337,它們?nèi)?部位于反密碼子識別結(jié)構(gòu)域的螺旋a14,接近于突變位點341。這證實 了在Y341A突變中，a14是松弛的并本身呈柔性環(huán)狀，不再被連接于 ELR區(qū)域。圖6圖解了 Y341A突變對人類TyrRS整體三級結(jié)構(gòu)的開口 效果。F34L4《賞/4'f全# 7>W^ A資iA^Vi。 Y341是一個理想的突變?nèi)壗Y(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。在全長TyrRS和微型-TyrRS中將該殘基突變?yōu)楸彼?來確定所述連接的破壞改變細(xì)胞因子和酶活性的程度。細(xì)胞因子活性在 雞尿嚢絨膜(CAM)中測定，基質(zhì)膠試驗用于血管生成測定。微型-TyrRS中包括入Y341A突變在CAM試驗中未對它的活性產(chǎn)生 可觀察到的影響-正常多肽和變體都促進(jìn)了血管生成。全長野生型人類 TyrRS在該試驗中無活性。但是人類TyrRS的Y341突變?yōu)楸彼?即 TyrRS-Y341 A)則將該酶轉(zhuǎn)變成為促血管生成的細(xì)胞因子。為了證實在 CAM試驗中觀察到的結(jié)果，又將該多肽在小鼠基質(zhì)膠栓模型中進(jìn)行測 定。在這個試驗中，含有PBS或其它蛋白的膠原栓^皮皮下注射。當(dāng)在栓 內(nèi)有促血管生成因子時，血管會散布進(jìn)入栓中。在注射熒光內(nèi)皮細(xì)胞結(jié) 合凝集素后，每個栓中的血管密度可以通過分光光度分析定量。在這個 模型中，VEGF和微型-TyrRS都呈現(xiàn)血管生成活性陽性。野生型TyrRS 則無活性，與PBS的血管生成水平相似。相反，TyrRS-Y341A則誘導(dǎo) 血管生成。這些數(shù)據(jù)獨立地證實了 CAM試驗的結(jié)果。管新生顯著增加，而野生型多肽或PBS均沒有誘導(dǎo)應(yīng)答(多肽在7^龍網(wǎng)-鑲嵌的膠原植入物中按lpM的濃度施用)。圖7進(jìn)一步表征了在小鼠基質(zhì)膠栓試驗中該TyrRS多肽的體內(nèi)活 性。小鼠按400pL量皮下注射單獨的生長因子減少的基質(zhì)膠或與250nM 蛋白混合。5天培養(yǎng)后，移除栓并評定血管的存在。VEGF^(20nM)用作 陽性對照。按先前的報道，微型-TyrRS在這個試驗中促進(jìn)血管生成。在 微型-TyrRS中Y341突變?yōu)楸彼?即，微型-TyrRS-Y341A)不影響該應(yīng) 答。但是當(dāng)在全長TyrRS中制造Y341A突變時，則相對于野生型TyrRS 有2倍的血管生成應(yīng)答提升。K 4L4焚茺炎7>*/ 話必潛^^^處力豸關(guān)。通過測定酪氨酸依賴 的ATP-PPi交換反應(yīng)來評定氨基酸的活化作用。如圖8所示，Y341A點 突變敲除了全長TyrRS以及微型-TyrRS形成酪氨酰腺苷酸的能力。因此 參與tRNA氨基酰化的結(jié)構(gòu)元件與那些參與細(xì)胞因子功能的不同。內(nèi)皮細(xì)胞遷移試驗用來評價本發(fā)明的TyrRS變體刺激與傷口愈合 有關(guān)的內(nèi)皮細(xì)胞遷移的能力。人類臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)接種于含 有10%FBS的EGM培養(yǎng)基中并生長至匯合單層。將細(xì)胞在不含有FBS 的培養(yǎng)基中饑餓處理，然后用移液管尖頭沿孔劃傷細(xì)胞。損傷層用無血 清培養(yǎng)基洗滌以除去細(xì)胞碎片，允許細(xì)胞在存在和不存在TyrRS變體以 及對照因子的條件下遷移。無細(xì)胞創(chuàng)傷區(qū)域的影像在損傷后0和6小時 拍攝，并使用圖像分析軟件(NIHImageJ, 1.33版)進(jìn)行分析。按剩余的 無細(xì)月包區(qū)i或(remaining cell-free area)才目^f 一刀始的創(chuàng)傷區(qū)^戈(area of the initial wound)的百分比計算內(nèi)皮細(xì)胞遷移，從中確定在各種條件下閉合 區(qū)域(areaclosed)的百分比。圖9顯示在用本發(fā)明的TyrRS變體和對照處 理的損傷細(xì)胞培養(yǎng)物中，剩余無細(xì)胞區(qū)域與初始創(chuàng)傷區(qū)域的百分比圖(縱軸)。無細(xì)胞區(qū)域相對更小的百分比顯示內(nèi)皮細(xì)胞遷移和傷口愈合的提 高。如圖9所示，本發(fā)明的TyrRS變體刺激內(nèi)皮細(xì)胞遷移的程度與微型 TyrRS的程度相當(dāng)，而比野生型TyrRS的程度更大。在不脫離本發(fā)明新穎特征的精神和范圍的情況下，可以對上述實施 方案進(jìn)行許多變化和修改。對于在此闡述的特定實施方案并無意圖進(jìn)行 限制，也不應(yīng)當(dāng)推斷為進(jìn)行限制。
權(quán)利要求
1.一種分離的酪氨酰tRNA合成酶(TyrRS)多肽變體，它包括(a)Rossmann折疊區(qū)域或其部分；以及(b)反密碼子識別結(jié)構(gòu)域或其部分；其中該變體包括相對于人類TyrRS氨基酸殘基序列(SEQ ID NO3)的至少一個非保守的氨基酸殘基取代，并且顯示大于天然人類TyrRS血管生成活性的血管生成活性。
2. 權(quán)利要求1的TyrRS多肽變體，其中該變體具有相對于人類 TyrRS的氨基酸殘基序列(SEQ ID NO: 3)的至少50%的氨基酸殘基序列 同一性。
3. 權(quán)利要求1的TyrRS多肽變體，其中該變體具有相對于人類 TyrRS的氨基酸殘基序列(SEQ ID NO: 3)的至少80%的氨基酸殘基序列 同一性。
4. 權(quán)利要求1的TyrRS多肽變體，其中該變體具有相對于人類 TyrRS的氨基酸殘基序列(SEQ ID NO: 3)的至少95%的氨基酸殘基序列 同一性。
5. 權(quán)利要求1的TyrRS多肽變體，包括在相當(dāng)于SEQ ID NO: 3的 位置46、 340和341的一個或多個位置上的氨基酸殘基的非保守氨基酸 殘基取代。
6. 權(quán)利要求1的TyrRS多肽變體，包括在相當(dāng)于SEQ ID NO: 3的 殘基341的位置上的非極性氨基酸殘基。
7. —種分離的酪氨酰tRNA合成酶(TyrRS)多肽變體，包括(a) 包括a5巻曲的Rossmann折疊區(qū)域或其部分；和(b) 包括al4巻曲的反密碼子識別結(jié)構(gòu)域或其部分； 其中該變體具有相對于人類TyrRS的氨基酸殘基序列(SEQ ID NO:3)的至少50%的氨基酸殘基序列同一性，包括相對于人類TyrRS氨基酸 殘基序列的至少 一 個非保守的氨基酸殘基取代，并在該變體三級結(jié)構(gòu)中 的a5巻曲和cd4巻曲之間具有間隔，該間隔大于天然人類TyrRS的a5 巻曲和a14巻曲間的間隔。
8. 權(quán)利要求7的TyrRS多肽變體，其中該變體具有相對于人類 TyrRS的氨基酸殘基序列(SEQ ID NO: 3)的至少80%的氨基酸殘基序列 同一性。
9. 權(quán)利要求7的TyrRS多肽變體，其中該變體具有相對于人類 TyrRS的氨基酸殘基序列(SEQ ID NO: 3)的至少95%的氨基酸殘基序列 同一性。
10. 權(quán)利要求7的TyrRS多肽變體，包括在相當(dāng)于SEQ ID NO: 3的 位置46、 340和341的一個或多個位置上的氨基酸殘基的非保守氨基酸 殘基取代。
11. 權(quán)利要求7的TyrRS多肽變體，包括在相當(dāng)于SEQ ID NO: 3的 殘基341的位置上的非極性氨基酸殘基。
12. 權(quán)利要求7的TyrRS多肽變體，包括在相當(dāng)于SEQ ID NO: 3的 位置46的位置上的具有大的非極性側(cè)鏈的氨基酸殘基。
13. 權(quán)利要求7的TyrRS多肽變體，包括在相當(dāng)于SEQ ID NO: 3的 位置340的位置上的具有大的非極性側(cè)鏈的氨基酸殘基。
14. 一種分離的酪氨酰tRNA合成酶(TyrRS)多肽變體，包括(a) Rossmann折疊區(qū)域或其部分，其中包括含有ELR基序的a5巻 曲^ 和(b) 包括a14巻曲的反密碼子識別結(jié)構(gòu)域或其部分，其中在該變體 的三級結(jié)構(gòu)中，tx5巻曲的ELR基序與a14巻曲至少間隔大約6埃，這 是由a14巻曲的任一氨基酸殘基的a碳和a5巻曲ELR基序的任一氨基 酸殘基的a石友之間的空間間隔確定的；其中該變體具有的氨基酸殘基序列與人類TyrRS的氨基酸殘基序 列(SEQ ID NO: 3)相比至少有50%的相同，包括代替相當(dāng)于SEQ ID NO: 3的341位的酪氨酸的非極性氨基酸殘基，和存在位于該多肽三級結(jié)構(gòu) 外面部分的暴露的ELR基序。
15. 權(quán)利要求14的TyrRS多肽變體，其中所述非極性氨基酸殘基 具有脂肪族側(cè)鏈。
16. 權(quán)利要求14的TyrRS多肽變體，其中所述非極性氨基酸殘基 選自由甘氨酸殘基、丙氨酸殘基、苯丙氨酸殘基、纈氨酸殘基、亮氨基 酸殘基、異亮氨酸殘基、甲硫氨酸殘基和脯氨酸殘基構(gòu)成的組。
17. 權(quán)利要求14的TyrRS多肽變體，其中所述非極性氨基酸殘基 選自由甘氨酸殘基、丙氨酸殘基和脯氨酸殘基構(gòu)成的組。
18. 權(quán)利要求14的TyrRS多肽變體，其中所述非極性氨基酸殘基 是丙氨酸殘基。
19. 權(quán)利要求14的TyrRS多肽變體，其中該變體具有相對于人類 TyrRS的氨基酸殘基序列(SEQ ID NO: 3)的至少80%的氨基酸殘基序列 同一性。
20. 權(quán)利要求14的TyrRS多肽變體，其中該變體具有相對于人類 TyrRS的氨基酸殘基序列(SEQ ID NO: 3)的至少95%的氨基酸殘基序列 同一性。
21. —種分離的酪氨酰tRNA合成酶(TyrRS)多肽變體，包括SEQ ID NO: 4的氨基酸殘基序列或它的包括至少SEQ ID NO: 4的殘基1至364 的片段，其中SEQ ID NO: 4的位置341上的殘基X選自甘氨酸殘基、 丙氨酸殘基、纈氨酸殘基、亮氨基酸殘基、異亮氨酸殘基、曱硫氨酸殘 基和脯氨酸殘基構(gòu)成的組。
22. 權(quán)利要求21的TyrRS多肽變體，其中SEQ ID NO: 4的位置341 上的殘基X是選自由甘氨酸殘基、丙氨酸殘基和脯氨酸殘基構(gòu)成的組的 氨基酸殘基。
23. 權(quán)利要求21的TyrRS多肽變體，其中SEQ ID NO: 4的位置341 上的殘基X是丙氨酸殘基。
24. —種純化的酪氨酰tRNA合成酶(TyrRS)多肽變體，由SEQ ID NO: 4的氨基酸殘基序列組成，其中SEQIDNO: 4的位置341上的殘基 X選自甘氨酸殘基、丙氨酸殘基、苯丙氨酸殘基、纈氨酸殘基、亮氨基 酸殘基、異亮氨酸殘基、曱硫氨酸殘基和脯氨酸殘基構(gòu)成的組。
25. 權(quán)利要求24的TyrRS多肽變體，其中SEQ ID NO: 4的位置341 上的殘基X選自由甘氨酸殘基、丙氨酸殘基和脯氨酸殘基構(gòu)成的組。
26. 權(quán)利要求24的TyrRS多肽變體，其中SEQ ID NO: 4的位置341 上的殘基X是丙氨酸殘基。
27. —種在哺乳動物的組織中刺激血管生成的方法，包4舌以血管生 成量的權(quán)利要求1的TyrRS多肽變體接觸該組織。
28. —種在哺乳動物的組織中刺激血管生成的方法，包括以血管生 成量的權(quán)利要求7的TyrRS多肽變體接觸該組織。
29. —種在哺乳動物的組織中刺激血管生成的方法，包括以血管生 成量的權(quán)利要求14的TyrRS多肽變體接觸該組織。
30. —種在哺乳動物的組織中刺激血管生成的方法，包括以血管生 成量的權(quán)利要求21的TyrRS多肽變體接觸該組織。
31. —種在哺乳動物的組織中刺激血管生成的方法，包括以血管生成量的權(quán)利要求24的TyrRS多肽變體接觸該組織。
32. —種在哺乳動物的組織中促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移的方法，包括以內(nèi) 皮細(xì)胞遷移刺激量的權(quán)利要求1的TyrRS多肽變體接觸該組織。
33. —種在哺乳動物的組織中促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移的方法，包括以內(nèi) 皮細(xì)胞遷移刺激量的權(quán)利要求7的TyrRS多肽變體接觸該組織。
34. —種在哺乳動物的組織中促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)月包遷移的方法，包>^以內(nèi) 皮細(xì)l包遷移刺激量的—又利要求14的TyrRS多肽變體4妻觸該組織。
35. —種在哺乳動物的組織中促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)l包遷移的方法，包括以內(nèi) 皮細(xì)胞遷移刺激量的權(quán)利要求21的TyrRS多肽變體接觸該組織。
36. —種在哺乳動物的組織中促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)月包遷移的方法，包括以內(nèi) 皮細(xì)l包遷移刺激量的;k利要求24的TyrRS多肽變體接觸該組織。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種分離的酪氨酰tRNA合成酶(TyrRS)多肽變體，該變體包括(a)Rossmann折疊區(qū)域或其部分，優(yōu)選地包括α5卷曲；和(b)反密碼子識別結(jié)構(gòu)域或其部分，優(yōu)選地包括α14卷曲。優(yōu)選地，相對于天然人類TyrRS中的相應(yīng)空間間隔，在該變體的三級結(jié)構(gòu)中α5卷曲和α14卷曲具有更大的空間間隔。該變體優(yōu)選具有相對于人類TyrRS的氨基酸殘基序列(SEQ ID NO3)的至少大約50％的氨基酸殘基序列同一性，相對于人類TyrRS氨基酸殘基序列包括至少一個非保守的氨基酸殘基取代，并且優(yōu)選地在該多肽三級結(jié)構(gòu)外面部分的α5卷曲中提供暴露的ELR基序。優(yōu)選的TyrRS蛋白變體包含SEQ ID NO4的氨基酸殘基序列或其部分。本發(fā)明的蛋白質(zhì)和蛋白片段有血管生成活性，可用于在哺乳動物組織中刺激血管生成。
文檔編號C12Q1/68GK101336299SQ200680052307
公開日2008年12月31日 申請日期2006年12月1日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月2日
發(fā)明者X·-L·楊 申請人:斯克里普斯研究學(xué)院