專利名稱：利用單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)雞脂肪性狀的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)雞數(shù)量性狀的方法，特別涉及一種利用單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)雞脂肪性狀的方法。
背景技術(shù)：
近幾年來，隨著肉雞生長(zhǎng)速度的提高，雞的脂肪性狀越來越受到關(guān)注。在肉用仔雞生產(chǎn)中，過多的脂肪沉積不僅降低肉仔雞的飼料利用率，同時(shí)影響肉的風(fēng)味，降低肉仔雞的商品價(jià)格。另外，容易引起肉仔雞脂肪肝綜合癥，給后續(xù)產(chǎn)品加工增加困難，并對(duì)環(huán)境造成巨大污染。而且產(chǎn)蛋雞在其產(chǎn)蛋后期沉積過多的脂肪將影響產(chǎn)蛋。因此，遺傳育種者在選擇生長(zhǎng)速度的同時(shí)，非常重視脂肪性狀，在育種工作中，希望選擇腹脂低、皮下脂厚小的雞個(gè)體。但是，腹脂和皮下脂厚是屠體性狀，無法直接度量，只能進(jìn)行傳統(tǒng)的同胞或后裔選擇，由于遺傳力低，在時(shí)間和資金上耗費(fèi)大，難應(yīng)用于育種實(shí)踐。血液生化指標(biāo)也被證明不能作為雞脂肪性狀的理想指標(biāo)。
動(dòng)物采食后，食物中的脂肪、膽固醇等脂質(zhì)物質(zhì)經(jīng)過小腸時(shí)在胰脂酶的作用下形成乳糜微粒而進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，乳糜微粒經(jīng)過腸粘膜被運(yùn)輸至血液，存在于脂肪組織、骨骼肌和心臟等毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的脂蛋白脂肪酶可作用于乳糜微粒，釋放出游離脂肪酸，乳糜微粒則衍生為乳糜微粒殘粒，后者被肝臟吸收并在那兒參加新的代謝過程，衍生為脂肪酸、甘油、膽固醇和蛋白。因此，食物中的脂質(zhì)物質(zhì)主要的命運(yùn)是變成甘油三酯轉(zhuǎn)運(yùn)至脂肪細(xì)胞或變成膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)至肝臟。在后續(xù)的合成過程中，來自肝臟中的脂肪酸合成的極低密度脂蛋白(VLDL)是血漿脂蛋白的主要來源。和乳糜微粒一樣，VLDL分子接受來自高密度脂蛋白(HDL)的apoB和apoCII(載脂蛋白B和CII)成為活性分子，在脂蛋白脂肪酶的作用下生成中間密度脂蛋白(IDL)和脂肪酸，后者則進(jìn)入脂肪細(xì)胞和肌細(xì)胞，合成脂肪或?yàn)槠涮峁┠芰?，大約50％的IDL被肝臟攝取，其余的IDL則在脂蛋白脂肪酶的作用下轉(zhuǎn)化為低密度脂蛋白(LDL)，LDL的主要功能在于將內(nèi)源或外源的膽固醇運(yùn)送到其他組織。
在雞的脂肪代謝過程中，脂蛋白脂肪酶(lipoprotein lipase，LPL)是關(guān)鍵酶，催化血漿脂蛋白中的總甘油三酯水解成脂肪酸和甘油的最重要的酶之一。脂蛋白脂肪酶是一種糖蛋白，分子量為60kD?；钚訪PL以同源二聚體形式存在。LPL主要水解血漿乳糜微粒和VLDL的甘油三酯，使甘油三酯1位和3位酯鍵斷裂。反應(yīng)中釋放出的游離脂肪酸可進(jìn)一步發(fā)生氧化反應(yīng)來供應(yīng)能量(例如在肌肉組織)，或可作為能源物質(zhì)被再酯化貯存在脂肪細(xì)胞。比較人類脂肪組織、牛乳腺、鼠巨噬細(xì)胞、豬脂肪組織和禽類的LPL一級(jí)結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)人類LPL氨基酸序列與哺乳類動(dòng)物有87％-94％同源性，與禽類比較也有70％同源性，表明了LPL在進(jìn)化過程中的高度保守性。
雞LPL基因全長(zhǎng)17kb，含10個(gè)外顯子和9個(gè)內(nèi)含子，成熟的酶蛋白編碼465個(gè)氨基酸(Cooper DA，Lu SC，Viswanath R，F(xiàn)reiman RN，Bensadoun A.the structureand complete nucleotide sequence of the avian lipoprotein lipase gene.Biochim Biophys Acta，1992，1129(2)166-171)，與哺乳類LPL的同源性則為73-77％。外顯子10是LPL基因中最大的外顯子，長(zhǎng)2206nt，含有整個(gè)3’端非翻譯區(qū)，它編碼5個(gè)多腺嘌呤信號(hào)(AATAAA)。其表達(dá)有組織特異性，受組織特異性順式調(diào)節(jié)子的調(diào)節(jié)。在雞LPL基因的5’端上游區(qū)，已闡明4個(gè)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，2個(gè)啟動(dòng)子和幾個(gè)增強(qiáng)子。參考Cooper DA等在GenBank中發(fā)表的雞LPL基因的基因組序列(GenBank Accession NumberX60547)，將開放閱讀框的第一個(gè)堿基C定為+1，將-1108nt至-803nt區(qū)段定義為d位點(diǎn)，-805nt至-500nt區(qū)段定義為e位點(diǎn)。較常見的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)在-204nt處，在這個(gè)位點(diǎn)下游16nt有一個(gè)類似于TATA box的基序TATAGGT，雞LPL是屬于不需功能性TATA box來起始轉(zhuǎn)錄的基因，因?yàn)樵谄?1～-300的啟動(dòng)子區(qū)含有76％的G和C，在-1947～-1這個(gè)區(qū)域內(nèi)發(fā)現(xiàn)了14個(gè)CCCC序列，該序列為ETF(表皮生長(zhǎng)因子受體)結(jié)合的核心序列，而沒有TATA box的啟動(dòng)子必須有ETF參與。雞LPL有多個(gè)負(fù)調(diào)控元件和順式調(diào)控元件調(diào)控轉(zhuǎn)錄。負(fù)調(diào)控元件位于-1947～-139區(qū)域內(nèi)，除去這些負(fù)調(diào)控元件，發(fā)現(xiàn)順式調(diào)控元件位于主要轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)至其上游138bp處。在這個(gè)區(qū)域內(nèi)有兩個(gè)正向重復(fù)的八聚核苷基序ATTTGCAT(-53～-26)，一個(gè)CCAAT box和一個(gè)GC島(-95～-68)，除去八聚核苷基序和GC島很顯著地降低雞LPL的表達(dá)。
在人類LPL研究中，研究者利用RFLPS技術(shù)及SSCP技術(shù)等檢測(cè)出LPL基因位點(diǎn)存在多態(tài)性，已發(fā)表的突變存在外顯子1-9，內(nèi)含子2、3、6、8，以及啟動(dòng)子區(qū)域，研究表明人類LPL基因的多態(tài)性與血脂、動(dòng)脈硬化及肥胖等疾病有關(guān)。(Jemaa R，TuzetS，Portos C，Betoulle D，Apfelbaum M，F(xiàn)umeron F.LPL gene polymorphismsassociations with hypertriglyceridemia and body mass index in obese people.Int J Obes Relat Metab Disord.1995，19(4)270-274；Razzaghi H，Aston CE，Hamman RF，Kamboh MI.genetic screening of the lipoprotein lipase gene formutations associated with high triglyceride/low HDL-cholesterol levels.Hum.genet.2000，107(3)257-267)。吳珍芳等發(fā)現(xiàn)豬的LPL基因的5′非翻譯區(qū)存在SSCP多態(tài)性(吳珍芳，熊遠(yuǎn)著，鄧昌彥，蔣思文，I.HARBTZ.豬LPL基因多態(tài)性及其部分DNA片段的測(cè)序.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1999，18(5)461-465。)。
單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)，主要是指在基因組水平上由單個(gè)核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。SNP所表現(xiàn)的多態(tài)性只涉及到單個(gè)堿基的變異，這種變異可由單個(gè)堿基的轉(zhuǎn)換(transition)或顛換(transversion)所引起，也可由堿基的插入或缺失所致。但通常所說的SNP并不包括后兩種情況。這種變異可能是轉(zhuǎn)換(C→T，在其互補(bǔ)鏈上則為G→A)，也可能是顛換(C→A，G→T，C→G，A→T)。轉(zhuǎn)換的發(fā)生率總是明顯高于其它幾種變異，具有轉(zhuǎn)換型變異的SNP約占2/3，其它幾種變異的發(fā)生幾率相似。
SNP檢測(cè)方法常采用一些已有的成熟技術(shù)，如DNA測(cè)序、限制性酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)、單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)、等位基因特異的寡聚核苷酸雜交(ASO)等。但不管哪一種方法，首先必須進(jìn)行靶序列的擴(kuò)增，然后才能進(jìn)行其它檢測(cè)。
日本Orita等研究發(fā)現(xiàn)，單鏈DNA片段呈復(fù)雜的空間折疊構(gòu)象，這種立體結(jié)構(gòu)主要是由其內(nèi)部堿基配對(duì)等分子內(nèi)相互作用力來維持的，當(dāng)有一個(gè)堿基發(fā)生改變時(shí)，會(huì)或多或少地影響其空間構(gòu)象，使構(gòu)象發(fā)生改變，空間構(gòu)象有差異的單鏈DNA分子在聚丙烯酰胺凝膠中受排阻大小不同。因此，通過非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)，可以非常敏銳地將構(gòu)象上有差異的分子分離開，該方法為單鏈構(gòu)象多態(tài)性(Single-Strand Conformation Polymorphism，SSCP)分析。將SSCP用于檢查PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的基因突變，建立了PCR-SSCP技術(shù)，進(jìn)一步提高了檢測(cè)突變方法的簡(jiǎn)便性和靈敏性。其基本過程是①PCR擴(kuò)增靶DNA；②將特異的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物變性，而后快速復(fù)性，使之成為具有一定空間結(jié)構(gòu)的單鏈DNA分子；③將適量的單鏈DNA進(jìn)行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳；④最后通過放射性自顯影、銀染或溴化乙錠顯色分析結(jié)果。若發(fā)現(xiàn)單鏈DNA帶遷移率與正常對(duì)照相比發(fā)生改變，就可以判定該鏈構(gòu)象發(fā)生改變，進(jìn)而推斷該DNA片段中有堿基突變。該方法簡(jiǎn)便、快速、靈敏，不需要特殊的儀器，適合臨床實(shí)驗(yàn)的需要。但它也有不足之處。例如，只能作為一種突變檢測(cè)方法，要最后確定突變的位置和類型，還需進(jìn)一步測(cè)序；電泳條件要求較嚴(yán)格；另外，由于SSCP是依據(jù)點(diǎn)突變引起單鏈DNA分子立體構(gòu)象的改變來實(shí)現(xiàn)電泳分離的，這樣就可能會(huì)出現(xiàn)當(dāng)某些位置的點(diǎn)突變對(duì)單鏈DNA分子立體構(gòu)象的改變不起作用或作用很小時(shí)，再加上其他條件的影響，使聚丙烯酰胺凝膠電泳無法分辨造成漏檢。盡管如此該方法和其他方法相比仍有較高的檢測(cè)率。首先，它可以發(fā)現(xiàn)靶DNA片段中未知位置的堿基突變。Takao經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明小于300bp的DNA片段中的單堿基突變，90％可被SSCP發(fā)現(xiàn)，他認(rèn)為現(xiàn)在知道的所有單堿基改變絕大多數(shù)可用該方法檢測(cè)出來。另外，SSCP方法可通過聚丙烯酰胺凝膠電泳將不同遷移率的突變單鏈DNA分離，并且還可以進(jìn)一步提純。用這種方法可以最終從DNA序列水平上鑒別突變DNA片段。
發(fā)明創(chuàng)造內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種利用單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)雞脂肪性狀的方法。
本發(fā)明提供的利用單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)雞脂肪性狀的方法，是用由序列表中SEQID №1和SEQ ID №2以及SEQ ID №3和SEQ ID №4組成的兩對(duì)引物中的至少一對(duì)引物對(duì)雞的總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到序列表中SEQ ID №5或/和SEQ ID№6的DNA序列；然后對(duì)所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)，確定自序列表中SEQ ID №5的5′端第31位堿基是A還是G，自序列表中SEQ ID №5的5′端第128位堿基是G還是缺失G；或/和自序列表中SEQ ID №6的5′端第32位堿基是C還是G，自序列表中SEQ ID №6的5′端第281位堿基是C還是T。
所述單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)的方法可為DNA測(cè)序、限制性酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)、單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)或等位基因特異的寡聚核苷酸雜交(ASO)等方法。為得到更好的檢測(cè)結(jié)果，所述單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)的方法優(yōu)選為先對(duì)所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行單鏈構(gòu)象多態(tài)性檢測(cè)，然后進(jìn)行DNA測(cè)序。
以序列表中SEQ ID №1和SEQ ID №2為引物得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為306bp，具有SEQ ID №5的核苷酸序列，如果自序列表中SEQ ID №5的5′端第31位堿基即雞LPL基因的-1078nt處為A，自序列表中SEQ ID №5的5′端第128位堿基即雞LPL基因的-981nt處為G，其純合體的基因型為AA；自序列表中SEQID №5的5′端第31位堿基即雞LPL基因的-1078nt處為G，自序列表中SEQ ID №5的5′端第128位堿基即雞LPL基因的-981nt處缺失G，其純合體的基因型為BB；其雜合體的基因型為AB。
以序列表中SEQ ID №3和SEQ ID №4為引物得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為306bp，具有SEQ ID №6的核苷酸序列，如果自序列表中SEQ ID №6的5′端第32位堿基即雞LPL基因的-774nt處為G，自序列表中SEQ ID №6的5′端第281位堿基即雞LPL基因的-525nt處為T，其純合體的基因型為CC；自序列表中SEQID №6的5′端第32位堿基即雞LPL基因的-774nt處為C，自序列表中SEQ ID №6的5′端第281位堿基即雞LPL基因的-525nt處為C，其純合體的基因型為DD；其雜合體的基因型為CD。
當(dāng)用由序列表中SEQ ID №1和SEQ ID №2以及SEQ ID №3和SEQ ID №4組成的兩對(duì)引物對(duì)雞的總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，結(jié)果表明BBDD、BBCC、ABDD型的平均肌間脂寬極顯著地低于AACC型(p＜0.01)，而且顯著低于AADD、BBCD、ABCD型(p＜0.05)；BBDD、ABDD型的平均皮下脂厚極顯著地低于AADD型(p＜0.01)，顯著低于AABB型(p＜0.05)；BBCC型的平均腹脂重極顯著地低于AADD型(p＜0.01)，ABCC型顯著低于AADD型(p＜0.05)，BBCC型顯著低于ABCC型(p＜0.05)。
當(dāng)用由序列表中SEQ ID №1和SEQ ID №2對(duì)雞的總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，結(jié)果表明d位點(diǎn)BB和AB基因型的平均肌間脂寬和皮下脂厚均顯著低于AA型(p＜0.05)；BB基因型的平均腹脂重極顯著低于AA和AB型(p＜0.01)；當(dāng)用由序列表中SEQ ID №3和SEQ ID №4對(duì)雞的總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，結(jié)果表明e位點(diǎn)CD和DD基因型的平均腹脂重極顯著低于CC型(p＜0.01)。
本發(fā)明鑒于LPL在脂類代謝過程中的生物學(xué)功能，將LPL基因作為脂肪沉積性狀的候選基因，利用單核苷酸多態(tài)性研究LPL基因的不同基因型與脂肪性狀的關(guān)系，對(duì)開展雞脂肪性狀的分子遺傳標(biāo)記輔助選擇，提高雞肉質(zhì)性狀選種的準(zhǔn)確性，提高遺傳進(jìn)展，具有重要意義。


圖1為d位點(diǎn)SSCP分型結(jié)果電泳圖譜圖2為e位點(diǎn)SSCP分型結(jié)果電泳圖譜具體實(shí)施方式
實(shí)施例1、檢測(cè)雞脂肪性狀1)基因組DNA的提取取500μl按常規(guī)方法制備的裂解血中加入蛋白酶K(20mg/ml)4μl，至終濃度200μg/ml，50-55℃消化過夜后，用等體積飽和苯酚，1∶1的苯酚∶氯仿，氯仿分別抽提1次，水相加入2倍體積的無水乙醇。然后離心，倒去上清，沉淀以70-75％的乙醇洗滌，離心后真空或空氣中干燥，沉淀溶于無菌雙蒸水中。
2)設(shè)計(jì)擴(kuò)增雞LPL基因5′側(cè)翼區(qū)d位點(diǎn)和e位點(diǎn)序列的引物擴(kuò)增d位點(diǎn)的引物序列為L(zhǎng)PL-d-5′F5′-TAA GAC CGC CAA ATC CCC-3′(SEQ ID №1)LPL-d-5′R5’-CAG TGG TTT CTC AGA GTG-3’(SEQ ID №2)擴(kuò)增e位點(diǎn)的引物序列為L(zhǎng)PL-e-5′F5′-CTG CCC TTG AAG TGA ATG-3′(SEQ ID №3)LPL-e-5′R5′-TGC AAG TTG CTG GAG GCT-3′(SEQ ID №4)3)PCR擴(kuò)增擴(kuò)增條件為94℃ 5min；30個(gè)循環(huán)的94℃ 40s、55℃ 40s、72℃ 55s；反應(yīng)于72℃延伸7min。
4)取1μL PCR產(chǎn)物，加入5-6μL的上樣緩沖液，98℃變性10min，然后冰浴5min，變性后PCR產(chǎn)物進(jìn)行非變性聚丙烯酰胺凝膠(PAGE，14％)電泳。10V/cm電泳10-12h后，銀染顯色。結(jié)果如圖1和圖2所示，表明d位點(diǎn)和e位點(diǎn)均存在多態(tài)性，d位點(diǎn)擴(kuò)增片段存在3種基因型，分別定義為AA、BB和AB(圖1)；e位點(diǎn)擴(kuò)增片段存在3種基因型，分別定義為CC、DD和CD(圖2)。圖1中，泳道1-2為AA基因型的擴(kuò)增產(chǎn)物；泳道3，5，6，7為BB基因型的擴(kuò)增產(chǎn)物；泳道4為AB基因型的擴(kuò)增產(chǎn)物。圖2中，泳道1-2為CC基因型的擴(kuò)增產(chǎn)物；泳道3-7為DD基因型的擴(kuò)增產(chǎn)物；泳道9-10為CD基因型的擴(kuò)增產(chǎn)物。
5)經(jīng)SSCP分析后，分別取d位點(diǎn)純合基因型個(gè)體和e位點(diǎn)純合基因型個(gè)體的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物交由北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司進(jìn)行PCR擴(kuò)增產(chǎn)物雙向直接測(cè)序。結(jié)果表明d位點(diǎn)擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID №5所示，e位點(diǎn)擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID №6所示。長(zhǎng)度均為306bp；在位點(diǎn)d處發(fā)現(xiàn)2個(gè)單核苷酸突變，基因型AA的自序列表中SEQ ID №5的5′端第31位堿基即雞LPL基因的-1078nt處為G，自序列表中SEQ ID №5的5′端第128位堿基即雞LPL基因的-981nt處為G，基因型BB的自序列表中SEQ ID №5的5′端第31位堿基即雞LPL基因的-1078nt處為G突變成A，自序列表中SEQ ID №5的5′端第128位堿基即雞LPL基因的-981nt處缺失G；在位點(diǎn)e處發(fā)現(xiàn)2個(gè)單核苷酸突變，基因型CC的自序列表中SEQ ID №6的5′端第32位堿基即雞LPL基因的-774nt處為G，自序列表中SEQ ID №6的5′端第281位堿基即雞LPL基因的-525nt處為T；基因型DD的自序列表中SEQ ID №6的5′端第32位堿基即雞LPL基因的-774nt處G突變?yōu)镃，自序列表中SEQ ID №6的5′端第281位堿基即雞LPL基因的-525nt處T突變?yōu)镃。
6)采用混合模型對(duì)位點(diǎn)d、e的基因型組合與三個(gè)脂肪性狀(肌間脂寬、皮下脂厚和腹脂重)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果如表1所示，表明不同基因型組合之間的效應(yīng)差異顯著。BBDD、BBCC、ABDD型的平均肌間脂寬分別比AACC型的低1.86毫米、1.52毫米、1.77毫米，差異極顯著(p＜0.01)，比AADD型的低1.39毫米、1.05毫米、1.30毫米，差異顯著(p＜0.05)，比BBCD型的低1.35毫米、1.01毫米、1.26毫米，差異顯著(p＜0.05)，比ABCD型的低0.67毫米、0.33毫米、0.58毫米，差異顯著(p＜0.05)；BBDD、ABDD型的平均皮下脂厚分別比AADD型低0.45毫米、0.67毫米，差異極顯著(p＜0.01)，分別比AABB型低0.42毫米、0.64毫米，差異顯著(p＜0.05)；BBCC型的平均腹脂重比AADD型的低11.297克，差異極顯著(p＜0.01)，ABCC型的平均腹脂重比AADD型的低3.862克，差異顯著(p＜0.05)，BBDD、BBCC型的平均腹脂重分別比ABCC型的低1.226克、7.535克，差異顯著(p＜0.05)。根據(jù)上述結(jié)果，可以以雞LPL基因5′側(cè)翼區(qū)d位點(diǎn)和e位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性的基因型組合為標(biāo)記，對(duì)雞的三個(gè)脂肪性狀(肌間脂寬、皮下脂厚和腹脂重)進(jìn)行標(biāo)記輔助選擇。
混合模型y＝μ+b×x+comb+gi+gj+gi*gj+e其中y＝脂肪性狀(肌間脂寬、皮下脂厚、腹脂重)觀察值μ＝群體均值b＝協(xié)變量x的回歸系數(shù)x＝個(gè)體活重comb＝組合效應(yīng)gi＝位點(diǎn)i的基因型效應(yīng)(即位點(diǎn)e的基因型效應(yīng))gi＝位點(diǎn)j的基因型效應(yīng)(即位點(diǎn)d的基因型效應(yīng))gi*gj＝位點(diǎn)i的基因型與位點(diǎn)j的基因型的互作效應(yīng)(即位點(diǎn)e的基因型與位點(diǎn)d的基因型的互作效應(yīng))e＝隨機(jī)殘差效應(yīng)表1.基因型組合對(duì)雞脂肪性狀的最小二乘均值和多重比較

注含不同字母表示兩組之間差異顯著，大寫字母表示差異極顯著(p＜0.01)，小寫字母表示差異顯著(p＜0.05)。
7)采用模型分別對(duì)位點(diǎn)d、e的基因型與三個(gè)脂肪性狀(肌間脂寬、皮下脂厚和腹脂重)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果如表2和表3所示，表明位點(diǎn)d、e的不同基因型之間的效應(yīng)差異顯著。d位點(diǎn)BB和AB基因型的平均肌間脂寬分別比AA型低0.640毫米，差異顯著(p＜0.05)，d位點(diǎn)BB和AB基因型的皮下脂厚分別比AA型低0.25毫米、0.22毫米，差異顯著(p＜0.05)；d位點(diǎn)BB基因型的平均腹脂重比AA、AB型分別低5.554克、5.353克，差異極顯著(p＜0.01)；當(dāng)用由序列表中SEQ ID №3和SEQ ID №4對(duì)雞的總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，結(jié)果表明e位點(diǎn)CD和DD基因型的平均腹脂重極分別比CC型低3.630克、3.941克，(p＜0.01)，差異極顯著(p＜0.01)。
模型y＝μ+b×x+comb+g+e其中y＝脂肪性狀(肌間脂寬、皮下脂厚、腹脂重)觀察值μ＝群體均值b＝協(xié)變量x的回歸系數(shù)x＝個(gè)體活重comb＝組合效應(yīng)g＝基因型效應(yīng)e＝隨機(jī)殘差效應(yīng)表2.位點(diǎn)d的基因型對(duì)雞脂肪性狀的最小二乘均值和多重比較

注含不同字母表示兩組之間差異顯著，大寫字母表示差異極顯著(p＜0.01)，小寫字母表示差異顯著(p＜0.05)。
表3.位點(diǎn)e的基因型對(duì)雞脂肪性狀的最小二乘均值和多重比較

注含不同字母表示兩組之間差異顯著，大寫字母表示差異極顯著(p＜0.01)，小寫字母表示差異顯著(p＜0.05)。
序列表<160>6<210>1<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>1taagaccgcc aaatcccc 18<210>2<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>2cagtggtttc tcagagtg 18<210>3<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>3ctgcccttgaagtgaatg18<210>4<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>4tgcaagttgctggaggct18<210>5<211>306<212>DNA<213>雞(Gallus domestiaus)<220>
<221>misc-feature<222>(31)<223>n＝a或g<400>5taagaccgcc aaatccccac catgaccact naccacgtcc ctcagtgcca catccacctg60gttcttgaat acctccacag acagtgactt catcacctcc acggccagcc tgtgccactg120cttcagcgac tctttcagag aagtttttct ccacacccaa cctgagatgc atacttgcgc180tgggatctca ctggtcctct atcagatcgg caccttgcag aggtgaccca gtgctgctct240gcctgcacca cctcctgtgc ctatggggac caggagtgtt ttaattccca ctctgagaaa300
ccactg 306<210>6<211>306<212>DNA<213>雞(Gallus domestiaus)<220>
<221>misc-feature<222>(32)<223>n＝g或c<220>
<221>misc-feature<222>(281)<223>n＝t或c<400>6ctgcccttga agtgaatggc gtttgctcca tnctgccaga accaaggagc cctctttctc60tacaccaaaa gcacctcgtg aagccaagcc tttgacaaaa caatgcacag taaataaaag120caaggctcac tattaattta atatttctct gttacattcc cttaaataac tgatccttca180ccctgtggca gcagcaaaag gtaacagctg acaaactgct ggcagagggg cacagagagg240tgaaaaacta ggagaggcaa ctctgtgtct ctccacagta ngcacggcag cctccagcaa300cttgca 30權(quán)利要求
1.一種利用單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)雞脂肪性狀的方法，是用SEQID NO3和SEQ IDNO4組成的一對(duì)引物對(duì)同一只雞的總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到SEQ ID NO6；對(duì)所述SEQ ID NO6進(jìn)行單鏈構(gòu)象多態(tài)性檢測(cè)后測(cè)序，確定自SEQID NO6的5′端第32位堿基是G還是C，自5′端第281位堿基是T還是C；單鏈構(gòu)象多態(tài)性檢測(cè)為一條帶，且自SEQ ID NO6的5′端第32位堿基為G，第281位堿基為T的是CC基因型的雞；單鏈構(gòu)象多態(tài)性檢測(cè)為一條帶，且自SEQID NO6的5′端第32位堿基為C，第281位堿基為C的是DD基因型的雞；單鏈構(gòu)象多態(tài)性檢測(cè)為二條帶，且其中的一條帶自SEQID NO6的5′端第32位堿基為G，第281位堿基為T，另一條帶自SEQ ID NO6的5′端第32位堿基為C，第281位堿基為C的是CD基因型的雞；脂肪沉積的能力由強(qiáng)到弱依次為CC，CD，DD基因型的雞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于該方法還包括，用SEQID NO1和SEQ ID NO2組成的一對(duì)引物對(duì)雞的總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到SEQ ID NO5；對(duì)所述SEQID NO5進(jìn)行單鏈構(gòu)象多態(tài)性檢測(cè)后測(cè)序，確定自SEQ ID NO5的5′端第31位堿基是A還是G，自5′端第128位堿基是G還是缺失G；單鏈構(gòu)象多態(tài)性檢測(cè)為一條帶，且自SEQ ID NO5的5′端第31位堿基為G，第128位堿基為G的是AA基因型的雞；單鏈構(gòu)象多態(tài)性檢測(cè)為一條帶，且自SEQID NO5的5′端第31位堿基為A，第128位堿基缺失G的是BB基因型的雞；單鏈構(gòu)象多態(tài)性檢測(cè)為二條帶，且其中的一條帶自SEQ ID NO5的5′端第31位堿基為G，第128位堿基為G，另一條帶自SEQID NO5的5′端第31位堿基為A，第128位堿基缺失G的是AB基因型的雞；脂肪沉積的能力最強(qiáng)的是純合的AACC基因型的雞，最弱的是純合的BBDD基因型的雞，其它雜合基因型的雞脂肪沉積的能力居中。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)雞脂肪性狀的方法，是用SEQ ID NO3和SEQ ID NO4組成的一對(duì)引物對(duì)同一只雞的總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到SEQ ID NO6；對(duì)所述SEQ ID NO6進(jìn)行單鏈構(gòu)象多態(tài)性檢測(cè)后測(cè)序，確定自SEQ ID NO6的5′端第32位堿基是G還是C，自5′端第281位堿基是T還是C；單鏈構(gòu)象多態(tài)性檢測(cè)為一條帶，且自SEQ ID NO6的5′端第32位堿基為G，第281位堿基為T的是CC基因型的雞；單鏈構(gòu)象多態(tài)性檢測(cè)為一條帶，且自SEQ ID NO6的5′端第32位堿基為C，第281位堿基為C的是DD基因型的雞；單鏈構(gòu)象多態(tài)性檢測(cè)為二條帶，且其中的一條帶自SEQ IDNO6的5′端第32位堿基為G，第281位堿基為T，另一條帶自SEQ ID NO6的5′端第32位堿基為C，第281位堿基為C的是CD基因型的雞；脂肪沉積的能力由強(qiáng)到弱依次為CC，CD，DD基因型的雞。本發(fā)明對(duì)開展雞脂肪性狀的分子遺傳標(biāo)記輔助選擇，提高雞肉質(zhì)性狀選種的準(zhǔn)確性，提高遺傳進(jìn)展，具有重要意義。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1982478SQ200710000229
公開日2007年6月20日 申請(qǐng)日期2004年8月6日 優(yōu)先權(quán)日2004年8月6日
發(fā)明者張沅, 劉銳, 孫東曉, 王雅春, 俞英 申請(qǐng)人:張沅