專利名稱：一種提高微生物油脂發(fā)酵生產(chǎn)效率的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物油脂的生產(chǎn)，具體地說是一種提高微生物油脂發(fā)酵 生產(chǎn)效率的方法，是在發(fā)酵期間添加醇類化合物于發(fā)酵培養(yǎng)基中，通風(fēng)培
養(yǎng)至發(fā)酵液中總還原糖濃度降至lg/L以下時停止，離心收集菌體，經(jīng)有機 溶劑抽提獲得更高產(chǎn)量的微生物油脂。本發(fā)明技術(shù)簡單有效，可增強微生 物將碳水化合物轉(zhuǎn)化為油脂的能力，并且可以縮短發(fā)酵周期，顯著提高微 生物油脂的生產(chǎn)效率。
背景技術(shù)：
微生物油脂是指某些微生物包括酵母菌、霉菌、藻類等在一定條件下 將碳水化合物、碳氫化合物等轉(zhuǎn)化為菌體內(nèi)的脂肪酸甘油酯，其脂肪酸組
成與常規(guī)植物油脂相似，主要是Cw和d8系脂肪酸，如棕櫚酸、硬脂酸、油
酸禾口亞麻酸等o
目前用于油脂生產(chǎn)的原料主要以油料植物和油料作物為主，但因其占 用耕地，生產(chǎn)受到季節(jié)和自然條件的制約，不利于油脂原料穩(wěn)定和連續(xù)供 應(yīng)。而利用微生物發(fā)酵法獲取微生物油脂是一條發(fā)展?jié)摿薮蟮墨@取新油 源的好途徑。微生物油脂不但可以緩解我國油脂資源緊缺的局面，而且能 夠合理利用廢棄的生物質(zhì)資源，降低油脂生產(chǎn)成本，提高產(chǎn)品附加值，實 現(xiàn)連續(xù)大規(guī)模生產(chǎn)，有利于環(huán)境保護。微生物油脂用途廣泛，通過與醇進 行酯交換反應(yīng)，生產(chǎn)可降解的潤滑油、溶劑油、油漆和油墨溶劑、表面活 性劑、粘接劑等產(chǎn)品。因此，微生物油脂研究具有廣闊的發(fā)展空間。
提高微生物油脂發(fā)酵生產(chǎn)效率的技術(shù)途徑很多，其中縮短發(fā)酵時間和
提高脂肪得率系數(shù)(脂肪得率系數(shù)是指每100克底物經(jīng)發(fā)酵轉(zhuǎn)化所獲得的 脂肪質(zhì)量)是最重要的途徑。其中脂肪得率系數(shù)又與生物量產(chǎn)量和菌體油 脂含量相關(guān)聯(lián)。本發(fā)明通過在發(fā)酵過程中添加微量醇類化合物，提高了微 生物油脂發(fā)酵的技術(shù)經(jīng)濟性。

發(fā)明內(nèi)容
色醇、對羥基苯乙醇、苯基乙醇、法尼醇和香葉醇是真核生物進行細 胞間互相聯(lián)系的信號分子，信號分子的釋放與接受促使微生物群體同步、 協(xié)調(diào)地應(yīng)對環(huán)境變換。細胞間的信號傳遞幾乎影響著每一個反應(yīng)，它確保 某一特定類型的全部細胞接收并轉(zhuǎn)化信號；憑借這一方式，相同類型的細 胞對同一信號作出同步反應(yīng)，其功能是協(xié)調(diào)各細胞間代謝產(chǎn)物的流動。本 發(fā)明正是將這一理論應(yīng)用于微生物發(fā)酵。在發(fā)酵期間添加醇類化合物，如 色醇、對羥基苯乙醇、苯基乙醇、法尼醇和香葉醇這些信號分子來參與細 胞間的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，調(diào)控微生物的代謝機制和產(chǎn)油機制，增強微生物的產(chǎn)脂能力，從而提高微生物油脂的生產(chǎn)效率。
本發(fā)明的目的在于提供一種縮短發(fā)酵周期、增強微生物對底物利用能 力、提高微生物油脂發(fā)酵生產(chǎn)效率的方法。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為
一種提高微生物油脂發(fā)酵生產(chǎn)效率的方法，將產(chǎn)油酵母菌種子液接種 于發(fā)酵液中，于30'C通風(fēng)培養(yǎng)，在發(fā)酵期間添加醇類化合物，其在發(fā)酵液
中的濃度為0.01-5.0mM，其添加時間為發(fā)酵液接種后0-40h，待發(fā)酵液中總 還原糖濃度降至l g/L以下時停止培養(yǎng)，離心收集菌體，經(jīng)有機溶劑抽提獲 得微生物油脂。
所述醇類化合物包括色醇(CAS: 526-55-6)、對羥基苯乙醇(CAS: 501-94-0)、苯基乙醇(CAS: 60-12-8)、法尼醇(CAS: 4602-84-0)和/或 香葉醇(CAS: 106-24-1)。
所述產(chǎn)油酵母菌常為斯達氏油脂酵母Z470m_yC" Wwfe,或紅冬孢酵母
本發(fā)明具有如下優(yōu)點
1. 本發(fā)明利用微生物代謝調(diào)控規(guī)律，在發(fā)酵期間加入少量醇類化合物 來調(diào)控產(chǎn)油酵母的代謝機制，從而明顯增強菌體對底物的利用能力和油脂 積累的能力，縮短發(fā)酵時間，獲得更高的油脂產(chǎn)量，達到提高油脂生產(chǎn)效 率的目的，取得更顯著的綜合效益，提高了微生物油脂發(fā)酵的技術(shù)經(jīng)濟性。
2. 本發(fā)明切實有效，簡單易行，為微生物油脂生產(chǎn)效率的提高提供了 一種新的方法。其在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加醇類化合物，與不加入醇類化合物
的對照組比較，菌體生物量增率達0.6%-5.7%，菌體油脂含量增率達 0.2%-7.4%，油脂產(chǎn)量增率達0.7%-13.5%，脂肪得率系數(shù)增率達1.4%-13.2%， 發(fā)酵時間縮短2.8%-27.1%。
具體實施例方式
本發(fā)明所添加的醇類化合物包括色醇(CAS: 526-55-6)、對羥基苯乙 醇(CAS: 501-94-0)、苯基乙醇(CAS: 60-12-8)、法尼醇(CAS: 4602-84-0) 和/或香葉醇(CAS: 106-24-1 )。將醇類化合物分別溶解于二甲基亞砜(DMSO) 中，配制成溶液。
本發(fā)明使用的YEPD種子液配方為(g/L):葡萄糖20，酵母粉10，蛋白 胨10， pH5-6。發(fā)酵培養(yǎng)基配方為(g/L):葡萄糖70，酵母粉5.0，磷酸二氫 鉀1.0，七水硫酸鎂0.5， pH5-6。
本發(fā)明使用的產(chǎn)油微生物菌株包括紅冬孢酵母i /2odo^on^wm torw/oWes或斯達氏油脂酵母h>om_ycas Warfe"'，將生長于YEPD培養(yǎng)基中 的產(chǎn)油酵母種子液(含10S l()S個細胞/mL)按10%的接種量接入到滅菌后 的發(fā)酵培養(yǎng)基中，于3(TC通風(fēng)培養(yǎng)，在發(fā)酵期間添加醇類化合物，待發(fā)酵 液中總還原糖濃度降至lg/L以下時停止培養(yǎng)，經(jīng)離心、洗滌，收集菌體沉 淀，在105 "C干燥至恒重，即得干菌體，經(jīng)有機溶劑抽提獲得微生物油脂。 與不加入醇類化合物的對照組比較，利用該技術(shù)可使油脂發(fā)酵過程菌體生
物量增率達0.6%-5.7%，油脂含量增率達0.2%-7.4%，油脂產(chǎn)量增率達 0.7%-13.5%，脂肪得率系數(shù)增率達1.4%-13.2%，發(fā)酵時間縮短2.8%-27.1%。 本發(fā)明使用酸熱-有機溶劑法提取微生物油脂。按每克干菌體加入6 mL 的4mol/L鹽酸，于78 "C水浴熱處理60分鐘，冷卻后加入與HC1等體積 甲醇，充分振蕩，再加入等體積氯仿，充分振蕩，靜置收集氯仿層。甲醇 層加入二倍體積氯仿，充分振蕩，靜置收集氯仿層。合并氯仿浸提液，加 入等體積的0.in/。NaCl溶液，充分振蕩，靜置收集氯仿層，用無水Na2S04
干燥、過濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去氯仿，再于105 x:烘干至恒重，即得到微生物油脂。
下面是提高微生物油脂生產(chǎn)效率的具體實施例。通過實施例可進一步 了解不同醇類化合物對微生物產(chǎn)脂能力的影響。 對比例l:
將斯達氏油脂酵母h) o，c"加A，' AS 2.1560種子液接種于發(fā)酵液 中，加入250 pLDMSO， 30 'C通風(fēng)培養(yǎng)144 h，此時發(fā)酵液中葡萄糖濃度 降至1 g/L以下。于6000 rpm離心10分鐘收集菌體。得到干菌體17.5 g/L， 菌體油脂含量57.8%，脂肪得率系數(shù)14.4。
實施例l
將斯達氏油脂酵母丄^omjc" sto/^y/ AS 2.1560種子液接種于發(fā)酵液 中，在30。C通風(fēng)培養(yǎng)12 h后加入對羥基苯乙醇至終濃度為100 nM，培養(yǎng) 至110 h，于6000 rpm離心10分鐘收集菌體。得到干菌體17.8 g/L，菌體 油脂含量58.7%，脂肪得率系數(shù)14.9。與對比例1比較，發(fā)酵時間縮短34 h， 千菌體、油脂含量和脂肪得率系數(shù)增率分別為1.7%、 1.6%和3.5%。
實施例2
將斯達氏油脂酵母丄^om;^" AS 2.1560種子液接種于發(fā)酵液
中，在30。C通風(fēng)培養(yǎng)12h后加入色醇至終濃度為100|iM，培養(yǎng)至115h， 于6000 rpm離心10分鐘收集菌體。得到干菌體18.0 g/L，菌體油脂含量 60.5%，脂肪得率系數(shù)15.6。與對比例1比較，發(fā)酵時間縮短29h，干菌體、 油脂含量和脂肪得率系數(shù)增率分別為2.9%、 4.7%和8.3%。
實施例3
將斯達氏油脂酵母Z^owyc" storey/ AS 2.1560種子液接種于發(fā)酵液 中，在3(TC通風(fēng)培養(yǎng)36h后加入色醇至終濃度為lOO)iM，培養(yǎng)至lllh， 于6000 rpm離心10分鐘收集菌體。得到干菌體18.3 g/L，菌體油脂含量 62.0%，脂肪得率系數(shù)16.3。與對比例1比較，發(fā)酵時間縮短33h，干菌體、 油脂含量和脂肪得率系數(shù)增率分別為4.6%、 7.3%和13.2%。
實施例4
將斯達氏油脂酵母Z^omyc" sto^rej;/ AS 2.1560種子液接種于發(fā)酵液 中，在30 。C通風(fēng)培養(yǎng)36h后加入對羥基苯乙醇至終濃度為100 pM，培養(yǎng)
至107 h，于6000 rpm離心10分鐘收集菌體。得到干菌體18.1 g/L，菌體 油脂含量58.6%，脂肪得率系數(shù)15.2。與對比例1比較，發(fā)酵時間縮短37 h， 干菌體、油脂含量和脂肪得率系數(shù)增率分別為3.4%、 1.4%和5.6%。 實施例5
將斯達氏油脂酵母Z^ow;;c" Warfey' AS 2.1560種子液接種于發(fā)酵液 中，在30。C通風(fēng)培養(yǎng)36h后加入苯基乙醇至終濃度為100|iM，培養(yǎng)至112 h，于6000 rpm離心10分鐘收集菌體。得到干菌體17.9 g/L，菌體油脂含 量59.1%，脂肪得率系數(shù)15.1。與對比例l比較，發(fā)酵時間縮短32h，干菌 體、油脂含量和脂肪得率系數(shù)增率分別為2.3%、 2.2%和4.9%。
實施例6
將斯達氏油脂酵母丄^omyc" storfe;;/ AS 2.1560種子液接種于發(fā)酵液 中，在30 。C通風(fēng)培養(yǎng)36 h后加入法尼醇至終濃度為100 一，培養(yǎng)至109 h， 于6000 rpm離心10分鐘收集菌體。得到干菌體17.9 g/L，菌體油脂含量 59.7%，脂肪得率系數(shù)15.3。與對比例1比較，發(fā)酵時間縮短35h，干菌體、 油脂含量和脂肪得率系數(shù)增率分別為2.3%、 3.3%和6.3%。
實施例7
將斯達氏油脂酵母丄^ o/^c" storey/ AS 2.1560種子液接種于發(fā)酵液 中，在30 。C通風(fēng)培養(yǎng)36 h后加入香葉醇至終濃度為100 pM，培養(yǎng)至110 h， 于6000 rpm離心10分鐘收集菌體。得到干菌體17.9 g/L，菌體油脂含量 62.0%,脂肪得率系數(shù)15.9。與對比例1比較，發(fā)酵時間縮短34h，干菌體、 油脂含量和脂肪得率系數(shù)增率分別為2.3%、 7.3%和10.4%。
實施例8
將斯達氏油脂酵母hjwmyc" Ww^y/ AS 2.1560種子液接種于發(fā)酵液 中，在3(TC通風(fēng)培養(yǎng)0h時加入色醇至終濃度為10|aM，培養(yǎng)至136h，于 6000 rpm離心10分鐘收集菌體。得到干菌體17.7 g/L，菌體油脂含量58.0%， 脂肪得率系數(shù)14.7。與對比例l比較，發(fā)酵時間縮短8h，干菌體、油脂含 量和脂肪得率系數(shù)增率分別為1.1%、 0.3%和2.1%。
實施例9
將斯達氏油脂酵母Z&owyces storey' AS 2.1560種子液接種于發(fā)酵液 中，在30"C通風(fēng)培養(yǎng)38h后加入色醇至終濃度為5.0mM，培養(yǎng)至140h， 于6000 rpm離心10分鐘收集菌體。得到干菌體17.6 g/L，菌體油脂含量 57.9%，脂肪得率系數(shù)14.6。與對比例l比較，發(fā)酵時間縮短4h，干菌體、 油脂含量和脂肪得率系數(shù)增率分別為0.6%、 0.2%和1.4%。
實施例10
將斯達氏油脂酵母h>owyc" storey/ AS 2.1560種子液接種于發(fā)酵液 中，在30。C通風(fēng)培養(yǎng)38 h后加入色醇至終濃度為50 pM和對羥基苯乙醇至 終濃度為50pM，培養(yǎng)至105h，于6000rpm離心IO分鐘收集菌體。得到 干菌體17.9g/L，菌體油脂含量59.2%，脂肪得率系數(shù)15.1。與對比例1比
較，發(fā)酵時間縮短39 h，干菌體、油脂含量和脂肪得率系數(shù)增率分別為2.3%、 2.4%禾口 4.9%。 對比例2:
將紅冬孢酵母7 /zo^wponW/wm AS 2.1389種子液接種于發(fā)酵
液中，加入250 ^LDMSO， 30。C通風(fēng)培養(yǎng)5d，發(fā)酵液中葡萄糖濃度降至1 g/L以下。于6000 rpm離心10分鐘收集菌體。得到干菌體17.6 g/L，菌體 油脂含量57.9%，脂肪得率系數(shù)14.6。
實施例11
將紅冬孢酵母i^ofifewponW/ww tora/o^ay AS 2.1389種子液接種于發(fā)酵 液中，在30。C通風(fēng)培養(yǎng)24h后加入色醇至終濃度為100拜，培養(yǎng)5d，于 6000 rpm離心10分鐘收集菌體。得到干菌體18.6 g/L，菌體油脂含量62.2%， 脂肪得率系數(shù)16.5。與對比例2比較，干菌體、油脂含量和脂肪得率系數(shù) 增率分別為5.7%、 7.4%和13.0%。
實施例12
將紅冬孢酵母i /20^wpon'<i/wm ton//o/<i^ AS 2.1389種子液接種于發(fā)酵 液中，在30 。C通風(fēng)培養(yǎng)24h后加入對羥基苯乙醇至終濃度為100pM，培 養(yǎng)5 d，于6000 rpm離心10分鐘收集菌體。得到干菌體18.5 g/L，菌體油 脂含量61.1%，脂肪得率系數(shù)16.1。與對比例2比較，干菌體、油脂含量和 脂肪得率系數(shù)增率分別為5.1%、 5.5%和10.3%。
實施例13
將紅冬孢酵母i / ocfospon'c^m torw/o/cfe AS 2.1389種子液接種于發(fā)酵 液中，在30 。C通風(fēng)培養(yǎng)24 h后加入苯基乙醇至終濃度為100 ^M，培養(yǎng)5 d， 于6000 rpm離心10分鐘收集菌體。得到干菌體18.1 g/L，菌體油脂含量 60.3%，脂肪得率系數(shù)15.6。與對比例2比較，干菌體、油脂含量和脂肪得 率系數(shù)增率分別為2.8%、 4.1%和6.8%。
權(quán)利要求
1.一種提高微生物油脂發(fā)酵生產(chǎn)效率的方法，將產(chǎn)油酵母菌種子液接種于發(fā)酵液中通風(fēng)培養(yǎng)，待發(fā)酵液中總還原糖濃度降至1g/L以下時停止培養(yǎng)，離心收集菌體，經(jīng)有機溶劑抽提獲得微生物油脂，其特征在于在發(fā)酵期間添加醇類化合物，醇類化合物于發(fā)酵液中的濃度為0.01-5.0mM，其添加時間為發(fā)酵液接種后的0-40h。
2. 按照權(quán)利要求1所述提高微生物油脂生產(chǎn)效率的方法，其特征在于: 所述醇類化合物為色醇、對羥基苯乙醇、苯基乙醇、法尼醇和/或香葉醇。
3. 按照權(quán)利要求1所述提高微生物油脂生產(chǎn)效率的方法，其特征在于: 所述產(chǎn)油酵母菌為斯達氏油脂酵母h》w^c" Wwfe^或紅冬孢酵母
全文摘要
本發(fā)明涉及微生物油脂的生產(chǎn)，具體地說是一種提高微生物油脂發(fā)酵生產(chǎn)效率的方法，將產(chǎn)油酵母菌種子液接種于發(fā)酵液中，在發(fā)酵期間添加醇類化合物，醇類化合物于發(fā)酵液中的濃度為0.01-5.0mM，其添加時間為發(fā)酵液接種后的0-40h，待發(fā)酵液中總還原糖濃度降至1g/L以下時停止培養(yǎng)，離心收集菌體，經(jīng)有機溶劑抽提獲得微生物油脂；與不加入醇類化合物的對照組比較，菌體生物量、油脂含量和脂肪得率系數(shù)增率分別達0.6％-5.7％、0.2％-7.4％和1.4％-13.2％，發(fā)酵時間縮短2.8％-27.1％。其切實有效，簡單易行，是一種縮短發(fā)酵周期，增強微生物對底物利用能力，提高微生物油脂生產(chǎn)效率的新方法。
文檔編號C12R1/645GK101338328SQ200710011958
公開日2009年1月7日 申請日期2007年7月4日 優(yōu)先權(quán)日2007年7月4日
發(fā)明者雙 武, 趙宗保 申請人:中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所