專利名稱：：一種利用中國紅豆杉細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生紫杉烷的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，具體地說是一種大幅度提高中國紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉烷的產(chǎn)量并促使其外泌，同時(shí)誘導(dǎo)新紫杉烷化合物產(chǎn)生的方法。紫杉醇作為治療晚期卵巢癌、乳腺癌的一線用藥，是迄今為止少數(shù)幾個(gè)最具抗癌活性的天然化合物之一，每年有數(shù)十億美元的銷售額，但藥源問題仍然是紫杉醇研究者們要解決的首要問題。全世界能夠生產(chǎn)紫杉醇的植物種類不多，生長(zhǎng)緩慢，紫杉醇的含量極低，即使在含量最高的樹皮中平均也只有萬分之一點(diǎn)五。而通過砍伐紅豆杉屬植物來獲取紫杉醇嚴(yán)重破壞生態(tài)平衡和生物多樣性，最終將導(dǎo)致資源枯竭。紫杉醇化學(xué)全合成雖然早已成功，但合成路線長(zhǎng)，產(chǎn)率低，成本高，不能商業(yè)化生產(chǎn)。半合成是目前臨床應(yīng)用紫杉醇的主要來源，半合成的前體為由紅豆杉枝葉中分離得到的baccatinIII(巴卡亭III)或10—deacetylbaccatinIII(10_脫乙酰基巴卡亭ni)，但依然遠(yuǎn)遠(yuǎn)滿足不了臨床及實(shí)驗(yàn)的需要。利用植物細(xì)胞培養(yǎng)方法生產(chǎn)紫杉醇因其環(huán)境友好、生產(chǎn)周期短、可控性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)日益受到人們的重視。但不產(chǎn)紫杉醇或紫杉醇產(chǎn)率低仍然是該項(xiàng)技術(shù)普遍面臨的難題。在努力拓展紫杉醇的藥源并提高紫杉醇產(chǎn)量的同時(shí)，科學(xué)家亦投身到紫杉烷類化合物的研究中，期望找到抗癌活性更好的紫杉垸類化合物或者找到合適的先導(dǎo)化合物。已經(jīng)有幾百種紫杉烷從紫杉原植物或細(xì)胞培養(yǎng)液中分離出來。云南紫杉烷Tc(TaxuyunnanineC)是一種具有類神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)活性的化合物，能夠強(qiáng)化NGF的作用，有利于老年癡呆癥(Alzheimer'sdisease)的治療。Tc與紫杉醇同屬于三環(huán)二萜類化合物。其結(jié)構(gòu)式如下
背景技術(shù)：
Tc被推測(cè)是紫杉醇生物合成途徑中的代謝中間產(chǎn)物，可以作為紫杉醇或其它有用化合物合成的前體，具有潛在的商業(yè)價(jià)值。自從在中國紅豆杉懸浮細(xì)胞培養(yǎng)體系中發(fā)現(xiàn)含量較高的TC以來，華東理工大學(xué)的鐘建江教授所在的生物反應(yīng)器國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室使用各種調(diào)控技術(shù)提高Tc的產(chǎn)量，使Tc產(chǎn)量在1升氣升式反應(yīng)器中達(dá)到612mg/L。后來他們實(shí)驗(yàn)室又與錢旭紅教授合作，使用后者合成的新誘導(dǎo)子，使得搖瓶中Tc的最高產(chǎn)量達(dá)827mg/L，反應(yīng)器中Tc的最高產(chǎn)量達(dá)738mg/L。Choietal.Tc在中國紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng)第35天獲得Tc的最高產(chǎn)量為885.9mg/L。綜觀提高Tc產(chǎn)量所使用的各種調(diào)控技術(shù)，均著眼于對(duì)Tc生物合成途徑的調(diào)控，很少關(guān)注對(duì)Tc后生物合成途徑—即Tc合成后貯存和轉(zhuǎn)運(yùn)方面的調(diào)控。這正是我們這項(xiàng)技術(shù)的發(fā)明點(diǎn)所在通過在中國紅豆杉懸浮細(xì)胞培養(yǎng)體系中添加合適的吸附劑，使Tc由胞內(nèi)被高效地吸附到胞外，從而解決高含量Tc累積在胞內(nèi)時(shí)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的傷害，對(duì)Tc進(jìn)一步生產(chǎn)的阻遏。這項(xiàng)既對(duì)Tc生物合成過程進(jìn)行調(diào)控亦對(duì)其后生物合成過程進(jìn)行調(diào)控的技術(shù)大大增加了Tc產(chǎn)量進(jìn)一步提高的空間和潛力。在中國紅豆杉懸浮培養(yǎng)體系中，通過誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)、補(bǔ)糖添加及吸附劑聯(lián)合調(diào)控來提高云南紫杉垸產(chǎn)量，還未見報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種利用中國紅豆杉(Taxiischinensis)懸浮培養(yǎng)體系，以誘導(dǎo)劑重復(fù)誘導(dǎo)、補(bǔ)糖及吸附劑添加相結(jié)合的聯(lián)合調(diào)控手段提高云南紫杉垸產(chǎn)量同時(shí)誘導(dǎo)新紫杉垸化合物產(chǎn)生的方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為將中國紅豆杉細(xì)胞置于其常用培養(yǎng)基中培養(yǎng)，細(xì)胞接種量為50200g/L濕重，在細(xì)胞指數(shù)生長(zhǎng)初期，于每升培養(yǎng)基中加入濃度為12000uM的誘導(dǎo)劑、50-200g的無菌吸附劑和1050g的糖；在細(xì)胞指數(shù)生長(zhǎng)中期，再次加入濃度為l2000uM的誘導(dǎo)劑；所述誘導(dǎo)劑為非生物誘導(dǎo)劑或真菌誘導(dǎo)子。所述非生物誘導(dǎo)劑為硝酸銀、水楊酸或茉莉酸及其衍生物，所述糖為蔗糖或葡萄糖；所述衍生物為甲基茉莉酸酮酯(MJA)、2—羥乙基茉莉酸(HEJA)、3—氟乙基茉莉酸(TFEJA)或2，3-二羥丙基茉莉酸(DHPJA)。中國紅豆杉細(xì)胞的培養(yǎng)條件為旋轉(zhuǎn)式搖床，轉(zhuǎn)速60200rpm，培養(yǎng)溫度為2030。C，暗培養(yǎng)；培養(yǎng)周期為1530天，每隔14-20天傳代一次；所述細(xì)胞指數(shù)生長(zhǎng)初期是指細(xì)胞接種于培養(yǎng)基后的第410天，即誘導(dǎo)劑的第一次添加時(shí)間；細(xì)胞指數(shù)生長(zhǎng)中期是指細(xì)胞接種于培養(yǎng)基后的第1015天，即誘導(dǎo)劑的第二次添加時(shí)間；在第一次添加誘導(dǎo)劑和第二次添加誘導(dǎo)劑的期間還可添加紫杉烷的的合成前體0.252.0克/每升培養(yǎng)基；合成前體可為醋酸鈉或苯甲酸。所述吸附劑為經(jīng)處理對(duì)紫杉烷類化合物有較強(qiáng)的吸附能力并對(duì)細(xì)胞無毒的多孔材料，如各種大孔吸附樹脂。中國紅豆杉細(xì)胞的常用培養(yǎng)基組成為，于MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加0.l1.0mg/L6—節(jié)基腺嘌呤，0.10.5mg/L2，4一二氯苯氧乙酸，0.11.0mg/L萘乙酸，20200mg/L抗壞血酸及1060g/L蔗糖，pH值為5.56.5。本發(fā)明方法原理在添加誘導(dǎo)劑和補(bǔ)糖同時(shí)添加特定種類和濃度的吸附劑能顯著提高Tc產(chǎn)量，其主要原因有以下三方面1、誘導(dǎo)劑能有效刺激植物細(xì)胞次生代謝能力，促進(jìn)紫杉垸的生物合成生產(chǎn)；2、通過補(bǔ)糖可彌補(bǔ)因細(xì)胞快速生長(zhǎng)和代謝造成的碳源不足；3、通過特定吸附劑加入使細(xì)胞壁上的紫杉垸外泌到胞外，從而解除了產(chǎn)物的反饋抑制，避免了紫杉垸存在于胞內(nèi)時(shí)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的傷害及對(duì)進(jìn)一步生產(chǎn)的阻礙，同時(shí)也避免了紫杉烷在胞內(nèi)的降解。本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)1、聯(lián)合應(yīng)用重復(fù)誘導(dǎo)、添加補(bǔ)料和吸附劑來促進(jìn)中國紅豆杉細(xì)胞云南紫杉垸Tc的生產(chǎn)，獲得的產(chǎn)量大大超出目前文獻(xiàn)報(bào)道的最高值。目前文獻(xiàn)報(bào)道的在搖瓶中培養(yǎng)中國紅豆杉細(xì)胞，其云南紫杉烷Tc的最高產(chǎn)量為827±29mg/L，而本調(diào)控手段可使Tc最高產(chǎn)量達(dá)1830.42±62.69mg/L，為文獻(xiàn)報(bào)道最高值的2.2倍。2、本發(fā)明使得云南紫杉垸Tc90%以上外泌，被吸附到吸附劑里。這就大大簡(jiǎn)化了提取分離純化的操作，降低了成本，為進(jìn)一步工業(yè)化生產(chǎn)提供了很大的可能性。3、本發(fā)明同時(shí)還得到了兩個(gè)新的紫杉院，為紫杉烷及紫杉醇生物合成途徑的研究提供了新的線索。在聯(lián)合誘導(dǎo)培養(yǎng)體系中，提取分離純化得到的兩種新紫杉烷為2—脫乙?；颇献仙价鵆和2，14-脫乙?；颇献仙纪镃。2，14-脫乙酰基云南紫杉烷C是首次發(fā)現(xiàn)的新紫杉烷化合物。4、本發(fā)明還可同前體添加等其它技術(shù)相結(jié)合，進(jìn)一步提高紫杉烷的產(chǎn)5、本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)條件可以保證細(xì)胞快速生長(zhǎng)并保證良好的均一性。圖1為實(shí)施例3第3組實(shí)驗(yàn)Tc胞內(nèi)外分配情況圖。具體實(shí)施方式以下將通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的有關(guān)內(nèi)容作進(jìn)一步說明。一種利用中國紅豆杉細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生紫杉垸的方法，包括以下步驟(1)中國紅豆杉細(xì)胞的培養(yǎng)本實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株最初由中國紅豆杉(T.Chinesis)幼莖誘導(dǎo)的愈傷組織懸浮培養(yǎng)而來，采用文獻(xiàn)公開的Murashige-Skoog(MS)培養(yǎng)基，添加0.l1.0mg/L6—節(jié)基腺嘌呤，0.10.5mg/L2，4一二氯苯氧乙酸，0.11.0mg/L萘乙酸，20200mg/L抗壞血酸及1060g/L蔗糖，pH值為5.56.5。每隔14天傳代一次，使用旋轉(zhuǎn)式搖床，轉(zhuǎn)速60200rpm,培養(yǎng)溫度為2030(2)Tc的聯(lián)合誘導(dǎo)生產(chǎn)將步驟(l)所獲得的中國紅豆杉細(xì)胞置于含上述培養(yǎng)基的搖瓶中培養(yǎng)，細(xì)胞接種量為50200g/L濕重。培養(yǎng)條件為旋轉(zhuǎn)式搖床，轉(zhuǎn)速60200rpm，培養(yǎng)溫度為203CTC，暗培養(yǎng)。培養(yǎng)周期為1530天。在搖瓶培養(yǎng)過程中利用誘導(dǎo)劑進(jìn)行誘導(dǎo)，在細(xì)胞指數(shù)生長(zhǎng)前期和中期分別進(jìn)行一次誘導(dǎo)，培養(yǎng)基中誘導(dǎo)劑添加的最終濃度為12000uM。在第一次添加誘導(dǎo)劑的同時(shí)進(jìn)行補(bǔ)糖，補(bǔ)加量為1050g/L，所加的糖為蔗糖。在第一次添加誘導(dǎo)劑的同時(shí)添加吸附劑，加入量為50g/L以上。由獲得的培養(yǎng)物分離得到細(xì)胞部分和吸附劑部分，分別提取Tc。Tc生產(chǎn)率最高可達(dá)80.67mg/(Ld)，最高產(chǎn)量可達(dá)1830.42mg/L。(3)Tc的提取和測(cè)定取100mg干細(xì)胞粉末(或250mg吸附劑)，加4mL1:1(v/v)的甲醇&二氯甲垸，室溫超聲提取3h并4000rpm離心10min，上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，蒸干后溶于4mL二氯甲烷，以lmL純凈水萃取4次，每萃取1次4000rpm離心5min，棄去水層。二氯甲烷層旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，溶于lmL色譜純甲醇，0.22um膜過濾，備做HPLC。HPLC采用Agilent1100高效液相色譜儀，檢測(cè)波長(zhǎng)為227nm。色譜柱采用中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所102組一快速分析與檢測(cè)課題組裝填的AlkylPhenyl柱(4.6腿X250mm，5ym)，流動(dòng)相為乙腈水=58:42，流速1.0mL/min，進(jìn)樣量10uL。(4)新紫杉烷化合物的制備、純化及結(jié)構(gòu)鑒定收集幾批實(shí)驗(yàn)中吸附了紫杉烷的吸附劑，以8倍體積甲醇二氯甲垸l:l(v/v)室溫超聲提取3h，提取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，溶于色譜純甲醇，過濾，準(zhǔn)備做制備。制備工作在中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所1804組一藥物化學(xué)課題組完成。制備色譜儀為watersDP4000，制備色譜柱為CAPCELLPAKC18柱(Type:UG80，SIZE:20X250腿，5Mm)，流動(dòng)相為乙腈水=60:40，流速-15ml/min。經(jīng)制備得到兩個(gè)較純化合物，但經(jīng)TLC檢測(cè)發(fā)現(xiàn)不是單一的點(diǎn)，繼續(xù)做硅膠柱層析純化。兩個(gè)樣品分別以石油醚丙酮=90:10和95:5洗脫，收集得到純品。兩個(gè)純品已經(jīng)中國科學(xué)院上海藥物研究所進(jìn)行了結(jié)構(gòu)鑒定，結(jié)構(gòu)式如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>2—脫乙酰基云南紫杉烷C，分子式C26H3807分子量462.26。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>實(shí)施例1采用中國紅豆杉懸浮細(xì)胞；培養(yǎng)條件lOOmL搖瓶懸浮培養(yǎng)，采用MS培養(yǎng)基，另添加0.2mg/L2，4_二氯苯氧乙酸，0.5mg/L萘乙酸，0.5mg/L6—芐基腺嘌呤，100mg/L抗壞血酸及30g/L蔗糖。將過濾得到的2g濕細(xì)胞接種到含有20mL上述培養(yǎng)基的搖瓶中，旋轉(zhuǎn)式搖床轉(zhuǎn)速100rpm，25"C培養(yǎng)。第7天添加MJA至最終濃度為100pM，同時(shí)添加100g/LXAD-7,繼續(xù)培養(yǎng)至21天，收獲細(xì)胞并在5(TC干燥。細(xì)胞密度在第15天達(dá)到最高(干重12.7g/L)。Tc分析測(cè)定結(jié)果如下表(*代表最大值)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>同時(shí)得到兩種云南紫杉烷Tc的衍生物2，14-脫乙?；颇献仙纪镃和2—脫乙酰基云南紫杉烷C。實(shí)施例2培養(yǎng)條件同實(shí)施例1，在第7天添加DHPJA至最終濃度為100uM，同時(shí)添加100g/LXAD-7HP，繼續(xù)培養(yǎng)至21天。細(xì)胞密度在第12天達(dá)到最高(干重13.2g/L)。Tc的生產(chǎn)能力見下表。<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>同時(shí)得到兩種云南紫1杉烷Tc的衍3fe物2，14-脫乙?；颇献仙价鵆和2—脫乙?；颇献仙纪镃。實(shí)施例3培養(yǎng)條件同實(shí)施例1，第一組在第7天添加DHPJA至100tiM，同時(shí)補(bǔ)加蔗糖20g/L;第二組在第7天和第12天分別添加DHPJA至100uM，在第7天補(bǔ)加蔗糖20g/L;第三組在第7天和第12天分別添加DHPJA至100uM，在第7天補(bǔ)加蔗糖20g/L，同時(shí)添加XAD-7100g/L，繼續(xù)培養(yǎng)至21天，細(xì)胞密度在第21天達(dá)最高(干重18.4g/L)。Tc的生產(chǎn)能力見下表。第一組(同時(shí)誘導(dǎo)和補(bǔ)糖)培養(yǎng)時(shí)間(天)Tc含量(mg/gDW)Tc產(chǎn)量(mg/L)Tc產(chǎn)率(mg/(L'd))<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>第二組(補(bǔ)糖和重復(fù)誘導(dǎo))<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>第三組(補(bǔ)糖、添加吸附劑和重復(fù)誘導(dǎo))<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>同時(shí)得到兩種云南紫杉垸Tc的衍生物2，14-脫乙?；颇献仙纪镃和2—脫乙酰基云南紫杉垸C。實(shí)施例4培養(yǎng)條件同實(shí)施例1，在第7天和第12天分別添加DHPJA至100iiM，在第7天補(bǔ)加蔗糖20g/L，同時(shí)添加XAD-7HP100g/L，繼續(xù)培養(yǎng)至30天。細(xì)胞密度在第18天達(dá)到最高(干重17.lg/L)。Tc的生產(chǎn)能力見下表。<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>同時(shí)得到兩種云南紫杉烷Tc的衍牛物2，14-脫乙?；颇献仙纪镃和2—脫乙?；颇献仙纪镃。權(quán)利要求1.一種利用中國紅豆杉細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生紫杉烷的方法，其特征在于將中國紅豆杉細(xì)胞置于其常用培養(yǎng)基中培養(yǎng)，細(xì)胞接種量為50～200g/L濕重，在細(xì)胞指數(shù)生長(zhǎng)初期，于每升培養(yǎng)基中加入濃度為1～2000μM的誘導(dǎo)劑、50-200g的無菌吸附劑和10～50g的糖；在細(xì)胞指數(shù)生長(zhǎng)中期，再次加入濃度為1～2000μM的誘導(dǎo)劑；所述誘導(dǎo)劑為非生物誘導(dǎo)劑或真菌誘導(dǎo)子。2.按照權(quán)利要求1所述方法，其特征在于:所述非生物誘導(dǎo)劑為硝酸銀、水楊酸或茉莉酸及其衍生物，所述糖為蔗糖或葡萄糖。3.按照權(quán)利要求2所述方法，其特征在于:所述衍生物為甲基茉莉酸酮酯、2—羥乙基茉莉酸、3—氟乙基茉莉酸或2，3-二羥丙基茉莉酸。4.按照權(quán)利要求1所述方法，其特征在于:所述中國紅豆杉細(xì)胞的培養(yǎng)條件為旋轉(zhuǎn)式搖床，轉(zhuǎn)速60200rpm，培養(yǎng)溫度為2030。C，暗培養(yǎng)；培養(yǎng)周期為1530天，每隔14-20天傳代一次。5.按照權(quán)利要求1所述方法，其特征在于:所述細(xì)胞指數(shù)生長(zhǎng)初期是指細(xì)胞接種于培養(yǎng)基后的第410天，即誘導(dǎo)劑的第一次添加時(shí)間。6.按照權(quán)利要求1所述方法，其特征在于:所述細(xì)胞指數(shù)生長(zhǎng)中期是指細(xì)胞接種于培養(yǎng)基后的第1015天，即誘導(dǎo)劑的第二次添加時(shí)間。7.按照權(quán)利要求l所述方法，其特征在于在第一次添加誘導(dǎo)劑和第二次添加誘導(dǎo)劑的期間還可添加紫杉烷的的合成前體O.252.0克/每升培養(yǎng)基。8.按照權(quán)利要求1所述方法，其特征在于:所述合成前體為醋酸鈉或苯甲酸。9.按照權(quán)利要求l所述方法，其特征在于所述吸附劑為經(jīng)處理對(duì)紫杉烷類化合物有較強(qiáng)的吸附能力并對(duì)細(xì)胞無毒的多孔材料，如各種大孔吸10.按照權(quán)利要求l所述方法，其特征在于:所述中國紅豆杉細(xì)胞的常用培養(yǎng)基組成為，于MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加O.11.0mg/L6—芐基腺嘌呤，0.10.5mg/L2，4—二氯苯氧乙酸，0.11.0mg/L萘乙酸，20200mg/L抗壞血酸及1060g/L蔗糖，pH值為5.56.5。全文摘要本發(fā)明涉及植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，具體地說是一種利用中國紅豆杉細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生紫杉烷的方法，將中國紅豆杉細(xì)胞置于其常用培養(yǎng)基中培養(yǎng)，細(xì)胞接種量為50～200g/L濕重，在細(xì)胞指數(shù)生長(zhǎng)初期，于每升培養(yǎng)基中加入濃度為1～2000μM的誘導(dǎo)劑、50-200g的無菌吸附劑和10～50g的糖；在細(xì)胞指數(shù)生長(zhǎng)中期，再次加入濃度為1～2000μM的誘導(dǎo)劑；所述誘導(dǎo)劑為非生物誘導(dǎo)劑或真菌誘導(dǎo)子。本發(fā)明因絕大部分紫杉烷類化合物外泌到胞外被吸附到吸附劑上，因而大大簡(jiǎn)化了提取分離純化的操作，從而降低了成本，易于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。另外，由于本發(fā)明可誘導(dǎo)產(chǎn)生新的紫杉烷化合物，紫杉烷作為一線抗癌藥物—紫杉醇的前體化合物，該技術(shù)有重要的商業(yè)應(yīng)用前景。文檔編號(hào)C12N5/04GK101319199SQ20071001162公開日2008年12月10日申請(qǐng)日期2007年6月8日優(yōu)先權(quán)日2007年6月8日發(fā)明者衛(wèi)張,虞星炬,金美芳,高明波申請(qǐng)人:中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所