專利名稱：：新的微生物及使用該新的微生物制造十二氫-3a,6,6,9a-四甲基萘并[2,1-b]呋喃中間體...的制作方法新的微生物及使用該新的微生物制造十二氫-3a，6，6，9a-四甲基萘并呋喃中間體。進一步，本發(fā)明涉及使用該新的微生物制造十二氫-3a,6,6，9a-四甲基萘并[2,l-b]呋喃中間體的方法。
背景技術(shù)：
：十二氫-3a，6，6,9a-四甲基萘并[2,l-b]呋喃(有時稱作"Ambroxan(商標)")是一種具有令人滿意地持久的特性的芳香化合物，該化合物主要從提取自硬膜鼠尾草(&z/v/a"/w^)的香紫蘇醇經(jīng)由化學(xué)轉(zhuǎn)化制造。圖1顯示了從香紫蘇醇制造十二氫-3a，6，6，9a-四甲基萘并[2,l-b]呋喃的方法。如圖1所示，已知十氫-2-羥基-2,5，5,8a-四甲基萘乙醇和香紫蘇內(nèi)酯(sclareolide)(十二氫-3a,6，6,9a-四甲基萘并[2,l-b]呋喃-2(lH)-酮)是十二氫-3a,6,6，9a-四甲基萘并[2,l-b]呋喃中間體。另外，盡管圖1中沒有顯示，已知環(huán)醚化合物(8ci,13-環(huán)氧-12,13-脫氫-15，16-二去甲半日花烷(dinorlabdane))也是十二氫-3a,6,6,9a-四甲基萘并[2，l-b]呋喃中間體。通過微生物將香紫蘇醇轉(zhuǎn)化成十二氫-3a，6,6，9a-四甲基萘并[2,l-b]呋喃中間體描述于，例如，日本專利第2547713號、日本專利第2802588號、日本專利第3002654號和日本專利第2063550號。日本專利第2547713號描述了通過7/j;//zo2ymara^om'gerATCC20624制造十氫-2-羥基-2,5，5，8a-四甲基萘乙醇。日本專利第2802588號描述了通過羅倫隱球酵母((3^tococcw/aww"W)ATCC20920制造十二氫-3a,6，6,9a-四甲基萘并[2，l-b]呋喃中間體。日本專利第3002654號描述了通過5eww>2gtow/ac/〃/atoATCC20919制造十二氫-3a，6,6,9a-四甲基萘并[2,l-b]呋喃中間體。日本專利第2063550號描述了通過淺白隱球酵母(Coptococcwa仿Ww)ATCC20918和淺白隱球酵母ATCC20921制造十二氫-3a，6，6,9a-四甲基萘并[2,l-b]呋喃中間體。因此，如日本專利第2547713號、日本專利第2802588號、日本專利第3002654號和日本專利第2063550號中所公開，已知僅擔(dān)子菌綱(SayWomyceteO或Fy;/w2yma微生物是具有使用香紫蘇醇作為底物產(chǎn)生十二氫-3a,6，6，9a-四甲基萘并[2,l-b]呋喃中間體的能力的微生物。
發(fā)明內(nèi)容在上述情形下，本發(fā)明意在提供一種新的微生物，該微生物可以有效地使用香紫蘇醇作為底物產(chǎn)生十二氫-3a，6,6，9a-四甲基萘并[2,l-b]呋喃中間體。而且，本發(fā)明意在提供一種使用該微生物制造十二氫-3&,6,6,9&-四甲基萘并[2,1七]呋喃中間體的方法。為了解決上述問題，為了分離并鑒別出具有所關(guān)注特性的微生物，本發(fā)明者對作為微生物源的土壤樣品進行了集中研究，上述樣品獲自日本櫪木縣芳賀郡和日本櫪木縣宇都宮市。結(jié)果，他們成功地分離并鑒別出三種新的微生物菌株，該微生物沒有作為傳統(tǒng)微生物而被分類并具備所關(guān)注特性?；谶@些發(fā)現(xiàn)完成了本發(fā)明，以實現(xiàn)可以使用香紫蘇醇作為底物制造十二氫-3a，6,6,9a-四甲基萘并[2,l-b]呋喃中間體的效果，該同樣的效果可以由上述新的微生物來實現(xiàn)。根據(jù)本發(fā)明的新的微生物屬于子囊菌綱"scomyc"^)，并且具有能夠使用香紫蘇醇作為底物產(chǎn)生十二氫-3a,6,6,9a-四甲基萘并[2，l-b]呋喃中間體的能力。具有這種能力的子囊菌綱微生物代表了新的發(fā)現(xiàn)，這些微生物可以用于制造十二氫-3a,6，6,9a-四甲基萘并[2,l-b]呋喃及其中間體。關(guān)于由本發(fā)明者分離并鑒別的新的微生物，編碼28SrRNA的基因的核苷酸序列(下文中稱作"28SrDNA")被鑒別。這些核苷酸序列如SEQIDNO:1-3所顯示。關(guān)于新的微生物，編碼18SrRNA的基因的核苷酸序列(下文中稱作"18SrDNA")被鑒別。這些核苷酸序列如SEQIDNO:4-6所顯示。而且，發(fā)現(xiàn)新的微生物具有表1所示的真菌學(xué)特性。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>本發(fā)明者試圖基于如SEQIDNo:1-3所示的28SrDNA的核苷酸序列、如SEQIDNo:4-6所示的18SrDNA的核苷酸序列和如表1所示的真菌學(xué)特性來鑒別新型微生物。結(jié)果，他們僅能夠辨明屬于子囊菌綱的新的微生物。具體地，新的微生物沒有被分類至子囊菌綱的已知屬或種。因此，推斷這些新的微生物屬于新的屬。真菌學(xué)特性方面的分類根據(jù)以下文獻進行Bamett,J.A.,Payne,R.W.,andYarrow,D.，2000，Yeasts:Characteristicsandidentification,3rdedition,CambridgeUniversityPress,Cambridge,U.K.;禾卩Kurtzman,CP.andFell,J.W"1998,TheYeasts,ataxonomicstudy,4edition,Elsevier,Amsterdam,Netherlands。新的微生物保藏在獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所的專利生物"f呆藏中'Ci、(theInternationalPatentOrganismDepositaryoftheNationalInstituteofAdvancedIndustrialScienceandTechnology)(IPOD:曰本茨城縣筑波市東1-1-1中央第6，郵編305-8566)，于2006年1月12日保藏的保藏號為FERMBP-10713和FERMBP-10712,于2006年7月13日保藏的保藏號為FERMBP-10714。具體地，本發(fā)明的微生物屬于子囊菌綱，并且具有在使用香紫蘇醇作為底物合成十二氫-3a,6，6,9a-四甲基萘并[2，l-b]呋喃的過程中制造中間體的能力。另外，優(yōu)選地，本發(fā)明的微生物包括由與SEQIDNO:1-3中任意一個所示的核苷酸序列的同源性為95%或更高的核苷酸序列組成的28SrDNA，或者由與SEQIDNO:4-6中任意一個所示的核苷酸序列的同源性為95%或更高的核苷酸序列組成的18SrDNA。而且，本發(fā)明的微生物優(yōu)選地具有表1所示的真菌學(xué)特性。而且，本發(fā)明的微生物優(yōu)選地屬于由保藏號FERMBP-10713、FERMBP-10712或FERMBP-10714識別的子囊菌綱酵母菌株。本發(fā)明的微生物可以屬于子囊菌綱酵母菌株所屬的屬，優(yōu)選種，更優(yōu)選菌株。本發(fā)明的中間體的例子包括十氫-2-羥基-2,5,5,8a-四甲基萘乙醇和/或香紫蘇內(nèi)酯(十二氫-3a,6,6,9a-四甲基萘并[2,l-b]呋喃-2(lH)-酮)。本發(fā)明可以提供使用本發(fā)明的新的微生物制造十二氫-3a,6,6,9a-四甲基萘并[2，l-b]呋喃中間體的方法。具體地，根據(jù)本發(fā)明的制造十二氫-3^6,6，9&四甲基萘并[2,1七]呋喃中間體的方法包括在含有香紫蘇醇的培養(yǎng)基中培養(yǎng)新的微生物，并在使用香紫蘇醇作為底物合成十二氫-33,6,6,9^四甲基萘并[2,1七]呋喃的過程中產(chǎn)生中間體。本發(fā)明可以提供一種新的微生物，該微生物屬于子囊菌綱，并且具有在使用香紫蘇醇作為底物合成十二氫-3a，6，6，9a-四甲基萘并[2,l-b]呋喃的過程中產(chǎn)生中間體的能力。十二氫-3a,6,6,9a-四甲基萘并[2，l-b]呋喃作為芳香化合物或類似物的起始原料，可以由這些中間體制造。因此，使用本發(fā)明的新的微生物能夠低成本地制造十二氫-3a，6，6,9a-四甲基萘并[2，l-b]呋喃。本發(fā)明還可以提供制造十二氫-3a,6，6，9a-四甲基萘并[2，l-b]呋喃中間體的方法，該中間體是作為芳香化合物或類似物的起始原料的十二氫-3a,6,6,9a-四甲基萘并[2,l-b]呋喃的起始原料。根據(jù)本發(fā)明的制造十二氫-3a,6,6,9a-四甲基萘并[2，l-b]呋喃中間體的方法，可以低成本地制造十二氫-3a，6,6,9a-四甲基萘并[2,l-b]呋喃。本發(fā)明書包括作為本申請的優(yōu)先權(quán)文件的日本專利申請第2006-048550號的說明書和/或附圖中所公開的部分或全部內(nèi)容。圖1顯示了從香紫蘇醇制造十二氫-3a，6,6,9a-四甲基萘并[2,l-b]呋喃的過程。具體實施例方式以下，對本發(fā)明進行詳細說明。新的微生物本發(fā)明的新的微生物屬于子囊菌綱，并在使用香紫蘇醇作為底物合成十二氫-3a，6,6，9a-四甲基萘射2，l-b]呋喃的過程中產(chǎn)生中間體，艮卩，十二氫-3a,6，6,9a-四甲基萘并[2，l-b]呋喃中間體。本文所用的術(shù)語"十二氫-3a,6，6，9a-四甲基萘并[2,1-b]呋喃中間體"是指十氫-2-羥基-2，5,5,8a-四甲基萘乙醇和香紫蘇內(nèi)酯(十二氫-3^6,6,9&四甲基萘并[2,l-b]呋喃-2(lH)-酮)。利用產(chǎn)生十二氫-3a,6，6，9a-四甲基萘并[2，l-b]呋喃中間體的能力作為指標，可以從土壤中分離出本發(fā)明的新的微生物。通過在含有香紫蘇醇的培養(yǎng)基中培養(yǎng)試驗微生物，并檢測培養(yǎng)基中的十二氫-3a,6,6,9a-四甲基萘并[2,l-b]呋喃中間體，可以對產(chǎn)生十二氫-3a,6,6,9a-四甲基萘并[2,l-b]呋喃中間體的能力進行評價。通過使用有機溶劑從已經(jīng)除去試驗微生物的培養(yǎng)基中提取十二氫-3a，6，6，9a-四甲基萘并[2,l-b]呋喃中間體，然后進行例如氣相色譜(GC)，可以檢測培養(yǎng)基中的十二氫-3^6，6,9&-四甲基萘并[2,1七]呋喃中間體。檢測十二氫-3a,6，6,9a-四甲基萘并[2,l-b]呋喃中間體的方法并不限于GC。例如，可以采用常規(guī)的分析方法，例如氣液色譜(GLC)、薄層色譜(TLC)、高效液相色譜(HPLC)、紅外光譜(IR)、或核磁共振(NMR)。本發(fā)明者已經(jīng)通過這些方式從日本櫪木縣芳賀郡和日本櫪木縣宇都宮市的土壤樣品中分離出新的子囊菌綱微生物。分離出的新的微生物在含有香紫蘇醇的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使得這些微生物可以在培養(yǎng)基中產(chǎn)生十二氫-3a,6,6，9a-四甲基萘并[2,l-b]呋喃中間體。本發(fā)明者將這些新的微生物命名為子囊菌(Acow_yce&w.)KSM-JL2842、子囊菌KSM-J3571和子囊菌KSM-JL4651，并將其保藏在獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所的專利生物保藏中心(IPOD:日本茨城縣筑波市東1-1-1中央第6，郵編305-8566)，保藏號為FERMBP-10713、FERMBP-10712和FERMBP誦10714。本發(fā)明的新的微生物包括通過保藏號FERMBP-10713、FERMBP-10712或FERMBP-10714識別的屬于子囊菌綱的酵母菌株的微生物，以及被分類至與酵母菌株相同的屬、優(yōu)選被分類至與酵母菌株相同的種、更優(yōu)選相同菌株的微生物。另外，這些微生物具有產(chǎn)生十二氫-3a,6，6,9a-四甲基萘并[2,l-b]呋喃中間體的能力。通過保藏號FERMBP-10713、FE腿BP-10712和FERMBP-10714識別的子囊菌綱酵母菌株具有分別包括SEQIDNO:1、2和3中任意一個所示的核苷酸序列的28SrDNA。因此，本發(fā)明的新的微生物包括子囊菌綱酵母菌株，該子囊菌綱酵母菌株具有28SrDNA并且具有產(chǎn)生十二氫-3a，6,6，9a-四甲基萘并[2,l-b]呋喃中間體的能力，該28SrDNA包括與SEQIDNO:1-3中任意一個所示的任一核苷酸序列的同源性為95%或更高、優(yōu)選98%或更高、更優(yōu)選99%或更高的核苷酸序列。而且，通過保藏號FERMBP-10713、FERMBP-10712和FERMBP-10714識別的子囊菌綱酵母菌株具有分別包括SEQIDNO:4、5和6所示的核苷酸序列的18SrDNA。因此，本發(fā)明的新的微生物包括子囊菌綱酵母菌株，該子囊菌綱酵母菌株具有18SrDNA并且具有產(chǎn)生十二氫-3a，6，6,9a-四甲基萘并[2,l-b]呋喃中間體的能力，該18SrDNA包括與SEQIDNO.4-6中任意一個所示的任一核苷酸序列的同源性為95%或更高、優(yōu)選98%或更高、更優(yōu)選99%或更高的核苷酸序列。通過新的微生物產(chǎn)生十二氫-3a，6，6,9a-四甲基萘并r2,l-bl呋喃中間體使用上述本發(fā)明的新的微生物，可以產(chǎn)生十二氫-3a，6,6，9a-四甲基萘并[2,l-b]呋喃中間體。產(chǎn)生的十二氫-3a,6,6,9a-四甲基萘并[2,l-b]呋喃中間體可以用作制造十二氫-3a,6,6,9a-四甲基萘并[2,l-b]呋喃一一種新的具有令人滿意地持久的特性的高價值的芳香化合物的起始原料。當(dāng)使用本發(fā)明的新的微生物產(chǎn)生十二氫-3a,6，6，9a-四甲基萘并[2，l-b]呋喃中間體時，首先將本發(fā)明的新的微生物在含有香紫蘇醇的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。可以使用任何組成的培養(yǎng)基，其條件是其中可以生長子囊菌綱微生物?？梢允褂玫呐囵B(yǎng)基的例子包括含有碳源、氮源、礦物質(zhì)和維生素的固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基。根據(jù)培養(yǎng)條件等，用于培養(yǎng)本發(fā)明的新的微生物的培養(yǎng)基可以含有表面活性劑或消泡劑。添加到培養(yǎng)基中的碳源的例子包括單糖、二糖、寡糖和多糖。它們可以兩種或更多種組合使用。糖以外的碳源的例子包括有機酸鹽，例如醋酸鹽。根據(jù)需要，這些碳源可以獨立使用，或者可以兩種或更多種組合使用。氮源的例子包括無機和有機銨鹽，例如氨、氯化銨、硫酸銨、硝酸銨、碳酸銨、磷酸銨和醋酸銨；含氮有機物質(zhì)，例如尿素、胨、肉汁、酵母提取物、和酪蛋白水解物；以及氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酸、丙氨酸和蛋氨酸。根據(jù)需要，這些氮源可以獨立使用，或者可以兩種或更多種組合使用。而且，礦物質(zhì)的例子包括氯化鈉、硫酸亞鐵、硫酸鎂、硫酸錳、硫酸鋅和碳酸鈣。根據(jù)需要，各種礦物質(zhì)可以獨立使用，或者可以兩種或更多種組合使用。本發(fā)明的新的微生物的培養(yǎng)條件不受特別限制，培養(yǎng)可以在最理想的pH水平和溫度下進行。具體地，最理想的pH水平為3至8，優(yōu)選4至8，更優(yōu)選5至7。最理想的溫度為1(TC至35。C，優(yōu)選15。C至3(TC，更優(yōu)選2(TC至3(TC。培養(yǎng)可以經(jīng)由，例如震蕩培養(yǎng)、厭氧培養(yǎng)、靜止培養(yǎng)或在發(fā)酵罐中培養(yǎng)進行。此外，還可以采用靜止細胞反應(yīng)和固定化細胞反應(yīng)。向具有這些組成的培養(yǎng)基中添加的香紫蘇醇的濃度不受特別限制，該濃度優(yōu)選為0.1%至50%。香紫蘇醇可以在培養(yǎng)之前或者在培養(yǎng)過程中(即流加培養(yǎng)(feedingculture))被添加至培養(yǎng)基。另外，可以同時補料香紫蘇醇以外的組分，例如碳源、氮源、維生素、礦物質(zhì)、表面活性劑或消泡劑。如上所述對新的微生物進行培養(yǎng)之后，可以從培養(yǎng)基中回收十二氫-3a，6,6,9a-四甲基萘并[2，l-b]呋喃中間體?？梢愿鶕?jù)常規(guī)技術(shù)從培養(yǎng)基中回收十二氫-3a,6,6,9a-四甲基萘并[2,l-b]呋喃中間體，不受特別限制。例如，使用離心、超濾、離子交換色譜、反滲透膜過濾、電滲析、鹽析、結(jié)晶和其它方式的組合，可以將細胞從培養(yǎng)基中分離并除去，以及分離并提純十二氫-3a,6,6,9a-四甲基萘并[2,l-b]呋喃中間體。使用生成的十二氫-3a，6,6,9a-四甲基萘并[2，l-b]呋喃中間體制造十二氫-3a,6,6,9a-四甲基萘并[2,l-b]呋喃的方法不受特別限制，可以采用合適的常規(guī)技術(shù)。具體地，將香紫蘇內(nèi)酯用，例如，氫化鋁鋰、硼氫化鈉或硼氫化鉀/氯化鋰混合物還原，得到十氫-2-羥基-2，5,5,8a-四甲基萘乙醇。在各種類型的溶劑中使用酸性催化劑，例如，對甲苯磺酸、對甲苯磺酰氯(p-toluenesulfonicacidchloride)或催化量的硫酸和酸性離子交換劑對十氫-2-羥基-2,5,5,8a-四甲基萘乙醇進行環(huán)化脫水，得到十二氫-3a,6,6,9a-四甲基萘并[2,l-b]呋喃。實施例以下，參考實施例對本發(fā)明進行更詳細的說明，但本發(fā)明的技術(shù)范圍不限于以下實施例。[實施例1]分離新的微生物新的微生物以以下方式自日本櫪木縣芳賀郡和日本櫪木縣宇都宮市的土壤樣品中分離。首先，將100^il土壤懸浮液應(yīng)用于含有0.2。/。酵母提取物、0.2%硝酸銨、0.1%磷酸二氫鉀、0.05%七水硫酸鎂、2.0%瓊脂、1.0%香紫蘇醇(分別滅菌)和0.5。/。Tween80(分別滅菌)的瓊脂培養(yǎng)基。培養(yǎng)在25'C下進行7至14天，將生長的菌落接種到含有0.2%酵母提取物、0.2%硝酸銨、0.1%磷酸二氫鉀和0.05%七水硫酸鎂的液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)在25。C下進行1天，得到引子(starter)菌株。隨后，將引子菌株接種到含有0.2%酵母提取物、0.2%硝酸銨、0.1%磷酸二氫鉀、0.05%七水硫酸鎂、1.0%香紫蘇醇(分別滅菌)和0.5n/。Tween80(分別滅菌)的培養(yǎng)基中至濃度為1%，培養(yǎng)在25'C下進行1周。培養(yǎng)完成之后，將目標物質(zhì)用0.6ml乙酸乙酯從0.1ml培養(yǎng)液中提取出來，加以充分稀釋，然后進行氣相色譜(GC)分析。使用Agilenttechnologies6890N作為GC分析儀在以下條件下進行分析。使用火焰離子化檢測器(FID)作為檢測器，入口溫度設(shè)定在25(TC，使用分流比為100:1的分流注射模式，總的流速為200ml/min，柱流速為0.4ml/min，使用DB-WAX(cp0.1mmX10m，J&W)柱作為柱子，爐溫為25(TC。在這些條件下，環(huán)醚化合物，即，十二氫-3a,6,6,9a-四甲基萘并[2,l-b]呋喃中間體在大約0.8分鐘處出峰，香紫蘇內(nèi)酯在大約2.4分鐘處出峰，香紫蘇醇在大約2.7分鐘處出峰，十氫-2-羥基-2,5，5,8&四甲基萘乙醇在大約3分鐘處出峰。在這些條件下，對6,950引子菌株進行產(chǎn)生十二氫-3a,6,6，9a-四甲基萘并[2,l-b]呋喃中間體的能力方面的評價。結(jié)果，分離出具有主要產(chǎn)生十氫-2-羥基-2,5,5,8a-四甲基萘乙醇的能力的新的微生物。分離出的新的微生物命名為KSM-JL2842、KSM-J3571和KSM-JL4651。新的微生物的分類對實施例1中分離出的KSM-JL2842、KSM-J3571和KSM-JL4651的真菌學(xué)特性進行鑒別，并分析其rDNA，以期對這些菌株進行分類。首先，以如下方式鑒別KSM-JL2842的真菌學(xué)特性。在YM瓊脂(BectonDickinson)平板培養(yǎng)基上觀察濕的淺紅色菌落，菌落外周部分的形狀相對平滑。觀察其微觀特征。結(jié)果，觀察到卵形至橢圓形的圓柱狀滋養(yǎng)細胞的形成，發(fā)現(xiàn)滋養(yǎng)細胞因出芽生殖而增殖。作為生化特性試驗的結(jié)果，得到了表2所示的結(jié)果。在表2中，符號"+"表示陽性結(jié)果，符號"-"表示陰性結(jié)果，符號"W"表示弱陽性結(jié)果。另外，KSM-JL2842在25。C下生長，但在30。C或更高溫度下不生長。以如下方式鑒別KSM-J3571的真菌學(xué)特性。在YM瓊脂(BectonDickinson)平板培養(yǎng)基上觀察濕的淺紅色至淺黃紅色菌落，菌落外周部分的形狀是平滑的。觀察其微觀特征。結(jié)果，觀察到卵形至橢圓形的紡錘狀滋養(yǎng)細胞的形成，發(fā)現(xiàn)滋養(yǎng)細胞因出芽生殖而增殖。作為生化特性試驗的結(jié)果，得到了表2所示的結(jié)果。另夕卜，KSM-J3571在25。C下生長，在3(TC下微弱生長，但在35。C或更高溫度下不生長。以如下方式鑒別KSM-JL4651的真菌學(xué)特性。在YM瓊脂(BectonDickinson)平板培養(yǎng)基上觀察濕的淺紅色菌落，菌落外周部分的形狀相對平滑。觀察其微觀特征。結(jié)果，觀察到卵形至橢圓形的圓柱狀滋養(yǎng)細胞的形成，發(fā)現(xiàn)滋養(yǎng)細胞因出芽生殖而增殖。作為生化特性試驗的結(jié)果，得到了表2所示的結(jié)果。另夕卜，KSM-JL4651在30。C下生長，但在35X:或更高溫度下不生長。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>隨后，以下列方式分析KSM-JL2842、KSM-J3571和KSM-JL4651的rDNA。具體地，根據(jù)O，Donnell方法(O，Donnell,K.1993,Fusariumanditsnearrelatives,inReynolds,D.R.andTaylor,丄W.(Eds)TheFungalHolomorph:Mitotic,MeioticandPleomorphicSpeciationinFungalSystematics,CABInternational,Wallingford)分析28SrDNA的D1/D2區(qū)和18SrDNA，以推導(dǎo)其分類群。確定了28SrRNA的Dl/D2區(qū)的核苷酸序列，結(jié)果顯示于SEQIDNO:1-3。另夕卜，確定了18SrDNA的核苷酸序列，結(jié)果顯示于SEQIDNO:4-6。通過BLAST進行同源性檢索。獲自KSM-JL2842的28SrDNA的Dl/D2區(qū)的核苷酸序列表現(xiàn)出與尸M"cfowrariwmzo"a^m(AF096198)的核苷酸序列的同源性為94.9%，與CW"w/aca//cz'i/bw2&(AY544680)的核苷酸序列的同源性為94.6%，其中，上述尸wwcfowraf/wwzowart/m是子囊菌綱菌株。另夕卜，18SrDNA的核苷酸序列表現(xiàn)出高度同源性即，與Bw/gan'a/"^/""ra(AJ224362)的核苷酸序列的同源性為98.8%，與oscomycetesp.BBA71218(AJ301960)的同源性為98.9%,與Co^tospw/o/w^raW"'co/a(DQ002903)的核苷酸序列的同源性為98.9%，其中，上述Sw/gan'"/w/"am是子囊菌綱菌株。但是，很難推導(dǎo)KSM-JL2842的分類學(xué)組別分到比"綱(class)"級別更小的分類中。因此，推斷所關(guān)注的菌株是子囊菌綱的新的屬的酵母菌株，其分類在子囊菌綱中。該實施例的結(jié)果能夠?qū)⑺P(guān)注的菌株鑒別為子囊菌KSM-JL2842。獲自KSM-J3571的28SrDNA的Dl/D2區(qū)的核苷酸序列表現(xiàn)出與尸化wfifowraHMmzowWwm(AF096198)的核苷酸序列的同源性為94.9%，與Z^wccwewra^ora/^/c/zew'ma(AF096193)的核苷酸序歹U的同源性為94.8%，與CWm//"ca//c#wm&(AY544680)的核苷酸序列的同源性為94.6%，其中，上述尸化MfibwraHwmzo"Www是子囊菌綱菌株。18SrDNA的核苷酸序列表現(xiàn)出與ascowycefesp.BBA71218(AJ301960)的同源性為99.0%，與Sw/gan'a/"《Mz'"ara(AJ224362)的核苷酸序列的同源性為98.8%，其中，上述ascomycete^p.是子囊菌綱菌株。但是，難以將KSM-J3571的分類群推導(dǎo)到比"綱"級別更小的分類中。因此，推斷所關(guān)注的菌株是構(gòu)成子囊菌綱的新的屬的酵母菌株，其分類在子囊菌綱中。該實施例的結(jié)果能夠?qū)⑺P(guān)注的菌株鑒別為子囊菌KSM-J3571。獲自KSM-JL4651的28SrDNA的Dl/D2區(qū)的核苷酸序列表現(xiàn)出與P化MtfoMra^/mzo"Www(AF096198)的核苷酸序列的同源性為94.6%，與丄ewcowewras;wra/w/c/zem'ma(AF096193)的核苷酸序列的同源性為94.4%，其中，上述Psew(ioi/ra"Mmzo"a^w是子囊菌綱菌株。18SrDNA的核苷酸序列表現(xiàn)出與oscomycetesp.BBA71218(AJ301960)的同源性為99.0%，與5w/ganV7/"《m'""ra(AJ224362)的核苷酸序列的同源性為98.8%，其中，上述oscw^cefesp.是子囊菌綱菌株。但是，難以將KSM-JL4651的分類群推導(dǎo)到比"綱(class)"級別更小的分類中。因此，推斷所關(guān)注的菌株是構(gòu)成子囊菌綱的新的屬的酵母菌株，其分類在子囊菌綱中。該實施例的結(jié)果能夠?qū)⑺P(guān)注的菌株鑒別為子囊菌KSM-JL4651。子囊菌KSM-JL2842和KSM-J3571于2006年1月12日，以FERMBP-10713和FERMBP-10712的保藏號，子囊菌KSM-JL4651于2006年7月13日，以FERMBP-10714的保藏號，保藏在獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所的專利生物保藏中心(IPOD:日本茨城縣筑波市東1-1-1中央第6，郵編305-8566)?？疾飚a(chǎn)生十二氫-3a,6,6,9a-四甲基萘并[2,l-b]呋喃中間體的能力在該實施例中，考察子囊菌KSM-JL2842產(chǎn)生十二氫-3a,6,6,9a-四甲基萘并[2,l-b]呋喃中間體的能力。首先，將鉑環(huán)量的子囊菌KSM-JL2842接種到2.1。/。YM肉湯(BectonDickinson)中，在25。C下震蕩培養(yǎng)2天，生成物稱為引子菌株。隨后，將引子菌株接種到含有2.P/。YM肉湯、0.1%七水硫酸鎂、P/。Tween80和2。/。香紫蘇醇的培養(yǎng)基中至濃度為2%，在25'C下進行震蕩培養(yǎng)。通過實施例1的方法對培養(yǎng)液進行提取和GC分析，確定產(chǎn)生的十二氫-3a,6,6,9a-四甲基萘并[2,l-b]呋喃中間體的量。結(jié)果顯示在表3中。表3中所顯示的數(shù)值的單位為"g/l"。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>表3中的結(jié)果表明，子囊菌KSM-JL2842主要可以產(chǎn)生十二氫-33,6,6,93-四甲基萘并[2,1-13]呋喃中間體當(dāng)中的十氫-2-羥基-2,5，5,8&-四甲基萘乙醇。考察產(chǎn)生十二氫-3a，6，6，9a-四甲基萘并[2，l-b]呋喃中間體的能力在該實施例中，考察子囊菌KSM-JL2842、KSM-J3571和KSM-JL4651產(chǎn)生十二氫-3a，6，6，9a-四甲基萘并[2，l-b]呋喃中間休的能力。首先，將鉑環(huán)量的這些菌株接種到含有0.2%酵母提取物(BectonDickinson)、0.2°/0硝酸銨、0.1%磷酸二氫鉀、0.05%七水硫酸鎂和1.0%葡萄糖的培養(yǎng)基中，在25"C下進行2天震蕩培養(yǎng)，生成物稱為引子菌株。隨后，將引子菌株接種到含有0.2%酵母提取物(BectonDickinson)、0.2%硝酸銨、0.1%磷酸二氫鉀、0.05%七水硫酸鎂、1.0%葡萄糖、0.5%Tween80和1.0%香紫蘇醇的培養(yǎng)基中至濃度為1%，在25'C下進行6天震蕩培養(yǎng)。通過實施例1的方法對培養(yǎng)液進行提取和GC分析，確定產(chǎn)生的十二氫-3a,6,6,9a-四甲基萘并[2,l-b]呋喃中間體的量。結(jié)果顯示在表4屮。表4中所顯示的數(shù)值的單位為"gA"。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>表4中的結(jié)果表明，于囊菌綱細菌KSM-JL2842、KSM-J3571和KSM-JL4651均產(chǎn)生十二氫-3a,6,6,9a-四甲基萘并[2,l-b]呋喃中間體。在此將本文引用的所有出版物、專利和專利申請全部并入作為參考。權(quán)利要求1.一種微生物，其特征在于，所述微生物屬于子囊菌綱，并且具有在使用香紫蘇醇作為底物合成十二氫-3a，6，6，9a-四甲基萘并[2，1-b]呋喃的步驟中產(chǎn)生中間體的能力。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微生物，其特征在于，所述微生物具有28SrDNA或18SrDNA，其中，所述28SrDNA包括與SEQIDNO:1-3中任意一個所示的核苷酸序列的同源性為95%或更高的核苷酸序列，所述18SrDNA包括與SEQIDNO:4-6中任意一個所示的核苷酸序列的同源性為95%或更高的核苷酸序列。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的微生物，其特征在于，所述微生物具有下表1所示的真菌學(xué)特性。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage3</column></row><table>4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任意一項所述的微生物，其特征在于，所述微生物為由保藏號FERMBP-10713、FERMBP-10712或FERMBP-10714識別的子囊菌綱酵母菌株。5.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任意一項所述的微生物，其特征在于，所述微生物屬于與由保藏號FERMBP-10713、FERMBP-10712或FERMBP-10714識別的子囊菌綱酵母菌株相同的屬。6.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任意一項所述的微生物，其特征在于，所述微生物屬于與由保藏號FERMBP-10713、FERMBP-10712或FERMBP-10714識別的子囊菌綱酵母菌株相同的種。7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任意一項所述的微生物，其特征在于，所述微生物具有產(chǎn)生作為所述中間體的十氫-2-羥基-2,5，5,8a-四甲基萘乙醇和/或香紫蘇內(nèi)酯(十二氫-33,6,6,9&四甲基萘并[2，1七]呋喃-2(111)-酮)的能力。8.—種產(chǎn)生十二氫-3a,6,6,9a-四甲基萘并[2,l-b]呋喃中間體的方法，其特征在于，所述方法包括在含有香紫蘇醇的培養(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求1-7中任意一項所述的微生物，并且在使用香紫蘇醇作為底物產(chǎn)生合成十二氫-3a,6,6,9a-四甲基萘并[2，l-b]呋喃的過程中產(chǎn)生中間體。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的產(chǎn)生十二氫-3a,6，6，9a-四甲基萘并[2,l-b]呋喃中間體的方法，其特征在于，所述方法包括回收作為所述中間體的十氫-2-羥基-2,5,5,8a-四甲基萘乙醇和/或香紫蘇內(nèi)酯(十二氫-3a,6,6,9a-四甲基萘并[2，l-b]呋喃-2(lH)-酮)的步驟。全文摘要本發(fā)明涉及一種新的微生物，該微生物使用香紫蘇醇作為底物有效產(chǎn)生十二氫-3a，6，6，9a-四甲基萘并[2，1-b]呋喃中間體。作為集中研究的結(jié)果，分離并鑒別出多種具有所關(guān)注特性并且沒有被分類為常規(guī)微生物的新的微生物。本發(fā)明的新的微生物屬于子囊菌綱，并且具有使用香紫蘇醇作為底物產(chǎn)生十二氫-3a，6，6，9a-四甲基萘并[2，1-b]呋喃中間體的能力。這些子囊菌綱的微生物代表了新的發(fā)現(xiàn)，其可以有效產(chǎn)生十二氫-3a，6，6，9a-四甲基萘并[2，1-b]呋喃及其中間體。文檔編號C12P17/04GK101426900SQ20068005403公開日2009年5月6日申請日期2006年12月21日優(yōu)先權(quán)日2006年2月24日發(fā)明者五十嵐一曉,檜垣紀彥,瀧澤修一,萩原浩申請人:花王株式會社