專利名稱：半滑舌鰨微衛(wèi)星標(biāo)記HSTS_lx的檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevis)DNA分子遺傳標(biāo)記技術(shù)，涉及一種檢測(cè)半滑舌鰨微衛(wèi)星標(biāo)記HSTS_lx的技術(shù)方法，具體是半滑舌鰨微衛(wèi)星標(biāo)記HSTS_lx的檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevis)屬鰈形目、舌鰨科、舌鰨屬，是一種暖溫性近海大型底層魚類，終年生活棲息在我國(guó)近海海區(qū)，是我國(guó)重要的海水養(yǎng)殖新品種。為合理利用和保護(hù)野生半滑舌鰨種質(zhì)資源，一些學(xué)者利用同工酶技術(shù)、RAPD技術(shù)及AFLP技術(shù)研究了半滑舌鰨的遺傳結(jié)構(gòu)及其遺傳多樣性(莊志猛等，《海洋水產(chǎn)研究》，2006，2期，10-16頁；韓志強(qiáng)等，《中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)》，2007，2期，192-200頁)。然而由于同工酶標(biāo)記、RAPD標(biāo)記和AFLP標(biāo)記都屬于顯性遺傳標(biāo)記，檢測(cè)效率不如微衛(wèi)星標(biāo)記等共顯性標(biāo)記高。另外，同工酶標(biāo)記的缺點(diǎn)是多態(tài)性低，RAPD標(biāo)記的穩(wěn)定性不好，AFLP標(biāo)記操作繁瑣，這些都大大限制了它們的應(yīng)用。而微衛(wèi)星序列廣泛分布于真核生物基因組中，其特點(diǎn)是種類多，等位基因數(shù)目多，多態(tài)性高，共顯性，孟德爾遺傳方式，并隨機(jī)分布于基因組中，而且微衛(wèi)星際記檢測(cè)效率高，結(jié)果穩(wěn)定。但由于缺乏半滑舌鰨微衛(wèi)星標(biāo)記，限制了其分子遺傳學(xué)研究的發(fā)展，所以迫切需要獲取微衛(wèi)星標(biāo)記以進(jìn)行半滑舌鰨遺傳多樣性和系譜認(rèn)證等方面的研究和應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種半滑舌鰨DNA分子遺傳標(biāo)記技術(shù)，即半滑舌鰨微衛(wèi)星標(biāo)記HSTS_lx的快速檢測(cè)方法，以彌補(bǔ)已有技術(shù)的不足。
本發(fā)明的基本構(gòu)思主要是利用半滑舌鰨EST序列中含有的微衛(wèi)星核心序列，在其兩端設(shè)計(jì)特異性引物并進(jìn)行PCR檢測(cè)，從而快速地檢測(cè)半滑舌鰨每個(gè)個(gè)體在此微衛(wèi)星區(qū)的遺傳變異，獲得該引物(微衛(wèi)星標(biāo)記HSTS_lx)對(duì)半滑舌鰨的多態(tài)性圖譜，通過圖譜直觀地檢測(cè)出每個(gè)個(gè)體的基因型?；谏鲜霰尘艾F(xiàn)狀和實(shí)際要求，本發(fā)明從半滑舌鰨EST序列中獲取了一個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記，命名為HSTS_lx，該微衛(wèi)星標(biāo)記HSTS_lx可用于半滑舌鰨遺傳多樣性分析和系譜認(rèn)證。
本發(fā)明是按照以下操作技術(shù)方案完成的首先提取半滑舌鰨血液中的基因組DNA并稀釋備用；再利用半滑舌鰨EST序列中含有的微衛(wèi)星核心序列，在其序列兩端設(shè)計(jì)特異性引物；然后使用該引物對(duì)半滑舌鰨不同地理群或半滑舌鰨群內(nèi)個(gè)體的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，從而確定每個(gè)個(gè)體的基因型，獲得半滑舌鰨的遺傳多態(tài)性圖譜。
提取半滑舌鰨基因組DNA，將其稀釋為50ng/μl，每個(gè)PCR反應(yīng)中加入1μl，反應(yīng)總體積為25μl。
含有微衛(wèi)星序列的EST序列為1 attcgttttt tttttttttt ttagaatgaa tcacaaaaat ctttatttct ttttcttaga61 cactgaaaga ctgagcatca taaccagcag aaatgaatcc tttttagaag ttttcttttt121 ctaattcttg ttaaaagaca gaaatgcaga gaagagagta aaaccaggag cagagtctca181 gagagtcaga tcaggactga gaacactggt ttgtccacag tgtctctgtg agtggagtgt241 gggagccctg ggtggcctca caggtcacag tggtcacctt catccactgg tcagcaggga301 gcctcagcgt gctgctccag ctgtagtggc cgtccttctc catcagccca cggctcctgc361 tctcctccca gctgctgctg ctgctgctgc tgataccgcc caccttccag gacagagtcc421 agtctgaggg gaagcccttg ttggccagac acgtgagcgt ggccttaccc tgctgcagct481 cctggctgga gggaggcagc actgtcaggg tggggggggc aaaaactgta ggagacagca541 gtcactttag aggacagtga ggagacagat gtcagtccaa caacacacac ccagacacat其中微衛(wèi)星核心序列為gctgctgctgctgctgctgctHSTS_lx微衛(wèi)星引物序列為正鏈5’-TAGTGGCCGTCCTTCTCCAT-3’，負(fù)鏈5’-TGACAGTGCTGCCTCCCTCC-3’，使用該引物時(shí)的退火溫度為58℃。
微衛(wèi)星核心序列和引物序列是本發(fā)明的核心，在半滑舌鰨遺傳多樣性檢測(cè)中呈現(xiàn)多態(tài)性。
PCR擴(kuò)增的加樣參數(shù)為每個(gè)PCR反應(yīng)總體積為25μl，包括50ng半滑舌鰨基因組DNA；10×PCR Buffer，2.5μl；Mg2+1.5mmol/L；Tag酶1u；dNTP各0.1mmol/L；上述的引物各10pmol；加ddH2O至25μl。使用該引物時(shí)設(shè)置PCR儀的程序參數(shù)為94℃變性5min；94℃45sec，58℃1min，72℃40sec，該反應(yīng)進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min，4℃保存。
PCR產(chǎn)物的檢測(cè)步驟將PCR產(chǎn)物在8％的變性聚丙烯酰胺凝膠中以15W恒功率電泳1.5小時(shí)進(jìn)行分離。電泳結(jié)束后，首先用10％的冰醋酸溶液浸泡30min，然后蒸餾水沖洗5min，再以0.1％的硝酸銀溶液浸泡30min，用3％的碳酸鈉溶液顯色5min，最后用10％的冰醋酸溶液浸泡5min，即可得到半滑舌鰨微衛(wèi)星標(biāo)記HSTS_lx的多態(tài)性圖譜。
因此，本發(fā)明的特點(diǎn)是可快捷的獲得半滑舌鰨的HSTS_lx微衛(wèi)星標(biāo)記的遺傳變異圖譜，方法簡(jiǎn)便。而且，相對(duì)于其它分子遺傳標(biāo)記技術(shù)而言，微衛(wèi)星標(biāo)記符合孟德爾遺傳模式，呈共顯性遺傳，所得結(jié)果可直觀地檢測(cè)出半滑舌鰨每個(gè)個(gè)體的基因型；而應(yīng)用于不同地理群或半滑舌鰨群內(nèi)個(gè)體間遺傳標(biāo)記、系譜認(rèn)證和遺傳圖譜的構(gòu)建等。


圖1是本發(fā)明微衛(wèi)星標(biāo)記HSTS_lx對(duì)半滑舌鰨23個(gè)個(gè)體的檢測(cè)圖譜(編號(hào)1-23是半滑舌鰨的23個(gè)個(gè)體)。
具體實(shí)施例方式
下面通過實(shí)施例詳細(xì)敘述本發(fā)明在半滑舌鰨HSTS_lx微衛(wèi)星核心序列DNA分子遺傳標(biāo)記技術(shù)方法。首先提取半滑舌鰨血液中的基因組DNA并稀釋備用；再利用半滑舌鰨EST序列中含有的微衛(wèi)星核心序列，在其序列兩端設(shè)計(jì)特異性引物；然后使用該引物對(duì)半滑舌鰨不同地理群或半滑舌鰨群內(nèi)個(gè)體的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，確定每個(gè)個(gè)體的基因型，即獲得半滑舌鰨的遺傳多態(tài)性圖譜。
1、半滑舌鰨基因組DNA的提取將100μl半滑舌鰨血液加入Eppendorf管中，再加入細(xì)胞裂解液500μl和20mg/ml的蛋白酶K 5μl，輕輕搖勻，37℃過夜。然后在裂解好的樣品中加入600μl酚氯∶仿∶異戊醇(25∶24∶1)混合液，晃動(dòng)20min后12000rpm離心10min，取上清液。再加入酚∶氯仿∶異戊醇混合液，重復(fù)上述操作3次。再取上清液，加入2倍體積冷卻的無水乙醇和1/10體積的3mol/L的醋酸鈉，12000rpm離心10min，棄去上清液，保留DNA沉淀，再用70％乙醇洗滌該沉淀2次，待乙醇揮發(fā)完全后，以TE緩沖液溶解DNA，4℃保存。
2、微衛(wèi)星引物的設(shè)計(jì)在半滑舌鰨EST序列基礎(chǔ)上，利用微衛(wèi)星DNA兩側(cè)的序列在同一物種相對(duì)于核心序列的高度保守性，據(jù)此在其兩端設(shè)計(jì)特異性引物，用其擴(kuò)增出該位點(diǎn)的微衛(wèi)星片段。由于微衛(wèi)星核心序列突變率相對(duì)較高，造成微衛(wèi)星DNA核心序列重復(fù)次數(shù)的增加或減少，即微衛(wèi)星DNA序列長(zhǎng)度的變化，這是檢測(cè)微衛(wèi)星多態(tài)性的根源。本發(fā)明的微衛(wèi)星區(qū)核心序列兩端的特異性引物序列為正鏈5’-TAGTGGCCGTCCTTCTCCAT-3’，負(fù)鏈5’-TGACAGTGCTGCCTCCCTCC-3’，使用該引物時(shí)的退火溫度為58℃。
3、PCR擴(kuò)增首先加樣，加樣量如下半滑舌鰨基因組DNA(50ng/L)，1μl；10×PCR Buffer，2.5μl；Mg2+(25mmol/L)，1.5μl；Taq酶(5u/μl)，0.2μl；dNTP(各2.5mmo/L)，1μl；引物(各10pmol/μl)，1μl；加滅菌水至25μl。其次，進(jìn)行PCR反應(yīng)，其PCR擴(kuò)增儀程序參數(shù)為94℃變性5min；94℃45sec，58℃1min，72℃40sec，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min，4℃保存。
4、PCR產(chǎn)物的檢測(cè)將PCR產(chǎn)物在8％的變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離，電泳儀功率為15W，電泳時(shí)間為1.5小時(shí)左右。電泳結(jié)束后，首先用10％的冰醋酸溶液浸泡30min，然后蒸餾水沖洗5min，0.1％的硝酸銀溶液浸泡30min，3％的碳酸鈉溶液顯色5min，最后用10％的冰醋酸溶液浸泡5min即可得到半滑舌鰨在HSTS_lx微衛(wèi)星核心序列的多態(tài)性圖譜，如圖1所示。
<110>中國(guó)海洋大學(xué)<120>半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevis)微衛(wèi)星標(biāo)記HSTS_lx的檢測(cè)方法<160>1<210>1<211>600<212>DNA<213>半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevis)<220>
<221>repeat_region<222>(371)…(391)<400>11 attcgttttt tttttttttt ttagaatgaa tcacaaaaat ctttatttct ttttcttaga61 cactgaaaga ctgagcatca taaccagcag aaatgaatcc tttttagaag ttttcttttt121 ctaattcttg ttaaaagaca gaaatgcaga gaagagagta aaaccaggag cagagtctca181 gagagtcaga tcaggactga gaacactggt ttgtccacag tgtctctgtg agtggagtgt241 gggagccctg ggtggcctca caggtcacag tggtcacctt catccactgg tcagcaggga301 gcctcagcgt gctgctccag ctgtagtggc cgtccttctc catcagccca cggctcctgc361 tctcctccca gctgctgctg ctgctgctgc tgataccgcc caccttccag gacagagtcc421 agtctgaggg gaagcccttg ttggccagac acgtgagcgt ggccttaccc tgctgcagct481 cctggctgga gggaggcagc actgtcaggg tggggggggc aaaaactgta ggagacagca541 gtcactttag aggacagtga ggagacagat gtcagtccaa caacacacac ccagacacat
權(quán)利要求
1.一種半滑舌鰨微衛(wèi)星標(biāo)記HSTS_lx的檢測(cè)方法，其特征在于首先提取半滑舌鰨血液中的基因組DNA并稀釋備用；再利用半滑舌鰨EST序列中含有的微衛(wèi)星核心序列，在其序列兩端設(shè)計(jì)特異性引物；然后使用該引物對(duì)半滑舌鰨不同地理群或半滑舌鰨群內(nèi)個(gè)體的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，從而確定每個(gè)個(gè)體的基因型，獲得半滑舌鰨的遺傳多態(tài)性圖譜。
2.如權(quán)利要求1所述的半滑舌鰨微衛(wèi)星標(biāo)記HSTS_lx的檢測(cè)方法，其特征在于上述提取的半滑舌鰨基因組DNA稀釋為50ng/μl。
3.如權(quán)利要求1所述的半滑舌鰨微衛(wèi)星標(biāo)記HSTS_lx的檢測(cè)方法，其特征在于微衛(wèi)星核心序列兩端設(shè)計(jì)的特異性引物序列分別為正鏈5’-TAGTGGCCGTCCTTCTCCAT-3’，負(fù)鏈5’-TGACAGTGCTGCCTCCCTCC-3’，使用該引物時(shí)的退火溫度為58℃。
4.如權(quán)利要求1所述的半滑舌鰨微衛(wèi)星標(biāo)記HSTS_lx的檢測(cè)方法，其特征在于對(duì)半滑舌鰨不同地理群或半滑舌鰨群內(nèi)個(gè)體的基因組DNA進(jìn)行的PCR擴(kuò)增，其加樣參數(shù)為每個(gè)PCR反應(yīng)總體積為25μl，包括50ng半滑舌鰨基因組DNA；10×PCR Buffer，2.5μl；Mg2+1.5mmol/L；Tag酶1u；dNTP各0.1mmol/L；上述特異性引物各10pmol；最后加ddH2O至25μl；使用該引物時(shí)設(shè)置PCR儀的程序參數(shù)為94℃變性5min；94℃45sec，58℃1min，72℃，40sec，該反應(yīng)進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min，4℃保存。
5.如權(quán)利要求1所述的半滑舌鰨微衛(wèi)星標(biāo)記HSTS_lx的檢測(cè)方法，其特征在于對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)的步驟將PCR產(chǎn)物在8％的變性聚丙烯酰胺凝膠中以15W恒功率電泳1.5小時(shí)進(jìn)行分離，以10％的冰醋酸溶液浸泡30min，然后蒸餾水沖洗5min，再以0.1％的硝酸銀溶液浸泡30min，用3％的碳酸鈉溶液顯色5min，最后用10％的冰醋酸溶液浸泡5min，即可得到半滑舌鰨在HSTS_lx微衛(wèi)星核心序列的多態(tài)性圖譜。
6.半滑舌鰨微衛(wèi)星標(biāo)記HSTS_lx應(yīng)用于半滑舌鰨群體間遺傳標(biāo)記、系譜認(rèn)證和遺傳圖譜的構(gòu)建。
全文摘要
一種半滑舌鰨微衛(wèi)星標(biāo)記HSTS_lx的檢測(cè)方法。首先提取半滑舌鰨血液中的基因組DNA并稀釋備用；再利用半滑舌鰨EST序列中含有的微衛(wèi)星核心序列，在其序列兩端設(shè)計(jì)特異性引物；然后使用該引物對(duì)半滑舌鰨不同地理群或半滑舌鰨群內(nèi)個(gè)體的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)；利用產(chǎn)物出現(xiàn)的條帶進(jìn)行分析，確定每個(gè)個(gè)體的基因型，并獲得半滑舌鰨的遺傳多態(tài)性圖譜。本發(fā)明的特點(diǎn)是可快捷的獲得半滑舌鰨遺傳標(biāo)記HSTS_lx的遺傳變異圖譜，方法簡(jiǎn)便。而且，相對(duì)于其它分子遺傳標(biāo)記技術(shù)而言微衛(wèi)星標(biāo)記符合孟德爾遺傳模式，呈共顯性遺傳，所得結(jié)果可直觀地檢測(cè)出半滑舌鰨每個(gè)個(gè)體的基因型；應(yīng)用于不同地理群或半滑舌鰨群內(nèi)個(gè)體間遺傳標(biāo)記、系譜認(rèn)證和遺傳圖譜的構(gòu)建等。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101038269SQ20071001419
公開日2007年9月19日 申請(qǐng)日期2007年4月16日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月16日
發(fā)明者劉云國(guó), 李八方 申請(qǐng)人:中國(guó)海洋大學(xué)