專利名稱：減毒重組體新城疫病毒及包含該病毒的疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于轉(zhuǎn)錄新城疫病毒(NDV)基因組的重組體載體、 一種由該載體制備的具有致病性NDV表面抗原的減毒重組體NDV毒 林、 一種使用該栽體制備的具有低致病性和抗新城疫病(ND)的高防護(hù) 效力的重組體NDV的方法以及一種包含該重組體NDV的ND疫苗。
背景技術(shù)：
新城疫病(ND)——已知為最重要的國(guó)際上已知的家畜疾病類之 一——是一種急性熱呼吸系統(tǒng)疾病，并且按照韓國(guó)規(guī)定(by law in Korea) 為第一級(jí)傳染病。如果未免疫家禽的感染，則死亡率為100%。由于新城 疫病毒(NDV)在韓國(guó)普遍存在，預(yù)計(jì)消滅該疾病會(huì)有許多困難。同時(shí)， 因?yàn)槎喾N新城疫病毒廣泛分布在東南亞、中國(guó)和中國(guó)臺(tái)灣，而這些地區(qū)都 與韓國(guó)貿(mào)易活躍，并且因?yàn)檫@些病毒是潛在的十分危險(xiǎn)的因素，所以存在 開發(fā)亞洲型新城疫病疫苗的迫切需求。
新城疫病毒(NDV)是一種單鏈RNA病毒，屬于禽副粘病毒 (Jvw/m^"s)屬。新城疫病毒的包膜包括使該病毒與宿主結(jié)合的血凝素-神經(jīng)氨酸酶(HN)蛋白，以及使包膜與宿主細(xì)胞融合的融合(F)蛋白。 F和HN蛋白均是糖蛋白并均分布于所述病毒包膜的表面上。
F蛋白屬于I型膜糖蛋白組并形成一個(gè)三聚體結(jié)構(gòu)(三聚體)。F蛋白 形成為一種無活性前體形式(FO)，并且在該前體F0分子經(jīng)過高爾基膜時(shí)被分成二硫鍵連接的亞基Fl和F2。該過程在所述Fl亞基的氬基末端 暴露一個(gè)疏水結(jié)構(gòu)域，其中該結(jié)構(gòu)域在成熟蛋白的生物活性中發(fā)揮重要功 能。被稱為融合肽的該疏水結(jié)構(gòu)域在副粘病毒的F蛋白中是高保守的，并 且直接參與膜融合。副粘病毒的F蛋白包括共有的結(jié)構(gòu)特征，例如七肽重 復(fù)區(qū)域以及能夠形成oc螺旋結(jié)構(gòu)的兩個(gè)區(qū)域。所述重復(fù)區(qū)域的最長(zhǎng)七肽重 復(fù)區(qū)域A與Fl的N末端疏水融合肽相鄰，七肽重復(fù)區(qū)域B由一系列在 每7個(gè)殘基處高度保守的亮氨酸或異亮氨酸(Isoleusine)構(gòu)成。
HN蛋白屬于II型膜糖蛋白，并且在病毒包膜的表面上形成四聚體， 以穿透it^v細(xì)胞膜中(Gorman et al.， 1988; Ng et al.， 1989 )。 HN蛋白通 過結(jié)合于糖綴合物的唾液酸而使病毒體定位于宿主細(xì)胞表面上。HN蛋白 可分成三個(gè)區(qū)域跨膜結(jié)構(gòu)域、莖結(jié)構(gòu)域和球狀結(jié)構(gòu)域?？乖荏w的結(jié)合 位點(diǎn)和神經(jīng)氨酸酶的活性位點(diǎn)都位于所述球狀結(jié)構(gòu)域上。融合誘導(dǎo)的活性 位點(diǎn)位于所述莖結(jié)構(gòu)域上，并與F蛋白相互作用(Sergei et al.， 1993 )。預(yù) 計(jì)的莖區(qū)結(jié)構(gòu)為oc螺旋結(jié)構(gòu)，具有包括七肽重復(fù)區(qū)域A (在第74-88位) 和七肽重復(fù)區(qū)域B (在第96-110位)的兩個(gè)七肽重復(fù)區(qū)域。還已經(jīng)報(bào)道 了，任何破壞該結(jié)構(gòu)的突變都會(huì)降低受體結(jié)合和神經(jīng)氨酸酶活性。而且還 已經(jīng)才艮道了 ，能夠破壞結(jié)構(gòu)的突變可引起受體結(jié)合和神經(jīng)氨酸酶活性的降 低。
才艮據(jù)雞中的疾病水平，將NDV分類為下列致病類型(致病型)1) 呈現(xiàn)呼吸系統(tǒng)和神經(jīng)學(xué)癥狀及高死亡率的嗜內(nèi)臟速發(fā)型(高致病)NDV; 主要呈現(xiàn)消化器官病變和高死亡率的嗜神經(jīng)速發(fā)型NDV; 2)呈現(xiàn)低死亡 率但在一些家禽中呈現(xiàn)急性呼吸系統(tǒng)和神經(jīng)學(xué)癥狀的中發(fā)型NDV; 3)引 起輕微疾病或無癥狀的呼吸系統(tǒng)感染的緩發(fā)型(lentogenic )(低致病) NDV和非致病NDV。
為了使NDV感染細(xì)胞，前體糖蛋白Fo需要被切割成Fl和F2。這 種翻譯后切割受到宿主細(xì)胞的蛋白酶的干涉。如果不發(fā)生該切割，就可形 成無感染性的病務(wù)體，并且病毒復(fù)制無法進(jìn)行。強(qiáng)毒病毒的Fo蛋白可被 多種蛋白酶切割，而低毒性病毒的Fo蛋白易感性受到限制一一具體而言， 低毒性病毒僅可在特定的宿主細(xì)胞類型中生長(zhǎng)。
鑒于緩發(fā)型病毒僅在包括呼吸系統(tǒng)器官或消化道的具有胰蛋白酶樣 酶的區(qū)域中繁殖，因?yàn)閺?qiáng)毒病毒在包括組織和器官的多個(gè)區(qū)域中繁殖，所 以所述強(qiáng)毒病毒會(huì)引起胎兒的全身感染。通過對(duì)Fo前體的M酸檢查可鑒定，緩發(fā)型病毒具有一個(gè)連接F2 和Fl亞基的單精氨酸(R )，而毒性超過中發(fā)型的毒林具有其他堿性氨基 酸，在切割區(qū)上形成兩個(gè)對(duì)例如K/R-X-K/R-R-F。而且，致病性超過中 發(fā)型的毒林的F2鏈通常由苯丙氨酸殘基表示，而致病性低于緩發(fā)型的病 毒毒抹的F2鏈通常由亮氨酸表示。
在美國(guó)，滅活疫苗已被用于鑒定新城疫病(Hofstad， 1953)。利用這 樣的觀察結(jié)果，即部分的地方性動(dòng)物病病毒僅產(chǎn)生輕度疾病，第一次開發(fā) 了中發(fā)型活疫苗Roakin，隨后開發(fā)了更溫和的Hitdiner Bl和LaSota (Goldhaft, 1980 )。
活疫苗的主要優(yōu)點(diǎn)之一是能夠通過使用低成本的批量施用方法給予。 一種常規(guī)的施用方法為通過々欠用水給予所述疫苗。
通過噴霧和氣霧劑批量施用活疫苗是非常有用的，這是因?yàn)榭梢愿?地將該疫苗給予許多鳥，從而對(duì)其進(jìn)行預(yù)防接種。對(duì)產(chǎn)生顆粒的噴嘴進(jìn)行 控制以獲得嚴(yán)格的顆粒大小是重要的。
最近使用的活疫苗出現(xiàn)了一些問題。因?yàn)檫@些疫苗仍具有小的致病 性，所以偶爾會(huì)出現(xiàn)疫苗的副作用。而且，因?yàn)槔^承自母系的抗體可中和 活疫苗病毒，所以成功的免疫性形成會(huì)受干擾。因此，使用非常溫和的病 毒來進(jìn)行初次疫苗接種是重要的，并且需要一種能夠克服母體抗體的疫 苗。
滅活疫苗通常產(chǎn)生自與合適的補(bǔ)充物混合的傳染性尿嚢液，并經(jīng)福爾 馬林或0丙內(nèi)酯處理以滅活病毒。將疫苗給予至肌肉或通過皮下注射給 予，但是其缺點(diǎn)在于較高的生產(chǎn)和施用成本。
最近，據(jù)推測(cè)，國(guó)內(nèi)外產(chǎn)生的速發(fā)型NDV的抗原性與疫苗林相比表 現(xiàn)出了許多差異。由于此原因，可以推斷可能會(huì)發(fā)現(xiàn)與疫苗林的基因型有 許多差異的野生毒林，并且如果疫苗的抗體滴度不足，它能防止死亡，但 無法阻止產(chǎn)蛋率的降低等。
根據(jù)基于F基因的部分序列的系統(tǒng)發(fā)生分析，將NDV的基因型分類 成基因I型-基因IX型。在分子流行病學(xué)上，分布在韓國(guó)的大多數(shù)新城疫 病毒屬于基因VI型和基因VII型。對(duì)于基因VI型的情況，縱使由于密 集疫苗接種可能出現(xiàn)變體毒林，其分離也相對(duì)低于基因VII型，并且在 2000年后基本上僅分離到基因VII型，所以考慮了它消失的可能性。因 此，測(cè)序分析(通過基因組項(xiàng)目確定最近的NDV基因序列)和通過與世界范圍內(nèi)的登記在GenBank中的NDV進(jìn)行基因比較的分子流行病學(xué)研 究對(duì)于開發(fā)一種優(yōu)化的疫苗株是很重要的。
現(xiàn)在，常規(guī)使用的新城疫病(ND)的滅活油佐劑疫苗是通過使用例 如克隆30 ( Clone 30 )或LaSota毒林的緩發(fā)型NDV產(chǎn)生的，并且由于 安全性的問題，禁止使用速發(fā)型NDV生產(chǎn)滅活疫苗是。因此，對(duì)于用于 制備更安全的、更經(jīng)濟(jì)的且其中抗原類似于野毒林(field strain)的ND 疫苗的技術(shù)，有不斷增加的需求，并且使用反求遺傳學(xué)技術(shù)來開發(fā)疫苗是 最接近這種需求的技術(shù)。
負(fù)鏈RNA病毒的反求遺傳學(xué)技術(shù)作為一種技術(shù)被提出，用于從病毒 基因組拯救傳染性的病毒(美國(guó)專利5,166,057 )?？v使最初提出該技術(shù)是 為了操縱流感病毒基因組，但可將其成功地施用于多種分節(jié)段的和不分節(jié) 段的負(fù)鏈RNA病毒，包括狂犬病病毒、呼吸道合胞病毒和仙臺(tái)病毒。
本發(fā)明使用如上文所述的反求遺傳學(xué)技術(shù)開發(fā)了一種新型疫苗林；其 結(jié)果是，發(fā)展了生產(chǎn)具有類似于野毒林的抗原性的安全ND疫苗林的技 術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)是，提供一種用于轉(zhuǎn)錄NDV基因組的重組體載體。
本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)是，提供一個(gè)具有致病性NDV表面抗原的減 毒重組體NDV毒林。
本發(fā)明的另 一個(gè)目標(biāo)是，提供一種使用該載體制備具有低致病性和 抗新城疫病(ND)的高防護(hù)效力的重組體NDV的方法。
本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)是，提供一種使用反求遺傳學(xué)技術(shù)對(duì)NDV進(jìn) 行減毒以使其免疫原性增加并使其致病性降低的方法。
本發(fā)明的又一個(gè)目標(biāo)是，提供一種包含所述重組體NDV的抗ND 疫苗。


圖1示出了使用國(guó)內(nèi)的速發(fā)型新城疫病毒KBNP-4152的基因組 RNA進(jìn)行的RT-PCT結(jié)果以及擴(kuò)增的RT-PCR產(chǎn)物的名稱和位置。 圖2示出了將圖l的擴(kuò)增產(chǎn)物克隆至TA-克隆載體中的結(jié)果。圖3示出了在重組體NDV基因組兩端插入限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn) 5s附J I和5mI的過程。
圖4示出了用于制備親本載體的連接子序列、用于克隆NDV的基 因組DNA的pTMH以及用于制備該連接子的引物序列。
圖5示出了制備pTMH載體的過程的原理圖。
圖6示出了 pTMH載體中主要位點(diǎn)的核苷^列。
圖7示出了 pTMH載體的全核苦*列。
圖8示出了使用La Sota毒抹的基因組RNA進(jìn)行的RT-PCT結(jié)果以
及擴(kuò)增的RT-PCR產(chǎn)物的名稱和位置。
圖9示出了將圖8的擴(kuò)增產(chǎn)物克隆至TA-克隆載體中的結(jié)果。
圖10示出了將NDV基因組DNA克隆至pBR322載體中的過程。
圖11示出了制備用于表達(dá)NDV的NP、 P和L基因的質(zhì)粒的過程，
其中A的第2、 3和4道分別表示NP、 P和L基因的RT-PCR結(jié)果，A
的第6、 7和8道分別表示插入至載體中的基因，該栽體是在將所述NP、
P和L基因插入至pcDNA3.1/TOPO載體后經(jīng)AWI處理的；B表示概要 顯示其的原理圖。
圖12示出了使用PTDS技術(shù)的F和HN基因的半合成過程。
圖13示出了所述F蛋白的費(fèi)林蛋白酶(furin)-樣酶識(shí)別位點(diǎn)的核
苷酸序列，以及所述重組體病毒的M和F基因的連接子。
圖14示出了一個(gè)基因的合成過程，其中使用PTDS和定向誘變?cè)谒?br> 述F蛋白的費(fèi)林蛋白酶-樣酶識(shí)別位點(diǎn)中引起一個(gè)突變。圖15示出了用于將KBNP-4152的HN (1-566)基因與La Sota毒林
的HN末端(567-577)基因連接的引物的設(shè)計(jì)圖。
圖16示出了制備重組體病毒KBNP-C4152R2L的過程。
圖17示出了制備具有多個(gè)費(fèi)林蛋白酶-樣酶識(shí)別位點(diǎn)的重組體病毒的
克隆的過程。
圖18為通過使用平板血凝試驗(yàn)顯示接種于雞胚中的 KBNP-C4152R2L是否增加的結(jié)果。
圖19示出了用來確證KBNP-C4152R2L的致病性的致病型特異的 RT-PCR結(jié)果。
圖20為KBNP-4152和KBNP-C4152R2L的F蛋白的費(fèi)林蛋白酶-樣 酶識(shí)別位點(diǎn)的核苷酸序列的比較結(jié)果。圖21示出了通過使用雜交血凝抑制試驗(yàn)得出的La Sota毒林、
KBNP-4152和KBNP-C4152R2L之間的抗原關(guān)系。
圖22示出了 KBNP-C4152R2L的細(xì)胞病變效應(yīng)(cytophatic effect )。 圖23示出了克隆至pTMH載體的KBNP-C4251R2L基因組和該基
因組的核苷^列的圖i普。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明涉及一種用于轉(zhuǎn)錄新城疫病毒(NDV )基因組的重組體載體、 一種由該載體制備的具有致病性新城疫病毒表面抗原的減毒重組體
NDV毒林、 一種使用該載體制備的具有低致病性和抗新城疫病(ND) 的高預(yù)防效力的重組體NDV的方法以及一種包含該重組體新城疫病毒的 抗新城疫病疫苗。
本發(fā)明的F基因(384bp;定位于F基因的第1-384位核苷酸)和采 用鄰接法(neighbor-joining method )對(duì)新城病毒的進(jìn)4亍系統(tǒng)發(fā)生分沖斤的 結(jié)果如下78
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顯示于圖中的毒林僅為實(shí)例，現(xiàn)有的多種新城疫病毒毒林被分類為
基因I-IX型。而且，已經(jīng)多次報(bào)道通過分子流行病學(xué)分析來對(duì)新城病毒
進(jìn)行分類。因此，按照上文所述將毒林分類至各基因型是本發(fā)明所屬技術(shù) 領(lǐng)域技術(shù)人員可以很容易理解的。在該說明書中，其毒林分類的標(biāo)準(zhǔn)引用 了以下參考文獻(xiàn)中記栽的內(nèi)容，這些參考文獻(xiàn)通過引用的方式全文納入本
文
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現(xiàn)在，被用作疫苗株的LaSota/46為基因II型，而大多數(shù)被鑒定為 野毒林屬于基因VI-VTI型，它們?cè)谶z傳上與疫苗林LaSota/46較遠(yuǎn)。例 如，在NDV的HN蛋白中，已知HN蛋白上的345-PDEQDYQIR-353 位點(diǎn)是一種形成中和抗體的重要的線性表位。作為國(guó)內(nèi)的致病性NDV， 該病毒的基因VI型(95-98、 99-70、 99-71)和基因VII型已共存，并且更 具體地，NDV的基因VI型在1999年被分離到，但從2000年至2006年 根本沒有再被分離到。在1995年，第一次從禽類中分離到NDV的基因 VIIa型，然后就再?zèng)]有分離到該病毒，僅分離到NDV的基因VIId型。 在病毒的基因VI型的情況下，在1993年和1994年分離的毒抹 (SNU9358GG、 SNU9444)中觀察到線性表位(E347K)的第一個(gè)變體 毒林，并繼續(xù)在95-98、 99-70和99-71中觀察到所述變體。因此，這些變 體毒林被認(rèn)為可以避開免疫并存活較長(zhǎng)時(shí)間，并且在韓國(guó)這些變體毒林被 認(rèn)為從2000年開始幾乎被新出現(xiàn)的基因VII型所取代。對(duì)于該病毒的基 因VII型的情況，1995年-2001年分離的所有病毒都類似于La Sota毒林 的線性表位。然而，該線性表位(E347K)的變體^^林在2002年第一次 ^^現(xiàn)，具有其他突變的NDV大部分是在2005年纟iLiL現(xiàn)(參考下表)。
常規(guī)表位_變體表位_
年份346DEQDYQIRM 346-K——M/K-3541995
2000
2001
2002
2003
2004
2005
2006
354
L6
(79%)
(6.25%)
4 (10.5%)
1
15 (93.75%)
2
考慮這一點(diǎn)，因?yàn)橐郧暗囊呙缒↙a Sota/46不能有效地用于預(yù)防現(xiàn)在 新出現(xiàn)的抗原性不同的新城疫病毒，因此本發(fā)明提供的用于開發(fā)具有幾乎 類似于野毒林抗原性的疫苗林的技術(shù)是非常重要的。
本文使用的術(shù)語"高致病性(速發(fā)型)新城疫病毒"包括具有等于或 高于中發(fā)型毒林的致病性的致病性新城疫病毒，以及除非定義不同，否則 通常被分類為高致病性的新城疫病毒。在本發(fā)明中，高致病性新城疫病毒 是通過在感染至動(dòng)物時(shí)在其體內(nèi)的所有細(xì)胞中產(chǎn)生侵染性的病毒來顯示 其致病性的。在所述F蛋白的第113-116位的氨基酸序列由下式l表示的 情況下，該F蛋白^皮存在于體內(nèi)幾乎所有細(xì)胞中的費(fèi)林蛋白酶或費(fèi)林-樣 蛋白酶(下文中稱作"費(fèi)林蛋白酶，，)切割，從而被轉(zhuǎn)化成一種活性結(jié)構(gòu) 并獲得侵染能力。因此，致病性新城疫病毒可被定義為在F蛋白的第 113-116位具有編碼由下式1表示的氨基酸序列的核苷酸序列
式l
1130^X2X3X4-116
其中
X!、 X;j和X4獨(dú)立地為精氨酸(R)或賴氨酸(K)，并且
X2選自丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、曱硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、 色氨酸、纈氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、絲氨酸、蘇 氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、組氨酸和賴氨酸。
在這種情況下，如果F蛋白的第112位的氨基酸為例如精氨酸或賴氨 酸的堿性氨基酸，那么該致病性新城疫病毒具有較高的致病性。
同時(shí)，本文使用的術(shù)語"低致病性(緩發(fā)型)新城疫病毒"包括無致病性的非致病性新城疫病毒，以及除非定義不同，否則通常被分類為緩發(fā)
型的新城疫病毒。在本發(fā)明中，低致病性新城疫病毒在F蛋白的第113-116 位具有編碼由下式2表示的氨基酸序列的核苷酸序列，并且當(dāng)感染至動(dòng)物 時(shí)，該病毒僅被消化器官和呼吸器官中某些特定的細(xì)胞外蛋白酶所激活， 從而僅局部地感染而顯示低致病性。因此，低致病性新城疫病毒被定義為 在F蛋白的第113-116位具有編碼以下式2表示的M酸序列的核苷^ 列
式2
113-X4X5X7X8-116 其中
X5、 X6和X7獨(dú)立地選自丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甲At氨酸、苯
丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、纈氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酰胺、甘 氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、組氨酸和
賴氨酸，且Xs和X7不同時(shí)為精氨酸(R)或賴氨酸(K)，并且 Xs為精氨酸(R)或賴氨酸(K)。
當(dāng)位于新城疫病毒的F蛋白中的切割位點(diǎn)被費(fèi)林蛋白酶切割并且F 蛋白與細(xì)胞膜融合的融合區(qū)暴露時(shí)，該病毒獲得致病性。費(fèi)林蛋白酶是一 種分布于整個(gè)動(dòng)物體內(nèi)的酶，因此費(fèi)林蛋白酶對(duì)病毒侵染能力的激活可以 在整個(gè)動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生，籍此該病毒具有致病性。因此，新城疫病毒的致病 性水平可依賴于費(fèi)林蛋白酶對(duì)F蛋白中切割位點(diǎn)的識(shí)別和切割的程度。
如果新城疫病毒的F蛋白的費(fèi)林蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)(第113-116位JL^ 酸)具有式1所示的至少3個(gè)堿性氨基酸(113-R-X-K/R-R-116 )，那么該 病毒是可以全身感染的，并獲得致病性。然而，如式2中所示，如果以非 堿性氨基酸替換一個(gè)多個(gè)堿性氨基酸，那么切割和識(shí)別不是由費(fèi)林蛋白酶 而是由局部存在的細(xì)胞外蛋白酶進(jìn)行，且不會(huì)發(fā)生病毒的致死性全身感 染，從而呈現(xiàn)低致病性。
本發(fā)明涉及通過以下方式基于低致病性新城疫病毒制備遺傳穩(wěn)定的 且減毒的重組新城疫病毒的技術(shù)，該方式即將F蛋白和HN蛋白的編碼區(qū) 替換為國(guó)內(nèi)和亞洲流行的高致病性病毒的這些區(qū)域以增強(qiáng)該病毒對(duì)高致 病性病毒的防護(hù)效應(yīng)；以及用非堿性氨基酸的密碼子替換編碼高致病性新 城疫病毒的第115位氨基酸的密碼子，其中在出現(xiàn)至少兩個(gè)點(diǎn)突變時(shí)可將 一個(gè)非堿性氨基酸的密碼子轉(zhuǎn)換成堿性氨基酸的密碼子。如上文所述，根據(jù)本發(fā)明的重組體新城疫病毒具有與野毒林相同或類似的表面抗原，從而
呈現(xiàn)了對(duì)野毒林的高抗原性并且是被有效減毒的。另外，除非在F蛋白的 第115位氨基酸的密碼子出現(xiàn)至少兩個(gè)點(diǎn)突變，否則根據(jù)本發(fā)明的重組體 新城疫病毒不能被轉(zhuǎn)換成高致病毒林，從而呈現(xiàn)出優(yōu)良的穩(wěn)定性和安全性。
根據(jù)致病性新城疫病毒的細(xì)胞病變效應(yīng)，可以將其分類至形成合胞體 的合胞型和形成顆粒的顆粒型，并且通常已知合胞型具有比顆粒型更高的 致病性。本發(fā)明的特征可以在于通過以下方式顯著降低致病性，該方式即 使用顆粒型病毒克隆作為高-速發(fā)型新城疫病毒來提供編碼F和HN蛋白 的區(qū)域。另外，在新城疫病毒的HN蛋白中，高致病性新城疫病毒的HN 蛋白具有571個(gè)氨基酸，其長(zhǎng)度相對(duì)較短，而低致病性新城疫病毒的HN 蛋白具有577個(gè)或616個(gè)M酸，比高致病性病毒長(zhǎng)，因此高致病毒林和 低致病毒林可通過HN的C末端M酸序列來分類。因此，在本發(fā)明中， 將HN蛋白的C末端改造成低致病毒林的對(duì)應(yīng)的區(qū)域(577個(gè)氨基酸)， 從而制備一種更加減毒的重組新城疫病毒。
如本文使用的，用于轉(zhuǎn)錄新城疫病毒基因組和重組體新城疫病毒的載 體中所包含的編碼P、 M、 F、 HN和L蛋白的核苷酸序列應(yīng)凈皮理解為， 包括存在于P、 M、 F、 HN和L基因中的所有非編碼核苷酸序列(條件 是它們對(duì)所表達(dá)的蛋白沒有影響)，以及直接編碼這些蛋白的核苷^列。
更具體而言，本發(fā)明涉及一種用于轉(zhuǎn)錄新城疫病毒基因組的載體，包 括一個(gè)由編碼新城疫病毒的NP、 P、 M、 F、 HN和L蛋白的核苷酸序列 組成的基因片段；以及一個(gè)啟動(dòng)子和一個(gè)終止子，它們可操作地連接至該 基因片段，
其中所述NP、 P、 M和L基因源自低致病性新城疫病毒La Sota毒 林的基因組，F(xiàn)和HN基因源自高致病性新城疫病毒KBNP-4152的基因 組，
其中在所述栽體中包含的F蛋白編碼序列的特征在于，以任一選自以 下的密碼子替換編碼速發(fā)型新城疫病毒(包括KBNP-4152)的F蛋白第 115位的堿性氨基酸的密碼子包括GCA、 GCC、 GCG和GCU的丙氨 酸密碼子；包括GAC和GAU的天冬氨酸密碼子；包括UUC和UUU的 苯丙氨酸密碼子；包括AUC和AUU的異亮氨酸密碼子；包括UUA和 UUG的亮氨酸密碼子；包括UCA、 UCC、 UCG和UCU的絲氨酸密碼子；包括ACC和ACU的蘇氨酸密碼子；包括GUA、 GUC、 GUG和GUU 的纈氨酸密碼子；以及包括UAC和UAU的酪氨酸密碼子。
該載體的HN基因可以被額外地突變，使得HN蛋白的笫l-569位氨 基酸的密碼子編碼高致病性新城疫病毒的相應(yīng)氨基酸，第570位之后的氨 基酸的密碼子編碼低致病性新城疫病毒(包括LaSota毒林)的相應(yīng)M 酸。
另外，所述啟動(dòng)子和終止子的使用可以沒有特別的限制，條件是它們 可以與所述質(zhì)粒中的新城疫病毒基因組可操作地連接。本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng) 域的技術(shù)人員可容易地選擇并使用這種啟動(dòng)子和終止子。在本發(fā)明的一個(gè) 實(shí)施方案中，所述啟動(dòng)子和終止子可以分別是T7啟動(dòng)子和T7終止子。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，用于轉(zhuǎn)錄該病毒基因組的載體可包括編 碼SEQ ID NO: 2 - 7的M酸序列的核苷酸序列或以下SEQ ID NO: 1的 核苷酸序列(參考圖23，后文中稱為pTNH-c4152R2L)。
基因起始
1 accaaacagagaatccgtgagttacgataaaaggcgaaggagcaattgaagtcgci^g^ 61 X^gi^ggtgtgaatctcgagtgcgagcccgaagcacaaactcgagaaagccttctgccaa
MSSVFDEYEQLLAAQTRPNG-121 c ATCTCTTCCGTATTTGATGAGTACGMCAGCTCCTCGCGGCTCAGACTCGCCCCMTGG
AHGGGEKGSTCKVDVPVFTL-181 AGCTCATGGAGGGGGAGAAAMGGGAGTACCTTAAMGTAGACGTCCCGGTATTCACTCT
-NSDDPEDRWSFVVFCLRIAV' 241 TAACAGTGATGACCCAGMGATAGATGGAGCTTTGTGGTATTCTGCCTCCGGATTGCTGT
SEDANKPLRQGALISLLCSH-301 TAGCGMGATGCCMC嵐CCACTCAGGCMGGTGCTCTCATATCTCTTTTATGCTCCCA
SQVMRNHVAIAGKQNEATLA-361 CTCACAGGTMTGAGGMCCATGTTGCCATTGCAGGG患CAGMTGMGCCACATTGGC
VLEIDGFANGTPQFNNRSGV-421 CGTGCTTGAGATTGATGGCTTTGCCAACGGCACGCCCCAGTTCMCMTAGGAGTGGAGT
SEERAQRFAMIAGSLPRACS-481 GTCTGMGAGAGAGCACAGAGATTTGCGATGATAGCAGGATCTCTCCCTCGGGCATGCAG
NGTPFVTAGAEDDAPEDITD-541 CMCGGMCCCCGTTCGTCACAGCCGGGGCAGMGATGATGCACCAGAAGACATCACCGA
TLERILSIQAQVWVTVAKAM-601 TACCCTGGAGAGGATCCTCTCTATCCAGGCTCMGTATGGGTCACAGTAGCAAAAGCCAT
-TAYETADESETRRINKYMQC1-661 GACTGCGTATGAGACTGCAGATGAGTCGG嵐CAAGGCGMTCMTMGTATATGCAGCA
-GRVQKKYILYPVCRSTIQLT-721 AGGCAGGGTCCAAMGAMTACATCCTCTACCCCGTATGCAGGAGCACAATCCMCTCAC
-IRQSLAVRIFI, VSELKRGRN' 781 GATCAGACAGTCTCTTGCAGTCCGCATCTTTTTGGTTAGCGAGCTCAAGAGAGGCCGCM
TAGGTSTYYNLVGDVDSYIR-841 CACGGCAGGTGGTACCTCTACTTATTATMCCTGGTAGGGGACGTAGACTCATACATCAG
NTGLTAFFLTLKYGINTKTS 901 GMTACCGGGCTTACTGCATTCTTCTTGACACTCAAGTACGGMTCMCACCMGACATC
ALALSSLSGDIQKMKQLMRL 961 AGCCCTTGCACTTAGTAGCCTCTCAGGCGACATCCAGAAGATGAAGCAGCTCATGCGTTT
YRMKGDNAPYMTLLGDSDQM 1021 GTATCGGATGAAAGGAGATMTGCGCCGTACATGACATTACTTGGTGATAGTGACCAGAT
SFAPAEYAGLYSFAMGMASV 1081 GAGCTTTGCGCCTGCCGAGTATGCACAACTTTACTCCTTTGCCATGGGTATGGCATCAGT
LDKGTGKYQFARDFMSTSFW 1141 CCTAGAT組GGTACTGGGAMTACCMTTTGCCAGGGACTTTATGAGCA匿ATTCTG
RLGVEYAQAQGSS I NEDMAA 1201 GAGACTTGGAGTAGAGTACGCTCAGGCTCAGGGMGTAGCATTMCGAGGATATGGCTGC
ELKLTPAAMKGLAAAAQRVS 1261 CGAGCTAAAGCTAACCCCAGCAGCMTGMGGGCCTGGCAGCTGCTGCCCAACGGGTCTC
DDTSSIYMPTQQVGVLTGLS 1321 CGACGATACCAGCAGCATATACATGCCTACTCMCAAGTCGGAGTCCTCACTGGGCTTAG
EGGSQAIQGGSNRSQGQPEA 1381 CGAGGGGGGGTCCCMGCTCTACAAGGCGGATCGMTAGATCGCMGGGCMCCAGMGC
GDGETQFLDLMRAVANSMRE 1441 CGGGGATGGGGAGACCCMTTCCTGGATCTGATGAGAGCGGTAGCAMTAGCATGAGGGA
APNSAQGTPQSGPPPTPGPS 1501 GGCGCCAAACTCTGCACAGGGCACTCCCCMTCGGGGCCTCCCCCAACTCCTGGGCCATC
QDNDTDWGY 1561 CCMGATMCGACACCGACTGGGGGTATTGAtggacaaaacccagcctgcttccacaaaa 1621 acatcccaatgccctcacccgtagtcgacccctcgatttgcggctctatatgaccacacc 1681 ctcaaacaaacatccccctctttcctccctccccctgctgtacaactccgcacgccctag
基因結(jié)束
1741 ataccacaggcacaatgcggctcactaacaatcaaaacagagccgagggaa"agag33a 基因起始
1801 遂t aggggt柳柳g卿t at t cagaga t c agggc aagt c t c c cgagt ctctgctctct
MATFTDAEIDEL 1861 cc t c t acc t gat agaccaggacaaacATGGCCACCTTTACAGATGCAGAGATCGACGAGC
FETSGTVIDNI ITAQGKPAE 1921 TATTTGAGACMGTGGMCTGTCATTGACMCATMTTACAGCCCAGGGTMACCAGCAG
TVGRSAIPQGKTKVLSAAWE 1981 AGACTGTTGGMGGAGTGCMTCCCACMGGCAAGACCMGGTGCTGAGCGCAGCATGGG
KHGSIQPPASQDNPDRQDRS 2041 AGMGCATGGGAGCATCCAGCCACCGGCCAGTCMGACMCCCCGATCGACAGGACAGAT
■DKQPSTPEQTTPHDSPPATS 2101 CTGACAAACAACCATCCACACCCGAGCAMCGACCCCGCATGACAGCCCGCCGGCCAC虹
ADQPPTQATDEAVDTQFRTG 2161 CCGCCGACCAGCCCCCCACCCAGGCCACAGACGMGCCGTCGACACACAGTTCAGGACCG
-ASNSLLLMLDKLSNKSSNAK 2221 GAGCAAGCMCTCTCTGCTGTTGATGCTTGACMGCTCAGCMT雄TCGTCCMTGCTA Apal
KGPWSSPQEGNHQRPTQQQG 2281 應(yīng)縱C認(rèn)GGTCGAGCCCCCAAGAGGGGAATCACCMCGTCCGACTCAACAGCAGG
SQPSRGNSQERPQNQVKAAP 2341 GGACTCAACCCAGTCGCGGAMCAGTCAGGAMGACCGCAGMCCAAGTCMGGCCGCCC■GNQGTDVNTAYHGQWEESQL-2401 CTGGAMCCAGGGCACAGACGTGMCACAGCATATCATGGACAATGGGAGGAGTCACMC
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-SADHVQPPVDFVQAMMSMME-2521 TATCTGCGGATCATGTCCAGCCGCCTGTAGACTTTGTGCAAGCGATGATGTCTATGATGG
-AISQRVSKVDYQLDLVLKQT-2581 AGGCGATATCACAGAGAGTMGTMGGTTGACTATCAGCTAGATCTTGTCTTGAMCAGA
SSIPMMRSEIQQLKTSVAVM-2641 CATCCTCCATCCCT虹GATGCGGTCCG嵐TCCMCAGCTGAAMCATCTGTTGCAGTCA
EANLGMMKILDPGCANISSL-2701 TGGMGCCMCTTGGGAATGATGMGATTCTGGATCCCGGTTGTGCCMCATTTCATCTC
SDLRAVARSHPVLVSGPGDP-2761 TGAGTGATCTACGGGCAGTTGCCCGATCTCACCCGGTnTAGTTTCAGGCCCTGGAGACC
■SPYVTQGGEMALNKLSQPVP-2821 CCTCTCCCTATGTGACACMGGAGGCG嵐TGGCACTTMT雄CTTTCGCMCCAGTGC
HPSELIKPATACGPDIGVEK-2881 CACATCCATCTGMTTGATTMACCCGCCACTGCATGCGGGCCTGATATAGGAGTGGMA
DTVRALIMSRPMHPSSSAKL-2941 AGGACACTGTCCGTGCATTGATCATGTCACGCOMTGCACCCGAGTTCTTCAGCCMGC
LSKLDAAGSIEEIRKIKRLA-3001 TCCTMGCMGTTAGATGCAGCCGGGTCGATCGAGGAAATCAGGAAAATCAAGCGCCTTG
L N G
3061 CTCTAAATGGCTMttactactgccacacgtagcgggtccctgtccactcggcatcacac 3121 ggaatctgcaccgagUcccccccgcagaccca鄉(xiāng)tccaactctccaagcggcaatcct 3181 ctctcgcttcctcagccccactgaatgatcgcgtaaccgtaattaatctagctacattta 基因結(jié)束基因起始 M D S S
3241 agat f3a弱sa3朋t3i^ggt議a3UggagtgccccaattgtgccaagATGGACTCATC
RTIGLYFDSAHSSSNLLAFP-3301 TAGGACMTTGGGCTGTACTTTGATTCTGCCCATTCTTCTAGCMCCTGTTAGCATTTCC
IVLQDTGDGKKQIAPQYRIQ-3361 GATCGTCCTACMGACACAGGAGATGGGMGAAGCAAATCGCCCCGCAATATAGGATCCA
RLDLWTDSKEDSVFITTYGF-3421 GCGCCTTGACTTGTGGACTGATAGTMGGAGGACTCAGTATTCATCACCACCTATGGATT
IFQVGNEEATVGMIDDKPKR-3481 CATCTTTCMGTTGGGMTGMGMGCCACTGTCGGCATGATCGATGATAMCCCMGCG
AvrII
ELLSAAMLCLGSVPNTGDLI-3541 CGACTTACTTTCCGCTGCGATGCTCTG園歸GCGTCCC組TACCGGAGACCTTAT
ELARACLTMIVTCKKSATNT-3601 TGAGCTGGCMGGGCCTGTCTCACTATGATAGTCACATGCMGMGAGTGCAACTMTAC
-ERMVFSVVQAPQVLQSCRVV-3661 TGAGAGMTGGTnrCTCAGTAGTGCAGGCACCCCMGTGCTGCAAAGCTGTAGGGTTGT
ANKYSSVNAVKHVKAPEKIP-3721 GGCMACMATACTCATCAGTGMTGCAGTCMGCACGTGMAGCGCCAGAGMGATTCC
GSGTLEYKVNFVSLTVVPKK-3781 CGGGAGTGGMCCCTAGMTACMGGTGMCTTTGTCTCCTTGACTGTGGTACCGMGM
DVYKIPAAVLKVSGSSLYNL-3841 GGATGTCTACMGATCCCAGCTGCAGTATTGAAGGTTTCTGGCTCGAGTCTGTACMTCT
■ALNVTINVEVDPRSPLVKSL-3901 TGCGCTCAATGTCACTATTMTGTGGAGGTAGACCCGAGGAGTCCTTTGGTTMATCrCT
SKSDSGYYANLFLHIGLMTT-3961 GTCTMGTCTGACAGCGGATACTATGCTMCCTCTTCTTGCATATTGGACTTATGACCAC
VDRKGKKVTFDKLEKKIRSL-4021 CGTAGATAGGMGGGGAAG雄GTGACATTTGACMGCTGGAAMG纖TMGGAGCCT
DLSVGLSDVLGPSVLVKARG-4081 TGATCTATCTGTCGGGCTCAGTGATGTGCTCGGGCCTTCCGTGTTGGTAAMGCMGAGG
ARTKLLAPFFSSSGTACYPI-4141 TGCACGGACTMGCTTTTGGCACCTTTCTTCTCTAGCAGTGGGACAGCCTGCTATCCCAT
ANASPQVAK I LWSQTACLRS-4201 AGC歸GOTCTCCTCAGGTGGCCMGATACTCTGGAGTC藏CGCGTGCCTGCGGAG
VKI I IQAGTQRAVAVTADHE-4261 CGTTAAMTCATTATCCMGCAGGTACCCMCGCGCTGTCGCAGTGACCGCCGACCACGA
VTSTKLEKGHTLAKYNPFKK-4321 GGTTACCTCTACTAAGCTGGAGMGGGGCACACCCTTGCCAMTACMTCCrnTMGM
4381 ATMgctgcgtctctgagattgcgctccgcccactcacccagatcatcatgacacaaaaa
基因結(jié)束 MIuI
4441 actaatctgtcttgattatUacagttagUtacctgtctatcaag"柳a3朋3C3gg" 基因起始 M G S K -
4501 ggf3ggggf柳柳gtctggatcccgaccggcacaUca卿cgcaatATGGGCTCCM
LSTRIPAPLMLTTRITLILS-4561 ACTTTCTACCAGGATTCCAGCACCTCTGATGCTGACCACCCGGATTACGCTGATATTGAG
-CIRPTSSLDGRPLAAAGIVV-4621 CTGTATCCGTCCGACAAGCTCTCTTGACGGCAGGCCTCTTGCAGCTGCAGGMTTGTAGT
TGDKAVNVYTSSQTGSI IVK-4681 AACAGGAGATMGGCAGTCMTGTATACACCTCGTCTCAGACAGGGTCMTCATAGTCM
-LLPNMPRDKEACAKAPLEAY-4741 GTTGCTCCCGMTATGCCCAGGGATAMGAGGCGTGTGC麵GCCCCATTAGAGGCATA
NRTLTTLLTPLGDSIRKIQG-4801 TMCAGMCACTGACTACTTTGCTMCTCCTCTTGGCGACTCCATCCGCMGATCCMGG
切割位點(diǎn)
SVSTSGGGRQARLIGAVIGS-4861 GTCTGTGTCCACGTCTGGAGGAGGCAGACMGCACGCCTGATAGGTGCTGTTATTGGCAG
Not I
■VALGVATAAQITAAAALIQA-4921 TGTAGCTCTTGGGGTTGCMCAGCGGCACAGATMCAGCA縱g(mCCTMTACAAGC
-NQNAANILRLKESIAATNEA' 4981 CAACCAGMTGCCGCCAACATCCTCCGGCTTMGGAGAGCATTGCTGCMCCMTGMGC
■VHEVTDGLSQLSVAVGKMQQ. 5041 TGTGCATGMGTCACCGACGGATTATCACMCTATCAGTGGCAGTTGGGMGATGCAGCA
FVNDQFNNTARELDCIKITQ-5101 GTTCGTCMTGACCAGTTrMT羅CAGCACGAGMTTGGACTGTATAAMATCACACA
QVGVELNLYLTELTTVF.GPQ-5161 AC AGGTTGGTGTAGAGCTAAACCTATACCTMCTGMTTGACTACAGTATTCGGGCCACA
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NMNYLLTKLGIGNNQLSSLI-5281 CAATATGMTTACTTATTMCTAAGTTAGGTATAGGGMCAATCMCTCAGCTCATTMT
GSGLITGYPILYDSQTQLLG-5341 TGGTAGCGGCCTGATCACTGGTTACCCTATACTGTATGATTCACAGACTCMCTCTTGGG
-IQVNLPSVGNLNNMRATYLE-5401 CATACAAGTGMTTTGCCCTCAGTCGGGMCTTAMTMTATGCGTGCCACCTATTTGGA
-TLSVSTTKGYASALVPKVVT' 5461 GACCTTATCTGTMGTACMCCMAGGATATGCCTCAGCACTTGTCCCGMAGTAGTGAC
-QVGSVIEELDTSYCIESDLD-5521 ACAGGTCGGTTCTGTGATAGMGAGCTCGACACCTCATACTGCATAGAGTCCGATCTGGA
LYCTRIVTFPMSPGIYSCLS-5581 TTTATATTGTACTAGAATAGTGACATTCCCCATGTCCCCAGGTATTTATTCCTGCTTGAG
GNTSACMYSKTEGALTTPYM-5641 CGGCMCACATCAGCTTGCATGTATTCAAAGACTGAAGGCGCACTCACTACGCCGTATAT
ALKGSVIANCKITTCRCTDP-5701 GGCCCTTAMGGCTCGGTTATTGCCMTTGTMGATAACMCATGTAGATGTACAGACCC
-PGI ISQNYGEAVSLIDRHSC-5761 TCCTGGTATCATATCGCAAMTTATGGAGMGCCGTATCCCTGATAGATAGACATTCGTG
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TELGNVNNSISNALDSLAES-5941 MCTGMCTTGGAMCGTCMCMTTCMTCAGCMTGCCTTGGATAGTTTGGCAG嵐G
NSKLEKINVRLTSTSALITY-6001 CAACAGCMGCTGGMAAMTCAATGTCAGACTMCCAGCACATCTGCTCTCATTACCTA
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LMYKQKAQQKTLLWLGNNTL. 6121 CCTGATGTACMACAGMGGCACMCAAAAGACCTTGCTATGGCTTGGGMTAATACCCT
DQMRATTRA 6181 CGATCAGATGAGAGCCACTACMGAGCATGAatgcagat aagaggt gggt at at acccaa
基因結(jié)束
6241 cagcagcctgtgtatcaattccgataacctgtcaagtagaagact fs柳33aagctact
基因起始
6301 gggaataagcaaccaaagagcactac^￡g^^g^cgatcagaggagccacccttcaat
M
6361 cggaaattaggcttcacaacatccgttctaccgcatcaccaacaacaagagtcaatcATG Hpal
DRAVNRVVLENEEREAKNTW 6421 GACCGCGCGf扁fflGAGTCGTGCTGGAGMTGAGG嵐GAGMGCMAGMCACATGG
RLVFRIAVLLLMVMTLAISS 6481 CGCCTGGTTTTCCGGATCGCAGTTTTACTnTMTGGTAATGACTCTAGCTATCTCCTCA
AALAYSTGASTPHDLASILT 6541 GCTGCCCTGGCATACAGCACGGGGGCCAGTACGCCGCACGACCTCGCMGCATATTGACT
VISKTEDKVTSLLSSSQDVI 6601 GTGATCTCCMGACAGAAGATMGGTTACGTCTTTACTCAGTTCMGTCMGACGTGATA
DRIYKQVALESPLALLNTES 6661 GATAGGATATACMGCAGGTGGCTCTTGMTCCCCGCTGGCACTACT鹿ACTGMTCT
VIMNAITSLSYQINGAANNS 6721 GTMTTATGMTGCMTMCCTCTCTTTCTTATCAMTTMCGGGGCTGCGMCMTAGC
GCGAPVHDPDYIGGIGKELI 6781 GGATGTGGGGCGCCTGTTCATGACCCAGATTATATCGGGGGGATAGGCAMGMCTCATAVDDISDVTSFYPSAYQEHLN 6841 GTGGACGACATCAGTGATGTTACATCATTTTATCCTTCTGCATATCAAGAACACTTGMT FIPAPTTGSGCTRIPSFDMS 6901 TTCATCCCGGCACCTACTACAGGATCCGGTTGCACTCGGATACCCTCGTTTGACATGAGC
TTHYCYTHNVILSGCRDHSH 6961 ACCACCCATTATTGTTATACTCACAATGTGATACTATCCGGTTGCAGAGATCACTCACAC
SHQYLALGVLRTSATGRVFF 7021 TCACATCMTACTTAGCACTTGGTGTGCTTCGGACATCTGCMCAGGGAGGGTATTCTTT STLRSINLDDTQNRKSCSVS 7081 TCTACTCTGCGCTCTATCAATTTAGATGACACCCAAAATCGGMGTCCTGCAGTGTGAGT
ATPLGCDMLCSKVTGTEEED 7141 GCMCCCCTTTAGGTTGTGATATGCTGTGCTCCAAGGTCACAGGGACTGMGAGGAGGAT
YKSVAPTSMVHGRLGFDGQY 7201 TACAAGTCAGTTGCCCCCACATCMTGGTGCACGGAAGGCTAGGGTTTGACGGTCMTAC
HEKDLDTTVLFKDWVANYPG 7261 CATGAMAGGACTTAGACACCACGGTCTTATTTMGGATTGGGTGGCAAATTACCCAGGA
AGGGSFIDDRVWFPVYGGLK 7321 GCGGGAGGAGGGTCTTTTATTGACGACCGTGTATGGTTCCCAGTTTACGGAGGGCTCAM
PDSPSDTAQEGKYVIYKRHN 7381 CCCGATTCACCCAGTGACACTGCACMGMGGG嵐TACGTMTATACMGCGCCATAAC
NTCPDKQDYQIRKAKSSYKP 7441 MCACATGCCCCGATAAACMGATTACCAMTTCGGMGGCTMGTCTTCATATAMCCC
GRFGGKRVQQAILSIKVSTS 7501 GGGCGATTTGGTGGGAAGCGCGTACAGCMGCCATCTTATCCATC雄GTGTCAACATCT
LGKDPVLTIPPNTITLMGAE 7561 TTGGGTMGGACCCGGTGCTGACTATTCCACCTAATACMTCACACTCATGGGAGCCGM
GRILTVGTSHFLYQRGSSYF 7621 GGCAGMTTCTCACAGTGGGGACATCTCACTTCTTGTACCMCGAGGGTCTTCATATTTC
SPALLYPMTVNNKTATLHSP 7681 TCCCCTGCCTTATTATATCCCATGACAGTAMTMCAAMCGGCTACACTCCATAGTCCT
YTFNAFTRPGSVPCQASARC 7741 TATACGTTTAATGCTTTCACTCGGCCAGGTAGTGTCCCTTGCCAGGCATCAGCMGATGC
PNSCITGVYTDPYPLIFHRN 7801 CCCAACTCATGCATTACTGGAGTCTATACTGATCCATATCCCTTAATCTTCCATAGGMT
HTLRGVFGTMLDDECJARLNP 7861 CATACTCTACGAGGGGTCTTCGGMCGATGCTTGATGATGMCAAGCGAGACTTMCCCC
VSAVFDNVSRSRVTRVSSSS 7921 GTATCCGCAGTATTCGACMCGTATCCCGCAGTCGTGTCACCCGGGTGAGTTCMGCAGC
TKAAYTTSTCFKVVKTNKTY 7981 ACCMGGCAGCATACACGACATCGACATGTTTCAMGTTGTCAAGACCMTAMACTTAT
CLSIAEISNTLFGEFRIVPL 8041 TGTCTTAGTATTGCAGAMTATCCMTACCCTGTTCGGGGMTTTAGGATCGTTCCCn^ Spel
LVEILKDDGVREARSG 8101 aMg7TGAGATCCTCAAGGATGACGGGGTTAGAGMGCCAGGTCTGGCTAGt tgagt caa
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基因結(jié)束
8281 catgcgatcagattaagccttgtcaatagtctcttgat fs柳33333tgtaagtggcaa基因起始M A S S G
8341 tgagatacaaggcaaaacagctcatggtaaataat^gggX3^cATGGCGAGCTCCGG
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KHKLLYYWKLTGLPLPDECD-8461 CAAGCACAAACTACTCTATTACTGGMATTAACTGGGCTACCGCTTCCTGATGMTGTGA
■FDHLILSRQWKKILESASPD-8521 CTTCGACCACCTCATTCTCAGCCGACMTGGAMMMTACTTGAATCGGCCTCTCCTGA
-TERMIKLGRAVHQTLNHNSR-8581 TACTGAGAGAATGATAAMCTCGGMGGGCAGTACACCAAACTCTTMCCACMTTCCAG
ITGVLHPRCLEELANIEVPD-8641 MTMCCGGAGTGCTCCACCCCAGGTGTTTAGMGMCTGGCTMTATTGAGGTCCCAGA
STNKFRKIEKKIQIHNTRYG-8701 TTCMCCMCMATTTCGGAAGATTGAGMGMGATCCAAATTCACAACACGAGATATGG
ELFTRLCTHIEKKLLGSSWS-8761 AGMCTGTTCACAAGGCTGTGTACGCATATAGAGMGMACTGCTGGGGTCATCTTGGTC
BsiWI
■NNVPRSEEFSSIRTDPAFWF' 8821 TAACMTGTCCCCCGGTCAGAGGAGTTCAGCAGCATTa^C諸CCGGCATTCTGGTT
HSKWSTAKFAWLHIKQIQRH-8881 TCACTCAMATGGTCCACAGCCMGTTTGCATGGCTCCATATAAMCAGATCCAGAGGCA
LMVAARTRSAANKLVMLTHK-8941 TCTGATGGTGGCAGCTAGGACMGGTCTGCGGCCAACAMTTGGTGATGCTMCCCATM
-VGQVFVTPELVVVTHTNENK-9001 GGTAGGCCMGTCTTTGTCACTCCTGMCTTGTCGTTGTGACGCATACGMTGAGMCM
FTCLTQELVLMYADMMEGRD-9061 GTTCACATGTCTTACCCAGGMCTTGTATTGATGTATGCAGATATGATGGAGGGCAGAGA
MVNI ISTTAVHLRSLSEKID-9121 TATGGTCMCATMTATCMCCACGGCGGTGCATCTCAGMGCTTATCAGAGAAMTTGA
DILRLIDALAKDLGNQVYDV-9181 TGACATTTTGCGGTTAATAGACGCTCTGGCAAAAGACTTGGGTMTCMGTCTACGATGT
VSLMEGFAYGAVCJLLEPSGT. 9241 CGTATCACTMTGGAGGGATTTGCATACGGAGCTGTCCAGCTACTCGAGCCGTCAGGTAC
FAGDFFAFNLQELKDILIGL. 9301 ATTTGCAGGAGATTTCTTCGCATTCMCCTGCAGGAGCTTAMGACATTCTMTTGGCCT
LPNDIAESVTHAIATVFSGL-9361 CCTCCCCAATGATATAGCAGMTCCGTGACTCATGCMTCGCTACTGTATTCTCTGGTTT
■EQNQAAEMLCLLRLWGHPLL 9421 AGMCAGAATCMGCAGCTGAGATGTTGTGTCTGTTGCGTCTGTGGGGTCACCCACTGCT
ESRIAAKAVRSQMCAPKMVD-9481 TGAGTCCCGTATTGCAGCAMGGCAGTCAGGAGCCAMTGTGCGCACCGAAAATGGTAGA
FDMILQVLSFFKGTI INGYR-9541 CTTTGATATGATCCTTCAGGTACTGTCTTTCTTCMGGGMCMTCATCMCGGGTACAG
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MFLKDKAIAHPNDNWLASFR--RN"SEDQKKIIVKEATSTNR 9841 GCGGMCCTTCTCTCCGMGACCAGMG嵐CATGTAAAAGMGCMCTTCGACTMTCG LLIEFLESNDFDPYKEMEYL 9901 CCTCTTGATAGAGTTTTTAGAGTCAAATGArnTGATCCATATMAGAGATGGMTATCT TTLEYLRDDNVAVSYSLKEK 9961 GACGACCCTTGAGTACCTTAGAGATGACMTGTGGCAGTATCATACTCGCTCAAGGAGAA EVKVNGRIFAKLTKKLRNCQ 10021 GGMGTGAAAGTTMTGGACGGATCTTCGCTMGCTGAC嵐GMGTTMGGMCTGTCA VMAEGILADQIAPFFQGNGV 10081 GGTGATGGCGGMGGGATCCTAGCCGATCAGATTGCACCTTTCTTTCAGGGMATGGAGT IQDSISLTKSMLAMSQLSFN 10141 CATTCAGGATAGCATATCCTTGACCMGAGTATGCTAGCGATGAGTCMCTGTCTTTTM SNKKRITDCKERVSSNRNHD 10201 CAGCMTMGAMCGTATCACTGACTGTAMGAMGAGTATCTTCAAACCGCAATCATGA -PKSKNRRRVATFITTDLQKY 10261 TCCGAMAGCMGAACCGTCGGAGAGTTGCMCCTTCATMCMCTGACCTGCAMAGTA CLNWRYQTIKLFAHAINQLM 10321 CTGTCTTMTTGGAGATATCAGACMTCAMTTGTTCGCTCATGCCATCMTCAGTTGAT GLPHFFEWIHLRLMDTTMFV 10381 GGGCCTACCTCACTTCTTCGMTGGATTCACCTMGACTGATGGACACTACGATGTTCGT GDPFNPPSDPTDCDLSRVPN 10441 AGGAGACCCTTTCMTCCTCCMGTGACCCTACTGACTGTGACCTCTCMGAGTCCCTM DDIYIVSARGGIEGLCQKLW 10501 TGATGACATATATATTGTCAGTGCCAGAGGGGGTATCGMGGATTATGCCAGMGCTATG TMISIAAIQLAAARSHCRVA 10561 GACMTGATCTCMTTGCTGCMTCCMCTTGCTGCAGCTAGATCGCATTGTCGTGTTGC CMVQGDNQVIAVTREVRSDD 10621 CTGTATGGTACAGGGTGATMTCMGTMTAGCAGTMCGAGAGAGGTMGATCAGACGA SPEMVLTQLHQASDNFFKEL 10681 CTCTCCGGAGATGGTGTTGACACAGTTGCATCMGCCAGTGATMTTTCTTCAAGGMTT IHVNHLIGHNLKDRETIRSD 10741 AATTCATGTCMTCATTTGATTGGCCATMTTTGMGGATCGTGAMCCATCAGGTCAGA -TFFIYSKRIFKDGAILSQVL 10801 CACATTCTTCATATACAGCAAACGMTCTTCMAGATGGAGCMTCCTCAGTCMGTCCT KNSSKLVLVSGDLSENTVMS 10861 CAAAAATTCATCTAAATTAGTGCTAGTGTCAGGTGATCTCAGTGAAMCACCGTMTGTC CANIASTVARLCENGLPKDF 10921 CTGTGCCAACATTGCCTCTACTGTAGCACGGCTATGCGAGMCGGGCTTCCC嵐GACTT CYYLNYIMSCVQTYFDSEFS 10981 CTGTTACTATTTAAACTATATMTGAGTTGTGTGCAGACATACTTTGACTCTGAGTTCTC ITNNSHPDLNQSWIEDISFV 11041 CATCACCMCMTTCGCACCCCGATCTTMTCAGTCGTGGATTGAGGACATCTCTTTTGT HSYVLTPAQLGGLSNUYSR 11101 GCACTCATATGTTCTGACTCCTGCCCMTTAGGGGGACTGAGTMCCTTCMTACTCMG LYTRNIGDPGTTAFAEIKRL 11161 GCTCTACACTAGMATATCGGTGACCCGGGGACTACTGCTTTTGCAGAGATCMGCGACT EAVGLLSPNIMTNILTRPPG 11221 AGAAGCAGTGGGATTAaGAGTCCTAACATTATGACTMTATCTTAACTAGGCCGCCTGG NGDWASLCNDPYSFNFETVA11281 GMTGGAGATTGGGCCAGTCTGTGCMCGACCCATACTCTTTCMTTTTGAGACTGTTGC
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LVSSNMCSLTLADYARNRSW 11701 CTTAGTCTCTTCTMTATGTGTTCTCTGACACTGGCAGACTATGCACGGAATAGAAGCTG
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IWAYGDNEVNWTAALTIAKS 12061 GATCTGGGCTTATGGGGATMTGAAGTAAATTGGACTGCTGCTCTTACGATTGCAAMTC
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-TVIRSVIYMEAEGDLADTVF-14581 CACAGTTATCCGGTCTGTGATATATATGGMGCTGAGGGTGATCTCGCTGACACAGTATT
LFTPYNLSTDGKKRTSLKQC-14641 TCTATTTACCCCTTACMTCTCTCTACTGACGGGMMAGAGGACATCACTTAAACAGTG
TROILEVTILGLRVENLNKI-14701 CACGAGACAGATCCTAGAGGTTACMTACTAGGTCTTAGAGTCGAAMTCTCMTMMT
GDIISLVLKGMISMEDLIPL-14761 AGGCGATATMTCAGCCTAGTGCTTAMGGCATGATCTCCATGGAGGACCTTATCCCACT
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基因結(jié)束
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15121 aatgt ct t aaaaaaaggt tgcgcacaat t at t ct tgagtgtagtctcgtcat t caccaaa
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15241 贏< 嚴(yán)慕孤7^釘61^71^麵縱;^皿cggat ccggct get aacaaag
T7終止子
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15361 ^rC7rT賴C(2^7C77G4(m777777K;atatgcggtgtgaaataccgcacagat
15421 gcgtaaggagaaaataccgcatc鄉(xiāng)cgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgc
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15781 gatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgta
15841 ggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccg
15901 ttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagac
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16141 ccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgc16201 gcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctUgatcUUctacggggtctgacgctcagt
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16561 cagcaataaaccagccagccggaagggccgagcgcagaagtggtcctgcaactttatccg
16621 cctccatccagtctattaattgttgccgggaagctagagtaagtagttcgccagttaata
16681 gtttgcgcaacgttgttgccattgctgcaggcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggta
16741 tggcttcattcagctccggttcccaacgatcaaggcgagttacatgatcccccatgttgt
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16861 tgttatcactcatggttatggcagcactgcataattctcttactgtcatgccatccgtaa
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16981 gaccgagttgctcttgcccggcgtcaacacgggataataccgcgccacatagcagaactt
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17401 ttatcatgacattaacctataaaaataggcgtatcacgaggccctttcgtcttcaagaat T7啟動(dòng)子
17461 Ttm^CC40^簾
由用于轉(zhuǎn)錄該基因組(pTNH-c4152R2L)的載體所表達(dá)的NP、 P、 M、 F、 HN和L蛋白的絲絲列分別顯示于SEQIDNO:2曙7中。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及包括P、 M、 F、 HM和L基因的編碼區(qū) 的重組體新城疫病毒，其中所述NP、 P、 M和L基因的編碼區(qū)源自低致 病性新城疫病毒，F(xiàn)和HN基因的編碼區(qū)源自高致病性新城疫病毒，其中 所述F蛋白編碼序列的特征在于，以任一選自以下的密碼子替換高致病性 新城疫病毒的F蛋白第115位的氛基酸的密碼子包括GCA、GCC、GCG 和GCU的丙氨酸密碼子；包括GAC和GAU的天冬氨酸密碼子；包括 UUC和UUU的苯丙氨酸密碼子；包括AUC和AUU的異亮氨酸密碼子； 包括UUA和UUG的亮氨酸密碼子；包括UCA、 UCC、 UCG和UCU的 絲氨酸密碼子；包括ACC和ACU的蘇氨酸密碼子；包括GUA、 GUC、 GUG和GUU的纈氨酸密碼子；以及包括UAC和UAU的酪氨酸密碼子。
該重組體新城疫病毒的HN基因可以被額外地突變，使得HN蛋白的 第1-569位氨基酸的密碼子編碼高致病性新城疫病毒的相應(yīng)氨基酸，第 570位之后的氨基酸的密碼子編碼低致病性新城疫病毒(包括La Sota毒林)的相應(yīng)氨基酸。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該重組體新城疫病毒可以為
KCTC10984BP
才艮據(jù)本發(fā)明的重組體新城疫病毒的特征在于，其表面抗原和抗原性與 高致病性野毒林相同或類似，且致病性低于現(xiàn)有的低致病性疫苗林的致病 性。所述致病性新城疫病毒在F蛋白中具有費(fèi)林蛋白酶的識(shí)別切割區(qū)，并 且當(dāng)該切割區(qū)被費(fèi)林蛋白酶切割的時(shí)候，F(xiàn)蛋白與細(xì)胞膜融合的融合肽區(qū) 被暴露，從而獲得侵染性。因?yàn)橘M(fèi)林蛋白酶分布于體內(nèi)大多數(shù)細(xì)胞中，所 以新城疫病毒在體內(nèi)可全身性感染，從而呈現(xiàn)出高致病性。
在用于轉(zhuǎn)錄本發(fā)明的病毒基因組的載體中，所述低致病性新城疫病毒 與上文所定義的相同，例如所述低致病性新城疫病毒可選自I型和II型 的新城疫病毒，并且優(yōu)選可以是屬于II型的La Sota/46毒林(AY845400 )。 所述高致病性新城疫病毒與上文所定義的相同，它可以是選自V型、VI 型、VII型、預(yù)型和XI型的新城疫病毒(它們是全世界流行的野毒林)的 任一種，并且優(yōu)選地選自VI型和VII型的新城疫病毒。在本發(fā)明的一個(gè) 優(yōu)選實(shí)施方案中，所述高致病性新城疫病毒可以為KBNP-4152 (保藏號(hào) KCTC10919BP )。制備KBNP-4152毒林的方法及其特征與韓國(guó)專利申請(qǐng) 2006-0026667和'Cho SH， Ahn YJ， Kim SJ， Kwon HJ. Characterization of a Newcastle disease virus with variation in the major Hemagglutinin-Neuraminidase (HN) linear epitope. The49th Annual Meeting of the Korean Society of Veterinary Science 2005， 45 (3，suppl)， 199'中記載的相同，它們通過引用的方式納入本文。只要本文使用的高致 病性新城疫病毒和低致病性新城疫病毒被不同地定義，就按照上文所ii^ 它們進(jìn)行定義。
在使用常規(guī)的反求遺傳學(xué)對(duì)新城疫病毒進(jìn)行減毒時(shí)， 一個(gè)實(shí)例是以甘 氨酸替換第115位氨基酸，但是對(duì)該替換的甘氨酸的密碼子的僅一個(gè)g 進(jìn)行的任意突變均可導(dǎo)致第115位氨基酸變成堿性氨基酸例如賴氨酸和 精氨酸，所述病毒可再次恢復(fù)其致病性。
然而，在根據(jù)本發(fā)明的重組體新城疫病毒中，以編碼非堿性氨基酸的 密碼子替換F蛋白的第115位氨基酸，其中除非出現(xiàn)至少兩個(gè)點(diǎn)突變，否 則編碼該非堿性氬基酸的密碼子不能被轉(zhuǎn)換成編碼堿性氬基酸的密碼子。 因此，重組體病毒恢復(fù)其致病性的可能性^艮低，并且與現(xiàn)有的其他減毒毒林相比該病毒的穩(wěn)定性顯著增加。當(dāng)根據(jù)本發(fā)明對(duì)F蛋白的切割位點(diǎn)進(jìn)行 突變的時(shí)候，F(xiàn)蛋白的切割位點(diǎn)不是由費(fèi)林蛋白酶切割的一一由此不會(huì)發(fā) 生全身感染一一而是由僅分布于體內(nèi)少數(shù)器官(呼吸器官和消化器官)中 的胰蛋白酶或胰蛋白酶樣酶切割的，導(dǎo)致局部感染。
為了達(dá)到這樣的效果，以任一選自以下的密碼子替換本發(fā)明的F蛋白 的第115位氨基酸的密碼子包括GCA、 GCC、 GCG和GCU的丙氨酸 密碼子；包括GAC和GAU的天冬氨酸密碼子；包括UUC和UUU的苯 丙氨酸密碼子；包括AUC和AUU的異亮氨酸密碼子；包括UUA和UUG 的亮氨酸密碼子；包括UCA、 UCC、 UCG和UCU的絲氨酸密碼子；包 括ACC和ACU的蘇氨酸密碼子；包括GUA、 GUC、 GUG和GUU的 纈氨酸密碼子；以及包括UAC和UAU的酪氨酸密碼子。
在另一方面，本發(fā)明涉及一種制備重組體新城疫病毒的方法，包括以 下步驟
將編碼低致病性新城疫病毒的F和HN蛋白的核苷酸序列以高致病性 新城疫病毒的相應(yīng)序列替換；以任一選自以下的密碼子替換高致病性新城 疫病毒的F蛋白的第U5位氮基酸的密碼子包括GCA、 GCC、 GCG 和GCU的丙氨酸密碼子；包括GAC和GAU的天冬氨酸密碼子；包括 UUC和UUU的苯丙氨酸密碼子；包括AUC和AUU的異亮氨酸密碼子； 包括UUA和UUG的亮氨酸密碼子；包括UCA、 UCC、 UCG和UCU的 絲氨酸密碼子；包括ACC和ACU的蘇氨酸密碼子；包括GUA、 GUC、 GUG和GUU的纈氨酸密碼子；以及包括UAC和UAU的酪氨酸密碼子，
其中該病毒的特征在于具有等于或類似于高致病性新城疫病毒的抗 原性，以及降低的致病性。
在制備該重組體新城疫病毒過程中，所述HN基因可以被額外地突 變，使得HN蛋白的第1-569位氨基酸的密碼子編碼高致病性新城疫病毒 的相應(yīng)氨基酸，第570位之后的氨基酸的密碼子編碼低致病性新城疫病毒 (包括La Sota毒林)的相應(yīng)氬基酸。
另夕卜，該方法包括以下步驟將上述用于轉(zhuǎn)錄才艮據(jù)本發(fā)明的新城疫病 毒基因組的載體轉(zhuǎn)染至宿主細(xì)胞中；并拯救重組體新城疫病毒。對(duì)于用于 轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞沒有特別的限制，可優(yōu)選地為選自Hep2和BHK21的動(dòng) 物細(xì)胞。
在另一方面，本發(fā)明涉及一種弱化新城疫病毒的致病性并且提高其抗原性和穩(wěn)定性的方法，包括以下步驟
將編碼低致病性新城疫病毒的F和HN蛋白的核苷酸序列以高致病性 新城疫病毒的相應(yīng)序列替換；以及
以任一選自以下的密碼子替換編碼高致病性新城疫病毒的F蛋白的 第115位氨基酸的密碼子包括GCA、 GCC、 GCG和GCU的丙氨酸密 碼子；包括GAC和GAU的天冬氨酸密碼子；包括UUC和UUU的苯丙 氨酸密碼子；包括AUC和AUU的異亮氨酸密碼子；包括UUA和UUG 的亮氨酸密碼子；包括UCA、 UCC、 UCG和UCU的絲氨酸密碼子；包 括ACC和ACU的蘇氨酸密碼子；包括GUA、 GUC、 GUG和GUU的 纈氨酸密碼子；以及包括UAC和UAU的酪氨酸密碼子。
在該方法中，所述載體的HN基因可以被額外地突變，使得HN蛋白 的笫1-569位氨基酸的密碼子編碼高致病性新城疫病毒的相應(yīng)氨基酸，第 570位之后的氨基酸的密碼子編碼低致病性新城疫病毒(包括La Sota毒 林)的相應(yīng)氨基酸。
在另 一方面，本發(fā)明涉及一種包含所述重組新城疫病毒的新城疫病疫 苗，具有如上文所述的增加的抗原性和降低的致病性。該新城疫病疫苗可 以是通過將重組新城疫病毒滅活獲得的滅活疫苗?？赏ㄟ^應(yīng)用本發(fā)明所屬 技術(shù)領(lǐng)域中已知的常規(guī)方法進(jìn)行滅活，所述技術(shù)例如使用甲醛或氳溴酸溴 甲基胺(bromomethyl amine hydrobromide)等?；蛘?由于重纟且新城疫 病毒的低致病性、高穩(wěn)定性和高安全性，還可能使用活疫苗形式或可直接 應(yīng)用至受精卵的卵內(nèi)疫苗形式的新城疫病疫苗。當(dāng)使用活疫苗形式的本發(fā) 明的疫苗的時(shí)候，其給藥途徑?jīng)]有限制，例如為與癥狀和目的相適應(yīng)，可 以通過皮下或肌肉途徑給予它或者通過噴霧或飲水的方式給予它。本發(fā)明 的疫苗劑量可能依賴于給予方法和被給予的受試者的狀況，例如所述疫苗 劑量可以為101 EIDso (50%卵感染劑量)至1012 EIDso毒林/個(gè)體。更具 體而言，在滅活疫苗的情況下，疫苗用量可優(yōu)選地為10^"EIDso/個(gè)體， 更優(yōu)選108'Q~1GEIDso/個(gè)體。在卵內(nèi)疫苗的情況下，才艮據(jù)待給予的卵中母系 抗體水平使用的疫苗可優(yōu)選為10M力EID5o/蛋的量，更優(yōu)選103'Q~7'G EID別/ 蛋的量。
如上文所述，可通過F蛋白的費(fèi)林蛋白酶的識(shí)別切割區(qū)的M,列 來確定新城疫病毒的致病性。即，如果F蛋白的費(fèi)林蛋白酶的識(shí)別切割區(qū) 的M酸序列是R-X-K/R-R (位于第113-116位；在下文中，除非該位置區(qū)間定義不同，否則它適用于所有的M酸四聚體)，那么F蛋白可被存 在于全身的所有細(xì)胞中的費(fèi)林蛋白酶切割并被激活，導(dǎo)致全身性感染，從 而顯示高致病性。相反，如果僅有一個(gè)堿性氨基酸或有不連續(xù)的堿性M 酸(例如R-Q-G-R或G-Q-G-R)，那么F蛋白被僅存在于消化道和器官 的部分上皮細(xì)胞中的胰蛋白酶或其類似物激活，導(dǎo)致局部的感染，從而顯 示低致病性。對(duì)于HN，高致病性病毒包含571個(gè)氣基酸，該氨基酸長(zhǎng)度 相對(duì)較短。相反，低致病性病毒包含577或616個(gè)氨基酸，該氨基酸長(zhǎng)度 相對(duì)較長(zhǎng)，其中的額外C末端區(qū)使得有可能區(qū)別高致病性病毒與低致病 性病毒。因此，通過制備具有HN的額外C末端區(qū)和F蛋白的切割位點(diǎn) 的多種組合的重組體病毒，有可能制備具有多種致病性水平的病毒。
具體而言，本發(fā)明的特征在于，F(xiàn)蛋白的切割位點(diǎn)的M酸序列被更 安全的氨基酸序列替換，目的是抑制該重組體病毒通過任何可能的遺傳變 異獲得致病性。如上文所述，低致病性病毒F蛋白的切割位點(diǎn)的氨基, 列是R-Q-G-R或K-Q-G-R。為了將該低致病性病毒改造成高致病性病毒， 應(yīng)將上述氨基酸序列改變成R-X-K/R-R，因此位于第三位的甘氨酸(G) 必須變成精氨酸(R)或賴氨酸(K )。這種從G至R或K的變化可很容 易地僅通過一個(gè)點(diǎn)突變來實(shí)現(xiàn)。即，考慮到甘氨酸密碼子為GGA、 GGC、 GGG或GGU，以及精氨酸或賴氨酸密碼子為AGA、 AGG、 CGA、 CGC、 CGG、 CGU、 AAA或AAG，在任一甘氨酸密碼子中出現(xiàn)甚至僅一個(gè)點(diǎn) 突變即可將甘氨酸容易地改造成精氨酸或賴氨酸，導(dǎo)致低致病性病毒轉(zhuǎn)換 成高致病性病毒。事實(shí)上，2001年在澳大利亞已有報(bào)道稱，非致病性新 城疫病毒Ulster樣毒林通過類似于上述的機(jī)制變成致病性的，從而引起新 城疫病。
因此，為了顯著地降低所述疫苗林中任何點(diǎn)突變所導(dǎo)致的與現(xiàn)有^M目 比致病性增加的可能性，本發(fā)明提供了一種使用諸如PTDS (基于PCR 的兩步DNA合成)方法的任意常規(guī)方法來制備重組體病毒的技術(shù)，其中 該重組體病毒呈現(xiàn)出較低的這種由點(diǎn)突變導(dǎo)致的氨基酸變成賴氨酸或精 氨酸的可能性。即，在本發(fā)明中，位于常規(guī)低致病性病毒的F蛋白第115 位的氨基酸一一甘氨酸被選自以下的任一M酸替換丙氨酸、天冬氨酸、 苯丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、纈氨酸和色氨酸，例如 形成R-Q-A-R或G-Q-A-R，其中僅當(dāng)?shù)?15位甘氨酸的替換氨基酸的密 碼子中所有或至少2個(gè)堿基突變時(shí)，所述第115位甘氨酸的替換氨基酸才可變成賴氨酸或精氨酸，使得可制備更安全的疫苗林。
重組體新城疫病毒的致病性水平通過測(cè)量平均死亡時(shí)間(MDT)和 腦內(nèi)病原指數(shù)(ICPI)來確定。重組體新城疫病毒的生物性質(zhì)通過EIDso (50。/。卵感染劑量)、血凝離解率等來確證。結(jié)果是，才艮據(jù)本發(fā)明的重組 體新城疫病毒具有比現(xiàn)有低致病毒林顯著更低的致病性。
通過參考以下實(shí)施例，進(jìn)一步對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)的說明。然而，不 應(yīng)將這些實(shí)施例解釋為以任何方式的限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例l:克隆病毒基因 1.1病毒DNA的合成
選擇一種代表新城疫病毒的病毒，該病毒是最近國(guó)內(nèi)流行的速發(fā)型抗 原變異毒林SNU4152毒林，由College of Veterinary Medicine of Seoul National University的Avian Disease & Laboratory分離。在雞胚成纖維 細(xì)胞(CEF)進(jìn)行3次斑塊純化后，克隆該病毒，并將其在SPF含胚卵 中傳代培養(yǎng)兩次。所克隆的病毒毒林被命名為KBNP-4152 (保藏號(hào) KCTC10919BP )。
在無核糖核酸酶(RNase)的玻璃器亞和塑料器皿中進(jìn)行RNA操作， 所有溶液均使用高壓滅菌并且以1%焦碳酸二乙酯(DEPC)處理的三蒸 水(DEPC-DW )。然后，將該病毒在Beckman SW40轉(zhuǎn)子中以21,000 rpm 離心70 min，并將得到的沉淀片再懸浮于懸浮溶液(50mM Tris HC1 pH7.5、 50mM EDTA、 0.5% SDS )中。以蛋白酶K ( 200 /ig/ml， Invitrogen Co.)在37°C下處理卯min后，通過酸性酚提取(acidic phenol extraction) 來提取RNA。然后，在通過乙醇沉淀將所述RNA沉淀后，將所得到的沉 淀經(jīng)75%乙醇洗滌、干燥并再懸浮于DEPC-處理水中。
將l W的經(jīng)紫外線分光計(jì)(Eppendorf， Biophotometer)定量的所述 提取RNA、 1 W的在表l中顯示的引物(10pmol/)^)和10 a^的DEPC-水混合，使該混合物在70"C下變性10 min。向該混合物中添加4/^的5 x RT緩沖溶液(250 mM Tris-HCl， pH 8.3， 375 mM KC1， 15mM MgCl2; GibcoBRL/Life Technologies )、2 W的0.1 M DTT和2 W的10 mM dNTP (各2.5 mM)后，使該混合物在42t:下反應(yīng)2 min 。 然后,向該反應(yīng)混 合物中添加l W的逆轉(zhuǎn)錄酶(200單位，Invitroge n co.)，然后使其在42。C下反應(yīng)60 min。用于克隆KBNP-4152病毒基因的引物
引物
引物序列(5'->3')
ND畫ZJ-1F cgtctcgaccaaacagagaatctgtgaggtac (SEQ ID NO: 8)
ND-ZJ-1844R tcgtcttggtctctggatgtctc (SEQ ID NO: 17)
ND-ZJ-1746F gacaacacaggcacagctcg (SEQ ID NO: 9)
ND國(guó)ZJ-2948R cttctccactcccatgtcagg (SEQ ID NO: 18)
ND國(guó)ZJ曙2827F catctccttacgtgacacaagg (SEQ ID NO: 10)
ND國(guó)ZJ畫4612R cagcataatccgggtgatcagc (SEQ ID NO: 19)
ND-ZJ-F陽F tcgcgacgcaatatggctccaaactttc (SEQ ID NO: 11)
ND-ZJ-F-R ccgcggtagaacggatgttgtgaagcctaa (SEQ ID NO: 20)
ND國(guó)ZJ-HN畫F ccgcggcaccgacaacaagagtcaatcatg (SEQ ID NO: 12)
ND-ZJ-HN國(guó)R ctcaactagtaagggaacgatcctaaattcc (SEQ ID NO: 21)
ND-ZJ-8100F actagttgagatcctcaaggatgatag (SEQ ID NO: 13)
ND-ZJ-11815R tatggtatcagggttggatacacc (SEQ ID NO: 22)
ND-ZJ-11648F catgcaatgttgtccagagatg (SEQ ID NO: 14)ND-ZJ-12591R agctcataactcttgaagatagc (SEQ ID NO: 23) ND匪ZJ-12539F tcagagagagatttcgcgagac (SEQ ID NO: 15) ND-ZJ-14110R cacagaatgcatggcaatcagg (SEQ ID NO: 24) ND-ZJ-14021F cattgtgacattgagattcctcc (SEQ ID NO: 16) ND-ZJ-15118R actgaatccgaatacgacttcc (SEQ ID NO: 25)
為了減少PCR反應(yīng)過程中的人工突變，使用了具有DNA修復(fù)功能 的Pwo聚合酶(Invitrogen co.)。另外，將PCR產(chǎn)物通過可溶的純化試 齊'J盒(soluble purification kit) ( Boehringer Mannheim Co.)或通過i京月旨 糖膠純化試劑盒(QiagenCo.)進(jìn)行純化。
通過RT-PCR所荻得的KBNP-4152病毒基因的產(chǎn)物的定位顯示于圖 l中。
將該9類純化產(chǎn)物分別克隆至TA載體中，例如XL-Topo、 pCR8/GW/Topo或pcDNA3.1V5 Topo栽體(Invitrogen co.)，并得到3 個(gè)以上的克隆。然后，制備這些克隆的質(zhì)粒并確定質(zhì)粒的核普酸序列。
使用循環(huán)測(cè)序試劑盒(PRISM Ready Reaction Dye終止子試劑盒) 和自動(dòng)DNA測(cè)序儀(ABBIO， Applied Biosystems Co.)確定所有核苷酸 序列。
用于核苷瞎列分析的引物分別是Ml3正向引物和M13反向引物。 對(duì)于未被引物識(shí)別(read)的片段的情況，依照引物步行方法使用在表3 中顯示的引物分析這些核苷^列。 HN和F蛋白的半胱氨酸殘基和N-連接的糖基化位點(diǎn)的變化
HN
Cl (123)G5 (508)G6 (538)C2 (27)
曙(w)-++
SNU4152+++-(R)
SNU0202++--(R)影響F蛋白的結(jié)構(gòu)和極性的氨基酸的變化_
27 76 104 112 115 145 192 195232247403422430480486 KBNP-4152 RCGRKN NRQNDHDSS
VII (共有).........D畫--R -
Ulster CFE G G - KQ-D-Q-K-LaSota C - E G G K KQKDNQGKR VGGAC - EGGK KQKDNQGKR
如這些結(jié)果中顯示的,證實(shí)了本發(fā)明中使用的KBNP-4152毒抹具 有類似于基因VII型的基因型，并且該毒林與其他病毒型(與包括以前的 疫苗林La Sota毒抹)有遺傳差異。實(shí)施例2:用LaSota毒抹作為骨架制備用于轉(zhuǎn)錄新城疫病毒(NDV) 基因組的重組體載體
2丄表達(dá)新城疫病毒(NDV)的親本載體(pTMH)的設(shè)計(jì)和構(gòu)建 為了從NDV cDNA制備病毒，必須以與所述病毒基因組相同的結(jié)構(gòu) 轉(zhuǎn)錄該cDNA,而不能在所述病毒基因組的5，-末端和3，-末端添加不必 要的堿基。為了獲得這種結(jié)構(gòu)，制備了具有以下特征的親本載體pTMH (SEQ ID NO: 84 ):
1) 一個(gè)T7啟動(dòng)子位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的前端(參考圖l和圖4)。
2) —條肝炎5病毒(HDV)核酶序列位于NDV反基因組序列 (antigenomic sequence)后面,以發(fā)生自切割。
3) —個(gè)用于克隆NDV基因組的多克隆位點(diǎn)(MCS)最終位于T7啟 動(dòng)子和HDV核酶之間(參考圖4)。
4 )使用pBR322的復(fù)制起點(diǎn)(ori)，以使克隆載體穩(wěn)定地存在于大腸 桿菌中，即使在包括相當(dāng)于約15 kb核苷酸序列的全NDV瓦基因組的情 況下。
5 )將兩個(gè)不同的限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)5^i5 I和5sfl I置于T7啟 動(dòng)子和瓦基因組的5，-末端之間(NDV的轉(zhuǎn)錄在其中起始)，以及置于 HDV核酶和M因組的3，-末端之間(NDV的轉(zhuǎn)錄在其中終止)，以便 具體地從NDV"因組轉(zhuǎn)錄病毒基因組的兩個(gè)末端(參考圖3)。
如圖4中所示，將用于制備連接子的TM pl-p4引物中的TM p2引 物和TM p3引物各1.5 pmol、 TM pl引物和TM p4引物各30 pmol、 5 的10X PCR緩沖物、5 W的2.5 mM dNTP以及2.5 U的Taq聚合酶混合， 然后在該混合物中添加DW以使總體積為50 W。然后，使該混合物反應(yīng) 在94。C下lmin，隨后是25個(gè)循環(huán)在卯C下30sec、在55C下45sec 及在72匸下15sec,然后在72匸下進(jìn)一步反應(yīng)5min。在確證該P(yáng)CR擴(kuò) 增子以后，將其克隆至pCR8/GW/Topo TA克隆載體中，所獲得的具有全 核苷酸序列的克隆被命名為pCR-TM載體。
通過使用HDV的F和R引物以及才莫板pTV載體(獲自Mogam Biotechnology Research Institute的Park MH博士 )的PCR方法，擴(kuò)增 了包括HDV核酶和T7終止子區(qū)的片段，所得到的片段也被克隆至 pCR8/GW/Topo TA克隆載體中，所獲得的具有全核普酸序列的克隆被命 名為pCR-HDV。將以限制性內(nèi)切酶5s" I和A^fe I切割pCR-HDV載體產(chǎn)生的HDV 片段以及以相同限制性內(nèi)切酶切割的pCR-TM載體用T4 DNA連接酶連 接，并將其轉(zhuǎn)化至ToplOF，感受態(tài)細(xì)胞中。然后，將所獲得的轉(zhuǎn)化載體 命名為pCR-TMH。為了將所述載體穩(wěn)定地克隆至大腸桿菌中，將通過限 制性內(nèi)切酶五a 及I和I處理的pCR-TMH載體的T7啟動(dòng)子 -MCS-HDV核酶區(qū)亞克隆至pBR322載體(Promega Co" Cat. # D1511) 中，并將所得到的克隆命名為pTMH載體(SEQ ID NO: 84 )。
制備pTMH載體的過程的原理圖顯示于圖5中，親本載體pTMH的 一般切割圖鐠和核苷酸序列顯示于圖6中，所制備的pTMH栽體的核苷 ^列顯示于圖7中。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所制備的親本載體pTMH的限制性內(nèi) 切酶識(shí)別位點(diǎn)如下 (未出現(xiàn)位點(diǎn))
^grf 爿vfll J ^iJI 5y"51 5s附F I
5s附I 5虛 Eco及V
歷wrfin 爭(zhēng)I 2T/ml 舉I 她I 脂I 腸I 飾I 胸I 泡1 戶附el尸v"II 5Vi/1柳S附fll化AI AM 扁I X廳I (出現(xiàn)一個(gè)位點(diǎn))
X附wl 1959 鄉(xiāng)I 2166 5^1 64 55 5VicI 175及wl 0 1605 iVspI 471
7Vr I 49 ，el 293 l卯3I 1584
0 1752 C7fll 43 155
5s附J I30 5w附70 5附r I 1404 1478 丑fl"I 1312 5fl附m 181爿vrll 76 1535 如I 0 如I 35 J/wM882，11 471 (出現(xiàn)兩個(gè)位點(diǎn))
鄉(xiāng)I76,256 紐I 71,1843 AMI 345， 715 j/m" 785,2031^1/11 147， 2282 5sfl I 82,1431*
2.2. La Sota毒林的全cDNA的克隆
La Sota/46毒林(AY845400)的RNA提取和cDNA合成通過實(shí)施例 1的方法進(jìn)4亍。2.2.1 NDV全長(zhǎng)cDNA的PCR
基于GenBank數(shù)據(jù)，通過實(shí)施例1的方法，通過PCR反應(yīng)使用在表 8中顯示的引物組來擴(kuò)增相當(dāng)于15,186 bp的核苦酸序列的全NDVcDNA, 并將其克隆。用于克隆La Sota毒株全基因組基因的引物_
引物 引物序列(5'->3')_
Sl-Fcgtctcgaccaaacagagaatccgtgagttacg (SEQ ID NO: 36)
51- Rccatgggccc tttttagcat tggacg (SEQ ID NO: 37)
52- Faaaagggccc atggtcgagc cc (SEQ ID NO: 38) S2-Rtatcatcgat catgccgaca gtg (SEQ ID NO: 39) S3誦Fcatgatcgat gataaaccca age (SEQ ID NO: 40) S3誦Rtcgcgaatgagccggt egggatccag ac (SEQ ID NO: 41) S4-Ftcgcgacgcaatatgg ctccaaactt tc (SEQ ID NO: 42)
54- Rccgcggtagaacggat gttgtgaagc ctaa (SEQ ID NO: 43)
55- Fccgcggcaccgacaac aagagtcaat catg (SEQ ID NO: 44)
55- Rctcaactagt aagggaacga tcctaaattc c (SEQ ID NO: 45)
56- Fa￡tagt tgagat cctcaaggat gatag (SEQ ID NO: 46) S7曙Rgatcegtacg aatgcagctg aactc (SEQ ID NO: 47) S9國(guó)Fcctagg tatt accaaactca aaga (SEQ ID NO: 48)
S9-RGGTCTCaaccaaacaaa gatttggtga atg (SEQ ID NO: 49)
通過RT-PCR獲得的La Sota毒林基因的產(chǎn)物的位置顯示于圖8中。 分別將8部分的La Sota毒林基因插入至TA-克隆載體中的載體圖顯
示于圖9A，用PCR將插入至以處理的該載體中的片段的大小顯
示于圖9A中。
2.2.2. NDV全長(zhǎng)cDNA的克隆和序列分析
在將所擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳評(píng)估后，將所得到的凝膠 經(jīng)GenClean mTM ( Qbio Co.)純化，并用Topo克隆試劑盒(Invitrogen ) 或XL-Topo克隆試劑盒(Invitrogen)克隆。將得到的每個(gè)克隆的所有核 苷酸序列用載體上的引物(例如M13正向、M13反向等)或者用在表9 中顯示的引物分析。結(jié)果是，選擇了具有與以前已知的LaSota毒株相同 核苷酸序列的克隆，即那些其中參發(fā)生突變的克隆。[表9用于分析La Sota毒林基因組的核苷紗列的引物_
引物 引物序列(5'->3')_
La-601 taccctggagaggatcctc (SEQ ID NO: 50) La-1261 cgagctaaagctaaccccag (SEQ ID NO: 51) La-1901 agatgcagagatcgacgagc (SEQ ID NO: 52) La-2581 aggcgatatcacagagagta (SEQ ID NO: 53) La國(guó)3271 gtgccccaattgtgccaag (SEQ ID NO: 54) S6-F畫La actagttgagatcctcaaagatgacgg (SEQ ID NO: 55)
56- R-La tgctctgccctttcaggaccggagctcgccatg (SEQ ID NO: 56)
57- F-La catggcgagctccggtcctgaaagggcagagca (SEQ ID NO: 57) La-5121 cagctcaggaattagactgc (SEQ ID NO- 58)
La-5711 gtcatcgccaactgcaagat (SEQ ID NO: 59) La-7042 ctccggacatctgcaacag (SEQ ID NO: 60) La-8591 aaactcggaagggcagtac (SEQ ID NO: 61) La-9311 ttcgcattcaacctgcagg (SEQ ID NO: 62) La-9971 cttagagatgacaatgtggc (SEQ ID NO: 63) La-10661 gtaagatcagacgactctcc (SEQ ID NO:64) La-11321 tttgagactgttgcaagcc (SEQ ID NO: 65) La-12012 tgtcgcc織tgtaaaggc (SEQ ID NO: 66) La-12721 tacccgaaattggatcagtg (SEQ ID NO: 67) La-13339 catgtctcggaagagcctc (SEQ ID NO: 68) La-13981 atctgcagtgccct譜ga (SEQ ID NO: 69) Lal4976acagtaactgtgactcttaacgaaaatcacatattaataggctcc (SEQ ID NO: 70)
Lal5020R ggagcctattaatatgtgattttcgttaagagtcacagttactgt (SEQ ID NO: 71)
S7-R gatccgtacgaatgctgctgaactc (SEQ ID NO: 72)
NDV-Pt國(guó)R tgccactgmtagttgygata (SEQ ID NO: 73) NDcomF15 atacacctcrtcycagacag (SEQ ID NO: 74) 6
La-8892R gagccatgc纖cttggctgtggacc (SEQ ID NO: 75) La-14708 acagtgcacgagacagatcc (SEQ ID NO: 76)La畫15092R gtcctaaggagtcagggttc (SEQ ID NO: 77)_
將核苷酸序列未出現(xiàn)突變的所有克隆分別克隆至親本載體pTMH的 多克隆位點(diǎn)中，如圖10中所示。同時(shí)，在L基因之間引入了新的限制性 識(shí)別位點(diǎn)。該克隆過程顯示于圖10中。
2.2.3.表達(dá)用于形成RNP復(fù)合體的NP、 P和L蛋白的載體的制備 為了制備用于表達(dá)新城病毒的NP、 P和L蛋白的載體，通過RT-PCR 反應(yīng)^f吏用在表10中顯示的引物分別對(duì)La Sota毒林的NP、 P和L基因進(jìn) 行擴(kuò)增，并將擴(kuò)增的產(chǎn)物克隆至TA-克隆栽體中。在對(duì)這些克隆進(jìn)行測(cè)序 分析后，僅將核苷酸序列未出現(xiàn)突變的克隆以A^/I處理，并將其亞克隆 至pcDNA6/V5載體的7VWI位點(diǎn)中。 KBNP-4152的ICPI測(cè)量
天數(shù)12345678總和(指數(shù))
有癥狀600000006xl
死亡41010101010101074x2
正常00000000
總計(jì)二 154
ICPI = 154/80 = 1.925[表12KBNP-C4152R2L的ICPI測(cè)量
天數(shù)12345678總和(指數(shù))
有癥狀000000000xl
死亡000000000x2
正常1010101010101010
總計(jì)=154
ICPI = 0/80 = 0.0
嵌合船V疫苗的保護(hù)效率及免疫原性
荊量 !滴度
疫苗
〖滅活、HA測(cè)試
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04, 6i i 15如表14中所示，即使通過HA效價(jià)計(jì)算的KBNP-C4152R2L的抗原 量比La Sota毒林低，KBNP-C4152R2L的抗體形成能力也大大優(yōu)于以前 的疫苗。具體而言，與使用LaSota毒糾目比，使用KBNP-C4152R2L時(shí) 的抗野毒林的血清學(xué)免疫是更優(yōu)的。
3.9. KBNP-C4152R2L的卵內(nèi)疫苗試驗(yàn)
KBNP-C4152R2L具有比用于當(dāng)前疫苗的病毒毒林更低的致病性，其 用于卵內(nèi)疫苗的可能性較高。為了確證這一點(diǎn)，將卵內(nèi)疫苗接種于18日 齡雞胚中，并將孵化率以及在孵化后兩周得到的體重增加速率與對(duì)照組進(jìn) 行比較。通過檢查2周齡或更大的接種雞胚的抗體效價(jià)，確定了母體抗體 是否纟皮克服，并且比較了免疫水平。在2周后，用所述速發(fā)型病毒激發(fā)該 雞胚，并確定了抑制所述病毒的保護(hù)率。
用于該試驗(yàn)的雞胚為通常的產(chǎn)卵雌性小雞，并將O.lcc的各稀釋的疫 苗林(107'0 EID5()/ml)接種于18日齡的雞胚中。陰性對(duì)照組是以O(shè).lcc 的無菌PBS接種的。為了確證母體抗體的水平，在孵化后立即將陰性對(duì) 照組的5只雞胚安樂死，并取所述安樂死的雞胚的血清。在17天后，測(cè) 量每組個(gè)體的重量并取血。然后，將毒林KBNP-4152 (106'5 EIDso)接種 至其鼻腔和口腔中。在所述攻擊接種后，觀測(cè)直至10天的存活率。結(jié)果 顯示于表15中。
[表1SKBNP-C4152R2L的卵內(nèi)疫苗效應(yīng)的比較
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如表15中所示，KBNP-C4152R2L接種組和陰性對(duì)照組的孵化率和 體重增加速率在統(tǒng)計(jì)學(xué)上沒有顯著差異。然而，在孵化后17天時(shí)， KBNP-C4152R2L接種組中的抗體效價(jià)比對(duì)照組中的高。即，在對(duì)照組的情況下，母體抗體對(duì)La Sota毒林的抑制(HI )效價(jià)從1天時(shí)的平均5.8 ± 2.7降低2.7 ± 1.7。在另一方面，在KBNP-C4152R2L接種組的情況下， 在l天時(shí)母體抗體對(duì)LaSota毒林的HI效價(jià)為4.9 ± 1.1，并顯示5.5 ± 1.4的相對(duì)較高的HI效價(jià)。另外，在激發(fā)后，對(duì)照組中出現(xiàn)33%的死亡 率，而重組體疫苗接種組中出現(xiàn)100%的存活率。
這些結(jié)果比Akzo Nobel N/6 V (NL) Company的題為"Recombinant Newcastle virus as an embryo vaccine"的美國(guó)專利"US6，699，479B1"好 得多，其意義在于疫苗獲自于通過不使用依照P基因編輯的減毒的新方法 開發(fā)的KBNP-C4152R2L。
最近，發(fā)達(dá)國(guó)家已優(yōu)先選擇可以在孵化前直接對(duì)雞胚進(jìn)行疫苗接種的 卵內(nèi)疫苗，這是因?yàn)檫@些疫苗具有接種簡(jiǎn)單和經(jīng)濟(jì)性的特點(diǎn)。然而，在現(xiàn) 在已知的應(yīng)用于新城疫病的活疫苗抹中具有限制，因?yàn)檫@些毒林對(duì)于雞胚 有致病性。在另一方面，已確認(rèn)本發(fā)明的KBNP-C4152R2L在雞胚中無 致病性，并且預(yù)期應(yīng)用KBNP-C4152R2L作為卵內(nèi)疫苗的價(jià)值是很高的。
如上文所述，本發(fā)明的新城疫病毒具有與同時(shí)在國(guó)內(nèi)及整個(gè)亞洲流4亍 的速發(fā)型新城疫病毒類似的抗原性。另外，因?yàn)楸景l(fā)明的新城疫病毒具有 與現(xiàn)在使用的疫苗林類似或顯著較低的致病性，所以該疫苗可被用作卵內(nèi) 疫苗。另外，通過點(diǎn)突變獲得致病性的可能性要顯著低于以前的疫苗抹。 因此，本發(fā)明的新城疫病毒可用于制備滅活疫苗、活疫苗及卵內(nèi)疫苗，用 于在國(guó)內(nèi)及整個(gè)亞洲預(yù)防新城疫病。
權(quán)利要求
1.一種用于轉(zhuǎn)錄新城疫病毒基因組的載體，包括編碼低致病性新城疫病毒的NP、P、M和L蛋白的核苷酸序列，所述低致病性新城疫病毒在F蛋白的第113-116位具有下文式1所表示的氨基酸序列；和編碼高致病性新城疫病毒的F和HN蛋白的核苷酸序列，所述高致病性新城疫病毒在F蛋白的第113-116位具有下文式2所表示的氨基酸序列，其中包括在所述載體中的F蛋白編碼序列的特征在于，以任一選自以下的密碼子替換編碼所述高致病性新城疫病毒的F蛋白的第115位氨基酸的密碼子包括GCA、GCC、GCG和GCU的丙氨酸密碼子；包括GAC和GAU的天冬氨酸密碼子；包括UUC和UUU的苯丙氨酸密碼子；包括AUC和AUU的異亮氨酸密碼子；包括UUA和UUG的亮氨酸密碼子；包括UCA、UCC、UCG和UCU的絲氨酸密碼子；包括ACC和ACU的蘇氨酸密碼子；包括GUA、GUC、GUG和GUU的纈氨酸密碼子；以及包括UAC和UAU的酪氨酸密碼子式1113-X1X2X3X4-116其中X1、X3和X4獨(dú)立地為精氨酸(R)或賴氨酸(K)，并且X2選自丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、纈氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、組氨酸和賴氨酸。式2113-X4X5X7X8-116其中X5、X6和X7獨(dú)立地選自丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、纈氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、組氨酸和賴氨酸，且X5和X7不同時(shí)為精氨酸(R)或賴氨酸(K)，并且X8為精氨酸(R)或賴氨酸(K)。
2.根據(jù)權(quán)利要求l的載體，其中所述^f^it病性新城疫病毒選自基因n型 新城疫病毒，所述高致病性新城疫病毒選自基因vi和vn型新城疫病毒。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2的載體，其中所述4級(jí)病性新城疫病毒為L(zhǎng)a Sota/46 毒林(AY845400 )，所述高致病性新城疫病毒為KBNP-C4152 ( KCTC 10919BP )o
4. 才Mt權(quán)利要求l的載體，其中編碼所述HN蛋白的核苷酸序列為編碼 重組體HN蛋白的核苷齡列，其中將所述^Jt病性新城疫病毒的HN蛋白的 第570位后的M酸序列連接至所述高致病性新城疫病毒的HN蛋白第569 位g的C-末端。
5. 根據(jù)權(quán)利要求l的載體，具有SEQH)NO:l的核苷斷列。
6. —種新城疫病^4林，包括編碼^Jt病性新城疫病毒的NP、 P、 M和L蛋白的核苷斷列，所 述^Jt病性新城疫病毒在F蛋白的第113-116位具有下文式1所表示的M酸 序列；和編碼高致病性新城疫病毒的F和HN蛋白的核苦酸序列，所述高致 病性新城疫病毒在F蛋白的笫113-116位具有下文式2所表示的絲斷列，其中包括在所述毒抹中的F蛋白編碼序列的特征在于，以任一選自以下 的密碼子替換編碼所述高致病性新城疫病毒的F蛋白的第115位氨基酸的密碼 子包括GCA、 GCC、 GCG和GCU的丙氨酸密碼子；包括GAC和GAU 的天冬氨酸密碼子；包括UUC和UUU的苯丙氨酸密碼子；包括AUC和AUU 的異亮氨酸密碼子；包括UUA和UUG的亮氨酸密碼子；包括UCA、 UCC、 UCG和UCU的絲氨酸密碼子；包括ACC和ACU的蘇氨酸密碼子；包括 GUA、 GUC、 GUG和GUU的纈氨酸密碼子；以及包括UAC和UAU的酪 氨酸密碼子式l113-X!X2X3X4國(guó)U6其中&、 X3和X4獨(dú)立地為精氨酸(R)或賴氨酸(K)，并且X2選自丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、曱硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、纈氨酸、天冬酰胺、半J3t^酸、^酰胺、甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、 酪氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、組氨酸和賴氨酸， 式2113-X4XsX7Xg-116其中X5、 X6和X7獨(dú)立itk^自丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、曱石錄酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、纈氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、M酰胺、甘氨酸、絲 氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、組氨酸和賴氨酸，且Xs和X7不同時(shí)為精氨酸(R)或賴氨酸(K)，并且 Xs為精氨酸(R)或賴氨酸(K)。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6的毒抹，其中所述^Jt病性新城疫病"^選自基因n型新城疫病毒，所述高致病性新城疫病毒選自基因vi型和vn型新城疫病毒。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7的毒林，其中所述低致病性新城疫病毒為L(zhǎng)a Sota/46 毒抹(AY845400 )，所述高致病性新城疫病毒為KBNP-C4152 ( KCTC 薩9BP )。
9. 根據(jù)權(quán)利要求6的泰眛，其中編碼所述HN蛋白的核苷酸序列為編碼 重組體HN蛋白的核苷齡列，其中所述4組病性新城疫病毒的HN蛋白的第 570位后的M酸序列連接至所述高致病性新城疫病毒的HN蛋白第569位殘 基的C-末端。
10. 根據(jù)權(quán)利要求6的毒林，其中所述毒林為KCTC 10984BP。
11. 一種制備重組體新城疫病毒的方法，包括下述步驟 將編碼低致病性新城疫病毒的F和HN蛋白的核苷酸序列以高致病性新城疫病毒的F和HN蛋白的核苷^列替換，所述4級(jí)病性新城疫病毒在F 蛋白的第113-116位具有下文式1所表示的絲斷列，所述高致病性新城疫 病毒在F蛋白的第113-116位具有下文式2所表示的M,列；以任一選自以下的密碼子替換編碼所述高致病性新城疫病毒的F蛋白的 第115位氨基酸的密碼子包括GCA、 GCC、 GCG和GCU的丙氨酸密碼子； 包括GAC和GAU的天冬氨酸密碼子；包括UUC和UUU的苯丙氨酸密碼子； 包括AUC和AUU的異亮氨酸密碼子；包括UUA和UUG的亮氨酸密碼子； 包括UCA、 UCC、 UCG和UCU的絲氨酸密碼子；包括ACC和ACU的蘇 氨酸密碼子；包括GUA、 GUC、 GUG和GUU的纈氨酸密碼子；以及包括 UAC和UAU的酪氨酸密碼子式l<formula>formula see original document page 4</formula>其中&、 X3和X4獨(dú)立地為精氨酸(R)或賴氨酸(K)，并且 X2選自丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甲減氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色 氨酸、纈氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、M酰胺、甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、組氨酸和賴氨酸，式2<formula>formula see original document page 5</formula>其中X5、 X6和X7獨(dú)立地選自丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甲減氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、纈氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、絲 氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、組氨酸和賴氨酸，且Xs和X7不同時(shí)為精氨酸(R)或賴氨酸(K),并且 Xs為精氨酸(R)或賴氨酸(K)。
12. 根據(jù)權(quán)利要求ll的方法，其中所述4敏病性新城疫病毒選自基因n型新城疫病毒，所述高致病性新城疫病毒選自基因VI和VII型新城疫病毒。
13. 根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中所述^Jt病性新城疫病毒為L(zhǎng)a Sota/46 毒林(AY845400 )，所述高致病性新城疫病毒為KBNP-C4152 (KCTC 10919BP)。
14. 根據(jù)權(quán)利要求ll的方法，另外包括以下步驟對(duì)編碼所述HN蛋白 的核苷酸序列進(jìn)^#飾以編碼一種重組體HN蛋白，其中將所述低致病性新城 疫病毒的HN蛋白的第570位后的^J^酸序列連接至所述高致病性新城疫病毒 的HN蛋白第569位g的C-末端。
15. 根據(jù)權(quán)利要求ll的方法，其特M于將所述栽體用于轉(zhuǎn)a利要求 1-5任一項(xiàng)中限定的重組體新城疫病毒基因組。
16. 根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中所述重組體新城疫病毒為KCTC 10984BP。
17. —種減毒并改進(jìn)新城疫病毒的抗原性和穩(wěn)定性的方法，包括下述步驟 將編碼^ft病性新城疫病毒的F和HN蛋白的核苷斷列以高致病性新城疫病毒的F和HN蛋白的核苷斷列替換，所述^ft病性新城疫病毒在F 蛋白的第113-116位具有下文式1所表示的^酸序列，所述高致病性新城疫 病毒在F蛋白的第113-116位具有下文式2所表示的^^^列；以任一選自以下的密碼子替換編碼所述高致病性新城疫病毒的F蛋白的 第115位氨基酸的密碼子包括GCA、 GCC、 GCG和GCU的丙氨酸密碼子； 包括GAC和GAU的天冬氨酸密碼子；包括UUC和UUU的苯丙氨酸密碼子； 包括AUC和AUU的異亮氨酸密碼子；包括UUA和UUG的亮氨酸密碼子； 包括UCA、 UCC、 UCG和UCU的絲氨酸密碼子；包括ACC和ACU的蘇氨酸密碼子；包括GUA、 GUC、 GUG和GUU的纈氨酸密碼子；以及包括 UAC和UAU的酪氨酸密碼子 式l113^X2X3X4-116其中Xp X3和X4獨(dú)立地為精氨酸(R)或賴氨酸(K)，并且 X2選自丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甲減氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、纈氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、a酰胺、甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、組氨酸和賴氨酸， 式2113-X4X5X7X8-116其中X5、 X6和X7獨(dú)立地選自丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甲M酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、纈氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酖胺、甘氨酸、絲 氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、組氨酸和賴氨酸，且Xs和X7不同時(shí)為精氨酸(R)或賴氨酸(K),并且 Xs為精氨酸(R)或賴氨酸(K)。
18. 才緣權(quán)利要求17的方法，另外包括以下步驟對(duì)編碼所述HN蛋白 的核苷酸序列進(jìn)行修飾以編碼一種重組體HN蛋白，其中將所述低致病性新城 疫病毒的HN蛋白的第570位后的M斷列連接至所述高致病性新城疫病毒 的HN蛋白第569位tt的C-末端。
19. 一種新城疫病疫苗，含有權(quán)利要求6-10任一項(xiàng)中所限定的重組體新 城疫病"^^林。
20. 才娥權(quán)利要求19的疫苗，其中所述疫苗的使用類型選自滅活死疫苗、 活疫苗和卵內(nèi)疫苗。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于轉(zhuǎn)錄新城疫病毒(NDV)基因組的重組體載體、一個(gè)由該載體制備的具有致病性NDV表面抗原的減毒重組體NDV毒株、一種使用該載體制備具有低致病性和抗新城疫病(ND)的高防護(hù)效力的重組體NDV的方法以及一種抗包含所述重組體NDV的ND的疫苗。
文檔編號(hào)C12N15/63GK101595220SQ200680056436
公開日2009年12月2日 申請(qǐng)日期2006年9月27日 優(yōu)先權(quán)日2006年9月26日
發(fā)明者安映珍, 樸昤浩, 權(quán)赫俊, 趙瑄熙, 金兌恩, 金善中, 金日煥, 金泰煥, 金采鉉, 韓長(zhǎng)赫, 高米訂 申請(qǐng)人:Kbnp株式會(huì)社;Biopoa株式會(huì)社