專(zhuān)利名稱(chēng)：：編碼的多重粒子的比較基因組雜交的制作方法編碼的多重粒子的比較基因組雜交相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用本申請(qǐng)要求下述申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán)于2005年12月23日提交的美國(guó)申請(qǐng)序號(hào)60/753,584;于2005年12月23日提交的美國(guó)專(zhuān)利序號(hào)60/753,822;于2006年2月3日提交的美國(guó)專(zhuān)利序號(hào)60/765,311，和于2006年2月3日提交的美國(guó)專(zhuān)利序號(hào)60/765,355，上述每個(gè)申請(qǐng)的內(nèi)容通過(guò)引用并入本文。背景比較基因組雜交(CGH)是評(píng)價(jià)基因組內(nèi)容物(genomiccontent)的方法。例如，可以使用CGH分析先天性異常、遺傳疾病和癌癥。概述我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)使用編碼的粒子平行地評(píng)價(jià)多個(gè)樣品，從而評(píng)價(jià)基因組內(nèi)容物的方法。在一些實(shí)施方案中，可以通過(guò)平行地評(píng)價(jià)來(lái)自未知樣品的DNA和參比DNA,來(lái)檢測(cè)基因組內(nèi)容物中的差別，例如，無(wú)需將用于分析的DNA與參比DNA組合成單一的混合物。用于分析的DNA和參比DNA保持^f皮此分離。例如，可以用單一標(biāo)記評(píng)價(jià)多個(gè)樣品。在其它一些實(shí)施方案中，通過(guò)比較相同混合物中用于分析的DNA和參比DNA，使用單一的檢測(cè)標(biāo)記^r測(cè)基因組內(nèi)容物的差別。例如，用于分析的DNA和參比DNA可具有不同的直接或間接標(biāo)記。還可以使用本方法評(píng)價(jià)其它核酸，例如，mRNA，如用于基因表達(dá)分析中。在一個(gè)方面，本公開(kāi)的特征在于評(píng)價(jià)基因組DNA的方法。本方法使用混合物，其包括來(lái)自不同粒子集的粒子。每個(gè)粒子集包含大量的編碼的粒子，和用于特定基因組基因座的核酸雜交探針，使得所述混合物共同地包括用于多個(gè)不同基因組基因座的探針。該方法可以包括提供基因組DNA樣品和粒子混合物；在雜交條件下將樣品與部分粒子混合物接觸；和通過(guò)監(jiān)測(cè)可4企測(cè)標(biāo)記，在混合物的各個(gè)部分評(píng)價(jià)樣品與粒子的雜交。監(jiān)測(cè)信號(hào)表示每個(gè)需要研究的(interrogated)基因組基因座的拷貝數(shù)。可以提供多于一個(gè)的核酸樣品(例如，包括基因組DNA的樣品)。例如，可以根據(jù)本發(fā)明評(píng)價(jià)每個(gè)核酸樣品?？梢栽诓煌那皇?compartment)內(nèi)評(píng)價(jià)樣品。在一些實(shí)施方案中，可以在同樣的腔室內(nèi)評(píng)價(jià)多于一個(gè)DNA樣品。在一些實(shí)施方案中，可以用光譜法檢測(cè)可檢測(cè)標(biāo)記。例示性的可4企測(cè)標(biāo)記可以包含藻紅蛋白或其它熒光分子。在一些實(shí)施方案中，核酸雜交探針包括或源自克隆的核酸。例如，核酸雜交探針可以包含來(lái)自細(xì)菌人工染色體(BAC)的核酸。BAC核酸可以包含人基因組DNA的片段或非人(例如，小鼠、大鼠、兔、豚鼠、倉(cāng)鼠、羊、牛、狗、貓、馬、鳥(niǎo)、爬行動(dòng)物、非人靈長(zhǎng)類(lèi)(例如，猴或狒狒)，或蒼蠅)基因組DNA的片段。在一些實(shí)施方案中，核酸雜交探針可以包含對(duì)特定的染色體基因座具有特異性的一個(gè)或多個(gè)寡核苷酸(例如，寡核苷酸的集合)。例如探針可以對(duì)彼此為50、20、5、2、1或0.5百萬(wàn)堿基(megabases)之內(nèi)的序列具有特異性。在一些實(shí)施方案中，例如，可以使用至少2、5、10、20、50、100或200個(gè)不同的粒子集，來(lái)評(píng)價(jià)不同的基因組基因座各自的數(shù)目。在一些實(shí)施方案中，粒子集中所有編碼的粒子可以具有同樣的編碼(code)。在其它實(shí)施方案中，每個(gè)粒子具有唯一的編碼，并儲(chǔ)存信息，指示哪個(gè)粒子在哪個(gè)粒子集中或哪些探針附接于每個(gè)粒子。在一些實(shí)施方案中，多個(gè)樣品中至少一個(gè)樣品可為參比樣品，其中每個(gè)需要測(cè)定的基因組基因座的拷貝數(shù)已知。方法可以包括，將參比樣品的監(jiān)測(cè)信號(hào)與其它樣品的信號(hào)進(jìn)行比較，以確定樣品中每個(gè)需要測(cè)定的基因組基因座的拷貝數(shù)。在一些實(shí)施方案中，當(dāng)提供多于一個(gè)的DNA樣品時(shí)，將每個(gè)樣品用第一間接標(biāo)記來(lái)標(biāo)記，并可將每個(gè)樣品與用第二間接標(biāo)記來(lái)標(biāo)記的參比DNA組合。參比DNA可為來(lái)自參比來(lái)源、每個(gè)需要測(cè)定的基因組基因座拷貝數(shù)都已知的基因組DNA。例如，第一間接標(biāo)記可以是熒光素，而第二間接標(biāo)記可以是生物素。在一些實(shí)施方案中，評(píng)價(jià)可以包括(i)將包括單一標(biāo)記和與第一間^接標(biāo)記結(jié)合的物質(zhì)的第一組成部分(firstmoiety)與樣品的第一部分結(jié)合，和(ii)將包括單一標(biāo)記和與第二間接標(biāo)記結(jié)合的物質(zhì)的第二組成部分與樣品的第二部分結(jié)合。例如，第一組成部分可以包括抗生蛋白鏈菌素(streptavidin)或抗生物素蛋蛋白(avidin)和可檢測(cè)標(biāo)記(例如，藻紅蛋白)，而第二組成部分可以包括抗-熒光素抗體或其功能部分和可^r測(cè)標(biāo)記(例如，藻紅蛋白)。在一些實(shí)施方案中，對(duì)每個(gè)基因組樣品，評(píng)價(jià)每個(gè)不同粒子集中的至少5、10、20、30、50、70或100個(gè)粒子。當(dāng)提供多于一個(gè)樣品時(shí)，多于一個(gè)樣品中的每個(gè)可在多腔室i殳備的不同腔室中。在一些實(shí)施方案中，每個(gè)樣品可以在多孔板的不同孔中。多孔板可以是96孔、384孔或1024孔試驗(yàn)牙反?？梢允褂梅椒ǎ?，檢測(cè)多個(gè)不同的染色體基因座的雜合性(heterozygosity),可以檢測(cè)染色體擴(kuò)增，雜合性的缺失、染色體基因座的雜合缺失(heterozygousdeletion)，或者染色體基因座的純合缺失(homozygousdeletion)。在一些實(shí)施方案中，粒子不與聚合酶接觸，例如在雜交后不與聚合酶接觸。在一些實(shí)施方案中，粒子不與任何酶接觸，例如，在雜交后不與任何酶接觸。在一些實(shí)施方案中，基因組DNA樣品可為未標(biāo)記的(unlabeled)。該方法可還包括將標(biāo)記的探針雜交至基因組樣品，其中，對(duì)于附接于粒子的每個(gè)核酸雜交探針，標(biāo)記的探針雜交至在同樣的基因組基因座的基因連接位點(diǎn)，使得如果樣品中存在基因組基因座，則可以通過(guò)由標(biāo)記的探針與樣品核酸鏈雜交和樣品核酸鏈與附接于粒子的核酸雜交探針雜交而形成的復(fù)合物將標(biāo)記的探針固定于粒子。在一些實(shí)施方案中，可以在將基因組DNA樣品雜交至附接于粒子的核酸探針的同時(shí)，將標(biāo)記的探針雜交。在一些實(shí)施方案中，可以在將基因組DNA樣品雜交至附接于粒子的核酸探針之后，將標(biāo)記的探針雜交。在一些實(shí)施方案中，本方法可還包括用間接標(biāo)記來(lái)標(biāo)記某個(gè)來(lái)源的基因組DNA,以提供基因組DNA樣品。在一些實(shí)施方案中，例如當(dāng)^f吏用單一可檢測(cè)標(biāo)記時(shí)，本方法可還包括用單一標(biāo)記來(lái)標(biāo)記某個(gè)來(lái)源的基因組DNA以提供基因組DNA樣品的步驟。在本方法的一些實(shí)施方案中，可以用單一標(biāo)記來(lái)標(biāo)記所有的基因組DNA樣品。在一些實(shí)施方案中，可以用同樣的間接標(biāo)記來(lái)標(biāo)記基因組內(nèi)容物未知的所有基因組DNA樣品。在一些實(shí)施方案中，可以用同樣的間接標(biāo)記來(lái)標(biāo)記大部分基因組DNA樣品o在一些實(shí)施方案中，本方法可還包括在評(píng)價(jià)雜交之前振蕩粒子。例如，粒子可以用焚光染料全息編碼或編碼，所述染料具有與單一^^測(cè)標(biāo)記可分離的光譜(spectra)。在本方法的一些實(shí)施方案中，粒子可以具有石茲性。例^口，4立子是力l頁(yè)石茲5朱(paramagneticbead)。在另一個(gè)方面，本公開(kāi)提供使用單一的可檢測(cè)部分和粒子混合物評(píng)價(jià)基因組DNA的方法，所述混合物包括來(lái)自不同粒子集的粒子，其中每個(gè)粒子集包含大量編碼的粒子和用于特定基因組基因座的核酸雜交探針，使得混合物共同地包括用于多個(gè)不同基因組基因座的探針。所述方法包括提供至少一個(gè)參比DNA樣品和多個(gè)基因組DNA樣品。每個(gè)樣品用同樣的可檢測(cè)部分標(biāo)記。所述方法還包括將每個(gè)樣品與部分粒子混合物在雜交條件下接觸；并通過(guò)監(jiān)測(cè)可檢測(cè)部分，評(píng)價(jià)混合物各個(gè)部分中每個(gè)樣品與粒子的雜交。例如，每個(gè)樣品在各自的容器中與粒子混合物接觸。監(jiān)測(cè)信號(hào)可表示每個(gè)需要研究的基因組基因座的拷貝數(shù)。所述方法可以包括本文所述的其它特征。在另一個(gè)方面，本公開(kāi)的特點(diǎn)在于使用單一的可檢測(cè)標(biāo)記和粒子混合物評(píng)價(jià)核酸的方法，所述混合物包括來(lái)自不同粒子集的粒子，其中每個(gè)粒子集包含大量編碼的粒子和用于特定靶物的核酸雜交探針，使得混合物共同地包括用于多個(gè)不同靶物的探針。所述方法可包括提供至少一個(gè)用第一間接標(biāo)記來(lái)標(biāo)記參比核酸樣品和多個(gè)測(cè)試核酸樣品。每個(gè)測(cè)試樣品用第二間4妻標(biāo)記來(lái)標(biāo)記。所述方法可包括將每個(gè)測(cè)試樣品和參比樣品與部分粒子混合物在雜交條件下接觸，其中每個(gè)測(cè)試樣品與參比樣品在各自的容器中與粒子混合物接觸；將包括單一標(biāo)記和與第一間接標(biāo)記結(jié)合的物質(zhì)的第一組成部分與每個(gè)測(cè)試樣品的第一部分結(jié)合；將包括單一標(biāo)記和與第二間接標(biāo)記結(jié)合的物質(zhì)的第二組成部分與每個(gè)測(cè)試樣品的第二部分結(jié)合；通過(guò)監(jiān)測(cè)樣品第一部分中的單一標(biāo)記和樣品第二部分中的單一標(biāo)記來(lái)評(píng)價(jià)每個(gè)測(cè)試樣品。監(jiān)測(cè)信號(hào)可表示每個(gè)靶物的拷貝數(shù)。所述方法可包括，對(duì)于每個(gè)測(cè)試樣品，比較來(lái)自第一部分中的單一標(biāo)記的信號(hào)與來(lái)自第二部分中的單一標(biāo)記的信號(hào)，以獲得測(cè)試樣品中的探針拷貝數(shù)相對(duì)于參比樣品的表征值。所述方法可包括本文所述的其它特征。在另一個(gè)方面，本公開(kāi)提供粒子混合物，所述混合物包含來(lái)自不同粒子集的粒子，其中每個(gè)粒子集可包含大量編碼的粒子和用于特定基因組基因座的核酸雜交探針，使得混合物共同地包括用于多個(gè)不同基因組基因座的探針。在一些實(shí)施方案中，用于至少一些基因座的探針可包含細(xì)菌人工染色體DNA。在一些實(shí)施方案中，用于至少一些基因座的探針可包含超聲處理的細(xì)菌人工染色體DNA。在一些實(shí)施方案中，用于至少一些基因座的探針可包含合成寡核苷酸集合。在一些實(shí)施方案中，粒子混合物可還包括粒子，所述粒子包括來(lái)自至少兩個(gè)樣品的雜交的DNA，其中每個(gè)樣品包括基因組DNA，而且每個(gè)樣品可用不同的間接標(biāo)記來(lái)標(biāo)記。在一些實(shí)施方案中，粒子混合物可還包括來(lái)自單一樣品的雜交的DNA，所述單一樣品用可^:測(cè)標(biāo)記來(lái)標(biāo)記，或者包括來(lái)自多于一個(gè)樣品(例如，第一樣品和第二樣品)的雜交的DNA。在另一個(gè)方面，本公開(kāi)的特點(diǎn)在于具有多個(gè)腔室的多腔室板，其中至少多個(gè)孔中的每個(gè)可包含粒子混合物，比如本文描述的任何粒子混合物；和樣品或參比基因組核苷酸。樣品和參比核苷酸可在單獨(dú)的容器中。在一些實(shí)施方案中，樣品和參比核酸可以用同樣的標(biāo)記檢測(cè)。在另一個(gè)方面，本公開(kāi)的特點(diǎn)在于試劑盒，其包括用第一間接標(biāo)記來(lái)標(biāo)記的參比基因組DNA(或其它參比核酸)樣品；用第二間接標(biāo)記來(lái)標(biāo)記基因組DNA(或其它核酸)樣品的試劑。試劑盒還可以包括下述的一種或多種包括單一標(biāo)記和與第一間接標(biāo)記結(jié)合的物質(zhì)的第一組成部分；包括單一標(biāo)i己和與第二間接標(biāo)記結(jié)合的物質(zhì)的第二組成部分；和粒子混合物，比如本文所述的任何粒子混合物。試劑盒還可以(任選地)包括對(duì)如何使用試劑盒檢測(cè)單一標(biāo)記和/或進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的說(shuō)明。還公開(kāi)了包括本文所述的一種或多種組分的試劑盒。試劑盒還可以包括材料，其包括使用組分用于方法(例如本文所述方法)的說(shuō)明。試劑盒可以包括一個(gè)或多個(gè)克隆的或合成的核酸序列(比如細(xì)菌人工染色體(BACS)或一個(gè)或多個(gè)合成寡核芬酸集合，或個(gè)體寡核苷酸)，一個(gè)或多個(gè)^UL板，和/或一個(gè)或多個(gè)粒子集(例如，如本文所述)或粒子混合物。粒子，比如珠，提供特別穩(wěn)固的系統(tǒng)用于評(píng)價(jià)基因組內(nèi)容物?；诹Ｗ拥姆椒òń咏蛱幱谌芤合鄤?dòng)力學(xué)的雜交，因此提供增強(qiáng)的均勻性。粒子易于獲取用于特定探針的很多數(shù)據(jù)點(diǎn)。例如，對(duì)于小粒子(例如，直徑達(dá)到幾微米的粒子)，可以分別分析具有相同探針的至少10、50或100個(gè)粒子。大粒子可以從每個(gè)粒子的不同位置獲得多個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)。對(duì)于大粒子，獲得很多數(shù)據(jù)點(diǎn)經(jīng)常需要更少的粒子?？梢允褂媒y(tǒng)計(jì)學(xué)確定具有相同探針內(nèi)容物的粒子群的中值或平均信號(hào)?？梢詫⒈疚乃龇椒ㄓ糜诒壤?jì)量(ratiometric)實(shí)^r。比例計(jì)量方法通過(guò)同時(shí)而竟?fàn)幮缘剡M(jìn)行多個(gè)實(shí)驗(yàn)，從而修正實(shí)驗(yàn)精確性中的很多潛在誤差。例如，溫育條件或捕獲分子或標(biāo)記試劑的濃度中的任何偏差，都可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)化來(lái)修正。可以使用竟?fàn)幮院头蔷範(fàn)幮缘谋壤?jì)量方法，例如，用于比4交基因組內(nèi)容物或基因表達(dá)。本文引用的所有專(zhuān)利、專(zhuān)利申請(qǐng)和參考文件都通過(guò)引用并入本文。附圖簡(jiǎn)述圖l-6是根據(jù)一個(gè)實(shí)例，以固定于實(shí)驗(yàn)珠上的捕獲分子進(jìn)行的系列特異性結(jié)合相互作用的示意圖。圖7是圖1至6中所述實(shí)例方法的流程圖。圖8-10描述根據(jù)例示性實(shí)施方案進(jìn)行的參比實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。圖11描述使用雙重間接標(biāo)記-單雜交來(lái)表達(dá)RNA的例示性實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。圖12是線形圖，描述根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案進(jìn)行的單色(單標(biāo)記)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，其中參比和測(cè)試樣品不在同一個(gè)孔中。詳述有效而經(jīng)濟(jì)的設(shè)計(jì)特點(diǎn)大大地4足進(jìn)了多重核酸方法。如本文所述，可以使用單標(biāo)記檢測(cè)進(jìn)行宏大的多重實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)使用來(lái)自不同粒子集的小粒子混合物。每個(gè)粒子集包含大量編碼的粒子和用于特定靶物(如特定基因組基因座或RNA)的核酸雜交探針?？蓪?lái)自不同集的粒子組合以提供混合物，所述混合物共同地包括用于多個(gè)不同靶物的探針。在一個(gè)實(shí)例中，將粒子混合物分成至少兩部分，A和B。用第一組成部分標(biāo)記測(cè)試樣品基因組DNA,并與標(biāo)記的A部分雜交。用基團(tuán)標(biāo)記參比DNA(通常為來(lái)自參比樣品的基因組DNA),所述基團(tuán)可以與第一組成部分相同或不同(即，第二組成部分)。參比DNA與B部分雜交。測(cè)定來(lái)自A部分和B部分的信號(hào)，然后比較。如果參比DNA和樣品DNA用同樣的基團(tuán)標(biāo)記，那么它們?cè)诓煌萜髦羞M(jìn)行處理。進(jìn)行少量操作，可使用設(shè)備評(píng)價(jià)兩個(gè)雜交反應(yīng)，所述設(shè)備經(jīng)過(guò)配置以檢測(cè)標(biāo)記基團(tuán)是直接標(biāo)記，還是與直接標(biāo)記偶連(例如，在雜交之前或之后)。所用的基團(tuán)可以是間接標(biāo)記(如用作間接標(biāo)記的染料)、直接標(biāo)記(如染料，例如焚光團(tuán))，或特異性結(jié)合對(duì)的成員。檢測(cè)可以是直接或間接的，例如，通過(guò)使用特異性結(jié)合對(duì)的標(biāo)記的第二成員進(jìn)行二級(jí)(secondary)檢測(cè)。在第二個(gè)實(shí)例中，用不同的間接標(biāo)記來(lái)分別標(biāo)記測(cè)試和參比樣品基因組DNA。間接標(biāo)記通常是特異性結(jié)合對(duì)的第一成員。將樣品互相混合，并與粒子混合物的同一部分雜交。在溫育和洗滌后，將所述部分分入至少兩個(gè)容器中，用于與兩個(gè)特異性結(jié)合對(duì)中相應(yīng)的第二成員一起溫育。兩個(gè)特異性結(jié)合對(duì)中的這些第二成員可以與第三標(biāo)記偶連，而且如果需要，可以與第四標(biāo)記偶連，所述第四標(biāo)記用于檢測(cè)。通常，檢測(cè)器標(biāo)記和兩個(gè)間接標(biāo)記彼此完全不同。例如，如果一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記是熒光標(biāo)記，那么它們具有不同的激發(fā)和/或發(fā)射光譜，使得它們可以通過(guò)光譜區(qū)分。為了說(shuō)明，可將生物素用作測(cè)試樣品的間接標(biāo)記，并將羧基熒光素用作參比樣品的間接標(biāo)記。因此，在第一個(gè)容器中，加入焚光標(biāo)記的抗生蛋白鏈菌素(其與生物素結(jié)合)并溫育，而在第二個(gè)容器中，加入熒光標(biāo)記的抗-熒光素(其與羧基熒光素結(jié)合)并溫育。對(duì)于LUMINEXxMAPTM系統(tǒng)，優(yōu)選用于4企測(cè)的熒光標(biāo)記是藻紅蛋白。然后使用單色檢測(cè)系統(tǒng)順序讀出每個(gè)與結(jié)合的熒光標(biāo)記產(chǎn)物溫育的粒子混合物的值(測(cè)試和參比樣品)，并將信號(hào)進(jìn)行比較。這兩個(gè)例子說(shuō)明了使用單一檢測(cè)獲得比較或比例計(jì)量信息的方法。在例示性應(yīng)用中，可以在單一多孔板中，使用具有用于不同靶物(例如不同基因組基因座)的探針的粒子混合物，處理大量不同的病人樣品。將粒子混合物置于板的每個(gè)孔中。每個(gè)樣品放入一個(gè)孔中。以這種方式，可以平行而且在有機(jī)器人(robotic)幫助的情況下處理多個(gè)樣品。然后可使用設(shè)備(比如流式細(xì)胞儀)評(píng)價(jià)每個(gè)樣品，從而檢測(cè)與混合物中不同粒子類(lèi)型的雜交。在一些實(shí)施方案中，用兩種不同的直接或間接標(biāo)記來(lái)標(biāo)記測(cè)試和參比樣品。如果標(biāo)記是直接的(例如，熒光染料，比如青色素(cyanine)3和青色素5),則可以混合樣品并與粒子集雜交，用能區(qū)分兩種標(biāo)記的設(shè)備進(jìn)行檢測(cè)。如果標(biāo)記是間接的(即，特異性結(jié)合對(duì)的第一成員，比如生物素和熒光素)，則特異性結(jié)合對(duì)的每個(gè)第二成員(例如，抗生蛋白鏈菌素和抗熒光素)可用唯一的檢測(cè)器標(biāo)記(如青色素3和青色素5)來(lái)標(biāo)記，并用能區(qū)分兩種標(biāo)記的設(shè)備進(jìn)行檢測(cè)。粒子可以使用各種不同類(lèi)型的粒子以評(píng)價(jià)核酸內(nèi)容物，例如，基因組內(nèi)容物。粒子可以是任何形狀(例如，圓柱、球形等)、大小、組成或物理化學(xué)性質(zhì)。可以選擇粒度或粒子組成，使得粒子可以從流體中分離，例如，在具有特定孔徑的濾器上或通過(guò)其它物理性質(zhì)(例如-茲性)來(lái)分離。粒子通常適于多重實(shí)驗(yàn)。例如，每個(gè)粒子包括唯一的編碼，特別是，除特異于基因組DNA的核酸探針之外的編碼。編碼以能夠在雜交和分析過(guò)程中穩(wěn)定的方式嵌入(例如，在粒子內(nèi)部中)或另外附接于粒子?？梢酝ㄟ^(guò)任何可才全測(cè)方法，如通過(guò)全息編碼，通過(guò)焚光性質(zhì)、顏色、形狀、大小、光發(fā)射、量子點(diǎn)發(fā)射等提供編碼，以鑒定粒子從而鑒定固定于其上的捕獲探針。在一些實(shí)施方案中，編碼不是由核酸提供的。例如，可以使用光學(xué)、化學(xué)、物理或電子標(biāo)志編碼粒子。這種編碼技術(shù)的實(shí)例是光條形碼熒光染料，或其它手段。一個(gè)例示性的平臺(tái)使用浸漬于聚合物粒子中的熒光染料混合物，作為鑒定固定了特異性捕獲探針的粒子集的每個(gè)成員的手段。另一個(gè)例示性的平臺(tái)使用全息條形碼以鑒定圓柱形玻璃粒子。例如，Chandler等(5，981，180)描述了基于粒子的系統(tǒng)，其中不同的粒子類(lèi)型由浸漬于聚合物粒子中的兩個(gè)或更多熒光染料的各個(gè)部分的混合物來(lái)編碼。Soini(5,028,545)描述了基于粒子的多重實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，其使用時(shí)間分辨的(time-resolved)熒光進(jìn)行粒子鑒定。Fulwyler(4,499,052)描述使用通過(guò)顏色和/或大小區(qū)分的粒子的例示性方法。US2004-0179267、2004-0132205、2004-0130786、2004-0130761、2004-0126875、2004-0125424和2004-0075907描述由全息條碼編碼的例示性粒子。US6,916,661描述了與納米顆粒結(jié)合的聚合微粒，所述納米顆粒具有為粒子提供編碼的染料。聚合微粒的直徑小于一毫米，例如，大小為直徑在從約0.1微米至約1000微米，例如，3-25nm或約6-12pm。納米顆粒可以具有，例如/人約1納米(nm)至約100,000nm的直徑，例如，約10-1000nm或200-500nm?？梢酝ㄟ^(guò)將來(lái)自不同粒子集的粒子組合而制備用于檢測(cè)多個(gè)基因組基因座的粒子混合物。每個(gè)粒子集包含大量具有相同編碼的粒子，和特異于特定基因座的核酸探針內(nèi)容物。例如，不同粒子元素的數(shù)量可為10-3000、10-500、20-200、50-2000、50-500或50-200，或75-300?？梢苑謩e制備每個(gè)粒子集，然后將粒子集的部分與其它粒子集的部分組合，以提供粒子混合物。粒子集的每個(gè)部分包括大量粒子，從而當(dāng)使用粒子混合物的部分分析DNA樣品時(shí)，在每個(gè)樣品的雜交反應(yīng)中存在很多特異于特定基因座的粒子(例如，至少10、20、30、50、80,或100個(gè)粒子；或者甚至1-5個(gè))?？梢栽谝后w樣品中在懸浮液中振蕩粒子，以促進(jìn)較快地結(jié)合于探針。分析粒子以確定與粒子雜交的程度。例如，檢測(cè)與基因組DNA相關(guān)的標(biāo)記?？梢允褂迷O(shè)備分別評(píng)價(jià)粒子，所述設(shè)備能夠讀出粒子編碼，并確定與每個(gè)特定粒子關(guān)聯(lián)的信號(hào)。核酸探針粒子通常具有特異于一個(gè)特定染色體基因座或基因的探針，視應(yīng)用而定。例如，可以從克隆的DNA(例如，BAC或酵母人工染色體或其它來(lái)源克隆的DNA)、擴(kuò)增的DNA或寡核苷酸制備探針。通常，可以使用序列可確定的任何來(lái)源的核酸。將探針固定于粒子上，例如在表面上，或用于多孔粒子，或內(nèi)表面和/或外表面。一個(gè)染色體探針包含合成寡核苷酸的混合物。另一個(gè)例示性類(lèi)型的染色體探針源自BAC克隆的DNA，其可以固定為片段的BACDNA。通常，附接于特定粒子的探針可以是片段的混合物。例如，片段包含隨機(jī)重疊序列，其中大部分的長(zhǎng)度為600-2000堿基對(duì)?？梢灾苽浜铣晒押塑账嵝蛄械幕旌衔镒鳛樘结?，其中每個(gè)序列長(zhǎng)度為約60-150堿基對(duì)，或者重疊或者是連續(xù)的序列。寡核苷酸混合物具有確定的組成，并可以用經(jīng)濟(jì)有效的方式制備。探針可以共價(jià)附接于特定粒子上。例如，US6,048,695描述了附接探針的例示性方法。如果用于特定粒子集的探針是一個(gè)或多個(gè)化學(xué)合成的寡核苷酸，則可以合成具有能與粒子上的基團(tuán)反應(yīng)的化學(xué)基團(tuán)(例如，胺)的寡核苦酸。探針還可以源自其它來(lái)源，例如，質(zhì)粒、粘粒和人工染色體。例如，可將細(xì)菌人工染色體(BAC)超聲處理，然后與交聯(lián)劑反應(yīng)，所述交聯(lián)劑將BAC共價(jià)附接于粒子上。例如，可以使用l-乙基-3-[3-二曱基氨基丙基]鹽酸碳化二亞胺(l-e勿l-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimidehydrochloride)(EDC或EDAC化學(xué))以將核酸探針(如超聲處理的BACDNA)附接于粒子上。通常，將探針附接于粒子集時(shí)，粒子集中的所有粒子就具有了相同的"編碼"。因此，檢測(cè)器將與特定的附接的探針雜交的信號(hào)與粒子集中所有粒子的"編碼，，相關(guān)聯(lián)?？梢允褂密浖?或者甚至人工計(jì)算)，以將兩個(gè)"編碼，，的信號(hào)與特定的探針相關(guān)聯(lián)。在極端情況下，每個(gè)粒子具有唯一的序號(hào)，即，它自己的編碼。只要用特定探針修飾粒子編碼的數(shù)據(jù)庫(kù)軌跡(databasetrack),就可以使用來(lái)自檢測(cè)器的數(shù)據(jù)以將信號(hào)和與探針的雜交相關(guān)聯(lián)。標(biāo)記標(biāo)記樣品?？梢允褂酶鞣N方法標(biāo)記樣品DNA，例如用于分析的基因組DNA。可以使用核苷酸通過(guò)聚合來(lái)引入標(biāo)記，所述核香酸包括至少一些經(jīng)修飾的核苷酸，例如，生物素、地高辛(digoxygenin)、熒光素或青色素々務(wù)飾的核苷酸。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)隨機(jī)引發(fā)和聚合來(lái)引入標(biāo)記。其它實(shí)例包括切口平移(nicktranslation)(RocheAppliedScience,IndianapolisIN;Invitrogen，CarlsbadCA)和化學(xué)標(biāo)記(KreatechULS，AmsterdamNL)。通常，可以《吏用適于標(biāo)記基因組DNA樣品的任何標(biāo)記方法。共享的參比。在很多實(shí)施方案中，方法評(píng)價(jià)已知參比樣品和未知實(shí)驗(yàn)樣品之間的信號(hào)比例。例如，使用兩個(gè)間接標(biāo)記(生物素和焚光素)，以允許兩個(gè)樣品的竟?fàn)庪s交。雜交后，將樣品分成兩個(gè)(或更多的)部分，分別評(píng)價(jià)每個(gè)部分?？梢允褂迷u(píng)價(jià)的結(jié)果以提供兩個(gè)間接標(biāo)記水平的比例。這個(gè)方法具有使用竟?fàn)幮噪s交來(lái)將實(shí)驗(yàn)之間的任何偏差標(biāo)準(zhǔn)化的優(yōu)點(diǎn)將參比和實(shí)驗(yàn)樣品在同樣的容器中同時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，與同樣的粒子混合。平行參比。對(duì)于某些實(shí)施方案，也可能將已知和未知樣品分隔開(kāi)。不使用竟?fàn)幮噪s交。在這種情況下，在一個(gè)容器中對(duì)參比樣品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，而在另一個(gè)容器中對(duì)至少一個(gè)實(shí)驗(yàn)樣品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。例如，容器可以是多孔板的不同孔。如果使用多個(gè)實(shí)驗(yàn)樣品，可在不同容器(例如在多孔板的不同孑L)中評(píng)價(jià)每個(gè)樣品。對(duì)于每個(gè)探針，可以用與竟?fàn)帉?shí)驗(yàn)同樣的方法，獲得實(shí)驗(yàn)樣品信號(hào)與參比樣品信號(hào)之間的比例。在使用這種方法時(shí)，可以在幾個(gè)或很多實(shí)驗(yàn)樣品之間共享單一參比樣品。對(duì)于每天涉及多個(gè)樣品的實(shí)驗(yàn)，通過(guò)避免對(duì)多個(gè)重復(fù)的正常樣品進(jìn)行標(biāo)記，可以節(jié)省試劑成本和勞力。也不需要對(duì)樣品進(jìn)行操作，以獲得用于不同分析的不同部分。每個(gè)樣品可以只評(píng)Y介一次。非共價(jià)附接的標(biāo)記。在另一個(gè)實(shí)施方案中，避免單獨(dú)對(duì)每個(gè)樣品進(jìn)行共價(jià)標(biāo)記。例如，將未標(biāo)記的基因組DNA樣品與固定于編碼的粒子的捕獲探針雜交，其中所述捕獲探針包含BACDNA或如上所述的寡核苷酸混合物。還可以將預(yù)標(biāo)記的報(bào)告序列與探針樣品復(fù)合物在鄰近于捕獲探針序列但不與其重疊的序列雜交。這些標(biāo)記的報(bào)告序列可以在相同或不同的雜交反應(yīng)中來(lái)進(jìn)行雜交。以此方式，可以在大規(guī)模環(huán)境中大量生產(chǎn)標(biāo)記的報(bào)告序列，與進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)分別標(biāo)記每個(gè)樣品相比，可以降低每個(gè)實(shí)驗(yàn)的成本。檢測(cè)可以通過(guò)評(píng)價(jià)來(lái)自一個(gè)或多個(gè)可檢測(cè)標(biāo)記的信號(hào)，對(duì)于每個(gè)粒子，檢測(cè)表示雜交程度的信號(hào)。通常分別評(píng)價(jià)粒子。例如，粒子可以通過(guò)流式細(xì)胞儀。例示性的流式細(xì)胞儀包括可從BeckmanCoulter,Inc.(FullertonCA)得到的CoulterElite-ESP流式細(xì)胞儀或FACScanTM流式細(xì)胞儀，和可從Cytomation,Inc.,FortCollins,Colo.得到的MOFLCFM流式細(xì)胞儀。除了流式細(xì)胞術(shù)，可以使用離心機(jī)作為分離和將微粒分類(lèi)的設(shè)備。在美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,926,387中描述了合適的系統(tǒng)。除了流式細(xì)胞儀和離心，可以使用自由流動(dòng)電泳i殳備，作為分離和將微粒分類(lèi)的設(shè)備。美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,310,408中描述了合適的系統(tǒng)。還可將粒子置于表面上，并掃描或成像。例示性應(yīng)用本文所述的基因組評(píng)價(jià)方法具有各種應(yīng)用，包括診斷學(xué)和法醫(yī)學(xué)。例如，可將它們用于確定成人、生殖細(xì)胞、胎盤(pán)細(xì)胞或胎兒細(xì)胞的基因組內(nèi)容物。細(xì)胞可以來(lái)自任何物種，但通常來(lái)自二倍體物種或具有更多倍數(shù)性(ploidy)的物種。例如，細(xì)胞可以來(lái)自#_物(例如，農(nóng)作物植物)或動(dòng)物(例如，人類(lèi)或馴化的動(dòng)物)。對(duì)于人類(lèi)醫(yī)療用途，可以使用方法評(píng)價(jià)來(lái)自病人的樣本，例如，來(lái)自活組織一企查的樣本、血液樣本、羊水樣本或頰拭子。特別地，病人可以是具有患癌癥風(fēng)險(xiǎn)或患有癌癥的病人。樣本可以是來(lái)自腫瘤附近或來(lái)自腫瘤的組織的樣本。例如，方法可用于評(píng)價(jià)來(lái)自癌或肉瘤，或者來(lái)自肺、乳房、曱狀腺、淋巴、胃腸、生殖-泌尿道的腫瘤、腺癌，例如，惡性結(jié)腸癌、腎細(xì)胞癌、前列腺癌和/或睪丸腫瘤、肺的非小細(xì)胞癌、小腸癌和食道癌的細(xì)胞的基因組內(nèi)容物。已知很多在癌癥中發(fā)生改變的染色體基因座。參見(jiàn)，例如Dutrillaux等CancerGenetCytogenet.49:203-217(1990)，US5,670,314(肺癌)，US5力35,351(神經(jīng)膠質(zhì)瘤)和US6,110,673。方法可用于評(píng)價(jià)血液細(xì)胞的基因組內(nèi)16容物，例如B或T細(xì)胞，或者來(lái)自白血病或淋巴瘤的細(xì)胞。本文所述的方法也可適用于其它核酸，例如，除了基因組DNA之外的DNA、mRNA或其它RNA。通過(guò)下述非限定性實(shí)例進(jìn)一步闡述發(fā)明的一些方面。實(shí)施例實(shí)施例1在這個(gè)例示性的比例計(jì)量實(shí)驗(yàn)中，使用粒子評(píng)價(jià)具有單一標(biāo)記的平行的多個(gè)樣品。例如，將不同的樣品置于單獨(dú)的容器，比如兩個(gè)單獨(dú)的微板孔中。在每個(gè)容器中使用一種或多種對(duì)照試劑(controlreagent)以將兩者之間的結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化。下面描述了使用單一標(biāo)記讀出系統(tǒng)的例示性多結(jié)合實(shí)驗(yàn)。例如，用兩個(gè)樣品I和II進(jìn)行多重多結(jié)合粒子實(shí)驗(yàn)。可以將實(shí)驗(yàn)延伸至其它樣品。用間接標(biāo)記來(lái)標(biāo)記每個(gè)樣品，如用生物素標(biāo)記樣品I,而用二硝基酚(DNP)標(biāo)記樣品II。來(lái)自兩個(gè)樣品的特異性分析物竟?fàn)幣c針對(duì)每個(gè)粒子類(lèi)型的核酸探針結(jié)合。在溫育和洗滌后，將粒子集分到兩個(gè)容器中，與兩種特異性二級(jí)標(biāo)記分別溫育。在第一個(gè)容器中，加入熒光標(biāo)記的抗生蛋白鏈菌素并進(jìn)行溫育，而在第二個(gè)容器中，加入熒光標(biāo)記的抗-DNP并進(jìn)行溫育。對(duì)于LUMINEXxMAPTM系統(tǒng)，優(yōu)選的熒光標(biāo)記是藻紅蛋白。通過(guò)將粒子編碼與藻紅蛋白信號(hào)相關(guān)聯(lián)的單色檢測(cè)系統(tǒng)，順序評(píng)價(jià)結(jié)合有熒光標(biāo)記的產(chǎn)物I和II的每個(gè)經(jīng)溫育的粒子集中的粒子、參照?qǐng)D1,實(shí)驗(yàn)珠1具有固定于其表面上的捕獲分子2。在圖中，就本實(shí)施例而言，將捕獲分子示意性顯示為線性核酸序列，但是捕獲分子可以是特異結(jié)合對(duì)中的任何核酸成員，比如克隆的DNA或寡核芬酸。將實(shí)驗(yàn)珠懸浮于第一液體實(shí)驗(yàn)緩沖液3中。在圖2中，向圖1的珠懸浮液中加入兩個(gè)標(biāo)記樣品。在這個(gè)實(shí)施例中，如在基因表達(dá)或比較基因組雜交實(shí)驗(yàn)中可以發(fā)現(xiàn)的，將樣品示意性地顯示為核酸序列，但本技術(shù)可以用于任何類(lèi)型的特異性結(jié)合實(shí)驗(yàn)。在圖中，用第一間接標(biāo)記B(在本實(shí)施例中為生物素)標(biāo)記來(lái)自第一樣品的分子5，用第二間接標(biāo)記D(在本實(shí)施例中為二硝基酚[DNP])標(biāo)記來(lái)自第二樣品的分子4。在這個(gè)實(shí)施例中，用"D"標(biāo)記的分子4是用"B"標(biāo)記的分子5的兩倍。樣品分子將竟?fàn)幣c它們固定在珠上的結(jié)合對(duì)的互補(bǔ)物結(jié)合。圖3描述了將樣品分子溫育并特異性結(jié)合以捕獲珠上的分子后，圖1中間接標(biāo)記的樣品分子和珠。標(biāo)記的樣品分子4和5竟?fàn)幗Y(jié)合在捕獲分子2上，并在結(jié)合處形成結(jié)合復(fù)合物。每個(gè)珠上的特異性結(jié)合事件的數(shù)目近似地與互補(bǔ)樣品分子的濃度成比例；在本實(shí)施例中，在每個(gè)珠上捕獲的用"D"標(biāo)記的樣品分子4是用"B"標(biāo)記的樣品分子5的兩倍。在圖4中，將具有其捕獲的間接標(biāo)記的分析物7和8的珠復(fù)合物9洗滌并在第二緩沖液12中重懸。洗滌去除任何沒(méi)有與珠特異性結(jié)合的任何樣品分子。還顯示將珠分成兩等份A和B。這通常通過(guò)下述方法完成通過(guò)振蕩將珠懸浮于緩沖液中，然后將約一半體積的珠-緩沖液懸浮液吸取至另一個(gè)容器中，如另一個(gè)微板孔中。珠復(fù)合物9的兩等份具有近似相等的量和濃度。在圖5中，向每等份中加入與樣品分子上的間接標(biāo)記互補(bǔ)的、不同的熒光標(biāo)記分子綴合物10和11。在A部分中，加入與熒光標(biāo)記IO(如藻紅蛋白或青色素或其它熒光團(tuán))綴合的抗生蛋白鏈菌素。選擇熒光標(biāo)記，使其與下游的熒光珠閱讀系統(tǒng)相容。在B部分中，加入與同樣的熒光標(biāo)記11綴合的抗DNP。在本實(shí)施例中使用抗生蛋白鏈菌素和抗DNP，因?yàn)樗鼈兣c例示性的生物素和DNP間接標(biāo)記互補(bǔ)，但是可以使用任何高親和性特異性結(jié)合對(duì)。在圖6中，在溫育圖5所示的混合物后，形成了焚光標(biāo)記的珠綴合物13和14，然后洗滌并將珠復(fù)合物重懸于第三緩沖液15中。每等份包含熒光標(biāo)記的珠復(fù)合物，每等份中珠上的熒光標(biāo)記的量近似與一個(gè)實(shí)驗(yàn)樣品中的分析物濃度成比例。每等份可以單獨(dú)在單標(biāo)記熒光珠閱讀系統(tǒng)，如LUMINEXxMAP系統(tǒng)中讀數(shù)，以產(chǎn)生與每個(gè)珠上的焚光標(biāo)記密度成比例的信號(hào)。圖7是圖1-6中所述實(shí)施例實(shí)驗(yàn)的流程圖。將第一樣品16與第一間接標(biāo)記n(此例中為生物素)一起溫育18,以產(chǎn)生第一間接標(biāo)記的樣品19。分別地，將第二樣品20與第二間接標(biāo)記(DNP)21—起溫育22，以產(chǎn)生第二間接標(biāo)記的樣品23。然后將具有間接標(biāo)記的兩個(gè)樣品19和23與編碼珠集24—起以竟?fàn)幮苑绞綔赜?5，其中珠集可以是，例如，具有固定于每個(gè)珠類(lèi)型(LUMINEX術(shù)語(yǔ)中的珠"區(qū)域")上的不同捕獲分子的編碼LUMINEX珠的集合。在竟?fàn)幮詼赜?5后，洗滌珠，并用洗滌緩沖液34重懸26，將重懸的珠分成兩等份27和28。然后向每個(gè)等份分別加入每個(gè)間接標(biāo)記的焚光標(biāo)記的特異性互補(bǔ)物。在這個(gè)實(shí)施例中，將抗生蛋白鏈菌素-藻紅蛋白29溫育31于第一間接珠等份27，其中抗生蛋白鏈菌素特異性地與珠復(fù)合物上的生物素間接標(biāo)記結(jié)合。分別地，將抗DNP-藻紅蛋白30與第二珠等份28—起溫育32，其中抗DNP特異性結(jié)合于珠復(fù)合物上的DNP間接標(biāo)記。接下來(lái)，繼續(xù)保持兩等份相分離，用洗滌緩沖液35和36洗去31和32過(guò)量的熒光綴合物。最后，在本實(shí)施例中使用LUMINEXxMAP10()tm或xMAP200頂設(shè)備分別讀取33每個(gè)熒光標(biāo)記的珠等份。實(shí)施例2圖8至10描述例示性參比實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。圖8顯示五重(five-plex)BAC-CGH實(shí)驗(yàn)的特異性和靈敏性，所述實(shí)驗(yàn)在LUMINEX平臺(tái)上運(yùn)行，以生物素和熒光素作為間接標(biāo)記。首先，將來(lái)自五個(gè)BAC中每一個(gè)的片段化的DNA通過(guò)下述方法固定在LUMINEX珠的五個(gè)集上起初將羧化的珠表面修飾成氨基表面，然后使用l-乙基-3-[3-二曱氨基丙基]鹽酸碳化二亞胺(ECD或EDAC化學(xué))將BAC片段的5，末端固定于珠上。然后將六個(gè)珠集(每個(gè)集具有不同的LUMINEX珠ID或"區(qū)域，，)匯合成多重珠集。這些步驟詳述如下BAC探針、標(biāo)準(zhǔn)物和樣品。使用細(xì)菌人工染色體(BAC)DNA使捕獲探4十固定于編碼玉朱上。將全部由HealthResearchDivision,RoswellParkCancerInstitute(Buffalo,NY)提供的五種不同的人BAC在下述實(shí)驗(yàn)中用作固定化捕獲探針RP11-289D12(15qll.2);RP11-524F11(17pll.2);RP11-1398P2(4pl6.3);RP11-476-C20(22qll.21);RP5-59D14(17pl3.3)。在括號(hào)中列出了這些BAC的RoswellPark克隆#及染色體基因座。將這些BAC在實(shí)驗(yàn)中用作標(biāo)準(zhǔn)物。使用五種BAC的匯合物產(chǎn)生酶標(biāo)記的陽(yáng)性樣品，所述樣品用生物素標(biāo)記和未標(biāo)記的核苷酸進(jìn)行Klenow隨機(jī)引物標(biāo)記。此外，將Cot-1DNA(Invitrogen15279-011,CarlsbadCA)固定于編碼珠，作為陰性對(duì)照。制備BAC探針并固定于珠上。將BACDNA固定于來(lái)自Luminex(AustinTX)的LUMINEXxMAPtm珠上。xMAPtm珠由表面上以狻基官能化的聚苯乙烯制成。這些珠以順磁和無(wú)磁兩種形式提供。順磁珠促進(jìn)將珠從溶液中分離用于洗滌步驟，但是當(dāng)在過(guò)濾柱或板(例如，HTS0.45(im，目錄MSHVN4510，Millipore,BillericaMA)上進(jìn)行洗滌時(shí)，同樣的規(guī)程對(duì)無(wú)磁珠也起作用。將BAC和對(duì)照探針固定在》茲性LUMINEX珠上的固定-見(jiàn)程如下。通過(guò)與4,9-二氧雜-1，12-十二烷二胺和乙基-3-[3-二曱氨基丙基]鹽酸碳化二亞胺(EDC)反應(yīng)，進(jìn)行羧化物珠的氨基轉(zhuǎn)化(aminoconversion).1.使用硅化的200jil吸液管吸頭，將來(lái)自六個(gè)珠區(qū)域(24、46、47、56、68和79)的LUMINEX標(biāo)準(zhǔn)運(yùn)輸/儲(chǔ)存瓶中的250pl(2.5x106珠)分裝入六個(gè)單獨(dú)的1.5mlEppendorf管中。2.向每管中加入750pl的0.1M2-(N-嗎啉)-乙烷磺酸(MES)0.15MNaClpH6.0。將每管漩渦振蕩并超聲處理。3.通過(guò)將釤-鈷磁盤(pán)磁體接觸瓶的側(cè)面IO分鐘，使每個(gè)管中的磁珠球成粒(pellet)。小心去除900^il液體，同時(shí)避免攪動(dòng)^茲J朱。4.在每管中用MES將總體積調(diào)整至80pl。向每管中添加10jil4,9-二氧雜-l,12-十二烷二胺(在50pl/mlMES)和10plEDC(50mg/ml在MES中)。5.將每管漩渦振蕩并超聲處理以將珠重懸。6.在室溫于試管旋轉(zhuǎn)器上溫育120分鐘。7.向珠中加入900plPBS，旋渦振蕩并超聲處理。8.^使用^t體，用5分鐘將;茲^朱制成粒狀。用移液管移出1000!^r液體，加入1000pl磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)。將每管漩渦振蕩并超聲處理以將珠重懸。9.通過(guò)用-茲體制粒，洗滌每管玉朱3x，取出液體，加入洗滌緩沖液(lxPBS，0.01%BSA,0.01%Tween20)，超聲處理并旋渦振蕩。最后加入緩沖液250pi1xPBS0.01%BSA,用于儲(chǔ)存。將BAC和對(duì)照DNAEDC偶連(EDCcoupling)在珠上1.將六個(gè)珠區(qū)域中每個(gè)0.5x106氨基珠(50)il)等分入1.5mlEppendorf管中，旋渦振蕩并超聲處理。2.向各管中加入5.0filBACDNA或Cot-1DNA(通過(guò)超聲處理片段化)(標(biāo)稱(chēng)濃度50ng4U)，短時(shí)間漩渦振蕩。加入5ji1剛剛?cè)芙獾腅DC(IOmg/ml在dH20中)。立即旋渦振蕩，然后在室溫于暗處溫育30分鐘。重復(fù)加入EDC,漩渦振蕩并溫育30分鐘。加入700|il溶于dH20中的0.2%Tween20，并旋渦振蕩。3.使用磁體將磁珠制成粒狀5分鐘。去除上清液。將珠重懸于900iil溶于dH20的0.05%Tween20中，旋渦振蕩并超聲處理。在100。C加熱5分鐘以使偶連至表面的雙鏈DNA變性。將此步At再重復(fù)一次。制備多重珠混合物1.將具有固定化BAC和Cot-l對(duì)照探針的6管珠中的每管漩渦振蕩并超聲處理。從每個(gè)珠管中吸取等份至新管中，預(yù)計(jì)的珠量為2500珠~1。2.^使用石茲體將多重^M昆合物制成粒狀10分鐘。加入200(J溫的AMBIONSlideHybridizationBuffer#2(Ambion,AustinTX)。等份中使用10(il珠混合物，使每等份中每個(gè)區(qū)域的約2500個(gè)珠足夠進(jìn)行20次雜交。對(duì)于驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，通過(guò)匯集用于制備多重珠的同樣的BACDNA片段來(lái)制許以已知濃度樣品產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線。將八個(gè)濃度中每種的稀釋物(從6.25ng/ml向下兩倍稀釋)用作標(biāo)準(zhǔn)。將這些DNA稀釋物中的每個(gè)分成兩等份，用焚光素或生物素標(biāo)記兩等份中的各一等份以產(chǎn)生間接標(biāo)記的樣品。使用以生物素標(biāo)記的和熒光素標(biāo)記的核苷酸取代標(biāo)準(zhǔn)青色素染料標(biāo)記的核苷酸的標(biāo)準(zhǔn)BioPrimeBAC平面微陣列隨機(jī)引物標(biāo)記試劑盒(Invitrogen,CarlsbadCA)進(jìn)行標(biāo)記。具體如下1.將五種BAC中的每一個(gè)等份匯集到一個(gè)管中，漩渦振蕩。向兩個(gè)微量離心管中各加入2嗎匯集物。用去離子H20將體積調(diào)整至50)il。2.將來(lái)自試劑盒的40(il2.5X隨機(jī)引物混合物加入兩個(gè)標(biāo)記反應(yīng)中的每一個(gè)。漩渦振蕩2秒鐘，離心10秒鐘。3.于10(TC在加熱塊上將DNA變性5分鐘。在冰水中快速冷卻(snap-co01)5分鐘，離心10秒鐘。4.制備生物素主混合物(mastermix)(足夠進(jìn)行六次反應(yīng))16pl光譜標(biāo)記緩沖液(EDTA和tris緩沖液中未標(biāo)記的dNTP核苦酸混合物，SpectralGenomics，HoustonTX)10|il生物素dCTP6,5|ilKlenow(Invitrogen，CarlsbadCA)共32.5(il5.向每管中加入lOiil主混合物，離心10秒鐘，并將每管在37。C溫育2小時(shí)。6.從每個(gè)反應(yīng)中移出3并在瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，以確認(rèn)標(biāo)記產(chǎn)物長(zhǎng)約100bp。7.加入8^溶于dH20中的EDTA,pH8.0，在70。C溫育10分鐘。將標(biāo)記樣品置于水上。8.力口入90SpectralGenomicsHybridizationBuffer1(人Cot-lDNA和剪切鮭魚(yú)睪丸)，加入38.8pi5MNaCl，并漩渦振蕩。加入260(J異丙醇，旋渦振蕩并離心。9.室溫溫育20分鐘。全速離心20分鐘。在需要使用前于4。C儲(chǔ)存。10.在使用之前，將標(biāo)記的BAC加熱至室溫，并離心10分鐘。11.移出上清液，并加入1000pi70%乙醇30%d。另外離心3分鐘，并去除所有液體，保留沉淀(pellet)。12.風(fēng)干10分鐘，或者直至目測(cè)干燥。13.向沉淀加入20(il去離子水，在室溫溫育IO分鐘。標(biāo)記DNA的預(yù)計(jì)濃度2嗎/20i^l(100ng4U)。在步驟4,用熒光素核苷酸取代第二熒光主混合物中的生物素核苷酸，重復(fù)上述步驟。這兩種操作的產(chǎn)物是生物素標(biāo)記的BAC匯集物和焚光素標(biāo)記的BAC匯集物。這些包含與用作探針的相同BAC的標(biāo)記匯集物，其是固定化探針的完美匹配陽(yáng)性雜交互補(bǔ)物?？蓪⑼瑯拥牟襟E用于從細(xì)胞制備的核酸樣品，例如，來(lái)自病人或其它受試者的基因組DNA。然后將八對(duì)間接標(biāo)記的樣品中的每對(duì)與LUMINEX多重珠集雜交，八對(duì)樣品由濃度逐漸增加的焚光素標(biāo)記的樣品與濃度逐漸減少的生物素標(biāo)記的樣品混合組成，根據(jù)圖8中沿圖示的橫軸上的標(biāo)志。如下所詳述，雜交在50。C進(jìn)行兩小時(shí)，然后是三次嚴(yán)緊洗滌(stringencywash),也在50。C進(jìn)行。嚴(yán)緊洗滌緩沖液為，按照順序，2XSSC+50。/。去離子曱酰胺；2XSSC+0.1%Igepal;和0.2XSSC。雜交與檢測(cè)1.在1.5ml微量離心管中制備四個(gè)稀釋系列的標(biāo)記樣品。將相應(yīng)對(duì)的同樣標(biāo)記的稀釋液混合，形成下述8個(gè)樣品<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>AshevilleNC)中千燥減少(drydown)標(biāo)記樣品的體積。加入10pi如上所制備的溫?zé)岬亩嘀刂榛旌衔?。用吸頭混合，并于98。C在塊加熱器(blockheater)上變性2分4中。3.通過(guò)在覆蓋鋁箔的50ml離心管中溫育微管來(lái)進(jìn)行雜交，置于50。C烘箱中的旋轉(zhuǎn)架上2小時(shí)。4.雜交后，向每個(gè)樣品管中加入1ml的0.2XSSC并漩渦振蕩。5.將每管中的物質(zhì)轉(zhuǎn)移至96孔PCR板的兩個(gè)孔中，將每個(gè)雜交的珠集分成一對(duì)500^等份。6.用磁體在板孔中將珠制粒10分鐘，小心去除500ial上清液以避免珠的丟失。7.向每對(duì)孔的一個(gè)中加入100pl的8嗎/mlPJ31S抗生蛋白鏈菌素-藻紅蛋白(Prozyme,SanLeandroCA),并向一對(duì)中的另一個(gè)孔加入100(xl的8嗎/ml抗焚光素-藻紅蛋白(Invitrogen，A-21250)。然后，溫育板，同時(shí)于室溫在NCSTMShakerIncubator(PerkinElmer,BostonMA)上950RPM振蕩30分鐘，然后用1xPBS+0.01%Tween20緩沖液洗滌珠。8.用f茲體將每個(gè)板孔中的珠制粒10分鐘，小心去除100(xl上清液以避免珠的丟失。加入100|ilTris-NaCl-Tween20緩沖液，通過(guò)反復(fù)吸取而混合以將J朱重懸。9.在LUMINEX100TM分析儀上將樣品讀數(shù)，記錄每個(gè)孔中每個(gè)珠區(qū)域的中值熒光強(qiáng)度。如上述步驟(7-9)中所詳述的，在完成了使用間接標(biāo)記進(jìn)行的兩樣品竟?fàn)庪s交實(shí)驗(yàn)后，重新劃分多重實(shí)驗(yàn)珠集。將一個(gè)等份用4嗎/ml抗-熒光素-藻紅蛋白進(jìn)行第二標(biāo)記，而另一等份用4)ag/ml抗生蛋白鏈菌素-藻紅蛋白進(jìn)行第二標(biāo)記。然后將這些第二標(biāo)記的珠集中的每個(gè)在LUMINEXxMAP200系統(tǒng)上分別讀數(shù)。結(jié)果示于圖8中。將來(lái)自每個(gè)BAC的信號(hào)顯示為單獨(dú)的數(shù)據(jù)追蹤(datatrack),單獨(dú)顯示熒光素標(biāo)記的樣品與生物素標(biāo)記的樣品。每一個(gè)顯示在約160:1的濃度范圍內(nèi)濃度對(duì)信號(hào)的線性響應(yīng)?？雌饋?lái)最大的熒光素標(biāo)記信號(hào)沒(méi)有干擾最低的生物素標(biāo)記信號(hào)，反之亦然。而且，來(lái)自其上固定有COT-1的珠的信號(hào)比特異性結(jié)合事件的最低信號(hào)還要低。這樣的信號(hào)在所有條件下都小于全標(biāo)度(flillscale)的2%。這證明，在這些濃度范圍中，兩種間接標(biāo)記沒(méi)有顯示實(shí)質(zhì)的(substantial)干擾或者交叉反應(yīng)性。圖9顯示用不同的方式格式化的來(lái)自圖8的數(shù)據(jù)。這是"一樣-一樣(same-same)"散點(diǎn)圖，其為差異基因表達(dá)微陣列分析中常用的類(lèi)型。兩個(gè)軸的標(biāo)度是生物素和熒光素標(biāo)記的BAC樣品的標(biāo)準(zhǔn)化濃度。在理想或完美的實(shí)驗(yàn)中，每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)都將在對(duì)角線上每個(gè)竟?fàn)帉?shí)驗(yàn)的間接標(biāo)記樣品的信號(hào)都是一樣的，因?yàn)闈舛仁且粯拥摹?shí)際的數(shù)據(jù)在接近對(duì)角線處聚集，與理想實(shí)驗(yàn)的偏差不超過(guò)1.5倍，通常偏差會(huì)更小。標(biāo)準(zhǔn)CGH(或基因表達(dá))實(shí)驗(yàn)通常使用2:1差異信號(hào)作為指示生物顯著性的閾值。實(shí)施例3圖IO表示5重CGH實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，該實(shí)驗(yàn)使用與上述相同的多重珠集，針對(duì)間接標(biāo)記的基因組DNA樣品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將基因組DNA樣品(人基因組DNA:男性；PromegaCorporation,MadisonWI)分成兩等份。一份用熒光素間接標(biāo)記，而另一份用生物素間接標(biāo)記，實(shí)驗(yàn)使用前面才是及的BioPrimeTM試劑盒以產(chǎn)生兩種間接標(biāo)記樣品。然后將兩種間接標(biāo)記樣品混合，一起針對(duì)多重珠集進(jìn)行竟?fàn)幮詫?shí)驗(yàn)。在使用間接標(biāo)記進(jìn)行竟?fàn)帉?shí)驗(yàn)后，將珠集分開(kāi)，一等份用抗-熒光素-藻紅蛋白進(jìn)行第二標(biāo)記，而另一等份用抗生蛋白鏈菌素-藻紅蛋白進(jìn)行第二標(biāo)記。然后將這些第二標(biāo)記的珠集中的每個(gè)在LUMINEXxMAP200TM系統(tǒng)上讀數(shù)。將得到的數(shù)據(jù)，再次格式化為圖10中的"一樣-一樣"散點(diǎn)圖。如圖9中所示的特別構(gòu)建的稀釋系列，基因組DNA分組樣品的數(shù)據(jù)接近地符合圖上的對(duì)角線。實(shí)施例4在闡述本發(fā)明另一方面的例示性實(shí)驗(yàn)中，將合成的70-mer胺-修飾的寡核苦酸探針(OperonBiotechnologies,HuntsvilleAL)固定于Luminex多重珠并進(jìn)行單色實(shí)驗(yàn)，其中參比和測(cè)試樣品不在同一個(gè)孔中。這個(gè)實(shí)驗(yàn)使用17個(gè)不同的探針，其中四個(gè)是代表X和Y染色體上基因座的五個(gè)寡核苷酸的匯集的或組合的集合，如下表詳述。用這個(gè)多重探針集進(jìn)行區(qū)分男性和女性DNA的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>將胺修飾的寡核苷酸探針與編碼LuminexxMap微球或珠偶連以制備多重寡聚物珠(oligobead)混合物的規(guī)程如下。1.將-20。C的新鮮等份，干燥的(desiccated)EDC(l-乙基-3[3-二曱基氨基丙基]鹽酸碳化二亞胺鹽)粉末(PierceBiotechnology,RockfordIL)升至室溫。2.將70merC-6胺-修飾的寡核香酸在dH20中重懸至100joM(100皮摩爾/pL)。3.通過(guò)輕微振蕩和超聲處理約20秒將保存的xMAP微球重懸。4.將保存的微球中的1,250,000個(gè)珠(IOO^L)轉(zhuǎn)移至1.5mlSeal-Rite微量離心管(USAScientific,OcalaFL)中。5.通過(guò)在^8000xg微離心3-5分鐘(足夠固體粒形成的時(shí)間)，將保存的微球制粒。6.去除上清液，并通過(guò)超聲處理約20秒(時(shí)間足夠使管中見(jiàn)不到?；驈浬?，將制粒的微球重懸于500.1MMES緩沖液,pH4.5中。7.將100nM胺寡核苷酸1:4(1^L加入3jiLdH20中)稀釋至終濃度為25|iM(25皮摩爾VL)。8.加入1.0(iL捕獲寡聚物(25皮摩爾)，并通過(guò)超聲處理約20秒來(lái)混合。9.制備溶于dH20中的10mg/mLEDC的新鮮溶液(注意將EDC粉末返回干燥以再用于第二次EDC加入)。10.對(duì)于每個(gè)反應(yīng)，逐個(gè)向孩"求加入2.5新鮮的10mg/mLEDC(25嗎或-終)，并通過(guò)超聲處理約20秒來(lái)混合。11.于暗處在室溫溫育30分鐘，在15分標(biāo)記(mark)超聲處理(以減少微球的沉積)。12.在(020中制備第二份新鮮的10mg/mlEDC溶液(注意現(xiàn)在應(yīng)該棄去EDC粉末的等分。我們推薦使用新鮮的EDC粉末的等分進(jìn)行每個(gè)偶連事件)。13.對(duì)于每個(gè)反應(yīng)，逐個(gè)向微球中加入2.5|止的新鮮10mg/mLEDC，并通過(guò)超聲處理約20秒來(lái)混合。14.于暗處在室溫溫育30分鐘，在15分標(biāo)記超聲處理。15.向偶連的微球中加入1.0mL的0.02%Tween-20，通過(guò)旋渦振蕩和超聲處理來(lái)混合。16.通過(guò)^8000xg微離心3-5分鐘將偶連的孩b求制粒。17.去除上清液，并通過(guò)旋渦振蕩和超聲處理將偶連的微球重懸于1.0mL的0.1%SDS緩沖液中。18.通過(guò)^8000xg微離心6-10分鐘將偶連的微球制粒。19.去除上清液，并通過(guò)漩渦振蕩和超聲處理約20秒鐘將偶連的微球重懸于100(iL的10mMTris，1mMEDTA,pH8.0中。假設(shè)回收率為100%，得到的寡聚物-偶連的珠濃度為12,500微球4iL。將標(biāo)準(zhǔn)的正常基因組DNA用作本實(shí)驗(yàn)的測(cè)試樣品，所述DNA由多個(gè)同性別的名義上正常的個(gè)體匯集(Promega,MadisonWI)。使用男性DNA作為測(cè)試樣品，女性DNA作為參比樣品。用InvitrogenBioPrime試劑盒和SpectralGenomics試劑標(biāo)記2嗎每種樣品，如上面實(shí)施例4中所述，只是用生物素核苷酸取代試劑盒中的青色素核苷酸以獲得生物素標(biāo)記的樣品。在LuminexxMAP珠上進(jìn)行多重驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，樣品均為一式兩份，根據(jù)下述規(guī)程使用96孔微板中的四個(gè)孔進(jìn)行。1.對(duì)于每個(gè)樣品，向Matrix(HudsonNH)聚丙烯96孔V形底聚丙烯微板的孔中加入1.0嗎生物素標(biāo)記的人基因組DNA。2.向V形底板的每個(gè)孔中加入10.0嗎的CotlDNA和10.0嗎的鮭精(Invitrogen,CarlsbadCA)以進(jìn)行雜交。包括沒(méi)有生物素DNA的陰性對(duì)照孔，但是包含核酸阻斷劑(Cot1DNA和鮭魚(yú)精子)。這將用來(lái)確定^朱空白。3.在SpeedVac中將板干燥30-120分鐘，或直至孔的底部澄清。4.處理溫?zé)岬腟pectralGenomicsHybII緩沖液以溶解沉淀，并通過(guò)向1.5mL管中的％去離子蒸餾&0中加入％的緩沖液來(lái)稀釋。5.向稀釋的SpectralGenomicsHybII緩沖液中加入適當(dāng)量的多重寡聚物珠混合物，使得結(jié)果為每孔300的每種珠編碼(足夠7.5(iL/孔)。通過(guò)上下吸取來(lái)混合。6.使雜交緩沖液中的7.5多重寡聚物珠混合物在V形底板的每個(gè)孔中分布以進(jìn)行雜交。通過(guò)上下吸取來(lái)混合。7.用Matrix單條板蓋蓋住孔，并用Bio-Rad(HerculesCA)板蓋將板密封。8.在96孔熱循環(huán)儀中，于10(TC將板中的樣品變性2分鐘，然后冷卻至50°C2分鐘，蓋未加熱(withnoheatedlid)。9.將板放在PerkinElmerNCS微板溫育器中，在50。C和1150rpm搖動(dòng)下溫育過(guò)夜。10.雜交后，向每個(gè)反應(yīng)中加入100的2XSSC，50。/。曱酰胺(SpectmlGenomicsStringencyWash,4吏用前力口熱至50°C)，并在PerkinElmerNCS板溫育器中，在50。C和1150rpm搖動(dòng)下將板溫育20分鐘。11.用30fiL的0.2XSSC浸潤(rùn)Millipore0.45pmHT過(guò)濾板中的所有孔，用于均勻的真空過(guò)濾。12.將MatrixV形底板中的體積轉(zhuǎn)移至Millipore過(guò)濾板中進(jìn)行洗滌。13.使用Millipore真空歧管(manifold)輕微施加真空以去除液體，并用紙巾將過(guò)濾板的底部拍干(patdry)。14.向每個(gè)反應(yīng)中加入100pL的2XSSC，0.1%Igepal(SpectralGenomicsStringencyWash,使用前加熱至50。C)，用鋁箔蓋住頂部(松散地)，并在PerkinElmerNCS微板溫育器中，在50。C和1150rpm搖動(dòng)下將板溫育20分鐘。15.使用Millipore真空歧管輕微施加真空以去除液體，并用紙巾將過(guò)濾板的底部拍干。16.向每個(gè)反應(yīng)中加入100的2XSSC(SpectralGenomicsStringencyWash,使用前加熱至50°C),用鋁箔蓋住頂部(松散地)，并在PerkinElmerNCS微板溫育器中，在50。C和1150rpm搖動(dòng)下將板溫育10分鐘。17.使用Millipore真空歧管輕微施加真空以去除液體，并用紙巾將過(guò)濾板的底部拍干。18.向每個(gè)反應(yīng)中加入100的IXPBS、0.1%BSA、0.05%Tween及4,0pg/mL的PhycoLinkStreptavidin-R-PE(ProzymeLotPJ13S)，用鋁箔蓋住頂部(松散地)，并在PerkinElmerNCS混合器中，在25°C和1050rpm搖動(dòng)下將板溫育30分鐘。19.使用Millipore真空歧管輕微施加真空以去除液體，并用紙巾將過(guò)濾板的底部拍干。20.向每個(gè)反應(yīng)中加入100pL的IXPBS、0.01%Tween20，并對(duì)過(guò)濾板施加真空，拍干。21.向每個(gè)反應(yīng)中加入100^L的1XPBS、0.01%Tween20。在PerkinElmerNCS微板溫育器中，在1050rpm將過(guò)濾板振蕩至少1分鐘。22.使用Luminex200設(shè)備讀取樣品，使用每個(gè)珠區(qū)域的中值焚光信號(hào)，最小珠計(jì)數(shù)設(shè)定為50。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的結(jié)果示于圖12中，其中女性樣品信號(hào)與男性樣品信號(hào)的比例在縱軸，寡核苷酸探針同一性在橫軸。取每個(gè)樣品的一式兩份的信號(hào)的平均值。X和Y性別特異性染色體探針產(chǎn)生的信號(hào)比例在一致線(unityline)以上或以下超出1.2，同時(shí)所有非性別特異性探針產(chǎn)生的信號(hào)比例在一致線之上和之下小于1.2。實(shí)施例5通常使用雙熒光團(tuán)實(shí)驗(yàn)，在印制的微陣列上進(jìn)行多重差異基因表達(dá)。在這類(lèi)實(shí)驗(yàn)中，兩個(gè)RNA樣品即參比樣品和待測(cè)樣品，在標(biāo)記核苷酸存在的情況下，通過(guò)反轉(zhuǎn)錄酶酶法轉(zhuǎn)化成cDNA。因此cDNA產(chǎn)物有一部分核芬酸用焚光標(biāo)記，由此可對(duì)它們進(jìn)行光學(xué)檢測(cè)。每個(gè)樣品分別用兩種不同的萸光團(tuán)標(biāo)記，通常為青色素3和青色素5，將標(biāo)記的樣品匯集并竟?fàn)幮缘仉s交至微陣列。在熒光掃描設(shè)備上檢測(cè)，微陣列上每個(gè)元素上兩種染料的比例表示每個(gè)實(shí)驗(yàn)RNA序列在相應(yīng)樣品中的相對(duì)濃度。在順磁LuminexxMAPtm珠上，根據(jù)本技術(shù)的一個(gè)方面，用單焚光團(tuán)讀出器(readout)進(jìn)行這類(lèi)實(shí)驗(yàn)。從Operon(HuntsvilleAL)獲得代表38個(gè)基因的寡核苷酸("寡聚物")探針。這些寡聚物探針長(zhǎng)70-mer,在5'末端具有胺基。將每個(gè)寡聚物序列固定于xMAP珠集上，其具有特定的xMAP珠ID編碼或區(qū)域，使用常用的EDAC偶連化學(xué)。代表的38個(gè)基因是NRP2、CARD14、IGFALS、TSSC3、PSEN2、IGFBP4、TP53BP2、GAPD、PRODH、TNFRSF7、RAB6KIFL、ILF1、BCL2L2、DNASE1L3、PPP1R15A、PIG11、HSPD1、CDH1、IGFBP5、IRF1、TNFRSF10C、TNFRSF17、LTA、DFFB、IL16、PTPN13、IL3、TNFSF18、CCNG1、CCND1、TUCAN、RIPK3、CASP6、IL2、TNFAIP2、IL24、K-ALPHA-1和TRIP,并帶有陰性對(duì)照。然后將39種珠類(lèi)型匯集到一個(gè)多重珠集中，并將來(lái)自此集合的等份放于96孔微板的孔中，如下所述進(jìn)行基因表達(dá)實(shí)驗(yàn)。為了驗(yàn)證本技術(shù)，使用單一的參考RNA樣品(UniversalHumanReferenceRNA，Stratagene，LaJollaCA)。將單一樣品分成兩份，因此每個(gè)基因的差異實(shí)驗(yàn)的期望結(jié)果為1:1的比例。這通常在基因表達(dá)平臺(tái)上進(jìn)行評(píng)價(jià)。根據(jù)本技術(shù)的一個(gè)方面，作為間接標(biāo)記用生物素標(biāo)記RNA的一個(gè)等份，用熒光素標(biāo)記另一等份。然后匯集這兩個(gè)間接標(biāo)記的樣品，與先前制備的多重珠集混合，并允許同時(shí)進(jìn)行雜交。雜交后，將實(shí)驗(yàn)珠集分成兩等份。將抗生蛋白鏈菌素-藻紅蛋白報(bào)告試劑(對(duì)生物素標(biāo)記的樣品具有特異性)加入一個(gè)等份中并與該等份一起溫育，將抗-熒光素-藻紅蛋白(對(duì)熒光素標(biāo)記的樣品具有特異性)加入另一等份中并與該等份一起溫育。在XMAPTM設(shè)備中，藻紅蛋白是優(yōu)選的報(bào)告熒光團(tuán)。然后將順^^朱等分通過(guò)板;茲體推至孩M反孔壁，通過(guò)吸液管取出液體試劑，并將標(biāo)記的珠重懸于洗滌緩沖液中。然后在LuminexxMAP200頂設(shè)備上對(duì)兩等份珠按順序讀數(shù)。將得到的信號(hào)數(shù)據(jù)繪制在散點(diǎn)圖上，如圖11中所示。如果所有數(shù)據(jù)都處于同一線(identiyline)的位置，則對(duì)應(yīng)于1:1的比例且相關(guān)值112為1.0。在這個(gè)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中，相關(guān)因子是0.96。這個(gè)值是對(duì)使用2-染料檢測(cè)的通常印制微陣列產(chǎn)生的值的改進(jìn)，其通常產(chǎn)生0.92-0.96的112值。其它實(shí)施方案在權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。權(quán)利要求1.評(píng)價(jià)基因組DNA的方法，所述方法包括:提供基因組DNA樣品；提供粒子混合物，所述混合物包含來(lái)自不同粒子集的粒子，其中每個(gè)粒子集包含大量編碼的粒子和用于特定基因組基因座的核酸雜交探針，使得所述混合物共同地包括用于大量不同基因組基因座的探針；在雜交條件下將樣品與一部分粒子混合物接觸；和在混合物的各個(gè)部分中，通過(guò)監(jiān)測(cè)可測(cè)定的標(biāo)記來(lái)評(píng)價(jià)樣品與粒子的雜交，其中監(jiān)測(cè)信號(hào)表示每個(gè)需要測(cè)定的基因組基因座的拷貝數(shù)。2.權(quán)利要求1的方法，其中使用單一的可檢測(cè)標(biāo)記。3.權(quán)利要求1的方法，其中提供多于一個(gè)DNA樣品，并根據(jù)所述方法評(píng)價(jià)每個(gè)DNA樣品。4.權(quán)利要求l的方法，其中粒子集中所有編碼的粒子具有同樣的密碼。5.權(quán)利要求l的方法，其中可通過(guò)光譜檢測(cè)所述可檢測(cè)標(biāo)記。6.權(quán)利要求5的方法，其中所述可檢測(cè)標(biāo)記包含藻紅蛋白。7.權(quán)利要求1的方法，其中所述核酸雜交探針包含克隆的核酸。8.權(quán)利要求7的方法，其中所述核酸雜交探針包含BAC核酸。9.權(quán)利要求7的方法，其中所述BAC核酸包括人基因組DNA的片段。10.權(quán)利要求7的方法，其中所述BAC核酸包括非人基因組DNA的片段。11.權(quán)利要求1的方法，其中所述核酸雜交探針包含對(duì)特定的染色體基因座具有特異性的寡核苷酸集合。12.權(quán)利要求1的方法，其中使用至少20個(gè)不同的粒子集來(lái)評(píng)價(jià)至少20個(gè)不同的基因組基因座。13.權(quán)利要求3的方法，其中大量樣品中至少一個(gè)樣品是參比樣品，每個(gè)需要測(cè)定的基因組基因座的拷貝數(shù)已知，而且所述方法包括將參比樣品的監(jiān)測(cè)信號(hào)與其它樣品的信號(hào)進(jìn)行比較，以確定樣品中每個(gè)需要測(cè)定的基因組基因座的拷貝數(shù)。14.權(quán)利要求3的方法，其中每個(gè)樣品用第一間接標(biāo)記做標(biāo)記，而且每個(gè)樣品與用第二間接標(biāo)記做標(biāo)記的參比DNA組合。15.權(quán)利要求14的方法，其中參比DNA是來(lái)自參比來(lái)源的基因組DNA，其每個(gè)需要測(cè)定的基因組基因座的拷貝數(shù)已知。16.權(quán)利要求14的方法，其中第一間接標(biāo)記是熒光素，而第二間接標(biāo)記是生物素。17.權(quán)利要求1的方法，其中所述評(píng)價(jià)包含(i)將包含單一標(biāo)記和與第一間接標(biāo)記結(jié)合的物質(zhì)的第一組成部分與樣品的第一部分結(jié)合，和(ii)將包含單一標(biāo)記和與第二間接標(biāo)記結(jié)合的物質(zhì)的第二組成部分與樣品的第二部分結(jié)合。18.權(quán)利要求17的方法，其中所述第一組成部分包含抗生蛋白鏈菌素和藻紅蛋白，而所述第二組成部分包含抗熒光素和藻紅蛋白。19.權(quán)利要求l的方法，其中每個(gè)樣品是多腔室設(shè)備中不同的腔室。20.權(quán)利要求19的方法，其中每個(gè)樣品是多孔板中不同的孔。21.權(quán)利要求1的方法，其中對(duì)于每個(gè)基因組樣品，評(píng)價(jià)了來(lái)自每個(gè)不同粒子集的至少100個(gè)粒子。22.權(quán)利要求1的方法，其中在多個(gè)不同染色體基因座的雜合性是可檢測(cè)的。23.權(quán)利要求1的方法，其中染色體擴(kuò)增是可檢測(cè)的。24.權(quán)利要求l的方法，其中染色體的雜合缺失是可檢測(cè)的。25.權(quán)利要求l的方法，其中染色體的純合缺失是可檢測(cè)的。26.權(quán)利要求1的方法，其中，在雜交條件下接觸后，所述粒子不與聚合酶接觸。27.權(quán)利要求1的方法，其中，在雜交條件下接觸后，所述粒子不與酶接觸。28.權(quán)利要求l的方法，其中基因組DNA是未標(biāo)記的，且所述方法還包括將標(biāo)記的探針雜交至基因組樣品，其中，對(duì)于附接于粒子的每個(gè)核酸雜交探針，標(biāo)記的探針在同樣的基因組基因座雜交至基因連接的位點(diǎn)，使得如果所述樣品中存在該基因組基因座，則通過(guò)由標(biāo)記的探針與樣品核酸鏈雜交，以及樣品核酸鏈與附接于粒子的核酸雜交探針雜交所形成的復(fù)合物，將標(biāo)記的探針固定于粒子。29.權(quán)利要求28的方法，其中在將基因組DNA樣品雜交至附接于粒子的核酸探針的同時(shí)，將標(biāo)記的探針雜交。30.權(quán)利要求28的方法，其中在將基因組DNA樣品雜交至附接于粒子的核酸探針之后，將標(biāo)記的探針雜交。31.權(quán)利要求1的方法，其還包含來(lái)自具有間接標(biāo)記的來(lái)源的標(biāo)記基因組DNA，.以提供基因組DNA樣品。32.權(quán)利要求2的方法，其還包含來(lái)自具有單一標(biāo)記的來(lái)源的標(biāo)記基因組DNA，以提供基因組DNA樣品。33.權(quán)利要求2的方法，其中用單一標(biāo)記來(lái)標(biāo)記所有基因組DNA樣品。34.權(quán)利要求1的方法，其中用同樣的間接標(biāo)記來(lái)標(biāo)記具有未知基因組內(nèi)容物的所有基因組DNA樣品。35.權(quán)利要求1的方法，其中用同樣的間接標(biāo)記來(lái)標(biāo)記大部分基因組DNA樣品。36.權(quán)利要求1的方法，其包括在評(píng)價(jià)雜交之前攪拌所述粒子。37.權(quán)利要求2的方法，其中所述粒子用熒光染料全息編碼或編碼，所述熒光染料具有與單一檢測(cè)標(biāo)記可分離的光i普。38.權(quán)利要求1的方法，其中粒子是順;茲珠。39.使用單一可檢測(cè)組成部分評(píng)價(jià)基因組DNA的方法，所述方法包括提供至少一個(gè)參比DNA樣品和多個(gè)基因組DNA樣品，其中每個(gè)樣品用同樣的可4全測(cè)組成部分標(biāo)記；提供粒子混合物，所述混合物包含來(lái)自不同粒子集的粒子，其中每個(gè)粒子集包含大量編碼的粒子和用于特定基因組基因座的核酸雜交探針，使得所述混合物共同地包括用于多個(gè)不同基因組基因座的探針；在雜交條件下，將每個(gè)樣品與一部分粒子混合物接觸，其中在單獨(dú)的容器中將每個(gè)樣品與粒子混合物接觸；和通過(guò)監(jiān)測(cè)可檢測(cè)的組成部分來(lái)評(píng)價(jià)每個(gè)樣品與混合物的各個(gè)部分中粒子的雜交，其中監(jiān)測(cè)信號(hào)表示每個(gè)需要測(cè)定的基因組基因座的拷貝數(shù)。40.使用單一的可^r測(cè)標(biāo)記評(píng)價(jià)核酸的方法，所述方法包括提供用第一間接標(biāo)記來(lái)標(biāo)記的至少一個(gè)參比核酸樣品，和多個(gè)測(cè)試核酸樣品，其中每個(gè)測(cè)試樣品用第二間接標(biāo)記來(lái)標(biāo)記；'提供粒子混合物，所述混合物包含來(lái)自不同粒子集的粒子，其中每個(gè)粒子集包含大量編碼的粒子和用于特定靶物的核酸雜交探針，使得所述混合物共同地包括用于多個(gè)不同靶物的探針；在雜交條件下，將每個(gè)測(cè)試樣品和參比樣品與一部分粒子混合物接觸，其中每個(gè)測(cè)試樣品和參比樣品在單獨(dú)的容器中與粒子混合物接觸；將包含單一標(biāo)記和與第一間接標(biāo)記結(jié)合的物質(zhì)的第一組成部分與每個(gè)測(cè)試樣品的第一部分結(jié)合；將包含單一標(biāo)記和與第二間接標(biāo)記結(jié)合的物質(zhì)的第二組成部分與每個(gè)測(cè)試樣品的第二部分結(jié)合；通過(guò)監(jiān)測(cè)樣品第一部分中的單一標(biāo)記，并通過(guò)監(jiān)測(cè)樣品第二部分中的單一標(biāo)記，來(lái)評(píng)價(jià)每個(gè)測(cè)試樣品，其中監(jiān)測(cè)信號(hào)表示每個(gè)靶物的拷貝數(shù)；和對(duì)于每個(gè)測(cè)試樣品，比較第一部分中單一標(biāo)記的信號(hào)和第二部分中單一標(biāo)記的信號(hào)，以獲得測(cè)試樣品中探針拷貝數(shù)相對(duì)于參比樣品的指示。41.粒子混合物，所述混合物包含來(lái)自不同粒子集的粒子，其中每個(gè)粒子集包含大量編碼的粒子和用于特定基因組基因座的核酸雜交探針，使得所述混合物共同地包括用于多個(gè)不同基因組基因座的探針。42.權(quán)利要求41的粒子混合物，其中用于至少一些基因座的探針包含細(xì)菌人工染色體DNA。43.權(quán)利要求41的粒子混合物，其中用于至少一些基因座的探針包含超聲處理的細(xì)菌人工染色體DNA。44.權(quán)利要求41的粒子混合物，其中用于至少一些基因座的探針包含合成寡核苦酸的集合。45.權(quán)利要求41的粒子混合物，其還包含來(lái)自至少兩個(gè)樣品的雜交DNA,其中每個(gè)樣品包含基因組DNA,而且每個(gè)樣品用不同的間4妄標(biāo)記來(lái)標(biāo)記。46.權(quán)利要求41的粒子混合物，其還包含來(lái)自單一樣品的雜交DNA，所述單一樣品用可檢測(cè)標(biāo)記來(lái)標(biāo)記。47.具有多個(gè)孔的多孔板，至少多個(gè)孔中的每個(gè)都包含根據(jù)權(quán)利要求41的粒子混合物；和樣品或參比基因組DNA,其中所述樣品和參比DNA在不同的容器中，并且可用同樣的標(biāo)記^r測(cè)。48.試劑盒，其包含用第一間接標(biāo)記來(lái)標(biāo)記的參比基因組DNA樣品；用第二間接標(biāo)記來(lái)標(biāo)記基因組DNA樣品的試劑；包含單一標(biāo)記和與第一間接標(biāo)記結(jié)合的物質(zhì)的第一組成部分；包含單一標(biāo)記和與第二間接標(biāo)記結(jié)合的物質(zhì)的第二組成部分；和根據(jù)權(quán)利要求41的粒子混合物。全文摘要本文公開(kāi)的內(nèi)容涉及評(píng)價(jià)基因組DNA的方法，所述方法包括a)提供基因組DNA樣品；b)提供粒子混合物，所述混合物包含來(lái)自不同粒子集的粒子，其中每個(gè)粒子集包含大量編碼的粒子和用于特定基因組基因座的核酸雜交探針，使得混合物共同地包括用于大量不同基因組基因座的探針；c)在雜交條件下將樣品與一部分粒子混合物接觸；和d)在混合物的各個(gè)部分中，通過(guò)監(jiān)測(cè)可測(cè)定的標(biāo)記評(píng)價(jià)樣品與粒子的雜交，其中監(jiān)測(cè)信號(hào)表示每個(gè)需要測(cè)定的基因組基因座的拷貝數(shù)。本發(fā)明還涉及粒子混合物，其包含來(lái)自其不同粒子集的粒子。文檔編號(hào)C12M3/00GK101384732SQ200680053334公開(kāi)日2009年3月11日申請(qǐng)日期2006年12月22日優(yōu)先權(quán)日2005年12月23日發(fā)明者小卡爾·E·阿德勒,馬克·N·博布羅,麥克·J·舍默申請(qǐng)人:珀金埃爾默Las公司