專利名稱：借助細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生氫氣的制作方法
借助細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生氫氣 本發(fā)明涉及通過細(xì)胞產(chǎn)生氫氣的重組表達(dá)系統(tǒng)。更具體地，本發(fā)
明涉及在細(xì)菌細(xì)胞中(通常在大腸桿菌(EscAen'c/n'a co//)中)產(chǎn)生來自藍(lán) 細(xì)菌的氫化酶蛋白復(fù)合體的表達(dá)載體、由所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì) 胞、以及在適于光合產(chǎn)氫的條件下通過孵育所述宿主細(xì)胞產(chǎn)生氫氣的 方法。
背景技術(shù)：
氫能是代替?zhèn)鹘y(tǒng)化石燃料的潛在候選者，特別是由微生物產(chǎn)生的 氬氣。當(dāng)前，從微生物來源光合產(chǎn)氫存在大量限制。諸如藍(lán)細(xì)菌和綠 藻的傳統(tǒng)產(chǎn)氫微生物表現(xiàn)相對(duì)低的能量轉(zhuǎn)換效率和低氫氣生成率。另 外，由于多種抑制性因素，從這些生物體的產(chǎn)生隨時(shí)間存在固有的不 穩(wěn)定。例如，負(fù)責(zé)的酶天然地對(duì)氧氣敏感并在甚至微需氧條件中變性。
傳統(tǒng)方法已在過程控制中尋找進(jìn)步，以提高從微生物產(chǎn)生氫氣。 US4532210公開了使用交替的光/暗循環(huán)在藻類培養(yǎng)物中產(chǎn)生氫氣，所 述光/暗循環(huán)包括交替光存在時(shí)于需氧條件下水中培養(yǎng)所述藻類以在 所述藻類中積累光合產(chǎn)物的步驟和黑暗中于微需氧條件下水中培養(yǎng)所 述藻類以通過呼吸分解積聚的物質(zhì)從而產(chǎn)生氫氣的步驟。
更為近來，已采用分子技術(shù)處理所述問題。US6858718公開了所 述酶，即鐵氫化酶(HydA)，具有產(chǎn)生氫氣，具體地催化質(zhì)子向分子氫 的可逆還原，的工業(yè)應(yīng)用。該文件公開了從藻類斜生柵藻OSce"ecfes;m^ oW—M51)、 萊茵衣藻(CA/amj^/o歸朋51 mVi厶arato.)和小球藻(CA/ore〃a /w;yca)分離編碼鐵氫化酶的核酸序列。本發(fā)明進(jìn)一步公開HydA的基因 組核酸、cDNA和蛋白序列。迄今，所提出的方法還沒有適合以工業(yè) 規(guī)模產(chǎn)生氫氣。
本公開內(nèi)容涉及在宿主細(xì)胞中表達(dá)分離自光合細(xì)菌物種的酶或酶 復(fù)合體，所述光合細(xì)菌物種例如藍(lán)細(xì)菌物種，所述宿主細(xì)胞通常是不
表達(dá)所述酶或酶復(fù)合體的細(xì)菌宿主細(xì)胞；并涉及由所述宿主細(xì)胞產(chǎn)生 氫氣。
發(fā)明簡(jiǎn)述
根據(jù)本發(fā)明的方面，提供用于產(chǎn)生氫化酶蛋白或氫化酶蛋白復(fù)合 體的表達(dá)載體，所述表達(dá)載體包括可操作連接的下列元件
a) 轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子元件；
b) 編碼具有與藍(lán)細(xì)菌氫化酶相關(guān)的特異酶活性的多肽的核酸 分子；和
c) 轉(zhuǎn)錄終止子。 優(yōu)選地，所述核酸分子選自
i) 包括SEQIDNO:l的核香酸序列的核酸分子；
ii) 具有與SEQIDNO:l的核苷酸序列至少70%—致性的核酸
分子；
iii) 與SEQ ID NO:l的核酸序列雜交并編碼具有氫化酶活性 的多肽的核酸分子；或者
iv) 包括以上i)、 ii)和iii)的序列遺傳密碼的簡(jiǎn)并核苷酸序列的 核酸分子。
更為優(yōu)選地，所述核酸分子由SEQIDNO:l的核苷酸序列組成。 可選擇地，所述核酸分子選自
i) 包括SEQ ID NOs:2， 4， 7， 9和12的每一種的核苷酸序列的 核酸分子；
ii) 核酸分子，所述核酸分子包括具有與SEQ ID NO:2至少 70%—致性的核苷酸序列、具有與SEQ ID NO:4至少70%— 致性的核香酸序列、具有與SEQ ID NO:7至少70%—致性的 核苷酸序列、具有與SEQ ID NO:9至少70%—致性的核苦酸 序列以及具有與SEQ ID NO:ll至少70%—致性的核苷酸序 歹'J;或
iii) 核酸分子，所述核酸分子由下列所組成具有與SEQ ID NO:2至少70%—致性的核苷酸序列、具有與SEQIDNO:4至
少70%—致性的核苷酸序列、具有與SEQ ID NO:7至少70% 一致性的核苷酸序列、具有與SEQ ID NO:9至少70%—致性 的核苷酸序列以及具有與SEQ IDNO:ll至少70%—致性的核 苷酸序列。
更為優(yōu)選地，所述核酸分子由SEQ ID NOs:2， 4, 7， 9和12的每一 種的核苦酸序列組成。
可選擇地，所述核酸分子選自
i) 包括SEQ ID NOs:2， 4, 7, 9或12的至少一種的核芬酸序列 的核酸分子；或
ii) 包括下列的至少一種的核苷酸序列的核酸分子具有與 SEQ ID NO:2至少70%—致性的核苷酸序列、具有與SEQ ID NO:4至少70%—致性的核苷酸序列、具有與SEQIDNO:7至 少70%—致性的核苷酸序列、具有與SEQ ID NO:9至少70% 一致性的核苦酸序列以及具有與SEQ IDNO:ll至少70%—致 性的核苷酸序列。
更為優(yōu)選地，所述核酸分子是由SEQIDNO:2的核酸序列代表的 核酸分子，或與SEQIDNO:2雜交并編碼具有心肌黃酶活性的多肽的 變體核酸分子?？蛇x擇地，所述核酸分子是由SEQIDNO:4的核酸序 列代表的核酸分子，或與SEQIDNO:4雜交并編碼具有NADH脫氫酶 I活性的多肽的變體核酸分子。可選擇地，所述核酸分子是由SEQ ID NO:7的核酸序列代表的核酸分子，或與SEQ ID NO:7雜交并編碼具
有NAD還原氫化酶7活性的多肽的變體核酸分子?？蛇x擇地，所述核 酸分子是由SEQ ID NO:9的核酸序列代表的核酸分子，或與SEQ ID NO:9雜交并編碼具有NAD還原氫化酶S活性的多肽的變體核酸分子。 可選擇地，所述核酸分子是由SEQ ID NO:12的核酸序列^表的核酸 分子，或與SEQIDNO:12雜交并編碼具有NAD還原氫化酶jS活性的 多肽的變體核酸分子。優(yōu)選地，所述核酸分子在嚴(yán)緊雜交條件下雜交。
優(yōu)選地，所述核酸分子由編碼SEQ ID NOs:3， 5, 8, 10和13的每 一種多肽的核苷酸序列組成。
優(yōu)選地，所述變體核酸分子在嚴(yán)緊雜交條件下雜交。
優(yōu)選地，所述轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子元件包括賦予所述核酸分子或變體核酸 分子誘導(dǎo)型表達(dá)的元件。可選擇地，所述啟動(dòng)子元件包括賦予所述核 酸分子或變體核酸分子抑制型表達(dá)的元件?？蛇x擇地，所述轉(zhuǎn)錄啟動(dòng) 子元件賦予所述核酸分子或變體核酸分子組成型表達(dá)。
優(yōu)選地，所述表達(dá)栽體包括可選擇標(biāo)志物。優(yōu)選地，所述表達(dá)載 體包括翻譯控制元件。優(yōu)選地，所述翻譯控制元件是核糖體結(jié)合序列。
優(yōu)選地，所述核酸分子包括例如由DNA重排、傾向^l晉誤的PCR 或定位突變導(dǎo)入的所述核苷酸序列的特定改變，以致優(yōu)化密碼子使用。
在另外方面，本發(fā)明提供使用根據(jù)本發(fā)明第 一方面的表達(dá)載體轉(zhuǎn) 化的宿主細(xì)胞。
優(yōu)選地，所述細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞，更為優(yōu)選地，是革蘭氏陰性細(xì)菌 細(xì)胞，例如埃希氏菌(五sc/^n'c/n'as; / )屬，優(yōu)選大腸桿菌，更優(yōu)選大腸 桿菌BL21或大腸桿菌BL21(DE3)pLys5?？蛇x擇地，所述細(xì)胞可以是 另一細(xì)菌細(xì)胞，例如革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞，或者可選擇地，是酵母細(xì) 胞、藻細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞或植物細(xì)胞。
優(yōu)選地，所述細(xì)胞包括載體，所述載體包括tRNA基因，所述tRNA 基因例如編碼argU、 ilex、 leuW、 proL或glyT的tRNA基因。
根據(jù)本發(fā)明的另外方面，提供用于產(chǎn)生氫氣的方法，所述方法包
括
i) 將包括至少一種藍(lán)細(xì)菌氫化酶基因的核酸分子并入用于在 宿主細(xì)胞中表達(dá)的表達(dá)載體；并且
ii) 使用所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞； 其中所得轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞產(chǎn)生氫氣。
優(yōu)選地，所述至少一種氫化酶基因是雙向氬化酶基因。優(yōu)選地， 所述藍(lán)細(xì)菌屬于集胞藻屬，更為優(yōu)選地是集胞藻OS少wec/^Q^^ sp.)PCC 6803。
優(yōu)選地，所述核酸分子選自
i) 包括SEQIDN0:1的核香酸序列的核酸分子；
ii) 具有與SEQIDNO:l的核苷酸序列至少70%—致性的核酸
分子；
iii) 與SEQIDNO:l的核酸序列雜交的核酸分子；或者
iv) 包括以上i)、ii)和iii)的序列遺傳密碼的簡(jiǎn)并核苷酸序列的 核酸分子。
更為優(yōu)選地，所述核酸分子由SEQIDNO:l的核苷酸序列組成。 可選擇地，所述核酸分子選自
i) 包括SEQ ID NOs:2， 4， 7， 9和12的每一種的核苷酸序列的 核酸分子；
ii) 核酸分子，所述核酸分子包括具有與SEQ ID NO:2至少 70%—致性的核苷酸序列、具有與SEQ ID NO:4至少70%— 致性的核香酸序列、具有與SEQ ID NO:7至少70%—致性的 核苷酸序列、具有與SEQ ID NO:9至少70%—致性的核苷酸 序列以及具有與SEQ ID NO:ll至少70%—致性的核苷酸序 歹寸；或
iii) 核酸分子，所述核酸分子由下列所組成具有與SEQ ID NO:2至少70%—致性的核苷酸序列、具有與SEQIDNO:4至 少70%—致性的核苷酸序列、具有與SEQ ID NO:7至少70% 一致性的核苦酸序列、具有與SEQ ID NO:9至少70%—致性 的核普酸序列以及具有與SEQ IDNO:ll至少70%—致性的核 苷酸序列。
更為優(yōu)選地，所述核酸分子由SEQ ID NOs:2， 4, 7， 9和12的每一 種的核苷酸序列組成。
可選擇地，所述核酸分子選自
i) 包括SEQ ID NOs:2， 4, 7, 9或12的至少一種的核苷酸序列 的核酸分子；或
ii) 包括下列的至少一種的核苷酸序列的核酸分子具有與 SEQ ID NO:2至少70%—致性的核苷酸序列、具有與SEQ ID NO:4至少70%—致性的核苷酸序列、具有與SEQIDNO:7至 少70%—致性的核苷酸序列、具有與SEQ ID NO:9至少70% 一致性的核苷酸序列以及具有與SEQ ID NO:ll至少70%—致 性的核苷酸序列。 更為優(yōu)選地，所述核酸分子是由SEQIDNO:2的核酸序列代表的 核酸分子，或與SEQIDNO:2雜交并編碼具有心肌黃酶活性的多肽的 變體核酸分子?？蛇x擇地，所述核酸分子是由SEQIDNO:4的核酸序 列代表的核酸分子，或與SEQIDNO:4雜交并編碼具有NADH脫氫酶 I活性的多肽的變體核酸分子?？蛇x擇地，所述核酸分子是由SEQ ID NO:7的核酸序列4、表的核酸分子，或與SEQ ID NO:7雜交并編碼具
有NAD還原氫化酶7活性的多肽的變體核酸分子。可選擇地，所述核 酸分子是由SEQ ID NO:9的核酸序列代表的核酸分子，或與SEQ ID NO:9雜交并編碼具有NAD還原氫化酶S活性的多肽的變體核酸分子。 可選擇地，所述核酸分子是由SEQ ID NO:12的核酸序列代表的核酸 分子，或與SEQIDNO:12雜交并編碼具有NAD還原氫化酶|3活性的 多肽的變體核酸分子。優(yōu)選地，所述核酸分子在嚴(yán)緊雜交條件下雜交。
優(yōu)選地，所述核酸分子由編碼SEQ ID NOs:3， 5， 8， 10和13的每 一種多肽的核苦酸序列組成。
根據(jù)另外方面，本發(fā)明提供含有本發(fā)明的宿主細(xì)胞和足以支持所 述細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)基的反應(yīng)容器。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述容器是 生物反應(yīng)器，例如發(fā)酵罐。
在另外方面，本發(fā)明提供產(chǎn)生氫氣的方法，所述方法包括
i) 提供含有本發(fā)明的宿主細(xì)胞的容器；
ii) 提供促進(jìn)通過包含于所述容器的細(xì)胞培養(yǎng)物的產(chǎn)生氬氣的 細(xì)胞培養(yǎng)條件；并且可選擇地
iii) 從所述容器收集氫氣。
根據(jù)本發(fā)明的另外方面，提供用于通過細(xì)胞產(chǎn)生氫氣并收集細(xì)胞 所產(chǎn)生氫氣的裝置，所述裝置包括
i) 含有本發(fā)明的宿主細(xì)胞的反應(yīng)容器；和
ii) 與所述細(xì)胞培養(yǎng)容器在流體上相關(guān)的第二容器，其中改造 所述第二容器以用于收集和/或儲(chǔ)存由包含于(i)中的所述細(xì)胞 培養(yǎng)容器中的細(xì)胞產(chǎn)生的氫氣。
根據(jù)本發(fā)明的另外方面，提供藍(lán)細(xì)菌氫化酶在重組表達(dá)系統(tǒng)中用 于產(chǎn)生氫氣的用途。優(yōu)選地，所述藍(lán)細(xì)菌氫化酶由核酸分子編碼，所
述核酸分子選自
i) 包括SEQIDNO:-l的核苷酸序列的核酸分子；
ii) 具有與SEQ IDNO:l的核香酸序列至少70%—致性且編碼 具有氫化酶活性的多肽的核酸分子；
iii) 與SEQ ID NO:l的核酸序列雜交且編碼具有氫化酶活性 的多肽的核酸分子；或者
iv) 包括以上i)、ii)和iii)的序列遺傳密碼的簡(jiǎn)并核苷酸序列的 核酸分子。
根據(jù)本發(fā)明的另外方面，提供由SEQIDNO:l的核酸序列代表的 核酸分子。
貫穿本申請(qǐng)文件的說明書和權(quán)利要求書，詞語(yǔ)"包括(comprise)" 和"包含"以及所述詞語(yǔ)的變形，例如"包括(comprising)"和"包括 (comprises)"指"包括但不限于"，并且并非意在(且也未)排除其它部 分、添加物、組分、整數(shù)或步驟。
貫穿本申請(qǐng)文件的說明書和權(quán)利要求書，單數(shù)包括復(fù)數(shù)，除非上
下文另有要求。特別地，若使用不定冠詞，應(yīng)將本申請(qǐng)文件理解為涉 及復(fù)數(shù)和單數(shù)，除非上下文另有要求。
應(yīng)將與本發(fā)明的特定方面、實(shí)施方案或?qū)嵤├P(guān)聯(lián)描述的特征、 整數(shù)、特性、化合物、化學(xué)部分或基團(tuán)理解為適用于本文所述的任何 其它方面、實(shí)施方案或?qū)嵤├?，除非與其不兼容。
以下進(jìn)一步詳述本發(fā)明的多種方面。
附圖簡(jiǎn)述


圖1是集胞藻PCC6803全基因組內(nèi)所有氫代謝相關(guān)基因的1:1000 比例的示意圖2是集胞藻PCC6803基因組內(nèi)所述Aox操縱子的示意圖； 圖3是表達(dá)載體pET-17b的示意圖4是本發(fā)明的表達(dá)載體的圖示，所述表達(dá)載體包括具有SEQID NO:l的核苷酸序列的核酸分子；
圖5是SEQIDNO:l的核苷酸序列；
述核酸分子選自
圖6是SEQ ID NO:2的核苷酸序列；
圖7是SEQ ID NO:3的氨基酸序列；
圖8是SEQ ID NO:4的核苷酸序列；
圖9是SEQ ID NO:5的氨基酸序列；
圖10是SEQIDNO:6的核苷酸序列；
圖11是SEQIDNO:7的核苷酸序列；
圖12是SEQIDNO:8的氨基酸序列；
圖13是SEQIDNO:9的核苷酸序列；
圖14是SEQIDNO:10的氨基酸序列；
圖15是SEQIDNO:11的核苷酸序列；
圖16是SEQIDNO:12的核苷酸序列；以及
圖17是SEQIDNO:13的氨基酸序列。
發(fā)明詳述
微藻(綠藻和藍(lán)細(xì)菌)當(dāng)作為太陽(yáng)能收獲器而生長(zhǎng)時(shí)，相對(duì)于高等 植物具有某些獨(dú)特優(yōu)勢(shì)；它們以較快的速率生長(zhǎng)，容易在開放池或封 閉反應(yīng)器中操作，并且通常具有較高的光合效率?？梢詫⑺{(lán)細(xì)菌和綠
藻從水產(chǎn)生H2的固有能力改變成開發(fā)低碳清潔能量技術(shù)中的優(yōu)勢(shì)。所
述能力依賴多達(dá)兩種不同氫化酶的活性。 一種是二聚膜結(jié)合氫化酶， 其主要限于異形細(xì)胞和再用固氮酶產(chǎn)生H2的功能。第二種是雙向氫化 酶，即能再結(jié)合并消耗光合生成的電子和質(zhì)子以既產(chǎn)生又降解H2的 酵。
集胞藻0Sy"edbc""5" sp.)PCC 6803是單細(xì)胞非固氮藍(lán)細(xì)菌和淡水 居住者。該菌抹可由外源DNA天然轉(zhuǎn)化(即，它親自吸收DNA)，它 是自發(fā)地可轉(zhuǎn)化，并且它能通過同源重組將DNA整合進(jìn)其基因組。 所述生物體能在大量不同條件下生長(zhǎng)，所述不同條件的范圍從光合自 養(yǎng)模式到完全異養(yǎng)模式，從而使干擾基本過程的遺傳修飾切實(shí)可行， 所述遺傳修飾諸如光合作用(和本案的氫化酶)的研究。這些性質(zhì)使集 胞藻PCC 6803成為諸如本文所述那些的遺傳操作的受青睞選擇。事 實(shí)上，該生物體已被表明缺少功能性吸氫酶(由于缺少大亞基)。所述
特征還增加了這一情況下所述生物體的"有用性"，因而移除該吸氫酶 的有害影響，從而使體內(nèi)篩選氫化酶活性更為準(zhǔn)確而無需考慮所述吸 氫酶的產(chǎn)生相反結(jié)果(本案中)的作用。
已描述5種基因形成所述雙向氬化酶的酶復(fù)合體，四種與編碼真 養(yǎng)產(chǎn)堿菌(i a/Wom'a e^ro; /^)的四聚NAD+'還原氫化酶的基因同源， 其中所述心肌黃酶部分由hoxFU編碼并且該氫化酶部分由hoxYH編 碼。與真養(yǎng)產(chǎn)堿菌內(nèi)的所述可溶酶形成對(duì)照的是，集胞藻PCC 6803 的雙向氫化酶基因簇含有據(jù)認(rèn)為編碼心肌黃酶第三亞單位的另外的開 放閱讀框(hoxE)。因而，已假定HoxEFU起復(fù)合體I的NADH氧化部 分的作用，活躍于呼吸或圍繞光系統(tǒng)I的循環(huán)電子傳遞，所述假定主 要?dú)w因于與線粒體復(fù)合體I(NADH:Q氧化還原酶)三亞單位的顯著序 列相似性，以及HoxE與大腸桿菌的NuoE同源(所述三亞單位之一構(gòu) 成復(fù)合體I的親水部分)。選擇性分離實(shí)驗(yàn)已確定在異形細(xì)胞藍(lán)細(xì)菌物 種的單細(xì)胞及其異形細(xì)胞和營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞兩者內(nèi)注意到活性。
藍(lán)細(xì)菌產(chǎn)氫可以得生自固氮酶或雙向氫化酶的活性。藍(lán)細(xì)菌產(chǎn)生
的凈H2因而是固氮酶和雙向氫化酶催化產(chǎn)生的H2與所述吸氫酶催化
消耗的H2總和。本申請(qǐng)涉及通過所述雙向氫化酶(l)生成氫氣，歸因 于相對(duì)于所述固氮酶(2)的能量效率顯著提高的該反應(yīng)的能量效率，如 下所示
2H++ 2e-+ 2NADP — H2 + 2NAD++ 2P; (1) N2 + 8H+ + 8e- + 16ATP — 2NH3 + H2 + 16ADP + 16& (2) 已表明存在于集胞藻PCC 6803內(nèi)的氬化酶相關(guān)基因包括(1) sll0322-氬化酶成熟蛋白HypF(hypF)、 (2) slll078-氫化酶表達(dá)/形成蛋 白HypA(hypA)、 (3) slll079-氫化酶表達(dá)/形成蛋白HypB(hypB)、 (4) slll220-NADH脫氬酶I鏈E(hoxE)、 (5) slll221畫NADH脫氫酶I鏈 F(hoxF)、 (6) slll223-NAD-還原氫化酶HoxS 7亞單位(hoxU)、 (7) slll224-NAD-還原氬化酶HoxS S亞單位(hoxY)(EC. 1.12,1.2) 、 (8) slll226-NAD-還原氫化酶HoxS 0亞單位(hoxH)、 (9) slll432-氫化酶同 工酶形成(鎳并入)蛋白HypB(hypB)、 (10) slll462-氫化酶表達(dá)/形成蛋 白HypE(hypE)、 (11) slll559-可溶氫化酶42 kD亞單位、(12) slrl498-
氫化酶同工酶形成蛋白HypD(hypD)、(13) slrl675-氫化酶形成(鎳并入) 蛋白HypA(hypA)、 (14) slr2135-氫化酶輔助蛋白、(15) ssl3580-氫化酶 表達(dá)/形成蛋白HypC(hypC)。
集胞藻PCC 6803內(nèi)所有這些氫化酶相關(guān)基因的確切定位圖示于 圖1，所述圖即覆蓋該生物體全基因組的約75%的定位圖。因此，如 圖2所示，本發(fā)明利用長(zhǎng)約7 kb的得自集胞藻PCC 6803的Aojc操縱 子序列。
載體
如本文所用，術(shù)語(yǔ)"載體"指能夠轉(zhuǎn)運(yùn)已與它連接的另一核酸的 核酸分子。該載體能夠自主復(fù)制或者能整合進(jìn)宿主DNA。該載體可以 包括用于重組DNA插入的限制性酶位點(diǎn)，并且可以包括一種或多種 可選擇標(biāo)志物。該栽體可以是質(zhì)粒、噬菌體或粘粒形式的核酸。最為 優(yōu)選地，該載體適于細(xì)菌表達(dá)，例如，適于在大腸桿菌、枯草桿菌 (5ac/〃w w6"fe)、 沙門氏菌屬(Salmonella)、 葡萄；求菌屬 (staphylococcus)、鏈主求菌屬(Streptococcus)、 酵母菌(Saccharomycetes) 等中表達(dá)。
優(yōu)選地，該載體能夠在細(xì)菌細(xì)胞中增殖，并且被穩(wěn)定地傳遞至后代。
本文所用"可操作連接的"指單一上述控制元件或上述控制元件 的組合與編碼序列相互以功能性關(guān)系(例如，以使得指導(dǎo)所述編碼序列 表達(dá)的連接關(guān)系)在一起。
本文所用"調(diào)節(jié)序列"指能夠控制基因表達(dá)的DNA或RNA元件。 表達(dá)控制序列的實(shí)例包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、沉默子、SD序列(Shine Dalgarno sequences), TATA盒、內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)、轉(zhuǎn)錄因 子的附著位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄終止子、多聚腺苷酸化位點(diǎn)、RNA轉(zhuǎn)運(yùn)信號(hào)或?qū)?于紫外光介導(dǎo)基因應(yīng)答重要的序列。優(yōu)選地，所述表達(dá)載體包括與待 表達(dá)核酸序列可操作連接的 一種或多種調(diào)節(jié)序列。調(diào)節(jié)序列包括指導(dǎo) 組成型表達(dá)的那些，以及組織特異性調(diào)節(jié)和/或誘導(dǎo)型序列。
本文所用"啟動(dòng)子"指與RNA聚合酶結(jié)合以開始轉(zhuǎn)錄的DNA或
RNA的核苷酸序列。所述啟動(dòng)子可以是誘導(dǎo)型或組成型表達(dá)的?？蛇x 擇地，所述啟動(dòng)子受控于阻遏蛋白或刺激蛋白。優(yōu)選地，所述啟動(dòng)子 是T7、 T3、 lac、 lacUV5、 tac、 trc、 [X]PL、 Sp6或紫外線誘導(dǎo)型啟動(dòng) 子。更為優(yōu)選地，所述啟動(dòng)子是已知在例如大腸桿菌的細(xì)菌中具有功 能的T7或T3啟動(dòng)子。
本文所用"轉(zhuǎn)錄終止子"指終止負(fù)責(zé)將DNA轉(zhuǎn)錄成RNA的RNA 聚合酶功能的DNA元件。優(yōu)選的轉(zhuǎn)錄終止子由富含GC的二重對(duì)稱區(qū) 域后接連續(xù)的T殘基而表征。更為優(yōu)選地，轉(zhuǎn)錄終止子是來自所述T7 噬菌體的終止子序列。
本文所用"翻譯控制元件"指控制mRNA翻譯的DNA或RNA 元件。優(yōu)選的翻譯控制元件是核糖體結(jié)合位點(diǎn)。優(yōu)選地，所述翻譯控 制元件來自與所述啟動(dòng)子同源的系統(tǒng)，例如啟動(dòng)子和其相關(guān)的核酶結(jié) 合位點(diǎn)。優(yōu)選的核糖體結(jié)合位點(diǎn)是T7或T3核糖體結(jié)合位點(diǎn)。
本文所用"限制性酶識(shí)別位點(diǎn)"指由限制性酶識(shí)別的DNA的基序。
本文所用"可選擇標(biāo)志物"指蛋白，所述蛋白當(dāng)表達(dá)于宿主細(xì)胞 時(shí)在所述細(xì)胞上賦予表型，其允許選擇表達(dá)所述可選擇標(biāo)志物基因的 所述細(xì)胞。 一般來說，這可以是賦予對(duì)諸如氨節(jié)青霉素、卡那霉素、 氯霉素、四環(huán)素、潮霉素、新霉素或甲氨蝶呤的抗生素的抗性的蛋白。 抗生素的另外實(shí)例是青霉素、鹽酸氨千青霉素、氨千青霉素鈉、羥氨 千青霉素鈉、羧芐青霉素鈉、青霉素G、頭孢菌素、頭孢噻肟鈉、鹽 酸先鋒霉素、萬(wàn)古霉素、環(huán)絲氨酸。其它實(shí)例包括細(xì)菌抑制劑，例如 氯霉素、紅霉素、林可霉素、四環(huán)素、硫酸壯觀霉素、鹽酸克林霉素、 鹽酸金霉素。
所述表達(dá)載體的設(shè)計(jì)依賴諸如待轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的選擇、所需蛋白 表達(dá)的水平等等的因素。本發(fā)明的表達(dá)載體可以被導(dǎo)入宿主細(xì)胞從而 產(chǎn)生包括融合蛋白或多肽的由本文所述的核酸編碼的蛋白或多肽(例 如，集胞藻PCC6803雙向氫化酶蛋白復(fù)合體，即hoxE、 hoxF、 hoxU、 hoxY和hoxH蛋白亞單位)。
原核生物中蛋白表達(dá)最常使用含有指導(dǎo)融合或非融合蛋白表達(dá)的
組成型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的載體在大腸桿菌中進(jìn)行。融合載體向其中編 碼的蛋白(通常是向所述重組蛋白的氨基末端)添加一定量的氨基酸。
所述融合載體通常達(dá)到三種目的l)增強(qiáng)重組蛋白表達(dá)；2)增強(qiáng)所述 重組蛋白的可溶性；以及3)通過作為親和純化的配體起作用而幫助所 述重組蛋白的純化。通常，在所述融合部分和所述重組蛋白的連接處 導(dǎo)入蛋白水解切割位點(diǎn)以使所述重組蛋白從所述融合部分分開以隨后 純化融合蛋白。所述載體在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
優(yōu)選地，所述載體包括對(duì)在細(xì)菌細(xì)胞中表達(dá)雙向氬化酶蛋白復(fù)合 體必需的那些遺傳元件。在細(xì)菌細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄和翻譯所需的元件包括啟 動(dòng)子、所述雙向氫化酶蛋白復(fù)合體編碼區(qū)和轉(zhuǎn)錄終止子。
本發(fā)明的表達(dá)載體可以是細(xì)菌表達(dá)載體，例如重組噬菌體DNA、 質(zhì)粒DNA或粘粒DNA、例如重組酵母表達(dá)載體的酵母表達(dá)載體、例 如重組病毒(例如桿狀病毒)表達(dá)載體的用于在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)的載 體，或者用于在植物細(xì)胞中表達(dá)的載體，例如重組的病毒(諸如花椰菜 花葉病毒、CaMV、煙草花葉病毒、TMV)表達(dá)載體或重組的質(zhì)粒(諸如 Ti質(zhì)粒)表達(dá)載體。
優(yōu)選地，所述載體是細(xì)菌表達(dá)載體。優(yōu)選地，本表達(dá)載體是高拷 貝數(shù)表達(dá)載體；可選擇地，本表達(dá)載體是低拷貝數(shù)表達(dá)載體，例如， 樣吏型F質(zhì)粒。
優(yōu)選地，所述載體是包括T7啟動(dòng)子系統(tǒng)的細(xì)菌表達(dá)載體?？蛇x 擇地，所述載體是包括^c啟動(dòng)子系統(tǒng)的細(xì)菌表達(dá)栽體。
更為優(yōu)選地，所述載體是pET表達(dá)載體。例如，所述載體可以是 Novogen⑧pET載體，諸如pET-3a、 pET-3b、 pET-3c、 pET-3d、 pET-9a、 pET國(guó)9b、pET-9c、pET國(guó)9d、pET-lla、pET誦llb、pET國(guó)llc、pET國(guó)lld、pET隱12a、 pET國(guó)12b、 pET-12c、 pET-14b、 pET陽(yáng)15b、 pET國(guó)16b、 pET-17b、 pET-17xb、 pET畫19b、 pET畫20b(+)、 pET隱21(+)、 pET-21a(+)、 pET-21b(+)、 pET畫21c(+)、 pET畫21d(+) 、 pET-22b(+) 、 pET-23(+) 、 pET-23a(+) 、 pET-23b(+)、 pET-23c(+) 、 pET-23d(+) 、 pET-24(+) 、 pET-24a(+) 、 pET-24b(+)、 pET-24c(+)、 pET-24d(+)、 pET-25b(+) 、 pET-26b(+) 、 pET-27b(+)、 pET陽(yáng)28a(+)、 pET-28b(+)、 pET-28c(+) 、 pET陽(yáng)29a(+) 、 pET-29b(+)、
pET國(guó)29c(+)、 pET-30Ek/LIC、 pET國(guó)30 Xa/LIC、 pET-30a(+)、 pET-30b(+)、 pET誦30c(+)、 pET-31b(+)、 pET國(guó)32 Ek/LIC、 pET-32 Xa/LIC、 pET國(guó)32a(+)、 pET-32b(+)、 pET-32c(+)、 pET-33b(+) 、 pET-39b(+) 、 pET-40b(+)、 pET-41a(+)、 pET-41b(+)、 pET-41c(+)、 pET-41 Ek/LIC、 pET-42a(+)、 pET-42b(+)、 pET-42c(+)、 pET-43.1a(+)、 pET-43.1b(+)、 pET-43.1c(+)、 pET-43.1 Ek/LIC、 pET-44a(+)、 pET-44b(+)、 pET-44c(+)、 pET-44 Ek/LIC、 pET-45b(+)、 pET曙46 Ek/LIC、 pET國(guó)47b(+)、 pET-48b(+)、 pET隱49b(+)、 pET畫50b(+)、 pLacl、 pLysE、 pLysS，或者Invitrogen pET栽體，侈'JJ(口， pET161國(guó)DEST、 pET101/D-TOPO、 pET151/D/LacZ、 pET104.1國(guó)DEST、 pET161-GW/CAT、 pET104.1/GW/lacZ、 pET SUMO/CAT、 pETS而O、 pET-DEST41 、 pET-DEST42、 pET101/D/LacZ 、 pET151/D-TOPO 、 pET161國(guó)DEST、 pET100/D/LacZ、 pET161曙GW/CAT、 pET151/D/LacZ、 pET101/D-TOPO、 pET104-DEST、 pET160-DEST、 pET102/D/LacZ、 pET200/D/LacZ 、pET200/D國(guó)TOPO 、pET161/GW/D陽(yáng)TOPO 、 pET160國(guó)GW/CAT。
更為優(yōu)選地，所述載體是圖3所示的pET-17b(Novagen ， Madison, Wisconsin, USA), (Seed, B. (1987) Mm/w 329, 840)。所述pET-17b載體 攜帶后接有用克隆位點(diǎn)區(qū)域的N-末端11aaT7標(biāo)簽序列。包含于所述 多克隆區(qū)的是允許使用不對(duì)稱連接子有效克隆的雙/位點(diǎn)。獨(dú)特 位點(diǎn)示于圖3的環(huán)形圖。所述序列通過Pbr322慣例編號(hào)，因而所述 T7表達(dá)區(qū)在環(huán)形圖上反向。圖4示出T7RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄的編碼鏈的 克隆/表達(dá)區(qū)。
pET-17b載體包括T7啟動(dòng)子(核酸333-349)、T7轉(zhuǎn)錄起始(核酸332) 和T7終止子(核酸28-74)。所述pET-17b栽體還包括允許親和純化被 表達(dá)的酶的T7標(biāo)簽序列。所述pET-17b載體是/人所述BamHI識(shí)別位 點(diǎn)后的GAT三聯(lián)子表達(dá)的翻譯載體。
特別地，含有所述T7啟動(dòng)子區(qū)域的載體(例如，pET-17b)的使用 需要所述宿主細(xì)胞適于蛋白的高表達(dá)。
集胞藻PCC6803 Hox搡縱子
如本文所用，術(shù)語(yǔ)"核酸分子，，包括DNA分子(例如，cDNA或 基因組DNA)和RNA分子(例如mRNA)以及例如，通過使用核苷酸類 似物生成的DNA或RNA類似物。所述核酸分子可以是單鏈或雙鏈， l旦優(yōu)選是雙鏈DNA。
關(guān)于基因組DNA，術(shù)語(yǔ)"分離的"包括從與基因組DNA天然結(jié) 合的染色體分離的核酸分子。優(yōu)選地，"分離的"核酸沒有在所述核酸 得自的生物體的基因組DNA中天然側(cè)翼連接所述核酸的序列(即位于 所述核酸5，端和/或3'端的序列)。此外，諸如cDNA分子的"分離的" 核酸分子可以是由重組技術(shù)產(chǎn)生時(shí)基本上無其它細(xì)胞物質(zhì)或培養(yǎng)基， 或者由化學(xué)合成時(shí)基本上無化學(xué)前體或其它化學(xué)制品。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)"在嚴(yán)緊條件下雜交"描述雜交和清洗條件。 嚴(yán)緊條件為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知并能在可獲得的參考文獻(xiàn)(例如， Current Protocols in Molecular Biology(分子生物學(xué)實(shí)-瞼室指南)，John Wiley & Sons, N.Y., 1989， 6.3.1-6.3.6)中找到。水性及非水性方法描述 于該參考文獻(xiàn)且均可使用。嚴(yán)緊雜交條件的優(yōu)選實(shí)例是在約45。C下于 6x氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中雜交，隨后在50。C下于0.2xSSC、0.1%(w/v) SDS中清洗一次或多次。嚴(yán)緊雜交條件的另一實(shí)例是在約45。C下于 6xSSC中雜交，隨后在55。C下于0.2xSSC、 0.1%(w/v) SDS中清洗一 次或多次。嚴(yán)緊雜交條件的另外實(shí)例是在約45°C下于6xSSC中雜交， 隨后在60。C下于02xSSC、 0.1%(w/v) SDS中清洗一次或多次。優(yōu)選 地，嚴(yán)緊雜交條件是在約45。C下于6xSSC中雜交，隨后在65。C下于 0.2xSSC、 0.1%(w/v)SDS中清洗一次或多次。特別優(yōu)選的嚴(yán)緊雜交條 件(以及如果實(shí)施者不確定應(yīng)當(dāng)應(yīng)用什么條件以確定分子是否在本發(fā) 明的雜交限制內(nèi)，應(yīng)當(dāng)使用的條件)是在65°C下0.5摩爾磷酸鈉、 7%(w/v)SDS,隨后在65。C下于0.2xSSC、 l%(w/v) SDS中清洗一次或 多次。優(yōu)選地，在嚴(yán)緊條件下與SEQIDNO:1,2，4， 6, 7, 9, 11或12的 序列雜交的本發(fā)明的分離的核酸分子對(duì)應(yīng)天然存在的核酸分子。
如本文所用，"天然存在的"核酸分子指具有天然存在(例如，編 碼天然蛋白)的核苷酸序列的RNA或DNA分子。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)"基因"和"重組基因"指核酸分子，其包含
編碼蛋白的開放閱讀框，還可以包含非編碼調(diào)節(jié)序列和內(nèi)含子。
"非必需"氨基酸殘基是可以在(例如，SEQIDNO:3， 5, 8, 10或 13的序列)的野生型序列改變的殘基，所述改變不破壞、或更為優(yōu)選地 基本上不改變生物學(xué)活性，但是"必需"氨基酸殘基導(dǎo)致這種變化。 例如，據(jù)預(yù)測(cè)在本發(fā)明的多肽中保守的氨基酸殘基(例如，存在于保守 的鉀通道結(jié)構(gòu)域的那些)尤其經(jīng)不起改變，除開通?？梢詫⒖缒そY(jié)構(gòu)域 的氨基酸殘基替換為具有大概等價(jià)的疏水性的其它殘基而不顯著改變 活性。
"保守氨基酸取代"是使用具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基代替所述 氨基酸殘基的取代。本領(lǐng)域已定義具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基家族。 這些家族包括具有堿性側(cè)鏈(例如，賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性 側(cè)鏈(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不帶電極性側(cè)鏈(例如，甘氨酸、天 冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非極性側(cè) 鏈(例如，丙胺酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、 甲疏氨酸、色氨酸)、/3分支側(cè)鏈(例如，蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸) 和芳香族側(cè)鏈(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)的氨基酸。 因而，優(yōu)選地使用來自相同側(cè)鏈家族的另 一氨基酸殘基代替蛋白的非 必需氨基酸殘基。可選擇地，在另一實(shí)施方案中，可以諸如通過飽和 突變沿全部或部分編碼序列隨機(jī)引入突變，并且可以篩選所得突變體 的生物學(xué)活性以鑒定保留活性的突變體。依照SEQ ID NO:l， 2， 4, 6, 7, 9， 11或12的突變，可以重組地表達(dá)所編碼蛋白并且可以確定所述蛋 白的活性。
如本文所用，蛋白的"生物學(xué)活性部分"包括參與分子和非分子 間相互作用的蛋白片段。蛋白的生物學(xué)活性部分包括由足夠同源于或 得自所述蛋白的氨基酸序列(例如，SEQIDNO:3，5，8， 10和13所示的 氨基酸序列)的氨基酸序列組成的肽，所述肽包括比全長(zhǎng)蛋白更少的氨 基酸并表現(xiàn)蛋白的至少一種活性。通常地，生物學(xué)活性部分包括具有 所述蛋白的至少 一 種活性的結(jié)構(gòu)域或基序，所述活性例如調(diào)節(jié)膜應(yīng)激 性、胞內(nèi)離子濃度、膜極化和動(dòng)作電位的能力。
蛋白的生物學(xué)活性部分可以是SEQ IDNO:3， 5， 8, 10或13的例如
長(zhǎng)50， 100， 150, 200， 250， 300， 350， 400， 450， 500或更多氨基酸的多肽。 蛋白的生物學(xué)活性部分可以用作開發(fā)調(diào)節(jié)介導(dǎo)的活性，例如本文所述 生物學(xué)活性，的試劑的靶。
如下進(jìn)行序列間序列同源性或一致性(所述術(shù)語(yǔ)在本文可互換使 用)的計(jì)算。
為確定兩種氨基酸序列或兩種核酸序列的百分?jǐn)?shù)一致性，以最優(yōu) 比較目的比對(duì)所述序列(例如，可以在第一和第二氨基酸或核酸序列之 一或兩者中引入間隔以最優(yōu)比對(duì)，并且為比較目的可以忽略非同源序 列)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，為比較目的比對(duì)的參考序列的長(zhǎng)度是所述參 考序列長(zhǎng)度的至少30%，優(yōu)選至少40%,更優(yōu)選至少50%,還更優(yōu)選 至少60%,還更優(yōu)選至少70%、 75%、 80%、 82%、 84%、 85%、 86%、 87%、 88%、 89%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或100%。隨后比較相應(yīng)氨基酸位置或核苷酸位置的氨基酸 殘基或核苷酸。如果第一序列的位置由與第二序列的相應(yīng)位置相同的 氨基酸殘基或核苷酸占據(jù)，那么所述分子在該位置一致(如本文所用， 氨基酸或核酸的"一致性"等價(jià)于氨基酸或核酸的"同源性")?？紤] 到為最優(yōu)比對(duì)所述兩序列需要引入的間隔數(shù)量以及每一 間隔的長(zhǎng)度， 所述兩序列間的百分?jǐn)?shù)一致性是所述序列共有的一致位置的數(shù)量函 數(shù)。
可以使用數(shù)學(xué)算法完成兩序列間的序列比較和百分?jǐn)?shù)一致性的確 定。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用已并入GCG軟件包的GAP程序(可自 http:〃www.gcg.com獲4尋)6勺 Needleman et al. (1970) /. Mo/. 5z'o/. 48:444-453)算法，使用BLOSUM 62矩陣或PAM250矩陣，以及16, 14， 12, 10, 8, 6或4的間隔加權(quán)和1，2，3，4, 5或6的長(zhǎng)度加權(quán)，確定兩氨 基酸序列間的百分?jǐn)?shù)一致性。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，使用GCG軟件 包的GAP程序(可自http:〃www.gcg.com獲得)，使用NWSgapdna.CMP 矩陣和40, 50, 60, 70或80的間隔加權(quán)以及1， 2， 3， 4, 5或6的長(zhǎng)度加 權(quán)，確定兩核苷酸序列間的百分?jǐn)?shù)一致性。特別優(yōu)選的參數(shù)組(以及如
致性或同源性限制之內(nèi)時(shí)，應(yīng)使用的參數(shù)組)是具有12的間隔罰分、4
的間隔擴(kuò)展罰分和5的移框間隔罰分的BLOSUM 62評(píng)分矩陣。
可以使用已并入ALIGN程序(版本2.0)的Meyers et al. (1989) C45/OS4:ll-17)算法，使用PAM120加權(quán)殘基表、12的間隔長(zhǎng)度罰分 和4的間隔罰分，確定兩氨基酸或核苷酸序列間的百分?jǐn)?shù) 一 致性。
本文所述的核酸和蛋白序列可以用作"查詢序列"以進(jìn)行對(duì)公共 數(shù)據(jù)庫(kù)的檢索，從而，例如鑒定其它家族成員或相關(guān)序列?？梢允褂?Altschul, et al.(1990)J. Mo/.所o/. 215:403-410)的NBLAST和XBLAST 程序(版本2.0)進(jìn)行所述4企索。可以使用NBLAST程序、分?jǐn)?shù)=100、 詞長(zhǎng)=12進(jìn)行BLAST核苦酸檢索，以獲得與本發(fā)明的核酸分子同源的 核苷酸序列。可以使用XBLAST程序、分?jǐn)?shù)=50、詞長(zhǎng)=3進(jìn)行BLAST 蛋白檢索，以獲得與本發(fā)明的蛋白分子同源的氨基酸序列。為獲得比 較目的下的間隔比對(duì)，可以如Altschul et al. (1997， iVwc/.爿"V/j 25:3389-3402)所述使用間隔BLAST。當(dāng)使用BLAST和間隔BLAST 程序時(shí)，可以使用各自程序(例如，XBLAST和NBLAST)的默認(rèn)參數(shù)。 參見〈http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov〉。
由本發(fā)明的載體表達(dá)的多肽可以具有與SEQ ID NO:3， 5， 8， 10或 13的氨基酸序列足夠或基本上一致的氨基酸序列。本文所用的術(shù)語(yǔ) "足夠一致的"或"基本上一致的"指含有足夠量的或最少量的與第 二氨基酸或核苷酸序列一致或等價(jià)(例如，具有相似側(cè)鏈)的氨基酸殘 基或核苦酸的第 一氨基酸或核苷酸序列，以致第 一和第二氨基酸或核 苷酸序列具有共同結(jié)構(gòu)域或共同功能性活性。例如，本文將含有具有 至少約60%或65%—致性、很可能75%—致性、更可能85%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%或99%—致性的共 同結(jié)構(gòu)域的氨基酸或核苷酸序列定義為足夠或基本上一致。
本申請(qǐng)的表達(dá)載體包含編碼雙向氫化酶蛋白復(fù)合體的核酸序列。 所述核酸序列優(yōu)選地編碼圖2 —般性示出的/ ox操縱子編碼的集 胞藻PCC 6803的雙向氫化酶蛋白復(fù)合體。
本申請(qǐng)的/ ox:操縱子的核酸序列示于SEQ ID NO:l。所述序列長(zhǎng) 約6532個(gè)核苷酸。所述操縱子含有8個(gè)編碼序列SEQ ID NO: 1， 2， 4， 6, 7, 9， 11和12。
SEQ ID NO:2(SEQ ID NO:l的核苷酸31-429)是522個(gè)核苷酸(174 個(gè)氨基酸)心肌黃酶中長(zhǎng)約399個(gè)核苷酸且編碼133個(gè)氨基酸的命名為 hoxE的NADH脫氫酶I鏈E(SEQ ID NO:3)。
SEQ ID NO:4(SEQ ID NO:l的核苷酸627-2228)長(zhǎng)約1602個(gè)核苷 酸，且編碼533個(gè)氨基酸的命名為/zojcF的NADH脫氫酶I鏈F(SEQ ID NO:5)。
SEQ ID NO:6(SEQ ID NO:l的核苷酸2269-2907)長(zhǎng)約639個(gè)核苷 酸，且編碼與參與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)和DNA復(fù)制的與病毒調(diào)節(jié)性蛋白E2共有 28。1%—致性的未知蛋白。
SEQ ID NO:7(SEQ ID NO:l的核苷酸2934-3650)長(zhǎng)約717個(gè)核苷 酸，且編碼238個(gè)氨基酸心肌黃酶，即命名為AojcU的NAD還原氫化 酶7亞單位(SEQ ID NO:8)。
SEQ ID NO:9(SEQ ID NO:l的核苷酸3696-4244)長(zhǎng)約549個(gè)核苷 酸，且編碼182個(gè)氨基酸的命名為Ao;cY的NAD還原氫化酶S亞單位 (SEQ ID NO: 10)。
SEQ ID NO: 11 (SEQ ID NO:l的核苷酸4560-5009)長(zhǎng)約450個(gè)核苷 酸，且編碼與同樣未知功能的極端嗜熱菌(77^nwws Aeramo; /n7w)HB27 蛋白共有32.8%—致性的未知蛋白。
SEQ ID NO:12(SEQ ID NO:l的核苦酸5099-6523)長(zhǎng)約1425個(gè)核 苦酸，且編碼474個(gè)氨基酸的命名為/zojcH的NAD還原氫化酶/3亞單 位(SEQ ID NO: 13)。
以下描述并入本發(fā)明的表達(dá)載體的另外核酸分子。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的表達(dá)載體包括核酸分子，所述核酸 分子包括SEQIDNO:l的核苷酸序列或其部分或其片段。在一個(gè)實(shí)施 方案中，所述表達(dá)載體包括核酸分子，所述核酸分子包括編碼SEQID NOs:3， 5, 8， 10和13(集胞藻PCC6803五聚氫化酶蛋白復(fù)合體亞單位) 的多肽的核苷酸序列。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述表達(dá)載體包括核酸分 子，所述核酸分子包括SEQ ID NOs:2， 4, 7, 9和12(HoxEFUYH編碼區(qū)) 的核苷酸序列。在可選擇的實(shí)施方案中，所述表達(dá)載體包括核酸分子， 所述核酸分子包4舌SEQ ID NOs:2， 4, 6， 7, 9, 11和12的核苷酸序列。
還在另一實(shí)施方案中，所述表達(dá)載體包括核苷酸序列，所述核苷酸序
列包括SEQIDNO:l的片段，優(yōu)選地所述片段是生物學(xué)活性片段，即 具有氫化酶活性。
在另 一實(shí)施方案中，所述表達(dá)載體包括與SEQ ID NOs:l, 2, 4, 6, 7， 9， 11和12的任一所示的核苷酸序列或其部分或其片段互補(bǔ)的核酸序 列。在其它實(shí)施方案中，表達(dá)載體包括與SEQIDNOs:l， 2,4,6， 7， 9, 11 和12的任一所示的核苷酸序列足夠互補(bǔ)的核酸序列，以致它可以分別 與SEQIDNOs:1，2，4， 6, 7, 9, 11和12的任一所示的核苷酸序列雜交， 從而形成穩(wěn)定二聚體。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述表達(dá)載體包括與SEQIDNO:l所示的核 苷酸序列的全長(zhǎng)或其部分或其片段至少約60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99% 或100%同源的核酸序列。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述表達(dá)載體包括編碼多肽的天然存在的等 位變體的核酸序列，所述多肽包括SEQIDNO:3， 5, 8, 10和13所示的 氨基酸序列。SEQ ID NO:3， 5， 8， 10或13所示的氫化酶亞單位等位變 體包括功能性等位變體和hoxE、 hoxF、 hoxU、 hoxY或hoxH的氫化 酶亞單位。功能性等位變體是SEQ IDNO:3， 5， 8, 10和13所示的hoxE、 hoxF、 hoxU、 hoxY或hoxH的氫化酶亞單位的天然存在的氨基酸序列 變體，其維持氫化酶活性。功能性等位變體通常會(huì)只包含SEQ ID NO:3， 5， 8， 10或13的一種或多種氨基酸的保守性取代，或所述蛋白非關(guān)鍵 區(qū)的非關(guān)鍵殘基的取代、刪除或插入。非功能性等位變體是SEQ ID NO:3,5，8， 10或13的天然存在的氨基酸序列變體，其不具有氫化酶活 性。非功能性等位變體通常會(huì)只包含SEQIDNO:3，5，8, 10或13的氨 基酸序列的非保守性取代、刪除或插入或過早截?cái)啵蜿P(guān)鍵殘基或關(guān) 鍵區(qū)的取代、插入或刪除。相應(yīng)于本發(fā)明的氫化酶核酸分子的天然等 位變體和同源物的核酸分子可以基于其與本發(fā)明的核酸分子的同源 性、4吏用SEQIDNO:1，2, 4, 6，7，9， 11或12所述的核苷酸序列或其部 分作為嚴(yán)緊雜交條件下的雜交探針而分離。
在另外的實(shí)施方案中，所述表達(dá)載體包括由SEQIDNO:2的核酸
序列代表的核酸分子，或與SEQIDN0:2雜交并編碼具有心肌黃酶活 性的多肽的變體核酸分子。
在另外的實(shí)施方案中，所述表達(dá)載體包括由SEQIDNO:4的核酸 序列代表的核酸分子，或與SEQIDNO:4雜交并編碼具有NADH脫氫 酶I活性的多肽的變體核酸分子。
在另外的實(shí)施方案中，所述表達(dá)載體包括由SEQIDNO:7的核酸 序列代表的核酸分子，或與SEQ ID NO:7雜交并編碼具有NAD還原 氬化酶7活性的多肽的變體核酸分子。
在另外的實(shí)施方案中，所述表達(dá)載體包括由SEQIDNO:9的核酸 序列代表的核酸分子，或與SEQ ID NO:9雜交并編碼具有NAD還原 氫化酶S活性的多肽的變體核酸分子。
在另外的實(shí)施方案中，所述表達(dá)載體包括由SEQ ID NO:12的核 酸序列代表的核酸分子，或與SEQIDNO:12雜交并編碼具有NAD還 原氫化酶j8活性的多肽的變體核酸分子。
在另外的實(shí)施方案中，所述表達(dá)載體包括核酸分子，所述核酸分 子包括SEQIDNO:2的核苷酸序列或其部分或其片段。在另一實(shí)施方 案中，所述表達(dá)栽體包括核酸分子，所述核酸分子包括與SEQIDNO:2 的核苷酸序列的全長(zhǎng)或其部分或其片段至少約60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或100%同源的核苷酸序列。在另一實(shí)施方案中，所述表達(dá)載體包 括核酸分子，所述核酸分子包括SEQIDNO:2的核苷酸序列或其部分 或其片^殳以及SEQIDNO:4， 6， 7， 9， 11或12的至少一種核香酸序列或 其部分或其片段。在另一實(shí)施方案中，所述表達(dá)載體包括核酸分子， 所述核酸分子包括SEQ ID NO:2的核苷酸序列或其部分或其片段以及 與SEQIDNO:4， 6， 7， 9， 11或12的核苷酸序列的全長(zhǎng)或其部分或其片 段至少約60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或100%同源的至少一種核 苷酸序列。在另一實(shí)施方案中，所述表達(dá)載體包括核酸分子，所述核 酸分子包括與SEQIDNO:2的核苷酸序列的全長(zhǎng)或其部分或其片段至 少約60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 91%、 92%、 93%、
94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或100%同源的核苷酸序列，以及 SEQ IDNO:4， 6, 7, 9, 11或12的至少一種核香酸序列或其部分或其片 段。在另一實(shí)施方案中，所述表達(dá)載體包括核酸分子，所述核酸分子 包括與SEQ ID NO:2的核苷酸序列的全長(zhǎng)或其部分或其片段至少約 60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或100%同源的核苷酸序列，以及與SEQ ID NO:4， 6， 7， 9， 11或12的核苷酸序列的全長(zhǎng)或其部分或其片^R至少 約60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或100%同源的至少一種核苷酸序列。
在另一實(shí)施方案中，所述表達(dá)載體包括核酸分子，所述核酸分子 包括編碼SEQ ID NO:3的多肽(集胞藻PCC6803五聚氫化酶蛋白復(fù)合 體的hoxE蛋白亞單位)或其部分或其片段的核苷酸序列。在另一實(shí)施 方案中，所述表達(dá)載體包括核酸分子，所述核酸分子包括編碼與SEQ ID NO:3的多肽的全長(zhǎng)或其部分或其片革殳至少約60%、65%、70%、75%、 80%、 85%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或100%同源的多肽的核苦酸序列。在另一實(shí)施方案中，所述表達(dá) 載體包括核酸分子，所述核酸分子包括編碼SEQIDNO:3的多肽或其 部分或其片段的核苷酸序列以及編碼SEQ ID NO:5， 8， 10或13的多肽 的至少一種或其部分或其片段的核苷酸序列。在另一實(shí)施方案中，所 述表達(dá)載體包括核酸分子，所述核酸分子包括編碼SEQIDNO:3的多 肽或其部分或其片段的核苷酸序列，以及編碼與SEQ ID NO:5， 8， 10 或13的多肽的全長(zhǎng)或其部分或其片段至少約60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或100%同源的多肽的至少一種核苷酸序列。在另一實(shí)施方案中， 所述表達(dá)載體包括核酸分子，所述核酸分子包括編碼與SEQ ID NO:3 的多肽的全長(zhǎng)或其部分或其片段至少約60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99% 或100%同源的多肽的核苷酸序列，以及編碼SEQIDNO:5， 8, 10或13 的多肽的至少一種或其部分或其片段的核苷酸序列。在另一實(shí)施方案 中，所述表達(dá)載體包括核酸分子，所述核酸分子包括編碼與SEQ IDNO:3的多肽的全長(zhǎng)或其部分或其片^:至少約60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90o/o、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或100%同源的多肽的核苷酸序列，以及編碼與SEQ ID NO:5， 8, 10 或13的多肽的全長(zhǎng)或其部分或其片段至少約60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或100%同源的多肽的至少一種核苷酸序列。
在另外的實(shí)施方案中，所述表達(dá)載體包括核酸分子，所述核酸分 子包括SEQIDNO:4的核苷酸序列或其部分或其片段。在另一實(shí)施方 案中，所述表達(dá)載體包括核酸分子，所述核酸分子包括與SEQIDNO:4 的核苷酸序列的全長(zhǎng)或其部分或其片段至少約60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或100%同源的核苷酸序列。在另一實(shí)施方案中，所述表達(dá)載體包 括核酸分子，所述核酸分子包括SEQIDNO:4的核苷酸序列或其部分 或其片段以及SEQIDNO:2， 6,7, 9, 11或12的至少一種核苦酸序列或 其部分或其片段。在另一實(shí)施方案中，所述表達(dá)載體包括核酸分子， 所述核酸分子包括SEQ ID NO:4的核苦酸序列或其部分或其片4殳以及 與SEQIDNO:2， 6， 7， 9, 11或12的核苷酸序列的全長(zhǎng)或其部分或其片 段至少約60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或100%同源的至少一種核 苷酸序列。在另一實(shí)施方案中，所述表達(dá)載體包括核酸分子，所述核 酸分子包括與SEQ ID NO:4的核苷酸序列的全長(zhǎng)或其部分或其片段至 少約60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或100%同源的核普酸序列，以及 SEQ IDNO:2， 6, 7， 9, 11或12的至少一種核苷酸序列或其部分或其片 段。在另一實(shí)施方案中，所述表達(dá)載體包括核酸分子，所述核酸分子 包括與SEQ ID NO:4的核香酸序列的全長(zhǎng)或其部分或其片段至少約 60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或100%同源的核苷酸序列，以及與SEQ ID NO:2， 6， 7， 9, 11或12的核苷酸序列的全長(zhǎng)或其部分或其片l殳至少 約60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、
95%、 96%、 97%、 98%、 99%或100%同源的至少一種核苷酸序列。
在另一實(shí)施方案中，所述表達(dá)載體包括核酸分子，所述核酸分子 包括編碼SEQ ID NO:5的多肽(集胞藻PCC6803五聚氫化酶蛋白復(fù)合 體的hoxF蛋白亞單位)或其部分或其片段的核苷酸序列。在另一實(shí)施 方案中，所述表達(dá)載體包括核酸分子，所述核酸分子包括編碼與SEQ ID NO:5的多肽的全長(zhǎng)或其部分或其片段至少約60。/o、65Q/。、70。/。、750/0、 80%、 85%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或100%同源的多肽的核苷酸序列。在另一實(shí)施方案中，所述表達(dá) 載體包括核酸分子，所述核酸分子包括編碼SEQIDNO:5的多肽或其 部分或其片萃殳的核苷酸序列以及編碼SEQIDNO:3， 8， 10或13的多肽 的至少一種或其部分或其片段的核苷酸序列。在另一實(shí)施方案中，所 述表達(dá)載體包括核酸分子，所述核酸分子包括編碼SEQ ID NO:5的多 肽或其部分或其片段的核苷酸序列，以及編碼與SEQ ID NO:3， 8， 10 或13的多肽的全長(zhǎng)或其部分或其片革殳至少約60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或100%同源的多肽的至少一種核苷酸序列。在另一實(shí)施方案中， 所述表達(dá)載體包括核酸分子，所述核酸分子包括編碼與SEQ ID NO:5 的多肽的全長(zhǎng)或其部分或其片段至少約60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99% 或100%同源的多肽的核苷酸序列，以及編碼SEQ IDNO:3， 8， 10或13 的多肽的至少一種或其部分或其片段的核苷酸序列。在另 一實(shí)施方案 中，所述表達(dá)載體包括核酸分子，所述核酸分子包括編碼與SEQ ID NO:5的多肽的全長(zhǎng)或其部分或其片段至少約60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或100%同源的多肽的核苷酸序列，以及編碼與SEQ IDNO:3， 8, 10 或13的多肽的全長(zhǎng)或其部分或其片段至少約60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或100%同源的多肽的至少一種核苷酸序列。
在另外的實(shí)施方案中，所述表達(dá)載體包括核酸分子，所述核酸分 子包括SEQ ID NO:7的核苷酸序列或其部分或其片段。在另 一實(shí)施方
案中，所述表達(dá)載體包括核酸分子，所述核酸分子包括與SEQIDNO:7 的核苷酸序列的全長(zhǎng)或其部分或其片段至少約60%、 65%、 70°/。、 75%、 80%、 85%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或100%同源的核苷酸序列。在另一實(shí)施方案中，所述表達(dá)載體包 括核酸分子，所述核酸分子包括SEQIDNO:7的核苦酸序列或其部分 或其片革爻以及SEQIDNO:2， 4， 6, 9， 11或12的至少一種核苷酸序列或 其部分或其片段。在另一實(shí)施方案中，所述表達(dá)載體包括核酸分子， 所述核酸分子包括SEQ ID NO:7的核苷酸序列或其部分或其片>R以及 與SEQIDNO:2，4, 6, 9, 11或12的核苷酸序列的全長(zhǎng)或其部分或其片 4爻至少約60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或100%同源的至少一種核 苷酸序列。在另一實(shí)施方案中，所述表達(dá)載體包括核酸分子，所述核 酸分子包括與SEQ IDNO:7的核苷酸序列的全長(zhǎng)或其部分或其片段至 少約60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或100%同源的核苷酸序列，以及 SEQ ID NO:2， 4， 6， 9, 11或12的至少一種核苷酸序列或其部分或其片 段。在另一實(shí)施方案中，所述表達(dá)載體包括核酸分子，所述核酸分子 包括與SEQ ID NO:7的核苷酸序列的全長(zhǎng)或其部分或其片段至少約 60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或100%同源的核苷酸序列，以及與SEQ ID NO:2， 4， 6， 9, 11或12的核苷酸序列的全長(zhǎng)或其部分或其片^炎至少 約60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或100%同源的至少一種核苷酸序列。
在另一實(shí)施方案中，所述表達(dá)載體包括核酸分子，所述核酸分子 包括編碼SEQ ID NO:8的多肽(集胞藻PCC6803五聚氫化酶蛋白復(fù)合 體的hoxU蛋白亞單位)或其部分或其片段的核苷酸序列。在另一實(shí)施 方案中，所述表達(dá)載體包括核酸分子，所述核酸分子包括編碼與SEQ ID 1^0:8的多肽的全長(zhǎng)或其部分或其片段至少約60%、65%、70%、75%、 80%、 85%、 90%、 91%、 92%、 93。/。、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或100%同源的多肽的核苷酸序列。在另一實(shí)施方案中，所述表達(dá)載體包括核酸分子，所述核酸分子包括編碼SEQIDNO:8的多肽或其 部分或其片段的核苷酸序列以及編碼SEQIDNO:3，5, 10或13的多肽 的至少一種或其部分或其片段的核香酸序列。在另一實(shí)施方案中，所 述表達(dá)載體包括核酸分子，所述核酸分子包括編碼SEQIDNO:8的多 肽或其部分或其片段的核苷酸序列，以及編碼與SEQ ID NO:3， 5, 10 或13的多肽的全長(zhǎng)或其部分或其片段至少約60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或100%同源的多肽的至少一種核苷酸序列。在另一實(shí)施方案中， 所述表達(dá)載體包括核酸分子，所述核酸分子包括編碼與SEQ ID NO:8 的多肽的全長(zhǎng)或其部分或其片IS:至少約60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99% 或100%同源的多肽的核苷酸序列，以及編碼SEQIDNO:3，5， 10或13 的多肽的至少一種或其部分或其片段的核苷酸序列。在另一實(shí)施方案 中，所述表達(dá)載體包括核酸分子，所述核酸分子包括編碼與SEQ ID NO:8的多肽的全長(zhǎng)或其部分或其片段至少約60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或100%同源的多肽的核苷酸序列，以及編碼與SEQ ID NO:3， 5， 10 或13的多肽的全長(zhǎng)或其部分或其片革爻至少約60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或100%同源的多肽的至少一種核苷酸序列。
在另外的實(shí)施方案中，所述表達(dá)載體包括核酸分子，所述核酸分 子包括SEQIDNO:9的核苷酸序列或其部分或其片段。在另一實(shí)施方 案中，所述表達(dá)載體包括核酸分子，所述核酸分子包括與SEQIDNO:9 的核苷酸序列的全長(zhǎng)或其部分或其片^殳至少約60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或100%同源的核香酸序列。在另一實(shí)施方案中，所述表達(dá)載體包 括核酸分子，所述核酸分子包括SEQIDNO:9的核苷酸序列或其部分 或其片段以及SEQ ID NO:2， 4, 6, 7， 11或12的至少一種核苷酸序列或 其部分或其片段。在另一實(shí)施方案中，所述表達(dá)載體包括核酸分子， 所述核酸分子包括SEQ ID NO:9的核苷酸序列或其部分或其片段以及
與SEQIDNO:2，4, 6, 7, 11或12的核苷酸序列的全長(zhǎng)或其部分或其片 ,殳至少約60%、 65%、 70%、 75%、 80Q/。、 85%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或100%同源的至少一種核 苷酸序列。在另一實(shí)施方案中，所述表達(dá)載體包括核酸分子，所述核 酸分子包括與SEQ IDNO:9的核苷酸序列的全長(zhǎng)或其部分或其片段至 少約60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或100%同源的核香酸序列，以及 SEQ ID NO:2， 4, 6， 7, 11或12的至少一種核普酸序列或其部分或其片 段。在另一實(shí)施方案中，所述表達(dá)載體包括核酸分子，所述核酸分子 包括與SEQ ID NO:9的核苷酸序列的全長(zhǎng)或其部分或其片段至少約 60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或100%同源的核苷酸序列，以及與SEQ ID NO:2， 4, 6, 7, 11或12的核苷酸序列的全長(zhǎng)或其部分或其片^殳至少 約60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或100%同源的至少一種核苷酸序列。
在另一實(shí)施方案中，所述表達(dá)載體包括核酸分子，所述核酸分子 包括編碼SEQ ID NO:10的多肽(集胞藻PCC6803五聚氫化酶蛋白復(fù)合 體的hoxY蛋白亞單位)或其部分或其片段的核苷酸序列。在另一實(shí)施 方案中，所述表達(dá)載體包括核酸分子，所述核酸分子包括編碼與SEQ ID NO:10的多肽的全長(zhǎng)或其部分或其片段至少約60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或100%同源的多肽的核苷酸序列。在另一實(shí)施方案中，所 述表達(dá)載體包括核酸分子，所述核酸分子包括編碼SEQ ID NO:10的 多肽或其部分或其片萃史的核香酸序列以及編碼SEQ ID NO:3， 5, 8或13 的多肽的至少一種或其部分或其片段的核苷酸序列。在另一實(shí)施方案 中，所述表達(dá)栽體包括核酸分子，所述核酸分子包括編碼SEQ ID NO:10的多肽或其部分或其片l史的核苷酸序列，以及編碼與SEQ ID NO:3， 5， 8或13的多肽的全長(zhǎng)或其部分或其片段至少約60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或100%同源的多肽的至少一種核苷酸序列。在另一
實(shí)施方案中，所述表達(dá)載體包括核酸分子，所述核酸分子包括編碼與
SEQ ID NO:IO的多肽的全長(zhǎng)或其部分或其片段至少約60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或100%同源的多肽的核苦酸序列，以及編碼SEQID NO:3， 5, 8或13的多肽的至少一種或其部分或其片段的核苷酸序列。 在另一實(shí)施方案中，所述表達(dá)載體包括核酸分子，所述核酸分子包括 編碼與SEQ ID NO:10的多肽的全長(zhǎng)或其部分或其片^更至少約60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或100%同源的多肽的核苷酸序列，以及編碼 與SEQ ID NO:3， 5， 8或13的多肽的全長(zhǎng)或其部分或其片段至少約 60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或100%同源的多肽的至少一種核苦酸 序列。
在另外的實(shí)施方案中，所述表達(dá)載體包括核酸分子，所述核酸分 子包括SEQ ID NO:12的核苷酸序列或其部分或其片段。在另一實(shí)施 方案中，所述表達(dá)載體包括核酸分子，所述核酸分子包括與SEQ ID NO:12的核苷酸序列的全長(zhǎng)或其部分或其片段至少約60%、65%、70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或100%同源的核苷酸序列。在另一實(shí)施方案中，所述表達(dá) 載體包括核酸分子，所述核酸分子包括SEQ ID NO:12的核苷酸序列 或其部分或其片段以及SEQ ID NO:2， 4, 6， 7， 9或11的至少一種核苷 酸序列或其部分或其片段。在另一實(shí)施方案中，所述表達(dá)載體包括核 酸分子，所述核酸分子包括SEQ ID NO:12的核苷酸序列或其部分或 其片革爻以及與SEQ ID NO:2， 4, 6， 7， 9或11的核苷酸序列的全長(zhǎng)或其 部分或其片段至少約60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或100%同源的至少 一種核苷酸序列。在另一實(shí)施方案中，所述表達(dá)載體包括核酸分子， 所述核酸分子包括與SEQ ID NO:12的核苷酸序列的全長(zhǎng)或其部分或 其片段至少約60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或100%同源的核苷酸序列，
以及SEQ ID NO:2， 4, 6, 7, 9或11的至少一種核苷酸序列或其部分或 其片段。在另一實(shí)施方案中，所述表達(dá)載體包括核酸分子，所述核酸 分子包括與SEQ ID NO:12的核苷酸序列的全長(zhǎng)或其部分或其片段至 少約60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或100%同源的核苷酸序列，以及 與SEQ ID NO:2， 4, 6， 7， 9或11的核苷酸序列的全長(zhǎng)或其部分或其片 段至少約60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或100%同源的至少一種核 苷酸序列。
在另一實(shí)施方案中，所述表達(dá)載體包括核酸分子，所述核酸分子 包括編碼SEQ ID NO:13的多肽(集胞藻PCC6803五聚氬化酶蛋白復(fù)合 體的hoxH蛋白亞單位)或其部分或其片段的核苷酸序列。在另一實(shí)施 方案中，所述表達(dá)載體包括核酸分子，所述核酸分子包括編碼與SEQ ID NO:13的多肽的全長(zhǎng)或其部分或其片段至少約60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或100%同源的多肽的核苦酸序列。在另一實(shí)施方案中，所 述表達(dá)載體包括核酸分子，所述核酸分子包括編碼SEQ ID NO: 13的 多肽或其部分或其片段的核香酸序列以及編碼SEQ ID NO:3， 5, 8或10 的多肽的至少一種或其部分或其片段的核苷酸序列。在另一實(shí)施方案 中，所述表達(dá)載體包括核酸分子，所述核酸分子包括編碼SEQ ID NO:13的多肽或其部分或其片^a的核苦酸序列，以及編碼與SEQ ID NO:3， 5, 8或10的多肽的全長(zhǎng)或其部分或其片段至少約60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或100%同源的多肽的至少一種核苷酸序列。在另一 實(shí)施方案中，所述表達(dá)載體包括核酸分子，所述核酸分子包括編碼與 SEQ ID NO:13的多肽的全長(zhǎng)或其部分或其片段至少約60%、 65%、 70%、 75%、 80o/o、 85%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或100%同源的多肽的核香酸序列，以及編碼SEQID NO:3， 5, 8或10的多肽的至少一種或其部分或其片段的核苷酸序列。 在另一實(shí)施方案中，所述表達(dá)載體包括核酸分子，所述核酸分子包括
編碼與SEQ ID NO:13的多肽的全長(zhǎng)或其部分或其片4爻至少約60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或100%同源的多肽的核苷酸序列，以及編碼 與SEQ ID NO:3， 5, 8或10的多肽的全長(zhǎng)或其部分或其片^殳至少約 60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或100%同源的多肽的至少一種核苦酸 序列。
在另一實(shí)施方案中，所述表達(dá)載體包括如此前所述的核酸分子， 所述核酸分子包括所述核苷酸序列的特定改變，以致優(yōu)化密碼子和 mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)用于在宿主細(xì)胞中翻譯。優(yōu)選地，改變所述核酸的密 碼子使用以用于在所述宿主細(xì)胞中表達(dá)，例如，可以使用Calcgene， Hale， RS and Thomas G.尸ra^/"12, 185-188 (1998)， UpGene， Gao， W W a/.丑/o&c/mo/. iVog. 20， 443-448 (2004)，或者 Codon Optimizer, Fuglsang, A.尸rato'w尸i/ny: 31， 247-249 (2003) 完成密碼子優(yōu)化?？梢酝ㄟ^大量不同實(shí)驗(yàn)操作，包括小量密碼子的修 飾Ver雨rt " a/.油c/e/c ^"Ws紐25: 2069-2074 (2000),或者重寫大 段所述核酸序列，例如多達(dá)1000 bp的DNA， Hale, RS and Thomas G.
五x; ^ Pw〃y: 12,185-188 (1998)，完成才艮據(jù)所述優(yōu)選的密碼子優(yōu) 化^修改所述核酸?？梢酝ㄟ^遞歸PCR完成所述核酸序列的重寫，其中 通過重疊寡核苷酸引物的延伸產(chǎn)生所需序列，Prodromou and Pearl, 5: 827-829 (1992)。更大段DNA的重寫可能需要多達(dá)三個(gè) 連續(xù)輪次的遞歸PCR， Hale, RS and Thomas G.尸ra^z'w五x/ er.尸wn;/: 12, 185-188 (1998)， Te'o " fl/， F5MS M!cra&o/.190: 13-19， (2000)。
可選擇地，可以提高所述宿主細(xì)^^中同源tRNA的水平?？梢酝?過增加各自tRNA基因的拷貝數(shù)完成所述提高，例如通過將相容多拷 貝質(zhì)粒上的相關(guān)tRNA基因插入所述宿主細(xì)胞，或者可選擇地將所述 tRNA基因插入所述表達(dá)載體自身。使用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)時(shí)，可以 采用具有增強(qiáng)表達(dá)的argU表達(dá)(用于AGG/AGA的識(shí)別)的大腸桿菌宿 主細(xì)胞。此外，還可以采用包括ilex(用于AUA的識(shí)別)、leuW(用于 CUA的識(shí)別)、proL(用于CCC的識(shí)別)或glyT(用于GGA的識(shí)別)的
tRNA基因的宿主細(xì)月包，Brinkmann & a/. 85， 109-114， (1989),
Kane FJ. C Opzw. 6:494-500 (1995), Rosenburg W a/, /
5a"en'o/. 175， 716-722， (1993), Siedel " a/, 5/oc/ 簡(jiǎn)勿，31, 2598-2608 (1992)。
在另一實(shí)施方案中，所述表達(dá)載體包括如此前所述的核酸分子， 所述核酸分子包括所述核苷酸序列的特定改變，以致優(yōu)化所述雙向氳 化酶的表達(dá)、活性或功能性壽命。優(yōu)選地，使此前所述雙向氫化酶核 酸經(jīng)受遺傳操作和破裂技術(shù)。本領(lǐng)域已知多種遺傳操作和破裂技術(shù)， 包括但不限于DNA滑動(dòng)(US 6,132,970， Punnonen J et al, <Sc/e"ce cfe M^//c/"e, 7(2): 38-47， (2000)， US 6,132,970)、連續(xù)突變和篩選。突變的 一種實(shí)例是錯(cuò)誤傾向PCR，借此使用例如可商購(gòu)試劑盒，如 GeneMorph II試劑盒(Stratagene , US),在PCR期間通過US 2003152944所述4昔誤傾向DNA聚合酶和反應(yīng)條件的4吏用故意引入突 變。將隨機(jī)化DNA序列克隆進(jìn)表達(dá)載體并且篩選所得突變體文庫(kù)的 改變的或改良的蛋白活性。
Hox表達(dá)載體的制備
本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)清楚可用于表達(dá)載體制備的分子技術(shù)。
可以使用互為引物的寡核香酸和本文所述核酸序列，通過合成核 酸分子，制備如上所述的用于并入本發(fā)明的表達(dá)載體的核酸分子。
已開發(fā)大量分子技術(shù)用于經(jīng)互補(bǔ)粘性末端可操作地將DNA連接 至載體。在一種實(shí)施方案中，可以將互補(bǔ)同聚物帶添加至待插入所述 載體DNA的核酸分子。隨后通過互補(bǔ)同聚尾巴間的氫鍵連接所述載 體和核酸分子以形成重組DNA分子。
在可選擇的實(shí)施方案中，將含有所提供的 一種或多種限制性位點(diǎn) 的合成連接子用于可操作地將所述核酸分子連接至所述表達(dá)載體。在 一個(gè)實(shí)施方案中，如較早前所述，通過限制性內(nèi)切酶消化生成所述核 酸分子。優(yōu)選地，使用噬菌體T4 DNA聚合酶或大腸桿菌DNA聚合 酶I，即用其3，-5，-核酸外切活性移除突出性3'單鏈末端并用其聚合活 性填補(bǔ)3，凹端的酶，來處理所述核酸分子，〃Mv而生成平端DNA片段。
隨后在諸如噬菌體T4 DNA連接酶的能催化平端DNA分子連接的酶 的存在下，使用大摩爾過量的連接子分子孵育所述平端片段。因而所 述反應(yīng)產(chǎn)物是在其末端攜帶聚合連接子序列的核酸分子。隨后使用適 當(dāng)?shù)南拗菩悦盖懈钸@些核酸分子并將其連接至已使用產(chǎn)生與所述核酸 分子末端相容的末端的酶切割的表達(dá)載體。
可選擇地，可以采用包括無需連接的克隆(LIC)位點(diǎn)的栽體。隨后 可以將所需PCR擴(kuò)增的核酸分子克隆進(jìn)所述LIC栽體而無需限制性消 化或連接(Aslanidis and de Jong, M/c/.18, 6069-6074， (1990)， Haun， eZ a/, 5z'c^ecA/n々i/e51 13， 515-518 (1992)。
為分離和/或修飾用于插入所選質(zhì)粒的所關(guān)注的核酸分子，優(yōu)選使 用PCR?？梢栽O(shè)計(jì)用于PCR制備所述序列的適當(dāng)引物以分離所述核酸 分子的所需編碼區(qū)、添加限制性內(nèi)切酶或LIC位點(diǎn)、將所述編碼區(qū)置 于所需閱讀框。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，通過使用如Saiki et al (1988)239, 487-491公開的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，使用適當(dāng)?shù)墓押似账嵋?，制備用?并入本發(fā)明的表達(dá)載體的核酸分子。擴(kuò)增所述編碼區(qū)，同時(shí)所述引物 自身被并入所述擴(kuò)增序列產(chǎn)物。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述擴(kuò)增引物含 有使所擴(kuò)增序列產(chǎn)物被克隆進(jìn)適當(dāng)載體的限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)。
優(yōu)選地，通過PCR獲得SEQIDNO:l的核酸分子，并使用限制性 內(nèi)切酶消化和連接(本領(lǐng)域公知技術(shù))將其引入表達(dá)載體。更為優(yōu)選地， 將SEQIDNO:l的核酸分子引入pET-17b表達(dá)載體，并將其可操作地 連才妻至T7啟動(dòng)子。
可選擇地，通過酵母同源重組將SEQIDNO:l的核酸分子引入表 達(dá)載體(Raymon et al.， 26(1): 134-8, 140-1， 1999)。
本發(fā)明的表達(dá)載體可以包含此前所述核酸分子的單一拷貝，或此 前所述核酸分子的多拷貝。
優(yōu)選地，如圖4所示，本發(fā)明的表達(dá)載體是包括SEQ ID NO: 1(6532 bp)的雙向氫化酶的pET-17b表達(dá)載體(3306 bp)。
宿主細(xì)胞
本文所用"細(xì)胞的純化制備物"指在所培養(yǎng)細(xì)胞或微生物細(xì)胞的
情況下，至少10%且更為優(yōu)選50%的所述細(xì)胞的制備物。
本文所用"宿主細(xì)胞"和"重組宿主細(xì)胞"被可互換地使用。所 述術(shù)語(yǔ)指特定的所述細(xì)胞，并且還指所述細(xì)胞的子代或潛在子代。因 為出于突變或環(huán)境影響，某些修飾可能在后續(xù)代發(fā)生，因而所述子代 事實(shí)上可以與所述親代細(xì)胞不一致，但是仍然包含在本文所用術(shù)語(yǔ)的 范圍內(nèi)。
在另一方面，本發(fā)明提供用于本發(fā)明的表達(dá)系統(tǒng)的宿主細(xì)胞，所 述宿主細(xì)力包包括表達(dá)栽體，所述表達(dá)栽體包括本文所述核酸分子(例如 SEQIDNO:l的Hox操縱子)或其部分或其片段。在可選擇的實(shí)施方案 中，所述宿主細(xì)胞包括本發(fā)明的表達(dá)載體，所述表達(dá)載體包括本文所 述核酸分子(例如SEQIDNO:l的Hox才喿縱子)或其部分或其片段，所 述栽體還包括使其同源重組進(jìn)所述宿主細(xì)胞基因組的特定位點(diǎn)的序 列。
用于本發(fā)明的表達(dá)系統(tǒng)的宿主細(xì)胞可以是需氧細(xì)胞或可選擇地是 兼性厭氧細(xì)胞。優(yōu)選地，所述細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞?？蛇x擇地，所述細(xì)胞 可以是酵母細(xì)胞(例如，畢赤酵母(Saccharomyces， Pichia))、藻細(xì)胞、 昆蟲細(xì)月包或才直物細(xì)月包。
細(xì)菌宿主細(xì)胞包括革蘭氏陽(yáng)性和革蘭氏陰性細(xì)菌。合適的細(xì)菌宿 主細(xì)胞包括但不限于革蘭氏陰性細(xì)菌，例如腸細(xì)菌(五w&ra6a"en'a)家 族的細(xì)菌，最為優(yōu)選地，大腸桿菌。大腸桿菌是最為優(yōu)選的用于本發(fā) 明的細(xì)菌宿主細(xì)胞。大腸桿菌中的表達(dá)相對(duì)其它表達(dá)系統(tǒng)提供眾多優(yōu) 勢(shì)，特別是低開發(fā)成本和高產(chǎn)量。適合蛋白高表達(dá)的細(xì)胞包括，例如， 大腸桿菌W3110、大腸桿菌B菌株、大腸桿菌BL21, BL21(DE3)和 BL21(DE3)pLysS, pLysE， DH1， DH4I, DH5， DH5I, DH5IF，， DH5IMCR, DH10B, DHI0B/p3, DHl IS, C600, HB101, JM101, JM105, JM109, JM110， K38, RR1， Y1088, Y1089, CSH18, ER1451, ER1647特別適合用 于表達(dá)。還優(yōu)選大腸桿菌K12菌抹，因?yàn)樗鼍ㄊ欠遣≡詷?biāo)準(zhǔn)實(shí) 驗(yàn)室菌林，并且所述菌林包括NovaBlue、 JM109和DH5a(Novogen⑧)、 大腸桿菌K12RV308、大腸桿菌K12C600、大腸桿菌HB101,參見，
例如，Brown, Molecular Biology Labfax(分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室 Labfax)(Academic Press (1991))。
可選擇地，來自沙門氏菌屬、志賀菌屬、腸桿菌屬、沙雷氏菌屬、 變形桿菌屬和歐文氏菌屬的腸細(xì)菌。其它原核宿主細(xì)胞包括沙雷氏菌、 假單胞菌、柄桿菌或藍(lán)細(xì)菌，例如來自集胞藻屬或聚球藻屬的細(xì)菌， 更具體地，集胞藻PCC 6803或聚球藻PCC 6301。可選擇地，所述宿 主細(xì)胞可以屬于桿菌屬，例如短桿菌CBac/〃Ms &ev&)或枯草桿菌
Sw6"7zX)、蘇云金芽孢桿菌(5aCZ'〃MS ,/^W"g/eweS7'51)?？蛇x捧地，
所述宿主細(xì)月包可以屬于乳J求菌屬，例如乳乳球菌(丄a"ococc"s /ac""。
可選擇地，所述細(xì)菌細(xì)胞屬于放線菌家族，更具體地來自鏈霉菌屬、 紅球菌屬、棒桿菌屬、分支桿菌屬。更為特別地，淺青紫鏈霉菌
(&邵fom少ces //vzV^ms)、 產(chǎn)二素鏈霉菌(^邵tom少ces謂6o/ac/ew力、弗 雷德氏鏈霉菌(&^ptom_yces /ra&ae)、 灰褐鏈霉菌(5^e內(nèi)ow^ces g/lseci/kscws)、 紅串紅球菌(朋odococctw "Arapo//"、 谷氛酸棒桿菌 (Cb^ywe6aCen'w附 g7w^zwn'ct/附)、恥；后分4支4干菌(Afyco6aCen、/w
用于在原核宿主中增殖載體的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知 (參見,例如，Ausubel et al. Short Protocols in Molecular Biology 3rd Edition(精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南第三版)(John Wiley & Sons 199")。 為最大化大腸桿菌中重組蛋白的表達(dá)，本發(fā)明的表達(dá)載體可以在 蛋白水解切割所述重組蛋白的能力受損的宿主細(xì)菌中表達(dá)并入其中 的#亥酸分子(Gottesman， S., (1990) Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185(基因表達(dá)技術(shù)酶學(xué)方法185)， Academic Press，SanDiego， California, 119-128)?？蛇x擇地，可以將并入本發(fā)明 的表達(dá)載體的核酸分子減毒以致用于每一氨基酸的單獨(dú)密碼子是大 腸桿菌中偏好4吏用的那些(Wada et al., (1992) Nucleic Acids Res. 20:2111-2118)?？梢酝ㄟ^標(biāo)準(zhǔn)DNA合成4支術(shù)進(jìn)行對(duì)本發(fā)明的核酸序 列的所述改變。
宿主細(xì)力包轉(zhuǎn)化
可以通過常規(guī)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染技術(shù)將本發(fā)明的表達(dá)載體引入宿主細(xì)胞。
本文所用"轉(zhuǎn)化"和"轉(zhuǎn)染"指本領(lǐng)域已知用于將外源核酸引入 宿主細(xì)胞的多種技術(shù)。使用本發(fā)明的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化適當(dāng)宿主細(xì)胞由本 領(lǐng)域已知方法完成，并且通常依賴載體和宿主細(xì)胞的類型。所述技術(shù)
包括但不限于磷酸鉤或氯化鉀共沉淀、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、脂 轉(zhuǎn)染、化學(xué)穿孔或電穿孔。
本領(lǐng)域已知用于轉(zhuǎn)染細(xì)菌宿主細(xì)月包的4支術(shù)7>開于例如Sambrook et al (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual(分子克隆，實(shí)'驗(yàn)室 手冊(cè))，Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y; Ausubel et al (1987) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., NY; Cohen et al (1972) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 2110; Luchansky et al (1988) Mol. Microbiol. 2, 637-646。所有所述方法通過 引用并入本文。
可以通過本領(lǐng)域/>知技術(shù)鑒定成功轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，即，含有本發(fā)明 的表達(dá)載體的那些細(xì)胞。例如，可以培養(yǎng)使用本發(fā)明的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染 的細(xì)胞以產(chǎn)生所述雙向氫化酶蛋白復(fù)合體?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域公知技術(shù) 檢驗(yàn)細(xì)胞的所述表達(dá)栽體DNA的存在。可選擇地，可以使用與其雜 交的抗體檢測(cè)所述雙向氫化酶蛋白復(fù)合體或其部分或其片段的存在。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明包括轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的培養(yǎng)物。優(yōu)選地， 所述培養(yǎng)物是克隆上同質(zhì)的。
所述宿主細(xì)胞可以包含此前所述表達(dá)載體的單一拷貝，或者可選 擇地，所述表達(dá)載體的多拷貝。
氫氣的產(chǎn)生
用包括此前所述核酸分子的本發(fā)明的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞可 以用來產(chǎn)生(即表達(dá))具有氫化酶活性的多肽。
優(yōu)選地，本發(fā)明包括用于大規(guī)模產(chǎn)生氫氣的表達(dá)系統(tǒng)，所述產(chǎn)生 使用編碼雙向氫化酶蛋白的本發(fā)明的核酸編碼序列。優(yōu)選地，所述表 達(dá)系統(tǒng)是大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)。
使本發(fā)明的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞以技術(shù)人員熟悉的方式生長(zhǎng)或培養(yǎng)，
所述方式取決于所述宿主生物體。通常，在0°C至100°C，優(yōu)選地10°C 至60。C的溫度下，使宿主細(xì)胞生長(zhǎng)于液體培養(yǎng)基，同時(shí)通以氧氣，所 述液體培養(yǎng)基包括通常以糖形式的碳源，通常以諸如酵母提取物的有 機(jī)氮源或諸如硫酸銨的鹽的形式的氮源，諸如鐵鹽、錳鹽和鎂鹽的微 量元素，以及，如果合適的話，維生素。
可以使或不使所述液體培養(yǎng)基的pH保持恒定，即可以在所述培 養(yǎng)期調(diào)節(jié)所述液體培養(yǎng)基的pH?？梢允顾雠囵B(yǎng)物分批地、半分批地 或連續(xù)地生長(zhǎng)?？梢栽谒霭l(fā)酵開始時(shí)提供營(yíng)養(yǎng)物或者半連續(xù)地或連 續(xù)地進(jìn)料營(yíng)養(yǎng)物?？梢酝ㄟ^技術(shù)人員已知的方法，例如通過提取、蒸 餾、結(jié)晶化，如果合適的話，用鹽沉淀，和/或色譜法，從上述生物體 分離所產(chǎn)生的產(chǎn)物。為此，可以預(yù)先有利地破壞所述宿主細(xì)胞。在這 一過程中，使所述pH值有利地保持在pH4至pH 12,優(yōu)選地pH6至 pH9，尤其優(yōu)選地pH7至pH8。
可以在Chmiel的教科書(Bioproze(3technik 1. EinfDhrung in die Bioverfahrenstechnik [Bioprocess technology 1. Introduction to Bioprocess technology(生物工藝技術(shù) 1.生物工藝技術(shù)導(dǎo)論)](Gustav Fischer Verlag， Stuttgart, 1991))或在Storhas的教科書(Bioreaktoren und periphere Einrichtungen [Bioreactors and peripheral equipment(生物反應(yīng) 器和外圍設(shè)備)](Vieweg Verlag, Brunswick/Wiesbaden, 1994))中找到已 知培養(yǎng)方法的綜述。
待用培養(yǎng)基必須合適地滿足所考慮菌抹的需要。可以在美國(guó)細(xì)菌 學(xué)學(xué)會(huì)的教科書"Manual of Methods for General Bacteriology(普通細(xì)菌 學(xué)方法手冊(cè))"(Washington D.C., USA, 1981)里找到對(duì)用于各種微生物 的培養(yǎng)基的描述。
如上所述，根據(jù)本發(fā)明可以采用的這些培養(yǎng)基通常包括一種或多 種碳源、氮源、無機(jī)鹽、維生素和/或微量元素。
優(yōu)選的碳源是糖，諸如單糖、二糖或多糖。碳源的實(shí)例是葡萄糖、 果糖、甘露糖、半乳糖、核糖、山梨糖、核酮糖、乳糖、麥芽糖、蔗 糖、棉籽糖、淀粉或纖維素。也可以通過諸如糖蜜或來自糖精制的其
它副產(chǎn)物的復(fù)雜化合物向所述培養(yǎng)基添加糖。添加多種碳源的混合物 也可能是有優(yōu)勢(shì)的。其它可能的碳源是油和脂肪(諸如，例如，豆油、 向日葵油、花生油和/或椰子脂)、脂肪酸(諸如，例如，棕櫚酸、^J旨
酸和/或亞油酸)、醇和/或多元醇o(jì)者如，例如，丙三醇、曱醇和/或乙醇) 和/或有才幾酸(諸如，例如，乙酸和/或乳酸)。
氮源通常是有機(jī)或無機(jī)氮化合物或者包括這些化合物的物質(zhì)。氮 源的實(shí)例包括液態(tài)或氣態(tài)氨或諸如硫酸銨、氯化銨、磷酸銨、碳酸銨 或硝酸銨的銨鹽，硝酸鹽，尿素，氨基酸或諸如玉米漿、大豆粕、大 豆蛋白、酵母提取物、肉汁及其它的復(fù)雜氮源。所述氮源可以單獨(dú)使 用或作為混合物使用。
可以存在于所述培養(yǎng)基的無機(jī)鹽化合物包括鈣、鎂、鈉、鈷、鉬、 鉀、錳、鋅、銅和鐵的氯鹽、磷鹽和硫酸鹽。
i者如，例如石克酸鹽、亞石克酸鹽、連二亞辟b酸鹽、連四辟u酸鹽、碌u 代硫酸鹽、硫化物的含疏無機(jī)化合物，或者諸如硫醇和巰基化合物的 其它有機(jī)硫化合物可以用作用于產(chǎn)生特別是曱硫氨酸的含硫精細(xì)化學(xué) 藥品的碌u源。
磷酸、磷酸二氫鉀或磷酸氫二鉀或?qū)?yīng)的含鈉鹽可以用作磷源。 可以向所述培養(yǎng)基添加螯合劑以保持溶液中的金屬離子。特別適
合的螯合劑包括諸如兒茶酚或原兒茶酸酯的二羥基苯酚以及諸如檸檬
酸的有才幾酸。
根據(jù)本發(fā)明用于培養(yǎng)宿主細(xì)胞的發(fā)酵培養(yǎng)基通常也包括諸如維生 素或生長(zhǎng)促進(jìn)劑的其它生長(zhǎng)因子，所述生長(zhǎng)因子包括例如，生物素、 核黃素、碌b胺、葉酸、煙酸、泛酸和吡哆醇。生長(zhǎng)因子和鹽經(jīng)常得自 諸如酵母提取物、糖蜜、玉米漿及類似物的復(fù)雜培養(yǎng)基組分。此外，
可能向所述培養(yǎng)基添加合適的前體。所述培養(yǎng)基化合物的準(zhǔn)確組合嚴(yán) 重依賴具體的實(shí)驗(yàn)，并且為每一特定情況單獨(dú)決定。可以在教科書 "Applied Microbiol. Physiology, A Practical Approach(應(yīng)用孩吏生物生理 學(xué)，實(shí)踐方法)"(Editors P.M. Rhodes, P.F. Stanbury， IRL Press (1997) pp. 53-73， ISBN 0 19 963577 3)中找到優(yōu)化培養(yǎng)基的信息。生長(zhǎng)培養(yǎng)基還可 以獲得自商業(yè)供應(yīng)商，例如Standard l(Merck)或BHI(腦心浸液，DIFCO)
及類似物。
通過加熱(在1.5巴和121。C下20分鐘)或通過過濾除菌滅菌全部 培養(yǎng)基組分。所述組分可以一起滅菌或著如果需要，可以單獨(dú)滅菌。 全部培養(yǎng)基組分可以按需要存在于培養(yǎng)起始或者連續(xù)地或分批地加 入。
所述培養(yǎng)溫度通常是15。C至45°C，優(yōu)選地25°C至40°C,更為 優(yōu)選地25。C至37。C，更為優(yōu)選地35。C至37°C，更為優(yōu)選地，37°C，
變。所述培養(yǎng)基的pH應(yīng)當(dāng)在5至8.5的范圍，優(yōu)選7.0左右。可以通 過加入諸如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氨和氨水的堿性化合物或者諸如磷 酸或硫酸的酸性化合物，在培養(yǎng)期間控制用于培養(yǎng)的pH。可以通過采 用諸如，例如脂肪酸聚乙二醇醚的防沫劑，來控制發(fā)泡。為維持載體 穩(wěn)定性，可以向所述培養(yǎng)基添加具有選擇性作用的合適物質(zhì)，例如抗 生素?？梢酝ㄟ^向所述培養(yǎng)物導(dǎo)入氧氣或含氧氣的氣體混合物(諸如， 例如環(huán)境空氣)，來維持需氧條件。所述培養(yǎng)的溫度通常是20。C至 45。C，并且優(yōu)選地是25。C至40°C。繼續(xù)所述培養(yǎng)直至所需產(chǎn)物的形 成處于極大。本目標(biāo)通常在10小時(shí)至160小時(shí)內(nèi)達(dá)到。
以這種方式獲得的發(fā)酵肉湯，特別是包括多不飽和脂肪酸的那些， 通常包含按重量計(jì)7.5%至25%的干物質(zhì)。
隨后可以進(jìn)一步加工所述發(fā)酵肉湯。根據(jù)需要，可以通過諸如， 例如離心、過濾、傾析或這些方法的組合的分離方法，從所述發(fā)酵肉 湯中完全或部分移除所述生物量，或者使所述生物量完全留于所述肉 湯。在所述生物量分離后將其加工是有優(yōu)勢(shì)的。
然而，也可以使用已知方法(諸如，例如，借助旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、薄膜 蒸發(fā)器、降膜蒸發(fā)器，通過反滲透或納米過濾)，使所述發(fā)酵肉湯變濃 或濃縮，而不分離所述細(xì)胞。最后，可以加工所述濃縮發(fā)酵肉湯以獲
得其中存在的脂肪酸。
優(yōu)選地，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞以致產(chǎn)生雙向氫化酶蛋白復(fù)合物。 優(yōu)選地，在能夠誘導(dǎo)所述宿主細(xì)胞產(chǎn)生氫氣的條件下培養(yǎng)細(xì)胞。
可以使用分批發(fā)酵培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，特別是當(dāng)需要使用本發(fā)
明的雙向氫化酶表達(dá)系統(tǒng)大規(guī)模產(chǎn)生氫氣時(shí)。可選擇地，可以使用補(bǔ) 料發(fā)酵和/或連續(xù)培養(yǎng)從使用本發(fā)明的雙向氫化酶表達(dá)系統(tǒng)轉(zhuǎn)化的宿 主細(xì)胞生成一定量的氫氣。
可以在需氧或厭氧條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。在需氧條件下， 優(yōu)選地，通過例如，添加還原劑或去氧劑，或通過使用中性氣體凈化 所述反應(yīng)培養(yǎng)基，從所述培養(yǎng)基連續(xù)地移除氧氣。
本領(lǐng)域已知用于大規(guī)模培養(yǎng)宿主細(xì)胞的技術(shù)公開于，例如，Bailey and Ollis (1986) Biochemical Engineering Fundamentals(生物化學(xué)工程 基礎(chǔ))，McGraw-Hill, Singapore; 或者 Shuler (2001) Bioprocess Engineering: Basic Concepts(生4勿工藝工禾呈基礎(chǔ)才既念)，Prentice Hall。 所有這些技術(shù)通過引用并入本文。
優(yōu)選地，將轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞培養(yǎng)于含有用于所述表達(dá)載體的適當(dāng) 選擇性抗生素的LB。孵育所轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞同時(shí)在37°C下振搖直至 所述OD,達(dá)到0.6至1.0。隨后將所述培養(yǎng)物過夜儲(chǔ)存于4。C。次日 早上，通過離心(在微型離心機(jī)中30秒)收集所述細(xì)胞。隨后將收集的 細(xì)胞重懸于新鮮LB培養(yǎng)基。優(yōu)選地，所述LB培養(yǎng)基包含另外的營(yíng)養(yǎng) 培養(yǎng)基。優(yōu)選地，所述營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基是BG-ll或BG-110培養(yǎng)基，Stanier R,Y,a/. (1971) 5a"eno/.及ev. 35: 171- 205。
優(yōu)選地，最適地表達(dá)本發(fā)明的雙向氫化酶編碼序列的細(xì)菌細(xì)胞培 養(yǎng)物的雙向氪化酶含量是至少100 nmol/l全體細(xì)胞培養(yǎng)物，優(yōu)選地至 少150 nmol/l全體細(xì)胞培養(yǎng)物，更為優(yōu)選地幾乎250 nmol/1全體細(xì)胞 培養(yǎng)物，還更優(yōu)選地約500 nmol/1全體細(xì)胞培養(yǎng)物以及最為優(yōu)選地約 1000 nmol/l。通常地，所述雙向氫化酶含量是約200 nmol/1全體細(xì)胞 培養(yǎng)物。
可以將本發(fā)明的宿主細(xì)胞培養(yǎng)于容器，例如生物反應(yīng)器。生物反 應(yīng)器，例如發(fā)酵罐，是包括細(xì)胞或酶的容器，并且通常用于工業(yè)規(guī)模 地產(chǎn)生分子。所述分子可以是通過包含于所述容器的細(xì)胞產(chǎn)生的或通 過在所述反應(yīng)容器中完成的酶反應(yīng)產(chǎn)生的重組蛋白(例如，諸如氫化酶 的酶)或者化合物。通常，基于細(xì)胞的生物反應(yīng)器包括所關(guān)注的細(xì)胞， 并且包括需要進(jìn)行所述反應(yīng)的所有營(yíng)養(yǎng)物和/或輔因子。
實(shí)施例
實(shí)施例1 表達(dá)載體的構(gòu)建
使用作為模板的集胞藻PCC 6803文庫(kù)和寡核苷酸引物 SynBamFwd: ccaatcatgg atccgctgta ttgctccttt ttgagg (SEQ ID NO: 14)和 SynEcoRev: ggattactga attcccgtct gaatgttttt tg (SEQ ID NO: 15)通過PCR擴(kuò) 增生成所述雙向氫化酶蛋白復(fù)合體編碼區(qū)，即SEQ ID NO: 1。所得基因 序列編碼SEQ ID NO:l,其包括分別并入5'端和3'端的BamHI和EcoRI 限制性位點(diǎn)。
如圖4所示，所得PCR產(chǎn)物由限制性內(nèi)切酶，即BamHI和EcoRI, 于所并入的限制性位點(diǎn)而切割，并使用T4連接酶，通過連接插入也已使 用BamHI和EcoRI通過限制性內(nèi)切酶消化切割的表達(dá)載體pET-17b(此前 已述)。
實(shí)施例2 表達(dá)載體的構(gòu)建
在可選擇的實(shí)例中，使用作為模板的集胞藻PCC 6803文庫(kù)和寡 核苦酸引物SynBamFwd: ccaatcatgg atccgctgta ttgctccttt ttgagg (SEQ ID NO: 14)和SynNotRev: ggattactgc ggccgcccgt ctgaatgttt tttg (SEQ ID NO: 16)通過PCR擴(kuò)增生成所述雙向氬化酶蛋白復(fù)合體編碼區(qū)，即SEQ ID NO: 1 。所得基因序列編碼SEQ ID NO: 1,其包括分別并入5，端和3，端的BamHI 和NotI限制性位點(diǎn)。
所得PCR產(chǎn)物由限制性內(nèi)切酶，即BamHI和Notl,于所并入的限 制性位點(diǎn)而切割，并使用T4連接酶，通過連接插入已使用BamHI和Notl 通過限制性內(nèi)切酶消化切割的表達(dá)載體pET-17b(此前已述)。
實(shí)施例3 轉(zhuǎn)化
隨后將實(shí)施例1和實(shí)施例2所述的每一表達(dá)載體轉(zhuǎn)化進(jìn)NovoBlue⑧感受態(tài)細(xì)胞(Novagen⑧，USA)。將1 的每一表達(dá)載體產(chǎn)物 和20 ]Lil的1^(^081116@細(xì)胞于冰上孵育5分鐘，于42°C溫育30秒，并 于水上孵育2分鐘。添加80 /xl的SOC(RT)，并將反應(yīng)混合物于37°C 溫育60分鐘。隨后將反應(yīng)混合物接種于含有50 Ail羧千青霉素的LB 瓊脂，并置于37。C溫度下20小時(shí)。
載體穩(wěn)定性
選擇來自EcoRI表達(dá)載體轉(zhuǎn)化子和Notl表達(dá)載體轉(zhuǎn)化子兩者的集 落，并將其重懸以100 /d加入10.0 ml含50 jng/ml羧芐青霉素的LB 肉湯。隨后將所述反應(yīng)混合物于37。C培養(yǎng)20小時(shí)，并以250RPM振搖。
為證實(shí)pET17b-hox質(zhì)粒的存在，從所培養(yǎng)純抹提取質(zhì)粒。使用 MoBio 6分鐘質(zhì)粒小量提取試劑盒(MO BIO Laboratories, USA)完成 Notl質(zhì)粒的提取。使用Qiager^質(zhì)粒小量提取試劑盒(Qiagen氣Inc. USA) 完成EcoRI質(zhì)粒的提取。
相應(yīng)地4吏用BamHI和EcoRI或BamHI和Notl， 4吏所提取質(zhì)粒經(jīng) 受限制性消化，并且將所消化產(chǎn)物于0.6% TAE瓊脂糖凝膠在100 V 下經(jīng)受凝膠電泳60分鐘。檢測(cè)含有大小正確的片段的菌抹，所述片段 為3.3 kb pET-17b載體和6.4 kb Aox操縱子核酸分子插入。
雙向五聚氫化酶蛋白復(fù)合體的表達(dá)
將含有大小正確的片段的兩種純抹(一種Notl而一種EcoRI)轉(zhuǎn)染 進(jìn)大腸桿菌BL21和BL21(DE3)pLys5細(xì)胞系。具體地，制備1 ng/jtd 純抹細(xì)胞的稀釋液，用于轉(zhuǎn)染進(jìn)BL21和BL21(DE3)pLys5細(xì)胞系，所 述轉(zhuǎn)染通過隨后于冰上孵育5分鐘，于42°C溫育30秒，并于冰上再 孵育2分鐘。隨后添加80 /il的SOC(RT),并將反應(yīng)混合物于37。C溫 育60分鐘。隨后將100 jid的反應(yīng)混合物劃線接種于含有50 ]Lig/ml羧 芐青霉素或氨千青霉素的LB瓊脂板，接著在37。C下溫育過夜。
將Notl載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的 一種集落用作接種物，這包括將具有50 /ig/ml羧千青霉素的1 ml LB肉湯中的轉(zhuǎn)化子集落用于接種250 ml燒
瓶中的50 ml培養(yǎng)物。類似地，將EcoRI載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的一種集落 用作接種物。在37。C下孵育每一所述燒瓶培養(yǎng)物，并以250RPM將 其振搖4-5小時(shí)。隨后使用或不使用蛋白表達(dá)刺激(通過添加200/d的 100nMIPTG(終濃度0.4nM)而誘導(dǎo))孵育培養(yǎng)物。接著在37。C下進(jìn)一 步振搖孵育培養(yǎng)物3小時(shí)。隨后通過在4°C下以5000xg離心收獲細(xì) 胞。接著將所述細(xì)胞沉淀物干燥地儲(chǔ)存于70。C以備后用。
重組雙向氫化酶蛋白復(fù)合體以不溶性包涵體和可溶性蛋白積累。 使用12.5 ml TRIS-HC1 pH8.0清洗沉淀物一次。
使用2 ml的細(xì)菌蛋白提取試劑(溶于磷酸鹽緩沖液的B-PER; Pierce, USA)和40 /xl的10 mg/ml溶菌酶(終濃度200 /xg/ml)以進(jìn)一步消 化細(xì)胞碎片并釋放包涵體，從而提取包涵體蛋白。隨后將所述"包涵 體，，沉淀通過加熱、渦旋和超聲處理溶于1%SDS(1 ml)。
使用2 ml的B-PER試劑(Pierce, USA)并經(jīng)渦旋或吹打的機(jī)械勻漿 提取可溶性蛋白。隨后使用離心將所述部分在27,200xg下分離1小時(shí)， 從而導(dǎo)致超過90%的回收。通過添加5 ml的三氯乙酸/丙酮(5 ml的6N TCA或3 ml TCA,使用丙酮將300 /il的TBP稀釋至總體積30 ml)使 用TCA沉淀濃縮所述可溶性蛋白組分，將其充分混合并儲(chǔ)存于-20。C。 隨后以4,600xg離心所述混合物1小時(shí)，接著使用平衡緩沖液(300 /xl 的TBP加入29,700 jnl丙酮)清洗。隨后再次借助加熱、渦旋和超聲處 理將沉淀物重懸于1% SDS。
隨后，根據(jù)pl將分離自Notl和EcoRI轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的可溶性蛋白 和包涵體分開，并使用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)將其可 視化。具體地，將10 /xl的每一樣品(來自使用均誘導(dǎo)的和未誘導(dǎo)的DE3 和pLysS兩者轉(zhuǎn)化的Notl和EcoRI細(xì)胞的可溶性蛋白和包涵體)在150 V下跑10% SDS-PAGE凝膠65分鐘。這接著是染色1小時(shí)并過夜脫 色。
考慮到所得SDS-PAGE凝膠內(nèi)兩種雙向氫化酶亞單位(心肌黃酶 和天然的)的相對(duì)位置，將帶切除、清洗、脫色、用胰蛋白酶消化并提 取肽，此后使用質(zhì)語(yǔ)分析鑒定。使用QqTOF-MS-MS的肽指紋結(jié)果表 明在所述i秀導(dǎo)的DE3 Notl轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系中存在/wxU和hoxU亞單位。
而所述誘導(dǎo)的EcoRI轉(zhuǎn)化細(xì)胞的結(jié)果表明Zw;cH、 AoxU、 ZjojcF和AoxY 也是以包涵體存在于DE3和pLysS大腸桿菌細(xì)胞系中。
讀者的注意力涉及和本申請(qǐng)相關(guān)的與本說明書同時(shí)提交或之前提 交的且與本說明書一道向公眾檢查開放的所有論文和文件，并且所有 所述"i侖文和文件的內(nèi)容通過引用并入本文。
可以將本說明書(包括任何附帶的權(quán)利要求書、摘要和附圖)公開 的所有特征，和/或如此公開的任何方法或過程的所有步驟以任意組合 方式而組合，所述組合方式除去至少一些所述特征和/或步驟相互排斥 的組合方式。
可以用達(dá)到相同、等^f介或類似目的的可選擇特征4、替本"i兌明書(包 括任何附帶的權(quán)利要求書、摘要和附圖)公開的每一特征，除非已在表 達(dá)上相反地陳述。因此，除非已在表達(dá)上相反地陳述，公開的每一特 征只是等價(jià)或類似特征的 一般系列的 一種實(shí)例。
本發(fā)明不限于任何前述實(shí)施方案的細(xì)節(jié)。本發(fā)明延伸至本說明書 (包括任何附帶的權(quán)利要求書、摘要和附圖)所公開特征的任何新的一 種或任何新的組合，或者延伸至如此公開的任何方法或過程的步驟的 任何新的 一種或4壬何新的組合。
權(quán)利要求
1.用于產(chǎn)生氫化酶蛋白或氫化酶蛋白復(fù)合體的表達(dá)載體，包括可操作連接的下列元件a)轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子元件；b)編碼具有與藍(lán)細(xì)菌氫化酶相關(guān)的特異酶活性的多肽的核酸分子；和c)轉(zhuǎn)錄終止子。
2. 如權(quán)利要求1所述的表達(dá)載體，其中所述核酸分子選自i) 包括SEQIDNO:l的核苷酸序列的核酸分子；ii) 具有與SEQIDNO:l的核香酸序列至少70%—致性且編碼 具有氫化酶活性的多肽的核酸分子；iii) 與SEQ ID NO:l的核酸序列雜交且編碼具有氫化酶活性 的多肽的核酸分子；或者iv) 包括以上i)、ii)和iii)的序列遺傳密碼的簡(jiǎn)并核苷酸序列的 核酸分子。
3. 如權(quán)利要求2所述的表達(dá)載體，其中所述核酸分子由SEQ ID NO:l的核普酸序列組成。
4. 如權(quán)利要求1所述的表達(dá)載體，其中所述核酸分子選自i) 包括SEQ ID NOs:2， 4， 7， 9和12的每一種的核普酸序列的 核酸分子；ii) 核酸分子，所述核酸分子包括具有與SEQ ID NO:2至少 70%—致性的核苦酸序列、具有與SEQ ID NO:4至少70%—致性的核 苷酸序列、具有與SEQIDNO:7至少70%—致性的核苷酸序列、具有 與SEQ ID NO:9至少70%—致性的核普酸序列以及具有與SEQ ID NO:ll至少70%—致性的核苷酸序列；或iii) 核酸分子，所述核酸分子由下列所組成具有與SEQ ID NO:2至少70%—致性的核苷酸序列、具有與SEQ ID NO:4至少70% 一致性的核苷酸序列、具有與SEQIDNO:7至少70%—致性的核苷酸 序列、具有與SEQIDNO:9至少70%—致性的核苷酸序列以及具有與 SEQ IDNO:ll至少70%—致性的核苷酸序列。
5. 如權(quán)利要求4所述的表達(dá)載體，其中所述核酸分子由SEQ ID NOs:2， 4， 7, 9和12的每一種的核苷酸序列組成。
6. 如權(quán)利要求1所述的表達(dá)栽體，其中所述核酸分子選自i) 包括SEQ ID NOs:2， 4, 7, 9或12的至少一種的核香酸序列 的核酸分子；或ii) 包括下列的至少一種的核苷酸序列的核酸分子具有與 SEQ ID NO:2至少70%—致性的核香酸序列、具有與SEQ ID NO:4至 少70%—致性的核苷酸序列、具有與SEQIDNO:7至少70%—致性的 核苷酸序列、具有與SEQIDNO:9至少70%—致性的核苷酸序列以及 具有與SEQIDNO:ll至少70%—致性的核苷酸序列。
7. 如權(quán)利要求6所述的表達(dá)栽體，其中所述核酸分子是由SEQID NO:2的核酸序列代表的核酸分子，或與SEQ ID NO:2雜交并編碼具 有心肌黃酶活性的多肽的變體核酸分子。
8. 如權(quán)利要求6所述的表達(dá)載體，其中所述核酸分子是由SEQID NO:4的核酸序列代表的核酸分子，或與SEQ ID NO:4雜交并編碼具 有NADH脫氫酶I活性的多肽的變體核酸分子。
9. 如權(quán)利要求6所述的表達(dá)載體，其中所述核酸分子是由SEQID NO:7的核酸序列代表的核酸分子，或與SEQ ID NO:7雜交并編碼具 有NAD還原氬化酶7活性的多肽的變體核酸分子。
10. 如權(quán)利要求6所述的表達(dá)載體，其中所述核酸分子是由SEQ ID NO:9的核酸序列代表的核酸分子，或與SEQ ID NO:9雜交并編碼 具有NAD還原氬化酶S活性的多肽的變體核酸分子。
11. 如權(quán)利要求6所述的表達(dá)載體，其中所述核酸分子是由SEQ ID NO:12的核酸序列代表的核酸分子，或與SEQ ID NO:12雜交并編 碼具有NAD還原氫化酶/5活性的多肽的變體核酸分子。
12. 如權(quán)利要求1所述的表達(dá)載體，其中所述核酸分子由編碼SEQ IDNOs:3， 5, 8, 10和13的每一種多肽的核苷酸序列組成。
13. 如權(quán)利要求7至12中任一項(xiàng)所述的表達(dá)栽體，其中所述變體 核酸分子在嚴(yán)緊雜交條件下雜交。
14. 如權(quán)利要求1至13中任一項(xiàng)所述的表達(dá)栽體，其中所述轉(zhuǎn)錄件.
15.如權(quán)利要求1至13中任一項(xiàng)所述的表達(dá)載體，其中所述啟動(dòng)厶工S亦乂士 J:* 厶工杏l刑
16. 如權(quán)利要求1至13中任一項(xiàng)所述的表達(dá)載體，其中所述轉(zhuǎn)錄 啟動(dòng)子元件賦予所述核酸分子或變體核酸分子組成型表達(dá)。
17. 如權(quán)利要求1至16中任一項(xiàng)所述的表達(dá)載體，其中所述表達(dá) 載體包括可選擇標(biāo)志物。
18. 如權(quán)利要求1至17中任一項(xiàng)所述的表達(dá)載體，其中所述表達(dá) 載體包括翻譯控制元件。
19.如權(quán)利要求1至18中任一項(xiàng)所述的表達(dá)載體，其中所述翻譯 控制元件是核糖體結(jié)合序列。
20. 如任一前述權(quán)利要求所述的表達(dá)載體，其中所述核酸分子包 括所述核苷酸序列的特定改變，以致優(yōu)化密碼子使用。
21. 使用如權(quán)利要求1至20中任一項(xiàng)所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主 細(xì)胞。
22. 如權(quán)利要求21所述的宿主細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞。
23. 如權(quán)利要求22所述的宿主細(xì)胞，其中所述細(xì)菌細(xì)胞是革蘭氏 陰性細(xì)菌細(xì)胞。
24. 如權(quán)利要求23所述的宿主細(xì)胞，其中所述細(xì)胞屬于埃希氏菌屬。
25. 如權(quán)利要求24所述的宿主細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是大腸桿菌。
26. 如權(quán)利要求25所述的宿主細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是大腸桿菌 BL21或大腸斥干菌BL21(DE3)pLys5。
27. 如權(quán)利要求22所述的宿主細(xì)胞，其中所述細(xì)菌細(xì)胞是革蘭氏 陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)月包。
28. 如權(quán)利要求21至27中任一項(xiàng)所述的宿主細(xì)胞，其中所述細(xì) 胞包括載體，所述載體包括tRNA基因。
29. 如權(quán)利要求28所述的宿主細(xì)胞，其中所述tRNA基因編碼 argU、 ilex、 leuW、 proL或glyT。
30. 產(chǎn)生氫氣的方法，包括i)將包括至少一種藍(lán)細(xì)菌氫化酶基因的核酸分子并入用于在 宿主細(xì)胞中表達(dá)的表達(dá)載體；并且 iii)使用所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞； 其中所得轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞產(chǎn)生氫氣。
31. 如權(quán)利要求30所述的方法，其中所述至少一種氫化酶基因是 雙向氫化酶基因。
32. 如權(quán)利要求30或31所述的方法，其中所述藍(lán)細(xì)菌屬于集胞條屬o
33. 如權(quán)利要求32所述的方法，其中所述藍(lán)細(xì)菌是集胞藻PCC 6803。
34. 如權(quán)利要求30至33中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述核酸分 子選自i) 包括SEQIDN0:1的核苷酸序列的核酸分子；ii) 具有與SEQIDN0:1的核香酸序列至少70%—致性的核酸分子；iii) 與SEQIDNO:l的核酸序列雜交的核酸分子；或者iv) 包括以上i)、ii)和iii)的序列遺傳密碼的簡(jiǎn)并核苷酸序列的 核酸分子。
35. 如權(quán)利要求34所述的方法，其中所述核酸分子由SEQ ID NO:l的核苷酸序列組成。
36. 如權(quán)利要求30至35中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述核酸分 子選自i)包括SEQ ID NOs:2， 4， 7, 9和12的每一種的核苷酸序列的 核酸分子；ii) 核酸分子，所述核酸分子包括具有與SEQ ID NO:2至少 70%—致性的核苷酸序列、具有與SEQ ID NO:4至少70%—致性的核 香酸序列、具有與SEQIDNO:7至少70%—致性的核苷酸序列、具有 與SEQ ID NO:9至少70%—致性的核苷酸序列以及具有與SEQ ID NO:ll至少70%—致性的核苷酸序列；或iii) 核酸分子，所述核酸分子由下列所組成具有與SEQ ID NO:2至少70%—致性的核苦酸序列、具有與SEQ ID NO:4至少70% 一致性的核苷酸序列、具有與SEQIDNO:7至少70%—致性的核苷酸 序列、具有與SEQIDNO:9至少70%—致性的核苷酸序列以及具有與 SEQ ID NO:ll至少70%—致性的核苷酸序列。
37. 如權(quán)利要求36所述的方法，其中所述核酸分子由SEQ ID NOs:2， 4, 7， 9和12的每一種的核苷酸序列組成。
38. 如權(quán)利要求30至33中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述核酸分 子選自-.i) 包括SEQ ID NOs:2， 4, 7， 9或12的至少一種的核苷酸序列 的核酸分子；或ii) 包括下列的至少一種的核苷酸序列的核酸分子具有與 SEQ ID NO:2至少70%—致性的核苷酸序列、具有與SEQ ID NO:4至少70%—致性的核苷酸序列、具有與SEQ ID NO:7至 少70%—致性的核苦酸序列、具有與SEQ ID NO:9至少70% 一致性的核苷酸序列以及具有與SEQ ID NO:ll至少70%—致 性的核苦酸序列。
39. 如權(quán)利要求38所述的方法，其中所述核酸分子是由SEQ ID NO:2的核酸序列代表的核酸分子，或與SEQ ID NO:2雜交并編碼具 有心肌黃酶活性的多肽的變體核酸分子。
40. 如權(quán)利要求38所述的方法，其中所述核酸分子是由SEQ ID NO:4的核酸序列代表的核酸分子，或與SEQ ID NO:4雜交并編碼具 有NADH脫氬酶I活性的多肽的變體核酸分子。
41. 如權(quán)利要求38所述的方法，其中所述核酸分子是由SEQ ID NO:7的核酸序列代表的核酸分子，或與SEQ ID NO:7雜交并編碼具 有NAD還原氫化酶7活性的多肽的變體核酸分子。
42. 如權(quán)利要求38所述的方法，其中所述核酸分子是由SEQ ID NO:9的核酸序列代表的核酸分子，或與SEQ ID NO:9雜交并編碼具 有NAD還原氫化酶S活性的多肽的變體核酸分子。
43. 如權(quán)利要求38所述的方法，其中所述核酸分子是由SEQ ID NO:12的核酸序列代表的核酸分子，或與SEQ ID NO:12雜交并編碼 具有NAD還原氫化酶jS活性的多肽的變體核酸分子。
44. 如權(quán)利要求38所述的方法，其中所述核酸分子是由編碼SEQ IDNOs:3， 5,8， 10和13的每一種多肽的核苷酸序列組成。
45. 反應(yīng)容器，包含如權(quán)利要求21至29中任一項(xiàng)所述的宿主細(xì) 胞和足以支持所述細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)基。
46. 如權(quán)利要求45所述的反應(yīng)容器，其中所述容器是生物反應(yīng)器。
47. 如權(quán)利要求45或權(quán)利要求46所述的反應(yīng)容器，其中所述容 器是發(fā)酵罐。
48. 產(chǎn)生氫氣的方法，包括i)提供包括如權(quán)利要求21至29中任一項(xiàng)所述的宿主細(xì)胞的谷奮，ii) 提供促進(jìn)通過包含于所述容器的細(xì)胞培養(yǎng)物產(chǎn)生氫氣的細(xì) 胞培養(yǎng)條件；并且可選擇地iii) 從所述容器收集氬氣。
49. 用于由細(xì)胞產(chǎn)生氫氣并收集細(xì)胞所產(chǎn)生氫氣的裝置，所述裝 置包括i) 含有如權(quán)利要求21至29中任一項(xiàng)所述的宿主細(xì)胞的反應(yīng) 容器；和ii) 與所述細(xì)胞培養(yǎng)容器在流體上相關(guān)的第二容器，其中改造 所述第二容器以用于收集和/或儲(chǔ)存由包含于(i)中的所述細(xì)胞 培養(yǎng)容器的細(xì)胞產(chǎn)生的氫氣。
50. 藍(lán)細(xì)菌氫化酶在重組表達(dá)系統(tǒng)中用于產(chǎn)生氫氣的用途。
51. 如權(quán)利要求50的用途，其中所述藍(lán)細(xì)菌氬化酶由核酸分子編 碼，所述核酸分子選自i) 包括SEQIDN0:1的核香酸序列的核酸分子；ii) 具有與SEQIDNO:l的核苷酸序列至少70%—致性且編碼 具有氫化酶活性的多肽的核酸分子；iii) 與SEQ ID NO:l的核酸序列雜交且編碼具有氫化酶活性 的多肽的核酸分子；或者iv) 包括以上i)、ii)和iii)的序列遺傳密碼的簡(jiǎn)并核苷酸序列的 核酸分子。
52. 由SEQIDNO:l的核酸序列代表的核酸分子。
全文摘要
本申請(qǐng)公開了使用重組表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生氫氣的表達(dá)載體、宿主細(xì)胞和方法。所述表達(dá)載體包括SEQ ID NO1的雙向氫化酶蛋白復(fù)合體編碼序列。
文檔編號(hào)C12N9/02GK101370931SQ200680052679
公開日2009年2月18日 申請(qǐng)日期2006年12月21日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月22日
發(fā)明者亞當(dāng)·馬丁·博加, 希利亞·拉蒂安寧亞斯, 菲利普·克雷格·懷特 申請(qǐng)人:謝菲爾德大學(xué)