專利名稱：一種用于植物直接基因轉(zhuǎn)化的組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于植物直接基因轉(zhuǎn)化的組合物及其應(yīng)用，屬于生物工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
植物基因工程是在分子生物學(xué)深入發(fā)展和重組DNA技術(shù)日趨完善的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的。在植物抗病、抗蟲(chóng)、抗莠和改變植物的某些成分方面得到不少轉(zhuǎn)基因植物，有的已形成品系，為提高作物產(chǎn)量、抗逆能力、改進(jìn)品質(zhì)，進(jìn)行快速、優(yōu)質(zhì)、穩(wěn)產(chǎn)的良種選育提供了全新途徑。在高等植物基因工程研究中，外源基因的轉(zhuǎn)移是極為重要的一環(huán)。由于植物及其細(xì)胞自身的特殊性，因而對(duì)基因轉(zhuǎn)移方法也有一些特殊的要求?？v觀諸多外源基因轉(zhuǎn)移方法，按照載體的形式可以分為兩大類即用含外源基因Ti質(zhì)粒的根癌農(nóng)桿菌侵染植物和用含外源基因的DNA直接轉(zhuǎn)化植物。含外源基因DNA的直接轉(zhuǎn)化是用物理，化學(xué)和生物手段將裸露的外源DNA導(dǎo)入植物細(xì)胞組織或器官，并使外源DNA所包含的基因在植物細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行表達(dá)。這一方法從根本上克服了Ti質(zhì)粒只能侵染雙子葉植物的缺陷，使受體植物范圍大大擴(kuò)展。
在植物基因工程的發(fā)展中，研究最清楚和應(yīng)用最成功的是根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化。1974年，人們發(fā)現(xiàn)根癌農(nóng)桿菌在感染植物時(shí)，可將其中環(huán)狀的Ti質(zhì)粒上的一段DNA插入植物基因組中，引起植物遺傳特性的變化。從此，人們開(kāi)始嘗試?yán)眠@種天然的載體系統(tǒng)，將外源基因?qū)胫参锛?xì)胞，并利用植物細(xì)胞的全能性，借助于細(xì)胞培養(yǎng)或組織培養(yǎng)技術(shù)，使轉(zhuǎn)化細(xì)胞再生成完整的轉(zhuǎn)基因植株，從而實(shí)現(xiàn)外源基因?qū)χ参锏倪z傳轉(zhuǎn)化。1983年獲得了第一例轉(zhuǎn)基因植物。1985年，Horsh等人首創(chuàng)葉盤(pán)轉(zhuǎn)化法，使得轉(zhuǎn)化過(guò)程大為簡(jiǎn)化。此后，因該方法因具有轉(zhuǎn)基因低拷貝，遺傳穩(wěn)定以及能夠轉(zhuǎn)化大片段DNA等優(yōu)點(diǎn)而得到廣泛使用。目前，在眾多的轉(zhuǎn)基因植物中80％是由農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的。根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)，它含有Ti質(zhì)粒，能誘導(dǎo)被侵染的植物細(xì)胞形成腫瘤，即誘發(fā)冠癭瘤。Ti質(zhì)粒(包括Ri質(zhì)粒)上有一段轉(zhuǎn)移DNA(又稱T-DNA)，在農(nóng)桿菌侵染植物時(shí)，這段DNA可以插入到植物基因組中，使其攜帶的基因在植物中得以表達(dá)。由于T-DNA能夠進(jìn)行高頻率的轉(zhuǎn)移，而且Ti質(zhì)粒和Ri質(zhì)粒上可插入大到50kb的外源基因。因此，Ti質(zhì)粒和Ri質(zhì)粒就成為植物基因轉(zhuǎn)化的理想載體系統(tǒng)。Ti質(zhì)粒上T-DNA的轉(zhuǎn)移必須借助于Ti質(zhì)粒上vir基因編碼產(chǎn)生的毒蛋白virD2/E2virD2和virE2的作用才能實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化。但農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化一般需要經(jīng)過(guò)組織培養(yǎng)，受到受體植物類型，以及再生系統(tǒng)建立的限制。
基因槍法是目前直接轉(zhuǎn)化法中最為廣泛使用的一種方法，該法又稱粒子轟擊(particlebombardment)，高速粒子噴射技術(shù)(High-velocity particle microprojection)或基因槍轟擊技術(shù)(gene gun bombardment)，是由美國(guó)Comel大學(xué)生物化學(xué)系John.C.Santord等于1983年研究成功。并在1987年，Vlein首先報(bào)道了應(yīng)用此技術(shù)將TMV(煙草花葉病毒)RNA吸附到鎢粒表面，轟擊洋蔥表皮細(xì)胞，經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)病毒RNA能進(jìn)行復(fù)制，并以同樣技術(shù)將CAT(氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因)基因?qū)胙笫[表皮細(xì)胞?，F(xiàn)在，該技術(shù)已在煙草、水稻、小麥、黑麥草、甘蔗、棉花、大豆、菜豆、洋蔥、番木瓜、甜橙、葡萄等多種作物上成功。該方法具有應(yīng)用面廣，方法簡(jiǎn)單，轉(zhuǎn)化時(shí)間短，由于基因槍轟擊的隨機(jī)性，外源基因進(jìn)入宿主基因組的整合位點(diǎn)相對(duì)不固定，拷貝數(shù)往往較多，這樣轉(zhuǎn)基因后代容易出現(xiàn)突變、外源基因容易丟失，容易引起基因沉默等現(xiàn)象的發(fā)生，不利于外源基因在宿主植物的穩(wěn)定表達(dá)。而且基因槍價(jià)格昂貴、運(yùn)轉(zhuǎn)費(fèi)用高。
花粉管通道法，最早是由周光宇1983年建立。在植物授粉后一定時(shí)間，將外源DNA注入棉花子房的中胚胎部位，使DNA沿著已形成的花粉管通道進(jìn)入胚囊，從而轉(zhuǎn)化尚不具備正常細(xì)胞壁的受精卵或胚細(xì)胞。由于該方法有的是采用總DNA進(jìn)行導(dǎo)入，后代的變異是隨機(jī)的，加之很多的試驗(yàn)缺少分子驗(yàn)證，而且對(duì)于外源DNA整合的機(jī)制難以解釋清楚，所以對(duì)于花粉管通道方法的廣泛使用還存在著爭(zhēng)議。此外，由于設(shè)計(jì)原理和操作規(guī)程本身的限制，外源的轉(zhuǎn)化元件是裸露的DNA，在其通過(guò)花粉管進(jìn)入胚囊，通過(guò)受精卵的細(xì)胞膜、核膜完成整合的過(guò)程中，非常易于被降解，而且外源DNA進(jìn)入胚囊主要依賴于重力和滲透作用，外源DNA缺乏整合進(jìn)受體基因組的根本動(dòng)力，轉(zhuǎn)化效率低，所產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植株其后代不能穩(wěn)定的遺傳等問(wèn)題。
化學(xué)法一般利用植物原生質(zhì)體，在沒(méi)有載體的情況下，借助一些化學(xué)試劑的誘導(dǎo)能吸收外源DNA，質(zhì)粒等遺傳物質(zhì)，并有可能整合到植物染色體上去。常用的化學(xué)試劑有PEG(聚乙二醇)，PLD(多聚鳥(niǎo)氨酸)，PVA(聚乙稀醇)等，其中最為常用的是PEG。應(yīng)用這一方法，在植物細(xì)胞中首次進(jìn)行直接基因裝移的是戴維(Davey)和Krens等?；瘜W(xué)法打破了根癌農(nóng)桿菌侵染范圍的限制，使之可以廣泛應(yīng)用于多種單子葉的禾谷類植物，目前已實(shí)現(xiàn)了對(duì)栽培一粒小麥，多年生黑麥，水稻，高糧和小麥等原生質(zhì)體以及雙子葉植物油菜，煙草和矮牽牛的轉(zhuǎn)化。但單獨(dú)應(yīng)用化學(xué)法進(jìn)行轉(zhuǎn)化較難成功，轉(zhuǎn)化效率低?；瘜W(xué)法研究的時(shí)間比較長(zhǎng)，方法較成熟，且成本低、重復(fù)性好、易于推廣。但由于原生質(zhì)體再生頻率較低，培養(yǎng)難度大，周期長(zhǎng)，因而使這一方法的普及受到限制。
同時(shí)，目前廣泛應(yīng)用的基因槍和農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化方法，始終存在選擇標(biāo)記基因和載體骨架序列等非目的基因外源DNA片段引起的潛在安全性問(wèn)題。而以消除選擇標(biāo)記基因和載體骨架序列為目標(biāo)，國(guó)內(nèi)外許多實(shí)驗(yàn)室近年來(lái)采用了多種策略進(jìn)行大量的研究和不斷的改進(jìn)并且取得了一些進(jìn)展。
因此探討建立一種新的可以完全消除非目的基因外源DNA片段的安全、實(shí)用、簡(jiǎn)便、高效、穩(wěn)定，且不需經(jīng)過(guò)組織培養(yǎng)，受體范圍廣的直接轉(zhuǎn)化系統(tǒng)具有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種用于植物直接基因轉(zhuǎn)化的組合物和該組合物的安全、簡(jiǎn)便、高效的直接基因轉(zhuǎn)化方法以及該組合物的的應(yīng)用。
本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題采用的技術(shù)方案是，一種用于植物直接基因轉(zhuǎn)化的組合物，該組合物含有(1)目的基因及其表達(dá)調(diào)控元件的游離核酸組分，包括質(zhì)粒DNA或不含載體骨架的線性DNA片段；(2)轉(zhuǎn)化緩沖液，包括1/2MS液體培養(yǎng)基，或TE(pH8.0)或0.1×SSC緩沖液；(3)轉(zhuǎn)化輔助組分包括0.005％-0.02％的表面活性劑DOW CORNING Q2-5211，10mmol/L-50mmol/L Ca2+，1-10ppm 2，4-D，0.5ppm 6-BA。轉(zhuǎn)化輔助組分還包括0.1％硼酸、根癌農(nóng)桿菌分泌的VirD2蛋白和VirE2蛋白。根癌農(nóng)桿菌是指含有Vir區(qū)、Con區(qū)和Ori區(qū)，但不含有T-DNA轉(zhuǎn)移區(qū)的Ti質(zhì)粒。VirD2蛋白和VirE2蛋白通過(guò)乙酰丁香酮誘導(dǎo)分泌獲得。質(zhì)粒DNA是指具備完整的復(fù)制起點(diǎn)、目的基因、表達(dá)調(diào)控元件和邊界序列的環(huán)狀DNA或具備完整的復(fù)制起點(diǎn)、目的基因、表達(dá)調(diào)控元件，但不含有邊界序列的環(huán)狀DNA。線性DNA組分是指包含邊界序列、目的基因及其表達(dá)調(diào)控序列的線性DNA片段或包含目的基因及其表達(dá)調(diào)控序列，但不包含邊界序列的線性DNA片段。質(zhì)粒DNA和線性DNA在組合物中游離存在，不需要轉(zhuǎn)導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌中。線性DNA組分包括雙鏈DNA線形片段或單鏈DNA線形片段。雙鏈DNA線性片段可通過(guò)PCR方法從目的質(zhì)粒上擴(kuò)增所獲得或從目的質(zhì)粒上通過(guò)酶切獲得。單鏈DNA片段由雙鏈DNA通過(guò)99℃變性后0℃迅速降溫所獲得。
一種用于植物直接基因轉(zhuǎn)化的組合物的轉(zhuǎn)化方法，可以通過(guò)共培養(yǎng)，浸泡，表面涂抹，注射，滴注，噴施，蘸花方法轉(zhuǎn)化；也可以通過(guò)基因槍轟擊、超聲波、電擊方法轉(zhuǎn)化。
該組合物可應(yīng)用于針對(duì)受體植物細(xì)胞，包括受精卵、懸浮細(xì)胞、原生質(zhì)體、單層細(xì)胞、葉肉細(xì)胞的直接轉(zhuǎn)化，可應(yīng)用于針對(duì)受體植物組織，包括未成熟胚、胚性愈傷組織、分生組織的直接轉(zhuǎn)化，也可應(yīng)用于針對(duì)種子的直接轉(zhuǎn)化和可應(yīng)用于針對(duì)受體植物花粉、雌蕊、花柱、花粉管、子房的直接原位轉(zhuǎn)化。
本發(fā)明提供的植物基因轉(zhuǎn)化組合物及其在直接轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用，其核心技術(shù)在于提供的包含游離核酸組分、轉(zhuǎn)化緩沖液和轉(zhuǎn)化輔助組分的轉(zhuǎn)化組合物，能夠解決直接轉(zhuǎn)化中所面臨的目的基因轉(zhuǎn)化動(dòng)力、轉(zhuǎn)運(yùn)、保護(hù)和整合的一系列問(wèn)題。
本發(fā)明所提供的轉(zhuǎn)化輔助組分，主要包括表面活性劑Dow Corning Q2-5211，Ca2+，生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑2，4-D或6-BA，硼酸，以及經(jīng)乙酰丁香酮誘導(dǎo)的根癌農(nóng)桿菌所分泌到胞外的VirD2蛋白和VirE2蛋白。轉(zhuǎn)化輔助組分的結(jié)合使用，可以在轉(zhuǎn)化中起到提供轉(zhuǎn)化動(dòng)力，核定位，以及保護(hù)和促進(jìn)整合的作用。
Dow Corning Q2-5211超級(jí)潤(rùn)濕劑是一種低分子量的非離子聚醚改性有機(jī)硅表面活性劑，當(dāng)濃度為0.01％時(shí)，Dow Corning Q2-5211超級(jí)潤(rùn)濕劑可以使表面張力降低至23dynes/cm，這使得轉(zhuǎn)化緩沖液可以迅速濕潤(rùn)，并在難以濕潤(rùn)的外植體比如蠟狀葉子表面上迅速擴(kuò)散并被外植體所吸收，可以顯著提高轉(zhuǎn)化緩沖液的潤(rùn)濕性、延展性和滲透性，從而有助于提高轉(zhuǎn)化的效率，并安全無(wú)毒，是理想的轉(zhuǎn)化動(dòng)力來(lái)源。在本發(fā)明中，DOW CORNING Q2-5211的濃度范圍為0.005％-0.02％。
DNA可以通過(guò)鈣鹽的形式沉積在細(xì)胞的表面，并通過(guò)引發(fā)胞吞作用，實(shí)現(xiàn)DNA的轉(zhuǎn)移。用10mmol/L-50mmol/L的CaCl2(或磷酸鈣)處理受體細(xì)胞，可以引起細(xì)胞膨脹，增大細(xì)胞的通透性，使受體細(xì)胞易于接受外源DNA，提高轉(zhuǎn)化效率。在本發(fā)明中Ca2+的濃度范圍是10mmol/L-50mmol/L。
2，4-D和6-BA在低濃度下均為植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)，有助于細(xì)胞處理旺盛的生長(zhǎng)和分裂狀態(tài)，處于旺盛分裂期的細(xì)胞更有助于接受外源的DNA，提高轉(zhuǎn)化效率。本發(fā)明中2，4-D的濃度范圍是1-10ppm；6-BA的濃度是0.5ppm。
硼是一種向化性物質(zhì)，可以引導(dǎo)花粉管由柱頭到胚株的轉(zhuǎn)移，在針對(duì)花器官的轉(zhuǎn)化中，在本發(fā)明中加入0.1％硼酸可以有助于轉(zhuǎn)化元件經(jīng)柱頭或子房表面到到胚株，完成外源基因的定向傳輸和整合。
本發(fā)明所提供的轉(zhuǎn)化輔助組分中，特別利用農(nóng)桿菌誘導(dǎo)表達(dá)的毒蛋白virD2和virE2實(shí)現(xiàn)游離核酸向受體的轉(zhuǎn)移，核定位、保護(hù)及整合。毒蛋白virD2可以協(xié)助帶有T-DNA左右邊界序列的目的基因及其調(diào)控序列完成轉(zhuǎn)移、核定位及在植物基因組中的整合；virE2可以在細(xì)胞膜，及核膜上建立單鏈特異性的通道，并與單鏈核酸的結(jié)合起到穩(wěn)定和保護(hù)的作用，virE2具有核定位信號(hào)，協(xié)助virD2-單鏈核酸復(fù)合物向植物細(xì)胞核的定位和整合，解決目前游離核酸直接轉(zhuǎn)化過(guò)程中易被降解、轉(zhuǎn)化多拷貝、轉(zhuǎn)化效率低、重復(fù)性差等多種問(wèn)題。
本發(fā)明使用只含有Vir區(qū)、Con區(qū)和Ori區(qū)，但不含有T-DNA轉(zhuǎn)移區(qū)的農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒。virD2和virE2蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)主要通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)含有Ti質(zhì)粒的農(nóng)桿菌LBA4404或GV3101，接種于含有50mg/L的利福平和25mg/L的鏈霉素的YEB培養(yǎng)基中，于28℃和250rpm條件下?lián)u動(dòng)培養(yǎng)至生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期(菌液吸光度OD550為1.8-2.0)；將培養(yǎng)好的菌液在5000rpm條件下離心I0min，菌體重新懸浮于1/2MS液體培養(yǎng)基制成菌液，稀釋后的菌液濃度約為2×108cfu/ml，然后向菌液中加入乙酰丁香酮至終濃度為20mg/L，繼續(xù)在28℃和250rpm條件下?lián)u動(dòng)培養(yǎng)3-4個(gè)小時(shí)，3000rpm條件下離心10min離心去除菌體，上清液為含有virD2和virE2的轉(zhuǎn)化緩沖液。
農(nóng)桿菌virD2/virE2蛋白輔助的直接轉(zhuǎn)化包括兩種方式。一種是針對(duì)受體植物的細(xì)胞、組織的轉(zhuǎn)化。該轉(zhuǎn)化體系的主要技術(shù)路線是(1)樣品前處理受體細(xì)胞或組織在預(yù)轉(zhuǎn)化前于70％的乙醇消毒1分鐘，MS培養(yǎng)基沖洗一次，升汞消毒10分鐘，MS沖洗數(shù)次，然后可選擇置于高滲緩沖液中處理10-20分鐘，高滲緩沖液的組成為MS液體培養(yǎng)基+47g/L甘露醇+47g/L山梨醇。(2)轉(zhuǎn)化將處理后的受體細(xì)胞或組織與含有游離轉(zhuǎn)化元件、轉(zhuǎn)化緩沖液和經(jīng)乙酰丁香酮誘導(dǎo)的Ti質(zhì)粒菌液，或含有virD2和virE2的轉(zhuǎn)化輔助溶液的轉(zhuǎn)化組合物中培養(yǎng)30min-1h。(3)瞬時(shí)表達(dá)分析將外植體取置于含有0.5ppm 6-BA的MS分化培養(yǎng)基中在20-24℃條件下黑暗共培養(yǎng)1-3天，根據(jù)編碼基因的特性，選擇適當(dāng)?shù)姆椒z測(cè)該基因的瞬時(shí)表達(dá)。如上述的轉(zhuǎn)化組合物中添加終濃度為0.005％-0.02％的的DOW CORNINGQ2-5211，10mmol/L-100mmol/L的CaCl2，1-10ppm的2，4-D或0.5ppm的6-BA等轉(zhuǎn)化輔助組分，可以進(jìn)一步提高轉(zhuǎn)化效率。第二種是針對(duì)花器官的直接原位轉(zhuǎn)化。可借助花粉管通道法、子房注射，或子房滴注法，實(shí)現(xiàn)植物原位轉(zhuǎn)化。該轉(zhuǎn)化方法的主要技術(shù)路線是將含有游離轉(zhuǎn)化元件、轉(zhuǎn)化緩沖液和經(jīng)乙酰丁香酮誘導(dǎo)的Ti質(zhì)粒菌液，或含有virD2和virE2的轉(zhuǎn)化輔助溶液的轉(zhuǎn)化組合物直接滴加到切割過(guò)的柱頭或子房表面，或注射入柱頭或子房的內(nèi)部，實(shí)現(xiàn)游離核酸對(duì)合子的轉(zhuǎn)化，收獲的種子中即可能包含有轉(zhuǎn)化基因，收獲種子直接成株后，經(jīng)篩選分析，可以獲得穩(wěn)定持續(xù)的轉(zhuǎn)基因后代。該方法不需要經(jīng)過(guò)組織培養(yǎng)過(guò)程，簡(jiǎn)便、高效，成本低廉。同樣，在轉(zhuǎn)化組合物中添加終濃度為0.005％-0.02％的Dow Corning Q2-5211，10mmol/L-50mmol/L的CaCl2；0.1％硼酸；1-10ppm的2，4-D或0.5ppm的6-BA，可以進(jìn)一步提高轉(zhuǎn)化效率。
本發(fā)明中提供的含有目的基因及其表達(dá)調(diào)控元件的游離核酸組分主要包括質(zhì)粒DNA組分和線性DNA組分。質(zhì)粒DNA是指具備完整的復(fù)制起點(diǎn)、表達(dá)調(diào)控元件、包含(或不包含)邊界序列的環(huán)狀DNA，在本發(fā)明中質(zhì)粒不需要轉(zhuǎn)導(dǎo)入菌體中，在轉(zhuǎn)化組合物中以溶液形式游離存在。線性DNA組分是指包含(或不包含)邊界序列、目的基因及其調(diào)控序列的線性DNA片段，在轉(zhuǎn)化組合物中也以溶液形式游離存在。
邊界序列主要指Ti質(zhì)粒中T-DNA左右邊界的保守序列，在目的基因及其調(diào)控序列兩端加入T-DNA左右邊界的保守序列，有利于VirD2的識(shí)別，及在植物受體中的定位和整合。在本發(fā)明中，加入目的基因啟動(dòng)子之前序列為T(mén)-DNA右邊界，其保守序列為5-gtttacccgccaatatatcctgtca；加入到目的基因終止子之后的序列為T(mén)-DNA左邊界，其保守序列為5-tgtttacaccacaatatatcctgcca。本發(fā)明提供的線性DNA可以是單鏈的DNA也可以雙鏈的DNA。雙鏈的線性片段可通過(guò)PCR方法從目的質(zhì)粒上擴(kuò)增所獲得，或從目的質(zhì)粒上通過(guò)酶切獲得。單鏈DNA片段主要通過(guò)雙鏈DNA 99℃變性后0℃迅速降溫所獲得。
本發(fā)明的有益效果是，本發(fā)明提供的植物基因轉(zhuǎn)化組合物及其在直接轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用，能夠解決直接轉(zhuǎn)化過(guò)程中，目的基因所面臨的轉(zhuǎn)化動(dòng)力、定位、保護(hù)和整合的一系列問(wèn)題。利用僅由表達(dá)調(diào)控序列和目的基因組成的線性片段，可以實(shí)現(xiàn)無(wú)選擇標(biāo)記基因、無(wú)載體骨架序列的轉(zhuǎn)化過(guò)程，具有生物安全性；針對(duì)花器官的直接原位轉(zhuǎn)化，可以實(shí)現(xiàn)無(wú)組織培養(yǎng)的轉(zhuǎn)化過(guò)程，從而避免了植株再生系統(tǒng)建立的瓶頸，擴(kuò)大了轉(zhuǎn)化受體的范圍。因此，本發(fā)明提供的植物基因轉(zhuǎn)化組合物對(duì)于植物遺傳育種、品種改良或基因功能分析具有重要的意義。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說(shuō)明。
實(shí)施例1GUS基因在洋蔥表皮細(xì)胞中的快速高效的瞬間表達(dá)取洋蔥下表皮用刀片劃為適當(dāng)大小的組織塊，于70％的乙醇消毒1分鐘，MS培養(yǎng)基沖洗一次，升汞消毒5分鐘，MS沖洗數(shù)次，然后置于高滲緩沖液MS液體培養(yǎng)基+47g/L甘露醇+47g/L山梨醇中預(yù)處理10-20分鐘。
含有Ti質(zhì)粒的農(nóng)桿菌，接種于含有抗生素的YEB培養(yǎng)基中，于28℃和250rpm條件下?lián)u動(dòng)培養(yǎng)至生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期(菌液吸光度OD550為1.8-2.0)；③將培養(yǎng)好的菌液在5000rpm條件下離心10min，然后菌體重新懸浮于1/2MS液體培養(yǎng)基(附加乙酰丁香酮20mg/L)+轉(zhuǎn)化元件+0.01％的Dow corning Q2-5211+10mmol/L的CaCl2+0.1mmol/L亞精氨，稀釋后的菌液濃度約2×108cfu/ml；轉(zhuǎn)化元件為帶有RB+35S+GUS+NOS+LB的線性片段；④將經(jīng)過(guò)預(yù)處理的洋蔥下表皮置于菌液中，25-26℃條件下緩慢搖動(dòng)1.5h；⑤取出洋蔥下表皮轉(zhuǎn)入MS培養(yǎng)基(乙酰丁香酮200p mol/L)上，25-26℃共培養(yǎng)36-48小時(shí)；⑥將共培養(yǎng)后的洋蔥下表皮，用無(wú)菌水洗3次，再用附加500mg/L頭孢霉素的無(wú)菌水洗1次，用無(wú)菌濾紙吸干水分；⑦將洋蔥表皮置于96孔板中，每孔放置一片洋蔥表皮，鋪平后，表面滴加X(jué)-gluc20微升，然后置于37℃培養(yǎng)箱中1-12個(gè)小時(shí)，于體視顯微鏡下觀察記錄GUS基因的表達(dá)情況。結(jié)果表明，洋蔥表皮在農(nóng)桿菌分泌的毒蛋白virD2/E2的介導(dǎo)下，能夠有助于目的基因及其調(diào)控序列進(jìn)入到細(xì)胞核內(nèi)部，目的基因在其調(diào)控序列的作用下能夠?qū)崿F(xiàn)目的基因的瞬間表達(dá)，且表達(dá)的GUS蛋白在細(xì)胞中呈均勻分布。瞬間表達(dá)蛋白的細(xì)胞有60-80％。
實(shí)施例2含有GUS基因的線性片段通過(guò)花粉管通道法的高效穩(wěn)定轉(zhuǎn)化帶有農(nóng)桿菌毒蛋白virD2/E2的緩沖液的制備含有Ti質(zhì)粒的農(nóng)桿菌LBA4404，接種于含有50mg/L的利福平和25mg/L的鏈霉素的YEB培養(yǎng)基中，于28℃和250rpm條件下?lián)u動(dòng)培養(yǎng)至生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期(菌液吸光度OD550為1.8-2.0)；將培養(yǎng)好的菌液在5000rpm條件下離心10min，菌體重新懸浮于1/2MS液體培養(yǎng)基制成菌液，稀釋后的菌液濃度約為2×108cfu/ml，然后向菌液中加入乙酰丁香酮至終濃度為20mg/L，繼續(xù)在28℃和250rpm條件下?lián)u動(dòng)培養(yǎng)3-4個(gè)小時(shí)，3000rpm條件下離心10min離心去除菌體，上清液為帶有virD2和virE2的緩沖液。然后將緩沖液中加入終濃度分別為0.01％的Dow Corning Q2-5211、10mmol/L的CaCl2、0.1％硼酸和0.5ppm的6-BA制作成轉(zhuǎn)化緩沖液。
轉(zhuǎn)化元件的獲得以pBI121-GUS質(zhì)粒為模板，使用含有T-DNA邊界序列的引物PT1/PT2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，構(gòu)建基因轉(zhuǎn)化元件。PT15’-GTTTACCCGCCAATATATCCTGTCACTGCCTGCAGGTCCCCAGATTAGCCTT-3’，PT25’-TGGCAGGATATATTGTGGTGTAAACCGATCTAGTAACATAGATGACACCGC-3’，使用高保真LaTaq酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件如下95℃，5min后，94℃30s，55℃1.5min，72℃，1.5min共30個(gè)循環(huán)，72℃7min；PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，加入二倍體積無(wú)水乙醇，及1/10體積的3M的NaAc進(jìn)行沉淀，定量，溶于帶有毒蛋白virD2/E2的轉(zhuǎn)化緩沖液中，終濃度為100ngμl-1，用于進(jìn)一步的轉(zhuǎn)化。
在大豆自花授粉后6-32小時(shí)(花冠略高于花萼1mm左右)完整切除柱頭，將5ul轉(zhuǎn)化緩沖液滴于切口處。若氣溫較高，補(bǔ)滴一次。標(biāo)記處理的花朵，并剪除未進(jìn)行操作的花朵。成熟后收獲種子。以只含1/2MS轉(zhuǎn)化緩沖液的處理作對(duì)照。利用PCR、Southern雜交等分子手段對(duì)收獲的種子及其后代進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明在毒蛋白virD2/E2介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化緩沖液的作用下，線性片段以單拷貝的形式穩(wěn)定整合到大豆的基因組中。
權(quán)利要求
1.一種用于植物直接基因轉(zhuǎn)化的組合物，其特征在于，該組合物含有(1)目的基因及其表達(dá)調(diào)控元件的游離核酸組分，包括質(zhì)粒DNA或不含載體骨架的線性DNA片段；(2)轉(zhuǎn)化緩沖液，包括1/2MS液體培養(yǎng)基，或TE(pH8.0)或0.1×SSC緩沖液；(3)轉(zhuǎn)化輔助組分包括0.005％-0.02％的表面活性劑DOW CORNING Q2-5211，10mmol/L-50mmol/L Ca2+，1-10ppm 2，4-D，0.5ppm 6-BA。
2.根據(jù)權(quán)利1所述的一種用于植物直接基因轉(zhuǎn)化的組合物，其特征在于，所述的轉(zhuǎn)化輔助組分還包括0.1％硼酸。
3.根據(jù)權(quán)利1所述的一種用于植物直接基因轉(zhuǎn)化的組合物，其特征在于，所述的轉(zhuǎn)化輔助組分還包括根癌農(nóng)桿菌分泌的VirD2蛋白和VirE2蛋白。
4.根據(jù)權(quán)利3所述的一種用于植物直接基因轉(zhuǎn)化的組合物，其特征在于，所述的根癌農(nóng)桿菌是指含有Vir區(qū)、Con區(qū)和Ori區(qū)，但不含有T-DNA轉(zhuǎn)移區(qū)的Ti質(zhì)粒。
5.根據(jù)權(quán)利3所述的一種用于植物直接基因轉(zhuǎn)化的組合物，其特征在于，所述的VirD2蛋白和VirE2蛋白通過(guò)乙酰丁香酮誘導(dǎo)分泌獲得。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于植物直接基因轉(zhuǎn)化的組合物，其特征在于，所述的質(zhì)粒DNA是指具備完整的復(fù)制起點(diǎn)、目的基因、表達(dá)調(diào)控元件和邊界序列的環(huán)狀DNA或具備完整的復(fù)制起點(diǎn)、目的基因、表達(dá)調(diào)控元件，但不含有邊界序列的環(huán)狀DNA。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于植物直接基因轉(zhuǎn)化的組合物，其特征在于，所述的線性DNA組分是指包含邊界序列、目的基因及其表達(dá)調(diào)控序列的線性DNA片段或包含目的基因及其表達(dá)調(diào)控序列，但不包含邊界序列的線性DNA片段。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于植物直接基因轉(zhuǎn)化的組合物，其特征在于，所述的質(zhì)粒DNA和線性DNA在組合物中游離存在，不需要轉(zhuǎn)導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌中。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種用于植物直接基因轉(zhuǎn)化的組合物，其特征在于，所述的線性DNA組分包括雙鏈DNA線形片段或單鏈DNA線形片段。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的一種用于植物直接基因轉(zhuǎn)化的組合物，其特征在于，所述的雙鏈DNA線性片段可通過(guò)PCR方法從目的質(zhì)粒上擴(kuò)增所獲得或從目的質(zhì)粒上通過(guò)酶切獲得。
11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的一種用于植物直接基因轉(zhuǎn)化的組合物，其特征在于，所述的單鏈DNA片段由雙鏈DNA通過(guò)99℃變性后0℃迅速降溫所獲得。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于植物直接基因轉(zhuǎn)化的組合物的轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，可以通過(guò)共培養(yǎng)，浸泡，表面涂抹，注射，滴注，噴施，蘸花方法轉(zhuǎn)化；也可以通過(guò)基因槍轟擊、超聲波、電擊方法轉(zhuǎn)化。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于植物直接基因轉(zhuǎn)化的組合物，其特征在于，該組合物可應(yīng)用于針對(duì)受體植物細(xì)胞，包括受精卵、懸浮細(xì)胞、原生質(zhì)體、單層細(xì)胞、葉肉細(xì)胞的直接轉(zhuǎn)化。
14.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于植物直接基因轉(zhuǎn)化的組合物，其特征在于，該組合物可應(yīng)用于針對(duì)受體植物組織，包括未成熟胚、胚性愈傷組織、分生組織的直接轉(zhuǎn)化。
15.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于植物直接基因轉(zhuǎn)化的組合物，其特征在于，該組合物可應(yīng)用于針對(duì)種子的直接轉(zhuǎn)化。
16.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于植物直接基因轉(zhuǎn)化的組合物的應(yīng)用方法，其特征在于，該組合物可應(yīng)用于針對(duì)受體植物花粉、雌蕊、花柱、花粉管、子房的直接原位轉(zhuǎn)化。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種用于植物直接基因轉(zhuǎn)化的組合物、轉(zhuǎn)化方法及其應(yīng)用，組合物包括(1)目的基因及其表達(dá)調(diào)控元件的游離核酸組分，(2)轉(zhuǎn)化緩沖液，和(3)轉(zhuǎn)化輔助組分。轉(zhuǎn)化方法是通過(guò)共培養(yǎng)，浸泡，表面涂抹，注射，滴注，噴施，蘸花方法轉(zhuǎn)化；也可以通過(guò)基因槍轟擊、超聲波、電擊方法轉(zhuǎn)化。組合物可應(yīng)用于針對(duì)受體植物細(xì)胞，包括受精卵、懸浮細(xì)胞、原生質(zhì)體、單層細(xì)胞、葉肉細(xì)胞的直接轉(zhuǎn)化，針對(duì)受體植物組織，包括未成熟胚、胚性愈傷組織、分生組織的直接轉(zhuǎn)化，用于針對(duì)種子的直接轉(zhuǎn)化和可應(yīng)用于針對(duì)受體植物花粉、雌蕊、花柱、花粉管、子房的直接原位轉(zhuǎn)化。本發(fā)明對(duì)于植物遺傳育種、品種改良或基因功能分析具有重要的意義。
文檔編號(hào)C12N15/82GK101016553SQ20071001019
公開(kāi)日2007年8月15日 申請(qǐng)日期2007年1月22日 優(yōu)先權(quán)日2007年1月22日
發(fā)明者楊君, 程云清, 安利佳 申請(qǐng)人:大連理工大學(xué)