專利名稱：蘆葦γ－谷氨酰半胱氨酸合成酶基因PcGCS及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及蘆葦富集重金屬相關(guān)基因——γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因PcGCS及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
隨著工業(yè)的發(fā)展和人類生產(chǎn)活動(dòng)的加劇，重金屬污染已成為全球關(guān)注的問(wèn)題。目前我國(guó)存在數(shù)千萬(wàn)畝的重金屬污染土壤，對(duì)人類健康造成了極大地危害。因此，有效地去除重金屬污染成為當(dāng)前一個(gè)十分迫切的任務(wù)。
利用轉(zhuǎn)基因改良植物技術(shù)將新的性狀轉(zhuǎn)入高生物量植物中，以此開(kāi)發(fā)高效的轉(zhuǎn)基因植物修復(fù)系統(tǒng)，用于重金屬污染的土壤修復(fù)是一項(xiàng)具有廣闊應(yīng)用前景的技術(shù)。
基因工程在植物重金屬的富集方面已取得了一些相關(guān)的研究進(jìn)展，已識(shí)別和克隆了大量相關(guān)基因，并將這些基因轉(zhuǎn)入植物中，用于重金屬污染的土壤修復(fù)研究。許多實(shí)驗(yàn)表明，將細(xì)菌、真菌、動(dòng)物及植物本身與重金屬脫毒相關(guān)的基因轉(zhuǎn)入高生物量植物，異源表達(dá)產(chǎn)物可介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因植物耐受和高積累重金屬及類似物。
目前，已證明對(duì)重金屬修復(fù)有顯著作用的主要有植物絡(luò)合素(phytochelatins，PCs)。它是由重金屬誘導(dǎo)而合成的一類小分子多肽，能鰲合重金屬，從而減輕重金屬對(duì)植物的毒害。PCs并非基因的直接產(chǎn)物，而是由γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-glutamylsysteine synthetase，γ-ECS)、谷胱甘肽合成酶(GS)和植物絡(luò)合素合酶(PCS)分三步催化而合成。目前，已克隆了多個(gè)參與PCs生物合成的基因，并在生物量小的擬南芥和印度芥菜中證實(shí)了它們富集重金屬的功能。
蘆葦(Phragmites communis Trirn)可超富集重金屬(Cd2+、Pb2+、Zn2+)，為濕地處理污水的主要植物物種，然而其重金屬富集相關(guān)基因的克隆特別是γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因的克隆尚未見(jiàn)報(bào)道。
多花黑麥草、高羊茅、剪股穎為生物量大、生長(zhǎng)快的優(yōu)良草坪草。但是，經(jīng)檢索，將蘆葦?shù)摩?谷氨酰半胱氨酸合成酶基因轉(zhuǎn)入剪股穎以提高它的抗重金屬的性能尚未見(jiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的是提供一種蘆葦富集重金屬相關(guān)基因——γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因PcGCS及其應(yīng)用。
本發(fā)明的技術(shù)方案在于從蘆葦中分離得到γ-谷氨酰-半胱氨酸合成酶基因PcGCS，然后將該基因轉(zhuǎn)到高生長(zhǎng)量的草坪草中以實(shí)現(xiàn)土壤重金屬污染的修復(fù)。
本發(fā)明提供的基因名稱為蘆葦γ-谷氨酰-半胱氨酸合成酶基因PcGCS，所述基因cDNA序列如序列表SEQ ID No.1所示。
本發(fā)明還提供了一種含上述的蘆葦γ-谷氨酰-半胱氨酸合成酶基因PcGCS的植物表達(dá)載體pROK2，其特征在于所述載體克隆區(qū)域核苷酸序列如序列表SEQ ID No.2所示。
本發(fā)明所述基因PcGCS在培育抗重金屬植物中的應(yīng)用。
將本發(fā)明所述基因?qū)胫参锛?xì)胞，植物就可以獲得富集重金屬的能力，為了便于對(duì)轉(zhuǎn)基因植物或細(xì)胞系進(jìn)行篩選，可以對(duì)本發(fā)明所述植物表達(dá)載體pROK2進(jìn)行加工，如可以加入選擇標(biāo)記(GUS等)或者具有抗性的抗生素標(biāo)記物(潮霉素，卡那霉素，慶大霉素等)，任何一種可以將外源基因?qū)胫参镏斜磉_(dá)的載體都可以應(yīng)用，優(yōu)選的載體是pROK2。
本發(fā)明所述的基因可廣泛用于培育抗重金屬的生物量大、生長(zhǎng)快的植物品種，其中所述植物優(yōu)選剪股穎。
本發(fā)明的有益效果利用現(xiàn)有的植物基因工程技術(shù)，本發(fā)明首次克隆得到了蘆葦?shù)摩?谷氨酰-半胱氨酸合成酶基因PcGCS并通過(guò)根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法將該基因轉(zhuǎn)入生物量大、生長(zhǎng)快的植物品種特別是剪股穎中，經(jīng)過(guò)比較分析證明，轉(zhuǎn)基因植株比非轉(zhuǎn)基因植株的富集重金屬的能力得到了很大程度的提高。


圖1為蘆葦γ-谷氨酰-半胱氨酸合成酶基因的cDNA電泳圖，其中泳道1為基因的cDNA，M為Marker。
圖2為剪股穎抗卡那霉素篩選培養(yǎng)基選擇壓力的確定圖，其中1為0mg/L卡那霉素，2為5mg/L卡那霉素，3為10mg/L卡那霉素。
圖3為轉(zhuǎn)基因剪股穎的DNA鑒定圖，其中泳道1、2、3、4、5均為剪股穎轉(zhuǎn)基因植株的cDNA，泳道6為Marker。
圖4為GCS標(biāo)準(zhǔn)曲線。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1、PcGCS的克隆1.1 蘆葦總RNA的提取(1)蘆葦材料放入預(yù)冷的研缽中，加入液氮迅速研磨成均勻的粉末。注意研磨過(guò)程中要保證材料浸在液氮中。
(2)待液氮揮發(fā)后將材料迅速轉(zhuǎn)入預(yù)冷的離心管中，每50-100mg組織材料加入1ml TRIZOL溶液，混勻后，于室溫放置5min，12000r/min，2-8℃離心10min去沉淀。
(3)每1ml TRIZOL溶液中加入0.2ml氯仿，振蕩15sec充分混勻，于室溫放置5min，12000r/min，2-8℃離心15min。
(4)取上清，每1ml TRIZOL加入0.5ml的異丙醇，混勻，室溫放置10～20min。
(5)2-8℃ 12000r/min離心10min，棄上清。
(6)加1ml 75％乙醇洗滌沉淀2次，4℃不超過(guò)7500r/min離心5min，棄上清。
(7)室溫放置晾干后，加入15μl DEPC處理的雙蒸水溶解RNA。
1.2 逆轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA(1)0.2ml Eppendorf管中，加入下列成分用DNaseI純化的上述總RNA(0.1μg/μl) 2.0μlOlige(dT)anchored primer(2μM) 2.0μl(2)0℃水浴變性10分鐘，立即置于冰浴中。
(3)在10μl反應(yīng)體系中加入下列成分2.0μl 5×MMLV RT buffer；1.0μl 250μmol/L dNTP mix；0.25μl Rnasin；0.5μl(200u/μl)MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶；2μl上述RNA變性液。42℃進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)1hr。反轉(zhuǎn)錄第一鏈cDNA用于后面的反應(yīng)。
1.3 PCR以上述逆轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA為模板，PCR法擴(kuò)增基因片段。
(1)PCR引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成引物P15′-TTA TCG GTC TCA AGC AGG-3′引物P05′-CTG ATC TAG AGG TAC CGG ATC C-3′(2)PCR反應(yīng)體系10×PCR buffer2μlMgCl2(25mmol/L) 1.5μldNTP(each 250μmol/L) 0.2μlP0(10μmol/L) 1μlP1(4μmol/L) 1μl逆轉(zhuǎn)錄第一鏈產(chǎn)物 4μlEx Taq0.2μl無(wú)菌水10.1μl(3)PCR反應(yīng)程序94℃ 5min；94℃ 30sec，50℃ 30sec，72℃ 2min，35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸7min。PCR產(chǎn)物電泳如圖1所示。
1.4 5′-RACE按照TaKaRa 5′-Full RACE Core Set說(shuō)明書(shū)所示步驟操作。電泳5′-RACE產(chǎn)物。
1.5 目的片段的回收(1)用刀片切下上述電泳結(jié)果中含目的條帶的膠條置于1.5ml Eppendorf管中。
(2)稱重，加入3-4倍體積的DR-I Buffer，65℃加熱10min融化膠塊，每隔2min混勻一次保證膠塊能充分融化。
(3)加入DR-I Buffer量的1/2體積的DR-II Buffer，均勻混合。
(4)將Spin Cloumn安置于Collection Tube上，將上述溶液轉(zhuǎn)移至Spin Column中，5000rpm離心1min，棄濾液。
(5)將500μl Rinse A加入Spin Column中，5000rpm離心1min，棄濾液。
(6)將700μl Rinse B加入Spin Column中，5000rpm離心1min，棄濾液。
(7)重復(fù)步驟6，然后12000rpm再離心1min。
(8)將Spin Cloumn安置于新的1.5ml的離心管上，在Spin Cloumn膜的中央處加入預(yù)熱到60℃的25μl的水或洗脫緩沖液，室溫靜置1min。
(9)12000rpm離心1min洗脫DNA。
(10)重復(fù)步驟9，2次，將所有洗脫液集中收集于一管內(nèi)，混勻，取少量電泳檢查回收效率，其余加入1/10體積的3mol/L NaAc(pH5.3)和2倍體積的無(wú)水乙醇，-20℃沉淀1hr。
(11)然后4℃，12000rpm離心15min，用70％冷乙醇洗滌沉淀，棄盡液體，用40μl無(wú)菌水溶解沉淀。回收的片段用于后面的連接反應(yīng)。
1.6 連接用上述的回收目的片段與pGMT載體(購(gòu)自寶生物工程有限公司，下同)按摩爾比約1∶1的比例進(jìn)行連接，連接體系如下目的片段 7μlT-vector 1μl10×T4 DNA Ligase Buffer 1μlT4 DNA Ligase1μl混勻并短暫離心，16℃連接過(guò)夜。得到重組質(zhì)粒pGEM-GCS，用于后面的反應(yīng)。
1.7 CaCl2法制備感受態(tài)細(xì)胞(1)挑取DH10B單菌落接種于5ml LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。
(2)按1∶100-1∶50的比例，取1ml菌液接種于100ml LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至菌液OD600為0.3-0.6。
(3)將菌液冰浴10min，4℃ 4000rpm離心10min，收集菌體。
(4)沉淀加10ml預(yù)冷的0.1M CaCl2懸浮后，冰浴30min。
(5)4℃4000rpm離心10min。沉淀重懸浮于1ml預(yù)冷的0.1M CaCl2，混勻并冰水浴中保存，備用或加入15％的甘油置于-70℃中保存。
1.8 熱擊法轉(zhuǎn)化Ecoli DH10B(1)在無(wú)菌條件下吸取100μl感受態(tài)細(xì)胞，加入1.5ml預(yù)冷的無(wú)菌Eppendorf管中，加入10μl連接產(chǎn)物(1.6中的重組質(zhì)粒)，輕輕混勻，立即置于冰上30min。
(2)在42℃恒溫水浴中熱激90sec(準(zhǔn)確記時(shí))。
(3)冰浴3-5min。
(4)加入800μl不含抗生素的LB液體培養(yǎng)基，混勻，37℃振蕩培養(yǎng)45-60min。
(5)短暫離心收集菌體，用150μl LB液體培養(yǎng)基重懸菌體，轉(zhuǎn)至含抗生素Amp、X-gal、IPTG的LB固體平板上，用無(wú)菌涂布棒涂布。
(6)將平板于37℃正向放置15-30min至液體被吸收，倒置平板，于37℃培養(yǎng)12-16hr，觀察平板會(huì)有藍(lán)白斑。白斑用于后面的質(zhì)粒提取。
1.9 堿裂解法提取大腸桿菌質(zhì)粒(1)挑取白色單菌落，接入含抗生素Amp(50mg/L)的3ml LB液體培養(yǎng)基中，同時(shí)也要保存所挑取的白色單菌落于含抗生素Amp(50mg/L)的固體LB平板中，37℃震蕩培養(yǎng)12-16h；(2)12000rpm離心30sec，收集培養(yǎng)物中的菌體，盡量棄盡上清；(3)加入100μl冰預(yù)冷的溶液I，在渦旋器上使菌體充分重懸；(4)加入200μl溶液II，立即將離心管緩緩顛倒數(shù)次，冰浴5-10min；(5)加入150μl冰預(yù)冷的溶液III，緩緩顛倒離心管數(shù)次直至白色沉淀充分形成，冰浴5-10min；(6)12000rpm離心3min，取上清轉(zhuǎn)入另一微量離心管中，加入2倍體積95％乙醇，混勻后，室溫靜置3min；12000rpm離心3min，使質(zhì)粒DNA沉淀；(7)棄盡上清，取200μl TE溶液溶解沉淀；(8)加入等體積冰預(yù)冷的5mol/L LiCl溶液，冰浴5min，沉淀大量的RNA；(9)12000rpm，離心3min；(10)轉(zhuǎn)移上清到另一離心管中，加入2倍體積的95％乙醇，混勻后于室溫靜置3min，12000rpm離心3min使質(zhì)粒沉淀；(11)棄上清后用1ml 70％乙醇洗滌沉淀，棄盡液體；(12)室溫干燥后，取20μl含RNaseA(20μg/ml)的TE溶液溶解沉淀，37℃水浴30～60min消化RNA。
(13)為減少損失，可先用TE將總體積補(bǔ)充至200μl，加入等體積的酚-氯仿-異戊醇，充分振蕩5-10min，12000rpm離心5min；(14)取上清，加入等體積的氯仿-異戊醇，重復(fù)以上操作；(15)取上清，加入1/10體積的3mol/L醋酸鈉(pH5.3)和2倍體積的無(wú)水乙醇，混勻后-20℃放置15min，12000rpm離心3min使質(zhì)粒沉淀；(16)棄上清用1ml 70％乙醇洗滌沉淀，棄液體，用40μl TE或無(wú)菌水溶解沉淀。質(zhì)粒用于后面的反應(yīng)。
1.10 質(zhì)粒酶切驗(yàn)證用EcoRI酶切上述質(zhì)粒，酶切反應(yīng)體系如下表所示重組質(zhì)粒pGEM-GCS 16μlEcoRI限制性內(nèi)切酶 2μl10×Buffer 2μl將上述反應(yīng)體系混勻并5000rpm離心1min，37℃水浴反應(yīng)過(guò)夜，然后進(jìn)行1％的TAE瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。
1.11 DNA測(cè)序挑取含有重組質(zhì)粒的陽(yáng)性單菌落用含有Amp(50mg/L)的液體LB搖過(guò)夜，然后送上海博亞生物技術(shù)有限公司測(cè)序，得到測(cè)序結(jié)果基因cDNA序列如序列表SEQ ID No.1所示。
經(jīng)過(guò)NCBIblast分析，上述cDNA序列與禾本科的GSHI同源，證明實(shí)驗(yàn)得到的就是蘆葦?shù)摩?谷氨酰-半胱氨酸合成酶基因，命名為蘆葦γ-谷氨酰-半胱氨酸合成酶基因PcGCS。
實(shí)施例2、植物表達(dá)載體的構(gòu)建2.1目的基因的獲得引物設(shè)計(jì)及PCR反應(yīng)的體系和條件(1)設(shè)計(jì)如下一對(duì)PCR擴(kuò)增引物，引入植物表達(dá)載體pROK2(購(gòu)自寶生物工程有限公司)中所含有的兩個(gè)酶切位點(diǎn)SacI和XbalI。
P115’-CGAGCTCGA TGG AAG AAA ACC ATG TTA TCG-3’SacIP125’-GCTCTAGAGCTCA GTA TAA CAA GTG CTC G-3’XbalI(2)PCR反應(yīng)體系10×PCR buffer 2μlMgCl2(25mmol/L) 1.5μldNTP(each 250μmol/L)0.2μlP11(4μmol/L)1μlP12(4μmol/L)1μl重組質(zhì)粒pGEM-GCS 1μlrTaq(TaKaRa) 0.2μl無(wú)菌水 13.1μl(3)PCR反應(yīng)條件為94℃5min；94℃30sec，60℃30sec，72℃2min，35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸7min。PCR產(chǎn)物電泳回收后用于后面的反應(yīng)。
2.2表達(dá)載體的構(gòu)建將帶有SacI，XbalI酶切位點(diǎn)的cDNA與質(zhì)粒分別進(jìn)行SacI和XbalI的雙酶切，再按照5∶1的比例在T4連接酶的催化下進(jìn)行過(guò)夜連接。反應(yīng)體系及條件如下(1)酶切反應(yīng)體系和條件
cDNA/SacI+XbalI6μlSacI 1μl10X Buffer 2μlddH2O 1μl上表體系30℃1h，下表體系37℃1h原反應(yīng)液 10μlXbalI 1μl0.1％BSA 2μl0.1％TritonX-100 2μl10X Buffer 2μlddH2O 3μl(2)質(zhì)粒酶切反應(yīng)體系和條件pROK2質(zhì)粒 6μlSacI 1μl10X k Buffer 2μlddH2O 1μl上表體系30℃1h，下表體系37℃1h原反應(yīng)液 10μlXbalI 1μl0.1％BSA 2μl0.1％TritonX-100 2μl10X H Buffer 2μlddH2O 3μl連接反應(yīng)用T4 DNA Ligase進(jìn)行，體系和條件同pGEM-T的連接體系和條件。用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，從卡那霉素抗性的菌落中篩選出重組子，提取陽(yáng)性克隆pROK-GCS的質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定和雙酶切鑒定，反應(yīng)體系和條件同鑒定重組子。
2.3測(cè)序?qū)⒑兄亟M質(zhì)粒的陽(yáng)性菌株送上海博亞生物技術(shù)有限公司測(cè)序，得到的測(cè)序結(jié)果經(jīng)過(guò)NCBIblast分析，陽(yáng)性質(zhì)粒中確實(shí)含有蘆葦γ-谷氨酰-半胱氨酸合成酶基因PcGCS的cDNA序列。至此得到了重組表達(dá)載體，即含基因PcGCS的植物表達(dá)載體pROK-GCS。
實(shí)施例3、蘆葦γ-谷氨酰-半胱氨酸合成酶基因PcGCS的功能驗(yàn)證3.1酵母表達(dá)載體的構(gòu)建3.1.1目的基因的獲得(1)引物設(shè)計(jì)設(shè)計(jì)一對(duì)PCR擴(kuò)增引物(P9、P10)引入酵母表達(dá)載體pDR195(購(gòu)自寶生物工程有限公司)中所含有的兩個(gè)酶切位點(diǎn)BamHI和NotI。
P95’CGG GAT CCA TGG AAG AAA ACC ATG TTA TCG 3’BamHIP105’ATT TGC GGC CGC TCA GTA TAA CAA GTG CTC G 3’NotI
(2)PCR反應(yīng)體系10×PCR buffer2μlMgCl2(25mmol/L) 1.5μldNTP(each 250μmol/L) 0.2μlP9(4μmol/L) 1μlP10(4μmol/L) 1μl重組質(zhì)粒pGEM-GCS 1μlrTaq(TaKaRa) 0.2μl無(wú)菌水13.1μl(3)PCR反應(yīng)條件為94℃5min；94℃30sec，60℃30sec，72℃2min，35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸7min。PCR產(chǎn)物電泳回收后用于后面的反應(yīng)。
3.1.2表達(dá)載體的構(gòu)建步驟將帶有BamHI和NotI酶切位點(diǎn)的cDNA與質(zhì)粒分別進(jìn)行BamHI和NotI的雙酶切，再按照5∶1的比例在T4連接酶的催化下進(jìn)行過(guò)夜連接。反應(yīng)體系及條件如下(1)cDNA酶切反應(yīng)體系和條件cDNA/BamHI+Notl 6μlBamHI 1μl10X k Buffer2μlddH2O 1μl上表體系30℃1h，下表體系37℃1h原反應(yīng)液10μlNotI1μl0.1％BSA2μl0.1％TritonX-1002μl10x H Buffer2μlddH2O 3μl(2)質(zhì)粒酶切反應(yīng)體系和條件pDR195質(zhì)粒 6μlBamHI 1μl10x k Buffer2μlddH2O 1μl上表體系30℃1h，下表體系37℃1h原反應(yīng)液10μlNotl1μl0.1％BSA2μl0.1％TritonX-1002μl10X H Buffer2μlddH2O 3μl
連接反應(yīng)用T4 DNA Ligase進(jìn)行，體系和條件同T載體的連接體系和條件。用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，從卡那霉素抗性的菌落中篩選出重組子，得到酵母表達(dá)載體pDR-GCS。提取陽(yáng)性克隆pDR-GCS的質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定和雙酶切鑒定，反應(yīng)體系和條件同鑒定重組子。
3.2DNA導(dǎo)入酵母(1)挑取酵母菌株(野生型釀酒酵母)的單克隆，接種至10ml液體YPD培養(yǎng)基，30℃，200rpm，培養(yǎng)2-3天；(2)按照1∶50的比例將菌液轉(zhuǎn)移至50ml YPD液體培養(yǎng)基中30℃，200rpm，培養(yǎng)3～5h，此時(shí)的菌液OD0.4～0.6。
(3)將菌液分裝至10ml無(wú)菌離心管中，每管5ml；(4)3000rpm離心5min，收集細(xì)胞。用2.5ml無(wú)菌ddH2O重懸菌體；(5)3000rpm離心5min，收集細(xì)胞。用0.1ml 100mM(1×)LiAc/TE buffer重懸菌體；(6)3000rpm離心1～2min沉淀細(xì)胞(僅需將菌體離心至離心管底即可)，用微量移液器小心吸走上清；(7)用50μl 100mM(1×)LiAc/TE buffer重懸菌體，將菌懸液移至滅菌的1.5mlEppendorf管中；(8)將1ml單鏈擔(dān)體DNA煮沸5min，快速在冰水中冷卻；(注無(wú)需每次使用時(shí)都煮沸擔(dān)體DNA，可分裝成小份凍存；凍融3～4次后應(yīng)再煮沸，取出后應(yīng)保持在冰上)(9)將步驟7準(zhǔn)備的樣品，3000rpm離心1～2min沉淀細(xì)胞，用微量取樣器小心吸走上清；(10)按下列順序加入240μl PEG(50％w/v)(加入后用槍頭上下吹打，盡量將菌體懸浮)；36μl 1M(10×)LiAc；25μl單鏈擔(dān)體DNA(2.0mg/ml)50μl水和質(zhì)粒DNA(0.1～10μg)(一般情況下，質(zhì)粒加入10～40μl即可)；(11)渦旋振蕩Eppendorf管1min，直到細(xì)胞完全混勻，30℃水浴30min；(12)42℃水浴中熱激20～25min；(13)5000rpm離心1～2min，用微量移液器除去轉(zhuǎn)化混合液；(14)吸取0.2～1.0ml無(wú)菌水加到每個(gè)反應(yīng)管中，用移液器輕輕抽提以懸浮沉淀；(15)取50μl轉(zhuǎn)化液，均勻涂布在含卡那霉素抗性的培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)2～4d。用未轉(zhuǎn)化的酵母做對(duì)照。
3.3酵母重組子的鑒定3.3.1菌落PCR鑒定初篩(1)平板上的菌落長(zhǎng)到肉眼可見(jiàn)時(shí)。
(2)將除了模板以外的其他PCR反應(yīng)液組分準(zhǔn)備好，并分裝。
(3)用一根滅菌牙簽挑取菌落，在PCR管中測(cè)一下，放入一個(gè)滅菌的1.5ml離心管，對(duì)PCR管和1.5ml離心管編號(hào)。
(4)PCR擴(kuò)增，0.8％瓊脂糖凝膠電泳。對(duì)PCR擴(kuò)增顯現(xiàn)特異性條帶的克隆，置于1.5ml離心管中的半截牙簽扔到5mlYPD培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)，24±1小時(shí)提取DNA，用DNA作為模板再進(jìn)行PCR進(jìn)一步確定。
PCR反應(yīng)體系及條件如下10×PCR buffer 2μlMgCl2(25mmol/L)1.5μl
dNTP(each 250μmol/L) 0.2μlP0(4μmol/L) 1μlP1(4μmol/L) 1μl菌液 1μlrTaq(TaKaRa) 0.2μl無(wú)菌水 13.1μlPCR反應(yīng)條件為94℃5min；94℃30sec，60℃30sec，72℃2min，35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸7min。
3.3.2酵母總DNA為模板進(jìn)行二次鑒定酵母基因組的提取(1)接種重組和空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子于5ml MD培養(yǎng)基，菌于YPD培養(yǎng)基作對(duì)照，30℃，培養(yǎng)16-18小時(shí)。
(2)室溫下，1500g離心5-10min收集菌體。
(3)100uL TE(pH7.0)重懸后1500g離心5-10min收集菌體。
(4)用2ml的SCED(PH7.5)重懸。
(5)加入1～3mg蝸牛酶，37℃，50min。
(6)加入2ml 1％SDS，輕搖混勻，然后置于冰上5min。
(7)加入1.5ml 5M醋酸鉀，輕輕混勻。
(8)10000g離心5-10min，棄上清。
(9)加入2倍體積無(wú)水乙醇，室溫放置15min。
(10)10000g離心20min，棄上清。
(11)加入0.7mlTE緩沖液。
(12)加入等體積的苯酚∶氯仿(1∶1 V/V)。
(13)加入1/2體積的7.5M醋酸銨溶液。
(14)加入2倍體積的無(wú)水乙醇，-20℃放置1hr。
(15)10000g離心20min。
(16)加入lml 75％乙醇漂洗沉淀一次。
(17)干燥后，加入50ul的TE或H2O溶解，-20℃?zhèn)溆谩?br> PCR反應(yīng)體系的組成和反應(yīng)條件同菌落PCR，PCR產(chǎn)物0.8％瓊脂糖凝膠電泳分析。
3.4GCS含量測(cè)定3.4.1溫差破碎法提取GCS酵母發(fā)酵液4000r/min離心5min，收集菌體，菌體加水-20冰凍過(guò)夜，沸水浴煮沸5min，離心上清液用于測(cè)定。
DTNB處理方法每1mL待測(cè)樣品或標(biāo)準(zhǔn)品加入3mL 0.15mol/LNaOH溶液中，搖勻，加入體積分?jǐn)?shù)U＝0.03甲醛1mL，搖勻，靜置2min加入5mLDTNB分析溶液，搖勻，在25水浴保溫5min。
3.4.2標(biāo)準(zhǔn)品的制備準(zhǔn)確稱量1.00g/L GCS標(biāo)準(zhǔn)溶液，50.00mg GCS溶于雙蒸水中，在50mL容量瓶中定容，避光放置，當(dāng)日現(xiàn)配。分別取0.10，0.20，0.40，0.80，1.00mL的GCS標(biāo)準(zhǔn)溶液經(jīng)DTNB處理后，進(jìn)行測(cè)定，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。見(jiàn)圖4
3.4.3樣品的測(cè)定挑取六個(gè)轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性克隆J-1，J-2，J-3，J-4，J-5，J-6和六個(gè)未轉(zhuǎn)基因克隆w-1，w-2，w-3，w-4，w-5，w-6，進(jìn)行測(cè)量統(tǒng)計(jì)。
(1)分別挑取陽(yáng)性克隆和未轉(zhuǎn)化的克隆至30ml培養(yǎng)基中，培養(yǎng)過(guò)夜。
(2)取15ml菌液4000r/min離心5min，水洗兩次，收集菌體。
(3)85℃烘干至恒重，稱量。
(4)另外15ml菌液用溫差破碎法處理。
(5)上清液由DTNB處理。
(6)測(cè)定樣品在波長(zhǎng)412nm處的吸光度，通過(guò)計(jì)算或從標(biāo)準(zhǔn)曲線上得出GCS含量。
表1樣品中GCS的質(zhì)量濃度

表2樣品干重

表3樣品中GCS的含量

對(duì)表2和3中的兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，可以得出結(jié)論，轉(zhuǎn)基因酵母與未轉(zhuǎn)基因的酵母相比，干重并無(wú)顯著變化而GCS含量提高了30％。
實(shí)施例4、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的蘆葦γ-谷氨酰-半胱氨酸合成酶基因PcGCS的剪股穎轉(zhuǎn)化4.1DNA導(dǎo)入農(nóng)桿菌4.1.1農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備(1)活化農(nóng)桿菌AGL1(購(gòu)自寶生物工程有限公司)，然后挑取單菌落到10mlYEP中，28℃振搖過(guò)夜。
(2)取2ml菌液于100mlYEP中稀釋，28℃振搖過(guò)夜。將菌液倒入離心管后，冰上放置10min，然后于4℃下3000g離心10min后去上清。
(3)用預(yù)冷的0.05mol/L的CaCl2溶液每管5ml輕輕懸浮細(xì)胞，冰上放置15-30min后，4℃下3000g離心10min。
(4)棄去上清，用含15％甘油的預(yù)冷的。0.05mol/L的CaCl2溶液每管1ml輕輕懸浮細(xì)胞，冰上放置幾分鐘后，即成感受態(tài)細(xì)胞懸液。
(5)將感受態(tài)細(xì)胞分裝成200μl的小份，-70℃保存待用。
4.1.2轉(zhuǎn)化(1)向200μl農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞中加入0.5-1.0μg重組質(zhì)粒pGEM-GCS，冰上放置5min后，立即放入液氮中5min。取出離心管，37℃保溫5min后，用1mLYEP在無(wú)菌條件下稀釋，28℃振搖2-4h。
(2)取200涂布于含50mg/L卡那霉素(Kan)和40mg/L利福平(Rio)的YEP平板中，28℃培養(yǎng)得到單菌落。
4.1.3轉(zhuǎn)化鑒定(1)挑取農(nóng)桿菌單菌落，擴(kuò)增抽提重組質(zhì)粒pGEM-GCS。
(2)將重組質(zhì)粒pGEM-GCS轉(zhuǎn)化至DH10B感受態(tài)細(xì)胞并進(jìn)行鑒定。
4.2農(nóng)桿菌介導(dǎo)的剪股穎轉(zhuǎn)化(1)草坪草愈傷組織的誘導(dǎo)剪股穎種子在70％乙醇中浸泡30sec，經(jīng)10％NaClO消毒10min，無(wú)菌水漂洗8次，接種于愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，得到的愈傷用同樣的培養(yǎng)基繼代。
(2)篩選培養(yǎng)基選擇壓力的確定將未轉(zhuǎn)化的剪股穎愈傷組織轉(zhuǎn)移到含不同卡那霉素濃度(0，5，10mg/L)的繼代培養(yǎng)基上，25℃暗培養(yǎng)兩周，然后轉(zhuǎn)移到新的含相應(yīng)卡那霉素濃度的繼代培養(yǎng)基上繼續(xù)25℃暗培養(yǎng)兩周。結(jié)果如圖2所示。
4.2.1農(nóng)桿菌準(zhǔn)備(1)從-70℃冰箱取出含重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌AGL1，于含有抗生素的LB固體培養(yǎng)基上活化。
(2)兩天后YEP培養(yǎng)基上長(zhǎng)出農(nóng)桿菌單菌落，挑取單菌落于含有抗生素的10ml液體培養(yǎng)基中振搖培養(yǎng)。
(3)兩天后，液體培養(yǎng)的農(nóng)桿菌OD600為0.8±0.01，將農(nóng)桿菌劃線培養(yǎng)于含有抗生素的固體培養(yǎng)基上。用來(lái)轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌在培養(yǎng)基上需要生長(zhǎng)3天左右。
4.2.2轉(zhuǎn)化方法(1)草坪草愈傷組織轉(zhuǎn)移到新鮮的繼代培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)7天。
(2)農(nóng)桿菌在固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)3天后，離心收集農(nóng)桿菌再懸浮培養(yǎng)在含乙酰丁香酮的繼代培養(yǎng)基上，使初始的OD600＝0.8。
(3)將預(yù)培養(yǎng)的愈傷收集到無(wú)菌的三角瓶中，倒入上述的農(nóng)桿菌液，浸沒(méi)愈傷，靜置30min，接著用無(wú)菌濾紙吸干愈傷表面多余菌液后，轉(zhuǎn)移到鋪有濾紙的共培養(yǎng)基上共培養(yǎng)3天。
(4)共培養(yǎng)3天后，從共培養(yǎng)基上收集愈傷到三角瓶中，經(jīng)過(guò)如下洗滌先用無(wú)菌水漂洗愈傷，然后用加有Cef(頭孢霉素)的繼代培養(yǎng)基洗，這樣作為一個(gè)循壞，洗2-3個(gè)循環(huán)，然后無(wú)菌濾紙吸干。
(5)然后將愈傷組織轉(zhuǎn)移到選擇培養(yǎng)基上，進(jìn)行篩選。
(6)經(jīng)過(guò)一個(gè)月(兩輪)的篩選后，將愈傷組織轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上進(jìn)行再分化。
(7)再分化的愈傷轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)。
4.3CTAB法提取轉(zhuǎn)基因植株基因組DNA(1)稱取0.5g的剪股穎葉子，剪碎后用液氮研磨，迅速將粉末轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中，然后加入700μl預(yù)熱至65℃的2xCTAB提取緩沖液及0.1％的疏基乙醇，輕輕顛倒離心管混勻，然后置于65℃水浴保溫2h，不時(shí)顛倒混勻。
(2)混合物冷卻至室溫后加入等體積的酚∶氛仿∶異戊醇(25∶24∶1)，4℃下10000g離心10min。
(3)將水相轉(zhuǎn)移至一干凈離心管中，加入等體積的氯仿∶異戊醇(24∶1)，4℃下10000g離心10min。
(4)將水相轉(zhuǎn)移至一干凈離心管中，加入兩倍體積無(wú)水乙醇，溫和混勻，-20℃放置30min沉淀DNA。
(5)4℃下10000g離心10min，棄去液體，并用70％乙醇洗滌兩次，室溫干燥DNA后，加入100閃含無(wú)DNA酶的RNA酶的TE液溶解，37℃水浴30min(6)加入200μl無(wú)水乙醇，溫和混勻，-20℃放置30min沉淀DNA.4℃下10000g離心10min，棄去液體，并用70％乙醇洗滌兩次，室溫干燥DNA后，加入40μl無(wú)菌水溶解DNA，4℃保存待用。
4.4PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植株以CTAB法提取的DNA為模板，PCR法擴(kuò)增蘆葦γ-谷氨酰-半胱氨酸合成酶基因PcGCS(1)PCR反應(yīng)體系10×PCR buffer 2μlMgCl2(25mmol/L) 1.5μldNTP(each 250μmol/L) 0.2μlP11(4μmol/L) 1μlP12(4μmol/L) 1μlDNA模板1μlrTaq(TaKaRa) 0.2μl無(wú)菌水 13.1μl(2)PCR反應(yīng)程序94℃5min；94℃30sec，50℃30sec，72℃2min，35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸7min。
反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)液于0.8％TAE瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。結(jié)果如圖3所示，得到了5株陽(yáng)性植株。
4.5陽(yáng)性植株富集Cd離子的能力將陽(yáng)性植株和非轉(zhuǎn)基因植株分別轉(zhuǎn)到含有5mM的CdCl2IB培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，結(jié)果轉(zhuǎn)基因的陽(yáng)性植株能夠存活11天，而非轉(zhuǎn)基因植株生長(zhǎng)到6天時(shí)間葉子幾乎全變黃而死去。
注上述實(shí)驗(yàn)中用到的試劑等購(gòu)自TAKARA、Promega、Sigma等公司。
實(shí)驗(yàn)中用到的LB培養(yǎng)基配方0.5％酵母粉、1％NaCl、1％蛋白胨。
繼代培養(yǎng)基配方MS培養(yǎng)基+2ppm2，4-D。
生根培養(yǎng)基配方MS培養(yǎng)基+0.5ppmIAA+0.5ppm6-BA。
其它試劑配方見(jiàn)《分子克隆》第三版。
序列表<110>山東大學(xué)<120>蘆葦γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因PcGCS及其應(yīng)用<141>2007-5-22<210>1<211>1125<212>cDNA<213>蘆葦<400>1atggaagaaa accatgttat cggtctcaag cagggaaagc aaagcatttc gctagaacct60ggtggccagt ttgaacttag cggtgctcct cttgaaacat tacatcaaac ttgtgctgag120gtcaattcac atctttatca ggtcaaagca gttggagaag aaatgggtat aggatttctt180ggacttggtt ttcagccgaa gtgggcgctg agtgatatac caataatgcc caagggaaga240tacgaaataa tgaggaatta catgcctaaa gttggttctc ttggccttga tatgatgttc300cgcacgtgca ctgttcaggt taatcttgac ttcagttcag agaaggatat gataaggaaa360tttcgtgcta gccttgcatt gcaacctatt gcaacagcaa tatttgctaa ttctcccttt420aaagaaggaa aaccaaatgg gtttctcagc ttaagaagcc atatctggac agatactgat480aacaaccgct ctgggatgct tccttttgtc tttgatgact cgtttggatt tgagcaatat540gtggattatg cattagatgt cccaatgtat tttgtatatc gaaataagaa gtacattgac600tgtaccggaa tgccatttcg ggattttatg gaaggaaagc tcccacaagc tcctggggag660ttgcctactc taaatgattg ggagaaccat ctaacaacaa tttttcctga ggttaggttg720aagagataca tagagatgcg gggtgctgat ggtggcccat ggaggagatt gtgtgctttg780cctgcatttt gggttgggct gttatatgac gaggaatcat tacaaagcat tttggatatg840acttttgatt ggacaaagga agagagagag atgctacgac ggaaggtacc gttgactggt900ttgaagacac catttcgtga cggatatgta agagatttag gtgaagatgt tctaaaatta960gccaagagtg gactagaaag aagaggatac aaggaggttg gtttcttgag agaggtcgac1020gaagtagtga gaacaggagt gacaccttct gagaggcttt tgaatctgta cgagaccaag1080tggcaacgca gcgtggaccc tgtcttcgag cacttgttat actga1125<210>2<211>12883<212>DNA<213>人工序列<400>2ccgggctggt tgccctcgcc gctgggctgg cggccgtcta tggccctgca aacgcgccag60aaacgccgtc gaagccgtgt gcgagacacc gcggccgccg gcgttgtgga tacctcgcgg120
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1.蘆葦γ-谷氨酰-半胱氨酸合成酶基因PcGCS，其特征在于所述基因cDNA序列如序列表SEQ ID No.1所示。
2.一種含有權(quán)利要求1所述基因PcGCS的植物表達(dá)載體pROK2，其特征在于所述載體克隆區(qū)域核苷酸序列如序列表SEQ ID No.2所示。
3.權(quán)利要求1所述蘆葦γ-谷氨酰-半胱氨酸合成酶基因PcGCS在培育抗重金屬植物中的應(yīng)用。
4.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述植物是剪股穎，其含有權(quán)利要求1所述的蘆葦γ-谷氨酰-半胱氨酸合成酶基因PcGCS。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種蘆葦γ－谷氨酰－半胱氨酸合成酶基因PcGCS及所述基因PcGCS的植物表達(dá)載體，本發(fā)明還公開(kāi)了所述基因PcGCS在培育抗重金屬植物特別是剪股穎中的應(yīng)用。實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明所述轉(zhuǎn)基因植株比非轉(zhuǎn)基因植株的富集重金屬的能力得到了很大程度的提高。
文檔編號(hào)C12N9/00GK101067136SQ200710014450
公開(kāi)日2007年11月7日 申請(qǐng)日期2007年5月23日 優(yōu)先權(quán)日2007年5月23日
發(fā)明者向鳳寧, 趙翠珠, 夏光敏, 于延沖, 喬孟 申請(qǐng)人:山東大學(xué)