專利名稱：小麥體細(xì)胞雜種來源的低分子量谷蛋白亞基1-62的編碼序列與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及到小麥體細(xì)胞雜種小麥低分子量谷蛋白 亞基1-62編碼序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列與該基因在轉(zhuǎn)基因小麥優(yōu)質(zhì)育種中的應(yīng)用。
技術(shù)背景小麥?zhǔn)俏覈闹饕Z食作物之一，近年來我國的小麥育種不僅重視小麥產(chǎn)量而且開 始重視小麥的品質(zhì)。小麥面粉的品質(zhì)主要決定于谷粒中的谷蛋白多聚體，它的大小與性 質(zhì)影響了小麥面粉的粘彈性(Shewry and Tatham, 1990; Shewry et al， 2003)。成熟 小麥種子的貯藏蛋白主要由麥谷蛋白和醇溶蛋白組成。麥谷蛋白又可以分為高分子量麥 谷蛋白亞基(High molecular weight glutenin subunit, H麗-GS)和低分子量麥谷蛋 白亞基(Low molecular weight glutenin subunit, LMW-GS)，分別占10%和40%，對 小麥品質(zhì)起著主導(dǎo)作用。有研究證明，不同LMW -GS組成對面包加工品質(zhì)有不同影響， 而且LMW-GS能夠形成大聚合蛋白，與面團(tuán)筋力有顯著關(guān)系(PognaandKautran, 1990; Rui et al, 1993 ; Shewry and Tatham， 1997; Shewry et al， 2003 )。 因此，低 分子量麥谷蛋白亞基是影響面團(tuán)加工品質(zhì)的重要因素之一。研究表明，大部分低分子量麥谷蛋白亞基與大部分的Y -,全部的"-醇溶蛋白亞基 以相互緊密連鎖的方式存在于第一同組群的1A， 1B， ID染色體短臂末端(Shewry et al， 2003 )，與各自的染色體基因相對，標(biāo)記為A, ^/"-&, W"-ft，。Lew et al (1992)建議根據(jù)LMW-GS的氨基酸序列相似性進(jìn)行小麥的LMW-GS命名。 迄今，根據(jù)對其N-端測序和基因推導(dǎo)的氨基酸序列，L麗-GS可以分為s-型，m-型和i 型。隨著基因組PCR和RT-PCR在這一領(lǐng)域的應(yīng)用，近幾年人們得到了更多LMW-GS基因 序列 (see Mcintosh et al， s ' Catalogue of Gene Symbols for Wheat'， http:〃wheat. pw. usda. gov/ggpages/wgc)。低分子量麥谷蛋白的氨基酸序列除了信號 肽以外可以分為3個(gè)區(qū)域N-端保守區(qū)、N-端重復(fù)區(qū)和C-端保守區(qū)。 一般含有8個(gè)半 胱氨酸殘基。除了第一位和第七位的半胱氨酸殘基以外，其他6個(gè)半胱氨酸殘基位置相 對保守并形成分子內(nèi)二硫鍵，第一位和第七位的半胱氨酸殘基可形成分子間二硫鍵。在 它們之間以及它們與高分子量麥谷蛋白之間可以形成聚合物，由此產(chǎn)生小麥麥谷蛋白之 間的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，影響小麥面粉的彈性和延伸性，進(jìn)而影響小麥的品質(zhì)。Xuetal (2006) 用實(shí)驗(yàn)證實(shí)具有額外半胱氨酸殘基的低分子量谷蛋白亞基對大面團(tuán)的形成有貢獻(xiàn)。 一般 認(rèn)為，可以形成2個(gè)以上的分子間二硫鍵或/和含有較長的重復(fù)區(qū)的LMW-GS與優(yōu)質(zhì)相關(guān)。栽培小麥中的優(yōu)質(zhì)蛋白資源畢竟是有限的，而在長穗偃麥草等許多小麥的近緣種當(dāng) 中包含多種不同于小麥的蛋白亞基。長穗偃麥草(^ro/^/W7 e^/7卵^/z , StStStStEeEeEbEbExEx， 2n=70)，由于具有蛋白質(zhì)含量高和抗逆性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)成 為小麥育種中十分重要的野生資源之一(Xia et al， 2003)。通過普通小麥與長穗偃麥 草的遠(yuǎn)緣有性雜交，我國科學(xué)家已經(jīng)育成了一系列優(yōu)質(zhì)品種，例如小偃6號(Zhouetal， 1995)和小偃54 (Liu et al， 2001)。本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)成功獲得小麥與長穗偃麥草的屬
間體細(xì)胞雜種植株，并且產(chǎn)生大量株系， 一些體細(xì)胞雜交系已經(jīng)自交到了Fs代(Xiaet al， 2003; Liu et al， 2006)，從雜種后代中已獲得蛋白質(zhì)含量在20%以上的優(yōu)質(zhì)強(qiáng)筋 小麥新種質(zhì)和新品系及耐鹽(〉0. 5%)的小麥新品種"山融3號"?；蚪M原位雜交(GISH) 分析表明，長穗偃麥草染色體小片段漸滲到小麥基因組并且在后代穩(wěn)定遺傳(Wang et al， 2005);通過蛋白電泳、基因克隆與序列分析表明體細(xì)胞雜交獲得的普通小麥與長穗偃 麥草后代株系中，出現(xiàn)了不同于雙親的優(yōu)質(zhì)H麗-GS基因及組合如類似小麥的 他W腳7ft 7^r"+75y^(趙同金等，2003; Fengetal， 2004a，b; Liu et al， 2007)。 初步研究表明，這些優(yōu)質(zhì)雜種中也含有長穗偃麥草的或不同于雙親的LMW-GS基因(Chen et al， 2007)。對體細(xì)胞雜種小麥LMW-GS基因初步的序列分析表明，存在額外半胱氨 酸，有形成3-4個(gè)分子間二硫鍵的分子基礎(chǔ)，因而有可能對面粉品質(zhì)有正向作用(Xuet al， 2006)。因而推測，雜種的優(yōu)質(zhì)不僅與新的HMW-GS有關(guān)，而且與新的LMW-GS相關(guān)。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明是提供小麥體細(xì)胞雜種LMW-GS 1-62的編碼序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列與其 在小麥品質(zhì)改良方面的應(yīng)用。本發(fā)明所提供的小麥體細(xì)胞雜種LMW-GS 1-62的編碼基因來源于雜種株系11-12， 包括下列核苷酸序列1) 列表中SEQ ID NO. 1的DNA序列;2) 碼序列表SEQ ID N0.2中蛋白質(zhì)序列中的多核苷酸；3) 與序列表中SEQ ID NO. 1限定的DNA序列具有98%以上同源性，且編碼相同功能 的DNA序列。上述小麥低分子量谷蛋白亞基基因，優(yōu)選的編碼序列是序列表中的SEQ ID NO.l。 本發(fā)明還提供了含有上述小麥低分子量谷蛋白亞基基因的質(zhì)粒。 本發(fā)明還提供了含有上述小麥低分子量谷蛋白亞基基因的表達(dá)載體。 本發(fā)明所提供的小麥體細(xì)胞雜種低分子量谷蛋白亞基1-62的氨基酸序列指的是具 有SEQ ID NO. 2的氨基酸殘基序列。 本發(fā)明所述基因結(jié)構(gòu)特征本發(fā)明通過同源序列克隆技術(shù)，從11-12的基因組中鑒定分離得到的一個(gè)新的低分 子量谷蛋白基因。序列分析表明，該基因由啟始密碼ATG開始到雙終止密碼TGATAA結(jié) 束，包括一個(gè)無內(nèi)含子的924 bp開放閱讀框(編碼306個(gè)氨基酸殘基，去除兩個(gè)終止 密碼)，該基因的編碼序列和由DNA序列推導(dǎo)的氨基酸序列見序列表SEQ ID NO. 1和SEQ ID N0.2所示。推導(dǎo)的氨基酸序列顯示典型的LMW-GS—級序列結(jié)構(gòu)特點(diǎn) 一個(gè)由20個(gè) 氨基酸殘基組成的信號肽序列、N-端保守區(qū)、N-端重復(fù)區(qū)和C-端保守區(qū)。該序列由9 個(gè)半胱氨酸殘基組成，其中三個(gè)可以形成分子間二硫鍵，參與谷蛋白大聚體的形成，與 優(yōu)質(zhì)及其相關(guān)。該基因與克隆自小偃6號的亞基AY263369在DNA序列上有86%的相似性，其開放閱 讀框DNA的長度為918 bp,比基因7-&短，已經(jīng)證明AY263369能明顯促進(jìn)面粉面筋品 質(zhì)(Xu et al， 2006，theor appl genet)。 AY263369的推導(dǎo)序列有9個(gè)半胱氨酸殘基， 分布位置與1-62相似，因此推測具有類似Y17845結(jié)構(gòu)的1-62很可能是對面粉面筋品 質(zhì)有重要作用。
本發(fā)明所述的小麥低分子量谷蛋白亞基基因在轉(zhuǎn)基因小麥優(yōu)質(zhì)育種中具有極其廣 闊的應(yīng)用。


圖1為小麥體細(xì)胞雜種II-12低分子量谷蛋白亞基基因7-62的PCR擴(kuò)增 l或2:小麥體細(xì)胞雜種I1-12; M: Marker (入DNAAfcoR I。圖2為小麥體細(xì)胞雜種11-12低分子量谷蛋白亞基基因7-^"的原核表達(dá) 1，未轉(zhuǎn)化的菌體蛋白；2， IPTG誘導(dǎo)表達(dá)轉(zhuǎn)化菌體蛋白；3，未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的轉(zhuǎn)化 菌體蛋白；M，蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；箭頭指示表達(dá)蛋白位置。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例i小麥體細(xì)胞雜種n-12低分子量谷蛋白亞基基因7-^ 的分離、鑒定n-12的種子在黑暗條件下室溫萌發(fā)，使用CTAB法對萌發(fā)15天的幼苗進(jìn)行基因組DNA 的提取。LMW-GS基因特異性簡并引物序列為Pl，5， -GCATCAA/GACCAAGCAAA/CAC-3'; P2, 5， -TTATCAGTAGG/CCACCAACTC-3，。 PCR反應(yīng)程序95。C預(yù)變性5min， IO個(gè)循環(huán)；然 后以94'C/30 s，68。C/1 min(每個(gè)循環(huán)降l度)，72°C/90 s;進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；進(jìn)一步在94 °C/30 s,58。C/30 s， 72°C/90 s;最終在72。C延伸7min。 PCR產(chǎn)物在2. 0%瓊脂糖凝膠上 進(jìn)行電泳并回收(TIANGEN DNA回收試劑盒)。將PCR回收產(chǎn)物連到pMD18-T載體上，然后轉(zhuǎn)化f co7i DH10B感受態(tài)細(xì)胞。克隆轉(zhuǎn)化 方法參照分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(Sambrook et al， 1989)，鑒定出的陽性克隆進(jìn)行雙向兩 次測序，序列如SEQ ID NO. 1。利用MEGA 3. 1軟件以及NCBI和EBI等網(wǎng)站中的相關(guān)軟件進(jìn) 行序列分析和性質(zhì)鑒定，推導(dǎo)的氨基酸序列見SEQ ID NO. 2。含有基因7-6J的質(zhì)粒命名 為pMD18-7-6么并儲存于實(shí)驗(yàn)室超低溫冰箱中。實(shí)施例2小麥體細(xì)胞雜種11-12低分子量谷蛋白亞基基因fi^的原核表達(dá) 原核表達(dá)引物的設(shè)計(jì)選用的原核表達(dá)載體為pET-24a(Novagen)。根據(jù)克隆自小麥雜種 11-12的基因7-fi 的序列的信息設(shè)計(jì)引物，這些引物去除信號肽并且在產(chǎn)物兩端引入了 酶切位點(diǎn)以便于克隆到表達(dá)載體pET-24a中去。正向引物(下劃線為y\^W) : 5' - GCA CAT ATG ATG GAG ACT AGC TGC A -3，；反向引物(下劃線為fcc^/) :5'- CTA GAA TTC TTA TCA GTA GGC ACC AAC-3'。原核表達(dá)載體的構(gòu)建(1) PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)程序2XGC buffer I (50ul) ; 10mM dNTPs (4ul); 50uM表達(dá)引物各2yl; 質(zhì)粒DNA (50ng) ; 5U/ul LA Taq (0.5p1); ddH20補(bǔ)充至100 p 1。 PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序與實(shí)施例1。(2) 基因表達(dá)片段的克隆PCR擴(kuò)增的基因表達(dá)片段經(jīng)過1.0%瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下切割回收包含目的片段 的凝膠，用凝膠DNA回收試劑盒(Tiangen公司)回收目的片段，回收的目的片段與pUCm-T 載體進(jìn)行連接。連接轉(zhuǎn)化以及陽性克隆的篩選參照Sambrook et al (1989)方法進(jìn)行。(3) 基因表達(dá)片段的酶切及回收 10 X buffer H ( 5ul) ; Nde I (5U/ul， 2ul); EcoR I (5U/ul， 2ul);質(zhì)粒DNA (20ug) ; ddH20補(bǔ)充至50ul，反應(yīng)體系配制完成后37。 C水浴4hr;酶切產(chǎn)物經(jīng) 1.0%瓊脂糖凝膠電泳，回收目的片段，-20° C保存。(4) 表達(dá)載體的制備表達(dá)載體pET-24a保存在DH10B菌株里，用前在含卡那霉素(30 P g/ml)的平板上劃線過 夜活化，然后搖30ml菌液，提質(zhì)粒。表達(dá)載體的雙酶切10Xbuffer H (5ul ) ; Nde I (5U/ul， 2ul) ; EcoR I (5U/ul， 2ul) ; pET-24a (10ul) ; ddH20補(bǔ)足至50pl。酶切反應(yīng)體系配完后于37° C水浴4hr，酶切產(chǎn)物經(jīng) 1.0%瓊脂糖凝膠電泳，然后用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收載體片段，-20° C保存。(5) 基因表達(dá)片段與pET-24a載體連接連接反應(yīng)體系為10 XT4 buffer ( 2 u 1) ; T4連接酶(1 y 1) ; pET-24a載體片段(6 n 1); 基因表達(dá)片段(6u 1) ; ddH20 (5ul);反應(yīng)體系配制完成后16° C水浴連接過夜，連 接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH10B及陽性克隆的篩選使用EcoR I和Nde I進(jìn)行雙酶切鑒 定陽性克隆，方法同Sambrook et al (1989)。小麥體細(xì)胞雜種II-12低分子量谷蛋白亞基基因J-fi^的原核表達(dá)(1) 表達(dá)受體菌的制備及轉(zhuǎn)化表達(dá)受體菌為大腸桿菌BL21 (DE3) pLysS (Promega)。大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞的制 備方法按Sambrook et al (1989)的DH10B感受態(tài)細(xì)胞的制備方法進(jìn)行。取5ul陽性 表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞中，轉(zhuǎn)化時(shí)所用平板含有30ix g/ml的卡那霉 素，方法同Sambrook et al (1989)。(2) 蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)取帶有陽性表達(dá)質(zhì)粒的表達(dá)菌落接種于5ml含有30 P g/ml卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中， 37° C振蕩培養(yǎng)到0D6。。約為1.0時(shí)，吸出2ml菌液作為對照，在其余的培養(yǎng)液中加入IPTG 使其終濃度為1. OmM,然后繼續(xù)培養(yǎng)4hr誘導(dǎo)蛋白的表達(dá)。(3) 表達(dá)蛋白的提取及電泳分析未誘導(dǎo)和誘導(dǎo)的菌液都加入1. 5ml離心管中，10000rpm離心lmin收集菌體，棄上清， 加入100u 1蛋白提取液，旋渦振蕩混勻，沸水浴10min, 13000 rpm離心15min，上清 備用。表達(dá)蛋白的電泳分析按照文獻(xiàn)趙同金等(2003;山東大學(xué)學(xué)報(bào)理學(xué)版)的方法進(jìn) 行。 序列表〈110>山東大學(xué)<120>小麥體細(xì)胞雜種來源的低分子量谷蛋白亞基卜62的編碼序列與應(yīng)用<141> 2007-9-24<160〉2<210〉1<211〉924〈212〉GenomicDNA〈213〉小麥體細(xì)胞雜種來源的低分子量谷蛋白亞基1-62的可以表達(dá)的編碼DNA〈400〉13tg朋g3CCttcctcgtctttgcccttcta gccgttgtggcgacatctgccattgcacag60gctgcatccctggtttggagagaccatggc3gC3CC犯CCat tacaacaa120aaagagacatttcca>caaca<accaccatcttcacaacaacaacaacagcttctgcaacaB180caacaacaaccatttcctcaacaaccacca tttttgcagcaacaaccttcattttcgcag240caaccactatccagttctaccax^ccaa^ccagcattttcg300C3gC^C^Caaacagttctaccacaacaa ccagcattttcgcagcaaca360cttctgcaacaacaacaacaaatccctattgttcatccatccattttgca gcagctaaac420ccatgcaaggtattcctccagcagcagtgcatccctgtggcaatgcagcgatgtcttgct480aggtcacaagtgttgcagcagagcatttgccatgtgatgcagcaacaatgttgccagcaa540ttgcggcaaatccccgagcaatcccgccatgagtxaatccgtgctatcgtctactctatc600atcctgcagcacaacaacaacaacaacaac3gCgtC卿gtatcatccaa660t3tC3gC犯Caacaaccccaacagttgggccaatgtgtctcccaacccca acagcagttg720cagcagcaactcgggcaacaacctc已a(bǔ)caa caacaattg已cacatggtgcctttttgcag780cc3cacc3g3tagctcgccttg鄉(xiāng)tgatgacttccattgcactccgtaccctgccaacg840atgtgC3gtgtc犯tgtgccgttgtacagctccaccacta gtgcgccattaggcgttggc900acccgagttggtgcct已ctgat aa924<210>2〈211>306〈212>PRT<213>人工序列<400〉2Met Lys Thr Phe Leu Val Phe Ala Leu Leu Ala Val Val Ala Thr 5 10 15Ser Ala lie Ala Gin Met Glu Thr Ser Cys lie Pro Gly Leu Glu 20 25 30Arg Pro Trp Gin Gin Gin Pro Pro Gin Gin Gin Pro Pro Ser Phe Ser Pro Val Leu Pro Val Leu Pro Gin Leu Leu Gin Gin Leu Gin Gin Leu lie Pro Val Ala Gin Gin Ser lie Leu Arg Gin lie lie Val Tyr Ser Gin Gin Gin Gin Pro Gin Gin Leu Gin Gin Gin Leu Gly Ala Phe Leu Thr Ser lie Ala Val Pro Leu Tyr Thr Arg Val GlyHis35 Ser50 Phe65 Gin80 His95 Gin 110 Gin 125 Asn 140 Met 155 Cys 170 Pro 185 lie 200 Arg 215 Gly 230 Gly 245 Gin 260 Leu 275 Ser 290 Ala 305Gin Pro Leu Gin Ser Gin Gin Gin Pro Gin Gin Pro Gin Pro Leu Phe Gin Pro Ala Phe Pro Ala Phe Ser Gin Gin lie Pro Pro Cys Lys Val Gin Arg Cys Leu His Val Met Gin Glu Gin Ser Arg lie Leu Gin Gin Gin Ser lie lie Gin Cys Val Ser Gin Gin Pro Gin Pro His Gin lie Arg Thr Leu Pro Ser Thr Thr Ser TyrGin40 Gin55 Pro70 Ser85 Ser 100 Gin 115 lie 130 Phe 145 Ala 160 Gin 175 His 190 Gin 205 Gin 220 Gin 235 Gin 250 Ala 265 Thr 280 Ala 295Lys Glu Thr Phe Gin Leu Leu Gin Phe Leu Gin Gin Gin Lys Gin Gin Gin Gin Gin Gin Gin Gin His Gin Val His Pro Ser Leu Gin Gin Gin Arg Ser Gin Val Gin Cys Cys Gin Glu Ser lie Arg Gin Gin Gin Gin Tyr Gin Gin Gin Pro Gin Gin Gin Gin Gin Leu Thr Arg Leu Glu Val Met Cys Ser Val Pro Leu Gly ValPro45Gin60Gin75Gin90Thr105Gin120lie135Cys150Leu165Gin180Ala195Gin210Gin225Leu240His255Met270Asn285Gly300
權(quán)利要求
1.小麥體細(xì)胞雜種低分子量谷蛋白亞基1-62的編碼序列，是下列核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID NO.1的DNA序列；2)編碼序列表SEQ ID NO.2中蛋白質(zhì)序列中的多核苷酸；3)與序列表中SEQ ID NO.1限定的DNA序列具有98％以上同源性，且編碼相同功能的DNA序列。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的小麥低分子量谷蛋白亞基基因，其特征在于所述的小麥低 分子量谷蛋白亞基的編碼序列是序列表中的SEQ ID NO. 1。
3. 含有權(quán)利要求1所述的小麥低分子量谷蛋白亞基基因的質(zhì)粒。
4. 含有權(quán)利要求1所述的小麥低分子量谷蛋白亞基基因的表達(dá)載體。
5. 小麥體細(xì)胞雜種低分子量谷蛋白亞基1-62的氨基酸序列，指的是具有SEQIDN0.2 的氨基酸殘基序列。
6. 權(quán)利要求1所述的小麥低分子量谷蛋白亞基基因在轉(zhuǎn)基因小麥優(yōu)質(zhì)育種中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了小麥(Triticum aestivum)體細(xì)胞雜種來源的低分子量谷蛋白亞基1-62的編碼序列與應(yīng)用。本發(fā)明所提供的小麥低分子量谷蛋白亞基1-62的編碼序列包括1)序列表中SEQID NO.1的DNA序列；2)編碼序列表SEQID NO.2中蛋白質(zhì)序列中的多核苷酸；3)與序列表中SEQID NO.1限定的DNA序列具有98％以上的同源性，且編碼相同功能的DNA序列。小麥低分子量谷蛋白亞基氨基酸序列是基于其編碼序列推導(dǎo)的氨基酸序列，指的是具有SEQID NO.2的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。該基因可用于轉(zhuǎn)基因小麥優(yōu)質(zhì)育種工作。
文檔編號C12N15/29GK101157926SQ200710017098
公開日2008年4月9日 申請日期2007年9月25日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月25日
發(fā)明者夏光敏, 峰 趙, 陳凡國, 陳夢竹 申請人:山東大學(xué)