專利名稱：一種同時(shí)檢測牛輪狀病毒與牛病毒性腹瀉病毒的雙重rt－pcr方法及專用試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種同時(shí)檢測牛輪狀病毒與牛病毒性腹瀉病的方法，尤其涉及一種同時(shí)檢測牛輪狀病毒與牛病毒性腹瀉病毒的雙重RT-PCR方法及專用試劑盒。
背景技術(shù)：
牛輪狀病毒(bovine rotavirus，BRV)和牛病毒性腹瀉病毒(bovine viral diarrheavirus，BVDV)是兩種引起牛病毒性腹瀉的重要病原體。BRV可引起新生犢牛嚴(yán)重腹瀉，英國的調(diào)查顯示，其發(fā)病率為60-80％，給養(yǎng)牛業(yè)造成很大經(jīng)濟(jì)損失。BVDV也是一種廣泛存在于世界各國牧場牛群中的病原體，國內(nèi)王新平等對內(nèi)蒙古、吉林、寧夏等不同地區(qū)進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)其感染率為16.5-89％。目前隨著我國奶牛養(yǎng)殖業(yè)規(guī)模化、集約化程度的提高，牛腹瀉病特別是新生犢牛腹瀉病成為困擾我國奶牛養(yǎng)殖業(yè)的主要疾病之一，嚴(yán)重阻礙了我國奶牛養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。腹瀉病的病原有多種，主要包括細(xì)菌性病原和病毒性病原。近年來隨著奶牛養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大，由多種病原的混合感染的病例在臨床上屢見不鮮。輪狀病毒與牛病毒性腹瀉病毒的混合感染就是其中的一種，發(fā)病率雖然較低，但死亡率很高，達(dá)70％以上。另外由這兩種病原引起的腹瀉癥狀相似，臨床上很難區(qū)分。
目前，已有多種檢測BRV和BVDV的方法，如病毒分離法、中和試驗(yàn)、瓊擴(kuò)試驗(yàn)、電鏡觀察、ELISA、核酸探針、RT-PCR等，但特異性的針對牛腹瀉病的快速診斷方法研究較少，傳統(tǒng)的病毒分離、電鏡觀察、中和試驗(yàn)等方法耗時(shí)長，需7-10天才能出診斷結(jié)果，而ELISA、瓊擴(kuò)試驗(yàn)、核酸探針等方法敏感性和特異性較差。另外，查閱國內(nèi)文獻(xiàn)資料尚沒有關(guān)于同時(shí)檢測牛輪狀病毒與牛病毒性腹瀉病毒的診斷方法的研究。因此，建立一種同時(shí)檢測牛輪狀病毒與牛病毒性腹瀉病毒的快速診斷方法對于腹瀉病的流行病學(xué)調(diào)查、實(shí)驗(yàn)室快速鑒別診斷及疾病防治具有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明要解決的問題是利用雙重RT-PCR技術(shù)建立一種同時(shí)快速檢測牛輪轉(zhuǎn)病毒和牛病毒性腹瀉病毒的方法，并進(jìn)一步細(xì)化制備出相應(yīng)的診斷試劑盒，為牛腹瀉病的快速診斷和流行病學(xué)調(diào)查提供技術(shù)支持。
本發(fā)明所述的同時(shí)檢測牛輪狀病毒與牛病毒性腹瀉病毒的雙重RT-PCR方法，步驟包括樣品的采集，病毒RNA的提取，特異性引物的設(shè)計(jì)，RT-PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果判定；其特征在于所述特異性引物包括牛輪狀病毒特異性擴(kuò)增引物和牛病毒性腹瀉病毒特異性擴(kuò)增引物，其序列是牛輪狀病毒所用的特異性擴(kuò)增引物P15`-GTATGGTATTGAATATACCAC-3`，P25`-GATCCTGTTGGCCATCC-3`；牛病毒性腹瀉病毒所用的特異性擴(kuò)增引物P35`-GTAGTCGTCAGTGGTTCG-3`，P4 5`-GCCATGTACAGCAGAGAT-3`；所述RT-PCR擴(kuò)增采用兩步法，反轉(zhuǎn)錄時(shí)使用的引物為長9bp的隨機(jī)引物(5`-NNNNNNNNN-3`)，PCR反應(yīng)時(shí)在1個(gè)PCR反應(yīng)管中同時(shí)加入了牛輪狀病毒和牛病毒性腹瀉病毒的特異性上、下游引物P1、P2、P3、P4，其中RT-PCR反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為10μl，包含有RNA模板2μl，MgCl22μl，10倍反轉(zhuǎn)錄緩沖液1μl，DEPC處理水2.75μl，dNTP 1μl，RNase抑制劑0.25μl，AMV反轉(zhuǎn)錄酶0.5μl，隨機(jī)引物0.5μl；反應(yīng)條件為30℃10min，42℃30min，95℃5min，5℃5min；PCR反應(yīng)體系為50μl，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)后在反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)管中加入PCR緩沖液10μl，引物P1、P2、P3、P4各0.1μl，Taq酶0.25μl，滅菌三蒸水29.35μl；PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性2min，94℃30s，55℃30s，72 1min，共30個(gè)循環(huán)，然后72℃10min；所述結(jié)果判定是以陽性對照PCR產(chǎn)物電泳后產(chǎn)生的342bp和196bp條帶為標(biāo)準(zhǔn)對樣品的結(jié)果進(jìn)行判定，樣品結(jié)果產(chǎn)生342bp條帶的，判定為輪狀病毒感染；樣品結(jié)果產(chǎn)生196bp條帶的，判定牛病毒性腹瀉病毒感染；樣品結(jié)果同時(shí)產(chǎn)生342bp和196bp兩個(gè)條帶的，判定為牛輪狀病毒和牛病毒性腹瀉病毒混合感染；樣品結(jié)果沒有任何條帶的，則判為陰性。
本發(fā)明所述的同時(shí)檢測牛輪狀病毒與牛病毒性腹瀉病毒的雙重RT-PCR專用試劑盒，包括樣品病毒RNA提取試劑，反轉(zhuǎn)錄試劑盒，PCR試劑盒，陽性對照品和陰性對照品；其特征在于所述反轉(zhuǎn)錄試劑盒由15mM MgCl2，10倍反轉(zhuǎn)錄緩沖液，DEPC處理水；dNTP；RNase抑制劑；AMV反轉(zhuǎn)錄酶；50μM隨機(jī)引物組成，保存溫度-20℃；其反應(yīng)體系為MgCl22μl，10倍反轉(zhuǎn)錄緩沖液1μl，DEPC處理水2.75μl，dNTP 1μl，RNase抑制劑0.25μl，AMV反轉(zhuǎn)錄酶0.5μl，隨機(jī)引物0.5μl，RNA模板2μl；所述PCR試劑盒由PCR緩沖液，20mM牛輪狀病毒特異性擴(kuò)增引物和牛病毒性腹瀉病毒特異性擴(kuò)增引物P1、P2、P3、P4，Taq酶，滅菌三蒸水組成，保存溫度-20℃；其反應(yīng)體系為PCR緩沖液10μl，牛輪狀病毒所用的特異性擴(kuò)增引物P15`-GTATGGTATTGAATATACCAC-3`，P25`-GATCCTGTTGGCCATCC-3`；牛病毒性腹瀉病毒所用的特異性擴(kuò)增引物P35`-GTAGTCGTCAGTGGTTCG-3`，P45`-GCCATGTACAGCAGAGAT-3`各0.1μl，Taq酶0.25μl，滅菌三蒸水29.35μl。
RT-PCR方法可以針對不同的靶序列進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的診斷，在國內(nèi)外得到了廣泛應(yīng)用。本發(fā)明依據(jù)RT-PCR方法針對牛輪狀病毒和牛病毒性腹瀉病毒設(shè)計(jì)了兩對特異性引物，建立了能夠同時(shí)檢測牛輪狀病毒與牛病毒性腹瀉病毒的雙重RT-PCR方法，可在一次RT-PCR反應(yīng)中同時(shí)檢測出引起牛腹瀉的兩種病毒(牛輪狀病毒和牛病毒性腹瀉病毒)，檢測敏感性為1pg病毒RNA，具有很好的特異性和敏感性，本發(fā)明方法與病毒分離、中和試驗(yàn)、ELISA、核酸探針等方法相比，明顯地降低了檢測成本和檢測時(shí)間，非常適于牛病毒性腹瀉病的試驗(yàn)室快速診斷和流行病學(xué)研究。
本發(fā)明方法與分別檢測兩種病毒的RT-PCR方法相比，同樣很大程度上降低了檢測時(shí)間和檢測成本，本發(fā)明方法僅需4個(gè)多小時(shí)即可出結(jié)果，每份樣品的檢測費(fèi)用也只有約30元。


圖11％瓊脂糖凝膠電泳示各個(gè)毒株RT-PCR檢測結(jié)果其中1.BVDV分離株；2.BVDV標(biāo)準(zhǔn)株；3.BRV和BVDV分離株；4.BRV和BVDV標(biāo)準(zhǔn)株(oregon C24v)；5.BRV CHLY分離株；6.BRV標(biāo)準(zhǔn)株(NCDV)。
圖2瓊脂糖凝膠電泳示分別提取牛輪狀病毒和牛病毒性腹瀉病毒的細(xì)胞培養(yǎng)物、雞輪狀病毒、豬瘟病毒以及正常細(xì)胞培養(yǎng)物RNA進(jìn)行RT-PCR試驗(yàn)結(jié)果(特異性擴(kuò)增結(jié)果)其中1.正常細(xì)胞培養(yǎng)物；2.豬瘟病毒；3.雞輪狀病毒；4.BRV和BVDV。
結(jié)果BRV和BVDV組能得到目的條帶，其它均沒有擴(kuò)增出任何條帶。
圖3瓊脂糖凝膠電泳示對不同濃度的RNA進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增檢測敏感性試驗(yàn)結(jié)果其中1. 1pg RNA；2. 10pgRNA；3. 100pg RNA；4. 1μg RNA。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)本方法能檢測出1pg的病毒RNA。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例11.樣品采集與處理采腹瀉牛糞便樣品約10g，將糞便樣品加滅菌生理鹽水制備成1∶5糞便懸液，4000rpm/min，離心10min，取上清備用；或尸體剖檢時(shí)采取腸系膜淋巴結(jié)、腸管粘膜或脾臟低溫保存送試驗(yàn)室，取以上組織樣品約5g，剪碎，加滅菌生理鹽水研磨，然后，4000rpm/min，離心10min，取上清備用。
2.樣品RNA模板的提取(1)取步驟1上清液500μl加入1.5ml離心管，然后加入500μl TRIZOL LS，充分混勻，室溫放置10min。
(2)加入200μl氯仿，用力振蕩，使溶液呈乳白色，無分相，室溫放置10min。
(3)4℃13000rpm/min離心15min，取上層液相移入另一離心管(勿吸動白色中間相)。
(4)加入等體積異丙醇，輕輕顛倒離心管充分混勻液體，室溫放置10min。
(5)4℃13000rpm/min離心15min，小心吸去上清。
(6)1ml 75％乙醇洗一遍，4℃ 8000rpm/min離心10min，小心吸去上清，干燥5min。
(7)加入10μl DEPC處理水，然后立即做反轉(zhuǎn)錄。若要保存，置-20℃，可保存1個(gè)月左右。
3.使用本發(fā)明所述RT-PCR方專用試劑盒進(jìn)行以下試驗(yàn)(1)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)反應(yīng)體系為10μl，在200μl的PCR反應(yīng)管中依次加入10倍反轉(zhuǎn)錄緩沖液1μl，DEPC處理水2.75μl，MgCl22μl，dNTP 1μl，隨機(jī)引物(5`-NNNNNNNNN-3`)0.5μl，RNA模板2μl，RNase抑制劑0.25μl，AMV反轉(zhuǎn)錄酶0.5μl。
反應(yīng)條件為30℃10min，42℃30min，95℃5min，5℃5min。
同時(shí)設(shè)1個(gè)陽性對照和1個(gè)陰性對照，反應(yīng)體系和反應(yīng)條件同上，不同的是分別以該試劑盒的陽性對照品(輪狀病毒和病毒性腹瀉病毒的RNA模板，其濃度為100ng/ul)和陰性對照品(DEPC水)代替樣品RNA。
(2)PCR反應(yīng)反應(yīng)體系為50μl。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)后在反轉(zhuǎn)錄管中加入PCR緩沖液10μl，牛輪狀病毒所用的特異性擴(kuò)增引物P15`-GTATGGTATTGAATATACCAC-3`，P25`-GATCCTGTTGGCCATCC-3`；牛病毒性腹瀉病毒所用的特異性擴(kuò)增引物P35`-GTAGTCGTCAGTGGTTCG-3`，P4 5`-GCCATGTACAGCAGAGAT-3`各0.1μl，Taq酶0.25μl，滅菌三蒸水29.35μl。
PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性2min，94℃30s，55℃30s，72℃1min，共30個(gè)循環(huán)，然后72℃10min。
(3)瓊脂糖凝膠電泳檢測各取5μl PCR產(chǎn)物與DL 2000Marker，分別與1μl加樣緩沖液混勻后加樣于1％的瓊脂糖凝膠，80V電泳30-40min，利用凝膠成像系統(tǒng)照相，分析電泳結(jié)果。
(4)結(jié)果判定首先看陽性管與陰性管PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果，陽性管PCR產(chǎn)物電泳后應(yīng)產(chǎn)生兩條帶，分別為342bp和196bp，而陰性管沒有條帶。然后再看樣品管的結(jié)果，如果產(chǎn)生342bp的條帶，判定為輪狀病毒感染；如果產(chǎn)生196bp的條帶，判定牛病毒性腹瀉病毒感染，如果產(chǎn)生342bp和196bp兩個(gè)條帶，判定輪狀病毒和牛病毒性腹瀉病毒混合感染；如果沒有任何條帶則判為陰性。
權(quán)利要求
1.一種同時(shí)檢測牛輪狀病毒與牛病毒性腹瀉病毒的雙重RT-PCR方法，步驟包括樣品的采集，病毒RNA的提取，特異性引物的設(shè)計(jì)，RT-PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果判定；其特征在于所述特異性引物包括牛輪狀病毒特異性擴(kuò)增引物和牛病毒性腹瀉病毒特異性擴(kuò)增引物，其序列是牛輪狀病毒所用的特異性擴(kuò)增引物P15`-GTATGGTATTGAATATACCAC-3`，P25`-GATCCTGTTGGCCATCC-3`；牛病毒性腹瀉病毒所用的特異性擴(kuò)增引物P35`-GTAGTCGTCAGTGGTTCG-3`，P4 5`-GCCATGTACAGCAGAGAT-3`；所述RT-PCR擴(kuò)增采用兩步法，反轉(zhuǎn)錄時(shí)使用的引物為長9bp的隨機(jī)引物(5`-NNNNNNNNN-3`)，PCR反應(yīng)時(shí)在1個(gè)PCR反應(yīng)管中同時(shí)加入了牛輪狀病毒和牛病毒性腹瀉病毒的特異性上、下游引物P1、P2、P3、P4，其中RT-PCR反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為10μl，包含有RNA模板2μl，MgCl22μl，10倍反轉(zhuǎn)錄緩沖液1μl，DEPC處理水2.75μl，dNTP 1μl，RNase抑制劑0.25μl，AMV反轉(zhuǎn)錄酶0.5μl，隨機(jī)引物0.5μl；反應(yīng)條件為30℃ 10min，42℃ 30min，95℃ 5min，5℃ 5min；PCR反應(yīng)體系為50μl，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)后在反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)管中加入PCR緩沖液10μl，引物P1、P2、P3、P4各0.1μl，Taq酶0.25μl，滅菌三蒸水29.35μl；PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性2min，94℃ 30s，55℃ 30s，72 1min，共30個(gè)循環(huán)，然后72℃ 10min；所述結(jié)果判定是以陽性對照PCR產(chǎn)物電泳后產(chǎn)生的342bp和196bp條帶為標(biāo)準(zhǔn)對樣品的結(jié)果進(jìn)行判定，樣品結(jié)果產(chǎn)生342bp條帶的，判定為輪狀病毒感染；樣品結(jié)果產(chǎn)生196bp條帶的，判定牛病毒性腹瀉病毒感染；樣品結(jié)果同時(shí)產(chǎn)生342bp和196bp兩個(gè)條帶的，判定為牛輪狀病毒和牛病毒性腹瀉病毒混合感染；樣品結(jié)果沒有任何條帶的，則判為陰性。
2.權(quán)利要求1所述的同時(shí)檢測牛輪狀病毒與牛病毒性腹瀉病毒的雙重RT-PCR專用試劑盒，包括樣品病毒RNA提取試劑，反轉(zhuǎn)錄試劑盒，PCR試劑盒，陽性對照品和陰性對照品；其特征在于所述反轉(zhuǎn)錄試劑盒由15mM MgCl2，10倍反轉(zhuǎn)錄緩沖液，DEPC處理水；dNTP；RNase抑制劑；AMV反轉(zhuǎn)錄酶；50μM隨機(jī)引物組成，保存溫度-20℃；其反應(yīng)體系為MgCl22μl，10倍反轉(zhuǎn)錄緩沖液1μl，DEPC處理水2.75μl，dNTP 1μl，RNase抑制劑0.25μl，AMV反轉(zhuǎn)錄酶0.5μl，隨機(jī)引物0.5μl，RNA模板2μl；所述PCR試劑盒由PCR緩沖液，20mM牛輪狀病毒特異性擴(kuò)增引物和牛病毒性腹瀉病毒特異性擴(kuò)增引物P1、P2、P3、P4，Taq酶，滅菌三蒸水組成，保存溫度-20℃；其反應(yīng)體系為PCR緩沖液10μl，牛輪狀病毒所用的特異性擴(kuò)增引物P15`-GTATGGTATTGAATATACCAC-3`，P25`-GATCCTGTTGGCCATCC-3`；牛病毒性腹瀉病毒所用的特異性擴(kuò)增引物P35`-GTAGTCGTCAGTGGTTCG-3`，P4 5`-GCCATGTACAGCAGAGAT-3`各0.1μl，Taq酶0.25μl，滅菌三蒸水29.35μl。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種同時(shí)檢測牛輪狀病毒與牛病毒性腹瀉病毒的雙重RT－PCR方法，包括樣品的采集，病毒RNA的提取，特異性引物的設(shè)計(jì)，RT－PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果判定等步驟；本發(fā)明同時(shí)還公開了同時(shí)檢測牛輪狀病毒與牛病毒性腹瀉病毒的專用試劑盒，包括樣品病毒RNA提取試劑，反轉(zhuǎn)錄試劑盒，PCR試劑盒，陽性對照品和陰性對照品。利用本發(fā)明方法和試劑盒可在一次RT－PCR反應(yīng)中同時(shí)檢測出引起牛腹瀉的兩種病毒，檢測敏感性為1pg病毒RNA，具有很好的特異性和敏感性，本發(fā)明方法與病毒分離、中和試驗(yàn)、ELISA、核酸探針等方法相比，明顯地降低了檢測成本和檢測時(shí)間，非常適于牛病毒性腹瀉病的試驗(yàn)室快速診斷和流行病學(xué)研究。
文檔編號C12Q1/68GK101063176SQ20071001445
公開日2007年10月31日 申請日期2007年5月23日 優(yōu)先權(quán)日2007年5月23日
發(fā)明者楊少華, 王長法, 高運(yùn)東, 楊宏軍 申請人:山東奧克斯生物技術(shù)有限公司