專利名稱：：獲自畢赤酵母的自動(dòng)誘導(dǎo)型磷酸鈉協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)體啟動(dòng)子和利用該啟動(dòng)子制造重組蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及獲自畢赤酵母(Pichiapastoris)的自動(dòng)誘導(dǎo)型NPS啟動(dòng)子和利用所述啟動(dòng)子制造重組蛋白的方法。更具體而言，本發(fā)明涉及獲自畢赤酵母的自動(dòng)誘導(dǎo)型NPS啟動(dòng)子；攜帶所述啟動(dòng)子和核苷酸序列的重組表達(dá)載體，所述序列與所述啟動(dòng)子可操作地連接并編碼重組蛋白；轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染有所述重組表達(dá)載體的宿主細(xì)胞；以及制造重組蛋白的方法，所述方法包括培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞以表達(dá)所述重組蛋白并分離所述蛋白。
背景技術(shù)：
：蛋白質(zhì)合成是開始于轉(zhuǎn)錄的多步過程，其中，由DNA編碼的遺傳信息轉(zhuǎn)移至mRNA模板。轉(zhuǎn)錄開始于起始過程。RNA聚合酶與DNA的稱為啟動(dòng)子的特定區(qū)域相結(jié)合，所述啟動(dòng)子通常位于待轉(zhuǎn)錄的基因的上游。許多啟動(dòng)子(但并非所有的啟動(dòng)子)含有共同(保守)序列，這樣的序列稱為共有序列。在原核細(xì)胞中，啟動(dòng)子由位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游的-10位點(diǎn)和-35位點(diǎn)的兩段短序列構(gòu)成。在-10位點(diǎn)的序列通常由六個(gè)核苷酸"TATAAT"(TATA盒)構(gòu)成。在-35位點(diǎn)的另一序列通常由六個(gè)核苷酸TTGACA構(gòu)成。大多數(shù)啟動(dòng)子相互之間的區(qū)別在于實(shí)際堿基序列以及離所述共有序列的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的距離。這種變異性據(jù)信會(huì)導(dǎo)致啟動(dòng)子起始轉(zhuǎn)錄的不同頻率，即啟動(dòng)強(qiáng)度。因此啟動(dòng)子是決定蛋白質(zhì)制造效率的重要因素之一，并且目前正為在各種微生物中開發(fā)出強(qiáng)的且具有特異性的啟動(dòng)子而進(jìn)行廣泛的研究。畢赤酵母，一種甲基營養(yǎng)型酵母，正成為甲醇代謝和過氧化物酶體生成的研究中有用的重要生物模型，并且是優(yōu)于作為傳統(tǒng)酵母的釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的蛋白制造宿主系統(tǒng)。此外，受益于其特征性代謝和生理活性，畢赤酵母被公認(rèn)是一種有用的工業(yè)資源，其可用于環(huán)境友好的生物過程中。畢赤酵母氧化甲醇經(jīng)過甲醛和甲酸至二氧化碳。這些反應(yīng)分別由醇氧化酶(AOX)、甲醛脫氫酶(FLD)和甲酸脫氫酶(FMDH)催化。畢赤酵母有兩個(gè)醇氧化酶基因(A0X1和AOX2)，這兩個(gè)基因有各自的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。受益于其高活性，所述AOXl啟動(dòng)子通常用以在酵母中表達(dá)重組蛋白，而已知所述AOX2啟動(dòng)子(美國專利號(hào)5,032，516)表現(xiàn)出相對(duì)較弱的活性(J.Tschopp等，NucleicAcidsRes.1987，第15巻，第3859-3876頁)。此外，已研發(fā)出FLD基因啟動(dòng)子(D.Resina等，JournalofBiotechnology,2004，第109巻，第103-113頁)。對(duì)于畢赤酵母也已研發(fā)出甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAP)啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子已知為在各種微生物中的強(qiáng)組成型啟動(dòng)子(Waterham等，Gene,1997，第186巻，第37-44頁)。通過畢赤酵母制造重組蛋白中最常用的是參與甲醇代謝并由甲醇強(qiáng)烈誘導(dǎo)的啟動(dòng)子。當(dāng)使用參與甲醇代謝的基因的啟動(dòng)子時(shí)，必須小心謹(jǐn)慎以避免火災(zāi)，這是因?yàn)檗D(zhuǎn)錄需要甲醇這種高度易燃的燃料。在此情況下，生產(chǎn)設(shè)施必須包括特殊設(shè)備并要求仔細(xì)的檢査。此外，采用GAP啟動(dòng)子時(shí)，難以控制蛋白表達(dá)的效率。當(dāng)對(duì)所述細(xì)胞的生長有副作用時(shí)，其他組成型啟動(dòng)子由于會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞不穩(wěn)定，因此也難以使用在蛋白質(zhì)的大規(guī)模制造中。因此，需要這樣的強(qiáng)啟動(dòng)子，即該啟動(dòng)子經(jīng)誘導(dǎo)可足以調(diào)控重組蛋白在適于大規(guī)模制造的所需時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)或足以調(diào)控蛋白的過表達(dá)，并且其誘導(dǎo)所需的誘導(dǎo)物或者不受該過程的影響，或者根本不需要誘導(dǎo)物。
發(fā)明內(nèi)容為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，本發(fā)明人經(jīng)過深入而全面的研究，建立了不存在傳統(tǒng)方法中所遇到的問題的蛋白制造系統(tǒng)，這導(dǎo)致這樣的發(fā)現(xiàn)，即，當(dāng)隨著細(xì)胞的生長，合適的起始磷濃度降低至一個(gè)有限水平時(shí)，本發(fā)明的獲自畢赤酵母的NPS啟動(dòng)子在無需任何誘導(dǎo)物的情況下自動(dòng)誘導(dǎo)，因此能有效地制造目標(biāo)蛋白。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種啟動(dòng)子，其選自由以下序列組成的組(1)SEQIDNO.:4的核苷酸序列；(2)SEQIDNO.:4的位點(diǎn)337位點(diǎn)1，044的核苷酸序列；(3)SEQIDNO.:4的位點(diǎn)571位點(diǎn)1，044的核苷酸序列；禾口(4)SEQIDNO.:4的位點(diǎn)743位點(diǎn)1,044的核苷酸序列。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供了一種重組表達(dá)載體，其包括所述啟動(dòng)子和與所述啟動(dòng)子可操作地連接的編碼重組蛋白的核苷酸序列。根據(jù)本發(fā)明的再一方面，本發(fā)明提供了一種轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染有所述重組表達(dá)載體的宿主細(xì)胞；根據(jù)本發(fā)明的再一方面，本發(fā)明提供了一種用于制造重組蛋白的方法，其包括培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞以表達(dá)所述重組蛋白；和從培養(yǎng)物中分離所述重組蛋白。由以下詳細(xì)描述并結(jié)合附圖將可以更清楚地理解本發(fā)明的以上以及其他目的、特征和其他優(yōu)點(diǎn)，其中圖1顯示了采用NPS基因?qū)碜杂谠诹紫蘖颗囵B(yǎng)基中培養(yǎng)的畢赤酵母的mRNA進(jìn)行的Northern印跡結(jié)果(所述細(xì)胞以0.14(1)，0.08(2)和0.03(3)的特定生長速度生長)；圖2是顯示重組表達(dá)載體pNPS-AM-CLLip的構(gòu)建的示意圖，所述重組表達(dá)載體包含獲自畢赤酵母的NPS基因和與所述NPS基因可操作連接的報(bào)道基因；圖3A是其中繪制了在含有不同起始磷含量的培養(yǎng)基(*:磷不足，V:磷限量，磷過量)中，分批培養(yǎng)用pNPS-AM-CLLip轉(zhuǎn)化的畢赤酵母時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)物在不同培養(yǎng)時(shí)間的脂肪酶活性的曲線圖；圖3B是其中繪制了在含有不同起始磷含量的培養(yǎng)基(o:磷不足，磷限量，磷過量)中，分批培養(yǎng)用pNPS-AM-CLLip轉(zhuǎn)化的畢赤酵母時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)物在不同培養(yǎng)時(shí)間的磷濃度的曲線圖3C是其中繪制了在含有不同起始磷含量的培養(yǎng)基[葡萄糖濃度-(O:磷酸鹽耗盡，磷限量，磷過量)，細(xì)胞密度-("磷不足，T:磷限量，廳磷過量)]中，分批培養(yǎng)用pNPS-AM-CLLip轉(zhuǎn)化的畢赤酵母時(shí)，在不同培養(yǎng)時(shí)間的葡萄糖濃度和細(xì)胞密度的曲線圖4是在含有不同起始磷含量的培養(yǎng)基中培養(yǎng)經(jīng)pNPS-AM-CLLip轉(zhuǎn)化的畢赤酵母所獲得的脂肪酶蛋白的Western印跡結(jié)果；禾口圖5是描述篩選對(duì)NPS啟動(dòng)子生物功能必需的最小核苷酸序列的示意圖(+:陽性脂肪酶活性，ND:未檢測(cè)到脂肪酶活性)。具體實(shí)施例方式根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明涉及編碼用于磷酸鹽運(yùn)輸?shù)腘a+-磷酸鹽協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)體(下文中稱為"NPS")的基因。本發(fā)明的NPS基因具有SEQIDNO:1的核苷酸序列。該NPS基因可根據(jù)SEQIDNO:l的序列進(jìn)行化學(xué)合成，或者采用對(duì)應(yīng)于所述基因兩端的預(yù)定區(qū)域的引物，使用畢赤酵母的基因組DNA作為模板，通過PCR進(jìn)行合成。本發(fā)明的獲自畢赤酵母的NPS基因能用作檢測(cè)來自畢赤酵母各個(gè)種的NPS基因的探針。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明涉及用于調(diào)控畢赤酵母中NPS基因的表達(dá)的啟動(dòng)子。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述NPS基因的啟動(dòng)子由SEQIDNO.:4(1,044bp)的核苷酸序列構(gòu)成。即使所述SEQIDNO.:4的核苷酸序列的一部分，尤其是TATA區(qū)或CAT區(qū)，也被發(fā)現(xiàn)具有與由SEQIDNO.:4構(gòu)成的啟動(dòng)子幾乎相同的功能。為了鑒別行使NPS基因啟動(dòng)子功能所必需的最小序列，制備了各種截短的啟動(dòng)子構(gòu)建體，這些構(gòu)建體包括缺失堿基1336、1570、1742、1838、1891和1921的序列。檢測(cè)這些截短的啟動(dòng)子構(gòu)建體使與其可操作連接的重組蛋白表達(dá)的能力。結(jié)果，觀察到具有SEQIDNO.:4的核苷酸序列的截短構(gòu)建體在缺失堿基1336、1570或1742時(shí)能表達(dá)重組蛋白，但在缺失1838、1891或1921時(shí)不能表達(dá)重組蛋白。因此，本發(fā)明的NPS基因啟動(dòng)子選自由(1)SEQIDNO.:4的全長核苷酸序列；(2)SEQIDNO.:4的位點(diǎn)337位點(diǎn)1,044的核苷酸序列；(3)SEQIDNO.:4的位點(diǎn)571位點(diǎn)1,044的核苷酸序列；禾口(4)SEQIDNO.:4的位點(diǎn)743位點(diǎn)1，044的核苷酸序列組成的組。優(yōu)選的是，本發(fā)明的NPS基因啟動(dòng)子包括SEQIDNO.:4的位點(diǎn)743位點(diǎn)1,044的核苷酸序列，該核苷酸序列由SEQIDNO.:15表示。這些NPS基因啟動(dòng)子可以根據(jù)在本發(fā)明中公開的核苷酸序列進(jìn)行化學(xué)合成，或者采用對(duì)應(yīng)于所述公開的各核苷酸序列的兩端的預(yù)定區(qū)域的引物，使用畢赤酵母的基因組DNA作為模板，通過PCR進(jìn)行合成。由于本發(fā)明的NPS基因啟動(dòng)子獲得自畢赤酵母，因而能用作檢測(cè)至少來自畢赤酵母各個(gè)種的NPS基因的啟動(dòng)子的探針。當(dāng)在磷限量的條件下進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，可觀察到畢赤酵母過表達(dá)所述NPS基因(實(shí)施例1)。在表達(dá)與所述NPS啟動(dòng)子結(jié)合的報(bào)道基因的試驗(yàn)中，觀察到由于隨著細(xì)胞生長，耗盡了起始濃度的磷酸鹽，所述NPS啟動(dòng)子發(fā)生了自動(dòng)誘導(dǎo)，因此使得即使在不存在任何誘導(dǎo)物的情況下也能過表達(dá)所述目標(biāo)蛋白(實(shí)施例4)。當(dāng)在細(xì)胞生長過程中，培養(yǎng)基中可供使用的磷酸鹽變得有限時(shí)，所述NPS啟動(dòng)子自動(dòng)誘導(dǎo)，并因此強(qiáng)烈表達(dá)與其可操作連接的基因。因此，獲得自畢赤酵母的所述"NPS啟動(dòng)子"可用作自動(dòng)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。"啟動(dòng)子"是位于基因上游的DNA調(diào)控區(qū)域，該調(diào)控區(qū)域募集RNA酶到該調(diào)控區(qū)域上以提供調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的控制點(diǎn)。通常，啟動(dòng)子可分為兩類。首先，響應(yīng)于誘導(dǎo)物的存在而激活，"誘導(dǎo)型啟動(dòng)子"可啟動(dòng)與之相關(guān)的基因的表達(dá)。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子在用于表達(dá)基因時(shí)要求募集誘導(dǎo)物，這類誘導(dǎo)物通常價(jià)格昂貴，并且在一些情況下可導(dǎo)致身體或宿主細(xì)胞的毒性。此外，誘導(dǎo)物的使用要求進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)要進(jìn)行多種考慮，包括提供所述誘導(dǎo)物的時(shí)間點(diǎn)、培養(yǎng)基中誘導(dǎo)物的濃度等。另一方面，"組成型啟動(dòng)子"是未受調(diào)控的啟動(dòng)子，可使與其相關(guān)的基因連續(xù)轉(zhuǎn)錄而無需誘導(dǎo)物。然而，當(dāng)使用組成型誘導(dǎo)物時(shí)，基因表達(dá)的時(shí)間點(diǎn)不受控制。因此，當(dāng)目標(biāo)蛋白導(dǎo)致對(duì)宿主細(xì)胞的生長的毒性或副作用時(shí)，其難以大規(guī)模制造。相反，"自動(dòng)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子"使與之相關(guān)的基因在所希望的時(shí)間點(diǎn)表達(dá)，這是因?yàn)樗募せ畈⒎琼憫?yīng)于誘導(dǎo)物的存在而發(fā)生。它響應(yīng)于培養(yǎng)條件的限制或特定營養(yǎng)的耗盡而被誘導(dǎo)，因此克服了誘導(dǎo)型啟動(dòng)子和組成型啟動(dòng)子的多種缺點(diǎn)。得益于NPS基因的表達(dá)水平，可預(yù)期到本發(fā)明的NPS基因啟動(dòng)子對(duì)與其相關(guān)的基因的表達(dá)的作用。在一個(gè)實(shí)施方式中，采用對(duì)所述NPS基因的mRNA水平的檢驗(yàn)，可定量地確定其表達(dá)水平。在本領(lǐng)域中已知多種RNA檢驗(yàn)技術(shù)。例如，可使用RT-PCR、Northern印跡、雜交、斑點(diǎn)雜交、DNA陣列雜交和/或DNA微珠。此外，獨(dú)立檢驗(yàn)了本發(fā)明NPS啟動(dòng)子誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)的能力。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，報(bào)道基因的表達(dá)處于NPS啟動(dòng)子的控制之下，并可以定量地測(cè)量。適于該目的的報(bào)道基因的例子包括lacZ(卩-半乳糖苷酶)、uidA(卩-葡萄糖醛酸酶)、neo(新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶)、cat(氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶)、dhfr(二氫葉酸還原酶)、aphlV(潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶)和lux(熒光素酶)。在本發(fā)明中，其中纖維素結(jié)合域與來自嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillusstearothermophilus)的脂肪酶連接的融合蛋白(Ahn等，JournalofMicrobiol.Biotechnol.2003，第13巻，第451頁)優(yōu)選用作報(bào)道子。除了不導(dǎo)致毒性之外，所述融合蛋白還具有由于該纖維素結(jié)合域而高效率地分泌脂肪酶的優(yōu)點(diǎn)，并能測(cè)量活性，因此反映出了所述融合蛋白的表達(dá)水平(實(shí)施例2)。可使用本領(lǐng)域中廣泛已知的方法定性地或定量地分析所表達(dá)的報(bào)道子。盡管取決于報(bào)道基因，但是所述方法優(yōu)選涉及使用與相應(yīng)報(bào)道蛋白或其片段特異性結(jié)合的抗體。適合的抗體可以是單克隆抗體或者多克隆抗體，并包括可接受修飾抗體或衍生物，如Fab片段和單鏈抗體。為通過抗原-抗體反應(yīng)對(duì)分析物進(jìn)行鑒別和定量，可采用凝集法測(cè)定、Western印跡、ELISA、RIA、酶免疫測(cè)定(EIA)、熒光免疫測(cè)定(FIA)或免疫沉淀。如上所述，本發(fā)明的NPS啟動(dòng)子能在所希望的時(shí)間點(diǎn)強(qiáng)烈表達(dá)可操作連接的基因而無需誘導(dǎo)物的協(xié)助，并因此可用在重組蛋白的制造中。術(shù)語"重組蛋白"意指通過基因工程技術(shù)制備的蛋白，而并非局限于任何特定的一種蛋白。因此，術(shù)語"重組蛋白"可與術(shù)語"目標(biāo)蛋白"交換使用。重組蛋白的制造之前必須構(gòu)建攜帶有NPS啟動(dòng)子和與該啟動(dòng)子可操作連接的編碼所述重組蛋白的核苷酸序列的重組表達(dá)載體。所述重組表達(dá)載體構(gòu)成本發(fā)明的一個(gè)方面。所述重組載體可由商業(yè)提供的載體進(jìn)行制備。在此情況下，在所述載體中原本存在的啟動(dòng)子可由本發(fā)明的NPS啟動(dòng)子所替代。此外，所述重組載體可經(jīng)過設(shè)計(jì)以含有本發(fā)明的NPS啟動(dòng)子和通常使用的調(diào)控序列。如此處所使用的術(shù)語"載體"是指起到穩(wěn)定地將重組蛋白的核苷酸序列輸送到宿主細(xì)胞中的作用的媒介物。為了能夠使用，載體必需具有自身復(fù)制并轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞中的能力，并且必須包括可檢測(cè)部分。如此處所使用的術(shù)語"重組表達(dá)載體"意指用于向宿主細(xì)胞中引入并表達(dá)特定可操作連接的基因的環(huán)狀DNA分子。如在本領(lǐng)域中廣泛已知的，為了提高引入到宿主細(xì)胞中的異源基因的表達(dá)水平，所述基閑必須可操作地與能在所述宿主細(xì)胞中起作用的轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控序列連接。優(yōu)選的是，感興趣的基因由含有調(diào)控序列、可選擇的標(biāo)記和復(fù)制起點(diǎn)的一個(gè)載體所攜帶。如此處所使用的術(shù)語"調(diào)控序列"指對(duì)重組蛋白的表達(dá)是必須的或者有益的核苷酸序列。調(diào)控序列的例子包括分泌信號(hào)序列、多聚腺苷酸化信號(hào)序列、前肽序列、增強(qiáng)子、上游激活序列和轉(zhuǎn)錄終止因子。在本發(fā)明中，所述調(diào)控序列至少包括啟動(dòng)子，并優(yōu)選包括啟動(dòng)子和分泌信號(hào)序列?？蛇x的是，所述調(diào)控序列可包括其他調(diào)控因子，以提高目標(biāo)蛋白的表達(dá)水平。如此處使用的術(shù)語"分泌信號(hào)序列"意指能使所表達(dá)的蛋白運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞外的氨基酸序列，并通常用以促進(jìn)重組蛋白的分離和純化。轉(zhuǎn)移到細(xì)胞外的表面蛋白或分泌蛋白具有在細(xì)胞膜中被信號(hào)肽酶切割的N-末端序列。可用在本發(fā)明中的分泌序列的例子包括但不局限于a-因子信號(hào)序歹ll、殺〈矢毒素前導(dǎo)l言號(hào)序歹!j(killertoxinleadersignalsequence)、轉(zhuǎn)化酶信號(hào)序列和a-淀粉酶信號(hào)序列。為了被表達(dá)，編碼重組蛋白的核苷酸序列必須可操作地連接于包括本發(fā)明的啟動(dòng)子的調(diào)控序列。如此處所使用的術(shù)語"可操作地連接"指一條核苷酸序列與另一條核苷酸序列功能性地排列。例如，如果其參與成熟蛋白的分泌，則分泌序列可操作地連接于所述蛋白。如果編碼序列的轉(zhuǎn)錄處于啟動(dòng)子的控制之下，則其可操作地連接于所述啟動(dòng)子。如果核糖體結(jié)合位點(diǎn)位于能使編碼序列被翻譯的位置，則其可操作地連接于所述編碼序列。通常，"可操作地連接的"DNA序列與另一序列相接觸。例如，分泌性前導(dǎo)序列與目標(biāo)基因相接觸，并存在于開放閱讀框之內(nèi)。然而，增強(qiáng)子不需要與目標(biāo)基因相接觸。用所述重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞構(gòu)成本發(fā)明的另一方面?？捎迷诒景l(fā)明中的宿主細(xì)胞的例子包括典型的真核細(xì)胞宿主和原核細(xì)胞宿主，如大腸桿菌(E.coli)、各假單胞菌種(Pseudomonasspp.)、各芽包桿菌禾中(Bacillusspp.)、各鏈霉菌種(Streptomycesspp.)，真菌和酵母，昆蟲細(xì)胞如草地貪夜蛾(SF9),動(dòng)物細(xì)胞如CHO和小鼠細(xì)胞、非洲綠猴細(xì)胞(如C0S1、COS7、BSC1、BSC40和BMT10),培養(yǎng)得到的人類細(xì)胞和植物細(xì)胞。在本發(fā)明中優(yōu)選酵母細(xì)胞。更優(yōu)選為畢赤酵母，這足因?yàn)樗信c本發(fā)明的NPS啟動(dòng)子相同的來源?？筛鶕?jù)由Davis等在BasicMethodsinMolecularBiology,198中公開的技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染。優(yōu)選的例子包括DEAE-葡聚糖介導(dǎo)轉(zhuǎn)染、電穿孔、轉(zhuǎn)導(dǎo)、磷酸鈣轉(zhuǎn)染、陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染、劃痕荷載和感染。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明涉及制造重組蛋白的方法，其包括培養(yǎng)經(jīng)轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞以表達(dá)所述重組蛋白并分離所述重組蛋白。根據(jù)常規(guī)技術(shù)，本發(fā)明的宿主細(xì)胞可培養(yǎng)在適用于重組蛋白生成的營養(yǎng)培養(yǎng)基中，例如，在早期階段(初始培養(yǎng)階段)磷濃度為0.0010.02mM的含磷培養(yǎng)基。例如，可通過在允許表達(dá)和/或分離目標(biāo)蛋白的條件下小規(guī)?；虼笠?guī)模發(fā)酵或搖瓶發(fā)酵而在實(shí)驗(yàn)室或工業(yè)發(fā)酵罐中培養(yǎng)宿主細(xì)胞。可采用已知技術(shù)在含有碳源、氮源和無機(jī)鹽的合適營養(yǎng)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)基可以是商業(yè)提供的一種培養(yǎng)基，或者可以參考在AmericanTypeCultureCollection的目錄中公開的組分和組成而制備的培養(yǎng)基。本發(fā)明的宿主細(xì)胞可經(jīng)過分批培養(yǎng)或補(bǔ)^j"分批培養(yǎng)。如此處所使用的術(shù)語"分批培養(yǎng)"指使用在初始階段將生長所必需的所有營養(yǎng)物一次加入的培養(yǎng)基的生物分批過程。在分批培養(yǎng)中，所述宿主細(xì)胞能夠生長到一種必需營養(yǎng)物耗盡之后，或者生長到不適于其生長的條件形成(例如，pH降低，因此抑制宿主細(xì)胞的生長)之后。如此處所使用的術(shù)語"補(bǔ)料分批培養(yǎng)"指基于在發(fā)酵開始后立即、或者在所述培養(yǎng)基達(dá)到預(yù)定階段后、或者所述營養(yǎng)底物耗盡之后，將--種或多種生長營養(yǎng)底物補(bǔ)加到培養(yǎng)物中的生物分批過程。在補(bǔ)料分批過程中，例如將pH調(diào)節(jié)至預(yù)定值，并且將至少一種生長營養(yǎng)物再補(bǔ)加到培養(yǎng)物中。所述宿主細(xì)胞的生長速度取決于營養(yǎng)物的補(bǔ)加速率。通常，單種營養(yǎng)物或碳源是生長限制因素。同樣，其他營養(yǎng)或條件也可用作限制因素。例如，宿主細(xì)胞的生長可受限制于氮源、氧或各種特定營養(yǎng)物如維生素或氨基酸(當(dāng)所述宿主細(xì)胞對(duì)此是營養(yǎng)缺陷型時(shí))。可采用本領(lǐng)域中己知的方法從所述培養(yǎng)物中分離重組蛋白。例如，從所述培養(yǎng)物中分離重組蛋白可通過但不局限于傳統(tǒng)方法來實(shí)現(xiàn)，所述傳統(tǒng)方法例如為離心、過濾、提取、噴霧干燥、蒸發(fā)和沉淀。此外，各種技術(shù)，包括色譜法(例如離子交換法、親合法、疏水法和尺寸排阻法)、電泳法、分離結(jié)晶法(例如硫酸銨沉淀)、SDS-PAGE和萃取法可使用在所述重組蛋白的純化中。通過以下實(shí)施例能更好地理解本發(fā)明，提供所述實(shí)施例的目的是為了說明本發(fā)明，而不應(yīng)理解為限制本發(fā)明。實(shí)施例<實(shí)施例1>來自畢赤酵母的NPS啟動(dòng)子的克隆為了篩選在磷限量條件下能夠在畢赤酵母中過表達(dá)的基因，根據(jù)本申請(qǐng)人:在2004年11月27日遞交的韓國專利申請(qǐng)2004-98303中公開的方法，在磷限量培養(yǎng)基中以連續(xù)方式進(jìn)行培養(yǎng)。將從如此培養(yǎng)的細(xì)胞團(tuán)(cellmass)中分離出的mRNA用作RT-PCR的底物，以獲得過表達(dá)基因庫。通過核苷酸測(cè)序發(fā)現(xiàn)，所述基因庫含有負(fù)責(zé)磷代謝的N^-磷酸鹽協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)體(NPS)基因。隨之，克隆了用于調(diào)控所述基因表達(dá)的啟動(dòng)子。在這點(diǎn)上，在合成引物(SEQIDNO.:2和SEQIDNO.:3)的存在下，用先前克隆的Na+-磷酸鹽協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)體(NPS)基因作為探針進(jìn)行反向PCR。使用畢赤酵母的經(jīng)各種限制性酶消化后的基因組DNA作為所述反向PCR的模板。通過反向PCR從Kpnl消化后所得的基因組DNA片段中檢測(cè)到編碼Na^-磷酸鹽協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)體(NPS)的基因。將該NPS基因克隆在pSTBlue-1載體中，由此形成的重組載體命名為"pSTl"。通過堿基測(cè)序，發(fā)現(xiàn)了NPS的開放閱讀框及其上游區(qū)域，即1,044bp長的啟動(dòng)子(SEQIDNO.:4)。該啟動(dòng)子稱為"PNPS"。通過使用分離自在磷限量條件下培養(yǎng)的細(xì)胞的mRNA對(duì)所述NPS基因進(jìn)行Northern印跡，觀察到所述基因在磷限量條件下的過表達(dá)(圖1)。<實(shí)施例2>攜帶所述啟動(dòng)子PNPS的重組表達(dá)載體的構(gòu)建使用脂肪酶基因作為報(bào)道基因以驗(yàn)證所克隆的啟動(dòng)子PNPS的活性。詳細(xì)地說，脂肪酶LlF(CBD-Ll-脂肪酶，其中編碼纖維素結(jié)合域的基因與脂肪酶連接)用作報(bào)道基因，這是因?yàn)樗芨€(wěn)定地表達(dá)脂肪酶Ll(Ahn等JournalofMicrobiol.Biotechnol.2003，第13巻，第451貞)。攜帶有脂肪酶基因和所述啟動(dòng)子PNPS的重組表達(dá)載體基于pPIC9載體(Invitrogen，U.S.A.)。參考圖2，其中描述了制備攜帶有脂肪酶報(bào)道基因和所述啟動(dòng)子PNPS的重組表達(dá)載體的方法。在合成引物SEQIDNO.:5和SEQIDNO.:6(分別含有AvrII和Notl限制性位點(diǎn))的存在下，通過PCR由pYEGA-AM國CLLip(Ahn等，JournalofMicrobial.Biotechnol.2003，第13巻，第451頁)擴(kuò)增含有源自cc-淀粉酶的分泌信號(hào)和脂肪酶的序列。同樣，在合成引物SEQIDNO.:7和SEQIDNO.:8(分別含有BglII和AvrII限制性酶位點(diǎn))的存在下，將實(shí)施例1中克隆的pST〗用作模板，通過PCR擴(kuò)增所述啟動(dòng)子Pwps。編碼源自cc-淀粉酶的分泌信號(hào)和脂肪酶的基因用AvrII和Notl進(jìn)行消化，而所述啟動(dòng)子Pws用BglII和AvrII進(jìn)行處理。隨后，將編碼源自oc-淀粉酶的分泌信號(hào)和脂肪酶的報(bào)道基因和所述啟動(dòng)子Pws連接至用BglII和Notl部分消化的pPIC9載體。結(jié)果，制備了攜帶所述啟動(dòng)子PwPS和編碼源自ct-淀粉酶和脂肪酶的基因的重組表達(dá)載體，并稱之為"pNPS-AM-CLLip"。當(dāng)由所述載體表達(dá)時(shí)，所述(x-淀粉酶用作分泌信號(hào)以對(duì)所述脂肪酶進(jìn)行胞外分泌。<實(shí)施例3>畢赤酵母的轉(zhuǎn)化用在實(shí)施例2中制備的重組表達(dá)載體pNPS-AM-CLLip轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115。實(shí)施例2中制備的表達(dá)載體插入到畢赤酵母GSU5基因組上的his4基因中。為此，使用也存在于所述his4基因中的BspEI消化所述重組表達(dá)載體，然后采用鋰/TE法(Hill等，Nucl.Acids.Res.1991，第19巻，第5791頁)轉(zhuǎn)化到畢赤酵母中。詳細(xì)地說，將經(jīng)BsPEI消化的所述重組表達(dá)載體、載體DNA和PEG/LiAc相混合并在3(TC下反應(yīng)30分鐘。然后，在加入DMSO后，在42"C下反應(yīng)15分鐘。離心后，將沉淀在200plTE緩沖液中懸浮。將所述懸浮液鋪在His(-)板上(葡萄糖2%、酵母氮源0.67%、無his的氨基酸混合物0.077%、瓊脂2%)，然后進(jìn)行23天的培養(yǎng)。從所得的轉(zhuǎn)化體中，選擇出在基因組中僅插入單拷貝的所述重組表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化體。<實(shí)施例4>脂肪酶在Pwps控制下的表達(dá)采用報(bào)道基因來觀察所述啟動(dòng)子PNPS對(duì)所述報(bào)道基因在多種磷濃度下的表達(dá)方式的影響。更詳細(xì)地說，將實(shí)施例3中選擇出的用pNPS-AM-CLLip轉(zhuǎn)化的畢赤酵母以分批方式在含有不同初始磷濃度(用NaH2P04，2H20迸行調(diào)節(jié))的培養(yǎng)基(如以下表1所示)中培養(yǎng)。取出來自細(xì)胞團(tuán)的培養(yǎng)物并分析脂肪酶水平。根據(jù)培養(yǎng)時(shí)間測(cè)量細(xì)胞團(tuán)干重、脂肪酶活性以及葡萄糖、甘油和磷的濃度。如下進(jìn)行所述測(cè)量。(1)細(xì)胞團(tuán)干重將通過細(xì)胞培養(yǎng)物的離心獲得的細(xì)胞沉淀用等滲緩沖液洗滌，在8(TC干燥并稱重。(2)脂肪酶活性用pH-stat法測(cè)量脂肪酶的滴度。(3)葡萄糖水平用葡萄糖分析儀定量分析葡萄糖。磷水平用Fiske-Shubbarow法(Fiske等，JournalofBiologicalChemistry,1925，第66巻，第375頁)定量分析磷。表1在分批方式中采用的培養(yǎng)基的組成<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>參考圖3A、3B和3C，繪制了當(dāng)用pNPS-AM-CLLip轉(zhuǎn)化的畢赤酵母以分批方式在含有不同起始磷含量的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，脂肪酶活性、磷濃度、細(xì)胞密度和葡萄糖濃度相對(duì)于培養(yǎng)時(shí)間的圖。如圖所示，培養(yǎng)基中較高的起始磷濃度導(dǎo)致較快的細(xì)胞生長速率和葡萄糖攝入速率。在培養(yǎng)基C中，含有20mM的起始磷濃度(磷過量)，細(xì)胞生長至70O.D.并且50g/L葡萄糖在開始培養(yǎng)后22小時(shí)內(nèi)完全耗盡的程度。在培養(yǎng)基B中，含有2.0mM的起始磷濃度(磷限量)，細(xì)胞生長至610.D.并且起始量為50g/的L葡萄糖在開始培養(yǎng)后37.5小時(shí)完全消耗。培養(yǎng)基A含有0.20mM的起始磷濃度(磷貧乏)，即使在培養(yǎng)40小時(shí)后，經(jīng)測(cè)量還具有43g/L的葡萄糖，而細(xì)胞生長至至多15O.D.。這些數(shù)據(jù)表明，磷濃度影響了細(xì)胞的生長。培養(yǎng)基C僅在對(duì)數(shù)期生長末期顯示出低濃度磷，表明所述細(xì)胞的生長不受限于磷。在培養(yǎng)基B中，從開始培養(yǎng)后12小時(shí)開始，細(xì)胞的生長受到限制。因?yàn)槠鹗继峁┓浅Ｉ倭康牧?，培養(yǎng)基A僅允許細(xì)胞以受限的速率生長。在培養(yǎng)基B中觀察到脂肪酶活性，然而在培養(yǎng)基A和培養(yǎng)基C中幾乎未檢測(cè)到脂肪酶活性。這可由圖4的Western印跡結(jié)果所證實(shí)。因此，當(dāng)隨著細(xì)胞為其生長而消耗磷，使磷濃度由恰當(dāng)?shù)钠鹗妓浇档椭潦芟匏綍r(shí)，所述NPS啟動(dòng)子自動(dòng)誘導(dǎo)，因而能夠制造可操作連接的蛋白。相反，當(dāng)磷的濃度豐富而使所述細(xì)胞未受磷的限制時(shí)，或者所述磷的濃度對(duì)于細(xì)胞生長而言太低時(shí)，則沒有制造目標(biāo)蛋白。結(jié)果，本發(fā)明的NPS啟動(dòng)子是可自動(dòng)誘導(dǎo)的，因此能用磷濃度進(jìn)行控制，可以在磷限量條件下表達(dá)而無需任何誘導(dǎo)物。<實(shí)施例5〉NPS啟動(dòng)子的必要控制區(qū)的篩選為了鑒別其在轉(zhuǎn)錄中起到根本作用的區(qū)域，從5'-端將先前克隆的1,044bp長的PNPS(SEQIDNO.:4)截短至預(yù)定位點(diǎn)，并將由此形成的啟動(dòng)子片段與如同實(shí)施例2的在pNPS-AM-CLLip載體中那樣用作報(bào)道基因的所述脂肪酶基因連接。詳細(xì)地說，所述啟動(dòng)子Pws(SEQIDNO.:4)的、缺失位點(diǎn)1位點(diǎn)336、570、742、838、891和921的區(qū)域的多條核苷酸片段是采用SEQIDNO.:9和8、SEQIDNO.:10和8、SEQIDNO.:11禾卩8、SEQIDNO.:12和8、SEQIDNO.:13和8、以及SEQIDNO.:14和8多套引物，用pNPS-AM-CLLip作為模板，通過PCR進(jìn)行制備的。由此得到的各PCR產(chǎn)物用BglII和AvrII消化并獨(dú)立地連接至預(yù)先用Bgin和AvrII消化的pNPS-AM-CLLip。所得重組表達(dá)載體分別命名為pNPS(A336)-AM-CLLip、pNPS(A570)-AM-CLLip、pNPS(A742)-AM-CLLip、pNPS(A838)-AM-CLLip、pNPS(A891)-AM-CLLip和pNPS(A921)-AM-CLLip。如實(shí)施例3所述，將這些表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到畢赤酵母GS115之中，并選擇在所述基因組中僅分別插入單拷貝的相應(yīng)重組表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化體。為了測(cè)定截短的啟動(dòng)子是否是活性的，將所選擇的轉(zhuǎn)化體在能利ffl脂肪酶活性形成暈圈(halo)的板上進(jìn)行培養(yǎng)。如圖5所示，分別用pNPS(A336)-AM-CLLip，、pNPS(A570)-AM-CLLip和pNPS(A742)-AM-CLLip轉(zhuǎn)化的畢赤酵母株觀察到具有相似的脂肪酶活性，而在用pNPS(A838)-AM-CLLip、pNPS(A891)-AM-CLLip或pNPS(A921)-AM-CLLip轉(zhuǎn)化的畢赤酵母中未檢測(cè)到活性。因此，從3'-端沿5'-端方向跨越302bp長度的區(qū)域?qū)τ赟EQIDNO.:4的Pnps功能是必需的。啟動(dòng)子P^s的必需部分用SEQIDNO.:15表示。工業(yè)應(yīng)用性隨著細(xì)胞生長，當(dāng)恰當(dāng)?shù)钠鹗剂诐舛冉抵潦芟匏綍r(shí)，本發(fā)明的源自畢赤酵母的NPS啟動(dòng)子自動(dòng)誘導(dǎo)，從而能有效地制造目標(biāo)蛋白。利用本發(fā)明的可自動(dòng)誘導(dǎo)的NPS啟動(dòng)子的誘導(dǎo)型或組成型表達(dá)系統(tǒng)可以是解決大規(guī)模制造重組蛋白的傳統(tǒng)方法所面臨的細(xì)胞株的穩(wěn)定性問題和其他問題的有前景的解決方案。盡管結(jié)合目前認(rèn)為最實(shí)際和最優(yōu)選的實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了描述，但應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明并不局限于所公開的實(shí)施方式及其附圖，而相反，本發(fā)明旨在涵蓋在所附權(quán)利要求的精神和范圍之內(nèi)的各種改進(jìn)和變化。權(quán)利要求1.一種啟動(dòng)子，所述啟動(dòng)子選自由以下核苷酸序列組成的組(1)SEQIDNO.4的核苷酸序列；(2)SEQIDNO.4的位點(diǎn)337～位點(diǎn)1,044的核苷酸序列；(3)SEQIDNO.4的位點(diǎn)571～位點(diǎn)1,044的核苷酸序列；和(4)SEQIDNO.4的位點(diǎn)743～位點(diǎn)1,044的核苷酸序列。2.—種重組表達(dá)載體，所述重組表達(dá)載體包含權(quán)利要求l的啟動(dòng)子和與所述啟動(dòng)子可操作地連接的編碼重組蛋白的核苷酸序列。3.—種用權(quán)利要求2所述的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。4.如權(quán)利要求3所述的宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞為酵母。5.如權(quán)利要求4所述的宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞為畢赤酵母。6.用于制造重組蛋白的方法，所述方法包括培養(yǎng)權(quán)利要求35中任一項(xiàng)所述的宿主細(xì)胞以表達(dá)所述重組蛋白；和從培養(yǎng)物中分離所述重組蛋白。7.如權(quán)利要求6所述的方法，其中，所述宿主細(xì)胞培養(yǎng)在含有濃度為1mM20mM的磷的培養(yǎng)基中。全文摘要本發(fā)明公開了獲得自畢赤酵母的自動(dòng)誘導(dǎo)型NPS啟動(dòng)子；攜帶所述啟動(dòng)子和核苷酸序列的重組表達(dá)載體，所述序列與所述啟動(dòng)子可操作地連接并編碼重組蛋白；用所述重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞；以及制造重組蛋白的方法，所述方法包括培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞以表達(dá)所述重組蛋白并分離所述蛋白。所述NPS啟動(dòng)子可大規(guī)模地制造感興趣的重組蛋白而無需任何誘導(dǎo)物。文檔編號(hào)C12N15/11GK101415824SQ200680054180公開日2009年4月22日申請(qǐng)日期2006年8月7日優(yōu)先權(quán)日2006年4月12日發(fā)明者安廷梧,崔毅星,樸明洙,李弘遠(yuǎn),李殷教,李赫遠(yuǎn),洪智涎,鄭俊基,金千錫申請(qǐng)人:韓國生命工學(xué)研究院