專利名稱：：一種枯草芽孢桿菌脂肽類抗菌物質(zhì)的分離提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體地說是一種枯草芽孢桿菌脂肽類抗菌物質(zhì)的分離提取方法。
背景技術(shù)：
：枯草芽孢桿菌可以產(chǎn)生多種抗菌物質(zhì)，脂肽類抗菌物質(zhì)是其中重要的一類，它們具有很強的抗菌活性，該類抗菌物質(zhì)性質(zhì)穩(wěn)定，對高溫、酸堿、蛋白酶均具有很好的耐受性，且低毒、低殘留，在生物農(nóng)藥、詞料添加劑、食品添加劑、抗真菌藥物、抗病毒藥物等方面具有潛在的應(yīng)用價值，已成為當(dāng)前國內(nèi)外研究的一個熱點?？莶菅挎邨U菌脂肽類抗菌物質(zhì)由于結(jié)構(gòu)的不同，通常被分成三個組伊枯草菌素(iturins)、表面活性素(surfactin)和plipastatin-fengycin家族抗菌物質(zhì)，Uurins由7個氨基酸組成的肽鏈和l條(3-氨基脂肪酸鏈構(gòu)成，surfactin和plipastatin-fengycin分別由7個氨基酸和10個氨基酸組成的肽鏈及1條P-羥基脂肪酸鏈構(gòu)成?？莶菅挎邨U菌及其發(fā)酵產(chǎn)物可作為生物農(nóng)藥使用，由于其中雜質(zhì)較多，限制了它的使用范圍，對其活性成分進行分離提取，可以解決雜質(zhì)污染帶來的問題，使其有效成分能更好的發(fā)揮作用。目前，枯草芽孢桿菌脂肽類抗菌物質(zhì)的提取方法主要是分以下三個步驟(1)發(fā)酵液用鹽酸調(diào)至PH2.0,收集沉淀；(2)甲醇抽提；(3)反相高效液相色譜柱層析分離。現(xiàn)有技術(shù)取方法操作復(fù)雜、對設(shè)備要求高，可用于脂肽類抗菌物質(zhì)的少量制備，不適合大規(guī)模生產(chǎn)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的在于提供一種操作簡單、快速有效、條件溫和、適合工業(yè)化生產(chǎn)的枯草芽孢桿菌脂肽類抗菌物質(zhì)的分離提取方法。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所釆用的技術(shù)方案為分離提取方法將枯草芽孢桿菌發(fā)酵液的粗提物經(jīng)SephadexG-25柱層析，用去離子水進行洗脫，收集具有抗啤酒酵母活性的洗脫峰，經(jīng)SephadexG-25柱收集的洗脫峰再通過SephadexG-100柱層析，用去離子水進行洗脫，收集具有抗啤酒酵母活性的洗脫峰，所得物質(zhì)通過質(zhì)譜檢測，即為7種脂肽類抗菌物質(zhì)。所述枯草芽孢桿菌發(fā)酵液粗提物為將發(fā)酵的枯草芽孢桿菌液以6000-8000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，取上清液并加入發(fā)酵的枯草芽孢桿菌液2-3倍體積的丙酮，0-4'C沉淀12小時；而后再以11000-14000轉(zhuǎn)/分鐘離心10-20分鐘收集上清，所得上清液經(jīng)40-6(TC旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至原發(fā)酵液體積的5_10%,冷凍干燥后即得發(fā)酵液粗提物，待用。所述SephadexG-25柱層析是將待用的枯草芽孢桿菌發(fā)酵粗提物經(jīng)SephadexG-25層析柱層析，用去離子水進行洗脫，流速為0.15-0.2mL/min，收集具有抗啤酒酵母活性的洗脫峰，所得洗脫峰冷凍干燥，待用。所述S印hadexG-100柱層析是將經(jīng)SephadexG-25層析柱層析收集的物質(zhì)，再經(jīng)SephadexG-100層析柱純化，用去離子水進行洗脫，流速為0.15-0.2mL/min,收集具有抗啤酒酵母活性的洗脫峰，所得洗脫峰冷凍干燥，待用。本發(fā)明所具有的優(yōu)點本發(fā)明提供的方法可快速有效分離提取枯草芽孢桿菌發(fā)酵液中脂肽類抗菌物質(zhì)，其制備工藝簡單快速，操作條件溫和，對試劑、儀器設(shè)備要求低，更適合于工業(yè)化生產(chǎn)。分離提取后通過MALDI-T0F質(zhì)譜及氨基酸組成分析確定出分離的7種脂肽類抗菌物質(zhì)的分子構(gòu)成，其7種脂肽類抗菌物質(zhì)為CuitruinA(M+H)、C16itruinA(M+Na)、C16itruinA(M+K)、C17itruinA(M+H)、C"itruinA(M+Na)、C17itruinA(M+K)和C15surfactinC(M+K)。并且分離的7種脂肽類抗菌物質(zhì)具有廣譜的抗真菌活性，可用于番茄早疫病、芹菜菌核病、萵筍菌核病、黃瓜枯萎病、蘋果輪紋病等植物真菌病害的防治；同時，該7種脂肽類抗菌物質(zhì)也可做為飼料添加劑用于防治黃曲霉等真菌引起的霉變，另外它們在抗真菌、抗病毒、抗腫瘤方面也具有潛在的應(yīng)用價值。圖l為本發(fā)明分離出7種脂肽類抗菌物質(zhì)的MALDI-TOF質(zhì)譜圖。具體實施例方式枯草芽孢桿菌發(fā)酵液的粗提物的制備將枯草芽孢桿菌接種于LB培養(yǎng)基，在37'C，200轉(zhuǎn)/分鐘搖床振蕩培養(yǎng)24h,得到枯草芽孢桿菌發(fā)酵液。所述LB培養(yǎng)基蛋白胨lg，酵母粉O.5g,NaCllg,水lOOmL,pH7.2-7.4。取上述制備枯草芽孢桿菌發(fā)酵液50mL，按6000轉(zhuǎn)/分鐘的速度進行離心IO分鐘，取上清液，并在上清液中加入100mL丙酮，4。C沉淀過夜，12000轉(zhuǎn)/分鐘離心收集上清，6(TC旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至5mL，冷凍干燥，得到發(fā)酵液粗提物干物質(zhì)200mg，待用。稱取SephdexG-25凝膠40g,充分溶漲，常規(guī)裝柱，床體積為100mL(cH.7cmX44cm),將上述得到的凍干后的發(fā)酵液粗提物配成400mg/mL水溶液，取O.5mL加至SephdexG-25層析柱上，用去離子水洗脫，流速為0.2mL/min，用部分收集器每15分鐘收集一管，收集30管，每管3mL。以啤酒酵母作指示菌，釆用管碟法(見參考文獻"胡昌勒、劉煒，《抗生素微生物檢定法及其標準搡作》，氣象出版社，2004,198頁")檢測每管的抗菌活性，收集具有抗啤酒酵母的活性峰(一般為第11-14管)，冷凍干燥，得到干物質(zhì)5mg,待用。稱取SephdexG-100凝膠10g,充分溶漲，常規(guī)裝柱，床體積為100mL(cH.7cmX44cm),將過SephadexG-25柱后冷凍千燥的干物質(zhì)配成10mg/mL水溶液，取O.5mL加至S印hdexG-100層析柱上，用去離子水洗脫，流速為0.2mL/rain，用部分收集器每15分鐘收集一管，收集30管，每管3mL。以啤酒酵母作指示菌，釆用管碟法檢測每管的抗菌活性，收集具有抗啤酒酵母的活性峰(一般為7-10管)，冷凍干燥，得到干物質(zhì)1.9mg即為脂肽類抗菌物質(zhì)。將提取后的脂肽類抗菌物質(zhì)經(jīng)MALDI-TOF質(zhì)譜檢測含有7種抗菌活性成分，相對分子質(zhì)量分別為1071.63、1074.68、1085.65、1093.62、1107.66、1109.63、1123.66，(參見圖l)。綜合氨基酸組成分析結(jié)果，可以判斷上述7種活性成分為脂肽類抗菌物質(zhì)iturinA和surfactin(JoachimV，BarbelKablitz.Matrix—assistedlasterdesorptionionization-timeofflightmassspectrometryoflipopeptidebiosurfactantsinwholecellsandculturefiltratesofBacillussubtilisC_lisolatedfrompetroleumsludge.Appl.Envir.Microbiol,2002，68:6210-6219)各峰歸屬詳見表l。表1抗菌物質(zhì)MALDI-TOF質(zhì)譜各峰值的歸屬<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>權(quán)利要求1.一種枯草芽孢桿菌脂肽類抗菌物質(zhì)的分離提取方法，其特征在于:將枯草芽孢桿菌發(fā)酵液的粗提物經(jīng)SephadexG-25柱層析，用去離子水進行洗脫，收集具有抗啤酒酵母活性的洗脫峰，經(jīng)SephadexG-25柱收集的洗脫峰再通過SephadexG-100柱層析，用去離子水進行洗脫，收集具有抗啤酒酵母活性的洗脫峰，所得物質(zhì)通過質(zhì)譜檢測，即為7種脂肽類抗菌物質(zhì)。2.按權(quán)利要求1所述的分離提取方法，其特征在于所述枯草芽孢桿菌發(fā)酵液粗提物為將發(fā)酵的枯草芽孢桿菌液以6000-8000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，取上清液并加入發(fā)酵的枯草芽孢桿菌液2-3倍體積的丙酮，0-4。C沉淀12小時；而后再以11000-14000轉(zhuǎn)/分鐘離心10-20分鐘收集上清，所得上清液經(jīng)4G-6(TC旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至原發(fā)酵液體積的5-10%，冷凍干燥后即得發(fā)酵液粗提物，待用。3.按權(quán)利要求1所述的分離提取方法，其特征在于所述SephadexG-25柱層析是將待用的枯草芽孢桿菌發(fā)酵粗提物經(jīng)S印hadexG-25層析柱層析，用去離子水進行洗脫，流速為0.15-0.2mL/min，收集具有抗啤酒酵母活性的洗脫峰，所得洗脫峰冷凍干燥，待用。4.按權(quán)利要求1所述的分離提取方法，其特征在于所述SephadexG-100柱層析是將經(jīng)S印hadexG-25層析柱層析收集的物質(zhì)，再經(jīng)S印hadexG-100層析柱純化，用去離子水進行洗脫，流速為0.15-0.2mL/min,收集具有抗啤酒酵母活性的洗脫峰，所得洗脫峰冷凍干燥，待用。全文摘要本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體地說是一種枯草芽孢桿菌脂肽類抗菌物質(zhì)的分離提取方法。具體為將枯草芽孢桿菌發(fā)酵液的粗提物經(jīng)SephadexG-25柱層析，層析收集活性峰，經(jīng)SephadexG-25柱收集的活性峰再通過SephadexG-100柱層析，收集活性峰，所得物質(zhì)通過質(zhì)譜檢測，即為7種脂肽類抗菌物質(zhì)。本發(fā)明分離提純工藝具有簡單、快速、高效、操作條件溫和等特點。并且提取出的脂肽類抗菌物質(zhì)對多種病原真菌具有很好的抑制效果，且具有對溫度、pH穩(wěn)定，耐蛋白酶水解等優(yōu)點。文檔編號C12P21/00GK101372502SQ200710012540公開日2009年2月25日申請日期2007年8月22日優(yōu)先權(quán)日2007年8月22日發(fā)明者張惠文,張成剛,旭李,蘇振成申請人:中國科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所