專利名稱：：豬繁殖與呼吸綜合癥病毒弱毒疫苗株及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種弱毒疫苗株，尤其涉及一種豬繁殖與呼吸綜合癥病毒弱毒疫苗株及其應(yīng)用，屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
：豬繁殖與呼吸綜合征(PorcineReproductiveandRespiratorySyndrome,PRRS)是由PRRSV引起的，以繁殖障礙、呼吸道癥狀為特點(diǎn)的，具有高度傳染性的病毒病。1987年美國(guó)首先發(fā)現(xiàn)該病，Wensvoort等于1991年分離并鑒定了該病病原，PRRSV歸屬于動(dòng)脈炎病毒科(Arteriviridae)的動(dòng)脈炎病毒屬，是一種有囊膜的正鏈單股RNA病毒，由于PRRSV具有抗原漂移和變異的特性，并且它的主要靶細(xì)胞是具有重要免疫作用的肺泡巨噬細(xì)胞(PAM)，因此PRRSV的感染常伴有各種病原的繼發(fā)感染，尤其是呼吸道病原。目前已給養(yǎng)豬業(yè)造成重大損失，引起了國(guó)際上的廣泛關(guān)注。為了控制該病的發(fā)生和蔓延，開(kāi)展PRRS的疫苗的研究顯得尤為重要。國(guó)外先后研制出了預(yù)防PRRS的滅活苗和弱毒苗，并在預(yù)防和防制PRRS的發(fā)生和蔓延上發(fā)揮了巨大的作用。近年來(lái)PRRS已在我國(guó)蔓延開(kāi)來(lái)，嚴(yán)重阻礙了我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，引起了我國(guó)有關(guān)部門的重視。1996年中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所首次在國(guó)內(nèi)分離和鑒定了該病病原，同時(shí)建立了IFA檢測(cè)方法，經(jīng)普查PRRS已遍布我國(guó)大部分的省市自治區(qū)，因此針對(duì)國(guó)內(nèi)流行毒株的疫苗的研究顯得十分迫切。雖然國(guó)外已經(jīng)研制出了商品化的滅活苗和弱毒苗，但由于該病毒具有抗原變異和漂移的特性，因此國(guó)外疫苗的針對(duì)性相對(duì)較差，往往免疫效果并不理想，且國(guó)外已有報(bào)道，因使用PRRS弱毒苗而引起該病的爆發(fā)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一株新的豬繁殖與呼吸綜合癥病毒弱毒疫苗株，該弱毒疫苗株遺傳穩(wěn)定、安全性好，對(duì)于豬繁殖與呼吸綜合癥病毒具有良好的免疫原性。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是通過(guò)以下技術(shù)途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明選用國(guó)內(nèi)分離毒株P(guān)RRSVCH-la株，在Marc-145細(xì)胞上低溫傳代后，再在37TM專到第110170代時(shí)，進(jìn)行全面鑒定，檢測(cè)其純凈性TCID5Q、毒力和免疫原性測(cè)定，并通過(guò)RT-PCR試驗(yàn)和對(duì)各代次的病毒的0RF5進(jìn)行RFLP分析，證明110170代PRRSVCH-la種毒除其在Marc-145細(xì)胞上的病毒滴度有很大提高和致病性明顯降低外，其它特性基本與低代次PRRSVCH-la毒株特性相一致，將110170代PRRSVCH-la致弱毒株種毒(PorcineReproductiveandRespiratorySyndromevirus)命名為PRRSVCH-1R株，其微生物保藏號(hào)是CGMCCN0.1883;保藏時(shí)間是2006年12月11日；保藏單位中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心；保藏地址北京市海淀區(qū)中關(guān)村北一條13號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所。把110代PRRSVCH-la株定義為PRRSVCH-1R株1代，把PRRS活疫苗(CH-1R株)原始種子代次定義為PRRSVCH-1R株2535代(PRRSVCH-la株135145代)；基礎(chǔ)種子代次為3645代(PRRSVCH-la株146155代)；生產(chǎn)種子代次為4655代(PRRSVCH-la株156165代)。免疫原性試驗(yàn)表明，用本發(fā)明弱毒株免疫仔豬后，所免疫仔豬均能抵抗豬繁殖與呼吸綜合癥病毒強(qiáng)毒的攻擊。本發(fā)明弱毒株的安全性好，毒力測(cè)定試驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明弱毒株對(duì)妊娠母豬、仔豬等各年齡豬只均安全，無(wú)致病力。通過(guò)RFLP的分析表明，PRRSVCH-la株通過(guò)低溫連續(xù)傳代和多次克隆，當(dāng)傳至l10代在PRRSVORF5發(fā)生穩(wěn)定的點(diǎn)突變，該突變穩(wěn)定保持到170代，說(shuō)明本發(fā)明弱毒株是一株具有穩(wěn)定遺傳變異的致弱毒株。本發(fā)明弱毒株濕毒在-2(TC的保存期為12個(gè)月，在-7(TC的保存期為24個(gè)月；本發(fā)明弱毒株凍干毒在-2(TC和-7(TC的保存期為24個(gè)月。本發(fā)明疫苗的使用方法(1)接種途徑頸部肌肉注射。(2)接種劑量仔豬在34周齡免疫，每頭頸部肌肉注射疫苗1頭份；母豬于配種前1周免疫，每頭頸部肌肉注射疫苗2頭份。本發(fā)明弱毒株應(yīng)用范圍較寬，例如，可應(yīng)用于制備成診斷繁殖與呼吸綜合癥病毒的診斷試劑，還可應(yīng)用于制備成單苗或聯(lián)苗(活或滅活疫苗)疫苗等。圖1PRRSVCH-la株傳代次數(shù)與病毒滴度關(guān)系。圖2ORF5基因片段的RFLP分析結(jié)果。圖3用TspEI酶切ORF5的電泳圖。M:MarkerDL20001:MLV;2、3:CH-la株;4:VR2332株;5:GD-3株;6:CH-la70代;7:CH-la90代;8:CH-la110代;9:CH-la130代；IOCH-lal50代；ll:CH-la155代;12:CH-la160代;13:CH-la170代。為了進(jìn)一步闡述本發(fā)明，下面給出一系列實(shí)施例。這些實(shí)施例完全是例證性的，它們僅用來(lái)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體描述，不應(yīng)當(dāng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。具體實(shí)施方式1.1試驗(yàn)用豬購(gòu)自非疫區(qū)的PRRS血清抗體陰性豬場(chǎng)。1.2病毒細(xì)胞培養(yǎng)及克隆化1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)Marc-145細(xì)胞系用DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，其中含4%滅活犢牛血清、100U/ml的青霉素、80嗎/ml的鏈霉素，并用NaHC03調(diào)整pH值至7.2左右，過(guò)濾除菌。用此細(xì)胞培養(yǎng)液復(fù)蘇或傳代細(xì)胞系Marc-145至容量為100ml的滅菌小扁瓶里，待長(zhǎng)成良好細(xì)胞單層后用于接種病毒。1.2.2種毒的克隆化從國(guó)內(nèi)分離的PRRSVCH-la株在Marc-145細(xì)胞上傳代，分別在傳至30、50、70、90、110、130代時(shí)進(jìn)行了病毒克隆，除30代種毒克隆挑選2mm蝕斑外，隨后克隆均選擇lmm蝕斑。30、50代種毒選取群體蝕斑(37個(gè)單蝕斑混合培養(yǎng))，從70代種毒開(kāi)始選取lmm以內(nèi)單一蝕斑傳代培養(yǎng)，經(jīng)過(guò)90、110、130代獲得了比較單一的蝕斑直徑在lmm以內(nèi)的疫苗用種毒，每傳5代進(jìn)行l(wèi)次蝕斑大小檢查，如出現(xiàn)5y。以上大于2mm的蝕斑，則進(jìn)行再次克隆純化。1.2.3種毒的低溫培育將30代進(jìn)行了克隆的PRRSVCH-la株，置于36"C下繼代10代，然后置于35i:下繼代20代，隨后置于34i:下繼代30代，傳至90代，恢復(fù)37"C下繼續(xù)培養(yǎng)傳代至170代，選取不同代次測(cè)定TCID5Q。選取10、30、50、70、90、110、130、150、155、160、170代次的病毒，做病毒滴度測(cè)定。試驗(yàn)結(jié)果當(dāng)PRRSVCH-la在Marc-145細(xì)胞系傳至30代時(shí)，其病毒滴度在105GTCID5()/ml左右，在低于37'C的條件下培養(yǎng)時(shí)，病毒滴度提高不明顯，直到傳至90代病毒滴度才達(dá)到1063TCID5。/ml。經(jīng)測(cè)定PRRSVCH-la在Marc-145細(xì)胞上傳至110170代時(shí)，病毒滴度達(dá)到107GTCID5()/ml以上；傳至170代時(shí)，仍穩(wěn)定維持在107QTCID5()/ml以上。結(jié)果見(jiàn)表l、圖l。表l傳代次數(shù)與病毒滴毒的關(guān)系<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>1.3理化特性試驗(yàn)取分離毒株的90、110、130、150、155、160、170代細(xì)胞毒懸液(10711075TCID5。/ml)5ml，平均分裝于5試管中，試管1于56。C水浴作用45min;試管2加20%的乙醚震蕩10min后，4。C過(guò)夜，無(wú)菌揮去乙醚；試管3先用O.lMHCl調(diào)pH至3.0，于4'C作用2h后用O.lNaOH調(diào)pH至7.2;試管4加5-碘脫氧尿核苷(5-IUDR)50/d，4'C作用12h;測(cè)定經(jīng)過(guò)處理和未經(jīng)處理的細(xì)胞毒懸液的TCID5c，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2表2理化特性試驗(yàn)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>1.4紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)采用微量板法，分別用0.5%的雞、豚鼠、大鼠、兔和綿羊的紅細(xì)胞懸液測(cè)定110、130、150、155、160、170代細(xì)胞毒懸液(10711075TCID50/ml)的HA滴度，以50%紅細(xì)胞凝集的最高稀釋度作為判定終點(diǎn)。試驗(yàn)結(jié)果表明110、130、150、155、160、170代細(xì)胞毒懸液對(duì)0.5%的雞、豚鼠、大鼠、兔和綿羊的紅細(xì)胞均無(wú)凝集作用。1.5毒力測(cè)定選用26頭懷孕8593天的母豬，用10、30、50、70、90、110、130、150、170代PRRSVCH-la(4xl()72TCID5。)滴鼻，觀察發(fā)病情況。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。表3毒力測(cè)定結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>從表3中發(fā)現(xiàn)在Marc-145細(xì)胞上傳至110170代PRRSV的致病力明顯降低，而病毒滴度維持在較高的水平。1.6PRRSV0RF5基因的擴(kuò)增分別對(duì)90、110、130、150、155、160、170代次病毒的0RF5基因進(jìn)行擴(kuò)增，使用引物見(jiàn)表4，反應(yīng)條件見(jiàn)表5。表4ORF5基因進(jìn)行擴(kuò)增所用引物<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>表5ORF5基因進(jìn)行擴(kuò)增PCR反應(yīng)條件<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，紫外燈下觀察結(jié)果，結(jié)果均擴(kuò)增到特異目的條帶(見(jiàn)圖2)。1.7ORF5基因片段的RFLP分析采用TspEI限制性內(nèi)切酶對(duì)已經(jīng)純化各代次的ORF5進(jìn)行酶切，按TspEI限制性內(nèi)切酶使用說(shuō)明進(jìn)行。以上反應(yīng)均在37°CF，反應(yīng)2小時(shí)，然后取10pl反應(yīng)產(chǎn)物，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，具體瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見(jiàn)圖3。1.8免疫原性試驗(yàn)將25頭2835日齡PRRSV抗體陰性仔豬，隨機(jī)分為5組(5頭/組)，第14組為試驗(yàn)組，第5組為對(duì)照組。取150、155、160、170代細(xì)胞毒懸液(10711075TCID5Q/ml)各免疫5頭仔豬，2ml/頭，第5組設(shè)為不注射疫苗的對(duì)照組。在免疫后28天經(jīng)鼻內(nèi)接種2xloS力TCID5oPRRSVCH-la株強(qiáng)毒，測(cè)量仔豬體溫并觀察仔豬臨床表現(xiàn)，共觀察14天。試驗(yàn)結(jié)果將150、155、160、170代細(xì)胞病毒懸液(10711075TCID50/ml)接種仔豬后，均無(wú)不良臨床反應(yīng)出現(xiàn)。在免疫后28天用豬繁殖與呼吸綜合癥強(qiáng)毒攻擊，免疫組仔豬體溫正常，也無(wú)其它異常反應(yīng)，而對(duì)照組的豬均出現(xiàn)了體溫升高和呼吸困難的癥狀，說(shuō)明這4代次細(xì)胞病毒懸液具有良好的免疫原性，均能完全保護(hù)仔豬抵抗強(qiáng)毒的攻擊，具體結(jié)果見(jiàn)表6。表6PRRS活疫苗(CH-1R株)對(duì)仔豬的主動(dòng)免疫試驗(yàn)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>1.9無(wú)菌檢驗(yàn)取分離毒株的110、130、150、155、160、170代細(xì)胞毒懸液(lxl06('TCID5()/ml)按照按《中國(guó)獸藥典》進(jìn)行，試驗(yàn)結(jié)果表明無(wú)雜菌污染。1.10支原體檢驗(yàn)取分離毒株的IIO、130、150、155、160、170代細(xì)胞毒懸液(lxl066TCID50/ml)按《中國(guó)獸藥典》進(jìn)行，試驗(yàn)結(jié)果表明無(wú)支原體污染。Ul外源病毒檢測(cè)按《中國(guó)獸藥典》進(jìn)行。利用豬三價(jià)(HCV、PPV、BVDV)熒光抗體、豬偽狂犬病毒熒光抗體檢測(cè)，均未檢測(cè)到特異性熒光；采用細(xì)胞病變(CPE)方法檢測(cè)，未見(jiàn)Vero細(xì)胞出現(xiàn)CPE;采用紅細(xì)胞吸附法檢測(cè)，未見(jiàn)Vero細(xì)胞出現(xiàn)血細(xì)胞吸附現(xiàn)象出現(xiàn)。試驗(yàn)證明，CH-1R株P(guān)RRS種毒未檢測(cè)到外源病毒污染。1.12毒種保存期試驗(yàn)將凍干毒種和濕毒種分別在-2(TC和-7(TC保存6、12、24、30月定期檢査病毒滴度，并記錄結(jié)果，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表7。表7毒種不同條件下的保存期試驗(yàn)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>從表7可知，凍干毒種在—2(TC下，最長(zhǎng)可達(dá)24月，在一70。C下，保存24個(gè)月病毒滴度無(wú)明顯變化。濕毒種在一20'C以下，最長(zhǎng)可達(dá)12月，在一7(TC以下，保存24個(gè)月病毒含量無(wú)明顯變化。權(quán)利要求1.豬繁殖與呼吸綜合癥病毒(PorcineReproductiveandRespiratorySyndromevirus)弱毒疫苗株，其微生物保藏號(hào)是CGMCCNO.1883。2、一種疫苗組合物，其特征在于由權(quán)利要求1的弱毒疫苗株、藥學(xué)上可接受的佐劑或載體所組成。3、權(quán)利要求1的弱毒疫苗株在制備防治豬繁殖與呼吸綜合癥病毒藥物中的用途。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了豬繁殖與呼吸綜合癥病毒(PorcineReproductiveandRespiratorySyndromevirus)弱毒疫苗株，其微生物保藏號(hào)是CGMCCNO.1883。本發(fā)明弱毒疫苗株遺傳變異穩(wěn)定，安全性好，對(duì)妊娠母豬、仔豬等各年齡豬只均安全，無(wú)致病力。用本發(fā)明弱毒疫苗株免疫仔豬后，所免疫仔豬均能抵抗豬繁殖與呼吸綜合癥病毒強(qiáng)毒的攻擊。文檔編號(hào)C12N7/00GK101220348SQ20071000125公開(kāi)日2008年7月16日申請(qǐng)日期2007年1月9日優(yōu)先權(quán)日2007年1月9日發(fā)明者劉永剛,柴文君,王洪峰,蔡雪輝,郭寶清申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所