專利名稱：噬菌體芯片作為蛋白類芯片或基因芯片的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及噬菌體芯片的制備及其應(yīng)用，特別涉及展示外源抗原肽的噬菌體生物芯片的制備及其應(yīng)用。本發(fā)明將展示外源肽的不同噬菌體按照設(shè)計(jì)的陣列方式固定于芯片片基上，獲得噬菌體芯片，該芯片既可作為展示外源肽的蛋白類芯片，用于人體或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物各種樣本中抗體、配體和天然或人工合成物中特異性結(jié)合物的檢測(cè)、鑒定和篩選，也可作為基因芯片，用于特異性基因的檢測(cè)、鑒定和篩選。
背景技術(shù)：
生物芯片主要是指通過微加工和微電子技術(shù)在固體芯片表面構(gòu)建微型生物化學(xué)分析系統(tǒng)，以實(shí)現(xiàn)對(duì)生命機(jī)體的組織、細(xì)胞、蛋白質(zhì)、核酸、糖類以及其他生物組分進(jìn)行準(zhǔn)確、快速、大信息量的檢測(cè)。常見的生物芯片分為三類第一類為微陣列芯片，包括基因芯片(Gene chip，DNA chip，DNAmicroarray)、蛋白芯片(Protein chip)、細(xì)胞芯片和組織芯片(cell chip andtissue chip，cell microarray and tissue microarray)；第二類為微流控芯片(microfluid)(屬于主動(dòng)式芯片)，包括各類樣品制備芯片、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)芯片、毛細(xì)管電泳芯片和色譜芯片等；第三類為以生物芯片為基礎(chǔ)的集成化分析系統(tǒng)或稱芯片實(shí)驗(yàn)室(Lab-on-a-chip)。它是集分子生物學(xué)、免疫學(xué)、半導(dǎo)體、微電子、激光、化學(xué)染料等領(lǐng)域的最新科學(xué)研究成果于一體的前沿高新技術(shù)，其應(yīng)用幾乎涵蓋了生物、醫(yī)學(xué)、藥學(xué)、農(nóng)學(xué)、環(huán)保、法醫(yī)、衛(wèi)生學(xué)等所有生物技術(shù)的領(lǐng)域。生物芯片技術(shù)的突然崛起及其將帶來(lái)的巨大商業(yè)價(jià)值和應(yīng)用前景引起了世界各國(guó)的廣泛關(guān)注和重視，正在成為21世紀(jì)最具發(fā)展?jié)摿Φ纳锂a(chǎn)業(yè)之一。目前最為成熟，并廣泛使用的是基因芯片，但是，由于蛋白質(zhì)是各種生命現(xiàn)象的真正功能實(shí)現(xiàn)這和執(zhí)行者，因此，蛋白芯片將具有更為廣闊的應(yīng)用前景。但是，如何高通量獲得、純化各種不同的蛋白質(zhì)分子用于蛋白芯片的制備，仍舊存在諸多的技術(shù)瓶頸和難以克服的技術(shù)障礙。此外，由于蛋白質(zhì)有著較為復(fù)雜的空間結(jié)構(gòu)特征，將蛋白質(zhì)偶聯(lián)到芯片上有可能破壞蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)，使蛋白質(zhì)喪失活性。
特別對(duì)于分子量＞105道爾頓且結(jié)構(gòu)較復(fù)雜的蛋白質(zhì)，而言難度更大；再者，將大量物理和化學(xué)性質(zhì)不同的蛋白質(zhì)分子偶聯(lián)道同一芯片片基上時(shí)，芯片片基的處理技術(shù)也是必需考慮的問題和技術(shù)難點(diǎn)。正因?yàn)槿绱?，將物理化學(xué)性質(zhì)基本相同而生物活性不同的抗體偶聯(lián)于同一張芯片片基制備蛋白質(zhì)抗體芯片的技術(shù)難度較低，而發(fā)展迅速外，蛋白質(zhì)芯片的發(fā)展仍面臨諸多技術(shù)問題。因此，研發(fā)新型的生物芯片具有極其重要的意義。
1985年，Smith在前人對(duì)絲狀噬菌體分子生物學(xué)研究的基礎(chǔ)上首先提出了噬菌體展示(phage display)技術(shù)。其基本原理是通過利用化學(xué)合成、隨機(jī)突變、酶切和PCR等方法建立編碼多肽、蛋白或抗體文庫(kù)的DNA片段，將外源DNA片段插入噬菌體編碼蛋白基因PIII或PVIII中，使外源DNA片段對(duì)應(yīng)的表達(dá)產(chǎn)物融合在噬菌體的外殼蛋白中形成融合蛋白，呈現(xiàn)在噬菌體表面，然后收集這種重組噬菌體在宿主菌中的擴(kuò)增上清而構(gòu)建。該技術(shù)將蛋白質(zhì)分子的表型和基因型巧妙地結(jié)合于絲狀噬菌體這樣一個(gè)便于對(duì)其進(jìn)行一系列生化和遺傳操作的載體上，從而使融合蛋白展示在噬菌體顆粒的外部，而編碼融合殘基的DNA則位于噬菌體顆粒內(nèi)部。展示蛋白與其編碼DNA之間的這種物理聯(lián)系使得我們可以通過一種簡(jiǎn)單的“生物淘選”來(lái)對(duì)大量的蛋白變異株進(jìn)行篩選，通過進(jìn)一步的功能鑒定得到能與靶分子特異結(jié)合的噬菌體克隆。根據(jù)噬菌體克隆所展示多肽或蛋白與相應(yīng)編碼基因一一對(duì)應(yīng)的關(guān)系就可明確與靶分子對(duì)應(yīng)的配體的基因型和表型特點(diǎn)。且每個(gè)蛋白都能與其相應(yīng)的DNA序列聯(lián)系起來(lái)。
近年來(lái)，朱圣庚領(lǐng)導(dǎo)的研究組通過對(duì)噬菌體抗體庫(kù)的篩選，將展示不同單鏈抗體的噬菌體偶聯(lián)于硅片上，制備噬菌體抗體芯片(phage antibodychip)用于特異性抗原的識(shí)別和蛋白質(zhì)組學(xué)研究(洪龍，廖瑋，魏芳，趙新生，朱圣庚.用于識(shí)別不同細(xì)胞蛋白質(zhì)組的噬菌體抗體芯片.物理化學(xué)學(xué)報(bào).2004；20(10)1182-1185；廖瑋，洪龍，魏芳，朱圣庚，趙新生.利用的展示系統(tǒng)改進(jìn)噬菌體抗體芯片.物理化學(xué)學(xué)報(bào).2005，21(5)508-511；岑曉東，王文娟，趙新生，汪玄，沈悌，譚濤超，畢群，朱圣庚.高密度噬菌體抗體芯片對(duì)細(xì)胞表面蛋白的識(shí)別.物理化學(xué)學(xué)報(bào).2006，22(7)777～779)。盡管，噬菌體抗體芯片，不同于傳統(tǒng)蛋白質(zhì)抗體芯片，利用展示抗體片段的噬菌體替代傳統(tǒng)單抗制備噬菌體抗體芯片具有很多優(yōu)勢(shì)①通過親和淘選噬菌體抗體庫(kù)，獲得針對(duì)各種抗原的噬菌體抗體，無(wú)需免疫動(dòng)物；②通過單克隆擴(kuò)增獲得噬菌體抗體， 避免了步驟繁瑣的單抗制備和純化過程；③避免了芯片表面對(duì)抗體決定區(qū)的直接干擾(Arnaud，M.C.；Gazarian，T.；Rodriguez，Y.P.；Gazarian，K.；Sakanyan，V.Proteomics，2004，41959.Cekaite，L.；Haug，O.；Myklebost，O.；Aldrin，M.；Ostenstad，B.；Holden，M.；Frigessi，A.；Hovig，E.；Sioud，M.Proteomics，2004，42572.)。但是，噬菌體抗體芯片與蛋白質(zhì)抗體芯片一樣，也只能用于檢測(cè)和篩選特異性抗原，并不能用于人體或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物各種樣本中抗體、配體和天然或人工合成物中特異性結(jié)合物的檢測(cè)、鑒定和篩選，也不能作為基因芯片，用于特異性基因的檢測(cè)、鑒定和篩選。因此，研制可用于特異性抗體、配體的檢測(cè)和篩選噬菌體芯片，仍具有重大意義和現(xiàn)實(shí)必要性。
噬菌體肽庫(kù)是噬菌體展示技術(shù)的一個(gè)非常重要的分支。1990年Scatt(Scott JK，Smith GP.Searching for peptide ligands with an epitopelibrary.Science，1990；249(1)386-390.)設(shè)計(jì)并建立了噬菌體隨機(jī)肽庫(kù)(phage random peptide library)。該噬菌體肽庫(kù)通過將不同短肽的基因序列插入噬菌體單鏈DNA中，使表達(dá)的外源隨機(jī)序列多肽與絲狀噬菌體的表面外殼蛋白的N端融合形成具有一定的空間構(gòu)象的融合蛋白，呈現(xiàn)于噬菌體表面，并可作為任何靶抗原表位的模擬肽(minotope)。盡管噬菌體隨機(jī)肽庫(kù)展示的隨機(jī)肽段序列與天然分子并無(wú)相似之處，但卻仍舊具有與天然分子相類似的功能或抗原性。如從噬菌體表面隨機(jī)短肽庫(kù)中篩選出模擬環(huán)狀小肽(U.S.Patent No.5,835,382)，雖然其序列與天然EPO的序列亦無(wú)相似之處，但是它的確能夠與EPO受體高親合力結(jié)合，并且模擬促紅細(xì)胞生成素(EPO)的功能。長(zhǎng)期以來(lái)，噬菌體肽庫(kù)技術(shù)因其在抗原表位的分析中的特殊優(yōu)勢(shì)，在基因疫苗、多肽疫苗和重組疫苗的研究中發(fā)揮著巨大的作用(Matthew A.S，Deborah S，Kenichi M，et al.HSV-1 amplicon peptidedisplay vector.J Vir Meth.2002；10771-79)。目前，噬菌體隨機(jī)肽庫(kù)的隨機(jī)多樣性可達(dá)107～109，短肽長(zhǎng)度已由最初的6肽、7肽發(fā)展到9肽、15肽，直到38肽、40肽，噬菌體隨機(jī)肽庫(kù)是目前噬菌體展示肽庫(kù)中應(yīng)用最廣的肽庫(kù)之一(Ming-juan Zhang，Jun Yang，Zhuo-ren Lu.A New OuabainConjugated Peptide Was Found From Phage Displayed Peptide Library.Am J Hypert.2004，17619-623；張明娟，楊軍，呂卓人.噬菌體肽文庫(kù)的篩選.臨床檢驗(yàn)雜志，2002；20(4)247-248)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種噬菌體芯片的新用途，特別是將展示不同外源肽的噬菌體直接通過人或非人工的方法，按照預(yù)先設(shè)計(jì)的陣列模式偶聯(lián)于同一芯片片基上制備噬菌體芯片，該噬菌體芯片既可作為蛋白類芯片，用于人體或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物各種樣本中抗體、配體和天然或人工合成物中特異性結(jié)合物的檢測(cè)、鑒定和篩選，也可作為基因芯片，用于基因的檢測(cè)、鑒定和篩選。
為實(shí)現(xiàn)上述任務(wù)，本發(fā)明采用噬菌體展示技術(shù)，篩選噬菌體肽庫(kù)或構(gòu)建噬菌體展示庫(kù)，獲得展示特異性外源肽(或抗原表位)的噬菌體克隆，利用自動(dòng)或非自動(dòng)方式，按照設(shè)計(jì)的陣列模式將展示不同外源肽的噬菌體直接偶聯(lián)于同一芯片片基上，獲得噬菌體芯片。該芯片既可作為展示外源肽的蛋白類芯片，用于人體和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物各種樣本中抗體、配體及天然或人工合成物中特異性結(jié)合物的檢測(cè)、篩選和鑒定，也可作為克隆相關(guān)基因的基因芯片，用于基因的檢測(cè)、鑒定和篩選。
本發(fā)明的創(chuàng)新性之處在于①篩選噬菌體肽庫(kù)的抗體可直接來(lái)自患者，勿需表達(dá)、純化相應(yīng)抗原，也勿需免疫動(dòng)物制備抗體，在預(yù)先不知道診斷用靶抗原的情況下，使用患者血清從抗原決定簇庫(kù)中篩選出展示特異性抗原決定簇的噬菌體，這種噬菌體只能與病人血清抗體反應(yīng)，而不能與正常人的血清反應(yīng)，從而建立起疾病的特異性診斷方法；②利用噬菌體展示技術(shù)，通過對(duì)噬菌體隨機(jī)肽庫(kù)或抗原庫(kù)的親和淘選，即可獲得展示相關(guān)特異性外源肽(抗原表位)的噬菌體，通過簡(jiǎn)單的單克隆擴(kuò)增，即可高通量獲得大量重組噬菌體，同時(shí)，噬菌體顆粒穩(wěn)定，易于長(zhǎng)期保存，避免了步驟繁瑣而復(fù)雜的蛋白表達(dá)和純化過程以及蛋白質(zhì)的降解；③由于所有展示不同外源肽的噬菌體均具有完全相同的遺傳背景，因而通過相同的偶聯(lián)方式固定于芯片片基上，最大程度降低了芯片片基的處理難度，利于噬菌體芯片制備條件的優(yōu)化和規(guī)范化操作及芯片質(zhì)量的控制；④采用展示不同外源肽的噬菌體替代傳統(tǒng)蛋白分子制備生物芯片，避免了芯片表面的對(duì)抗蛋白分子的直接干擾，最大程度上保持了展示蛋白分子的結(jié)構(gòu)特征和生物活性，降低抗原-抗體(受體-配體)之間結(jié)合的空間位阻效應(yīng)，大幅度提高了噬菌體芯片的靈敏度和信噪比；⑤噬菌體展示技術(shù)將蛋白質(zhì)分子的表型和基因型結(jié)合于絲狀噬菌體這一微生物載體，將各種多肽或蛋白質(zhì)以融合蛋白的形式表達(dá)并展示在噬菌體表面，同時(shí)將其遺傳密碼整合于噬菌體基因組，因而既可作為展示外源肽的蛋白類芯片，用于人體和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物各種樣本中抗體、配體及天然或人工合成物中特異性結(jié)合物的檢測(cè)、篩選和鑒定，也可作為克隆相關(guān)基因的基因芯片，用于基因檢測(cè)。
因此，本發(fā)明具有廣闊的應(yīng)用前景和市場(chǎng)。


圖1展示抗HPVl6 L1抗原模擬肽的噬菌體芯片檢測(cè)小鼠抗HPVl6L1VLP抗血清。
以下結(jié)合附圖和發(fā)明人給出的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明利用噬菌體展示技術(shù)，通過篩選噬菌體肽庫(kù)或噬菌體抗原庫(kù)，獲得展示特異性外源肽(或抗原表位)的噬菌體克隆，將展示不同外源肽的噬菌體直接通過人工或非人工的方法，按照預(yù)先設(shè)計(jì)的陣列模式偶聯(lián)于同一芯片片基上制備生物芯片，有可能成為一類與傳統(tǒng)意義上的基因芯片和蛋白芯片完全不同的新型生物芯片——噬菌體芯片(phage chip or phagemicroarray)，該芯片既可作為展示外源肽的蛋白類芯片，用于人體或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物各種樣本中抗體、配體和天然或人工合成物中特異性結(jié)合物的檢測(cè)、鑒定和篩選，也可作為基因芯片，用于基因的檢測(cè)、鑒定和篩選。
1.展示特異性外源肽或抗原表位的噬菌體克隆的篩選和鑒定1.1采用特異性的抗體或血清(可來(lái)自患者或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物)，或者各種天然或人工合成的蛋白或非蛋白類物質(zhì)。通過簡(jiǎn)單的“吸咐—洗脫—擴(kuò)增”的方法，篩選噬菌體隨機(jī)肽庫(kù)(phage random peptide library)，挑取單克隆噬菌體，經(jīng)擴(kuò)增、DNA的提取、測(cè)序和同源性分析，確定展示特異性外源肽或抗原表位的噬菌體克隆保存?zhèn)溆?方法詳見Ph.D.-12TMPhage DisplayPeptide Library Kit說明書)。
1.2通過PCR等分子克隆技術(shù)獲得靶蛋白基因序列，將其插入噬菌體展示系統(tǒng)(如單鏈絲狀噬菌體展示系統(tǒng)、λ噬菌體展示系統(tǒng)、T4噬菌體展示系統(tǒng)等)，構(gòu)建噬菌體展示庫(kù)(具體方法參見《分子克隆》)。常規(guī)方法制備該蛋白的抗血清或抗體，通過“吸咐—洗脫—擴(kuò)增”的方法，篩選上述構(gòu)建的噬菌體展示庫(kù)(phage display library)，挑取單克隆噬菌體，或者直接隨機(jī)挑取單克隆噬菌體，并經(jīng)擴(kuò)增、DNA的提取、測(cè)序和同源性分析，確定展示特異性抗原表位的噬菌體克隆保存?zhèn)溆?方法同前)。
2.噬菌體芯片的制備采用人工或非人工的方法和相應(yīng)設(shè)備將上述獲得的展示特異性外源肽或抗原表位的噬菌體按照設(shè)計(jì)好的陣列模式偶聯(lián)至不同芯片片基上，如載玻片、硅片、瓷片、尼龍膜、PVDF膜、NC膜、聚丙烯酰胺凝膠或者磁珠、瓊脂糖等不同的微珠，即可獲得噬菌體芯片。同時(shí)，上述芯片片基可經(jīng)過或不經(jīng)過醛基化、巰基化、氨基化或環(huán)氧基等不同活化處理，以利于噬菌體以各種可能的方式展現(xiàn)在芯片片基上載玻片的表面。
3.噬菌體芯片的應(yīng)用3.1本發(fā)明所提供的噬菌體芯片可作為展示外源肽或抗原表位的蛋白芯片，用于人體或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物各種樣本中抗體、配體和天然或人工合成物中特異性配體或結(jié)合物的檢測(cè)、篩選和鑒定，具體方法如下3.1.1噬菌體芯片在抗體檢測(cè)中的應(yīng)用(1)常規(guī)方法封閉制備好的噬菌體芯片，加入稀釋好的人體或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物抗血清、抗體、體液或組織提取液，4℃過夜或室溫孵育，采用PBS緩沖液沖洗，加入熒光或者非熒光標(biāo)記的第二抗體，37℃孵育，PBS緩沖液沖洗后放入芯片閱讀儀中進(jìn)行結(jié)果分析。
(2)按照常規(guī)方法對(duì)含有被檢測(cè)抗體進(jìn)行熒光或者非熒光標(biāo)記。封閉制備好的噬菌體芯片，加入按照一定比例稀釋的含有被標(biāo)記抗體，4℃過夜或室溫孵育，采用PBS緩沖液沖洗，37℃孵育，PBS緩沖液沖洗后放入芯片閱讀儀中進(jìn)行結(jié)果分析。
3.1.2噬菌體芯片在配體檢測(cè)中的應(yīng)用
按照常規(guī)方法對(duì)含有被檢測(cè)配體的人體或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物體血清、體液、組織提取液及天然或人工合成物中特異性配體或結(jié)合物，進(jìn)行熒光或者非熒光標(biāo)記。常規(guī)方法封閉制備好的噬菌體芯片，加入按照一定比例稀釋的含有被標(biāo)記配體的提取液，4℃過夜或37℃孵育，PBS緩沖液沖洗后放入芯片閱讀儀中進(jìn)行結(jié)果分析。
3.1.3噬菌體芯片在配體篩選中的應(yīng)用(1)常規(guī)方法封閉制備好的噬菌體芯片，加入按照一定比例稀釋的含有被檢測(cè)配體的人體或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物體血清、體液、組織提取液及天然或人工合成物中特異性配體或結(jié)合物，4℃過夜或室溫孵育或37℃孵育，PBS緩沖液沖洗，采用表面增強(qiáng)激光解吸/離子化-飛行時(shí)間質(zhì)譜(SELDI-TOF-MS)技術(shù)，進(jìn)行配體篩選。
(2)常規(guī)方法封閉制備好的噬菌體微珠芯片(phage Bead Array)，加入按照一定比例稀釋的含有被檢測(cè)配體的人體或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物體血清、體液、組織提取液及天然或人工合成物中特異性配體或結(jié)合物，4℃過夜或室溫孵育或37℃孵育，PBS緩沖液沖洗，常規(guī)方法分離微珠，進(jìn)行配體篩選。
3.2本發(fā)明所提供的噬菌體芯片可作為整合靶基因的基因芯片，用于人體或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物血液、體液、分泌物、組織提取液或人工合成基因(如DNA或者RNA)的檢測(cè)、鑒定和篩選。
3.2.1用于人體或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物血液、體液、分泌物、組織提取液或人工合成基因(如DNA或者RNA)的檢測(cè)、鑒定。
常規(guī)方法提取人體或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物血液、體液、分泌物、組織提取液或人工合成基因(如DNA或者RNA。如果是mRNA后，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后將cDNA剪切為200～600bp長(zhǎng)的片段，篩選cDNA3’端，用PCR擴(kuò)增的方法獲得足夠量的cDNA)。在采用放射標(biāo)記技術(shù)或者熒光標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行基因的標(biāo)記，質(zhì)譜分析或化學(xué)發(fā)光等進(jìn)行基因芯片的檢測(cè)。
以下是發(fā)明人給出的實(shí)施例，需要說明的是以下的實(shí)施例僅用于理解、描述本發(fā)明，本發(fā)明并不限于這些實(shí)施例。
實(shí)施例中采用的質(zhì)粒、噬菌體隨機(jī)肽庫(kù)及主要試劑如下噬菌體隨機(jī)十二肽庫(kù)(Ph.D.12TMPhage Display Peptide Library)和E.coli ER2738(Cat.8110S)購(gòu)自New England Biolabs公司；Protein G MagneticBeads購(gòu)自New England BioLabs公司；HPV-16 L1單克隆抗體購(gòu)自Neomarker公司；HRP-IgG購(gòu)自DAKO公司；Cy3 dUTP/Cy5 dUTP購(gòu)自美國(guó)Amersham Pharmacia公司。
總RNA提取試劑盒購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司.Gen III Microarray Spotter芯片點(diǎn)樣儀購(gòu)自Amersham Pharmacia公司；恒溫雜交箱購(gòu)自Shellab公司；芯片掃描儀購(gòu)自Amersham Pharmacia公司；聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)儀購(gòu)自MJResearch公司；ScanArray 3000激光共聚焦掃描儀，General Scanning Inc；PTC-100 PCR擴(kuò)增儀，MJ Research Inc；UV-2000紫外透射分析儀，上海天能科技有限公司。
本實(shí)施例中涉及到的各種試劑的配置和方法參見《分子克隆》、《ProBondTM純化系統(tǒng)說明書》、《New England BioLabs公司Ph.D.-12TMPhageDisplay Peptide Library Kit說明書》等。
實(shí)施例1噬菌體芯片的制備1.展示外源肽或抗原表位的噬菌體的篩選和鑒定方法1噬菌體隨機(jī)肽庫(kù)的篩選和鑒定(1)常規(guī)方法采集并分離人體或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物的血清、抗體、體液或組織提取液。
(2)“生物淘選”法篩選噬菌體隨機(jī)肽庫(kù)取擴(kuò)增并稀釋后的噬菌體肽庫(kù)(1.0×1011pfu)，和300ng正常兔IgG溶液到2ml結(jié)合液中，37℃，振蕩孵育50rpm，1h進(jìn)行預(yù)吸附，加入蛋白G標(biāo)記的磁珠50μl，37℃，振蕩孵育50rpm 20min后，磁力吸附2min，取上清，用1/6體積2.5M PEG/NaCl沉淀，200μlTBS溶解，加入到2ml含300ng抗體的人體或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物的血清、抗體、體液或組織提取的結(jié)合液中，37℃，孵育1h，加入蛋白G標(biāo)記的磁珠50μl，37℃，振蕩孵育50rpm，20min，磁力吸附2min，TBST(TBS+0.1％Tween-20)沖洗，5min×3次，加入100μl 0.2Mglycine-HCl(pH2.2)，1mg/mlBSA，輕輕搖晃10min，磁力吸附5min，收集洗脫液，加入1M Tris-HCl(pH9.1)中和，檢測(cè)噬菌體滴度，留取20μl用于保存，對(duì)其余洗脫液加入到20ml ER2738培養(yǎng)液(已達(dá)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期)中，在37℃，230rpm，孵育4.5h。1/6體積2.5M PEG/NaCl沉淀，200μl TBS溶解即為已擴(kuò)增的噬菌體，檢測(cè)噬菌體滴度，4℃保存。取等量噬菌體(1.0×1011pfu)重復(fù)上述篩選過程3次，檢測(cè)第3次洗脫液的噬菌體滴度(方法詳見Ph.D.-12TMPhage Display Peptide Library Kit說明書)。
(3)快速純化噬菌體測(cè)序模板及測(cè)序用無(wú)菌的木簽，隨機(jī)蘸取測(cè)定第3次洗脫液噬菌體滴度的雙層瓊脂培養(yǎng)皿中的藍(lán)色噬菌體菌斑，投入含5ml已達(dá)指數(shù)生長(zhǎng)期的ER2738培養(yǎng)液中，在37℃，劇烈震蕩孵育230rpm，4.5h。離心后取上清液并再次離心，取80％上清，NaI法快速純化噬菌體測(cè)序模板(方法詳見Ph.D.-12TMPhage Display Peptide Library Kit說明書)，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，上海華諾生物科技有限公司測(cè)序。
(40)序列分析采用NCBI的Blastn和Blastp分析，并經(jīng)同源性分析確定展示特異性外源肽或抗原表位的噬菌體克隆。
方法2噬菌體展示庫(kù)的構(gòu)建和篩選(1)特異性蛋白噬菌體展示庫(kù)的構(gòu)建通過PCR等分子克隆技術(shù)獲得靶蛋白基因序列，將其插入單鏈絲狀噬菌體展示系統(tǒng)，構(gòu)建噬菌體展示庫(kù)(具體方法參見《分子克隆》)。
(2)噬菌體克隆的篩選常規(guī)方法制備該蛋白的抗血清或抗體，通過“吸咐—洗脫—擴(kuò)增”的方法，篩選上述構(gòu)建的噬菌體展示庫(kù)(phagedisplay library)，挑取單克隆噬菌體，或者直接隨機(jī)挑取單克隆噬菌體，經(jīng)擴(kuò)增、DNA的提取、測(cè)序和同源性分析，確定展示特異性抗原表位的噬菌體克隆保存?zhèn)溆?方法同前)。
2.噬菌體芯片的制備采用人工或非人工的方法和相應(yīng)設(shè)備將上述獲得的展示特異性外源肽或抗原表位的噬菌體按照設(shè)計(jì)好的陣列模式偶聯(lián)至不同芯片片基上，如載玻片、硅片、瓷片、尼龍膜、PVDF膜、NC膜、聚丙烯酰胺凝膠或者磁珠、瓊脂糖等不同的微珠，即可獲得噬菌體芯片。同時(shí)，上述芯片片基可經(jīng)過或不經(jīng)過醛基化、巰基化、氨基化或環(huán)氧基等不同活化處理，以利于噬菌體以各種可能的方式展現(xiàn)在芯片片基上載玻片的表面。方法如下采用芯片點(diǎn)樣儀將上述經(jīng)過鑒定的展示特異性外源肽的噬菌體的溶液1μl按照預(yù)先設(shè)計(jì)的陣列模式偶聯(lián)至NC膜上，并設(shè)陰性對(duì)照。
實(shí)施例2噬菌體芯片在抗體檢測(cè)中的應(yīng)用方法15％脫脂奶室溫封閉2h制備好的噬菌體芯片，加入1∶500稀釋的待檢測(cè)樣，本室溫孵育2h，TBST(含0.5％Tween-20的TBS)洗，10min×3，1∶1000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG室溫孵育20min，TBST洗10min×3，DAB顯色。即可檢測(cè)出樣本中的特異性抗體(圖1)。
方法2常規(guī)法分離樣本中的抗體，采用Cy3熒光標(biāo)記法進(jìn)行抗體的標(biāo)記(Cy3熒光標(biāo)記試劑盒購(gòu)自Pharmacia公司)。5％脫脂奶室溫封閉噬菌體芯片，加入Cy3標(biāo)記的待檢測(cè)樣，本室溫孵育2h，TBST(含0.5％Tween-20的TBS)洗，10min×3，熒光掃描儀判讀結(jié)果。
實(shí)施例3噬菌體芯片在配體檢測(cè)中的應(yīng)用采用常規(guī)法制備、分離樣本中配體，采用Cy3熒光標(biāo)記法進(jìn)行全蛋白標(biāo)記(Cy3熒光標(biāo)記試劑盒購(gòu)自Pharmacia公司)。5％脫脂奶室溫封閉噬菌體芯片，加入Cy3標(biāo)記的待檢測(cè)樣，本室溫孵育2h，TBST(含0.5％Tween-20的TBS)洗，10min×3，熒光掃描儀判讀結(jié)果。
實(shí)施例4噬菌體芯片在配體篩選中的應(yīng)用方法1常規(guī)方法封閉制備好的噬菌體芯片，加入按照一定比例稀釋的含有被檢測(cè)配體的人體或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物體血清、體液、組織提取液及天然或人工合成物中特異性配體或結(jié)合物，4℃過夜或室溫孵育或37℃孵育，PBS緩沖液沖洗，采用表面增強(qiáng)激光解吸/離子化-飛行時(shí)間質(zhì)譜(SELDI-TOF-MS)技術(shù)，進(jìn)行配體篩選。
方法2常規(guī)方法封閉制備好的噬菌體微珠芯片(phage Bead Array)，加入按照一定比例稀釋的含有被檢測(cè)配體的人體或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物體血清、體液、組織提取液及天然或人工合成物中特異性配體或結(jié)合物，4℃過夜或室溫孵育或37℃孵育，PBS緩沖液沖洗，常規(guī)方法分離微珠，進(jìn)行配體篩選。
實(shí)施例5噬菌體芯片在基因檢測(cè)中的應(yīng)用常規(guī)方法分離人體或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物離體新鮮組織樣本，切成多個(gè)1cm3小塊，在RNase-Free 0.9％生理鹽水中漂洗樣品，提取樣本中mRNA后，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后將cDNA剪切為50～600bp長(zhǎng)的片段，篩選cDNA3’端，用PCR擴(kuò)增的方法獲得足夠量的cDNA。
參照Draghici方法(Draghici S，Kulaeva O，HoffB，Petrov A，Shams S，Tainsky MA.Noise sampling methodan ANOVA approach allowing robustselection of differentially regulated genes measured by DNA microarrays.Bioinformatics.2003；191348-1359.)行cDNA單鏈探針并純化(Cy3熒光標(biāo)記試劑盒購(gòu)自Pharmacia公司)。用Cy3 dUTP標(biāo)記正常組織mRNA，用Cy5dUTP標(biāo)記樣本組織mRNA.具體方法是取稀釋60倍的cDNA克隆溶液作為模板，加入引物和10×反應(yīng)緩沖液5μl，10nmol的dATP，dCTP，dGTP和5nmol的dTTP，1mmol/L的Cy3-dUTP 1μl和3U Tag酶，加水調(diào)終體積為50μl。采用0.2ml的薄壁管，按94℃，5min，(94℃，40s；55℃，40s；72℃，90s)×30，72℃，5min的擴(kuò)增程序擴(kuò)增得到目的條帶，然后用PCR純化試劑盒純化擴(kuò)增產(chǎn)物，產(chǎn)物最終溶解在適量的5×SSC，0.2％SDS緩沖液中，終濃度約為50ng/μl。
檢測(cè)標(biāo)記的熒光含量。用分光光度計(jì)檢測(cè)260nm，550nm，650nm時(shí)的A值，然后計(jì)算出熒光含量。將標(biāo)記好的探針(Cy3/Cy5)按等量混勻，溶解在30μL的雜交緩沖液中。將芯片和雜交混合探針分別置于95℃雙蒸水浴中變性5min，立即將混合探針加在噬菌體芯片上，置于濕盒中65℃雜交4h，然后置2×SSC，0.1％SDS溶液中洗5min，0.1×SSC，0.1％SDS溶液中洗5min，0.1×SSC溶液中蕩洗數(shù)遍，晾干。ScanArray3000激光共聚焦掃描儀在適當(dāng)條件下掃描檢測(cè)其雜交信號(hào)后進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和處理。
權(quán)利要求
1.噬菌體芯片作為蛋白類芯片用于人體或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物各種樣本中抗體、配體和天然或人工合成物中特異性結(jié)合物的檢測(cè)、鑒定和篩選的應(yīng)用，或作為基因芯片用于特異性基因檢測(cè)的應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，用于噬菌體芯片的制備可通過以下途徑獲得采用特異性抗體或配體通過常規(guī)的吸咐、洗脫、擴(kuò)增的方法，篩選噬菌體隨機(jī)肽庫(kù)，挑取單克隆噬菌體，并經(jīng)擴(kuò)增、DNA的提取、測(cè)序和同源性分析，確定展示特異性外源肽或抗原表位的噬菌體克??；采用噬菌體展示技術(shù)，通過構(gòu)建展示特異性蛋白片段或短肽的噬菌體展示庫(kù)，挑取單克隆噬菌體，并經(jīng)擴(kuò)增、DNA的提取、測(cè)序和同源性分析，確定展示特異性外源肽或的噬菌體。
3.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，展示不同外源肽的噬菌體通過人工或非人工方法，按照預(yù)先設(shè)計(jì)的陣列模式偶聯(lián)于芯片片基上，制成噬菌體芯片。
4.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的噬菌體芯片片基是載玻片、硅片、瓷片、尼龍膜、PVDF膜、NC膜或聚丙烯酰胺凝膠，或者磁珠、瓊脂糖不同的微珠，且上述芯片片基經(jīng)過或不經(jīng)過醛基化、巰基化、氨基化或環(huán)氧基化不同活化處理。
5.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的噬菌體芯片上至少包含1個(gè)或1個(gè)以上噬菌體克隆。
6.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的噬菌體芯片用于人體或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物血液、體液、分泌物、組織提取液中特異性抗體或配體的檢測(cè)、鑒定和篩選。
7.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的噬菌體芯片用于天然或人工合成物中的特異性配體或結(jié)合物的檢測(cè)、鑒定和篩選。
8.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的噬菌體芯片用于人體或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物血液、體液、分泌物、組織提取液或人工合成基因的檢測(cè)、鑒定和篩選。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種噬菌體芯片作為蛋白類芯片或基因芯片的應(yīng)用。本發(fā)明分別通過篩選噬菌體肽庫(kù)或構(gòu)建噬菌體展示庫(kù)，獲得展示特異性外源肽(或抗原表位)的噬菌體克隆，利用自動(dòng)或非自動(dòng)方式，按照預(yù)先設(shè)計(jì)的陣列模式將展示不同外源肽的噬菌體直接偶聯(lián)于同一芯片片基上，獲得噬菌體芯片。該芯片既可作為展示外源肽的蛋白類芯片，用于人體和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物各種樣本中抗體、配體及天然或人工合成物中特異性結(jié)合物的檢測(cè)、篩選和鑒定，也可作為克隆相關(guān)基因的基因芯片，用于相關(guān)基因的檢測(cè)。該噬菌體芯片具有成本低廉、制備簡(jiǎn)單、穩(wěn)定性高、特異性高、易于長(zhǎng)期保存等顯著特點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101059515SQ20071001783
公開日2007年10月24日 申請(qǐng)日期2007年5月14日 優(yōu)先權(quán)日2007年5月14日
發(fā)明者楊軍, 張明娟, 李宗芳, 蘇寶山 申請(qǐng)人:西安交通大學(xué)