專利名稱：半滑舌鰨微衛(wèi)星標記HSTS_yg的檢測方法
技術領域：
本發(fā)明屬于半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevis)DNA分子遺傳標記技術，涉及一種檢測半滑舌鰨微衛(wèi)星標記HSTS_yg的技術方法，具體是半滑舌鰨微衛(wèi)星標記HSTS_yg的檢測方法。
背景技術：
半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevis)屬鰈形目、舌鰨科、舌鰨屬，是一種暖溫性近海大型底層魚類，終年生活棲息在我國近海海區(qū)，是我國重要的海水養(yǎng)殖新品種。為合理利用和保護野生半滑舌鰨種質資源，一些學者利用同工酶技術、RAPD技術及AFLP技術研究了半滑舌鰨的遺傳結構及其遺傳多樣性(莊志猛等，《海洋水產研究》，2006，2期，10-16頁；韓志強等，《中國水產科學》，2007，2期，192-200頁)。然而由于同工酶標記、RAPD標記和AFLP標記都屬于顯性遺傳標記，檢測效率不如微衛(wèi)星標記等共顯性標記高。另外，同工酶標記的缺點是多態(tài)性低，RAPD標記的穩(wěn)定性不好，AFLP標記操作繁瑣，這些都大大限制了它們的應用。而微衛(wèi)星序列廣泛分布于真核生物基因組中，其特點是種類多，等位基因數(shù)目多，多態(tài)性高，共顯性，孟德爾遺傳方式，并隨機分布于基因組中，而且微衛(wèi)星標記檢測效率高，結果穩(wěn)定。但由于缺乏半滑舌鰨微衛(wèi)星標記，限制了其分子遺傳學研究的發(fā)展，所以迫切需要獲取微衛(wèi)星標記以進行半滑舌鰨遺傳多樣性和系譜認證等方面的研究和應用。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種半滑舌鰨DNA分子遺傳標記技術，即半滑舌鰨微衛(wèi)星標記HSTS_yg的快速檢測方法，以彌補已有技術的不足。
本發(fā)明的基本構思主要是利用半滑舌鰨RAPD產物中含有的微衛(wèi)星核心序列，在其兩端設計特異性引物并進行PCR檢測，從而快速地檢測半滑舌鰨每個個體在此微衛(wèi)星區(qū)的遺傳變異，獲得該引物(微衛(wèi)星標記HSTS_yg)對半滑舌鰨的多態(tài)性圖譜，通過圖譜直觀地檢測出每個個體的基因型?；谏鲜霰尘艾F(xiàn)狀和實際要求，本發(fā)明從半滑舌鰨RAPD產物中獲取了一個微衛(wèi)星標記，命名為HSTS_yg，該微衛(wèi)星標記HSTS_yg可用于半滑舌鰨遺傳多樣性分析和系譜認證。
本發(fā)明是按照以下操作技術方案完成的首先提取半滑舌鰨血液中的基因組DNA并稀釋備用；再利用半滑舌鰨RAPD產物中含有的微衛(wèi)星核心序列，在其序列兩端設計特異性引物；然后使用該引物對半滑舌鰨不同地理群或半滑舌鰨群內個體的基因組DNA進行PCR擴增，對PCR產物進行變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，從而確定每個個體的基因型，獲得半滑舌鰨的遺傳多態(tài)性圖譜。
提取半滑舌鰨基因組DNA，將其稀釋為50ng/μl，每個PCR反應中加入1μl，反應總體積為25μl。
含有微衛(wèi)星序列的RAPD條帶序列為1ggaatcgaat cccgacttcg ttttcttctt caaaccttta ggaacaatcg ctagaacctt61 ctctctctct ctctcactct ctctcactct ctccttcaca cacacaacca cagagtgtgt121 gcagcagcag cagcagcagc agcagcagca gcatgatgtt ccagtggggg ctcccccagg181 cggtgtgcct gctgtccctg tccgtgtccc tgctcctggc ctacgacgac ggcgacatcg241 aggtgaacta cggcgactac agcttcaatg aaatctcacc tgtgttcaca ccagaggctc301 cggcagaacc agaacccgag cccaccgcca tgccctgcag ctccaaggac ctgaccaagt361 gggacaagct cttctccatg ttagagaaca gccagatgag ggagaacatg ctgctccagt421 acgccgatga catcatcaag gtggagatgg ggtcactgcg tgaagaacta accaggtctg481 tggccccgac cggtggctcc tgtggggccg cggcggagtt ggcctcgcag其中微衛(wèi)星核心序列為agcagcagcagcagcagcagcagcagcagcHSTS_yg微衛(wèi)星引物序列為正鏈5’-ATCCCGACTTCGTTTTCT-3’，負鏈5’-TCTCCCTCATCTGGCTGT-3’，使用該引物時的退火溫度為50℃。
微衛(wèi)星核心序列和引物序列是本發(fā)明的核心，在半滑舌鰨遺傳多樣性檢測中呈現(xiàn)多態(tài)性。
PCR擴增的加樣參數(shù)為每個PCR反應總體積為25μl，包括50ng半滑舌鰨基因組DNA；10×PCR Buffer，2.5μl；Mg2+1.5mmol/L；Tag酶1u；dNTP各0.1mmol/L；上述的引物各10pmol；加ddH2O至25μl。使用該引物時設置PCR儀的程序參數(shù)為94℃變性5min；94℃45sec，50℃1min，72℃40sec，該反應進行35個循環(huán)；72℃延伸5min，4℃保存。
PCR產物的檢測步驟將PCR產物在8％的變性聚丙烯酰胺凝膠中以15W恒功率電泳1.5小時進行分離。電泳結束后，首先用10％的冰醋酸溶液浸泡30min，然后蒸餾水沖洗5min，再以0.1％的硝酸銀溶液浸泡30min，用3％的碳酸鈉溶液顯色5min，最后用10％的冰醋酸溶液浸泡5min，即可得到半滑舌鰨微衛(wèi)星標記HSTS_yg的多態(tài)性圖譜。
因此，本發(fā)明的特點是可快捷的獲得半滑舌鰨的HSTS_yg微衛(wèi)星標記的遺傳變異圖譜，方法簡便。而且，相對于其它分子遺傳標記技術而言，微衛(wèi)星標記符合孟德爾遺傳模式，呈共顯性遺傳，所得結果可直觀地檢測出半滑舌鰨每個個體的基因型；而應用于不同地理群或半滑舌鰨群內個體間遺傳標記、系譜認證和遺傳圖譜的構建等。


圖1是本發(fā)明微衛(wèi)星標記HSTS_yg對半滑舌鰨23個個體的檢測圖譜(編號1-23是半滑舌鰨的23個個體)。
具體實施例方式
下面通過實施例詳細敘述本發(fā)明在半滑舌鰨HSTS_yg微衛(wèi)星核心序列DNA分子遺傳標記技術方法。首先提取半滑舌鰨血液中的基因組DNA并稀釋備用；再利用半滑舌鰨RAPD產物中含有的微衛(wèi)星核心序列，在其序列兩端設計特異性引物；然后使用該引物對半滑舌鰨不同地理群或半滑舌鰨群內個體的基因組DNA進行PCR擴增，對PCR產物進行變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，確定每個個體的基因型，即獲得半滑舌鰨的遺傳多態(tài)性圖譜。
1、半滑舌鰨基因組DNA的提取將100μl半滑舌鰨血液加入Eppendorf管中，再加入細胞裂解液500μl和20mg/ml的蛋白酶K 5μl，輕輕搖勻，37℃過夜。然后在裂解好的樣品中加入600μl酚氯∶仿∶異戊醇(25∶24∶1)混合液，晃動20min后12000rpm離心10min，取上清液。再加入酚∶氯仿∶異戊醇混合液，重復上述操作3次。再取上清液，加入2倍體積冷卻的無水乙醇和1/10體積的3mol/L的醋酸鈉，12000rpm離心10min，棄去上清液，保留DNA沉淀，再用70％乙醇洗滌該沉淀2次，待乙醇揮發(fā)完全后，以TE緩沖液溶解DNA，4℃保存。
2、含有微衛(wèi)星序列的RAPD條帶篩選半滑舌鰨DNA經(jīng)RAPD擴增后，擴增產物上樣8％的變性聚丙烯酰胺凝膠，然后利用微衛(wèi)星探針雜交篩選含有微衛(wèi)星序列的RAPD條帶。
3、RAPD條帶回收用鋒利的刀片切下含有微衛(wèi)星序列的目的RAPD條帶,放入盛有20μl TE和ACNa(3mol/L)(體積比為5∶1)混合液的1.5ml Eppendof管里，在40～50℃水浴中放置2～3h，12000g離心12min，取上清液3～4μl作模板進行二次PCR擴增，反應體系同原擴增反應體系一致。上樣再擴增產物200～300μl，以1％瓊脂糖電泳分離目的RAPD條帶，然后利用QIAquick回收試劑盒回收該條帶。
4、微衛(wèi)星引物的設計回收的片段測序后，找出微衛(wèi)星序列。再利用微衛(wèi)星DNA兩側的序列在同一物種相對于核心序列的高度保守性，據(jù)此在其兩端設計特異性引物，用其擴增出該位點的微衛(wèi)星片段。由于微衛(wèi)星核心序列突變率相對較高，造成微衛(wèi)星DNA核心序列重復次數(shù)的增加或減少，即微衛(wèi)星DNA序列長度的變化，這是檢測微衛(wèi)星多態(tài)性的根源。本發(fā)明的微衛(wèi)星區(qū)核心序列兩端的特異性引物序列為正鏈5’-ATCCCGACTTCGTTTTCT-3’，負鏈5’-TCTCCCTCATCTGGTGT-3’，使用該引物時的退火溫度為50℃。
5、PCR擴增首先加樣，加樣量如下半滑舌鰨基因組DNA(50ng/L)，1μl；10×PCR Buffer，2.5μl；Mg2+(25mmol/L)，1.5μl；Taq酶(5u/μl)，0.2μl；dNTP(各2.5mmo/L)，1μl；引物(各10pmol/μl)，1μl；加滅菌水至25μl。其次，進行PCR反應，其PCR擴增儀程序參數(shù)為94℃變性5min；94℃45sec，50℃1min，72℃40sec，35個循環(huán)；72℃延伸5min，4℃保存。
6、PCR產物的檢測將PCR產物在8％的變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離，電泳儀功率為15W，電泳時間為1.5小時左右。電泳結束后，首先用10％的冰醋酸溶液浸泡30min，然后蒸餾水沖洗5min，0.1％的硝酸銀溶液浸泡30min，3％的碳酸鈉溶液顯色5min，最后用10％的冰醋酸溶液浸泡5min即可得到半滑舌鰨在HSTS_yg微衛(wèi)星核心序列的多態(tài)性圖譜，如圖1所示。
<110>中國海洋大學<120>半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevis)微衛(wèi)星標記HSTS_yg的檢測方法<160>1<210>1<211>530<212>DNA<213>半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevis)<220>
<221>repeat_region<222>(123)...(152)<400>11 ggaatcgaat cccgacttcg ttttcttctt caaaccttta ggaacaatcg ctagaacctt61 ctctctctct ctctcactct ctctcactct ctccttcaca cacacaacca cagagtgtgt121 gcagcagcag cagcagcagc agcagcagca gcatgatgtt ccagtggggg ctcccccagg181 cggtgtgcct gctgtccctg tccgtgtccc tgctcctggc ctacgacgac ggcgacatcg241 aggtgaacta cggcgactac agcttcaatg aaatctcacc tgtgttcaca ccagaggctc301 cggcagaacc agaacccgag cccaccgcca tgccctgcag ctccaaggac ctgaccaagt361 gggacaagct cttctccatg ttagagaaca gccagatgag ggagaacatg ctgctccagt421 acgccgatga catcatcaag gtggagatgg ggtcactgcg tgaagaacta accaggtctg481 tggccccgac cggtggctcc tgtggggccg cggcggagtt ggcctcgcag
權利要求
1.一種半滑舌鰨微衛(wèi)星標記HSTS_yg的檢測方法，其特征在于首先提取半滑舌鰨血液中的基因組DNA并稀釋備用；再利用半滑舌鰨RAPD條帶中含有的微衛(wèi)星核心序列，在其序列兩端設計特異性引物；然后使用該引物對半滑舌鰨不同地理群或半滑舌鰨群內個體的基因組DNA進行PCR擴增，對PCR產物進行變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，從而確定每個個體的基因型，獲得半滑舌鰨的遺傳多態(tài)性圖譜。
2.如權利要求1所述的半滑舌鰨微衛(wèi)星標記HSTS_yg的檢測方法，其特征在于上述提取的半滑舌鰨基因組DNA稀釋為50ng/μl。
3.如權利要求1所述的半滑舌鰨微衛(wèi)星標記HSTS_yg的檢測方法，其特征在于微衛(wèi)星核心序列兩端設計的特異性引物序列分別為正鏈5’-ATCCCGACTTCGTTTTCT-3’，負鏈5’-TCTCCCTCATCTGGCTGT-3’，使用該引物時的退火溫度為50℃。
4.如權利要求1所述的半滑舌鰨微衛(wèi)星標記HSTS_yg的檢測方法，其特征在于對半滑舌鰨不同地理群或半滑舌鰨群內個體的基因組DNA進行的PCR擴增，其加樣參數(shù)為每個PCR反應總體積為25μl，包括50ng半滑舌鰨基因組DNA；10×PCR Buffer，2.5μl；Mg2+1.5mmol/L；Tag酶1u；dNTP各0.1mmol/L；上述特異性引物各10pmol；最后加ddH2O至25μl；使用該引物時設置PCR儀的程序參數(shù)為94℃變性5min；94℃45sec，50℃1min，72℃40sec，該反應進行35個循環(huán)；72℃延伸5min，4℃保存。
5.如權利要求1所述的半滑舌鰨微衛(wèi)星標記HSTS_yg的檢測方法，其特征在于對PCR產物進行檢測的步驟將PCR產物在8％的變性聚丙烯酰胺凝膠中以15W恒功率電泳1.5小時進行分離，以10％的冰醋酸溶液浸泡30min，然后蒸餾水沖洗5min，再以0.1％的硝酸銀溶液浸泡30min，用3％的碳酸鈉溶液顯色5min，最后用10％的冰醋酸溶液浸泡5min，即可得到半滑舌鰨在HSTS_yg微衛(wèi)星核心序列的多態(tài)性圖譜。
6.半滑舌鰨微衛(wèi)星標記HSTS_yg應用于半滑舌鰨群體間遺傳標記、系譜認證和遺傳圖譜的構建。
全文摘要
一種半滑舌鰨微衛(wèi)星標記HSTS_yg的檢測方法。首先提取半滑舌鰨血液中的基因組DNA并稀釋備用；再利用半滑舌鰨RAPD產物中含有的微衛(wèi)星核心序列，在其序列兩端設計特異性引物；然后使用該引物對半滑舌鰨不同地理群或半滑舌鰨群內個體的基因組DNA進行PCR擴增，對PCR產物進行檢測；利用產物出現(xiàn)的條帶進行分析，確定每個個體的基因型，并獲得半滑舌鰨的遺傳多態(tài)性圖譜。本發(fā)明的特點是可快捷的獲得半滑舌鰨遺傳標記HSTS_yg的遺傳變異圖譜，方法簡便。而且，相對于其它分子遺傳標記技術而言微衛(wèi)星標記符合孟德爾遺傳模式，呈共顯性遺傳，所得結果可直觀地檢測出半滑舌鰨每個個體的基因型；應用于不同地理群或半滑舌鰨群內個體間遺傳標記、系譜認證和遺傳圖譜的構建等。
文檔編號C12Q1/68GK101063168SQ20071001419
公開日2007年10月31日 申請日期2007年4月16日 優(yōu)先權日2007年4月16日
發(fā)明者劉云國, 李八方 申請人:中國海洋大學