專利名稱：載體zh-ha固定化糞產(chǎn)堿桿菌青霉素g酰化酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物化工中對(duì)酶進(jìn)行固定化的工藝，具體地說是一種新穎 修飾型環(huán)氧基載體ZH-HA固定化糞產(chǎn)堿桿菌青霉素G?；傅姆椒?。
背景技術(shù)：
自從1929年弗萊明發(fā)現(xiàn)青霉素以來，青霉素為人類的醫(yī)療衛(wèi)生事業(yè)作 出了巨大的貢獻(xiàn)。然而伴隨著使用以致濫用，細(xì)菌對(duì)青霉素的耐藥性也在 不斷增加。研制新型抗生素是解決問題的有效措施。20世紀(jì)60年代科研人 員發(fā)現(xiàn)了青霉素G酰化酶(PGA; EC 3.5丄11)，并開發(fā)了固定化酶技術(shù)用來 水解青霉素和頭孢菌素G生產(chǎn)6—氨基青霉烷酸(6—APA)和7—氨基脫 乙酰頭孢烷酸(7—ADCA)。而6—APA和7—ADCA是半合成抗生素的重 要醫(yī)藥中間體。固定化青霉素?；甘前牒铣?3-內(nèi)酰胺抗生素的生產(chǎn)得以 進(jìn)行的重要手段。而隨著社會(huì)需求的發(fā)展需要更好性能、更高效率的催化 劑，來增加工業(yè)生產(chǎn)的競(jìng)爭(zhēng)力。
近年來，人們已從自然界篩選到多種不同性質(zhì)的青霉素?；?，在所 有已知來源的青霉素G?；钢?，糞產(chǎn)堿桿菌"/^/^"^/flecfl&)青霉 素G酰化酶的基因直到1994年才被克隆(文獻(xiàn)l，美國(guó)專利5695978)，其 具有許多有工業(yè)價(jià)值的特點(diǎn)糞產(chǎn)堿桿菌青霉素G?；笇?duì)底物有更高的 親和力，其Km比其他青霉素?；付嫉投鋕cat是所有青霉素G?；?中最高的；糞產(chǎn)堿桿菌青霉素G?；甘乔嗝顾谿?；讣易逯形ㄒ辉谝?級(jí)結(jié)構(gòu)中具有二硫鍵的成員，其熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性都很高；對(duì)手性分子 的識(shí)別能力，糞產(chǎn)堿桿菌青霉素G?；妇哂懈叩倪x擇性；糞產(chǎn)堿桿菌 青霉素G酰化酶在有機(jī)溶劑中有很高的穩(wěn)定性；在催化(3-內(nèi)酰胺抗生素合 成時(shí)合成/水解率高等。所以糞產(chǎn)堿桿菌青霉素G?；冈诎牒铣煽股毓?業(yè)中有著更好的應(yīng)用前景。
固定化能夠改善酶的性質(zhì)，使固定化酶比游離酶具有更好的穩(wěn)定性和 更高的使用效率，并且使酶能夠回收利用，極大節(jié)約生產(chǎn)成本。固定化技 術(shù)是酶能夠應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)的關(guān)鍵技術(shù)之一。經(jīng)過幾十年的研究和發(fā)展， 先后開發(fā)了多種性能多樣的固定化載體和方法，固定化技術(shù)取得了長(zhǎng)足的 進(jìn)步，然而仍不能滿足理想生物催化劑的所有要求，真正能投入工業(yè)應(yīng)用 的固定化酶卻不多，主要原因是固定化使用的試劑和載體成本高，其次是 固定化效率低，穩(wěn)定性差；并且出于商業(yè)保密，很多工藝過程細(xì)節(jié)沒有公 開。我國(guó)相關(guān)工作起歩較晚，尚需依靠進(jìn)口來滿足半合成抗生素的生產(chǎn)， 因此研究高效的固定化青霉素?；妇哂兄匾饬x。
近代生物工程的技術(shù)進(jìn)步可以對(duì)酶進(jìn)行分子水平上的改造改善酶的結(jié)
構(gòu)功能獲得活力更高的酶，并依靠酶工程的進(jìn)步將酶固定化獲得更適合大 規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)的生物催化劑。我們已將糞產(chǎn)堿桿菌青霉素G?；富颍?轉(zhuǎn)化在大腸桿菌中構(gòu)建了高表達(dá)糞產(chǎn)堿桿菌青霉素G?；傅幕蚬こ?菌，無需誘導(dǎo)即可進(jìn)行組成型高表達(dá)(文獻(xiàn)2，袁中一等，中華人民共和國(guó)
專利，ZL200310108792.6)。在獲得糞產(chǎn)堿桿菌青霉素G?；傅幕A(chǔ)上， 申請(qǐng)人:又進(jìn)行了糞產(chǎn)堿桿菌青霉素G酰化酶固定化酶的研究。
考察一種新載體的固定化條件，其工藝流程為考察酶濃度、pH、鹽濃 度、溫度等條件，以固定化酶活力、溫度穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性及使用穩(wěn)定性 為評(píng)價(jià)指標(biāo)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是篩選新的固定化載體應(yīng)用于糞產(chǎn)堿桿菌青霉素G?；?的固定化，獲得固定化酶產(chǎn)品；并以糞產(chǎn)堿桿菌青霉素G?；笧槟Ｐ?，建 立起應(yīng)用新載體對(duì)酶進(jìn)行固定化的一般工藝流程。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，發(fā)明技術(shù)方案如下
載體ZH-HA固定化糞產(chǎn)堿桿菌青霉素G?；傅姆椒?，固定化糞產(chǎn)堿 桿菌青霉素G?；傅妮d體為ZH—HA，于緩沖溶液體系中，以ZH—HA 進(jìn)行固定化時(shí)，酶濃度為為180-240 mg/ml，固定化時(shí)l^1 12-18 h， 緩沖溶 液pH7.5 — 10.0，反應(yīng)體系中鹽的1.0-1.5 M，載體與緩沖溶液的重量體積 比例為1 g載體4一6 ml緩沖溶液。
當(dāng)體系中緩沖溶液的濃度低于1.0-1.5 M，體系中不足i勺離子強(qiáng)度可以 用可溶性鹽補(bǔ)充，使反應(yīng)體系中鹽的濃度1.0-1.5 M。如，采用濃度0.05M 的緩沖溶液，補(bǔ)加1.0-1.5 MNaCl。
本發(fā)明建立了修飾型環(huán)氧載體對(duì)糞產(chǎn)堿桿菌青霉素G?；傅墓潭ɑ?br> 本發(fā)明還對(duì)糞產(chǎn)堿桿菌青霉素G?；覆捎霉I(yè)化通用載體Eupergit C 進(jìn)行了固定化，并對(duì)其固定化條件進(jìn)行了研究，確定了以Eu^ergkC進(jìn)行固 定化時(shí)，其最佳條件為80-160 mg/ml，固定化200-320 h， 緩沖溶液pH7.0 一9.5，緩沖溶液濃度0.4-0.8 M。
本發(fā)明具有如下特點(diǎn)
1. 本發(fā)明采用商業(yè)化載體Eupergit C對(duì)目前研究較少的糞產(chǎn)堿桿菌青霉 素G?；高M(jìn)行了首次固定化，獲得了性能比自由酶大為改善的固定化酶； 并篩選出了適于固定化糞產(chǎn)堿桿菌青霉素G酰化酶的載體ZH—HA， ZH— HA的價(jià)格比Eupergit C低，采用此種載體對(duì)酶進(jìn)行固定化不僅大大降低了生 產(chǎn)成本，所需固定化時(shí)間比也比EupergitC大為減少，獲得的固定化酶活力 也更高。建立的工藝方法適用于對(duì)所有蛋白質(zhì)分子進(jìn)行固定化，改善性能， 提高其穩(wěn)定性及使用效率。
2. 本發(fā)明通過對(duì)酶濃度、固定化時(shí)間、pH以及緩沖溶液濃度等條件的 考察，確定了最優(yōu)固定化條件，建立了采用新載體固定化的工藝流程。固 定化酶的溫度、pH穩(wěn)定性都比自由酶有了改善。經(jīng)過連續(xù)多批水解青霉素
G鉀鹽，固定化糞產(chǎn)堿桿菌青霉素G?；革@示出良好的操作穩(wěn)定性，表現(xiàn) 出比自由酶的優(yōu)勢(shì)。


圖1為酶濃度和固定化時(shí)間對(duì)載體Eupergit C固定化糞產(chǎn)堿桿菌青霉素 G?；傅挠绊懀还潭ɑ瘲l件pH7.5, 1 M磷酸緩沖液；室溫。( ), 10 mg 蛋白質(zhì)/ml; (口),40 mg蛋白質(zhì)/ml; (△), 80 mg蛋白質(zhì)/ml; (x), 120 mg蛋白 質(zhì)/ml; (+), 160 mg蛋白質(zhì)/ml.
圖2為酶濃度和固定化時(shí)間對(duì)載體ZH—HA固定化糞產(chǎn)堿桿菌青霉素 G?；傅挠绊懀还潭ɑ瘲l件pH 7.5, 1 M磷酸緩沖液；室溫。(0),10mg 蛋白質(zhì)/ml; (□), 40 mg蛋白質(zhì)/ml; (△)， 80 mg蛋白質(zhì)/ml; (x), 120 mg蛋白質(zhì) /ml; (+), 160 mg蛋白質(zhì)/ml; ( ), 200 mg蛋白質(zhì)/ml; (一), 240 mg蛋白質(zhì)/ml
圖3為pH對(duì)載體Eupergit C和ZH—HA固定化糞產(chǎn)堿桿菌青霉素G ?；傅挠绊?；固定化條件100 mg蛋白質(zhì)/ g載體;室溫;固定化時(shí)間對(duì) Eupergit C、 ZH-EP和ZH-HA分別為150h和12h。 (O)，Eupergit C; (A),ZH-HA
圖4為離子強(qiáng)度對(duì)載體Eupergit C和ZH—HA固定化糞產(chǎn)堿桿菌青霉 素G?；傅挠绊?；固定化條件100mg蛋白質(zhì)/g載體；室溫；pH8.0;固 定化時(shí)間對(duì)Eupergit C和ZH-HA分別為150h禾n 12h。 (^),Eupergit C; (A),ZH-HA
圖5 pH對(duì)自由糞產(chǎn)堿桿菌青霉素G酰化酶和固定化在載體Eupergit C 和ZH—HA上糞產(chǎn)堿桿菌青霉素G?；富盍Φ挠绊?；(O),自由AfPGA; (□)， 固定化AfPGA/Eupergit C; (x)，固定化AfPGA / ZH-HA.
圖6溫度對(duì)自由糞產(chǎn)堿桿菌青霉素G?；负凸潭ɑ谳d體Eupergit C和ZH—HA上糞產(chǎn)堿桿菌青霉素G酰化酶活力的影響；(O),自由AfPGA; (□)，固定化AfPGA/Eupergit C;(x),固定化AfPGA / ZH-HA.
圖7自由糞產(chǎn)堿桿菌青霉素G?；负凸潭ɑ谳d體Eupergit C和ZH 一HA上糞產(chǎn)堿桿菌青霉素G?；傅膒H穩(wěn)定性；( ),自由AfPGA; (□)， 固定化AfPGA / Eupergit C; (x)，固定化AfPGA / ZH-HA.
圖8自由糞產(chǎn)堿桿菌青霉素G?；负凸潭ɑ谳d體Eupergit C和ZH _HA上糞產(chǎn)堿桿菌青霉素G?；傅臏囟确€(wěn)定性；( ),自由AfPGA; (□), 固定化AfPGA / Eupergit C; (x),固定化AfPGA / ZH-HA.
圖9固定化在載體Eupergit C和ZH—HA上糞產(chǎn)堿桿菌青霉素G?；?酶的使用穩(wěn)定性。(口),固定化AfPGA / Eupergit C; (A),固定化AfPGA / ZH-HA.
具體實(shí)施例方式
首先按常規(guī)方法培養(yǎng)產(chǎn)糞產(chǎn)堿桿菌青霉素G?；傅木w，細(xì)胞破碎，
提純，獲得糞產(chǎn)堿桿菌青霉素G?；?。然后是對(duì)選擇出的載體進(jìn)行固定 化條件的研究，獲得的固定化酶對(duì)其進(jìn)行性質(zhì)研究以評(píng)價(jià)固定化效果及其 工藝應(yīng)用潛力。 實(shí)施例
先進(jìn)行初步實(shí)驗(yàn)篩選出有潛力的載體，再對(duì)選擇出的載體進(jìn)行詳細(xì)的 固定化條件研究，獲得固定化酶后研究其性質(zhì)和溶液酶比較。
1載體的選擇經(jīng)過對(duì)多種候選載體的試驗(yàn)，最終篩選出香港GeneRad Biotech Laboratory有限公司開發(fā)的新型載體ZH—EP的改進(jìn)型載體ZH— HA。 ZH-EP，類似已工業(yè)化應(yīng)用的載體EupergitC，具有環(huán)氧活性基團(tuán)；而 ZH—HA，制備于ZH—EP，內(nèi)表面覆蓋有聚乙烯亞胺。作為對(duì)照，Eupergit C也被用于固定化。
2固定化條件的考察
2. 1糞產(chǎn)堿桿菌青霉素G?；傅臐舛纫约肮潭ɑ瘯r(shí)間 一般，共價(jià)固定化遵循兩步法機(jī)理首先是載體和蛋白之間快速的物 理吸附，然后是被吸附的蛋白和載體的活化基團(tuán)之間發(fā)生共價(jià)反應(yīng)。第一 步意味著酶濃度對(duì)于固定化是個(gè)重要因素。不同性質(zhì)載體其最適酶濃度不 同，采用最適酶濃度固定化可以在避免浪費(fèi)酶的情況下獲得高活力的固定 化酶。
通常情況下不需要采用純度高的酶進(jìn)行固定化，本專利中采用比活334 U/g蛋白的酶進(jìn)行固定化。固定化體系為lg載體、4 —6ml緩沖溶液。
采用不同的酶濃度體系進(jìn)行固定化，根據(jù)考察結(jié)果(圖1、圖2)，為 獲得最高固定化酶活力，確定采用載j^EupergitC，其最適蛋白濃度為120 mg/ml，固定化260h;對(duì)于ZH—HA采用200 mg/ml，固定化15h。
2. 2pH
常用的磷酸、Tris鹽酸等緩沖溶液緩沖范圍不足，因此采用 Britton-Robinson緩沖溶液(1.0M硼酸-1.0M乙酸-1.0M磷酸的混合 液，其pH由NaOH調(diào)節(jié))。
在不同pH的體系中對(duì)酶進(jìn)行固定化，通過對(duì)獲得的固定化酶活力進(jìn)行 比較(圖3)，對(duì)于用載體Eupergit C固定化糞產(chǎn)堿桿菌青霉素G?；?， 其最適固定化pH范圍7.5—9.0;對(duì)于ZH—HA，其最適固定化pH范圍7.5 一8.5。
2. 3離子強(qiáng)度
酶在載體上的兩歩法固定化機(jī)理第一步要求蛋白和載體表面具有較強(qiáng) 的相互作用力，而蛋白和載體之間的作用力受到引起蛋白和載體表面疏水 作用的鹽濃度或者緩沖溶液濃度的影響。
在不同離子強(qiáng)度的體系中對(duì)酶進(jìn)行固定化，通過對(duì)獲得的固定化酶活 力進(jìn)行比較(圖4)，對(duì)于用載體Eupergit C固定化糞產(chǎn)堿桿菌青霉素G酰 化酶，其最適緩沖溶液濃度0.5 M;對(duì)于ZH—HA，其最適緩沖溶液濃度
1.5 M。
2 4溫度
經(jīng)考察，溫度對(duì)于固定化的影響不是十分顯著，從經(jīng)濟(jì)方便的角度考慮， 采用室溫。對(duì)于溫度敏感型酶可以考慮其適宜的溫度。 3固定化糞產(chǎn)堿桿菌青霉素G?；傅男再|(zhì) 3. 1最適pH
采用不同pH的Britton—Robinson緩沖溶液(0.05 M硼酸一0.05 M冰醋 酸—0.05 M磷酸，NaOH調(diào)節(jié)pH)測(cè)定pH對(duì)溶液酶及固定化酶活力的影 響。自由酶的最適pH為7.5，固定化酶均向堿性范圍發(fā)生了偏移， AfPGA/Eupergit C最適pH為8.0， AfPGA/ZH-HA最適pH為10.0-11.0 (圖5)。
3. 2最適溫度
在不同的溫度測(cè)定溶液酶及固定化酶的活力。自由酶的最適溫度為 50°C，固定化酶的最適溫度均有所提高，為55 60。C (圖6)。 3. 3pH穩(wěn)定性
樣品在不同pH的緩沖溶液中室溫保溫1 h后測(cè)定其殘余活力，和未經(jīng) 保溫的樣品活力相比，在整個(gè)酸性到堿性范圍(pH 4.0-10.0)固定化酶的 pH穩(wěn)定性明顯比自由酶的好(圖7)。由于青霉素G?；覆粌H能在堿性 環(huán)境下催化水解反應(yīng)還能在酸性催化合成反應(yīng)，因此固定化后在酸性以及 堿性范圍內(nèi)提高了其穩(wěn)定性有著重要意義。
3. 4溫度穩(wěn)定性
在工業(yè)中采用較高的反應(yīng)溫度，有以下一些優(yōu)勢(shì)較高的反應(yīng)速率、改 變反應(yīng)平衡、更好的底物溶解性、較低的反應(yīng)介質(zhì)粘度以及微生物污染可 能性降低等。因此熱穩(wěn)定性的酶對(duì)于工業(yè)應(yīng)用具有重要意義。
樣品在不同溫度保溫1 h后，測(cè)定其殘余活力，和未經(jīng)保溫的樣品相比， 評(píng)價(jià)其溫度穩(wěn)定性。溶液酶及固定化酶均表現(xiàn)出了良好的溫度穩(wěn)定性，而 固定化酶在55"C以上表現(xiàn)出了其穩(wěn)定作用(圖8)。
3. 5使用穩(wěn)定性
固定化酶在柱式反應(yīng)器中催化水解青霉素G鉀鹽產(chǎn)生6-APA和苯乙 酸，NaOH溶液自動(dòng)加入保持反應(yīng)體系pH為8.0，固定化酶的活力和NaOH 的初始消耗速率成正比。在反應(yīng)過程中，青霉素G鉀鹽的水解速度逐漸降 低，NaOH的加入速率也相應(yīng)降低，當(dāng)最終NaOH停止消耗時(shí)反應(yīng)結(jié)束， 然后重復(fù)操作開始下一批反應(yīng)。經(jīng)過連續(xù)反應(yīng)40余批，固定化酶活力沒有 明顯損失，表現(xiàn)出了良好的使用穩(wěn)定性(圖9)。
實(shí)施例1以載體EupergitC固定化
采用比活334 U / g蛋白的糞產(chǎn)堿桿菌青霉素G酰化酶，酶溶解在 pH 8.0的磷酸緩沖液中，濃縮或者稀釋酶液至120 mg/ml。 1 g濕載體Eupergit C加入5ml酶液，室溫下均勻混合地反應(yīng)260小時(shí)。用沙芯漏斗抽濾，所
得固定化產(chǎn)物用磷酸緩沖液洗滌3_5次,固定化結(jié)束。
實(shí)施例2以載體ZH—HA固定化糞產(chǎn)堿桿菌青霉^G?；?10 g濕載體ZH—HA加入40 ml 0.02 mol/L磷酸鉀緩沖液pH 8.0，室溫 充分?jǐn)嚢柘礈?，過濾。加入40 ml 0.02 mol/L磷酸鉀緩沖液pH 8.0—2%戊 二醛溶液，室溫?cái)嚢?0min。過濾，ZH—HA再經(jīng)磷酸鉀緩沖液充分洗滌。 至此，載體ZH—HA活化結(jié)束，隨時(shí)可用。
采用比活334 U / g蛋白的糞產(chǎn)堿桿菌青霉素G?；?，酶溶解在pH 9.0的磷酸緩沖液中，濃縮或者稀釋酶液至200mg/ml。 lg活化后的濕載體 ZH—HA加入5 ml酶液，室溫下均勻混合地反應(yīng)15小時(shí)。用沙芯漏斗抽 濾，所得固定化產(chǎn)物用磷酸緩沖液洗滌3—5次,固定化結(jié)束。
權(quán)利要求
1. 載體ZH-HA固定化糞產(chǎn)堿桿菌青霉素G?；傅姆椒?，其特征在于固定化糞產(chǎn)堿桿菌青霉素G?；傅妮d體為ZH—HA，于緩沖溶液體系中，以ZH—HA進(jìn)行固定化時(shí)，酶濃度為為180-240mg/ml，固定化時(shí)間12-18h，緩沖溶液pH7.5—10.0，反應(yīng)體系中鹽的1.0-1.5M，載體與緩沖溶液的重量體積比例為1g載體4—6ml緩沖溶液。
2. 按照權(quán)利要求1所述載體ZH-HA固定化糞產(chǎn)堿桿菌青霉素G酰化 酶的方法，其特征在于當(dāng)體系中緩沖溶液的濃度低于1.0-1.5 M，體系中 不足的離子強(qiáng)度可以用可溶性鹽補(bǔ)充，使反應(yīng)體系中鹽的濃度1.0-1.5 M。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物化工中對(duì)酶進(jìn)行固定化的工藝，具體地說是載體ZH-HA固定化糞產(chǎn)堿桿菌青霉素G酰化酶的方法，固定化糞產(chǎn)堿桿菌青霉素G?；傅妮d體為ZH-HA，于緩沖溶液體系中，以ZH-HA進(jìn)行固定化時(shí)，酶濃度為為180-240mg/ml，固定化時(shí)間12-18h，緩沖溶液pH 7.5-10.0，反應(yīng)體系中鹽的1.0-1.5M，載體與緩沖溶液的重量體積比例為1g載體4-6ml緩沖溶液。本發(fā)明固定化酶的溫度、pH穩(wěn)定性都比自由酶有了改善。經(jīng)過連續(xù)多批水解青霉素G鉀鹽，固定化糞產(chǎn)堿桿菌青霉素G酰化酶顯示出良好的操作穩(wěn)定性，表現(xiàn)出比自由酶的優(yōu)勢(shì)。
文檔編號(hào)C12N9/78GK101381719SQ20071001271
公開日2009年3月11日 申請(qǐng)日期2007年9月5日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月5日
發(fā)明者健 孫, 袁中一, 許國(guó)旺 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所