專利名稱：耐熱性DNA聚合酶(Bcady-pol)基因及其編碼蛋白的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種來(lái)自高溫菌(flaci//us cflWo/yft'o DY)的DNA聚合酶基因的核苷 酸序列以及該基因所編碼的氨基酸序列。本發(fā)明還涉及由該核苷酸序列編碼的蛋白功能及 其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
DNA聚合酶DNA polymerases(EC 2.7.7.7)是能夠以DNA或RNA為模板，在寡核苷酸 或蛋白質(zhì)引物的引導(dǎo)下催化合成DNA的一類酶。在Mg^存在下，能催化5，一三磷酸脫 氧核糖核苷酸加到具有3'—羥基末端的引物多核苷酸鏈上，形成互補(bǔ)堿基對(duì)的第二條鏈。 此類酶在DNA序列、氨基酸序列、二、三級(jí)結(jié)構(gòu)方面有較高的同源性，且與RNA聚合酶 和反轉(zhuǎn)錄酶之間也有不同程度的同源性。同時(shí)，DNA聚合酶具有3'-5'核酸外切酶活性， 能糾正聚合過(guò)程中堿基的錯(cuò)配，起著校對(duì)的功能。也具有5'-3'核酸外切酶活性，能在半 不連續(xù)合成中切除岡崎片斷5'端RNA引物，還能切除由紫外線照射而形成的嘧啶二聚體。 有的DNA聚合酶還具有逆轉(zhuǎn)錄酶的活性，能以RNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。目前，已 有100多種來(lái)源于不同種生物的DNA聚合酶基因被克隆和測(cè)序，包括耐熱菌和古細(xì)菌。 一些天然和重組的的酶己經(jīng)被純化和鑒定。耐熱的DNA聚合酶在不同的分子生物學(xué)應(yīng)用 中起著重要的作用，例如DNA擴(kuò)增，測(cè)序和標(biāo)記等。它作為各種PCR反應(yīng)中的工具酶已 廣泛應(yīng)用于病原體檢測(cè)、基因病診斷、腫瘤研究、生物化學(xué)和分子生物學(xué)的研究領(lǐng)域。目前最常用的耐熱DNA聚合酶是來(lái)源于水生棲熱菌(7T!^mu5叫uariow)分離得到的 TaqDNA聚合酶，該酶具有耐熱性，聚合活性，和5'-3'核酸外切酶活性。此外，Taq還 具有逆轉(zhuǎn)錄活性，類似于逆轉(zhuǎn)錄酶，可將其用于RT-PCR中，但擴(kuò)增長(zhǎng)度有限，故限制了 該酶在某些領(lǐng)域的應(yīng)用。而來(lái)自高溫菌Baci//M5 caWofyriaw DY的DNA聚合酶在高溫下具 有良好的逆轉(zhuǎn)錄活性和3'-5'核酸外切酶活性，因此可應(yīng)用于cDNA文庫(kù)的單酶法構(gòu)建和 擴(kuò)增，可克服mRNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)反轉(zhuǎn)錄過(guò)程的抑制作用(合成cDNA時(shí)，需要在較高的 溫度下打開(kāi)RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu))，簡(jiǎn)化構(gòu)建和擴(kuò)增過(guò)程。發(fā)明內(nèi)容申請(qǐng)人從東太平洋(北緯12° 45' 42〃 ，西經(jīng)103° 41' 41〃 )水深3086米的深海沉積物中分離到一個(gè)菌株高溫菌BaciH旭ca/do/yricu5DY ，其最適生長(zhǎng)溫度約65°C，該菌株能產(chǎn)生耐熱的DNA聚合酶，具有很高的應(yīng)用潛力。但是野生的髙溫菌所產(chǎn)生的耐熱DNA聚合酶量很少，而且菌株培養(yǎng)條件苛刻，不易大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)獲得，因此基因工程重組表 達(dá)是大量獲取耐熱DNA聚合酶的最佳選擇。該菌株于2007年4月2日被保藏于中國(guó)典型 培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)CCTCCNO: M20732。本發(fā)明首次提取了高溫菌flac /i ozWbZyricu5 DY的基因組DNA，從中克隆和鑒定了耐 熱DNA聚合酶(Bcady—pol)基因，并在大腸桿菌工程菌中得到重組表達(dá)，從而對(duì)重組酶進(jìn)行了純化以及性質(zhì)測(cè)定，為該酶的實(shí)際應(yīng)用提供了基礎(chǔ)。本發(fā)明中的編碼Beady—pol基因的核苷酸序列是如此獲得的。以BaciMi caWoZ;yricwf DY基因組DNA為模板，根據(jù)合成序列SEQ ID No.3和SEQ ID No.4作為引物，經(jīng)PCR 擴(kuò)增所得到了 SEQ ID No.l的序列。然后通過(guò)重組表達(dá)Beady—pol基因，純化Beady— pol基因的表達(dá)產(chǎn)物，生物學(xué)方法證明Bcady—pol基因編碼的多肽(SEQIDNo.2)具有 耐熱DNA聚合酶的活性。本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種新的多核苷酸，該核苷酸編碼一種新的耐熱DNA聚合 酶，此酶被命名為Beady—pol 。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種利用重組技術(shù)生產(chǎn)所述的Beady—pol的方法。本發(fā)明還提供了這種Beady—pol基因序列和其所編碼的多肽。在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種分離出的DNA分子，它包括 一種分離出的DNA 分子，其特征在于，它包括編碼Bcady—pol酶的核苷酸序列，所述核苷酸序列與SEQ ID No.l中1-2637的核苷酸序列由至少70%的相似性；或者所述核苷酸序列能在中等嚴(yán) 謹(jǐn)條件下與SEQ ID No.l中1-2637的核苷酸序列雜交。較佳地，所述的序列編碼一多肽， 該多肽具有SEQ ID No.2所示的序列。更佳地，該序列具有SEQ ID No.l中1-2637位的 核苷酸序列。在本方面的另一方面，提供了一種分離的Bcady—pol酶，它包括具有SEQ ID No.2 氨基酸序列的多肽、或者其活性片段，或其活性衍生物。較佳地，該多肽是具有SEQE) No.2序列的多肽。在本發(fā)明的另一方面，提供了一種產(chǎn)生具有Bcady—pol酶的方法。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明中分離的多核苷酸全長(zhǎng)為2637個(gè)核苷酸， 其詳細(xì)序列見(jiàn)SEQ ID No.l,其中開(kāi)放閱讀框位于1-2637位核苷酸。在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)"Beady—pol編碼序列"是指編碼具有耐熱DNA聚合酶活性的核 苷酸序列，如SEQ ID No.l中的1-2637位序列及其簡(jiǎn)并序列。該簡(jiǎn)并序列是指，位于SEQ ID No.l序列的編碼框1-2637位核苷酸中，由一個(gè)和多個(gè)密碼子被編碼相同氨基酸的簡(jiǎn) 并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡(jiǎn)并性，所以與SEQ ID No.l中1-2637 位核苷酸相似性低至約70%的簡(jiǎn)并序列也能編碼出SEQ ID No.2所述的序列。該術(shù)語(yǔ)還 包括與SEQ ID No.l中1-2637的核苷酸序列的相似性至少70%,較佳地至少80%,更佳 地至少90%的核苷酸序列。該術(shù)語(yǔ)還包括能編碼具有與Beady—pol相同功能的SEQ ID No. 1序列變異形式。 這些形式包括若干個(gè)(通常為l-90個(gè)，較佳地l-60個(gè)，更佳地l-20個(gè)，最佳地 1-10個(gè))核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5'和/或3'添加數(shù)個(gè)(通常 為60個(gè)以內(nèi)，較佳地為30個(gè)以內(nèi)，更佳地10個(gè)以內(nèi)，最佳地5個(gè)以內(nèi))核苷酸。在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)"Bcady — pol蛋白多肽"指具有耐熱DNA酶活性的SEQ ID No.2 序列的多肽。該術(shù)語(yǔ)還包括具有Bcady-pol酶功能的SEQ ID No.2序列變異形式。 這些變異形式包括(但不限于)若干個(gè)(通常為l-50個(gè)，較佳地l-30個(gè)，更佳地 1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè))氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N 末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)(通常為20個(gè)以內(nèi)，較佳地為10個(gè)以內(nèi)，更佳地5個(gè)以內(nèi)) 氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通常不會(huì)改 變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸通常也不 會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語(yǔ)還包括Bcady—pol酶的活性片段和活性衍生物。該多肽的變異形式包括同源序列、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、 修飾形式、在高或低的嚴(yán)謹(jǐn)度條件下能與Bcady—pol基因雜交的DNA所編碼的蛋 白、以及利用抗Bcady—pol酶的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其它多 肽，如包含Bcady—pol酶或者其片段的融合蛋白。本發(fā)明還涉及Bcady—pol酶的類似物，這些類似物與天然Bcady — pol酶的差別 可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而 有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳突變體，誘導(dǎo)變異體可以通過(guò)各種技術(shù)得到， 如通過(guò)輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生的隨機(jī)誘變，還可通過(guò)定點(diǎn)誘變法或其他已知的 分子生物學(xué)技術(shù)。修飾(通常不改變一級(jí)結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如 乙酰化或羧基化。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進(jìn)一步加工 步驟中進(jìn)行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過(guò)將多肽暴露于進(jìn)行糖基化 的酶而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基的序列，還包括被修飾后提高 了其酶的活性或抗蛋白水解性能。在本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如已商品化的載體。在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)"宿主細(xì)胞"包括原核細(xì)胞和真核細(xì)胞。常用的原核宿主細(xì) 胞的例子包括大腸桿菌等。常用的真核宿主細(xì)胞包括酵母細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞和哺乳動(dòng) 物細(xì)胞。


附圖1 Bcady—pol重組表達(dá)純化的SDS-PAGE圖譜。說(shuō)明如下M:低分子 量Marker; 1:重組載體pTTQ-pol在菌株DH I的未誘導(dǎo)表達(dá)；2:重組載體pTTQ-pol 在菌株DHI的誘導(dǎo)表達(dá)；3:經(jīng)Ni-NTA純化所得的目的蛋白Bcady—pol (94kDa)。附圖2 Bcady—pol聚合酶活力單位的測(cè)定圖譜。說(shuō)明如下1 —6分別代表 商品化酶Tth的不同活性單位0， 0.04U, 0.07U, 0.1U, 0.15U， 0.2U。 7， 8分別代 表Bcady—pol在0.07^1， 0.15^1酶量下的聚合酶活力單位測(cè)定反應(yīng)結(jié)果。附圖3Mg"對(duì)Bcady—pol逆轉(zhuǎn)錄酶活力的影響圖譜。說(shuō)明如下1 —6分別5代表Mg2+濃度為0， 1.5 mol/L， 3 mol/L， 5 mol/L， 7.5 mol/L, 10 mol/L時(shí)，測(cè)定該金屬離子對(duì)逆轉(zhuǎn)錄酶活力的影響。附圖4PH值對(duì)Beady—pol逆轉(zhuǎn)錄酶活力的影響圖譜。說(shuō)明如下1—5分別 代表在PH值為7, 7.5， 8.0, 8.3， 9.0的不同酸堿度的反應(yīng)液中測(cè)定逆轉(zhuǎn)錄酶活力。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本 發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常 按照常規(guī)條件如分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press,2001)中所述的實(shí)驗(yàn)條件，或按照試劑或儀器生產(chǎn)廠商所建議的條件。 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施，其具體步驟是1. Baci〃"s cflWo/y"c"s DY基因組DNA的提取用接種環(huán)挑取-80'C保存的flac〃Z"s cfl/rfo/yn'c"s DY菌種，在LB培養(yǎng)基平板 (一種細(xì)菌培養(yǎng)基，含有1%的胰化蛋白胨，1%的氯化鈉，0.5%的酵母提取物， 1.5%的瓊脂糖)上劃線分離單菌落。待劃線后的平板置65C培養(yǎng)過(guò)夜，挑取一個(gè) 單菌落接種到5ml的LB培養(yǎng)液管中(一種細(xì)菌培養(yǎng)基，含有1%的胰化蛋白胨， 1%的氯化鈉，0.5%的酵母提取物)，65'C搖動(dòng)培養(yǎng)過(guò)夜，收集菌，6000g離心8分 鐘后棄去上清，沉淀重新懸浮于200jil緩沖液(100mM NaCl， 50mM Tri s-HCl ， 5mM EDTA，pH 8.0),加入少量溶菌酶，然后加入4ml裂解液(4M異硫氰酸胍)，輕 輕混勻，放置約10分鐘后加入100^1 1M MgCh和2ml體積的異丙醇，待出現(xiàn)白 色絮狀沉淀后，1000g離心30秒，棄上清，沉淀用70%的乙醇洗滌兩次，吸干， 分別加800pl TES (10mM Tris-HC1, lmM EDTA， 10mMNaCl，pH8.0)， 10^1 RNase A ( 10mg/ml)和40jU 10先SDS。放置過(guò)夜，再加入50^1蛋白酶K ( 20mg/ml)， 55 'C消化2小時(shí)，用酚/氯仿/異戊醇(25:24:1 )抽提兩次，15000g離心10分鐘， 上清小心轉(zhuǎn)移至另一個(gè)離心管中。用異丙醇沉淀DNA，再用乙醇洗滌兩次，沉淀 溶于重蒸水中，-20'C保存。2. 耐熱性DNA聚合酶(Bcady-pol)基因的PCR擴(kuò)增和序列分析以提取的Bacillus caldolyticus DY基因組DNA為模板，用引物N和C擴(kuò)增 全長(zhǎng)的Bcady-pol基因。N: GACGGATCCATGAGATTGAAAAAAAAGCTT ( SEQ ID No.3); C: TCATCT AGATTATTTCGCGTCATACCA ( SEQ ID No.4);劃線部分GGATCC代表BamHI酶切位點(diǎn)，TCTAGA代表Xbal酶切位點(diǎn)。PCR反應(yīng)條件為在50^1的反應(yīng)體系中含，100ng模板，400nM引物N，400nMC， 200pMdNTP， 2.5mM Mg2+, 5U LA-Taq DNA聚合酶(TaKARa公司)，5fU 10XPCR反應(yīng)緩沖液；PCR擴(kuò)增程序?yàn)?0個(gè)循環(huán)96°C變性1分鐘，55°C 退火1分鐘，68°C延伸3分鐘。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后與T載體連接，轉(zhuǎn)化到大腸 桿菌感受態(tài)細(xì)胞XL-Blue中，挑取有插入DNA片段的陽(yáng)性，經(jīng)測(cè)序，Bcady-pol 基因序列詳見(jiàn)SEQ ID No.l。根據(jù)得到的核苷酸序列推導(dǎo)出的Bcady-pol的氨基酸序列，共879個(gè)氨基酸殘 基，其氨基酸序列詳見(jiàn)SEQ ID No.2。3. 重組Bcady-pol的表達(dá)和純化將含有Bcady-pol基因的質(zhì)粒用Ba/nHI和X&a/酶切，膠回收Bcady-pol基 因片段，同時(shí)將質(zhì)粒pTTQ也用相同的酶進(jìn)行酶切。將兩者連接過(guò)夜(12-16小 時(shí))。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞XL-Blue中，提取質(zhì)粒，測(cè)序驗(yàn)證。 將含有Bcady-pol基因的重組表達(dá)質(zhì)粒pTTQ—pol轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH I ，選取陽(yáng)性 克隆在含100mg/L氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中37°C搖培至A6()()=0.6時(shí)，加入異 丙基硫代-e -D-半乳糖苷(IPTG)至終濃度0.1mmol/L， 30。C誘導(dǎo)8h后將菌液 收集至200邁1的離心管中，5000g離心沉淀細(xì)菌細(xì)胞。將細(xì)菌細(xì)胞重新懸浮在10ml 的緩沖液A (0.5M NaCl, 30mM咪唑，0.5% TritonX-lOO， 20 mM Tris-HCl, pH7.9)中，超聲波處理至菌液成半透明，再18000g離心20分鐘，上清與預(yù)先 用裂解緩沖液平衡的Ni-NTA Agarose混勻，4。C結(jié)合l小時(shí)，純化過(guò)程按照純化試劑盒說(shuō)明進(jìn)行(Qiagen公司)。純化的蛋白經(jīng)10%的SDS-PAGE電泳分析，其分子量約為94kDa，純度達(dá)95%以上。結(jié)果見(jiàn)圖1。4. 重組Bcady-pol的酶學(xué)性質(zhì)4.1聚合酶活力的測(cè)定取0.15pl純化后的重組表達(dá)的DNA聚合酶液，加適量的底物模板calfthymusDNA， dNTP， dCTP (熒光染料cy5標(biāo)記)，反應(yīng)緩沖液。酶反應(yīng)溶液的pH被調(diào)整在8.3， 70。C下進(jìn)行核苷酸摻入反應(yīng)30分鐘。商品TthDNA聚合酶(Roche公司產(chǎn)品)在同樣條件下進(jìn)行平行核苷酸摻入試驗(yàn)。反應(yīng)完成后，洗去未摻入的熒光標(biāo)記的dCTP,將樣品點(diǎn)在尼龍膜(Amersham公司產(chǎn)品)上進(jìn)行熒光掃描。并與商品TthDNA聚合酶進(jìn)行比較，計(jì)算酶活性為0.8U/pl。(圖2)4.2逆轉(zhuǎn)錄酶活力的測(cè)定取0.5nl純化后的重組表達(dá)的DNA聚合酶液，加適量的底物模板1.2kbkanamycin resistance gene mRNA ，Downstream Control Primer:5'—AGCCGCCGTCCCGTCAAGTCAG-3'， dNTP, dCTP (熒光染料cy5標(biāo)記)，反應(yīng)緩沖液。 酶反應(yīng)溶液的pH被調(diào)整在8.3, 5(TC下進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄核苷酸摻入反應(yīng)30分鐘。商 品M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶(Promega公司產(chǎn)品)在同樣條件下進(jìn)行平行逆轉(zhuǎn)錄核苷酸 摻入試驗(yàn)。反應(yīng)完成后，洗去未摻入的熒光標(biāo)記的dCTP,將樣品點(diǎn)在尼龍膜上 進(jìn)行熒光掃描。并與商品M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行比較，計(jì)算酶活性為8U/pl。4.3 Mg"對(duì)逆轉(zhuǎn)錄酶活力的影響反應(yīng)條件與4.2中所要求都一樣的情況下，用Mg"分別在0， 1.5mol/L, 3mol/L, 5 mol/L , 7.5 mol/L， 10 mol/L的濃度下測(cè)定其對(duì)逆轉(zhuǎn)錄酶活力的影 響。結(jié)果顯示在3mol/L的濃度下，金屬離子Mg"對(duì)逆轉(zhuǎn)錄酶活力有明顯性地增加。4.4PH值對(duì)逆轉(zhuǎn)錄酶活力的影響反應(yīng)條件與4.2中所要求都一樣的情況下，分別在PH值為7， 7.5， 8.0， 8.3， 9.0的不同酸堿度的反應(yīng)液中測(cè)定逆轉(zhuǎn)錄酶活力。結(jié)果顯示在PH值為8.3時(shí)， 逆轉(zhuǎn)錄酶活性達(dá)到最大。序列表1. SEQ ID No. 1的信息1) 名稱flfl"'〃"s cflWo/yn'cw DY耐熱性DNA聚合酶基因2) 分子類型DM3) 序列特征A) 長(zhǎng)度2637bpB) 類型核酸C) 鏈性雙鏈D) 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性4)序列描述SEQ ID No. 11ATGAGATTGA AAAAAAAGCT TGTTTTAATCGACGGCAGCAGCGTGGCGTACCGCGCCTTT61TTCGCCTTGCCGCTTTTGCATAACGACAAAGGCATCCATACGAACGCCGTCTACGGGTTT121ACGATGATGTTGAATAAAATTTTGGCGGAAGAAGAGCCAACTCATATGCTTGTCGCGTTT181GACGCCGGGAAAACGACGTTCCGGCATGAAGCGTTTCAAGAGTATAAAGGTGGGCGCCAG241CAGACGCCACCGGAGCTGTCGGAGCAGTTTCCGCTGTTGCGCGAGCTGCTGAGGGCGTAT301CGCATCCCCGCCTATGAACTCGAGAACTACGAAGCGGACGATATTATCGGAACGCTTGCC361GCCCGCGCTGAGCAGGAAGGGTTTGAGGTGAAAGTCATTTCCGGCGACCGCGATCTGACC421CAGCTCGCCTCCCCCCATGTGACGGTGGACATTACGAAAAAAGGGATTACCGATATCGAA481CCGTACACGCCGGAGGCGGTCCGCGAAAAATACGGCTTAACTCCGGAACAAATCGTTGAT5"TTGAAAGGATTGATGGGCGACAAATCGGACAACATTCCCGGAGTGCCGGGCATCGGGGAA601AAGACGGCGGTCAAGCTGCTCAAGCAATTCGGCACGGTCGAAAACGTGCTTGCCTCCATT661GACGAGATCAAAGGCGAAAAGTTGAAAGAAACGCTGCGCCAACACCGGGAGATGGCGCTG721TTAAGCAAAAAGCTCGCCGCCATTCGCCGCGACGCCCCGGTCGAGCTCTCGCTTGATGAC781ATCGTCTATCAAGGGGAAGACCGGGAGAAAGTGGTCGCTTTATTTAAAGAGCTTGGGTTT841CAATCGTTTTTAGAGAAAATGGAATCGCCGTCATCAGAAGAGGAAAAACCGCTTGCCAAG901ATGGCATTTACGCTTGCTGACCGCGTGACGGAGGAGATGCTTGCCGACAAGGCGGCGCTT961GTCGTTGAAGTGGTCGAGGAAAATTATCATGATGCGCCGATCGTCGGCATCGCTGTGGTC1021AACGAACATGGACGGTTTTTCCTGCGCCCGGAGACGGCGCTTGCCGATCCGCAGTTTGTC1081GCCTGGCTTGGTGATGAAACGAAGAAAAAAAGCATGTTTGACTCAAAGCGCGCGGCAGTC1141GCCTTGAAATGGAAAGGAATTGAGCTATGCGGCGTTTCCTTTGATTTATTGCTGGCCGCC1201TATTTGCTTGATCCGGCGCAAGGTGTTGATGATGTGGCTGCCGCAGCAAAAATGAAGCAA1261TACGAAGCGGTGCGCCCGGATGAAGCGGTGTATGGCAAAGGGGCGAAGCGGGCCGTGCCG1321GATGAGCCAGTGCTCGCCGAGCATCTCGTCCGCAAGGCGGCGGCGATTTGGGCGCTCGAA1381CGGCCGTTTTTGGATGAGCTGCGCCGCAACGAACAAGATCGGTTGCTCGTCGAGCTCGAG1441CAGCCGTTGTCTTCGATTTTGGCGGAAATGGAATTTGCCGGAGTGAAAGTGGATACGAAG1501CGGCTCGAACAGATGGGCGAAGAGCTCGCCGAGCAGCTGCGCACGGTCGAGCAGCGCATT1561TATGAGCTCGCCGGCCAAGAATTCAACATCAATTCACCGAAACAGCTCGGCGTCATTTTA1621TTTGAAAAACTGCAGCTGCCCGTCTTGAAAAAAACGAAAACCGGCTACTCCACTTCGGCG1681GATGTGCTTGAAAAACTTGCGCCTTATCACGAGATCGTGGAAAACATTTTGCATTACCGC1741CAGCTTGGCAAGTTGCAGTCGACGTATATTGAAGGATTGCTGAAAGTCGTGCGACCCGAT1801ACAAAGAAGGTGCATACGATTTTCAATCAGGCGTTGACGCAAACCGGACGGCTCAGCTCG<formula>formula see original document page 10</formula>B) 類型核酸C) 鏈性單鏈D) 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性4)序列描述SEQ ID No. 3GAC GGA TCC ATG AGA TTG AAA AAA AAG CTT4. SEQ ID No. 4的信息1) 分子類型寡核苷酸2) 序列特征A) 長(zhǎng)度27bpB) 類型核酸C) 鏈性單鏈D) 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性4)序列描述SEQ ID No. 4TCA TCT AGA TTA TTT CGC GTC ATA CCA1權(quán)利要求
1. 一種分離出的DNA分子，其特征在于，它包括編碼來(lái)自深海高溫菌Bacilluscaldolyticus DY的耐熱性DNA聚合酶基因的核苷酸序列，或者所述核苷酸序列與SEQID NO.1中1-2637位的核苷酸序列有至少70％的相似性，或者所述核苷酸序列能在中等嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID No.1中1-2637位的核苷酸序列雜交。
2. 如權(quán)利1中要求的DNA分子，其特征在于，所述的序列編碼一多肽，該多肽具有 SEQ ID No.2所示的序列。
3. —種分離的Bcady-pol蛋白多肽，其特征在于，它包括具有SEQIDNo.2所示的氨基酸序列的多肽，或其活性片段，或其活性衍生物。
4. 一種產(chǎn)生具有Bcady-pol蛋白活性的多肽的方法，其特征在于，該方法包括a. 將編碼具有Bcady-pol蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地與表達(dá)調(diào)控序 列連接，形成Bcady-pol基因表達(dá)載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID No.l中從核 苷酸l-2637位的核苷酸序列有至少70%的相似性；b. 將步驟a中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，形成Bcady-pol活性多肽的重組細(xì)胞；c. 在適合表達(dá)Bcady-pol活性多肽的條件下，培養(yǎng)步驟b中的重組細(xì)胞；d. 分離出具有Bcady-pol的活性多肽。
5. 如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，該重組的編碼多肽的核苷酸序列為SEQID No.l中從核苷酸1-2637位。
全文摘要
本發(fā)明涉及從一株深海高溫菌Bacillus caldolyticus DY基因組中克隆了一耐熱性DNA聚合酶基因，該基因所編碼的活性酶或者基因工程改造酶能廣泛應(yīng)用于各類PCR，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和DNA測(cè)序等分子生物學(xué)研究領(lǐng)域。首先涉及Bacillus caldolyticus DY基因組DNA的提取，其次是耐熱性DNA聚合酶基因的PCR擴(kuò)增和序列分析，第三是耐熱性DNA聚合酶基因的表達(dá)和純化，第四是對(duì)重組耐熱性DNA聚合酶的性質(zhì)進(jìn)行了測(cè)定。
文檔編號(hào)C12N9/00GK101255435SQ200710008960
公開(kāi)日2008年9月3日 申請(qǐng)日期2007年5月9日 優(yōu)先權(quán)日2007年5月9日
發(fā)明者琦 丁, 徐麗美, 豐 楊 申請(qǐng)人:國(guó)家海洋局第三海洋研究所