專利名稱：Sec2超抗原基因工程肽及其編碼基因和異源表達(dá)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程肽的基因克隆和異源表達(dá)，具體說是一系列具有 SEC2超抗原活性的基因工程肽、及其編碼基因的制備和異源表達(dá)。
背景技術(shù)：
超抗原(superantigen， SAg)是一組由細(xì)菌或病毒編碼的蛋白質(zhì)分子， 可以極低濃度(l 10ng/mL)刺激大部分T細(xì)胞增生，具有超強(qiáng)的增強(qiáng)機(jī) 體免疫反應(yīng)功能和一定的抗腫瘤活性。因此，超抗原是一種極好的免疫調(diào) 節(jié)劑和增效劑，可望被開發(fā)成潛在的新型抗腫瘤藥物，用于腫瘤治療。
金黃色葡萄球菌腸毒素(Staphylococcal enterotoxins， SEs)是一類 具有代表性的微生物外毒素。由于其極強(qiáng)的T細(xì)胞激活功能，成為一類典 型微生物超抗原，受到人們的廣泛重視。近年來，人們在對金黃色葡萄球 菌腸毒素(SE)結(jié)構(gòu)、免疫學(xué)功能及其抗腫瘤等進(jìn)行了大量研究工作，其 中主要集中在對SEA\SEB等的研究方面。我所在世界上首次對SEC2的基 因進(jìn)行了克隆、測序并在靶向融合蛋白研究方面取得了開創(chuàng)性成果，為進(jìn) 一步開展腸毒素C2 (SEC2)分子改造及其靶向融合蛋白的研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。
實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤學(xué)研究顯示利用SEC2作為腫瘤治療的超抗原藥物具有其它藥 物不可比擬的優(yōu)點(diǎn)SEC2較能抗消化并且耐熱以及只需使用很小的劑量就 可引發(fā)T細(xì)胞應(yīng)答和明顯的腫瘤抑制效應(yīng)。盡管如此，在臨床使用過程中 還不完全盡如人意。1)作為潛在腸胃毒素可引起伴隨著嘔吐和嚴(yán)重腹瀉等 毒副作用；2) SEC2超抗原對腫瘤細(xì)胞作用位點(diǎn)缺乏耙向性，在增強(qiáng)機(jī)體 免疫功能抑制腫瘤細(xì)胞生長的同時，可能對人體正常細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒作用； 劑量過大或應(yīng)用不當(dāng)亦可產(chǎn)生免疫耐受；3)作為潛在的臨床開發(fā)藥物，超 抗原SEC2分子量過大(約為27.6kD)，不易于靜脈注射和人體吸收。這些 問題限制了其在臨床上的應(yīng)用。因此，如何避免不利義素因素，充分利用 其強(qiáng)大的免疫功能，對于探索SEC2在抗腫瘤、甚至抗病毒中的作用，具有 非常重要的意義。
針對超抗原SEC2實(shí)際臨床應(yīng)用中所面臨的毒性效應(yīng)、缺乏靶向性以及 分子量偏大等問題，本發(fā)明根據(jù)金黃色葡萄球菌基因組、生物信息學(xué)等理 論，利用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)實(shí)現(xiàn)SEC2蛋白分子的定向改造，以獲得一系 列具有超抗原活性的基因工程多肽，這種經(jīng)遺傳改造的超抗原基因工程肽 對于擴(kuò)大其臨床應(yīng)用范圍，改善療效、降低毒副作用具有重要的實(shí)踐意義， 具有潛在的開發(fā)應(yīng)用前景。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及SEC2超抗原基因工程肽及其編碼基因和異源表達(dá)方法，其為一系列具有超抗原活性的基因工程肽，利用本發(fā)明可以在人工控制的條件下，大 量獲得高純度的具有超抗原活性的基因工程肽。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下
SEC2超抗原基因工程肽分別為下列任意氨基酸序列之一，
SEC2-1具有序列表SEQ ID NO: 2中氨基酸序列；
SEC2-2具有序列表SEQ ID NO: 4中氨基酸序列；
SEC2-3具有序列表SEQ ID NO: 6中氨基酸序列；
SEC2-4具有序列表SEQ ID NO: 8中氨基酸序列；
SEC2-5具有序列表SEQ ID NO: 10中氨基酸序列；
SEC2-6具有序列表SEQ ID NO: 12中氨基酸序列；
SEC2-7具有序列表SEQ ID NO: 14中氨基酸序列；
SEC2-8具有序列表SEQ ID NO: 16中氨基酸序列；
SEC2-9具有序列表SEQ ID NO: 18中氨基酸序列；
SEC2-10具有序列表SEQ ID NO: 20中氨基酸序列；
SEC2-11具有序列表SEQ ID NO: 22中氨基酸序列；
SEC2-12具有序列表SEQ ID NO: 24中氨基酸序列；
SEC2-13具有序列表SEQ ID NO: 26中氨基酸序列；
或SEC2-14具有序列表SEQ ID NO: 28中氨基酸序列。
所述基因工程肽的編碼基因分別對應(yīng)于下列核苷酸序列之一，
SEC2--1對應(yīng)的基因具有序列表SEQIDNO:1中堿基序列；
SEC2--2 X寸應(yīng)的基因具有序列表SEQIDNO:3中堿基序列；
SEC2--3對應(yīng)的基因具有序列表SEQIDNO:5中堿基序列；
SEC2--4對應(yīng)的基因具有序列表SEQIDNO:7中堿基序列；
SEC2--5對應(yīng)的基因具有序列表SEQIDNO:9中堿基序列；
SEC2--6對應(yīng)的基因具有序列表SEQIDNO:11中堿基序列;
SEC2.-7對應(yīng)的基因具有序列表SEQIDNO:13中堿基序列;
SEC2--8對應(yīng)的基因具有序列表SEQIDNO:15中堿基序列;
SEC2--9對應(yīng)的基因具有序列表SEQIDNO:17中堿基序列;
SEC2-10對應(yīng)的基因具有序列表SEQ ID NO: 19中堿基序列； SEC2-11對應(yīng)的基因具有序列表SEQ ID NO: 21中堿基序列； SEC2-12對應(yīng)的基因具有序列表SEQ ID NO: 23中堿基序列； SEC2-13對應(yīng)的基因具有序列表SEQ ID NO: 25中堿基序列； 或SEC2-14對應(yīng)的基因具有序列表SEQ ID NO: 27中堿基序列。 SEC2超抗原基因工程肽的異源表達(dá)方法
將編碼這一系列SEC2超抗原基因工程肽的核苷酸序列sec2-l、sec2-2、 sec2-3、 sec2-4、 sec2-5、 sec2-6、 sec2-7、 sec2-8、 sec2-9、 sec2-10、 sec2-ll、 sec2-12、 sec2-13或sec2-14分別克隆入表達(dá)載體pET-28a，以大腸桿菌 BL21(DE3)為宿主菌，構(gòu)建成異源表達(dá)超抗原活性基因工程肽的基因工程菌，在培養(yǎng)基中異源表達(dá)有超抗原活性的SEC2-l、SEC2-2、SEC2-3、SEC2-4、 SEC2隱5、 SEC2-6、 SEC2-7、 SEC2-8、 SEC2-9、 SEC2-10、 SEC2畫11、 SEC2-12、 SEC2-13或SEC2-14基因工程肽。
所述編碼SEC2超抗原基因工程肽的核苷酸序列的克隆方法如下，
以金黃色葡萄球菌基因組DNA為模板，采用引物sec2-l-F: 5' gAATTCgAgAgTCAACCAgACCCTA 3'禾B sec2-l-R: 5' gCCTCgAgTTATTTTATgTCTAgTTC 3' 通過PCR技術(shù)擴(kuò)增出sec2-l基因片段；
以金黃色葡萄球菌基因組DNA為模板，采用引物sec2-2-F: 5' gAATTCgAgAgTCAACCAgACCCTAC 3，禾Q sec2-2-R: 5， gCTCgAgTTAgTggTTTCCTTCATg 3,通過 PCR技術(shù)擴(kuò)增出sec2-2基因片段；
以金黃色葡萄球菌基因組DNA為模板，采用引物sec2-3-F: 5' gAATTCgAgAgTCAACCAgA 3，和sec2-3-R: 5， gCCTCgAgTTATCCATACATACAAg 3'通過PCR 技術(shù)擴(kuò)增出sec2-3基因片段；
以金黃色葡萄球菌基因組DNA為模板，采用引物sec2-4-F: 5' GAATTCGAGAGTCAACCAGACCCTA 3，和sec2-4-R: 5， gCTCgAgTTATTTTgTTATTCCTCCA 3'通過 PCR技術(shù)擴(kuò)增出sec2-4基因片段；
以金黃色葡萄球菌基因組DNA為模板，采用引物sec2-5-F: 5' gAATTCggTACgATgggTAATATg 3，禾口 sec2-5-R: 5, CTCgAgTTATCCATTCTTTgTTgTAAggT 3， 通過PCR技術(shù)擴(kuò)增出sec2-5基因片段；
以金黃色葡萄球菌基因組DNA為模板，采用引物sec2-6-F: 5' gAATTCggTACgATgggTAATATg 3'禾卩sec2畫6-R: 5， CTCgAgTTATTTTgTTATTCCTCCAT 3'通過 PCR技術(shù)擴(kuò)增出sec2-6基因片段；
以金黃色葡萄球菌基因組DNA為模板，采用引物sec2-7-F: 5' gAATTCggTACgATgggTAATATg 3，和sec2畫7-R: 5， CgCTCgAgTTATCCATACATACAAg 3'通過 PCR技術(shù)擴(kuò)增出sec2-7基因片段；
以金黃色葡萄球菌基因組DNA為模板，采用引物sec2-8-F: 5' gAATTCgCAAAgAAgTACAAAgATg 3'禾口 sec2誦8-R: 5， CgCTCgAgTTATTTTATgTCTAgTTC 3'通過 PCR技術(shù)擴(kuò)增出sec2-8基因片段；
以金黃色葡萄球菌基因組DNA為模板，采用引物sec2-9-F: 5， ggAATTCgAgAgTCAACCAgACCCTA 3'禾口 sec2-9-R: 5， CgCTCgAgTTATCCATACACATCAAC 3，通 過PCR技術(shù)擴(kuò)增出sec2-9基因片段；
以金黃色葡萄球菌基因組DNA為模板，采用引物sec2-10-F: 5， gAATTCgAgAgTCAACCAgAC 3,禾卩sec2-10-R: 5， CgCTCgAgTTAATCTTTgTACTTC 3'通過PCR 技術(shù)擴(kuò)增出sec2-10基因片段；
以金黃色葡萄球菌基因組DNA為模板，采用引物sec2-ll-F: 5' gAATTCgAgAgTCAACCAgACCCTA 3'禾n sec2扁ll-R: 5， CCCgCTCgAgTTAGTTTACATAgTAAT 3， 通過PCR技術(shù)擴(kuò)增出sec2-11基因片段；
以金黃色葡萄球菌基因組DNA為模板，采用引物sec2-12-F: 5，gAATTCAAATCAAgTgAgTTTACTg 3'禾B sec2-12-R: 5， CgCTCgAgTTAgTTTACATAgTAAT 3，通過 PCR技術(shù)擴(kuò)增出sec2-12基因片段；
以金黃色葡萄球菌基因組DNA為模板，采用引物sec2-13-F: 5' gAATTCggTACgATgggTAATAT 3，禾卩sec2-13-R: 5， CCgCTCgAgTTAgTTTACATAgTAA 3'通過 PCR技術(shù)擴(kuò)增出sec2-13基因片段；
或，以金黃色葡萄球菌基因組DNA為模板，采用引物sec2-14-F: 5， gAATTCgAgAgTCAACCAgACCCTA 3，禾卩sec2-14-R: 5， CgCTCgAgTTATAATAACTCTgTTTTCAC 3， 通過PCR技術(shù)擴(kuò)增出sec2-14基因片段。
本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)
1. 本發(fā)明為人工構(gòu)建的一系列編碼超抗原基因工程肽的核苷酸序列，首 次獲知其基因全序列的組成。
2. 本發(fā)明利用PCR技術(shù)，克隆一系列編碼超抗原基因工程肽的核苷酸 基因，并在大腸桿菌中表達(dá)，表達(dá)的一系列超抗原基因工程肽經(jīng)檢驗(yàn)具有 超抗原的生物學(xué)活性；應(yīng)用本發(fā)明，可提供直接用于生產(chǎn)該一系列超抗原 基因工程肽的基因工程菌株。
3. 本發(fā)明基因的異源表達(dá)提供了制備超抗原抗腫瘤生物制劑的一種新 方法，具有產(chǎn)量高，生產(chǎn)穩(wěn)定，方便純化的特點(diǎn)。
圖l為sec2-l、 sec2-2、 sec2-3、 sec2-4、 sec2-5和sec2-6基因的PCR擴(kuò) 增瓊脂糖凝膠電泳圖，其中1為DL2000DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，2-7為sec2-l、 sec2-2、 sec2-3、 sec2-4、 sec2-5和sec2-6基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；
圖2為sec2-7、 sec2-8、 sec2-9、 sec2-10、 sec2-11、 sec2-12、 sec2-13和 sec2-14基因的PCR擴(kuò)增瓊脂糖凝膠電泳圖，其中1為DL2000 DNA分子 量標(biāo)準(zhǔn)，2-9為ssec2-7、 sec2-8、 sec2-9、 sec2-10、 sec2-11、 sec2-12、 sec2-13 和sec2-14基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；
圖3為超抗原基因工程肽SEC2-1、 SEC2-2、 SEC2-3、 SEC2-4、 SEC2-5、 SEC2-6、 SEC2畫7、 SEC2-8、 SEC2-9、 SEC2-10、 SEC2-11、 SEC2-12、 SEC2-13 和SEC2-14的超抗原活性檢測實(shí)驗(yàn)(外周血單個核細(xì)胞PBMC增殖實(shí)驗(yàn)) 結(jié)果圖。橫坐標(biāo)為陰性對照牛血清白蛋白(BSA)、系列超抗原基因工程肽 和陽性對照腸毒素C2;縱坐標(biāo)為酶標(biāo)儀在OD570nm下的讀數(shù)值。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例l (1)
(A)超抗原基因工程肽SEC2-1，具有序列表SEQ ID NO: 2中的氨 基酸系列
esqpdptpdelhksseftgtmgnmkylyddhyvsatkvmsvdkfla hdllynlsdkklknydkvktellnedlakkykdevvdvygsnyyvn cyfsskdnvgkvtggktcmyggltkhegnhfdngnlqnvllrvyen krntlsfevqtdkksvtaqeldlkSEQIDNO.2的信息(參見序列表)
(a) 序列特征
*長度162個氨基酸
*類型肽鏈 *鏈型單鏈
*結(jié)構(gòu)二級結(jié)構(gòu)由4個完整的a螺旋和8個(3折疊構(gòu)成。其中 氨基酸殘基7-11， 13-17， 21-29， 70-78，分別形成四個完整的a螺旋結(jié)構(gòu)； 氨基酸殘基32-39， 47-53， 62-68， 81-87， 108-118分別形成四個(3折疊結(jié)構(gòu)， 129-154位氨基酸殘基形成三個財(cái)斤疊。除了7-11， 13-17位兩個a螺旋及殘 基129-154形成的三個財(cái)斤疊外，其他a螺旋和P折疊在三維結(jié)構(gòu)中形成一個 獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域，構(gòu)成一個"P-桶"狀結(jié)構(gòu)，而118位和122位組氨酸殘基形 成兩個Zn原子結(jié)合位點(diǎn)。
(b) 分子類型成熟肽鏈
(c) 假設(shè)否
(d) 反義否
(e) 最初來源金黃色葡萄球菌y/ococ譜awr衝) 編碼SEC2-1的基因sec2-l，具有序列表SEQ ID NO: 1中核苷酸序列。
AAAA
SEQIDNO.l的信息(參見序列表) (a)序列特征
*長度486堿基對
*鏈型雙鏈 *拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性 (b)分子類型cDNA
c A
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A A
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A A
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A A(C)假設(shè)否
(d) 反義否
(e) 最初來源金黃色葡萄球菌(5"啤/7y/ococ固a匿i/s)
(B)超抗原基因工程肽SEC2-2，具有序列表SEQ ID NO: 4中的氨
長度
esqpdptpdelhksseftgtmgnmkylyddhyvsatkvmsvdkfla hdliynlsdkklknydkvktellnedlakkykdevvdvygsnyyvn cyfsskdnvgkvtggktcmyggltkhegnh SEQIDN0.4的信息(參見序列表)
(a) 序列特征
122個氨基酸 肽鏈 單鏈
*結(jié)構(gòu)二級結(jié)構(gòu)由4個完整的ot螺旋和5個財(cái)斤疊構(gòu)成。其中 氨基酸殘基7-11， 13-17， 21-29， 70-78，分別形成四個完整的ot螺旋結(jié)構(gòu)； 氨基酸殘基32-39， 47-53， 62-68， 81-87， 108-118分別形成四個P折疊結(jié)構(gòu)。 除了7-11， 13-17位兩個oc螺旋外，其他a螺旋和(3折疊在三維結(jié)構(gòu)中形成一 個獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域，構(gòu)成一個"P-桶"狀結(jié)構(gòu)，而118位和122位組氨酸殘基 形成兩個Zn原子結(jié)合位點(diǎn)。
(b) 分子類型成熟肽鏈
(c) 假設(shè)否
(d) 反義否
(e) 最初來源金黃色葡萄球菌C—y/ococcw
編碼SEC2-2的基因sec2-2，具有序列表SEQIDNO: 3中核苷酸序列。
CAAAACATGAAGGAAACCAC SEQIDN0.3的信息(參見序列表) (a)序列特征
*長度366堿基對
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G A*類型核酸
*鏈型雙鏈
*拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性 (b)分子類型CDNA (C)假設(shè)否
(d) 反義否
(e) 最初來源金黃色葡萄球菌j/ococ醋o(hù)w潔)
(C)超抗原基因工程肽SEC2-3，具有序列表SEQ ID NO: 6中的氨
長度
esqpdptpdelhksseftgtmgnmkylyddhyvsatkvmsvdkfla
hdliynlsdkklknydkvktellnedlakkykdevvdvygsnyyvn
cyfsskdnvgkvtggktcmyg
SEQIDNO.6的信息(參見序列表)
(a) 序列特征
113個氨基酸 肽鏈 單鏈
*結(jié)構(gòu)二級結(jié)構(gòu)由4個完整的oc螺旋和4個(3折疊構(gòu)成。其中 氨基酸殘基7-11， 13-17， 21-29， 70-78，分別形成四個完整的a螺旋結(jié)構(gòu)； 氨基酸殘基32-39， 47-53, 62-68， 81-87分別形成四個P折疊結(jié)構(gòu)。除了 7-11， 13-17位兩個a螺旋外，其他oi螺旋和(3折疊在三維結(jié)構(gòu)中形成一個獨(dú)立的結(jié) 構(gòu)域。
(b) 分子類型成熟肽鏈
(c) 假設(shè)否
(d) 反義否
(e) 最初來源金黃色葡萄球菌(S啤/^/ococcws
編碼SEC2-3的基因sec2-3，具有序列表SEQIDNO: 5中核苷酸序列。
TAAAACTTGTATGTATGGA SEQIDNO.5的信息(參見序列表)
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A G T(a) 序列特征*長度339堿基對*類型核酸*鏈型雙鏈*拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(b) 分子類型cDNA(C) 假設(shè)否(d) 反義否(e) 最初來源金黃色葡萄球菌(Sto/ /!y/ococ，離價)(D) 超抗原基因工程肽SEC2-4，具有序列表SEQ ID NO: 8中的氨 基酸系列esqpdptpdelhksseftgtmgnmkylyddhyvsatkvmsvdkfla hdliynlsdkklknydkvktellnedlakkykdevvdvygsnyyvn cyfsskdnvgkvtggktcmyggltk SEQIDNO.8的信息(參見序列表)(a) 序列特征*長度117個氨基酸*類型肽鏈 *鏈型單鏈*結(jié)構(gòu)二級結(jié)構(gòu)由4個完整的OC螺旋和5個P折疊構(gòu)成。其中氨基酸殘基7-11， 13-17， 21-29， 70-78，分別形成四個完整的a螺旋結(jié)構(gòu)； 氨基酸殘基32-39， 47-53， 62-68， 81-87， 108-117分別形成五個財(cái)斤疊結(jié)構(gòu)。 除了7-11， 13-17位兩個a螺旋外，其他a螺旋和P折疊在三維結(jié)構(gòu)中形成一 個獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域。(b) 分子類型成熟肽鏈(c) 假設(shè)否(d) 反義否(e) 最初來源金黃色葡萄球菌(S鄉(xiāng)/^/ococ醒a(bǔ)匿tw0編碼SEC2-4的基因sec2-4，具有序列表SEQIDNO: 7中核苷酸序列。c AG AT TT GG GA GG TA GGcA Ac Tc GG Gc TA cT Ac Tc Tc TA GG AA Gc Tc GA AA Ac cT TG AA AG AA cG AGAcTATGTATTAcTAGAGATATTTATAAAGTATAcGGTTTTAAAAGAGcTGATTGAAAcAAccAAAAAATAGGATTAcAATATTAATTAGAcATTATTGAGAcAAAAGGAAAcAGTATAAAAAAG c TA A GA J ,G A AT T AA G TG T GA A GATAT 5 AAAAA……ATA1 T rATTA G TATAG T TT G cA A GATTA C A A AASEQIDNO.7的信息(參見序列表)(a) 序列特征*長度351堿基對 *類型核酸*鏈型雙鏈*拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(b) 分子類型cDNA (C)假設(shè)否(d) 反義否(e) 最初來源金黃色葡萄球菌—coc固aw固s)(E)超抗原基因工程肽SEC2-5，具有序列表SEQIDNO: 10中的氨 基酸系列g(shù)tmgnmkylyddhyvsatkvmsvdkflahdliynlsdkklknydk vktellnedlakkykdevvdvygsnyyvncyfsskdnvgkvtggkt cmyggltkhegnhfdngnlqnvllrvyenkrntlsfevqtdkksvta qeldlkarnfllnkknlyefnsspyetgylkflenngntfwydmmp apgdkfdqskylmmyndnktvdsksvklevhlttkng SEQIDNO.10的信息(參見序列表) (a)序列特征*長度221個氨基酸*類型肽鏈承鏈型* 單鏈*結(jié)^: 二級結(jié)構(gòu)由4個完整的a螺旋和12個P折疊構(gòu)成。其中 氨基酸殘基3-11， 52-60， 138-154， 190-202分別形成四個完整的a螺旋結(jié) 構(gòu)；氨基酸殘基14-21， 29-35， 44-50， 63-69， 90-110,111畫136,162-182，及 204-207， 210-219分別形成12個(3折疊結(jié)構(gòu)。其中138-154位形成的a螺旋 和111 -136， 162-182,及204-207，210-219形成的七個財(cái)斤疊，以及3-11 ， 52-60， 190-202形成的三個a螺旋和14-21， 29-35， 44-50， 63-69， 90-100所形成的 財(cái)斤疊在三維結(jié)構(gòu)中分別形成兩個獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域。而100位和104位組氨酸 殘基形成兩個Zn原子結(jié)合位點(diǎn)。(b) 分子類型成熟肽鏈(c) 假設(shè)否(d) 反義否(e) 最初來源金黃色葡萄球菌(Stop/7y/ococ譜a匿M;s)編碼SEC2-5的基因sec2-5,具有序列表SEQIDNO: 9中核苷酸序列,AGAATGGASEQIDN0.9的信息(參見序列表)(a) 序列特征*長度663堿基對*類型核酸*鏈型雙鏈*拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(b) 分子類型cDNA (C)假設(shè)否(d) 反義否(e) 最初來源金黃色葡萄球菌(S啤/zy/ococ譜離潔)(F)超抗原基因工程肽SEC2-6，具有序列表SEQIDNO: 12中的氨gtmgnmkylyddhyvsatkvmsvdkflahdllynlsdkklknydk vktellnedlakkykdevvdvygsnyyvncyfsskdnvgkvtggkt cmyggltkSEQIDNO.12的信息(參見序列表)(a)序列特征*長度99個氨基酸*類型肽鏈TAcT JMCAV 了MCA2 了 了S G AA A TASAr A ziceA2 Ac A TG T TT G TATTGATc T AATAT A AG c TG T AAGTGAAAcAGTATAAAAAATcAAAAAATAGTGAAAGAAAcGATTTAGAAGAAATATGAGAcAAAAcTAGGAGGAGTGAGAAGAGAAAcATGAGAAAccTAcTTTTTATcGcAAATGAcATTAATGTTcAAAATGGTGGAcATTGAAATGGATGTAATccAAAGGAAGTAcAAAAcAAAAGGAGGTATGAAATcATGTAAAAcATTcAAGGGTAATAGTTTcATTcTTAAccAAAGAAAATAAAAGATTGAGAcGAcAATGGAAAAGAATAGcAAAcGTGAAGTAATTTTAAGGAcGAAAATAcAGAcAAGAAcAcTGAcAATTGAGAGTTTAAAAAAAAAATTAAAGTATTTAAAATATATAGGAcAAAGAAccccGAGTAAGAGGTTTTcAAAcGGcAATATT TcTTAGTTTATAAAc G TT G cA c cAAAccAGTTGGGAccAAcAAcATAAATAAcAccTGAAGAA G TA c ATAGAAA AGTGGAG cc ATGTAATAc A AG A A*結(jié)構(gòu)二級結(jié)構(gòu)由2個完整的OC螺旋和5個P折疊構(gòu)成。其中氨基酸殘基3-11 ， 52-60，分別形成兩個完整的oc螺旋結(jié)構(gòu);氨基酸殘基14-21 ， 29-35， 44-50， 63-69， 90-99分別形成五個p折疊結(jié)構(gòu)。所有a螺旋和P折疊 在三維結(jié)構(gòu)中形成一個獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域，形成一個"(3-桶"狀結(jié)構(gòu)。 (b)分子類型成熟肽鏈(C)假設(shè)否(d) 反義否(e) 最初來源金黃色葡萄球菌(Stop/^fococcw編碼SEC2-6的基因sec2-6，具有序列表SEQ ID NO: 11中核苷酸序列。ATGTATGGAGGAATAACAAAA SEQIDNO.ll的信息(參見序列表)(a) 序列特征*長度297堿基對*類型核酸*鏈型雙鏈*拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(b) 分子類型cDNA (C)假設(shè)否(d) 反義否(e) 最初來源金黃色葡萄球菌j/ococ循(G)超抗原基因工程肽SEC2-7，具有序列表SEQIDNO: 14中的氨gtmgnmkylyddhyvsatkvmsvdkflahdliynlsdkklknydk vktellnedlakkykdevvdvygsnyyvncyfsskdnvgkvtggkt cmy gSEQIDNO.14的信息(參見序列表) (a)序列特征*長度95個氨基酸*類型肽鏈AGTAGAATTTATAAAGAAATGGGTAGcAGGGATGTcTGATTGAAATcAAcGAcAGTATAcTTTAcAAATTTAATTTAGTAccGGTTTTTAAATAAGGAAAcAGTATAAAAAATcAAAAAATAGTGAAAGAAAcGATTTAGAAGAAATTATGAGAcAAAAcTAGGATGTGTAGTTGATGAAGAGAAAcATGAGAATGTTA cc Ac ATAcTTTAATGGTTGAGT Ac cG AT Tc TA GA AA AT AG TT GA G丁 Ac TA GT TT AA AA T*鏈型單鏈
*結(jié)構(gòu)二級結(jié)構(gòu)由2個完整的Ot螺旋和4個(3折疊構(gòu)成。其中
氨基酸殘基3-11， 52-60，分別形成兩個完整的ot螺旋結(jié)構(gòu);氨基酸殘基14-21 ， 29-35， 44-50， 63-69分別形成四個P折疊結(jié)構(gòu)。兩個ot螺旋和四個p折疊在 三維結(jié)構(gòu)中形成一個獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域。 (b)分子類型成熟肽鏈
(C)假設(shè)否
(d) 反義否
(e) 最初來源金黃色葡萄球菌(5*/—y/ococ面a"固s)
編碼SEC2-7的基因sec2-7，具有序列表SEQ ID NO: 13中核苷酸序列。
ATGTATGGA
SEQIDNO,13的信息(參見序列表) (a)序列特征
*長度285堿基對
*鏈型雙鏈 *拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性 (b)分子類型cDNA
(C)假設(shè)否
(d) 反義否
(e) 最初來源金黃色葡萄球菌(Stop/^/ococc^
(H)超抗原基因工程肽SEC2-8，具有序列表SEQIDNO: 16中的氨 基酸系列
akkykdevvdvygsnyyvncyfsskdnvgkvtggktcmyggltkh egnhfdngnlqnvllrvyenkrntlsfevqtdkksvtaqeldlk SEQIDNO.16的信息(參見序列表) (a)序列特征
*長度89個氨基酸 *類型肽鏈 *鏈型單鏈
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T*結(jié)構(gòu)二級結(jié)構(gòu)由2個oc螺旋和5個P折疊構(gòu)成。其中氨基酸 殘基l-5， 83-89分別形成兩個oc螺旋結(jié)構(gòu)；氨基酸殘基8-14， 35-45， 56-64， 66-77， 79-81分別形成五個(3折疊結(jié)構(gòu)。兩個a螺旋和五個P折疊在三維結(jié)構(gòu) 中形成一個獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域。而45位和49位組氨酸殘基形成兩個Zn原子結(jié) 合位點(diǎn)。
(b) 分子類型成熟肽鏈
(c) 假設(shè)否
(d) 反義否
(e) 最初來源金黃色葡萄球菌(5to/ /^/ococcM^ )
編碼SEC2-8的基因sec2-8，具有序列表SEQ ID NO: 15中核苷酸序列,
SEQIDN0.15的信息(參見序列表) (a)序列特征
*長度267堿基對
*鏈型雙鏈 *拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性 (b)分子類型cDNA
(C)假設(shè)否
(d) 反義否
(e) 最初來源金黃色葡萄球菌(S鄉(xiāng)/zy/ococcus m/腦s)
(I)超抗原基因工程肽SEC2-9，具有序列表SEQ ID NO: 18中的氨 基酸系列
esqpdptpdelhksseftgtmgnmkylyddhyvsatkvmsvdkfla hdllynlsdkklknydkvktellnedlakkykdevvdvyg SEQ ID NO. 18的信息(參見序列表) (a)序列特征
86個氨基酸 肽鏈 單鏈
17
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度型型
長類鏈*結(jié)構(gòu)二級結(jié)構(gòu)由4個完整的oc螺旋和4個P折疊構(gòu)成。其中 氨基酸殘基7-11， 13-17， 21-29， 70-78，分別形成四個完整的a螺旋結(jié)構(gòu)； 氨基酸殘基32-39， 47-53， 62-68， 81-86分別形成四個P折疊結(jié)構(gòu)。除7-11， 13-17形成的兩個a螺旋外，其他兩個a螺旋和四個P折疊在三維結(jié)構(gòu)中形成 一個獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域。
(b) 分子類型成熟肽鏈
(c) 假設(shè)否
(d) 反義否 #
(e) 最初來源金黃色葡萄球菌(iS鄉(xiāng)/^/ococcM51 awwMS)
(J)超抗原基因工程肽SEC2-10，具有序列表SEQIDNO: 20中的氨
基酸系列
esqpdptpdelhksseftgtmgnmkylyddhyvsatkvmsvdkfla hdliynlsdkklknydkvktellnedlakkykd SEQIDNO.20的信息(參見序列表) (a)序列特征
*長度79個氨基酸
*類型肽鏈 *鏈型單鏈
編碼SEC2-9的基因sec2-9，具有序列表SEQ ID NO: 17中核苷酸序列,
TAGTTGATGTGTATGGA
SEQIDN0.17的信息(參見序列表)
(a) 序列特征
*長度258堿基對
*類型核酸
*鏈型雙鏈
*拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(b) 分子類型cDNA
(C)假設(shè)否
(d) 反義否
(e) 最初來源金黃色葡萄球菌(Stop/7y/0c0c面aw腦s)
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T G*結(jié)構(gòu)二級結(jié)構(gòu)由4個完整的a螺旋和3個財(cái)斤疊構(gòu)成。其中 氨基酸殘基7-11， 13-17， 21-29， 70-78，分別形成四個完整的a螺旋結(jié)構(gòu)； 氨基酸殘基32-39， 47-53， 62-68，分別形成三個卩折疊結(jié)構(gòu)。除7-11， 13-17
形成的兩個a螺旋外，其他兩個a螺旋和四個p折疊在三維結(jié)構(gòu)中形成一個獨(dú) 立的結(jié)構(gòu)域。
(b) 分子類型成熟肽鏈
(c) 假設(shè)否
(d) 反義否
(e )最初來源金黃色葡萄球菌(S啤/^/ococcM ) 編碼SEC2-10的基因sec2-10,具有序列表SEQ ID NO: 19中核苷酸序
SEQIDN0.19的信息(參見序列表)
(a) 序列特征
*長度237堿基對
*類型核酸 *鏈型雙鏈 *拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(b) 分子類型cDNA
(C)假設(shè)否
(d) 反義否
(e) 最初來源金黃色葡萄球菌(S鄉(xiāng)/^/ococcws
(K)超抗原基因工程肽SEC2-11，具有序列表SEQ ID NO: 22中的
esqpdptpdelhksseftgtmgnmkylyddhyvsatkvmsvdkfla hdliynlsdkklknydkvktellnedlakkykdevvdvygsnyyvn SEQIDN0.22的信息(參見序列表) (a)序列特征
*長度92個氨基酸 *類型肽鏈
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A A
A A*鏈型單鏈
*結(jié)構(gòu)二級結(jié)構(gòu)由4個完整的a螺旋和4個財(cái)斤疊構(gòu)成。其中 氨基酸殘基7-11， 13-17， 21-29， 70-78，分別形成四個完整的ot螺旋結(jié)構(gòu)； 氨基酸殘基32-39， 47-53， 62-68， 81-86分別形成四個P折疊結(jié)構(gòu)。除7-11， 13-17形成的兩個oc螺旋外，其他兩個ot螺旋和四個財(cái)斤疊在三維結(jié)構(gòu)中形成 一個獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域。
(b)分子類型成熟肽鏈
(C)假設(shè)否
(d) 反義否
(e) 最初來源金黃色葡萄球菌(S鄉(xiāng)/zy/ococcw aw艦s) 編碼SEC2-11的基因sec2-11,具有序列表SEQ ID NO: 21中核苷酸序
SEQIDN0.21的信息(參見序列表) (a)序列特征
*長度276堿基對
*鏈型雙鏈
*拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(b)分子類型cDNA
(C)假設(shè)否
(d) 反義否
(e) 最初來源金黃色葡萄球菌(S鄉(xiāng)/2—coc面aw腦s)
(L)超抗原基因工程肽SEC2-12，具有序列表SEQ ID NO: 24中的
ksseftgtmgnmkylyddhyvsatkvmsvdkflahdliynlsdkkl knydkvktellnedlakkykdevvdvygsnyyvn
SEQIDN0.24的信息(參見序列表)
(a)序列特征
*長度80個氨基酸
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A A T*類型肽鏈 *鏈型單鏈
*結(jié)構(gòu)二級結(jié)構(gòu)由3個完整的OC螺旋和4個財(cái)斤疊構(gòu)成。其中
氨基酸殘基l-5， 9-17， 58-66，分別形成三個完整的oc螺旋結(jié)構(gòu)；氨基酸殘 基20-27， 35-41， 50-56， 69-74分別形成四個(3折疊結(jié)構(gòu)。除1-5形成的一 個a螺旋外，其他兩個a螺旋和四個財(cái)斤疊在三維結(jié)構(gòu)中形成一個獨(dú)立的結(jié)構(gòu) 域。
(b)分子類型成熟肽鏈 (C)假設(shè)否
(d) 反義否
(e) 最初來源金黃色葡萄球菌dp/^/ococ譜
編碼SEC2-12的基因sec2-12,具有序列表SEQIDNO: 23中核苷酸序列。
SEQIDNO.23的信息(參見序列表)
(a) 序列特征
*長度240堿基對
*類型核酸
*鏈型雙鏈
*拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(b) 分子類型cDNA
(C)假設(shè)否
(d) 反義否
(e) 最初來源金黃色葡萄球菌(S鄉(xiāng)/^/ococ信做固s)
(M)超抗原基因工程肽SEC2-13，具有序列表SEQ ID NO: 26中的 氨基酸系列
gtmgnmkylyddhyvsatkvmsvdkflahdliynlsdk. klknydk vktellnedlakkykdevvdvygsnyyvn
SEQIDNO.26的信息(參見序列表)
(a)序列特征
*長度74個氨基酸
21*類型肽鏈 *鏈型單鏈
*結(jié)構(gòu)二級結(jié)構(gòu)由2個完整的Ot螺旋和4個(3折疊構(gòu)成。其中
氨基酸殘基3-ll，70-78，分別形成四個完整的a螺旋結(jié)構(gòu);氨基酸殘基14-21， 29-35， 44-50， 63-68分別形成四個P折疊結(jié)構(gòu)。兩個a螺旋和四個P折疊在 三維結(jié)構(gòu)中形成一個獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域。 (b)分子類型成熟肽鏈
(c)假設(shè)否
(d) 反義否
(e) 最初來源金黃色葡萄球菌(5y—_y/ococ， gm固s)
編碼SEC2-13的基因sec2-13,具有序列表SEQIDNO: 25中核苷酸序列。
AATTACTATGTAAAC
SEQIDNO.25的信息(參見序列表)
(a) 序列特征
*長度222堿基對
*類型核酸
*鏈型雙鏈
*拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(b) 分子類型cDNA
(c)假設(shè)否
(d) 反義否
(e) 最初來源金黃色葡萄球菌(5y—y/ococ固(W衝)
(N)超抗原基因工程肽SEC2-14，具有序列表SEQ ID NO: 28中的 氨基酸系列
esqpdptpdelhksseftgtmgnmkylyddhyvsatkvmsvdkfla hdllynlsdkklknydkvktell
SEQIDNO.28的信息(參見序列表) (a)序列特征
*長度69個氨基酸 *類型肽鏈
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22承鏈型* 單鏈
*結(jié)構(gòu)二級結(jié)構(gòu)由3個完整的OC螺旋和3個財(cái)斤疊構(gòu)成。其中
氨基酸殘基7-11， 13-17， 21-29分別形成四個完整的a螺旋結(jié)構(gòu)；氨基酸殘 基32-39， 47-53， 62-68分別形成三個財(cái)斤疊結(jié)構(gòu)。除7-11， 13-17形成的兩 個a螺旋外，其他一個oc螺旋和三個P折疊在三維結(jié)構(gòu)中形成一個獨(dú)立的結(jié)構(gòu) 域。
(b)分子類型成熟肽鏈
(C)假設(shè)否
(d) 反義否
(e) 最初來源金黃色葡萄球菌(5y—y/ococ， awr潔)
編碼SEC2-14的基因sec2-14,具有序列表SEQIDNO: 27中核苷酸序列。
AAGTGAAAACAGAGTTATTA SEQIDN0.27的信息(參見序列表) (a)序列特征
*長度207堿基對
*鏈型雙鏈
*—拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性 (b)分子類型cDNA (C)假設(shè)否
(d) 反義否
(e) 最初來源金黃色葡萄球菌(5"啤/^/ococ，
(2)編碼超抗原基因工程肽的全基因sec2-l、 sec2-2、 sec2-3、 sec2-4、 sec2-5、 sec2-6、 sec2-7、 sec2-8、 sec2-9、 sec2-10、 sec2-11、 sec2-12、 sec2-13 和sec2-14的PCR擴(kuò)增
1) 金黃色葡萄球菌基因組DNA的提取
接種金黃色葡萄球菌單菌落于5ml液體LB培養(yǎng)基中，37。C搖床過夜培 養(yǎng)，取1.5ml的培養(yǎng)物離心收集菌體。提取金黃色葡萄球菌基因組DNA(基 因組DNA提取操作按R奧斯伯，R.布倫特，R.E.金斯頓，D.D.穆爾， J.G.塞德曼，J.A.史密斯，K.斯特拉爾《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》美國
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A A紐約John Wiley & Sons出版社1995年第三版P39-40)。
2) PCR引物設(shè)計(jì)及反應(yīng)條件
分別設(shè)計(jì)合成PCR引物用來擴(kuò)增sec2-l、sec2-2、sec2-3、sec2-4、sec2-5、 sec2-6、 sec2-7、 sec2-8、 sec2-9、 sec2-10、 sec2-ll、 sec2-12、 sec2-13和sec2-14 的基因片斷，引物序列如上述發(fā)明內(nèi)容外所述；
PCR反應(yīng)體系為10 X Pyrobest buffer 5 u 1、 dNTP250umo1、 0.02% BSA2 u 1、上下游引物各25pmol、模板金黃色葡萄球菌基因組DNA 0.1 u g、 ExTaq DNA聚合酶2U，無菌超純水補(bǔ)齊體積至50 u 1。
各基因片斷的PCR反應(yīng)條件均為
第一階段95°C， 5分鐘；
第二階段94。C， 30秒；55°C， 30秒；72°C， 60秒(除secl-5片斷， secl-5片斷采用90秒)；共30個循環(huán)； 第三階段72匸，10分鐘;
3) SEC2基因的鑒定各片斷PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳 分析并分離(參見附圖1、 2所示)，切下相應(yīng)大小的目的帶，按杭州維特 潔生化技術(shù)有限公司膠回收試劑盒使用說明書進(jìn)行膠回收；回收產(chǎn)物分別 與pGEM-T克隆載體連接，構(gòu)建成一系列超抗原基因工程肽的基因克隆載 體pGEM-T-sec2畫l 、 pGEM-T-sec2-2 、 pGEM-T隱sec2-3 、 pGEM-T-sec2畫4 、 pGEM-T畫sec2隱5 、 pGEM-T-sec2-6 、 pGEM-T-sec2畫7 、 pGEM隱T誦sec2-8 、 pGEM-T-sec2畫9 、 pGEM-T畫sec2-10 、 pGEM-T-sec2-11 、 pGEM-T-sec2-12 、 pGEM-T-sec2-13和pGEM-T-sec2-14 。連接反應(yīng)按Promega公司產(chǎn)品pGEM-T 試劑盒使用說明書。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，(轉(zhuǎn)化操作 按R奧斯伯，R.布倫特，R.E.金斯頓，D.D.穆爾，J.G.塞德曼，J.A.史 密斯，K.斯特拉爾《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》美國紐約John Wiley & Sons 出版社1995年第三版P39-40),篩選陽性克隆并以Sanger雙脫氧末端終止 法測定DNA序列。
實(shí)施例2
超抗原基因工程肽的表達(dá)
1)超抗原基因工程肽表達(dá)載體的構(gòu)建分別將基因克隆載體 pGEM-T-sec2-l 、 pGEM-T-sec2-2 、 pGEM-T隱sec2國3 、 pGEM-T-sec2-4 、 pGEM-T-sec2-5 、 pGEM-T-sec2-6 、 pGEM-T-sec2-7 、 pGEM-T-sec2-8 、 pGEM-T-sec2-9 、 pGEM畫T畫sec2-10 、 pGEM誦T畫sec2-11 、 pGEM畫T-sec2-12 、 pGEM-T-sec2-13和pGEM-T-sec2-14 k粒DNA以五coR7、為o/雙酶切，膠 回收試劑盒回收相應(yīng)的超抗原基因工程肽的基因片段。以T4 DNA連接酶 分別連接入經(jīng)同樣雙酶切的pET-28a表達(dá)載體，構(gòu)建成表達(dá)載體pET-28a-sec2-l、 pET-28a-sec2-2、 pET-28a-sec2-3、 pET-28a-sec2-4、 pET-28a-sec2-5、 pET-28a-sec2-6 、 pET-28a-sec2-7 、 pET-28a-sec2-8 、 pET-28a-sec2-9 、 pET-28a-sec2-10、 pET-28a隱sec2-11 、 pET隱28a-sec2-12 、 pET-28a-sec2-13和
24pET-28a-sec2-14。轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)Sanger雙脫氧末端 終止法測序鑒定正確重組克隆。
2)超抗原基因工程肽的誘導(dǎo)表達(dá)和純化分別接種轉(zhuǎn)化了各表達(dá)載體
質(zhì)粒的BL21(DE3)單菌落于含40 pg/ml卡那霉素的液體LB培養(yǎng)基中，過 夜活化培養(yǎng)，以r"接種量轉(zhuǎn)接下一級，37。C搖床培養(yǎng)至OD,為0.6，加 入終濃度l.Ommol/L的IPTG， 30。C誘導(dǎo)表達(dá)6小時。
分別離心收集菌體，重懸于1/5體積的平衡緩沖液(20mM Tirs-HC1， 0. 5M NaCl， 20mM imidazole, pH7. 9)，以0. 5ml/min速度上樣 于預(yù)先平衡好的Ni親和層析柱；以含50mM imidazole的平衡緩沖液洗滌 10個柱體積，洗去非特異性結(jié)合的雜蛋白；最后以洗脫緩沖液(20mM Tirs-HCl， 0. 5M NaCl， 200mM imidazole, pH7.9)洗脫下目的產(chǎn)物既各超 抗原基因工程肽SEC2-1、 SEC2-2、 SEC2-3、 SEC2-4、 SEC2-5、 SEC2-6、 SEC2-7、 SEC2-8、 SEC2-9、 SEC2-10、 SEC2-11、 SEC2-12、 SEC2-13和 SEC2-14。
洗脫產(chǎn)物經(jīng)透析法除鹽濃縮。
實(shí)施例3
超抗原基因工程肽的超抗原活性
取正常新鮮人外周血抗凝后，密度梯度離心法分離外周血單個核細(xì)胞。 用含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度，以1 X 105cells/well 加到96孔板中，分別將經(jīng)純化的各超抗原基因工程肽SEC2-1、 SEC2-2、 SEC2畫3、 SEC2-4、 SEC2-5、 SEC2-6、 SEC2-7、 SEC2-8、 SEC2隱9、 SEC2-10、 SEC2-11、 SEC2-12、 SEC2-13和SEC2-14終濃度50ng/ml加入各孔，以BSA 作為陰性對照，SEC2標(biāo)準(zhǔn)品作為陽性對照，每樣3個復(fù)孔。按常規(guī)條件培 養(yǎng)96h，加入50ul/we11的MTT液。繼續(xù)培養(yǎng)4h， 1000r/min離心收集細(xì)胞， 加入DMSO120ul/we11，溶解15min后，酶標(biāo)儀上以570nm測定各孔的吸光 值(參見附圖3所示，超抗原基因工程肽剌激外周血單個核細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn))。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，微量的本發(fā)明中的超抗原基因工程肽即可有效的剌激 人外周血單個核細(xì)胞(PBMC)產(chǎn)生增殖。其刺激能力與SEC2標(biāo)準(zhǔn)品相比 未有較顯著降低。其中SEC2-1、 SEC2-4、 SEC2-5和SEC2-8因未破壞超抗 原主要功能區(qū)且分子量較SEC2有所減小，等同質(zhì)量濃度下顯示出與SEC2 標(biāo)準(zhǔn)品相當(dāng)?shù)腜BMC刺激增殖能力。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明本發(fā)明中的一系列超 抗原基因工程肽都具有一定的超抗原生物活性，其強(qiáng)大的體外刺激PBMC 增殖能力顯示出利用本發(fā)明中的系列超抗原基因工程肽作為新型抗腫瘤生 物制劑，具有巨大的開發(fā)潛力。
2權(quán)利要求
1.SEC2超抗原基因工程肽，其特征在于分別為下列任意氨基酸序列之一，SEC2-1具有序列表SEQ ID NO2中氨基酸序列；SEC2-2具有序列表SEQ ID NO4中氨基酸序列；SEC2-3具有序列表SEQ ID NO6中氨基酸序列；SEC2-4具有序列表SEQ ID NO8中氨基酸序列；SEC2-5具有序列表SEQ ID NO10中氨基酸序列；SEC2-6具有序列表SEQ ID NO12中氨基酸序列；SEC2-7具有序列表SEQ ID NO14中氨基酸序列；SEC2-8具有序列表SEQ ID NO16中氨基酸序列；SEC2-9具有序列表SEQ ID NO18中氨基酸序列；SEC2-10具有序列表SEQ ID NO20中氨基酸序列；SEC2-11具有序列表SEQ ID NO22中氨基酸序列；SEC2-12具有序列表SEQ ID NO24中氨基酸序列；SEC2-13具有序列表SEQ ID NO26中氨基酸序列；或SEC2-14具有序列表SEQ ID NO28中氨基酸序列。
2. —種權(quán)利要求l所述基因工程肽的編碼基因，其特征在于分別對 應(yīng)于下列核苷酸序列之一，SEC2--l對應(yīng)的基因具有序列表seqidno:1中堿基序列；SEC2--2對應(yīng)的基因具有序列表seqidno:3中堿基序列；SEC2--3對應(yīng)的基因具有序列表seqidno:5中堿基序列；SEC2.-4對應(yīng)的基因具有序列表seqidno:7中堿基序列；SEC2--5對應(yīng)的基因具有序列表seqidno:9中堿基序列；SEC2--6對應(yīng)的基因具有序列表seqidno:11中堿基序列;SEC2.-7對應(yīng)的基因具有序列表seqidno:13中堿基序列;SEC2--8對應(yīng)的基因具有序列表seqidno:15中堿基序列;SEC2--9對應(yīng)的基因具有序列表seqidno:17中堿基序列;SEC2-10對應(yīng)的基因具有序列表seq id no: 19中堿基序列； SEC2-11對應(yīng)的基因具有序列表seq id no: 21中堿基序列； SEC2-12對應(yīng)的基因具有序列表seq id no: 23中堿基序列； SEC2-13對應(yīng)的基因具有序列表seq id no: 25中堿基序列； 或SEC2-14對應(yīng)的基因具有序列表seq id no: 27中堿基序列。
3. —種權(quán)利要求1所述SEC2超抗原基因工程肽的異源表達(dá)方法，其 特征在于將編碼這一系列SEC2超抗原基因工程肽的核苷酸序列sec2-l、sec2-2、 sec2-3、 sec2-4、 sec2-5、 sec2-6、 sec2-7、 sec2-8、 sec2-9、 sec2-、10、 sec2-ll、sec2-12、sec2-13或sec2-14分別克隆入表達(dá)載體pET-28a，以大腸桿菌BL21 為宿主菌，構(gòu)建成異源表達(dá)超抗原活性基因工程肽的基因工程菌，在培養(yǎng) 基中異源表達(dá)有超抗原活性的SEC2-1、 SEC2-2、 SEC2-3、 SEC2-4、 SEC2-5、 SEC2-6、 SEC2-7、 SEC2-8、 SEC2-9、 SEC2-10、 SEC2-11、 SEC2-12、 SEC2-13或SEC2-14基因工程肽。
4.按照權(quán)利要求3所述異源表達(dá)方法，其特征在于所述編碼SEC2超抗原基因工程肽的核苷酸序列的克隆方法如下，以金黃色葡萄球菌基因組DNA為模板，采用引物sec2-l-F: 5' gAATTCgAgAgTCAACCAgACCCTA 3，禾卩sec2-l誦R: 5， gCCTCgAgTTATTTTATgTCTAgTTC 3' 通過PCR技術(shù)擴(kuò)增出sec2-l基因片段；以金黃色葡萄球菌基因組DNA為模板，采用引物sec2-2-F: 5' gAATTCgAgAgTCAACCAgACCCTAC 3，禾Q sec2-2-R: 5， gCTCgAgTTAgTggTTTCCTTCATg 3'通過 PCR技術(shù)擴(kuò)增出sec2-2基因片段；以金黃色葡萄球菌基因組DNA為模板，采用引物sec2-3-F: 5' gAATTCgAgAgTCAACCAgA 3，和sec2-3-R: 5， gCCTCgAgTTATCCATACATACAAg 3'通過PCR 技術(shù)擴(kuò)增出sec2-3基因片段；以金黃色葡萄球菌基因組DNA為模板，采用引物sec2-4-F: 5' GAATTCGAGAGTCAACCAGACCCTA 3，和sec2-4-R: 5， gCTCgAgTTATTTTgTTATTCCTCCA 3'通過 PCR技術(shù)擴(kuò)增出sec2-4基因片段；以金黃色葡萄球菌基因組DNA為模板，采用引物sec2-5-F: 5' gAATTCggTACgATgggTAATATg 3，和sec2畫5-R: 5' CTCgAgTTATCCATTCTTTgTTgTAAggT 3， 通過PCR技術(shù)擴(kuò)增出sec2-5基因片段；以金黃色葡萄球菌基因組DNA為模板，采用引物sec2-6-F: 5' gAATTCggTACgATgggTAATATg 3，禾Q sec2-6-R: 5， CTCgAgTTATTTTgTTATTCCTCCAT 3'通過 PCR技術(shù)擴(kuò)增出sec2-6基因片段；以金黃色葡萄球菌基因組DNA為模板，采用引物sec2-7-F: 5， gAATTCggTACgATgggTAATATg 3，禾卩sec2-7-R: 5， CgCTCgAgTTATCCATACATACAAg 3,通過 PCR技術(shù)擴(kuò)增出sec2-7基因片段；以金黃色葡萄球菌基因組DNA為模板，采用引物sec2-8-F: 5' gAATTCgCAAAgAAgTACAAAgATg 3,和sec2畫8-R: 5， CgCTCgAgTTATTTTATgTCTAgTTC 3'通過 PCR技術(shù)擴(kuò)增出sec2-8基因片段；以金黃色葡萄球菌基因組DNA為模板，采用引物sec2-9-F: 5， ggAATTCgAgAgTCAACCAgACCCTA 3'禾卩sec2-9隱R: 5, CgCTCgAgTTATCCATACACATCAAC 3,通 過PCR技術(shù)擴(kuò)增出sec2-9基因片段；以金黃色葡萄球菌基因組DNA為模板，采用引物sec2-10-F: 5' gAATTCgAgAgTCAACCAgAC 3，和sec2-10-R: 5, CgCTCgAgTTAATCTTTgTACTTC 3'通過PCR 技術(shù)擴(kuò)增出sec2-10基因片段；以金黃色葡萄球菌基因組DNA為模板，采用引物sec2-ll-F: 5'gAATTCgAgAgTCAACCAgACCCTA 3'禾卩sec2-ll-R: 5, CCCgCTCgAgTTAGTTTACATAgTAAT 3， 通過PCR技術(shù)擴(kuò)增出sec2-ll基因片段；以金黃色葡萄球菌基因組DNA為模板，采用引物sec2-12-F: 5' gAATTCAAATCAAgTgAgTTTACTg 3,禾卩sec2誦12-R: 5， CgCTCgAgTTAgTTTACATAgTAAT 3,通過 PCR技術(shù)擴(kuò)增出sec2-12基因片段；以金黃色葡萄球菌基因組DNA為模板，采用引物sec2-13-F: 5， gAATTCggTACgATgggTAATAT 3,禾卩sec2-13-R: 5， CCgCTCgAgTTAgTTTACATAgTAA 3,通過 PCR技術(shù)擴(kuò)增出sec2-13基因片段；或，以金黃色葡萄球菌基因組DNA為模板，采用引物sec2-14-F: 5' gAATTCgAgAgTCAACCAgACCCTA 3，禾卩sec2-14-R: 5， CgCTCgAgTTATAATAACTCTgTTTTCAC 3, 通過PCR技術(shù)擴(kuò)增出sec2-14基因片段。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因工程肽的基因克隆和異源表達(dá)，具體說是一系列具有SEC2超抗原活性的基因工程肽、及其編碼基因的制備和異源表達(dá)，SEC2-1～SEC2-14分別具有序列表SEQ ID NO2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26和SEQ ID NO28中氨基酸序列?？寺〉暮塑账嵝蛄锌稍诖竽c桿菌BL21(DE3)中表達(dá)，其表達(dá)的分別所對應(yīng)的蛋白SEC2-1～SEC2-14經(jīng)檢驗(yàn)具有超抗原的生物學(xué)活性。
文檔編號C12N15/31GK101298474SQ20071001117
公開日2008年11月5日 申請日期2007年4月30日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月30日
發(fā)明者迪 常, 張惠文, 張成剛, 徐明愷, 王小剛, 蘇振成, 艷 陳 申請人:沈陽科健生物技術(shù)有限公司