專利名稱：利用畢赤酵母分泌表達(dá)一種hpv16型治療性重組蛋白疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用畢赤酵母分泌表達(dá)HPV無佐劑治療性蛋白疫苗的新型工藝方法。技術(shù)背景本發(fā)明研制的疫苗，其HPV16來源為本科室自我國山西宮頸癌高發(fā)區(qū)分離得到的 HPV16常見亞型HPV16z，從HPV16z毒株中克隆出E6和E7基因片段用于構(gòu)建疫苗，對 我國的HPV16將具有較高的針對性。目前在研的HPV治療性疫苗多為原核表達(dá)，Hsp65-HPV16zE6E7融合蛋白疫苗也不例外， 在原核表達(dá)系統(tǒng)中以包涵體的形式表達(dá)，下游的復(fù)性存在諸多問題，如成本較高和熱源等， 而真核表達(dá)系統(tǒng)與其相比具有明顯優(yōu)勢，如表達(dá)量高，可溶表達(dá)，糖基化接近等。酵母是單 細(xì)胞低等真核生物，其既具有原核生物易于培養(yǎng)、繁殖快、便于基因工程操作和高密度發(fā)酵 等特性，同時(shí)又具有適合真核生物基因產(chǎn)物正確折疊的細(xì)胞內(nèi)環(huán)境和糖鏈加工系統(tǒng)。重組的 外源蛋白融合不同的信號(hào)序列后，酵母還可以將外源蛋白分泌至培養(yǎng)基中，有利于下游的純 化。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及融合蛋白的畢赤酵母表達(dá)菌的構(gòu)建。本發(fā)明的Hsp65-HPV16z E6/E7融合基 因，其HPV16zE6/E7片段包括E6 3'端264個(gè)堿基和經(jīng)修飾E7完整片段，E7基因編碼第24 位的半胱氨酸和第26位的谷氨酸的密碼子定點(diǎn)突變成甘氨酸密碼子，使其喪失導(dǎo)致抑癌基因 失活能力，同時(shí)E7的58和91位密碼子同時(shí)突變，其編碼的氨基酸由半胱氨酸突變成甘氨酸， 降低E7蛋白穩(wěn)定性，免疫呈遞效果更佳,本發(fā)明的Hsp65為牛結(jié)核桿菌來源的熱休克蛋白65 (Hsp65)，本發(fā)明的融合基因Hsp65-HPV16zE6E7可以通過設(shè)計(jì)引物從原核表達(dá)載體 PET28a-Hsp65-HPV16zE6E7 (CN2005100854614)中克隆獲得，插入到酵母表達(dá)載體中，本 發(fā)明優(yōu)選pPIC9K，將構(gòu)建正確的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母，獲得正確表達(dá)的菌株，本發(fā)明優(yōu)選 通過大量篩選G418抗性高的克隆菌株，獲得穩(wěn)定高表達(dá)Hsp65-HPV16zE6E7的基因工程酵 母。


圖1:酵母表達(dá)質(zhì)粒Ppic9K-Hsp65-HPV16zE6E7的構(gòu)建圖2: SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳分析融合蛋白的表達(dá)
具體實(shí)施例方式實(shí)施例一 Hsp65-E6/E7融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒和菌株的構(gòu)建 以質(zhì)粒PET28a- Hsp65-HPV16zE6E7為模板，設(shè)計(jì)2段引物，Pl: GAAAA GAGCCAAG ACAATTGCGTACGAC, P2: GCTCGAATTCTTATCATGGTTTCTG AGAACAGATGG，反應(yīng) 條件為94°C lmin， 55°C lmin， 72°C 2min， 30個(gè)循環(huán)。瓊脂糖凝膠電泳回收并使用EcoR I酶切PCR產(chǎn)物，產(chǎn)物再次瓊脂糖凝膠電泳回收備用。pPIC9質(zhì)粒經(jīng)Xho I單酶切后，T4DNA 聚合酶補(bǔ)平粘末端，經(jīng)純化后用EcoRI單酶切，將酶切后質(zhì)粒和外源片段16'C連接過夜， 轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，將鑒定正確的Ppic9-Hsp65-HPV16zE6E7質(zhì) 粒和Ppic9K質(zhì)粒使用Bpul1021和EcoRl雙酶切，分別回收前者的小片段和后者的大片段 進(jìn)行連接，條件同上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a,提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，將鑒定正確的質(zhì)粒和 菌株保種。大提質(zhì)粒進(jìn)行Bgin酶切，乙醇沉淀回收線性片段，將50ugDNA樣品溶解于不多 于20ul總體積。將樣品直接加入到凍存的感受態(tài)管中(PEG1000法制備)，按照INVITROGEN 公司的PROTOCAL轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞，最終酵母菌3(TCMD平板孵育3-4天，直至長出菌斑。實(shí)施例二 Hsp65-E6/E7融合蛋白高菌株的篩選和表達(dá)為篩選含多拷貝目的基因的酵母菌株，我們采用以下步驟1) 取一96孔板名A，在每個(gè)孔中加入200ulYPD;2) 分別挑取MD平板上酵母克隆，轉(zhuǎn)至A板每個(gè)孔中；3) 放置于30度溫箱內(nèi)培養(yǎng)2天；4) 取出A板，輕微震蕩混勻細(xì)胞，另取一無菌96孔板B，且每孔中加入l卯ulYPD;5) 從A板的每孔中取出10ul，加入到對應(yīng)的B板的孔中；6) 將B板置入30度溫箱內(nèi)培養(yǎng)1天；7) 2天后，取出B板，重復(fù)步聚5和6，將細(xì)菌傳到C板；8) 取出C板，重懸并吹打每個(gè)孔內(nèi)的細(xì)胞；9) 按一定的順序，每個(gè)孔分別取2ul點(diǎn)樣畫有格柵的含G418的平板中，G418的濃度分別 為0，， 0.5， 1.0， 1.5， 2.0, 3.0， 4.0mg/ml;10) 30度孵育，分別2， 3， 4， 5日檢測G418平板中菌落的生長情況; 從4.0mg/mlG418平板中挑取陽性單克隆，于100mlBMGY培養(yǎng)基中，30。C振蕩培養(yǎng)，直至OD 值達(dá)到約2-6， 3000g室溫離心10分鐘收集細(xì)胞，棄上清，使用20mlBMMY重懸細(xì)胞，30。C振蕩繼續(xù)培養(yǎng)。每24小時(shí)加入甲醇至終濃度為0.5%。 96小時(shí)后離心收集上清，進(jìn)行SDS-PAGE 蛋白電泳同時(shí)蛋白銀染。通過灰度測定，比較蛋白表達(dá)水平，篩選出高表達(dá)菌株。
權(quán)利要求
1. 用酵母分泌表達(dá)Hsp65-HPV16zE6E7。其特征在于表達(dá)用宿主細(xì)胞為畢赤酵母。
2. 如權(quán)利要求1所述的表達(dá)工程酵母的構(gòu)建。其特征在于Hsp65-HPV16zE6E7融合基因插入表 達(dá)載體如pPIC9K，將此表達(dá)載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母，即構(gòu)建Hsp65-HPV16zE6E7表達(dá)工程酵母。
3. 如權(quán)利要求1所述的Hsp65-HPV16zE6E7的分泌表達(dá)。其特征在于Hsp65-HPV16zE6E7在酵 母中表達(dá)后可以有效地分泌至培養(yǎng)基中。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用畢赤酵母分泌表達(dá)HPV無佐劑治療性蛋白疫苗的新型工藝方法，將Hsp65-HPV16zE6E7融合基因插入酵母表達(dá)質(zhì)粒中，轉(zhuǎn)化畢赤酵母后經(jīng)篩選得到高表達(dá)酵母工程菌，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)分泌至培養(yǎng)基中。
文檔編號(hào)C12N1/19GK101220337SQ20071000060
公開日2008年7月16日 申請日期2007年1月11日 優(yōu)先權(quán)日2007年1月11日
發(fā)明者偉 張, 王小兵 申請人:偉 張