專利名稱：：用作神經(jīng)遞質(zhì)分泌抑制劑和肌肉松弛誘導(dǎo)物的合成肽的制作方法用作神經(jīng)遞質(zhì)分泌抑制劑和肌肉松弛誘導(dǎo)物的合成肽本發(fā)明描述了涉及阻斷神經(jīng)遞質(zhì)分泌并誘導(dǎo)肌肉松弛的合成肽的材料和方法，以及所述肽作為神經(jīng)遞質(zhì)分泌和月幾肉收縮的抑制劑和作為肌肉松弛誘導(dǎo)物的用途。
背景技術(shù)：
：最近，為避免肌內(nèi)注射毒素，已披露了透皮肉毒桿菌毒素組合物和給藥方法(美國(guó)專利7>布號(hào)20050074461、美國(guó)專利7>布號(hào)20050175636)。然而，在皮膚上存^毒素可能是危險(xiǎn)的，原因是有可能接觸到口、鼻咽部位和消化道。在一個(gè)變化中，本發(fā)明提供增強(qiáng)傷口愈合的方法，該方法包括給予需要傷口愈合的受試者有效量的組合物的步驟，所述組合物含有本發(fā)明的一種或多種肽。在另一個(gè)變化中，本發(fā)明提供通過(guò)阻斷纖維化過(guò)程增強(qiáng)傷口愈合的方法，i亥方法包括給予需要傷口愈合的受試者有效量的組合物的步驟，所述組合物含有本發(fā)明的一種或多種肽。圖3顯示了本發(fā)明的肽組合對(duì)PC12細(xì)胞的神經(jīng)分泌的抑制。圖5A圖示了不同濃度的9Rac/am肽對(duì)弗林蛋白酶活性的作用。圖5B圖示了不同濃度的LSeII肽對(duì)弗林蛋白酶活性的作用。圖5C顯示了L-9K對(duì)弗林蛋白酶活性的作用。D氨基酸是L氨基酸的對(duì)映體形式，通常不摻入到天然合成的肽中。提出本發(fā)明的肽作為D-對(duì)映體氨基酸肽起作用，即從氨基(NH2)端至羧基(COOH)端的序列相l(xiāng)^但每個(gè)氬基酸均為D-對(duì)映體。。通過(guò)用PC12-ES細(xì)胞4企測(cè)[3司順激發(fā)的分泌，進(jìn)行了神經(jīng)分泌測(cè)定。測(cè)試了不同的分泌緩沖液(例如鈣分泌緩沖液CaSB和CaSB-葡萄糖)和促分泌素(80mM鉀、0.1mM煙堿或1mM卡巴膽堿(Carbachol);參見(jiàn)表1)，促分泌素定義為引起或刺激分泌的物質(zhì)。用未分化的PC12細(xì)胞以及NGF或STSP分化細(xì)月包，測(cè)定了[3H]NE激發(fā)的分泌。NE，并為釋放檢測(cè)做準(zhǔn)備。然后用鉀(80mM)、煙堿(O.lmM)或卡巴膽堿(lmM)刺激細(xì)胞15分鐘。收集培養(yǎng)基，通過(guò)液體閃爍計(jì)數(shù)測(cè)定釋放的卩H]NE以及總細(xì)胞含量。用不含促分泌素的鈣分泌緩沖液(CaSB)或補(bǔ)加11mM葡萄糖的CaSB(CaSB-葡萄糖)測(cè)量&出分泌。數(shù)據(jù)在表1中表示為分泌百分率[釋放量/(釋放量+細(xì)胞裂解物中的量)]x100。凈分泌是促分泌素刺激的釋放減去^出釋放。NE誘發(fā)釋放(表1)，這些結(jié)果與文獻(xiàn)才l告的緒果(Avila等,Mb/尸/wnwaco/.64:974-86,2003)相一致-在所有測(cè)試條件下，fH]NE的釋放百分率都是可檢測(cè)的。未分化的細(xì)胞表現(xiàn)出的fHINE載荷低于分化細(xì)胞，但L主要缺點(diǎn)的是，這些細(xì)胞對(duì)天然神經(jīng)遞質(zhì)分泌抑制劑如肉毒桿菌神經(jīng)毒素?zé)o反應(yīng)。因此，以后的試驗(yàn)都用分化的PC12-ES細(xì)胞進(jìn)行。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>實(shí)施例4:神經(jīng)分泌的抑制的區(qū)段的氨基酸序列。已知這些肽通過(guò)抑制小泡?？孔铚茹t細(xì)胞的Ca"依賴性分泌。00167PC12細(xì)胞用DMEM-WM(Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基(GIBCO,目錄號(hào)31968，補(bǔ)加青霉素和鏈霉素各25單位)洗滌，加載DMEM-CM(補(bǔ)力口6%馬血清和6%胎牛血清的DMEM-WM)中的卩H]去曱腎上腺素(NE;0.5^Ci/ml)1-2小時(shí)。細(xì)胞用DMEM-WM洗滌1小時(shí)，然后以5分鐘間隔洗條2次。與CaSB-葡萄糖5mMK+(CaSB-葡萄糖140mMNaCI，5mMKC1，2mMCaCl2，11mM葡萄糖，[pH7.4])溫育15分鐘后測(cè)定^54釋放。在載荷NE之后但在誘導(dǎo)分泌"^前將肽以限定濃度加入細(xì)胞中。細(xì)胞用85mMK+(CaSB-葡萄糖，Na+相應(yīng)減少)去極化15分鐘，以測(cè)定所刺激的釋放。取過(guò)融合物(superfUsate)(1ml)加至管中。貼壁細(xì)胞溶解在CaSB-葡萄糖-0.1%Triton(1ml7孔)中。通過(guò)對(duì)澄清的過(guò)融合物和細(xì)胞裂解物分別進(jìn)行液體閃爍外數(shù)，測(cè)定釋放的和M放的放射性標(biāo)記的神經(jīng)遞質(zhì)的量。通it^入舉改的和保留的放射性計(jì)算總4lt取，釋放百分率計(jì)算為(釋放的計(jì)凄t/總攝取計(jì)數(shù))x100。結(jié)果也用神經(jīng)分泌的抑制百分率表示。00168含有L-TAT-ESUP-A、L-Tat、L-Tat-六肽的培養(yǎng)物表現(xiàn)出對(duì)PC12神經(jīng)遞質(zhì)分泌的劑量依賴性抑制，見(jiàn)下表2。單獨(dú)的ESUP-A僅顯示出最小抑制。00169表2<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>NE,并為誘發(fā)釋放檢測(cè)做準(zhǔn)備。然后用鉀(80mM)+/-特異性弗林蛋白酶抑制劑或合成肽刺激細(xì)胞15分鐘。收集培養(yǎng)基，通過(guò)液體閃爍計(jì)數(shù)測(cè)定釋放的fH]NE以及總細(xì)胞含量。用補(bǔ)加llmM葡萄糖的鈣分泌緩沖液(CaSB-葡萄糖)檢測(cè)基礎(chǔ)分泌。數(shù)據(jù)在表4中表示為分泌百分率-[釋放量/(釋放量+細(xì)胞裂解物中的量)]x100。凈分泌是促分泌素刺激的釋放減去&出釋放。FI-I對(duì)PCL2-ES細(xì)胞的神經(jīng)iltt誘發(fā)的分泌顯示出顯著押制》當(dāng)以100^iM^^r葉，F(xiàn)T-I表現(xiàn)出50%的分泌抑制，相比之下D-9Rac/am為76.2%抑制，D-6R為57.4°/。抑制(表4)。對(duì)兩種目標(biāo)肽L-Bell(SEQIDNO.3)和D-9Rac/am(SEQIDNO.15)進(jìn)行了FITC標(biāo)記(Anaspec)，以追蹤它們對(duì)PC-12細(xì)胞(大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞)的內(nèi)化。在觀察到L-Bell-FITC綴合物內(nèi)化后，使用針對(duì)弗林內(nèi)切蛋白酶(fUrinendoprotease)的單克隆抗體通過(guò)共焦顯微鏡分析進(jìn)行了共定位研究。如上所述，本發(fā)明的合成肽被內(nèi)化進(jìn)入細(xì)胞嚢泡。F-肌動(dòng)蛋白在引導(dǎo)嚢泡和蛋白運(yùn)輸以及細(xì)胞骨架重排方面起核心作用?；诩?dòng)蛋白與嚢泡運(yùn)輸和肽內(nèi)化入嚢泡的關(guān)聯(lián)，檢測(cè)了所述肽對(duì)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架組構(gòu)的影響。如前所述制備含有PC-12細(xì)胞的載玻片用于定位研究。簡(jiǎn)而言之，使細(xì)胞接觸多種濃度的FITC標(biāo)記肽或未標(biāo)記肽達(dá)30分鐘，固定，然后透化。最后，用鬼筆環(huán)肽-四曱基異辟u(mài)氰酸羅丹明(TRITC)(SigmaAldrich)綴合物對(duì)F-肌動(dòng)蛋白進(jìn)行焚光標(biāo)記，用皂苷緩沖液(0.25pg/ml)稀釋，并用DAPI二鹽酸鹽(SigmaAldrich)(0.02ng/ml)于室溫核染色最多30^^K絲，對(duì)載波片進(jìn)4豫片和密封，于4'C遮光保存。如先前所述，通過(guò)共焦顯微鏡分析了所述tof肌動(dòng)蛋白聚合的影響。在控制溫度和C02條件下，使用配有旋轉(zhuǎn)盤(pán)Nipkow共焦頭(YokogawaCSU10)、PhotometriesCoolSNAP-HQCCD照相機(jī)和Metamorph6.0采集軟件(VisitronSystems,Puchheim,Germany)的ZeissAxiovert200M(Zeiss,Oberkochem,Germany),進(jìn)行活體3見(jiàn)頻顯微4竟才企。使用10x(Plan-Neofluar,Phi,NA0.3)和20x(Plan-Apochromat,Ph2,NA0.5)Zeiss物鏡以1幀/10秒的速率獲得相位對(duì)比序列。這提示，肽L-Bel1和D-9Rac/am誘導(dǎo)細(xì)胞松弛，此細(xì)胞松弛與和以上公開(kāi)的肌動(dòng)蛋白絲相關(guān)的結(jié)果有關(guān)聯(lián)。為測(cè)定本發(fā)明的肽組合物治療面部皺紋的功效，進(jìn)行臨床研究。首先在動(dòng)物模型中測(cè)試了肽組合物的乳劑(作為化妝品)，以證實(shí)無(wú)毒性作用和無(wú)刺激性作用。首先，控制肽在乳劑中的完整性和穩(wěn)定性以及乳化劑的可能改變(乳化劑的完整性)。然后測(cè)試乳化肽對(duì)小鼠和兔的異常毒性、劑量依賴性毒性以及可能的皮膚反應(yīng)。優(yōu)選可使用哺乳動(dòng)物，更優(yōu)選使用人、牛、馬、貓、狗、豬、山羊、綿羊、大鼠、豚鼠、小鼠、兔或其它適宜的哺乳動(dòng)物作為皮膚病學(xué)研究模型。[00220例如，SCID-hu異種移植模型(BoehnckeWHAc/zDermato/291:367-373，1999)允許人移植物出現(xiàn)在免疫缺陷SCID小鼠中，能夠檢驗(yàn)對(duì)人皮膚的作用。用于測(cè)試產(chǎn)品對(duì)微型豬細(xì)胞的作用的體外模型描述于Wu等，JDennato/.152:1263-67，2005，而Duva等人(五:c;Dm^to/.12增刊，2:64-70,2003)描述了用于評(píng)價(jià)化妝品對(duì)人皮膚作用的體外模型。其它模型是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的(例如Dreher等，5fe'MP/zmKaco/^;/Sfc>7P^w'o/.15增刊1:40-58,2002)。[00221在動(dòng)物模型中測(cè)試肽乳劑之后，將組合物給予健康志愿者。通過(guò)首先獲得健康志愿者的側(cè)眶前區(qū)的硅印模(siliconimprint),進(jìn)行檢測(cè)肽組合物有效性的皮膚形絲析。每息用2:fc^斤緣的油/水乳劑。志愿者在一個(gè)側(cè)眶前區(qū)應(yīng)用舍所g的乳劑，^目對(duì)的一側(cè)施用單獨(dú)的乳劑。在0、15和30天后得到硅印模，通過(guò)共焦激光掃描顯微鏡分析，評(píng)價(jià)處理前后的皮趺i面^L^。共焦顯^L鏡-使用反射模式和三維分析，以評(píng)價(jià)粗糙度的不同參數(shù)。依靠外部白光在放大鏡下觀察，在處理前和處理后(第15天和第30天)選"^相同皮膚部位。如果結(jié)果表明調(diào)節(jié)面部肌肉、松弛面部緊張度和減小已形成的皺紋的深度，則所述肽可有效地治療皺紋。皺紋深度改善至少30%以及30%-50%被認(rèn)為是皺紋深度顯著改變。00222預(yù)期本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)聯(lián)想到如以上說(shuō)明性實(shí)施例所敘述的本發(fā)明的眾多修改和變化。因此，只有出現(xiàn)在隨附權(quán)利要求書(shū)中的那些限制才適用于本發(fā)明。權(quán)利要求1.一種含有一種或多種肽的組合物，其中所述一種或多種肽基本上由在SEQIDNO:1-23中所示的氨基酸序列組成。2.權(quán)利要求1的組合物，其中所述肽包含所需氨基酸的L-對(duì)映體。3.權(quán)利要求1的組合物，其中所述肽包含所需氨基酸的D-對(duì)映體。4.權(quán)利要求1的組合物，其中所述肽包含所需氨基酸的L-對(duì)映體或D-對(duì)映體的混合物。5.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的組合物，其中所述一種或多種肽是在SEQIDNO:1-23中所示的肽的逆向逆型異構(gòu)體。6.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的組合物，其中所述一種或多種肽是融合蛋白。7.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的組合物，其中所述一種或多種肽與蛋白易位結(jié)構(gòu)域融合。8.權(quán)利要求7的組合物，其中所述蛋白易位結(jié)構(gòu)域由HIVTAT蛋白獲得。9.權(quán)利要求7的組合物，其中蛋白易位結(jié)構(gòu)域是富含精氨酸的序列。10.權(quán)利要求7的組合物，其中蛋白易位結(jié)構(gòu)域是富含胍基的序列。11.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的f且會(huì)物，其中所述肽與核酸融合。12.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的組合物，其中所述肽與脂解肽GKH融合。13.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的組合物，所述組合物為水包油乳劑。14.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的組合物，所述組合物為油包水浸漬液。15.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的組合物，所述組合物配制成供v^部用。16.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的組合物，其中所述一種或多種肽的總濃;t^組合物總重量的0.00001%至10%(重量/重量)。17.權(quán)利要求16的組合物，其'中所述一種或多種肽的總濃度約為0.001至1%(重量/重量)。18.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的組合物，所述組合物還^^有一種或多種選自以下的神經(jīng)遞質(zhì)抑制劑箭毒、oc-銀環(huán)蛇毒素、加拉明、哌侖西平AF-DX116pF-HHSiD、異丙托銨、東萊菪堿和阿托品。19.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的組合物，所述組合物還含有至少一秤選自以下的活性劑保濕劑、脫色劑、著色促進(jìn)劑、剝離劑、紫外線吸收劑、防曬活性劑、粘度調(diào)節(jié)劑、摩擦劑、pH調(diào)節(jié)劑、抗糖化劑、抗氧化劑、NO合酶抑制劑、刺激真皮和/或表皮大分子合成的物質(zhì)、防止真皮和/或表皮大分子降解的物質(zhì)、刺激M^原合成的物質(zhì)、防止膠原降解的物質(zhì)、刺激成纖維細(xì)胞和/或角質(zhì)形成細(xì)胞增殖或刺激角質(zhì)形成細(xì)胞分化的物質(zhì)、肌肉松弛劑、皮膚松弛劑、再生劑、抗污染劑和自由基清除劑、作用于毛細(xì)血管循環(huán)的物質(zhì)、作用于細(xì)胞代謝的物質(zhì)、抗炎劑、止汗劑、抗微生物劑和抗真菌劑，以及輔助性的親水和親脂凝膠劑、活性劑、防腐劑、溶劑、芳香劑、填充劑、色素、氣p未p及收劑。20.—種用于改善組織腫"長(zhǎng)的方法，所述方法包括使細(xì)胞與有效量的權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的組合物接觸的步驟。21.—種用于抑制肌肉收纟fl的方法，所述方法包括使細(xì)胞與有效量的權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的組合物接觸的步驟。22.—種用于抑制神經(jīng)遞質(zhì)釋放的方法，所述方法包括使分泌神經(jīng)遞質(zhì)的細(xì)胞與有效量的權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的組合物接觸。23.權(quán)利要求22的方法，其卞所述組合物含有由SEQIDNO:11-22中任一項(xiàng)所示的聚精氨酸組成的肽。24.權(quán)利要求23的方法，其中所述聚精氨酸由D-氨基酸組成。25.權(quán)利要求21或22的方法，其中所述接觸通過(guò)選自以下的途徑進(jìn)行透皮、局部、真皮內(nèi)和真皮下。26.—種用于增強(qiáng)傷口^T合的方法，所述方法包括給予需要傷口愈合的受試者有效量的權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的組合物。27.—種用于增強(qiáng)肌肉修-復(fù)的方法，所述方法包括給予需要傷口愈合的受試者有效量的權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的組合物。28.—種用于阻斷傷口中的纖維化過(guò)程的方法，所述方法包括給予需要傷口愈合的受試者有效量的權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的組合物的步驟。29.—種用于治療選自以下的疾病的方法多汗癥、局灶性肌張力障礙、非肌張力障礙性疾病、炎癥和疼痛，所述方法包括給予有需要的受試者有效量的權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的組合物的步驟。30.—種純化和分離的多^^苷酸，所述多核苦酸編碼權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)限定的多肽。31.—種載體，所述載體包含權(quán)利要求30的多核苷酸。32.—種用于轉(zhuǎn)化宿主細(xì)力包的方法，所述方法包括將權(quán)利要求31的載體導(dǎo)入所述宿主細(xì)胞中的步驟。33.—種宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞通過(guò)權(quán)利要求32的方法轉(zhuǎn)化。34.—種用于改善皮膚外〗現(xiàn)的方法，所述方法包括局部應(yīng)用含有權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的組合物和化妝品可接受的溶々某的化妝品。35.權(quán)利要求34的方法，其中所述皮膚是衰老的、光老化的、干燥的、有條紋的或起皺紋的皮膚。36.權(quán)利要求35的方法，其中所述組合物還含有一種或多種下列成分雌二醇、孕酮、孕烷醇酮、輔酶QIO、曱基磺酰甲烷(MSM)、銅肽(銅提取物)、浮游生物提取物(磷脂復(fù)合物)、乙醇酸、曲酸、棕櫚酸抗壞血酸酯、全反式視黃醇、杜鵑花酸、水楊酸、溴帕雌烯、雌酮、37.權(quán)利要求34的方法，其中所述組合物還包含防曬劑。38.權(quán)利要求34的方法，其中所述化妝品可"I矣受的溶J!某為水包油乳劑或油包水乳劑。39.權(quán)利要求34的方法，其中所述組合物選自乳劑、洗劑、噴霧劑、氣霧劑、粉劑、軟膏劑、乳斧劑和泡沫劑。全文摘要本發(fā)明描述了涉及阻斷神經(jīng)遞質(zhì)分泌并誘導(dǎo)肌肉松弛的合成肽的材料和方法，以及所述肽作為神經(jīng)遞質(zhì)分泌和肌肉收縮的抑制劑和作為肌肉松弛誘導(dǎo)物的用途。文檔編號(hào)C12N15/63GK101374860SQ200680052996公開(kāi)日2009年2月25日申請(qǐng)日期2006年12月22日優(yōu)先權(quán)日2005年12月23日發(fā)明者A·庫(kù)恩迪希,N·費(fèi)塞爾申請(qǐng)人:技術(shù)轉(zhuǎn)讓合伙人公司