專利名稱：：在酵母表達系統(tǒng)中增強重組外源蛋白的分泌效率的方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及在酵母表達系統(tǒng)中提高重組外源蛋白的分泌效率的方法。
背景技術：
：利用微生物大量產生外源蛋白是蛋白質藥業(yè)中最重要的
技術領域：
。為了回收和純化期望的產物，重組外源蛋白可被胞內表達，或者另外可被胞外分泌。胞內表達蛋白質時，蛋白質的過表達在許多情況下經?？蓪е碌鞍踪|以非活性和水不可溶的形式在胞內累積，并可帶來產率降低因素的各種劣勢，諸如破裂固體微生物的繁瑣的過程以及從存在于細胞中的各種宿主蛋白分離期望蛋白的復雜和艱難的純化過程。然而，期望蛋白的胞外分泌可提供容易的方式來避免與前述胞內表達蛋白質相關的困難和問題。而且，由于胞外蛋白分泌僅在緊接轉錄過程之后蛋白質的正確折疊和修飾之后才可成功進行，所以經由胞外分泌的蛋白質產生提供了能夠獲得活性形式的、具有正確的三級結構的可溶蛋白這一益處。因此，可以說，在蛋白質產率以及蛋白質質量調控方面，蛋白質的胞外分泌優(yōu)于重組外源蛋白的胞內累積系統(tǒng)。然而，在許多情況下，在采用強啟動子的重組蛋白表達系統(tǒng)中，胞外蛋白分泌系統(tǒng)經常遭受相比于胞內累積系統(tǒng)顯著低的表達和分泌水平。為了克服胞外分泌的這類劣勢和問題，已經進行了許多研究，以增強蛋白質的胞外分泌收率。大多數(shù)研究集中于直接優(yōu)化信號序列以有效分泌蛋白或發(fā)現(xiàn)新的強分泌信號序列(NucleicAcidsResSuppl.，2003(3):261-2;和BiochemCe謹ol.1993，71:401-5)。作為另一種方法，己經進行了許多研究，以通過使用分子生物學技術，經由誘導有助于蛋白質的折疊和水溶解的蛋白伴侶的過表達，促進相應于過表達重組外源蛋白時的初始限速步驟的蛋白質折疊以及防止可在蛋白的胞外分泌之前發(fā)生的不溶性沉淀，而增強期望蛋白的分泌效率(Robinson和Wittrup，5z'o&c/z.iVog".，11:171,1995;Robinsonetal.，5z'ofec/zwo/ogy,12:381-384，1994;以及Wulfing和Plukthun，Mo/.M'tro組12(5):685-692,1995)。半乳糖啟動子，傳統(tǒng)上被用于誘導外源重組蛋白在酵母中的表達，是一種利用半乳糖作為誘導物的強誘導型啟動子。即使蛋白表達的強誘導對于增加外源蛋白的胞內累積或表達水平可以是有利的，這也可導致在期望胞外分泌所需蛋白質時分泌效率下降或者細胞功能異常，原因在于在分泌的早期在細胞中發(fā)生不溶性沉淀。這類事件偶爾也在重組表達系統(tǒng)諸如大腸桿菌(￡.co//)表達系統(tǒng)和酵母表達系統(tǒng)中觀察到。為了克服這類缺點，進行了各種嘗試來降低培養(yǎng)溫度(BaneyxF.,CWr.(9;/".A/o&c/mo/.,10:411—421,1999;以及GeorgeGeorgiou禾口Pascal,Cw,t.O//".B/ofec/zw/.，7:1卯畫197，1996)。然而，這類降低培養(yǎng)溫度的方法具有與重組外源蛋白產生成本增加相關的劣勢，原因在于培養(yǎng)期延長。因此，在本領域中對于開發(fā)能夠通過調節(jié)半乳糖誘導型啟動子的活性來增強重組外源蛋白的分泌效率而不降低培養(yǎng)溫度的方法存在需求。為了這個目的，基于半乳糖誘導型啟動子的活性可通過調控宿主中半乳糖的可利用度進行調節(jié)這一想法，本發(fā)明的發(fā)明人已經確認，通過使用缺乏參與半乳糖吸收的半乳糖通透酶基因的突變株，或通過經由共添加--定比例的半乳糖和調節(jié)分解代謝物阻抑的葡萄糖進行補料分批培養(yǎng)而培養(yǎng)經轉化的酵母菌株，提高重組外源蛋白的分泌效率是可能的。本發(fā)明基于這些發(fā)現(xiàn)已經得以完成
發(fā)明內容技術問題因此，考慮上述問題而做出了本發(fā)明，并且本發(fā)明的一個目的是提供通過遺傳修飾酵母宿主菌株或改變培養(yǎng)條件而提高重組外源蛋白在酵母表達系統(tǒng)中的胞外分泌效率的方法。技術方案根據本發(fā)明的一個方面，通過提供提高外源蛋白分泌效率的方法可實現(xiàn)上述目的和其它目的，所述方法包括步驟(a)用重組外源基因構建體轉化酵母宿主以構建轉化酵母菌株，所述重組外源基因構建體包含半乳糖誘導型啟動子、分泌信號序列和編碼所述外源蛋白的基因；和(b)在所述半乳糖誘導型啟動子的活性受到調控的條件下培養(yǎng)所述轉化酵母菌株。有益效果通過經由適度調控作為半乳糖誘導性啟動子的誘導物在細胞中起作用的半乳糖的水平，降低基于半乳糖誘導型啟動子的常規(guī)酵母表達系統(tǒng)所經歷的重組外源蛋白的過表達引起的不溶性沉淀，根據本發(fā)明的提高外源蛋白分泌效率的方法可實現(xiàn)重組外源蛋白分泌效率的提高。因此，本發(fā)明的方法有效提高重組外源蛋白在酵母表達系統(tǒng)中的產率并有效降低生產成本。附圖簡述通過結合附圖進行下面的詳細描述，本發(fā)明的上述目的和其它目的、特征和其它優(yōu)勢將得到更清楚的理解，其中圖1是示意圖，其闡述了其中培養(yǎng)基中的半乳糖穿過酵母細胞膜并作用于外源蛋白表達誘導型啟動子的過程，以及其中由葡萄糖進行的分解代謝物阻抑在細胞中發(fā)生的過程；圖2是在本發(fā)明中使用的重組LK8蛋白表達載體M5LK8的切割圖譜；圖3是當除了C^/2基因外各自具有相同遺傳背景的兩種酵母宿主在作為唯一碳源的半乳糖供應的情況下進行培養(yǎng)時，比較隨時間變化的半乳糖消耗速率的曲線圖4是照片，其示出了外源基因在轉化酵母菌株A中表達后，具有表達誘導期的胞內總外源蛋白的蛋白質印跡分析結果；圖5是照片，其示出了轉化酵母菌株A中胞內水溶性外源蛋白的蛋白質印跡分析結果；圖6是照片，其示出外源基因在轉化酵母菌株B中表達后，具有表達誘導期的胞內總外源蛋白的蛋白質印跡分析結果。由此可見，相比于利用具有GL^2基因的酵母菌株A作為宿主表達蛋白質，外源蛋白質的胞內不溶性累積隨時間相對下降；圖7是曲線圖，其比較了通過補料分批培養(yǎng)轉化酵母菌株A和B進行外源基因表達后，分泌入培養(yǎng)基中的重組外源蛋白的量與表達誘導期的關系曲線；禾口圖8是適于在外源蛋白在酵母中表達后允許半乳糖誘導型蛋白質二硫鍵異構酶基因(尸D/7)進行共表達的表達載體pMPDIl的切割圖譜。實施發(fā)明的最佳方式在下文中，本發(fā)明將進行更詳細的描述。根據本發(fā)明提高外源蛋白的分泌效率的方法包括步驟(a)用重組外源基因構建體轉化酵母宿主，所述構建體包含半乳糖誘導型啟動子、分泌信號序列和編碼所述外源蛋白的基因，以構建轉化酵母菌株；和(b)在所述半乳糖誘導型啟動子的活性受到調控的條件下培養(yǎng)所述轉化酵母菌株。在本文中，進行步驟(a)，以用重組外源基因表達構建體轉化酵母宿主。對于轉化方法無特別限制。優(yōu)選地，通過將重組外源基因構建體插入(或多重插入)酵母宿主的染色體或者通過將基因構建體插入酵母宿主的細胞質使得它可以以環(huán)狀載體的形式存在，進行轉化?；驑嫿w參入染色體在使用酵母的轉化中被稱為"整合"，而基因構建體以環(huán)狀載體的形式參入酵母細胞質是指附加型表達法，其中外源基因以附加體的形式被引入，以在外源基因表達構建體插入可應用于酵母系統(tǒng)的載體(或質粒)之后表達和分泌外源蛋白。附加體是存在于細胞質中的環(huán)狀DNA并能夠獨立于宿主細胞的染色體發(fā)揮遺傳功能?？捎糜诒景l(fā)明的半乳糖誘導型啟動子的例子可包括任何類型的啟動子而無特別限制，只要其通過使用半乳糖作為誘導物在酵母系統(tǒng)中是功能上可操縱的。優(yōu)選地，可以使用SEQIDNO:1所示的釀酒酵母(5*.cem^/ae)的04丄/啟動子、SEQIDNO:2所示的釀酒酵母的04U0啟動子、SEQIDN0:3所示的釀酒酵母的O4丄7啟動子、或它們的組合或融合。更優(yōu)選O4ZJ。分泌信號序列可以是在酵母系統(tǒng)中用作分泌信號或者是本領域中常規(guī)上已知的任何序列。例如，信號序列可以選自SEQIDNO:4所示的MATct信號、SEQIDNO:5所示的釀酒酵母Kl殺傷毒素信號(Brown，J.L.等,TheKlkillertoxin:molecularandgeneticapplicationstosecretionandcellsurfaceassembly.In:Johnston,J.R.Mo/ecw/。r(7e"幼'cso/y"eas^-aprac".ca/a//raac/z.Thepracticalapproachseries,1994，第217-265頁；禾口Tokunaga,M.等，Way.Co/www".，144:613-619,1987)、SEQIDNO:6戶萬示的釀酒酵母轉化酶信號(日本未經審查專利公布1985-041488)、SEQIDNO:7所示的乳酸克魯維酵母(i:/w，mw^ca/flc他)殺傷毒素信號(Sugisaki,Y.等，五,乂歷ocAew.,141:241-245,1984)、SEQIDNO:8所示的尸/c/n'aacac/ae殺傷毒素信號(美國專利6,1,07,057)、葡萄有孢漢遜酵母(//araem'a^oram^rww)殺傷毒素信號(Radler，F(xiàn).等，v^c/.M/cto^o/.,154(2):175-178,1990;和Schmitt,M.J.等，JF/to/.,68(3):1765-1772,1994)、異常畢赤酵母(漢遜酵母屬)(/Vc/w》(7/"/wem/A3^"wcw"/a)殺j勞毒素《言號、及其j壬l可纟且合。此外，為了增加蛋白質或肽的分泌效率，分泌信號序列可進一步包括前肽序列，還進一步包括信號肽酶的識別位點，例如KEX1(用于殺傷表達l)或KEX2(美國專利4,929,553)。信號肽酶的識別位點的例子可包括Pro-Met-Tyr。同時，其中所述半乳糖誘導型啟動子的活性受到調控的條件可以使用各種方法諸如遺傳工程技術和培養(yǎng)技術加以建立。對建立所期望的培養(yǎng)條件的這類技術無特別限制，只要它可能調控半乳糖誘導型啟動子的活性。優(yōu)選地，半乳糖誘導型啟動子的活性可通過降低半乳糖從培養(yǎng)基進入轉化酵母菌株的轉運速率加以調控。就此而論，包括基于遺傳工程的菌株改造技術和培養(yǎng)技術在內的任何方法可被用于降低半乳糖的胞內轉運速率，只要它可能降低半乳糖向細胞內的輸送。例如，各種遺傳工程技術可被用于使作為靶標的轉化酵母半乳糖通透酶基因成為非功能性的。優(yōu)選地，通過使半乳糖通透酶基因缺損或使之部分破壞從而成為非功能性的是首選的。對缺陷引入或基因破壞的方法無特別限制，只要它們旨在(部分或完全地)使半乳糖通透酶的功能失效。例如，使用本領域中常規(guī)己知的各種遺傳工程技術，進行基因的缺陷(缺失)或部分(或完全)破壞。此外，可在本發(fā)明中使用的半乳糖通透酶缺陷型菌株不被特別限制。例如，釀酒酵母(Sacc/wram少c^cerev&^)BJ3501(ATCC208280)是通常已知的。優(yōu)選地，在步驟a)中調節(jié)半乳糖誘導型啟動子活性的條件是在細胞培養(yǎng)期間以一定比例向培養(yǎng)液共添加半乳糖和葡萄糖。對培養(yǎng)方法無特別限制，包括分批培養(yǎng)、連續(xù)培養(yǎng)、分批補料培養(yǎng)等。優(yōu)選分批補料培養(yǎng)。此外，對半乳糖和葡萄糖的比例無特別限制，只要葡萄糖分解代謝物阻抑致使半乳糖的胞內轉運得到抑制，同時半乳糖進行的誘導不受抑制。優(yōu)選地，半乳糖和葡萄糖的比例在4:1至1:1的范圍內。在通過用包含半乳糖誘導型啟動子、分泌信號序列和編碼外源蛋白的基因的重組外源基因構建體轉化酵母宿主來構建轉化酵母菌株中，酵母宿主優(yōu)選用含有蛋白質二硫鍵異構酶編碼基因的重組外源構建體轉化，所述蛋白質二硫鍵異構酶編碼基因在半乳糖誘導型啟動子的調控下進行表達。優(yōu)選地，提高外源蛋白的分泌效率的方法在步驟(a)和(b)之間進一步包括步驟(a-l):用含有在半乳糖誘導型啟動子調控下表達的蛋白質二硫鍵異構酶編碼基因的重組外源基因構建體進一步轉化步驟(a)的轉化酵母菌株。前述另外的步驟(a-l)是指酵母菌株用編碼蛋白質二硫鍵異構酶的基因再轉化，蛋白質二硫鍵異構酶對在細胞內產生的蛋白質的胞外分泌施加優(yōu)異的影響。蛋白質二硫鍵異構酶編碼基因轉化酵母菌株，可以在經由用包含半乳糖誘導型啟動子、分泌信號序列和編碼外源蛋白的基因的重組外源基因構建體轉化酵母宿主來構建轉化酵母的步驟(a)之前，通過前述用蛋白質二硫鍵異構酶編碼基因轉化酵母菌株來進行，或者可以在步驟(a)之后另外通過利用蛋白質二硫鍵異構酶編碼基因的轉化酵母菌株的另外的轉化步驟(a-l)來進行?？捎糜诒景l(fā)明的蛋白質二硫鍵異構酶編碼基因不被特別限制于來自某些物種的具體序列，只要它們可進行二硫鍵異構化。優(yōu)選地，蛋白質二硫鍵異構酶基因選自SEQIDNO:9所示的釀酒酵母(Tachikawa,H."a/.，乂腸c/7匿,110(2):306-313,1991)、SEQIDNO:10所示的織錦芋螺(Co謹toch7e)PD/(美國專利申請US2004/0203132Al)、SEQIDNO:11所示的線蟲(C.e/egfl"s)尸D/(Page,A.P"DiVJCe〃5/o/.'16(11):1335-1343,1997)、SEQIDNO:12所示的人胰腺尸D/基因(Desilva,M.G.Wa/.,DNACe//所o/.,15(1):9-16，1997)、SEQIDNO:13所示的米曲霉(A;e/^'〃wsor;;zae)尸D/(WO95/00636)、SEQIDNO:14所示的博伊丁假絲酵母(Omfi^aZ^Ww7)尸D/(美國專利5,965,426)、SEQIDNO:15所示的特異腐質霉(/ww'co/"/rao/era)戶Z)/(美國專利5,700，659)及其任何組合。編碼蛋白質二硫鍵異構酶的基因構建體不被特別限制于具體載體或其等價物。優(yōu)選的是具有圖8所示的切割圖譜的pMPDI。在酵母表達系統(tǒng)中，半乳糖誘導型啟動子被廣泛應用，其具有強表達強度。在細胞內存在作為誘導物的半乳糖時，半乳糖誘導型啟動子被激活，然后導致基因在上述半乳糖誘導型啟動子調控下進行高豐度表達。由于這類可誘導性，半乳糖誘導型啟動子被用作在酵母中表達外源重組蛋白的有用手段。然而，如以前所討論，本發(fā)明人觀察到，在外源蛋白質的分泌發(fā)生之前，外源蛋白質的不可溶沉淀在表達早期在細胞中發(fā)生(見圖4)。本發(fā)明人已經進行了各種廣泛和深入的研究和實驗來解決上述問題以及提高外源蛋白的胞外分泌。為了這個目的，基于這樣的事實——由于在細胞中半乳糖的過豐度導致的半乳糖誘導型啟動子過活化是外源蛋白在其分泌之前發(fā)生胞內不溶性沉淀的主要原因，本發(fā)明人進行了研究，以確認通過調控被用作半乳糖誘導型啟動子的表達誘導物的半乳糖的胞內流入，重組外源蛋白的分泌效率是否得到提高。首先，經半乳糖的胞內攝取途徑分析，半乳糖的胞內轉化可經由各種途徑發(fā)生。半乳糖轉化的主要途徑是半乳糖通透酶(Gal2)，其作為半乳糖操縱子的組成，在半乳糖的存在下得到表達，并表現(xiàn)出對半乳糖的最高親和性。然而，甚至當宿主細胞是半乳糖通透酶(Gal2)活性缺陷時，半乳糖轉運也未被完全阻斷。相反，這樣的Gal2-缺陷型宿主細胞可通過另外的方法實現(xiàn)半乳糖的胞內轉運，例如通過在細胞膜上存在的各種己糖轉運蛋白，例如HXT1、HXT9、HXT11和HXT14(WieczorkeR.efa/.,Le仏464(3):123-128，1999)，即使其它己糖轉運蛋白對于半乳糖具有相對低的親和性。因此，至少操縱GAL啟動子所必需的最小量的半乳糖可被轉運入細胞(見圖1)。圖1是概念圖，其說明了其中在培養(yǎng)基中的半乳糖穿過酵母細胞膜然后作用于誘導外源蛋白表達的啟動子這一過程以及其中葡萄糖在細胞中導致分解代謝物阻抑這一過程?；谠趫D1中所示的該圖解，本發(fā)明人考慮了通過使用編碼Ga12——一種主要的半乳糖轉運蛋白——的基因(Ga/2)缺陷的酵母宿主來最小化半乳糖的胞內轉運是可能的。為了這個目的，首先，在半乳糖誘導型啟動子的調控下表達外源基因的重組外源基因構建體被引入作為宿主的、具有Ga/2基因缺陷的釀酒酵母BJ3501(ATCC208280)(下文稱為"酵母宿主B")，從而構建轉化酵母(下文稱為"轉化酵母宿主B")，并且如此轉化的酵母菌株在含半乳糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。之后，將在轉化酵母菌株B中重組外源蛋白的分泌效率與作為宿主的另一轉化酵母菌株(下文稱為"轉化酵母宿主A")進行比較，該另一轉化酵母菌株通過不具有Gfl/2基因缺陷的正常酵母菌株(釀酒酵母2805，下文稱為"酵母宿主A")的轉化而獲得。如圖3所示，當除了G^/2基因外各自具有相同遺傳背景的酵母宿主A和B在含有半乳糖作為唯一碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)并且培養(yǎng)基中半乳糖隨時間的濃度被測定并在兩組之間進行比較時，確認了半乳糖進入細胞的流入速率根據GW2基因的存在/不存在而顯著變化。而且，使用外源蛋白的抗體，通過蛋白質印跡分析，確認了相比于當酵母宿主A被用作外源蛋白表達的宿主時(見圖4和5)，當酵母菌株B——由于C^/2基因的無操作，其半乳糖進入細胞的流入速率低——被用作外源蛋白表達的宿主時(見圖6)，由外源蛋白在半乳糖誘導型啟動子調控下過表達引起的外源蛋白的胞內不溶性沉淀相對下降。此外，還通過分泌入培養(yǎng)基中的外源蛋白的HPLC分析，確認了在外源蛋白的不溶性沉淀在實踐培養(yǎng)條件下降低的同時，外源蛋白的胞外分泌和分泌效率的增加——本發(fā)明的最終目的——也被實現(xiàn)(見圖7)。在本發(fā)明的一個實施方式中，即使具有半乳糖通透酶基因缺失的酵母菌株被用于降低半乳糖的胞內流入，抑制半乳糖通透酶基因功能的反義、siRNA、抗體、拮抗劑等也可被用于同一目的。對于合適地調節(jié)半乳糖的胞內可用性，本發(fā)明人已經采取了這樣的策略，其中導致分解代謝物阻抑(當葡萄糖是細胞的培養(yǎng)基環(huán)境中的主要碳源時，促進葡萄糖利用的某些糖代謝基因的表達的抑制)的葡萄糖和用作半乳糖誘導型啟動子的誘導物的半乳糖被"共給料"入分批補料培養(yǎng)基，以誘導兩種糖的同步消耗，使得外源蛋白的過表達依靠一部分包含在培養(yǎng)基中的葡萄糖，由分解代謝物阻抑適當調節(jié)。圖1是示意性圖表，其說明了半乳糖和葡萄糖對細胞中半乳糖誘導型啟動子的誘導和抑制的兩種相反的作用(K.-D.Entian和H.-J.Schuller,GlucoseRepressioninYeast.In:7"eos/Swg<arMetoZ)o/&m,F.K.Zimmermann，K.-D.Entian.,eds.pp.409-434.TechnomicPublishingAG,Bassel,Switzerland1997)。就此而論，經由適于維持培養(yǎng)基中葡萄糖濃度低于0.1g/L的葡萄糖限制型分批補料培養(yǎng)，通過加入混合碳源，防止了葡萄糖對半乳糖誘導型啟動子的完全抑制。本發(fā)明人將上述方法稱為混合碳源補料策略。在本發(fā)明中，細胞在含有各種比例的葡萄糖/半乳糖的分批補料培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并且對于每一種情況，人工調控外源蛋白的分泌。此外，在不同比例的葡萄糖/半乳糖下，所分泌的外源蛋白的量進行了比較，從而確認在具有不同的半乳糖轉化能力的酵母宿主菌株中外源蛋白分泌所需的最適葡萄糖/半乳糖比(見下文的表1禾口2)。相比于僅使用半乳糖作為唯一碳源的常規(guī)表達誘導法，當本發(fā)明所設計的混合碳源補料方法被用于酵母宿主A和B時，每細胞的外源蛋白產率以及每誘導物的外源蛋白產率分別增加了105%(表l)和85%(表2)。此外，當前述的轉化酵母菌株A和B通過應用所述混合碳源補料方法分別進行分批補料培養(yǎng)時，揭示了存在不同的最適葡萄糖/半乳糖濃度。具有相對高的半乳糖胞內流入和消耗速率的轉化酵母菌株A對于外源蛋白的最適分泌表現(xiàn)出大約1:1葡萄糖/半乳糖比的混合碳源，而由于半乳糖通透酶的無操作而具有降低的半乳糖轉運能力的轉化酵母菌株B表現(xiàn)出12大約2:3的最適比的混合碳源(葡萄糖/半乳糖)，從而相比于轉化酵母菌株A需要培養(yǎng)基中相對高比例的半乳糖(見表1和2)。結果間接證明了在使用半乳糖誘導型啟動子的外源蛋白表達系統(tǒng)中半乳糖轉運能力和混合碳源對外源蛋白表達的影響與本發(fā)明的目的很好地一致。另一方面，本發(fā)明人進行了研究，以確認通過用編碼被稱為蛋白質折疊助手的蛋白質二硫鍵異構酶的基因(PD/7)連同在半乳糖誘導型啟動子調控下表達的外源基因構建體轉化宿主細胞，蛋白質分泌效率是否得到提高。首先，含有SEQIDNO:9所示的釀酒酵母蛋白質二硫鍵異構酶基因(尸Z^)的表達載體pMPDIl被構建，并且所得到的表達載體連同外源基因構建體被分別轉化入酵母宿主菌株A和B。然后，轉化酵母菌株在含半乳糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并測定蛋白質分泌效率(見表3).結果，可以看出，用外源基因構建體和pMPDIl載體轉化酵母宿主A相對于對照組(未參入尸D/7基因的酵母宿主A)在蛋白質分泌效率上表現(xiàn)出30%的增加，而使用酵母宿主B的轉化相對于對照組在蛋白質分泌效率上表現(xiàn)出72%的增加。如上文所詳細描述，根據本發(fā)明提高外源蛋白的分泌效率的方法使得能夠經由適度調控細胞中作為半乳糖誘導型啟動子的誘導物發(fā)揮作用的半乳糖的水平，通過降低在基于半乳糖誘導型啟動子的常規(guī)酵母表達系統(tǒng)中遇到的外源蛋白質的過表達引起的不溶性沉淀，提高重組外源蛋白的分泌效率。因此，本發(fā)明的方法可有效地用于提高重組外源蛋白在酵母表達系統(tǒng)中的產率并降低生產成本。發(fā)明方式實施例現(xiàn)在，將參考下列實施例，更詳細地描述本發(fā)明。這些實施例僅僅被提供來闡述本發(fā)明，并且不應該被解釋成限制本發(fā)明的范圍和精神。實施例1:在酵母宿主A和B之間胞內半乳糖轉運能力的比較酵母宿主A(釀酒酵母2805，基因型M47bpep(v//^3;rW-J7.d^his3-雄0ura3-52GAL2canl,Sohn,J.H.尸亂所oc/亂，30:653-660,1995;和Kim,T.H.&a/."/ofec/2"0/.丄故.24:279-286，2002)和酵母宿主B(釀酒酵母BJ3501，基因型MATa;ep(:///513A67/nW-zl200wra_5-52ga/2ca"7，ATCC208280，USA)在YPD瓊脂板上劃線，并在30。C下置于培養(yǎng)箱中約18小時，以及分離集落。酵母宿主A和B的每一集落被接種入單獨的YPG[酵母提取物1%(w/v)、蛋白胨2%(w/v)和半乳糖2%(w/v)]液體培養(yǎng)基并在3(TC下在培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)約80小時。為了測定半乳糖隨吋間的消耗，通過經由3,5-二硝基水楊酸(DNS)分析定量還原糖，測定培養(yǎng)基中的殘留半乳糖濃度(Mohun，A.F.和Cook,I.J.,J.C//".尸fl〃w/.，15:169-180，1962,見圖3)。圖3是當除了Ga/2基因缺陷外各自具有相同遺傳背景的兩種酵母宿主在作為唯一碳源的半乳糖供應的情況下進行培養(yǎng)時，比較隨時間變化的半乳糖消耗速率的曲線圖。由圖3可見，相比于其中G^/2基因正常發(fā)揮功能的酵母宿主A，GW2基因缺陷型酵母宿主B表現(xiàn)出每單位時間的半乳糖消耗速率下降得到了確認。實施例2:使用酵母宿主A和B構建分泌外源蛋白的酵母轉化體2-1.使用酵母宿主A，構建分泌外源蛋白的酵母轉化體釀酒酵母2805/M5LK8使用被本發(fā)明人用來在巴斯德畢赤酵母(/^/n'apwto&)中產生重組LK8的表達載體pMBRI-LK8(韓國專利公布特許公開2004-0069840)，進行ot-因子分泌信號和LK8cDNA的共分離。該申請通過引用以其全部內容并入本文。pMBRI-LK8載體用￡coRI處理7小時，并使用PCR純化試劑盒(Qiagen,USA)進行洗滌。然后，該載體用萬awHI處理7小時，而DNA通過凝膠電泳進行分離。使用凝膠提取試劑盒(Qiagen,USA)，獲得DNA片段，其具有a-因子分泌信號SEQIDNO:4和LK8cDNA序列SEQIDNO:16。如此獲得的DNA片段被插入p426GALl(ATCC87833,USA)載體的啟動子和CYC1終止子之間，從而構建表達載體pMCLK8(6.9kb)，其可被用于在酵母中產生重組LK8。所產生的載體pMCLK8含有啟動子，其因此允許通過半乳糖誘導蛋白表達。在酵母轉化之后，使用t/W3標記作為選擇標記，在選擇培養(yǎng)基中選擇轉化體。之后，為了將由a-因子分泌信號序列和LK8cDNA組成的表達盒插入酵母染色體中，該表達盒被插入含有S序列和用來如下選擇插入的載體的新霉素抗性基因(")的p5neo載體(Lee，F(xiàn).W.和DaSilva,N.A.，^p/.M/cra&o/.B/ofec/mo/.，48:339，1997)，以便確保期望的基因可被插入5序列——位于酵母染色體中的轉座元件之首先，分別使用切割啟動子和Crc7終止子兩端的限制酶&cI禾口X/wI，由pMCLK8載體分離LK8表達盒。在本文中，由于LK8表達盒和pSneo載體的序列都含有5"a/1限制性位點并且在pSneo載體上存在的SWI限制性位點基本上是將該載體整合入酵母染色體所必需的，所以DNA平端試劑盒(DNAbluntingkit(Takara，Japan))被用來除去在LK8表達盒上存在的1限制性位點。另一方面，因為p5neo載體不含有I限制性位點，上述的DNA平端試劑盒被用來將pSneo載體的I限制性位點和分離的LK8表達盒的Xp/7I限制性位點都轉化成平端。然后，如此平端化的LK8表達盒和p5neo載體用連接酶連接，以構建重組載體，其被命名為M5LK8重組表達載體(圖2)。圖2是用于本發(fā)明的重組LK8蛋白表達載體的切割圖譜。.之后，使用AlkaliCationYeastTransformationKit(Q-BIOgene，Canada)，用上述重組M5LK8表達載體轉化釀酒酵母2805(Sohn，J.H."a/.Proc.5/oc/化附.，30:653-660,1995;禾口Kim，T.H.&a/"歷0,ec/2w0/.丄e仏，24:279-286,2002)。使用含有抗生素G418硫酸鹽(antibioticG418sulfate)的YPD板[2%(w/v)蛋白胨、1%(w/v)酵母提取物、2。/。(w/v)葡萄糖和2%(w/v)瓊脂]，選擇用M5LK8重組表達載體轉化酵母菌株。G418硫酸鹽的濃度被分別調節(jié)到5g/L、10g/L和15g/L，從而選擇最高抗生素抗性的酵母菌株，其被命名為釀酒酵母2805/M5LK8。在下文中，為了簡潔和方便，該酵母菌株將被稱為"轉化酵母A"。2-2:使用酵母宿主B，構建分泌外源蛋白的酵母轉化體釀酒酵母BJ3501扁LK8根據如實施例2-1相同的方式，釀酒酵母BJ3501(ATCC208280,USA)——除了(^4丄2基因缺陷外其具有與釀酒酵母2805相同的基因型——用實施例2-l中構建的重組表達載體MSLK8進行轉化。然后，進行集落篩選，以選擇具有最高分泌效率的克隆，其最終被命名為釀酒酵母BJ3501/MSLK8#36，并保藏于韓國典型培養(yǎng)物保藏中心(KCTC)，KoreaResearchInstituteofBioscienceandBiotechnology(KRIBB，Daejon，Korea),保藏號為KCTC10582BP(保藏于2004年1月13日)。在下文，為了簡潔和方便起見，該轉化體菌株將被稱為"轉化酵母菌株B"。實施例3:使用半乳糖作為碳源，比較在分批補料培養(yǎng)中轉化酵母菌株A和B的外源蛋白分泌能力在使用半乳糖分批補料培養(yǎng)實施例2中的酵母轉化體A和B的情況下，進行下列的分析，以比較外源蛋白的分泌效率。首先，作為主種子的轉化酵母菌株在1至3vvm的空氣和200至1000rpm下，在添加有2%(w/v)葡萄糖的YPD[酵母提取物1%(w/v)和蛋白胨2%(w/v)]培養(yǎng)基中進行種子培養(yǎng)24小時，使得可以獲得期望的細胞量和活性(20-倍稀釋，00600=0.8至1.2)。在YPD培養(yǎng)基中進行種子培養(yǎng)之后，種子培養(yǎng)溶液被接種入起始培養(yǎng)基。首先，分批培養(yǎng)階段是細胞生長期以及對被用作外源蛋白LK8的表達誘導物的半乳糖的適應期。為了這個目的，細胞被給予半乳糖適應期，同時通過接種超過1%(v/v)的種子培養(yǎng)溶液和供應作為碳源的葡萄糖和半乳糖，使得細胞發(fā)生增殖。在本文中，起始培養(yǎng)基由2n/。(w/v)葡萄糖、3%(w/v)半乳糖、4。/。(w/v)酵母提取物、0.5。/。(w/v)酪蛋白氨基酸、0.5g/L尿嘧啶和0.5g/L組氨酸組成。在分批培養(yǎng)階段，供應給起始培養(yǎng)基的碳源耗盡后，細胞的呼吸作用(氧消耗)下降，這通過由提供于發(fā)酵器上溶解氧探針表征的溶解氧水平的急劇增加而得到確認。從該時間點，使用DO-stat補料策略，加入含有半乳糖作為唯一碳源的培養(yǎng)基，進行分批補料培養(yǎng)。進行該分批補料培養(yǎng)，以進一步增加細胞濃度，并進一步持續(xù)維持外源蛋白的表達誘導期，從而提高外源蛋白的產率。具體而言，由50。/。(w/v)半乳糖、30g/L酵母提取物、20g/L蛋白胨、1g/L尿嘧啶和2g/L組氨酸組成的分批補料培養(yǎng)基被使用(分批補料培養(yǎng)基I)。為了誘導外源蛋白LK8的高水平分泌，通過以1mL/h至30mL/h的速率補給半乳糖，在培養(yǎng)基中殘留半乳糖的量被維持在5%(w/v)以下。通過測定培養(yǎng)基中半乳糖的殘留濃度并基于如此得到的值加入合適量的半乳糖從而維持殘留半乳糖的水平在合適的值，進行半乳糖補料。通過調控半乳糖的添加，LK8的表達和分泌可以被持續(xù)增強，同時在整個期中維持發(fā)酵器中殘留半乳糖的濃度在5%(w/v)以下。分批補料培養(yǎng)法在相同培養(yǎng)條件下被應用于在實施例2構建的轉化酵母菌株A和B，并且，在兩個酵母組之間就酵母的半乳糖轉運能力方面比較外源蛋白的表達和分泌曲線。首先，為了比較在酵母細胞中累積的外源蛋白的分布曲線，對在給定培養(yǎng)時間點下從兩組酵母組收集的培養(yǎng)樣品進行使用抗-LK8抗體的蛋白質印跡分析。為了這個目的，在培養(yǎng)期間周期性收集的每一轉化酵母菌株被調節(jié)至相同的量，在相同體積的樣品緩沖液中煮沸，并在SDS-聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳，以展開胞內蛋白質。如此展開的蛋白質被轉移至硝化纖維素膜。為了進行印跡，硝化纖維素膜被放入添加了含有0.1%(v/v)Tween2(f和5%(w/v)脫脂乳的PBS緩沖液的溶液，其在室溫下溫和攪拌2小時。之后，將兔抗LK8Ab加至同一溶液，然后該溶液在室溫下溫和攪拌1小時，并用含有0.1%(v/v)Tween20@的PBS緩沖液重復洗滌五次。接下來，抗兔IgG-HRP(抗兔IgG-辣根過氧化物酶，Sigma，USA)被加入添加了含有0.1%(v/v)Tween2(f和5%(w/v)脫脂乳的PBS緩沖液的溶液，并且如此處理的硝化纖維素膜被浸入其中抗兔IgG-HRP被加入的溶液中，并在室溫下溫和攪拌1小時。然后，膜用含有0.1。/c)(v/v)Tween2(f的PBS緩沖液重復洗滌五次。取出膜，并使其在加入檢測溶液的化學發(fā)光檢測試劑盒(SuperSignalTMWestPicokit,Pierce,USA)中經歷發(fā)光反應，并固定在感光膜上。檢查膜上的陰影(見圖4、5和6)。圖4是照片，其示出了外源基因在轉化酵母菌株A中表達后，具有表達誘導期的胞內總外源蛋白的蛋白質印跡分析結果；圖5是照片，其示出了轉化酵母菌株A中胞內水溶性外源蛋白的蛋白質印跡分析結果；以及圖6是照片，其示出外源基因在轉化酵母菌株B中表達后，具有表達誘導期的胞內總外源蛋白的蛋白質印跡分析結果。如圖4中所示，可以看出，當半乳糖轉運能力由于04丄2基因的正常操作而處于正常時，誘導外源基因表達的分批補料培養(yǎng)的持續(xù)導致了較高的外源蛋白胞內累積。然而，如圖5中所示，可以看出，當?shù)鞍踪|印跡僅進行來分析細胞中的水溶性蛋白質時，外源蛋白質隨著時間的過去主要是17不可溶蛋白質的形式，而不是可溶蛋白質的形式。另一方面，如圖6所示，可以看出，由于基因缺陷而具有降低的半乳糖轉運能力的酵母菌株B在表達期內表現(xiàn)出外源蛋白的胞內累積下降。為了確認圖6的結果是由于具有(^/2基因缺陷的轉化酵母菌株B中外源蛋白的分泌效率增加所致，還是由于蛋白質表達水平的總體下降所致，在實施例2中構建的轉化酵母菌株A和B在相同的培養(yǎng)條件下進行分批補料培養(yǎng)，并且對細胞培養(yǎng)物進行高效液相色譜(HPLC)分析，以量化分泌的外源蛋白。首先，離心細胞培養(yǎng)物，并通過0.2，的過濾器過濾所得到的上清液。然后，在HPLC中在214nm的波長下，使100W的過濾樣品經歷吸光度(OD)測定。通過反相分離柱(VydacTMc18柱，GraceVydac,USA)，使用展開劑"~例如含1%(w/v)三氟乙酸(TCA)的乙腈和含1%(w/v)TCA的水^作為流動相，分離外源蛋白LK8。在本文中，流動相由從25%(Wv)開始至40%(v/v)的乙腈梯度組成，從而能夠利用疏水相互作用分離具有單峰的純外源蛋白質。此外，在通過二辛可寧酸(bicinchoninicacid,BCA)分析測定作為標準物的高純度外源蛋白后，可以獲得HPLC中的面積積分以及外源蛋白濃度的校準曲線。使用如此得到的校準曲線，使該無細胞培養(yǎng)上清液進行HPLC分析，從而計算積分面積，并且所得到的值被應用于使用標準樣品(LK8)的校準曲線，從而量化培養(yǎng)上清液中的外源蛋白(圖7)。圖7是曲線圖，其比較了通過補料分批培養(yǎng)轉化酵母菌株A和B進行外源基因表達后，在表達誘導期內分泌入培養(yǎng)基中的重組外源蛋白的量。在該曲線圖中，實心圓(-i)表示在轉化酵母菌株A(釀酒酵母2805/M5LK8)中重組外源蛋白的胞外分泌，而空心正方形(-口-)表示轉化酵母菌株B(釀酒酵母BJ3501/M5LK8)中重組外源蛋白的胞外分泌。如圖7所示，可以看出，相比于半乳糖轉運功能正常的轉化酵母菌株A的蛋白質胞外分泌，半乳糖轉運降低的轉化酵母菌株B的蛋白質胞外分泌表現(xiàn)出2倍以上的增加。實施例4:混合碳源補料對轉化酵母菌株A中半乳糖誘導型啟動子活性阻抑的影響以及外源蛋白分泌收率的比較儲存于-70。C下的實施例2-1的轉化酵母菌株A以5至10%(v/v)的濃度接種在10mLYPD培養(yǎng)基上，并在30。C和180rpm下在振蕩培養(yǎng)箱中進行種子培養(yǎng)24小時(第一種子培養(yǎng)期)。然后，培養(yǎng)的細胞在200mLYPD培養(yǎng)基中傳代，并在相同的培養(yǎng)條件下進行種子培養(yǎng)24小時(第二種子培養(yǎng)期)。在由4。/。(w/v)酵母提取物、3%(w/v)酪蛋白氨基酸、0.05%(w/v)組氨酸、0.05%(w/v)尿嘧啶、2%(w/v)葡萄糖和3。/。(w/v)半乳糖組成的培養(yǎng)基中進行分批培養(yǎng)，同時分別調節(jié)培養(yǎng)條件至30°C、600rpm和pH5.0。通過根據溶解氧的量改變攪拌器的速度，調控所述分批培養(yǎng)。在分批培養(yǎng)的后期，溶解氧下降，原因在于細胞呼吸旺盛。為了防止溶解氧的下降，調控空氣供應和攪拌速度，以使溶解氧保持高于最大溶解氧的40%，直至分批培養(yǎng)完成。之后，在由3%(w/v)酵母提取物(Difco，USA)、2%(w/v)蛋白胨(Difco，USA)、0.2%(w/v)組氨酸(Sigma,USA)和0.1%(w/v)尿嘧啶(Sigma,USA)組成的培養(yǎng)基中進行分批補料培養(yǎng)。作為對照組，半乳糖的濃度被調節(jié)至50。/。(w/v)。對于葡萄糖和半乳糖之比為l:4的實驗組，葡萄糖和半乳糖被分別加至10%(w/v)葡萄糖和40。/。(w/v)半乳糖的濃度。對于葡萄糖和半乳糖之比為1:1的實驗組，葡萄糖和半乳糖被分別加至25。/。(w/v)葡萄糖和25%(w/v)半乳糖的濃度。對于葡萄糖和半乳糖之比為4:1的實驗組，葡萄糖和半乳糖被分別加至40%(w/v)葡萄糖和10%(w/v)半乳糖的濃度。通過調控液體培養(yǎng)基的供應速度以確保溶解氧被維持在最大溶解氧的20至80%的水平、培養(yǎng)基中剩余總還原糖(半乳糖+葡萄糖)的濃度被維持在0.5至5%(w/v)的水平以及葡萄糖濃度被維持在0.1g/L以下，進行分批補料培養(yǎng)。在分批培養(yǎng)和分批補料培養(yǎng)期間，樣品被定期收集，并進行在600nm處的OD測定、碳源測定和分泌外源蛋白(LK8)的量化(表l)。通過測量培養(yǎng)基中葡萄糖和半乳糖的殘留量，進行碳源測定。首先，通過使用葡萄糖分析試劑盒(Glucose-EKit,目錄號BC103-E，Young-DongPharm.,Seoul,Korea)的酶促方法，如下進行葡萄糖濃度的測定。收集的樣品在12,000ipm下離心，并取出所得到的上清液?；旌习谑褂盟雒复俜ǖ纳鲜龇治鲈噭┖兄械膌OOmL稀釋的PGO酶粉(過氧化物酶10011+葡萄糖氧化酶500U)、以及100mL的緩沖液，以制備顯色試劑。20W的葡萄糖標準樣品被加入3mL的顯色試劑。根據如上所述的相同方法，20W的分析樣品也被加入該顯色試劑。所得到的混合物在37C下反應5min，并在505nm的波長下測定每一樣品的吸光度(OD)。葡萄糖標準樣品和分析樣品的吸光度值被應用于給定的方程，并計算培養(yǎng)基中殘留葡萄糖的量。通過測量總還原當量的DNS(3，5-二硝基水楊酸)分析，測定培養(yǎng)基中的總碳源。葡萄糖和半乳糖都是還原糖，并對相同當量的DNS顯色試劑都表現(xiàn)出相同的應答。100W的分析樣品被加至1mL的DNS試劑，其中基于總共300mL的該DNS試劑，2M氫氧化鈉、0.25g3，5-二硝基水楊酸和75g酒石酸鈉鉀被加入。隨后煮沸該混合物約5分鐘，并測量550nm下的吸光度，以測定培養(yǎng)基中剩余的總碳源。以與實施例3中相同的方式，通過HPLC分析，測定分泌入培養(yǎng)基中的外源蛋白的量。表l在不同比例的半乳糖和葡萄糖下分批補料培養(yǎng)轉化酵母菌株A后的每細胞產率和每誘導物產率培養(yǎng)基中葡萄糖:半乳糖消耗的總分泌的細胞生長Yp/i1)Yp/x2)的重量比半乳糖LK8(OD600)(mg/g)(mg/L/OD)(g)(mg/L)對照(僅半乳糖)2701001200.370.831:42001141000.571,141:1190」150880.791.704:17844770.560.57"Yp/i:每誘導物產率(誘導物產率)，單位每表達誘導物(半乳糖)的分泌外源蛋白量2)Yp/x:每細胞產率(產品產率)，單位每細胞的分泌外源蛋白量當在完成分批培養(yǎng)之后在僅半乳糖作為碳源的情況下以及在具有不同比例的半乳糖和葡萄糖的情況下進行分批補料培養(yǎng)時，分別比較細胞生長、碳源消耗和外源蛋白分泌。如表1所示，相比于其它實驗組，僅使用半乳糖作為唯一碳源的分批補料培養(yǎng)表現(xiàn)出可達約100mg/L的濃度的外源蛋白(LK8)胞外分泌，并顯示出最高的細胞生長(OD600=120)。當細胞在1:4的葡萄糖和半乳糖下分批補料培養(yǎng)時，外源蛋白的分泌表現(xiàn)出可達114mg/L的水平，而每添加的表達誘導物(半乳糖)的外源蛋白分泌增加40%。添加的葡萄糖在進行分批培養(yǎng)的24小時內被完全消耗，并且在分批補料培養(yǎng)期間加入的葡萄糖也被立即消耗，以保持0.1g/L以下的殘留濃度。相比于其它實驗組，經在1:1的葡萄糖和半乳糖下分批補料培養(yǎng)，LK8的分泌顯示出可達約150mg/L的最大值。此夕卜，確認了相比于對照組，胞外分泌增加50%，并且每細胞產率(Yp/x:mg/L/OD纖)和每誘導物產率(Yp/i，mg/g)分別增加104%和114%，從而確認了外源蛋白分泌效率的增加。經在4:1的葡萄糖和半乳糖下分批補料培養(yǎng)，外源蛋白的表達和分泌受到抑制，原因在于高比例的葡萄糖，從而僅表現(xiàn)出約44mg/L的最大分泌。實施例5:混合碳源補料對轉化酵母菌株B中半乳糖誘導型啟動子活性阻抑的影響以及外源蛋白分泌收率的比較除了實施例2-2中構建的轉化酵母菌株B被用作菌株之外，分別比較當在僅半乳糖作為碳源的情況下以及在具有不同比例的半乳糖和葡萄糖的情況下進行轉化酵母菌株B的分批補料培養(yǎng)時，細胞生長、碳源消耗和外源蛋白分泌(見表2)。表2在不同比例的半乳糖和葡萄糖下分批補料培養(yǎng)轉化酵母菌株B后的每細胞產率和每誘導物產率<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>"Yp/i:每誘導物產率(誘導物產率)，單位每表達誘導物(半乳糖)的分泌外源蛋白量2)Yp/x:每細胞產率(產品產率)，單位每細胞的分泌外源蛋白量如表2所示，僅使用半乳糖作為唯一碳源的分批補料培養(yǎng)表現(xiàn)出約250mg/L的濃度的外源蛋白(LK8)胞外分泌。當在1:4的葡萄糖和半乳糖下進行分批補料培養(yǎng)時，外源蛋白的分泌表現(xiàn)出可達300mg/L的水平。此外，葡萄糖在進行分批培養(yǎng)的24小時內被完全消耗，并且在分批補料培養(yǎng)期間加入的葡萄糖也被立即消耗。經在2:3的葡萄糖和半乳糖下分批補料培養(yǎng)，LK8的最大分泌出現(xiàn)在160小吋的時間點，并且反應細胞生長的吸光度為OD6。(^47。與糖累積有關，還確認了葡萄糖和半乳糖都被用作碳源。外源蛋白的最大分泌量是約350mg/L，從而表明達到該最大分泌量的時間相比于其它實驗組最短。此夕卜，確認了相比于對照組，外源蛋白分泌增加40%，并且每細胞產率(Yp/x:mg/L/OD6o。)和每誘導物產率(Yp/i,mg/g)分別增加293%和85%，從而確認了外源蛋白分泌效率的顯著增加。相比于其它實驗組，經在1:1的葡萄糖和半乳糖下分批補料培養(yǎng)，細胞生長最活躍。此外，LK8的分泌量顯示出顯著高的可達約350mg/L的值。然而，經與顯示出相似的最大分泌量、使用2:3的葡萄糖和半乳糖的實驗比較，使用1:1的葡萄糖和半乳糖的實驗經過大約380小時來達到350mg/L的分泌量，這表明需要大約2.5-倍長的培養(yǎng)期來達到外源蛋白的同一最大分泌水平。經在3:2的葡萄糖和半乳糖下分批補料培養(yǎng)，細胞生長相對高，而糖消耗也活躍。然而，外源蛋白的表達和分泌受到抑制，原因在于高比例的葡萄糖，從而僅表現(xiàn)出約140mg/L的最大分泌。實施例6:在酵母菌株A和B中經由P2>/7基因的過表達來增加外源蛋白的分泌效率6-1.PD/7-共表達菌株的構建6-1-1.尸D/7表達載體的構建為了確?？赏ㄟ^半乳糖誘導表達蛋白質二硫鍵異構酶(PDI)，根據下列方法，編碼蛋白質二硫鍵異構酶的尸D/7基因被插入含有a4U0啟動子的表達載體首先，為了除去2p酵母復制原點，用M""I和S加BI切割pESC-URA(Stratagene,USA),并用DNA聚合酶(Klenow片段，NewEnglandBiolabs，USA)處理，從而使所得到的5.9-kb平末端DNA片段再連接，以獲得優(yōu)化的載體pMK71。使用得到的載體pMK71、作為模板的釀酒酵母2805-衍生染色體、以及兩個引物PDI1F:5'-ATAAGAATGCGGCCGCCATACATCTATCCCGTTATGAAG-3'(SEQIDNO:17)禾口PDI1R:5'國GGACTAGTTTACAATTCATCGTGAATGGCATC-3'(SEQIDNO:18)，進行PCR，以獲得含有尸D/7基因的1.7-kbDNA片段，所述尸Z)//基因具有M/IA爾eI限制性切割位點并如SEQIDNO:9所示。然后，線性化的pMK71和1.7-kbDNA片段分別用MfI和I切割，而切割的產物互相連接，以構建尸D/7基因表達載體，其被命名為pMPDIl(圖8)。圖8是pMPDIl表達載體的切割圖譜，所述pMPDIl表達載體適于在外源蛋白在酵母中表達后允許通過半乳糖進行蛋白質二硫鍵異構酶(尸D/"共表達。6-1-2.PZ)/7-共表達LK8生產菌株的構建轉化酵母菌株A和B分別用在實施例6-1-1中構建的載體pMPDIl轉化。"f吏用AlkaliCationYeastTransformationKit(Q-BIOgene,Canada),禾艮據生產商的說明，進行轉化。如此轉化酵母菌株分別被稱為釀酒酵母2805/MSLK8/PDI和釀酒酵母BJ3501/MSLK8/PDI。6-2.尸￡>/7對外源蛋白分泌的共表達效應以及酵母菌株A和B之間的比較為了比較基因對外源蛋白分泌的共表達效應，轉化酵母菌株A和B以及pMPDIl-轉化酵母菌株A和B(釀酒酵母2805/M5LK8/PDI和釀酒酵母BJ3501/M5LK8/PDI)在-7(TC儲藏下取出，然后以與實施例3相同的方式進行分批補料培養(yǎng)，以誘導外源蛋白質的表達和分泌(見表3)。表3在存在或不存在P"i7基因共表達的情況下，在轉化酵母菌株A和B中外源蛋白的最大胞外分泌之比較<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>"對照無PD/;的共表達由表3可見，釀酒酵母2805/M5LK8表現(xiàn)出100mg/L的LK8分泌，而釀酒酵母2805/M5LK8/尸Di7表現(xiàn)出130mg/L的LK8分泌，因此表明，在釀酒酵母2805/M5LK8/尸D/7中實現(xiàn)了更高的外源蛋白分泌。此外，另一酵母菌株釀酒酵母BJ3501/M5LK8表現(xiàn)出250mg/L的LK8分泌，而釀酒酵母8)3501/1^31^8/尸1)//表現(xiàn)出43011^/1^的1^8分泌，從而進一歩表明在具有尸D/7共表達的酵母菌株中，外源蛋白的分泌更高。也就是說，在兩種不同的菌株，具有戶D//共表達的酵母菌株表現(xiàn)出比無尸D//共表達的酵母菌株更高的LK8分泌量。盡管為了說明的目的，已經公開了本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，但本領域普通技術人員將理解，不背離如所附權利要求所公開的發(fā)明的范圍和精神，各種變化、添加和替換是可能的。序列表序列表以電子形式附上24<formula>formulaseeoriginaldocumentpage25</formula>權利要求1.一種提高外源蛋白的分泌效率的方法，其包括步驟(a)用重組外源基因構建體轉化酵母宿主，所述構建體包含半乳糖誘導型啟動子、分泌信號序列和編碼外源蛋白的基因，以構建轉化酵母菌株；和(b)在所述半乳糖誘導型啟動子的活性受到調控的條件下培養(yǎng)所述轉化酵母菌株。2.根據權利要求1所述的方法，其中通過將重組外源基因構建體插入所述酵母宿主的染色體或者通過將所述重組外源基因構建體以環(huán)狀載體的形式引入所述酵母宿主的細胞質，進行步驟(a)的所述轉化。3.根據權利要求1所述的方法，其中所述半乳糖誘導型啟動子是SEQIDNO:1所示的啟動子、SEQIDNO:2所示的G14丄川啟動子、或SEQIDNO:3所示的04丄7啟動子。4.根據權利要求1所述的方法，其中通過降低半乳糖從培養(yǎng)基進入所述轉化酵母菌株的轉運速率對步驟(b)中所述半乳糖誘導型啟動子活性進行調控。5.根據權利要求4所述的方法，其中通過使所述轉化酵母的半乳糖通透酶基因缺陷或部分破壞從而使其成為非功能性的來降低半乳糖從培養(yǎng)基進入所述轉化酵母菌株的轉運速率。6.根據權利要求1所述的方法，其中在步驟(b)中所述半乳糖誘導型啟動子的活性受到調控的條件是在培養(yǎng)時向所述培養(yǎng)基以給定比例共添加半乳糖和葡萄糖。7.根據權利要求6所述的方法，其中所述培養(yǎng)通過分批補料培養(yǎng)進行。8.根據權利要求6所述的方法，其中所述半乳糖和葡萄糖的比例在4:1至1:1的范圍內。9.根據權利要求1所述的方法，其中所述酵母宿主用重組外源基因構建體轉化，所述重組外源基因構建體含有在半乳糖誘導型啟動子的調控下表達的蛋白質二硫鍵異構酶編碼基因。10.根據權利要求1所述的方法，進一步在步驟(a)和(b)之間包括步驟(a-l):用含有在半乳糖誘導型啟動子的調控下表達的蛋白質二硫鍵異構酶編碼基因的重組外源基因構建體進一步轉化步驟(a)的轉化酵母菌株。11.根據權利要求9或10所述的方法，其中所述含有編碼蛋白質二硫鍵異構酶的基因的構建體是具有圖8所示的切割圖譜的pMPDI。全文摘要提供了提高重組外源蛋白在酵母表達系統(tǒng)中的分泌效率的方法。該方法包括用重組外源基因構建體轉化酵母宿主以構建轉化的酵母菌株，所述重組外源基因構建體包含半乳糖誘導型啟動子、分泌信號序列和編碼所述外源蛋白的基因；和在所述半乳糖誘導型啟動子的活性受到調控的條件下培養(yǎng)所述轉化酵母菌株。通過經由適度調控作為半乳糖誘導性啟動子的誘導物在細胞中起作用的半乳糖的水平，降低基于半乳糖誘導型啟動子的常規(guī)酵母表達系統(tǒng)所經歷的重組外源蛋白的過表達引起的不溶性沉淀，可以實現(xiàn)重組外源蛋白分泌效率的提高。由于重組外源蛋白分泌效率的提高，本發(fā)明有助于提高重組外源蛋白在酵母表達系統(tǒng)中的產率以及降低生產成本。文檔編號C12N15/10GK101473035SQ200680055047公開日2009年7月1日申請日期2006年6月20日優(yōu)先權日2006年6月20日發(fā)明者林瀅權,金圣根申請人:財團法人牧巖生命工學研究所